CN110859849A - 薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用 - Google Patents

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齐艳
许丽娜
毛章
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孙鹏远
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韩旭
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    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs

Abstract

本发明公开了薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用。MTT和形态学观察证明薯蓣皂苷对体外6‑OHDA诱导的PC12细胞具有明显地保护作用。同时，薯蓣皂苷对MPTP诱导的PD小鼠而引起的GFAP，IBA‑1表达水平显著升高具有明显的下调作用，说明薯蓣皂苷能抑制脑组织中小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。根据临床用药需求，可将薯蓣皂苷作为单一有效成分制成药物，也可与其他药物合用制成复方制剂。薯蓣皂苷具有安全、无毒副作用、有效、经济、实用等优点。

Description

薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种中药有效成分的新用途，特别是高纯度薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种好发于中老年人的神经退行性疾病，其重要临床症状包括运动迟缓、姿势步态异常、肌强直和静止性震颤等。主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺神经元的变性死亡。其发病率随着年龄增长呈现升高的趋势，中国一项大规模流行病学调查结果显示我国PD患者数量超过170万，是世界卫生组织确定的疑难疾病之一。目前PD治疗的策略，主要以左旋多巴制剂的替代疗法为主，辅以单胺氧化酶-B抑制剂、儿茶酚甲基转移酶抑制剂、抗胆碱药、金刚烷胺等，虽然这些药物能够不同程度改善患者临床症状，但是不能阻止或延缓PD进一步发展。中药作为补充和替代治疗药物正逐步得到全世界的广泛关注和认可。相对于化学合成药物，中药的毒副作用较小，不但可以明显改善症状，标本兼顾，而且可用来减轻化学合成药物的毒副作用。一些天然产物如人参皂苷、三七皂苷和姜黄素等都已报道对神经退行性疾病有较好的治疗作用。薯蓣皂苷，是一种天然甾体皂苷类化合物，广泛存在于薯蓣科植物穿山龙、山药等植物中。药理学研究表明薯蓣皂苷具有抗炎、抗高血脂、抗氧化应激损伤等多种药理学活性。
但迄今为止，未见薯蓣皂苷在帕金森病的保护及在制备帕金森保护药物中应用的相关报道。
发明内容
本发明是发现薯蓣皂苷对帕金森病具有保护作用，提供一种薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用。具体是指薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用。
本发明提供薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用。
进一步地，将薯蓣皂苷制备成单一化学成分的药物制剂，或与其他药物合用制备成复方药物制剂。也可以根据药剂学相关要求和临床需要制成各种剂型应用于临床中，如：片剂、胶囊剂、注射剂、口服液体制剂、颗粒剂等。
进一步地，薯蓣皂苷在降低6-OHDA诱导的PC12细胞损伤中的应用；薯蓣皂苷在改善脑组织中细胞坏死，细胞间隙增大，细胞排列不规则炎细胞浸润中的应用；薯蓣皂苷在改善MPTP诱导而引起的GFAP，IBA-1表达水平升高中的应用。
