DE10345386B4

DE10345386B4 - Rekombinante Hefezellen und Verfahren zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung

Info

Publication number: DE10345386B4
Application number: DE2003145386
Authority: DE
Inventors: Gotthard Prof. Dr. Kunze; Kristina Dr. Tag; Klaus Dr. Riedel; Andreas Dr. König; Jörg Prof. Dr. Metzger; Tanja Schultis
Original assignee: LEIBNIZ INST fur PFLANZENGENE; Leibniz-Institut fur Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung; Universitaet Stuttgart
Current assignee: Leibniz Institut Fuer Pflanzengenetik und Kulturpfl; Universitaet Stuttgart
Priority date: 2003-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2009-06-25
Anticipated expiration: 2023-10-01
Also published as: DE10345386A1

Abstract

Rekombinante Hefezellen der Gattung Arxula, umfassend:
ein Expressionsplasmid, enthaltend einen Promotor in funktioneller Verbindung mit einem Östrogenrezeptor-Gen und
ein Reporterplasmid, enthaltend einen induzierbaren Promotor, der mindestens eine ERE-Sequenz umfasst, in funktioneller Verbindung mit einem Fluoreszenzgen oder einem Gen, welches für ein sekretorisches Enzym kodiert, als Reportergen,
wobei der durch das Östrogenrezeptor-Gen kodierte Östrogenrezeptor durch eine Substanz mit östrogener Wirkung transaktiviert wird und an die ERE-Sequenz des Reporterplasmids bindet und so die Expression des Reportergens induziert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Hefezellen sowie Verfahren zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe, wobei die östrogene Wirkung durch Expression eines induzierbaren Fluoreszenz-Reportergens oder eines Gens, welches für ein sekretorische Enzym kodiert, in den Hefezellen angezeigt wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Nachweis-Kit und einen Biosensor, welche die erfindungsgemäßen Hefezellen enthalten, sowie die Verwendung dieser Hefezellen zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe.
Zahlreiche in der jüngsten Vergangenheit durchgeführte Forschungsprojekte haben bestätigt, dass viele Substanzen, die über Kläranlagen in die Oberflächengewässer gelangen, eine östrogene Aktivität aufweisen.
So wurde beispielsweise das Sexualhormon 17β-Östradiol in Kläranlagenabläufen nachgewiesen. Es ist also davon auszugehen, dass diese Stoffe in der Kläranlage nicht vollständig eliminiert werden und folglich in Oberflächengewässer gelangen können. Seit den dreißiger Jahren ist außerdem bekannt, dass nicht-steroidale Chemikalien wie Bisphenol-A ähnlich wirken können wie die körpereigenen weiblichen Sexualhormone des Menschen und aller Wirbeltiere. In den sechziger Jahren wurde die östrogene Aktivität von Organochlorinsektiziden wie Methoxychlor und DDT sowie für einige technische PCB-Mischungen entdeckt. Bis heute ist für mehr als 40 nicht-steroidale Chemikalien eine östrogenartige Wirkung in vitro und zum Teil auch in vivo nachgewiesen. Daneben besitzen auch zahlreiche Pflanzeninhaltsstoffe die Fähigkeit, die Wirkung der weiblichen Sexualhormone nachzuahmen (Phytoöstrogene).
Östrogene Substanzen in der Umwelt lassen sich in natürliche, synthetische und Xenoöstrogene einteilen. Zu den natürlichen Verbindungen zählen endogene Östrogene, von Menschen und Tieren gebildete Steroide (z. B. 17β-Östradiol, Östriol, Östron), Phyto- und Mykoöstrogene sowie von Pflanzen und Pilzen gebildete Verbindungen (Isoflavone). Bei den natürlichen Verbindungen handelt es sich um Östrogene, die für die Reproduktion und damit für die Arterhaltung generell von Bedeutung sind. In die Umwelt gelangen endogene Östrogene in Form von im Körper gebildeten inaktiven Metaboliten (Glucuronide, Sulfate) als konjugierte Ausscheidungsprodukte über den Harn. Dabei beträgt die Menge je nach Zyklusphase der Frau zwischen 25 und 100 μg pro Tag. Während der Schwangerschaft erfolgt dann ein Anstieg auf täglich bis zu 30 mg. Es wird vermutet, dass das Auftreten von freien endogenen Östrogenen in der aquatischen Umwelt von einer Dekonjugation durch Bakterien wie z. B. Escherichia coli herrührt. Aber auch im menschlichen Körper können die Metabolite bereits gespalten und somit in ihre aktive Form zurückgeführt werden. Eine weitere entscheidende Quelle für endogene Östrogene stellt die landwirtschaftliche Tierhaltung von Rindern, Schweinen, Pferden und Schafen dar. Der Eintrag in Grund- und Oberflächengewässer erfolgt durch Ausbringung von Gülle auf Äcker und Felder.
So konnte bei einem Versuch, der die Kläranlagenbedingungen simulieren sollte, der Abbau von 17β-Östradiol innerhalb von einer Woche über das Zwischenprodukt Östron nachgewiesen werden. Im Kläranlagenablauf und in Oberflächengewässern aus Nordrhein-Westfalen und Hessen wurden nur die unwirksameren Metabolite Östron mit einer Maximalkonzentration von 76 ng/l sowie Östriol mit bis zu 42 ng/l gefunden. Zur Feststellung der östrogenen Wirksamkeit dieser Wasserproben wurde der Hefezell-Assay eingesetzt. Die natürlichen Östrogene und allen voran 17β-Östradiol wurden bereits mit nahezu allen bekannten in vivo- und in vitro-Testansätzen auf ihre östrogene Wirksamkeit überprüft. So bestätigten beispielsweise 1998 Studien, dass die in der Umwelt vorkommenden Konzentrationen für eine Induktion der Vitellogeninsynthese bei der männlichen Regenbogenforelle ausreichend hoch sind (1–10 ng/l für 17β-Östradiol). Normalerweise wird Vitellogenin, eine Vorstufe des Eidotterproteins, lediglich von weiblichen, eierlegenden Vertebraten unter dem Einfluss von Östrogenen synthetisiert.
Synthetische Östrogene sind z. B. Kontrazeptiva und Medikamente mit zielgerichteter hormoneller und pharmakologischer Wirkung, die medizinisch bzw. veterinärmedizinisch eingesetzt werden.
Das synthetische Östrogen Ethinylöstradiol (EE2) zeigte in Kläranlagen ein deutlich schlechteres Abbauverhalten als natürliche Östrogene. In einem Experiment konnte gezeigt werden, dass 17β-Östradiol mit einer Anfangskonzentration von 30 ng/l bereits nach 3 Tagen vollständig abgebaut wurde. EE2 dagegen wurde erst nach 28 Tagen zu etwa 80%, Mestranol im gleichen Zeitraum sogar nur zu 20% abgebaut. Letzteres wird durch Abspaltung der Methylfunktion im Phenol-A-Ring in das stabilere EE2 umgewandelt. Es zeigte sich zu dem, dass eine Eliminierung von synthetischen Östrogenen während des Aufbereitungsprozesses in der Kläranlage vor allem durch Adsorption an Klärschlamm stattfindet.
Als Xenoöstrogene bezeichnet man strukturell unterschiedliche, von Menschen erzeugte Chemikalien, welche das Verhalten des weiblichen Geschlechtshormons 17β-Östradiol in Zellen der Zielorganismen nachahmen. In den letzten Jahren wurde verstärkt der Versuch unternommen, die Interaktionen zwischen den verschiedenen östrogen wirkenden Industriechemikalien und den endokrinen Systemen von Mensch und Tier zu untersuchen. Im folgenden werden exemplarisch aus der Literatur bekannte Befunde einiger Xenoöstrogene vorgestellt.
