DE60030796T2 - Zelle zur Bestimmung der Fähigkeit die Aktivität eines Liganden-abhängigen Transkriptionskontrollfaktors zu kontrollieren - Google Patents

Zelle zur Bestimmung der Fähigkeit die Aktivität eines Liganden-abhängigen Transkriptionskontrollfaktors zu kontrollieren Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelle zur Messung der Fähigkeit einer chemischen Substanz die Aktivität eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zu kontrollieren.
  • Ein Ligand-gesteuerter Transkriptionskontrollfaktor ist ein Protein, welches dahingehend funktioniert die Transkription eines Zielgens auf einer DNA wie einem Chromosom zu fördern, wobei das Protein an einen entsprechenden, zu aktivierenden Liganden bindet und an einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor bindet, welcher eine Sequenz erkennt, die in einer Transkriptionskontrollregion des Zielgens vorhanden ist. Als solches spielt der Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor wichtige Rollen in der Erhaltung des Gleichgewichts, der Vermehrung, der Entwicklung und des Wachstums, der Zelldifferenzierung, des Energiestoffwechsels, des Arzneistoffwechsels und ähnlichem von Organismen. Es ist bekannt, dass, wenn die Transkriptionskontrolle durch solche Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktoren nicht normal ist, bei der Transkriptionsaktivität des Zielgens des Faktors eine Abnormalität auftritt, was verschiedene Erkrankungen und Abnormalitäten bedingt.
  • Um Arzneistoffe, welche zur Vorbeugung und Behandlung solcher Erkrankungen und Abnormalitäten nützlich sind, zu entwickeln gab es Versuche nach chemischen Substanzen zu suchen, welche eine Aktivität haben die Fähigkeit zur Transkriptionskontrolle eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zu ändern. Weiterhin wurde die Entwicklung von leistungsfähigen Verfahren zur Untersuchung der Aktivität von chemischen Substanzen über die Fähigkeit zur Transkriptionskontrolle von Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktoren gewünscht.
  • Nichtsdestoweniger wurde kürzlich berichtet, dass einige chemische Substanzen in der Umwelt die Wirkung einer chemischen Substanz im Zusammenhang mit der Fähigkeit zur Kontrolle der Transkription eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors wie eine arylkohlenwasserstoffartige Wirkung oder eine anti-arylkohlenwasserstoffartige Wirkung, eine intranukleare hormonartige Wirkung oder anti-intranukleare hormonartige Wirkung, eine östrogenartige Wirkung oder anti-östrogenartige Wirkung, eine androgenartige Wirkung oder anti-androgenartige Wirkung, eine thyroidhormonartige Wirkung oder anti-thyroidhormonartige Wirkung und ähnliches (hiernach als die vorliegende Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollwirkung bezeichnet) zeigen. Da die Befürchtung besteht, dass solche Wirkungen von chemischen Substanzen das Hormongleichgewicht in Tieren zum Zusammenbrechen bringen, ein Ökosystem in Unordnung bringen oder Krankheiten bedingen, gibt es Versuche die vorliegende Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollwirkung einer chemischen Substanz als einen Teil von Sicherheitsbewertungen einer chemischen Substanz zu messen.
  • Im Fall von Östrogen kann zum Beispiel der Wirkungsmechanismus davon wie folgt sein: wenn Östrogen an einen Östrogenrezeptor bindet, welcher in der Zielzelle von Östrogen vorliegt, wird solch ein Rezeptor aktiviert, bindet an eine Östrogenrezeptoren erkennende Sequenz, welche in der Transkriptionskontrollregion des Zielgens auf einer DNA wie einem Chromosom vorhanden ist und fördert die Transkription des Zielgens. Hinsichtlich dessen war die Entwicklung von Testsystemen als ein Verfahren zur Messung der östrogenartigen Wirkungen oder anti-östrogenartigen Wirkung einer chemischen Substanz gewünscht, welche die Fähigkeit einer chemischen Substanz die Aktivität des Östrogenrezeptors zu kontrollieren messen können.