本发明的实施例中记载了，薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用，具体给药方式为口服给药情况下，其中，小鼠口服薯蓣皂苷(20、40和80mg/kg)对MPTP诱导的PD小鼠具有明显的保护作用，应用在临床上，推算出一个成人(60kg)每日口服约140～550mg(即2.3～9.17mg/kg体重)薯蓣皂苷对有帕金森病具有明显地保护作用。
本发明发现薯蓣皂苷具有帕金森病保护作用，可用于制成帕金森病保护药物。MTT和形态学观察证明薯蓣皂苷对体外6-OHDA诱导的PC12细胞具有明显地保护作用。同时，薯蓣皂苷对MPTP诱导的PD小鼠而引起的GFAP，IBA-1表达水平显著升高具有明显的下调作用，说明薯蓣皂苷能抑制脑组织中小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。根据临床用药需求，可将薯蓣皂苷作为单一有效成分制成药物，也可与其他药物合用制成复方制剂。薯蓣皂苷具有安全(无毒副作用)、有效、经济、实用等优点。
附图说明
图1为本发明实施例1薯蓣皂苷对6-OHDA诱导的PC12细胞细胞活力的影响。
图2为本发明实施例1薯蓣皂苷对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡的影响。
图3为本发明实施例1薯蓣皂苷对6-OHDA诱导的PC12细胞ROS的影响。
图4为本发明实施例2薯蓣皂苷对MPTP诱导的PD小鼠步态分析的影响。
图5为本发明实施例2薯蓣皂苷对MPTP诱导的PD小鼠模型行为学的影响。
图6为本发明实施例2薯蓣皂苷对MPTP诱导的PD小鼠组织病理学的影响。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1薯蓣皂苷对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤的保护作用研究
1.MTT法检测细胞活力。
处于对数生长时期的大鼠嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞(
Figure BDA0002317031910000031
CRL-1721TM)，采用0.25％胰酶消化，收集细胞悬液1200g/min离心5min计数，将浓度为1×106个/mL(100μL)细胞接种于96孔板，培养24小时后，分为如下几组：空白组，6-OHDA(6-羟基多巴胺)模型组，模型加薯蓣皂苷不同浓度给药组。给药组给予不同浓度的薯蓣皂苷(31.25、62.5、125、250、和500ng/ml),每个浓度设置6个复孔，预保护24h后，和模型组一起给予6-OHDA 400μM作用6h，在实验终止前4h加入10μL MTT(5.0mg/ml)，孵育后每孔加适量DMSO，震摇10min后立即用酶标仪测定490nm处吸光度值，计算细胞的活力。
由图1结果可知，PC12细胞给予6-OHDA造模后，细胞活力显著下降，而薯蓣皂苷保护后，细胞活力有一定程度的升高，说明薯蓣皂苷对6-OHDA诱导的PC12细胞损伤起到保护作用。
2.细胞凋亡染色分析
处于对数生长期的PC12细胞，1200g/min离心重悬后计算细胞数目，保证细胞在6孔板中浓度为2×105个/mL(1mL)，之后给予不同浓度的薯蓣皂苷(125、250、和500ng/ml)，预保护24h后和模型组一起给予6-OHDA 400μM作用6h。移去培养液并用PBS漂洗一遍，取浓度为1.0μg/mL溶于PBS的吖啶橙(AO)和溴化乙锭(EB)各20μL，混匀加入到各组，保证液面覆盖住6孔板底部。用荧光显微镜进行观察，注意染色和分析凋亡情况。细胞的铺板和给药处理方法同上，PBS漂洗甲醛固定，加入1.0μg/mL的DAPI溶液，培养箱37℃孵育10min，PBS清洗3遍，用荧光显微镜观察细胞染色和分析凋亡情况。
由图2结果可知，AO/EB染色后发现空白组细胞呈现有明亮的绿色荧光出现，而6-OHDA处理后细胞出现大量橘红色荧光说明细胞正处在凋亡过程。DAPI染色后观察发现，6-OHDA处理组细胞染色质凝固，细胞核呈皱缩并呈现明亮的蓝色。给予薯蓣皂苷治疗后，橘红色荧光减弱说明薯蓣皂苷能减轻6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡。