Eisphenol-A (BPA) besitzt zwar eine nur relativ geringe östrogene Aktivität, auf Grund seiner sehr weiten Verbreitung in der Umwelt ist es in diesem Zusammenhang jedoch nicht ohne weiteres vernachlässigbar. So wurden z. B. im Abwasser von Kläranlagenabläufen des Landes Baden-Württemberg 1999 mittlere Gehalte für BPA von 38–126 ng/l gefunden, was auf einen kontinuierlichen Eintrag in das Abwasser schließen lässt.
Fenarimol (a-(2-Chlorphenyl)-a-(4-chlorphynyl)-5-pyrimidinmetanol) wird als prophylaktisch und kurativ wirkendes Blattfungizid eingesetzt. In einer WWF-Studie aus dem Jahr 1997 wird es als Pestizid eingestuft, welches Fortpflanzungsstörungen und Beeinträchtigungen des Hormonsystems verursacht. Nach im Auftrag der Landesanstalt für Umweltschutz Baden-Württemberg 1999/2000 vorgenommenen Untersuchungen erhielt man in Kläranlagenabläufen und Oberflächengewässern 66 positive Fenarimolbefunde mit einem Maximalgehalt von 36,6 μg/l.
Nonylphenolpolyethoxylate (NpnEO) sind zwar selbst weder stark toxisch noch östrogen wirksam, sie werden jedoch beim mikrobiellen Abbau in der Kläranlage zunächst größtenteils zu stabileren und östrogen wirksamen Nonylphenolmonoethoxylaten und -diethoxylaten (NP1EO, NP2EO) abgebaut. Unter anaeroben Bedingungen erfolgt vor allem ein Abbau zu 4-Nonylphenol (4-NP). Die östrogene Wirksamkeit von 4-NP wurde bei Versuchen mit menschlichen Brustkrebszelllinien entdeckt. Alle genannten Substanzen führten bei einer Exposition von 30 μg/l über 3 Wochen bei männlichen Regenbogenforellen zur Induktion der Vitellogenin-Synthese. In Kläranlagenabläufen in Ditzingen (Baden-Württemberg) wurde für NP1EC ein Maximalgehalt von ca. 2,5 μg/l, sowie für 4-NP von ca. 1 μg/l gefunden.
Die östrogene Wirksamkeit von DDT wurde bereits durch zahlreiche in vivo- und in vitro-Testverfahren bestätigt. Auf Grund ihrer geringen Wasserlöslichkeit zeichnen sich Diphenylethane durch eine starke Akkumulationsfähigkeit im Fettgewebe von Tieren und Menschen aus. Ebenso findet eine starke Adsorption an Sediment-, Boden- und Schwebstoffpartikeln statt. Bei Untersuchungen von Rhein, Neckar, Main, Donau und Inn konnten von 1992 bis 1994 keine nennenswerten Konzentrationen von DDT und Derivaten nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu traten bei weiteren Untersuchungen von Elbe, Rhein, Sieg, Wupper, Spree, Elster und Havel vereinzelt positive Befunde mit Spitzenwerten von 1400 ng/l auf, was auf illegale punktuelle Einträge schließen lässt.
Bei Östrogenen handelt es sich um lipophile Hormone. Lipophile Hormone binden reversibel an spezifische Proteine (Carrier), von welchen sie über das Blut zu ihrem Wirkort transportiert werden. Nach Trennung von ihrem Carrier-Protein diffundieren lipophile Östrogene durch die Zellmembran in das Zytoplasma der Zielzelle, wo sie an entsprechende intrazelluläre Hormonrezeptoren (hormonbindende Proteine) binden und ihre physiologische Wirkung auslösen. Intrazelluläre Östrogen-Rezeptoren wirken direkt auf die Transkription, d. h. auf die Kontrolle der Genaktivität. Durch die Bindung des Hormonmoleküls an seinen Rezeptor und die anschließende Dimerisierung des Rezeptor-Hormon-Komplexes wird der Rezeptor transaktiviert, d. h. seine Affinität zu einer spezifischen DNA-Sequenz wird erhöht. Diese DNA-Sequenzen, die man estrogene response elements (ERE) nennt, bestehen aus punktsymmetrischen DNA-Segmenten (Palindromen), die als Verstärkerelemente die Transkription und somit die Neusynthese von Proteinen regulieren.
Die typischen östrogenen Wirkungen von natürlichen Östrogenen wie 17β-Ostradiol und seinen Abbauprodukten Östron und Östriol werden auf den klassischen Östrogenrezeptor ERα (estrogen receptor α) zurückgeführt. Während ERα in den typischen Östrogen-Zielorganen, vor allem der Uteruszelle vorkommt, findet sich der zweite bekannte Östrogenrezeptor, ERβ (estrogen receptor β), auch in Prostata, Hoden und Eierstöcken sowie in eini gen Teilen des Gehirns. Beide Rezeptortypen weisen eine hochgradige Homologie hinsichtlich ihrer DNA- und Liganden-bindenden Domänen auf. Auch in Bezug auf die Bindungseigenschaften zu ihrer DNA-Erkennungssequenz (ERE), die Dimerisierung der Rezeptormonomere sowie die Affinität zu natürlichem 17β-Östradiol verhalten sie sich sehr ähnlich. Mittlerweile gibt es aber Hinweise auf unterschiedliche Funktionen der beiden Rezeptoren. So zeigt ERβ beispielsweise eine erhöhte Bindungsaffinität zu den Phytoöstrogenen Coumestroll und Genistein sowie zu dem Xenoöstrogen Eisphenol-A, während die Bindungsaffinität zu Diethylstilbestrol geringer ist als bei ERα. Vermutlich spielen Sequenzunterschiede in der aminoterminalen Region von ERα und ERβ hierbei eine entscheidende Rolle.
Die relative Wirkpotenz von östrogenen Substanzen lässt sich prinzipiell aus Ergebnissen von in vitro- und in vivo-Tests abgeleiten. Alle Ansätze zur Bestimmung der östrogenen Wirkung basieren auf einer quantitativen Erfassung der Interaktion der Wirksubstanzen mit den jeweiligen zellulären bzw. subzellulären Zellstrukturen.
In vivo-Testverfahren zur Erfassung östrogener Effekte werden mit Säugetieren, Vögeln, Reptilien und Fischen durchgeführt; dabei werden unter anderem Veränderungen der Vagina, des Uterus und der Ovarien untersucht. Solche in vivo-Tests haben eine sehr hohe Aussagekraft, da sie die Reaktion des gesamten Organismus auf Umwelteinflüsse erfassen. Nachteilig sind jedoch die lange Testdauer, die erforderliche apparative Ausstattung und der hohe Arbeitsaufwand. Die naturgemäß starke Streuung der Messergebnisse durch den Unterschied zwischen den einzelnen Testtieren erschwert zudem eine präzise Interpretation der Ergebnisse.
Bei in vitro-Testansätzen handelt es sich dagegen um suborganismische Testverfahren; sie verwenden subzelluläre und zelluläre Systeme und stellen meist die schnellere und kostengünstigere Variante zur Bestimmung der östrogenen Aktivität von Substanzen dar.
Der ELRA-Test (enzyme-linked receptor assay) zählt zu den einfachsten und mit einer Versuchsdauer von wenigen Stunden auch zu den schnellsten subzellulären Testsystemen. Er basiert auf dem Prinzip des indirekten kompetitiven Enzymimmunoassays (ELISA). Dazu wird 17β-Östradiol mit Hilfe von BSA auf einem Träger immobilisiert und in einem ersten Schritt Östrogenrezeptoren eingesetzt. Die östrogenwirkenden Substanzen in der Probe konkurrieren dann mit dem immobilisierten 17β-Östradiol um die freien Bindungsstellen des in Lösung befindlichen Östrogenrezeptors. Schließlich wird über zwei Antikörperschritte die Menge an Rezeptor quantifiziert, die am immobilisierten Beschichtungskonjugat gebunden bleibt. Folglich verhält sich die Menge des nachgewiesenen Rezeptors umgekehrt proportional zur Menge der östrogen wirkenden Substanz.
Noch schneller ist der Nachweis des Östrogenrezeptor mittels Fluoreszenzpolarisation. Sie ermöglicht eine direkte Messung von östrogen wirkenden Substanzen sogar bei Anwesenheit von freien Liganden. Im Gegensatz zum ELRA-Test ist eine Abtrennung der ungebundenen Liganden vor der Messung dazu nicht mehr notwendig. Gemessen wird die Fähigkeit einer östrogen wirkenden Substanz, den fluoreszierenden Liganden durch Bindung an den Östrogenrezeptor aus dem Rezeptor-Liganden-Komplex zu verdrängen. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt in seiner geringeren Sensitivität. Das Bindungsassay mittels Fluoreszenzpolarisation weist im Vergleich mit den übrigen zur Verfügung stehenden in vitro-Verfahren die geringste Sensitivität auf.