  • Weiterhin kann zum Beispiel im Fall von Androgen der Wirkungsmechanismus davon wie folgt sein: wenn Androgen an einen Androgenrezeptor bindet, welcher in der Zielzelle von Androgen vorhanden ist, wird solch ein Rezeptor aktiviert, bindet an eine Androgenrezeptoren erkennende Sequenz, welche in der Transkriptionskontrollregion des Zielgens auf einer DNA wie einem Chromosom vorhanden ist und fördert die Transkription des Zielgens. Hinsichtlich dessen wurde die Entwicklung von Testsystemen als ein Verfahren zur Messung der androgenartigen Wirkung oder anti-androgenartigen Wirkung einer chemischen Substanz gewünscht, welche die Fähigkeit einer chemischen Substanz die Aktivität des Androgenrezeptors zu kontrollieren messen können.
  • Weiterhin kann zum Beispiel im Fall von Thyroidhormon der Wirkungsmechanismus davon wie folgt sein: wenn Thyroidhormon an einen Thyroidhormonrezeptor bindet, welcher in der Zielzelle von Thyroidhormon vorhanden ist, wird solch ein Rezeptor aktiviert, bindet an eine Thyroidhormonrezeptoren erkennende Sequenz, welche in der Transkriptionskontrollregion des Zielgens auf einer DNA wie einem Chromosom vorhanden ist und fördert die Transkription des Zielgens. Hinsichtlich dessen wurde die Entwicklung von Testsystemen als ein Verfahren zur Messung der thyroidhormonartigen Wirkungen oder anti-thyroidhormonartigen Wirkungen einer chemischen Substanz gewünscht, welche die Fähigkeit einer chemischen Substanz die Aktivität des Thyroidhormonrezeptors zu kontrollieren messen können.
  • Denison et al., Toxicology and Applied Pharmacology, 152 (1998): 406–414, offenbaren transformierte tierische Zellen, welche ein stabil integriertes, DRE-gesteuertes Leuchtkäferluciferase-Reportergen-Plasmid enthalten, dessen transkriptionelle Aktivierung in einer Liganden- und AhR-abhängigen Weise erfolgt. Das Plasmid umfasst ein Dioxin-gesteuertes Element, einen MMTV-Promotor, einen durch die Erkennungsstelle gesteuerten Leuchtkäferluciferase-Reporter und einen Ampicillin-Selektionsmarker, welcher, wie in Garrison et al., Fundamental and Applied Toxicology, 30 (1996): 194–203, erklärt, in tierischen Zellen nicht funktionell ist. Um eine selektive Resistenz zu erreichen, müssen die Zellen mit einem zusätzlichen Vektor transformiert werden, welcher ein Neomycin-Selektionsgen trägt.
  • Die Erfinder haben unter solchen Bedingungen intensiv geforscht und haben es im Ergebnis erreicht, eine durch Einfrieren konservierbare Zelle zu erhalten, welche verwendet werden kann, die Wirkung einer chemischen Substanz über die Fähigkeit zur Transkriptionskontrolle eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zu messen, wodurch die vorliegende Erfindung erreicht wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
    • 1. eine tierische Zelle, die ein Gen exprimiert, das einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert und eine DNA stabil beibehält, die in einem Molekül beide der folgenden Gene (a) und (b) umfasst:
    • (a) ein Reportergen, das stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor besteht, der in der Zelle funktionieren kann; und
    • (b) ein selektives Markergen, das in der Zelle funktionieren kann; mit der Maßgabe, dass das folgende Gen (c):
    • (c) ein Reportergen, das stromabwärts von einem Promotor verbunden ist, dessen Transkriptionsaktivität unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Liganden des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors in Kontakt gebracht wird, wobei das Reportergen (c) ein Protein codiert, das von dem Protein, das durch das Gen (a) codiert wird, unterschieden werden kann, in der Zelle nicht vorkommt;
    • 2. Zelle gemäß dem vorstehenden 1, wobei der Minimal-Promotor im wesentlichen aus einer TATA-Box besteht;
    • 3. Zelle gemäß dem vorstehenden 1, bei der der Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor einer ist, der aus einem Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor, intranuklearen Hormonrezeptor, Östrogenrezeptor, Androgenrezeptor und Thyroidhormonrezeptor ausgewählt ist;
    • 4. Zelle gemäß dem vorstehenden 1, wobei der Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor ist;
    • 5. Zelle gemäß dem vorstehenden 1, wobei der Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein intranuklearer Hormonrezeptor ist;
    • 6. Zelle gemäß dem vorstehenden 1, wobei der Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein Östrogenrezeptor ist;
    • 7. Zelle gemäß dem vorstehenden 1, wobei der Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein Androgenrezeptor ist;
    • 8. Zelle gemäß dem vorstehenden 1, wobei der Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein Thyroidhormonrezeptor ist;