3.细胞内活性氧(ROS)检测
PC12细胞消化离心后计数，将细胞悬液按2×105个/mL密度的细胞接种于6孔板中，然后按上述薯蓣皂苷以及6-OHDA造模方法进行预防性给药和造模。随后除去板中的培养液，向每孔中加入1ml浓度为10μM DCFH-DA溶液(用无胎牛血清培养液按1:1000的比例稀释)，孵育20min。时间结束后，用无胎牛血清的培养液洗涤细胞3次，然后用倒置荧光显微镜实时观测并采集图像。
由图3可知，6-OHDA给药后细胞呈明亮的绿色荧光，而给与薯蓣皂苷保护后，绿色荧光强度减弱，说明薯蓣皂苷减轻6-OHDA引起的细胞内活性氧的堆积。
实施例2薯蓣皂苷对MPTP诱导的PD小鼠的保护作用研究
将8-12周龄雄性C57小鼠70只，随机分为以下几组：空白组，MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)模型组，MPTP造模加薯蓣皂苷高中低剂量给药组(80,40,20mg/kg)和薯蓣皂苷(80mg/kg)单纯给药组，每组12只。空白组每天腹腔注射生理盐水，连续7天；MPTP模型组，每天经腹腔注射20mg/Kg的MPTP，2h后给予等量生理盐水灌胃进行，连续7天；MPTP造模加薯蓣皂苷给药组腹腔注射MPTP20mg/kg，2h后给予不同剂量(80,40,20mg/kg)薯蓣皂苷灌胃给药，连续7天，MPTP注射之后继续进行薯蓣皂苷灌胃7天；薯蓣皂苷单纯给药组每天薯蓣皂苷80mg/kg灌胃，连续14天。随后进行动物行为学实验，最后取材。
1.步态分析
小鼠步态分析采用Catwalk步态采集，Catwalk步态分析系统主要由含内置荧光灯的玻璃板、玻璃下方的高频摄像头及数据传输转换系统、计算机等硬件设施和自带软件组成。试验过程为:实验动物至少一记录3次顺畅通过玻璃板，而且每次一记录通过至少有10步。当动物顺利通过Catwalk时，小鼠爪印会使玻璃内的荧光灯发出的荧光发生反射，被下方的摄像头捕捉，从而传输到计算机，一记录下来，并行离线或在线处理。Catwalk系统根据每个爪印的位置、大小、压强及不同时间点爪印之间的相互关系，计算出步态的定量及定性参数，从而计算出步态的静态及动态指标。本实验关注Catwalk原始的、定量性爪印指标，包括:步幅(cm，单脚从一次接触玻璃板到下一次接触的距离)，站立时间(s，站立期内爪印与玻璃板接触的时间)，最大接触面积(cm2，爪印与玻璃板的最大接触面积)，行走循环周期(S，站立期与悬空期时间总和)和周期比率。
由图4、图5可知，与MPTP模型组相比，薯蓣皂苷给药组能显著增大小鼠的步幅，同时减少小鼠在通过平台过程中的站立时间，与走完一个循环的时间，并且减少小鼠脚掌与玻璃板的最大接触面积，说明薯蓣皂苷能显著改善PD小鼠的步态变化。
2.小鼠病理学检测
处死动物后，立即取新鲜全脑组织于10％甲醛中浸泡过夜，将脑组织对照脑图谱进行切片包埋进石蜡中制备成蜡块。切5μm薄片，制成空白切片。然后依照组织病理学常规方法进行苏木精和伊红(H&E)。最后将染色切片样本切片放于普通光学显微镜下观察，进行病理学分析。
由图6可知，PD小鼠脑组织中细胞出现坏死，细胞间隙增大，细胞排列不规则炎细胞浸润等，给与薯蓣皂苷后上述症状明显得到缓解。

Claims (3)

1.薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用，其特征在于：将薯蓣皂苷制备成单一化学成分的药物制剂，或与其他药物合用制备成复方药物制剂。
3.根据权利要求1所述的薯蓣皂苷在制备帕金森病保护药物中的应用，其特征在于：薯蓣皂苷在降低6-OHDA诱导的PC12细胞损伤中的应用；薯蓣皂苷在改善脑组织中细胞坏死，细胞间隙增大，细胞排列不规则炎细胞浸润中的应用；薯蓣皂苷在改善MPTP诱导而引起的GFAP，IBA-1表达水平升高中的应用。
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