Ein genereller Vorteil von zellgebundenen gegenüber den oben beschriebenen subzellulären (zellfreien) in vitro-Verfahren liegt darin, dass sie zusätzlich biologische Vorgänge wie beispielsweise die Membrandiffusion berücksichtigen.
Im sogenannten E-Screen (estrogen screen) Assay wird die Zunahme der Proliferationsrate menschlicher Krebszellen erfasst, welche aufgrund östrogener Einflüsse verursacht wird. Dazu werden spezielle, durch Subklonierung entstandene MCF-7-Subzelllinien verwendet, bei denen die Proliferation inhibiert ist. Durch Zugabe von Östrogenen kann diese Hemmung aufgehoben werden. Die zur Verfügung stehenden Sublinien haben jedoch im Laufe der Zeit in zahlreichen Labors unter unterschiedlichsten Selektionsbedingungen ihre biologischen Charakteristika, d. h. auch ihre östrogene Sensitivität, verändert. Ein direkter Vergleich zwischen den experimentellen Ergebnissen aus unterschiedlichen Laboren ist somit nur bedingt möglich. Darüber hinaus sind diese Tests sehr zeitaufwendig und stellen hohe Ansprüche an das Personal.
Ein weiteres, zellgebundenes Verfahren steht mit dem Hefezell-Assay (yeast screen assay, YSE) zur Verfügung. Bei der bislang angewendeten Form des Hefezell-Assays werden re kombinante Stämme von Saccharomyces cerevisiae eingesetzt, welche das Gen für den menschlichen Östrogenrezeptor auf einen Expressionsplasmid tragen. Auf einem Reporterplasmid besitzen die Hefestämme eine Erkennungssequenz für den östrogenen Rezeptor, kombiniert mit einem Gen für das Enzym β-Galactosidase (lacZ-Gen). Bindet eine östrogen wirksame Substanz an den Hormonrezeptor, werden die Rezeptormoleküle transaktiviert, so dass diese als Komplex an die auf dem Reporterplasmid lokalisierte DNA-Erkennungssequenz binden können. Dies hat die Expression des lacZ-Gens und damit die Synthese von β-Galactosidase zur Folge. Es gibt Hefezell-Assays, bei denen die Hefezellen das Reportergenprodukt β-Galactosidase direkt aus der Zelle ausschleusen können, sofern die Inkubationsdauer der Versuchsansätze ausreichend lang ist (ca. 4 Tage). Für andere Assays werden Hefezellen verwendet, bei denen die β-Galactosidasemoleküle zunächst aus dem Zellinnern durch Zellaufschluss freigesetzt werden müssen (Dauer ca. 1 Tag). Bei beiden Methoden erfolgt die Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität nach Zugabe weiterer, farbgebender Reagenzien photometrisch und dient als Maß für die östrogene Aktivität der Testsubstanzen. Genau wie beim ELRA-Test und der Fluoreszenzpolarisation werden für die Erfassung östrogener Substanzen mit S. cerevisiae Mikrotiterplatten-fähige optische Messinstrumente eingesetzt. Die Vorteile der Mikrotiterplatten-Leser liegen darin, dass diese Geräte im Vergleich zu mit Einzelküvetten ausgestatteten Photometern eine erhebliche Beschleunigung des Messvorgangs und eine Erhöhung des Probendurchsatzes ermöglichen, bei gleichzeitiger Verringerung des Probenvolumens und des Reagenzienverbrauchs. Dennoch ist die gesamte Prozedur durch die lange Inkubationszeit (4 Tage) bzw. den erforderlichen Zellausschluss vergleichbar langwierig und aufwendig.
Die von den verschiedenen Autoren ermittelten Testmittelpunkte IC50 für Östradiolstandards liegen bei der Verwendung von Hefezell-Assays übereinstimmend in einer Größenordnung von 1 nmol/l, was einer Konzentration von ca. 200–300 ng/l entspricht. Die Sensitivität des herkömmlichen Hefezell-Assays ist somit vergleichbar mit der des E-Screen-Assays. Mit dem ELRA-Test wurden ähnliche Untersuchungsergebnisse erzielt. Der Bindungsassay mittels Fluoreszenzpolarisation dagegen hat wie oben erwähnt zwar den Vorteil, der in diesem Zusammenhang einfachste und am schnellsten durchführbare Test zu sein, er ist jedoch auch am wenigsten sensitiv.
Es wäre insbesondere im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung der Analyse sowohl von Oberflächengewässern als auch Abwässern auf den Gehalt an Substanzen mit östrogener Wirkung, aber auch unter ökonomischen Gesichtspunkten wünschenswert, ein zellgebundenes in vitro-Verfahren einzusetzen, welches schnell und einfach durchführbar ist.
Da die Medianwerte für Östradiol in deutschen Gewässern im einstelligen ng/l-Bereich liegen, sollten die Verfahren neben einer verbesserten Praktikabilität darüber hinaus ähnlich sensitiv sein wie die im Stand der Technik bekannten Assays, möglichst sogar sensitiver.
Für den Einsatz in der Abwasser-Analyse wäre weiterhin vorteilhaft, wenn die in dem Verfahren verwendeten Organismen auch unter extremen Salz- und Temperaturbedingungen noch ausreichend leistungsfähig und sensitiv wären, um zuverlässige Aussagen über das östrogene Potential von Umweltproben zu liefern.
Der vorliegenden Erfindung liegt demnach das technische Problem zugrunde, ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung zu ermöglichen.
Dieses Problem wird erfindungsgemäß durch rekombinante Hefezellen gelöst, enthaltend:
ein Expressionsplasmid, enthaltend einen Promotor in funktioneller Verbindung mit einem Östrogenrezeptor-Gen und
ein Reporterplasmid, enthaltend einen induzierbaren Promotor, der mindestens eine ERE-Sequenz umfasst, in funktioneller Verbindung mit einem Fluoreszenzgen oder einem Gen, welches für ein sekretorisches Enzym kodiert, als Reportergen,
wobei der durch das Östrogenrezeptor-Gen kodierte Östrogenrezeptor durch eine Substanz mit östrogener Wirkung transaktiviert wird und an die ERE-Sequenz des Reporterplasmids bindet und so die Expression des Reportergens induziert.
Die Art des Nachweises entspricht folglich einem ähnlichen Prinzip, wie es dem herkömmlichen Hefezell-Assay zugrunde liegt. Das erfindungsgemäße Reporterplasmid weist jedoch wesentlich verbesserte Eigenschaften auf. Zunächst enthält es anstelle des herkömmlich verwendeten lacZ-Gens ein Fluoreszenzgen oder ein Gen, welches für ein sekretorisches Enzym kodiert, als Reportergen. Der Terminus „Fluoreszenzgen" bedeutet hierbei, dass das Gen für ein fluoreszierendes Protein kodiert. Die Verwendung eines fluoreszierenden Proteins als Reportergenprodukt hat zahlreiche Vorteile. Da weder ein Zellaufschluss zur Freisetzung des fluoreszierenden Proteins, noch eine langwierige Inkubationszeit notwendig ist, kann die Expression des Reportergens in den erfindungsgemäßen Hefezellen wesentlich einfacher und schneller nachgewiesen werden. Die Messung der Fluoreszenz kann direkt, d. h. intrazellulär erfolgen. Wird ein Gen, welches für ein sekretorisches Enzym kodiert, als Reportergen verwendet, kann das sezernierte Reportergenprodukt innerhalb weniger Minuten (z. B. Glucoamylase nach ca. 10 min, Wartmann et al. 2000) im Medium nachgewiesen werden. Die sekretorischen Proteine werden dabei über den Sekretionsweg der Zelle (ER-Golgi – cytoplasmatische Membran-Kultivierungsmedium) nach außen transportiert. Dazu befindet sich am 5'-Ende des Gens eine zur Sekretion benötigte Signalsequenz, die ein Signalpeptid kodiert, welches für das Einschleusen des Proteins ins ER verantwortlich ist (Bui et al., 1996). Ein Aufschluss der Zellen zur Freisetzung des Genproduktes oder eine langwierige Inkubationszeit entfallen.