    • 9. Tierische Zelle, die einen Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor und einen Arnt-Rezeptor exprimiert und die stabil eine DNA beibehält, die in einem Molekül beide der folgenden Gene (a) und (b) umfasst:
    • (a) ein Reportergen, das stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Arylkohlenwasserstoff-Rezeptors und einem Minimal-Promotor, der in der Zelle funktionieren kann, besteht; und
    • (b) ein selektives Markergen, das in der Zelle funktionieren kann; mit der Maßgabe, dass das folgende Gen (c):
    • (c) ein Reportergen, dass stromabwärts von einem Promotor verbunden ist, dessen Transkriptionsaktivität unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors in Kontakt gebracht wird, wobei das Reportergen (c) ein Protein codiert, das von dem Protein, das durch das Gen (a) codiert wird, unterschieden werden kann, in der Zelle nicht vorkommt;
    • 10. Verwendung einer tierischen Zelle entsprechend jedem der vorstehenden 1 bis 9 zur Evaluierung einer Agonist-Aktivität oder Antagonist-Aktivität einer chemischen Substanz über die transkriptionsfördernde Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors in einem Reporter-Test durch Messen der Menge eines Reportergens unter der Transkriptionskontrolle des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors;
    • 11. Verfahren zur Evaluierung einer chemischen Substanz, Agonist-Aktivität zu haben, über die Transkriptions-fördernde Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) das Züchten einer tierischen Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 in der Anwesenheit der chemischen Substanz;
    • (ii) das Messen der Expressionsmenge eines Reportergens in der Zelle; und
    • (iii) das Bewerten der chemischen Substanz, Agonist-Aktivität zu haben, über die Transkriptions-fördernde Fähigkeit des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wenn der gemessene Wert der Expressionsmenge des Reportergens, das in die Zelle eingeführt wurde, größer ist als der gemessene Wert der Expressionsmenge des Reportergens in Abwesenheit der chemischen Substanz;
    • 12. Verfahren zur Evaluierung einer chemischen Substanz, Antagonist-Aktivität zu haben, über die Transkriptions-fördernde Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) das Züchten einer tierischen Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 in der Anwesenheit der chemischen Substanz und eines Liganden des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors;
    • (ii) das Messen der Expressionsmenge eines Reportergens in der Zelle; und
    • (iii) das Bewerten der chemischen Substanz, Antagonist-Aktivität zu haben, über die Transkriptions-fördernde Fähigkeit des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wenn der gemessene Wert der Expressionsmenge des Reportergens, das in die Zelle eingeführt wurde, kleiner ist als der gemessene Wert der Expressionsmenge des Reportergens in Anwesenheit des Liganden und in Abwesenheit der chemischen Substanz;
    • 13. Mess-Kit, der eine tierische Zelle gemäß einem der vorstehenden 1 bis 9 umfasst;
    • 14. Verfahren zum Erhalt einer tierischen Zelle zum Messen der Fähigkeit, die Aktivität eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zu kontrollieren, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) das Einführen einer DNA, die in einem Molekül beide der folgenden Gene (a) und (b) umfasst, in eine tierische Zelle:
    • (a) ein Reportergen, das stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor, der in der Zelle funktionieren kann, besteht; und
    • (b) ein selektives Markergen, das in der Zelle funktionieren kann; wobei die tierische Zelle eine tierische Zelle ist, die eine DNA umfasst, die ein Gen umfasst, das einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, die vorher, nachher oder während der gleichen Zeit des oben stehenden Schritts (i) dahinein eingeführt wurde oder die natürlicherweise die Fähigkeit hat, das Gen, das den Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, zu exprimieren, mit der Maßgabe, das ein Reportergen (c), das stromabwärts von einem Promotor mit einer Transkriptionsaktivität verbunden ist, die unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors in Kontakt gebracht wird, wobei das Reportergen (c) ein Protein codiert, das von dem Protein, das durch das Gen (c) codiert wird, unterschieden werden kann, in der Zelle nicht vorkommt; und
    • (ii) das Gewinnen von der transformierten Zellen, die aus Schritt (i) erhalten wurde, einer transformierten Zelle, die die eingeführte DNA darin stabil beibehält.