Weiterhin ist das Reportergen induzierbar, das bedeutet, die Expression des Reportergens wird durch die Anwesenheit einer östrogen wirksamen Substanz spezifisch aktiviert.
In der folgenden Beschreibung werden die Begriffe „Substanz mit östrogener Wirkung", "östrogen wirksame Substanz", „östrogen artige Substanz" und „östrogen aktive Substanz" analog verwendet und beschreiben Substanzen, welche in den Hormonhaushalt von Lebewesen eingreifen.
Der Begriff „Gen" bezeichnet einen DNA-Abschnitt, welcher für ein Protein oder Peptid kodiert. Das Merkmal „in funktioneller Verbindung" weist darauf hin, dass die einzelnen Komponenten, d. h. das Rezeptor- bzw. Reportergen und ihre Regulationselemente, als Expressionskassetten jeweils aufeinander abgestimmt sind, so dass z. B. die Expression des Rezeptor- bzw. Reporterproteins unter der Kontrolle des funktionell verbundenen Promotors optimiert werden kann.
Das „Expressionsplasmid" dient der Expression eines Östrogenrezeptor-Gens. Der dem Rezeptorgen vorgeschaltete Promotor ist dabei vorzugsweise ein starker konstitutiver Promotor. Besonders bevorzugte Promotoren sind TEF, AHSB4 und ARFC3 (Rösel et al., 1995; Stoltenburg et al., 1999; Wartmann et al., in press). Das „Reporterplasmid" enthält das Reportergen. Beide Plasmide verfügen weiterhin über entsprechende wirtsspezifische Replikatoren und Selektionsmarker (z. B. Auxotrophiemarker oder Resistenzmarker, s. Tab. 1).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als induzierbarer Promotor ein GAA (Glucoamylase)-Promotor verwendet (Bui et al., 1996). Ein besonders bevorzugter GAA-Promotor stammt aus dem Hefestamm Arxula adeninivorans LS3. Bei dem GAA-Promotor handelt es sich um einen regulierbaren Promotor, der in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle aktiviert bzw. inhibiert wird. Dient als Kohlenstoffquelle z. B. Maltose oder Stärke, liegt der Promotor in seiner aktiven Form vor. Wird jedoch Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet, ist der Promotor fast vollständig reprimiert. Der GAA-Promotor zeichnet sich durch eine sehr starke Aktivität nach seiner Induktion durch Maltose und Stärke aus.
Ein weiterer bevorzugter induzierbarer Promotor ist ein AXDH (A. adeninvorans Xylitoldehydrogenase) Promotor ( PCT/EP01/05225 ). Prinzipiell ist jedoch jeder induzierbare Promotor geeignet.
Erfindungsgemäß weist der Promotor mindestens eine ERE-Sequenz auf. Als ERE-Sequenz (engl.: estrogene response element) werden DNA-Sequenzen bezeichnet, die aus palindromischen DNA-Segmenten bestehen und als Bindungsstelle für den Östrogenrezeptor-Ligand-Komplex dienen. Als Verstärkerelemente regulieren sie die Transkription und somit die Neusynthese von Proteinen.
Die ERE-Sequenz(en) wird bzw. werden derart in den Promotor integriert, dass die Sequenz in der α-Helix nach außen zeigt und so für den Östrogenrezeptor erreichbar ist. Bevorzugte Integrationsstellen z. B. für den GAA-Promotor sind die Positionen um –107, –150 und –203 der SEQ. ID Nr. 1, besonders bevorzugt ist die Position um –107.
Vorzugsweise werden die rekombinanten Hefezellen, welche den GAA-Promotor als induzierbaren Promotor enthalten, in Hefeminimalmedium (HMM) mit Glucose kultiviert. Da der GAA-Promotor bei Verwendung von Glucose als alleiniger Kohlenstoffquelle normalerweise reprimiert ist, erfolgt seine Aktivierung über die Bindung des durch östrogen wirksame Substanzen modifizierten Östrogenrezeptors an die ERE-Sequenz hochspezifisch und selektiv. Die Expression des nachgeschalteten Reportergenes erfolgt demnach ausschließlich in Abhängigkeit von der Konzentration östrogenartiger Substanzen in dem Medium.
Weiterhin enthält der GAA-Promotor vorzugsweise zwei ERE-Sequenzen. Durch Integration einer zweiten ERE-Sequenz wird die Promotoraktivität maximiert. Die Integration der beiden ERE-Sequenzen erfolgt vorzugsweise an den Positionen –107, –150 und –203 der SEQ. ID Nr. 1, besonders bevorzugt ist Position –107. Die resultierende Sequenz ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt (s. auch 6).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Hefezellen Hefen der Gattung Arxula, besonders bevorzugt ist Arxula adeninivorans.
Die Gattung Arxula zeichnet sich dadurch aus, dass sie besonders robust ist. Salzkonzentrationen bis zu 20% sowie Temperaturen von bis zu 48°C verträgt sie schadlos. Die Hefe ist entsprechend auch unter vergleichbar extremen Salz- und Temperaturbedingungen noch ausreichend leistungsfähig und sensitiv, um zuverlässige Aussagen über das östrogene Potential von Umweltproben zu liefern.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Östrogenrezeptor-Gen human, besonders bevorzugt sind die humanen Östrogenrezeptor-Gene hERα und hERβ (Kuiper et al. 1997, Mosselman et al. 1996). Die bisher bekannten humanen Östrogenrezeptor-Gene hERα und hERβ unterscheiden sich in ihren Bindungsaffinitäten gegenüber bestimmten östrogen wirkenden Substanzen (siehe oben). Die zusätzliche Verwendung von hERβ verbessert daher den Nachweis bestimmter Substanzen oder ermöglicht ihn erstmals. Das Spektrum der nachweisbaren Substanzen kann somit entscheidend erweitert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das als Reportergen verwendete Fluoreszenzgen ausgewählt aus der Gruppe, welche die für GFP, EYFP und DsRed kodierenden Gene umfasst. GFP (green fluorescent Protein) und EYFP (enhanced yellow fluorescent Protein) stammen aus einer Qualle und DsRed (red fluorescent Protein) aus einer Koralle (Chalfie et al. 1994, www.bdbiosciences.com/clontech, Gurskaya et al. 2001). Die Reportergene können von BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, bezogen werden. Die genannten fluoreszierenden Proteine unterscheiden sich in ihrem Emissions- und Extinktionsverhalten.
Besonders bevorzugt ist das für DsRed kodierende Gen, da langwelliges Licht absorbierendes DsRed-Protein in seinem Emissions- und Extinktionsspektrum am weitesten von dem Bereich entfernt ist, in dem auch Vitamine wie Riboflavin detektierbar sind. Somit ist gewährleistet, dass die Detektion der östrogen wirksamen Substanzen spezifisch erfolgt.
Bei dem als Reportergen verwendeten Gen, welches für ein sekretorisches Enzym kodiert, handelt es sich vorzugsweise um Phytase-Gene; besonders bevorzugt sind Phytase-Gene aus Aspergillus-Arten bzw. aus Arxula adeninivorans (Mayer et al. 1999, Sano et al. 1999). Weiterhin können Glucoamylasen, Glucanasen und Xylosidasen als sekretorische Enzyme eingesetzt werden, indem die entsprechenden Gene als Reportergene verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe, welches die folgenden Schritte umfasst:

– Inkubieren der erfindungsgemäßen Hefezellen mit der zu untersuchenden Probe, und
– Bestimmen der Fluoreszenz-Emission oder der Aktivität des sekretorischen Enzyms (für Assays siehe Mayer et al. 1999, Sano et al. 1999).

Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von dem herkömmlichen Hefezell-Assay, welches lacZ als Reportergen verwendet, insofern als dass weder der zusätzliche Schritt zur Freisetzung des Reportergenproduktes durch Zellaufschluss noch eine langwierige Inkubationszeit notwendig sind. Der Nachweis östrogen wirksamer Substanzen erfolgt schnell und unkompliziert. Gegenüber dem herkömmlichen Hefezell-Assay ergibt sich eine wesentliche Zeitersparnis. Ferner ist die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weniger arbeitsintensiv.
Um einen möglichst hohen Probendurchsatz bei geringem Probenvolumen und Reagenzienverbrauch zu ermöglichen, werden vorzugsweise Mikrotiterplatten verwendet. Die Fluoreszenzmessung bzw. die Messung der Enzymaktivität kann mit Hilfe von speziellen Lese geräten (Microtiter-Reader) erfolgen. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt direkt, also intrazellulär. Der Einsatz zusätzlicher, farbgebender Substanzen entfällt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist demnach nicht nur schneller und kostengünstiger, sondern auch umweltfreundlicher, da weniger Chemikalien notwendig sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in dem Verfahren eingesetzten erfindungsgemäßen Hefezellen frisch kultiviert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden in dem Verfahren konservierte Hefezellen eingesetzt. Besonders bevorzugt sind lyophilisierte Hefezellen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die in dem Verfahren eingesetzten Hefezellen immobilisiert. Die Immobilisierung kann dabei z. B. mit PVA (Polyvinylalkohol), PU (Polyuretan) oder PCS (Poly(carbamoyl)sulfonat) erfolgen.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe, umfassend:

– erfindungsgemäße Hefezellen und
– Detektions- und Kontrollsubstanzen.

Als Kontrollsubstanz kann u. a. eine östrogen wirksame Referenzsubstanz in dem Kit enthalten sein. Die Art der Detektionssubstanz wird abhängig von dem verwendeten Enzym gewählt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Biosensor zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe, umfassend:

– die erfindungsgemäßen Hefezellen und
– einen Transducer.

Der Begriff „Biosensor" bezeichnet einen Aufbau, in dem eine biologische Komponente (hier die erfindungsgemäßen Hefezellen) unmittelbar mit einem Signalwandler, d. h. einem Transducer, verbunden ist. „Biosensoren" wandeln die biochemische Information eines Substrates in ein physikalisch quantifizierbares Signal um, wobei durch die Wechselwirkung eines Analyten mit der Biokomponente resultierende physikalische oder physikochemische Veränderungen durch einen Transducer meist in elektrische Signale umgewandelt werden. Als Transducer kommen u. a. für Licht die Optrode, für elektroaktive Substanzen amperometri sche oder potentiometrische Substanzen, für Wärme der Thermistor und für Masse der Piezokristall in Betracht (Riedel et al. 2003).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Transducer ein optischer Transducer. Derartige Transducer beruhen auf der Erfassung von Veränderungen optischer Eigenschaften, wie beispielsweise der Fluoreszenz.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein elektrochemischer Transducer eingesetzt, der Veränderungen elektroaktiver Substanzen (z. B. des Produktes, welches bei der Reaktion des sekretorischen Enzyms entsteht) erfasst.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Hefezellen gemäß der Erfindung zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe. Dies können beispielsweise Proben von Oberflächengewässern, aber auch von Abwässern, speziell aus der Industrie und Landwirtschaft, sein.
Die nachfolgenden Figuren und Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
Figuren
1: Konstruktion von A. adeniniviorans G1211/pAL-ALEU2m-hERα. Dazu wurde das mit AccIII linearisierte Plasmid pAL-ALEU2m-hERα in A. adeninivorans G1211 transformiert. Die rekombinanten Hefezellen integrieren dieses Plasmid in ihre chromosomale 25S rDNA Region.
2: Nachweis von rekombinantem hERα in A. adeninivorans G1211/pAL-ALEU2m-hERα. Dazu wurde A. adeninivorans G1211 (1), G1211/pAL-ALEU2m-hERα (2, 3, 5) und G1211/pAL-ALEU2m (4) für 48 h in Hefeminimalmedium (HMM) mit 2% Glucose kultiviert, die Zellen vom Kultivierungsmedium getrennt und das intrazellulär lokalisierte hERα mittels Westernblot Analysen detektiert. Als Antikörper wurde ein käuflicher anti-hERα Antikörper eingesetzt.
3: Restriktions- und Genkarten der Plasmide pYES2-GFP und pYES2- DsRed.
4: GFP- bzw. DsRed-Fluoreszenz von rekombinanten S. cerevisiae Stämmen. Dazu wurden S. cerevisiae SEY6210/pYES2-GFP und SEY6210/pYES2-DsRed in SD-Medium mit Galactose als C-Quelle kultiviert und auf Fluoreszenz analysiert.
5: Schematische Darstellung des Einbaus der ERE-Regionen in den GAA-Promotor.
6: DNA-Sequenz des GAA-107-ERE-ERE-Promoters mit zwei ERE-Regionen an Position –107 (unterstrichen). Vgl. SEQ ID Nr. 2.
7: Gen- und Restriktionskarten der Plasmide pAL-HPH-GAA-Ds-Red, pAL-HPH-GAA-107-ERE-Ds-Red, pAL-HPH-GAA-107-ERE-ERE-Ds-Red und pAL-HPH-GAA-107-ERE-ERE-ERE-Ds-Red.
8: Gen- und Restriktionskarten der Plasmide pAL-HPH-GAA-150-ERE-Ds-Red, pAL-HPH-GAA-150-ERE-ERE-Ds-Red und pAL-HPH-GAA-150-ERE-ERE-ERE-Ds-Red.
9: Gen- und Restriktionskarten der Plasmide pAL-HPH-GAA-203-ERE-Ds-Red, pAL-HPH-GAA-203-ERE-ERE-Ds-Red und pAL-HPH-GAA-203-ERE-ERE-ERE-Ds-Red.
10: Fluoreszenzanalyse von A. adeninivorans G1211/pAL-ALEU2m-hERα-pAL-HPH-GAA-107-ERE-DsRed und A. adeninivorans G1211/pAL-HPH-GAA-107-ERE-DsRed. Dazu wurden die rekombinanten Hefen 48 h in HMM + 2% Glucose kultiviert und anschließend auf HMM + 2% Glucose (G), HMM + 2% Maltose (M) bzw. HMM + 2% Glucose + 500 μg/l 17β-Estradiol (E) überführt, alles für weitere 24 h kultiviert und anschließend mikroskopisch analysiert.
Beispiele
Selektionsmarker

Die im folgenden aufgeführten Gene können als Selektionsmarker für das Expressionsplasmid bzw. Reporterplasmid verwendet werden.

Marker	Funktion	Quelle	Literatur
hph Gen	Resistenzgen; Hygromycin B-Resistenz	E. coli	Rösel & Kunze, 1998
ALEU2 Gen	Auxotrophiemarker; komplementiert aleu2-Mutation von A. adeninivorans	A. adeninivorans	Wartmann et al., 2003
ATRP1 Gen	Auxotrophiemarker; komplementiert atrp1-Mutation von A. adeninivorans	A. adeninivorans	PCT/EP01/05225

Tab. 1: Beispiele für Selektionsmarker

Expression des Rezeptorgens in A. adeninivorans
1. Konstruktion eines Expressionsplasmids
Um das Gen für den humanen Östrogenrezeptor α (hERα) in A. adeninivorans zu exprimieren, wurde das entsprechende Genfragment mit geeigneten Regulationssequenzen flankiert und in ein Arxula-Expressionsplasmid (z. B. pAL-ALEU2m oder pAL-HPH1; Rösel et al., 1998; Wartmann et al., 2003) eingebaut. Um das Vorliegen des Rezeptors in der rekombinanten Hefe in möglichst hohen Konzentrationen zu erreichen, wurde das hERα-Gen zwischen dem aus A. adeninivorans stammenden TEF-Promotor und dem PHO5-Terminator (Wartmann et al., 2003) eingebaut. Die dabei erhaltene Expressionskassette mit TEF-Promotor–hERα-Gen–PHO5-Terminator wird in Arxula konstitutiv exprimiert, da es sich bei dem TEF-Promotor um einen sehr starken konstitutiven Promotor handelt. Nach Integration der Expressionskassette in das Arxula-Basisplasmid pAL-ALEU2m und Transformation des daraus resultierenden Plasmides pAL-ALEU2m-hERα in A. adeninivorans G1211 [aleu2] ließ sich eine rekombinante Hefe erhalten, die dieses Plasmid und damit die Expressionskassette in ihre chromosomale DNA, speziell in die 25S rDNA integriert hat (1).
2. Westernblot-Analyse
Mit Hilfe von Westernblot-Analysen unter Nutzung von anti-hERα-Antikörpern wurde die Bildung von hERα in den rekombinanten Arxula adeninivorans Stämmen überprüft. Im Gegensatz zu den Kontrollstämmen ohne hERα-Expressionskassette ließ sich das rekombinante Protein in A. adeninivorans G1211/pAL-ALEU2m-hERα nachweisen. Dabei wird die hERα-Akkumulation weder von der C-Quelle des Kultivierungsmediums noch von der Kultivierungstemperatur beeinflusst, was die konstitutive Expression der TEF-Promotor-hERα-Gen–PHO5-Terminator Kassette bestätigt (2).
Expression des Reportergens in A. adeninivorans
1. Auswahl des für den Hefe-Assay am besten geeigneten Fluoreszenz-Reportergens in S. cerevisiae
Voraussetzung des auf der Fluoreszenz basierenden Hefezell-Assays ist, dass die Fluoreszenzmessung nicht durch andere Stoffe wie Riboflavin beeinflusst wird. Um das für den Assay optimale Gen zu ermitteln, wurden daher mit den Genen GFP DsRed und EYFP drei Kandidatengene ausgewählt, deren fluoreszierende Genprodukte sich im Emissions- und Extinktionsverhalten unterscheiden.
Zunächst wurde das Fluoreszenzverhalten der rekombinanten Proteine im S. cerevisiae System geprüft. Zu diesem Zweck wurden die Gene GFP, DsRed und EYFP in das S. cerevisiae Plasmid pYES2 zwischen den aus S. cerevisiae stammenden GAL1-Promotor und den aus der gleichen Hefe stammenden CYC1-Terminator integriert und die resultierenden Plasmide pYES2-GFP, pYES2-DsRed und pYES2-EYFP als zirkuläre Plasmide in S. cerevisiae SEY6210 transformiert (3). Die dabei erhaltenen rekombinanten Hefezellen wurden anschließend auf ihre Fluoreszenz untersucht. Dazu wurden die Zellen in SD-Medium (Synthetic Dextrose Minimalmedium) mit Galactose als Kohlenstoff-Quelle kultiviert, geerntet und mikroskopisch analysiert. Im Gegensatz zu den auf Glucose-Medium kultivierten Stämmen, weisen die in Galactose-Medium kultivierten Zellen eine Fluoreszenz auf, die mikroskopisch detektierbar ist. Dabei kann bereits im Fluoreszenzmikroskop zwischen den einzelnen Genprodukten unterschieden werden. So fluoresziert z. B. das GFP im grünen und das DsRed-Protein im roten Bereich (4).
Da zwischen den rekombinanten Hefestämmen in der mittels Mikroskop detektierbaren Fluoreszenzintensität keine Unterschiede nachweisbar waren und das DsRed-Protein in seinem Emissions- und Extinktionsspektrum am weitesten von dem Bereich entfernt ist, in dem auch Vitamine wie Riboflavin detektierbar sind (4), wurde für den Hefezell-Assay das DsRed-Gen als Reportergen ausgewählt.
2. Konstruktion des Reporterplasmides, Integration von ERE-Sequenzen in den GAA-Promotor
Durch Insertion von ERE-Sequenz(en) wurde der GAA-Promotor so modifiziert, dass in A. adeninivorans in Glucose-HMM durch Östrogen eine spezifische Promotoraktivität erfolgt.
Zunächst wurden mit Hilfe der SOE-PCR (Horton et al., 1989) ERE-Sequenzen in die unterschiedlichen Positionen (–107, –150 und –203) des GAA-Promotors integriert, um zu gewährleisten, dass mindestens eines dieser Elemente in der α-Helix nach außen zeigt und so für den Östrogenrezeptor erreichbar ist (5); SEQ Nr. 1.
Außerdem wurden GAA-Promotoren mit mehreren ERE-Sequenzen konstruiert. Auch hierzu wurde die SOE-PCR genutzt (6).
3. Konstruktion von rekombinanten A. adeninivorans Stämmen mit Östrogen-Rezeptor (Expressionsplasmid) und DsRed-Expressionskassette (Reporterplasmid)
Die Expressionskassetten GAA-Promotor-DsRed-Gen–PHO5-Terminator, GAA-107-ERE-Prσmotor–DsRed-Gen–PHO5-Terminator, GAA-107-ERE-ERE-Promotor–DsRed-Gen-PHO5-Terminator, GAA-107-ERE-ERE-ERE-Promotor–DsRed-Gen–PHO5-Terminator, GAA-150-ERE-Promotor–DsRed-Gen–PHO5-Terminator, GAA-150-ERE-ERE-Promotor-DsRed-Gen–PHO5-Terminator, GAA-150-ERE-ERE-ERE-Promotor–DsRed-Gen–PHO5-Terminator, GAA-203-ERE-Promotor-DsRed-Gen–PHO5-Terminator, GAA-203-ERE-ERE-Promotor–DsRed-Gen–PHO5-Terminator und GAA-203-ERE-ERE-ERE-Promotor-DsRed-Gen–PHO5-Terminator wurden in das Arxula-Plasmid pAL-HPH1 integriert und die dabei erhaltenen Plasmide pAL-HPH-GAA-DsRed, pAL-HPH-GAA-107-ERE-DsRed, pAL-HPH-GAA-107-ERE-ERE-DsRed, pAL-HPH-GAA-107-ERE-ERE-ERE-DsRed, pAL-HPH-GAA-150-ERE-DsRed, pAL-HPH-GAA-150-ERE-ERE-DsRed, pAL-HPH-GAA-150-ERE-ERE-ERE-DsRed, pAL-HPH-GAA-203-ERE-DsRed, pAL-HPH-GAA-203-ERE-ERE-DsRed und pAL-HPH-GAA-203-ERE-ERE-ERE-DsRed in A. adeninivorans G1211/pAL-ALEU2m-hERα transformiert (7–9)
Die Transformanten A. adeninivorans G1211/pAL-ALEU2m-hERα–pAL-HPH-GAA-DsRed und G1211/pAL-ALEU2m-hERα–pAL-HPH-GAA-107-ERE-DsRed und G1211/pAL-ALEU2m-hERα–pAL-HPH-GAA-107-ERE-ERE-DsRed wurden mittels eines modifizierten Hefezell-Assays auf ihre Eignung zum Nachweis von Östrogen getestet. Dazu wurden als Kontrollstämme zusätzlich der Ausgangsstamm A. adeninivorans G1211 ohne Plasmide sowie G1211/pAL-HPH-GAA-DsRed mit DsRed-Expressionskassette, jedoch ohne Östrogen-Rezeptor-Kassette, eingesetzt.

Der Nachweis der Expression des DsRed-Gens erfolgte mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. Dazu wurden alle rekombinanten Stämme einschließlich der Kontrollstämme bis zu 72 h in HMM + 2% Glucose, HMM + 2% Maltose und HMM + 2% Glucose + 500 μg/l 17β-Östradiol kultiviert und die Fluoreszenz mikroskopisch detektiert. Wird ein HMM + 2% Glucose verwendet, so lassen sich bei keinem der zu analysierenden Stämme fluoreszierende Zellen finden. Wird dagegen HMM mit 2% Maltose genutzt, so fluoreszieren all die rekombinanten Stämme, die eine GAA-Promotor-DsRed-Gen Kassette enthalten. Die Expression dieser Kassette wird dabei weder von der im Promotor integrierten ERE-Sequenz, noch vom Vorhandensein der TEF-Promotor-hERα-Gen Kassette beeinflusst. Anders bei der Verwendung von HMM + 2% Glucose + 500 μg/l 17β-Östradiol: Hier fluoreszieren nur die Zellen, die beide Expressionskassetten enthalten (10, Tab. 2).

	HMM + 2% Glucose	HMM + 2% Maltose	HMM + 2% Glucose + 500 μg/l Östradiol
G1211/pAL-ALEU2m-hERα pAL-HPH-GAA-DsRed	–	+	–
G1211/pAL-ALEU2m-hERα pAL-HPH-GAA-107-ERE-ERE-DsRed	–	+	+
G1211	–	–	–
G1211/pAL-HPH-GAA-DsRed	–	+	–

Tab. 2: Expression des DsRed-Gens unter unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen in rekombinanten Stämmen von A. adeninivorans, welche mit verschiedenen Plasmiden bzw. Plasmidkombinationen transformiert wurden.

Literatur

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SEQUENCE LISTING

Claims

Rekombinante Hefezellen der Gattung Arxula, umfassend: ein Expressionsplasmid, enthaltend einen Promotor in funktioneller Verbindung mit einem Östrogenrezeptor-Gen und ein Reporterplasmid, enthaltend einen induzierbaren Promotor, der mindestens eine ERE-Sequenz umfasst, in funktioneller Verbindung mit einem Fluoreszenzgen oder einem Gen, welches für ein sekretorisches Enzym kodiert, als Reportergen, wobei der durch das Östrogenrezeptor-Gen kodierte Östrogenrezeptor durch eine Substanz mit östrogener Wirkung transaktiviert wird und an die ERE-Sequenz des Reporterplasmids bindet und so die Expression des Reportergens induziert.
Hefezellen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der induzierbare Promotor ein GAA-Promotor ist.
Hefezellen gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der GAA-Promotor mindestens eine ERE-Sequenz enthält.
Hefezellen gemäß Anspruch 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass sie Hefen der Art Arxula adeninivorans sind.
Hefezellen gemäß einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass das Östrogenrezeptor-Gen human ist.
Hefezellen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Östrogenrezeptor-Gen hERα und/oder hERβ ist.
Hefezellen gemäß einem der Ansprüche 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzgen ausgewählt ist aus der Gruppe, die die für GFP, EYFP und DsRed kodierenden Gene umfasst.
Hefezellen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzgen das für DsRed kodierende Gen ist.
Hefezellen gemäß einem der Ansprüche 1–8, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen, welches für das sekretorische Enzym kodiert, das für Phytase kodierende Gen ist.
Verfahren zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe, unassend die folgenden Schritte: – Inkubieren von Hefezellen nach einem der Ansprüche 1–9 mit der zu untersuchenden Probe, und – Bestimmen der Fluoreszenz-Emission oder der Aktivität des sekretorischen Enzyms.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass frisch kultivierte Hefezellen eingesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass konservierte Hefezellen eingesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die konservierten Hefezellen lyophilisierte Zellen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass immobilisierte Hefezellen eingesetzt werden.
Kit zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe, umfassend: – Hefezellen nach einem der Ansprüche 1–9 und – Detektions- und Kontrollsubstanzen.
Biosensor zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe, umfassend: – Hefezellen nach einem der Ansprüche 1–9 und – einen Transducer.
Biosensor gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Transducer ein optischer Transducer ist.
Biosensor gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Transducer ein elektrochemischer Transducer ist.
Verwendung von Hefezellen nach einem der Ansprüche 1–9 zum Nachweis von Substanzen mit östrogener Wirkung in einer Probe.