    • 15. Verfahren gemäß dem vorstehenden 14, wobei die Zelle eine tierische Zelle ist, umfassend eine DNA, die ein Gen umfasst, das den Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, die vorher, nachher oder zur gleichen Zeit von Schritt (i) dahinein eingeführt wurde.
    • 16. Verfahren gemäß dem vorstehenden 15, wobei die DNA, die ein Gen umfasst, das den Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, in einem Molekül ein selektives Markergen umfasst, dass in der Zelle funktionieren kann und das einen Phänotyp codiert, der unterschiedlich zu dem von Gen (b) ist.
  • Durch diese Beschreibung hindurch und durch die Ansprüche, welche folgen, wird das Wort „umfassen" und Variationen davon wie „umfasst" und „umfassend", solange es der Zusammenhang nicht anders erfordert, so verstanden werden, dass es das Einschließen einer genannten Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe von Zahlen oder von Schritten, aber nicht das Ausschließen jeglicher anderen Zahl oder jeglichen anderen Schrittes oder Gruppe von Zahlen oder Schritten impliziert.
  • Die 1 ist ein Bild, welches die Ergebnisse einer Messung der Fähigkeit von Genistein den Östrogenrezeptor α zu aktivieren durch einen Reporter-Test unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, welches die Transkriptionskontrolle durch den Östrogenrezeptor α erhält, zeigt. Von der linken Seite aus zeigen die Säulen ein Feld, in welchem nur DMSO, welches als Lösungsmittel für chemische Substanzen verwendet wird, hinzugefügt wird (DMSO), ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 10 nM (10 nM E2) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem Genistein zu einer Endkonzentration von 100 pM (100 pM Genistein) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem Genistein zu einer Endkonzentration von 1 nM (1 nM Genistein) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem Genistein zu einer Endkonzentration von 10 nM (10 nM Genistein) hinzugefügt wird, und ein Feld in welchem Genistein zu einer Endkonzentration von 1 μM (1 μM Genistein) hinzugefügt wird.
  • Die 2 ist ein Bild, welches die Ergebnisse einer Messung der Fähigkeit von 17-β-Östradiol den Östrogenrezeptor α zu aktivieren, durch einen Reporter-Test unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle zeigt. Von der linken Seite 'aus zeigen die Säulen ein Feld, in welchem nur DMSO, welches als Lösungsmittel für 17-β-Östradiol verwendet wurde, hinzugefügt wird (DMSO), ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 0,1 pM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 1 pM (1 pM E2) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 10 pM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 100 pM (100 pM Genistein) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 1 nM hinzugefügt wird, ein Feld in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 10 nM (10 nM E2) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 100 nM hinzugefügt wird.
  • Die 3 ist ein Bild, welches die Ergebnisse einer Messung der Fähigkeit von 17-β-Östradiol den Östrogenrezeptor β zu aktivieren, durch einen Reporter-Test unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle zeigt. Von der linken Seite aus zeigen die Säulen ein Feld, in welchem nur DMSO, welches als Lösungsmittel für 17-β-Östradiol verwendet wurde, hinzugefügt wird (DMSO), ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 0,1 pM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 1 pM (1 pM E2) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 10 pM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 100 pM (100 pM E2) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 1 nM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 10 nM (10 nM E2) hinzugefügt wird, und ein Feld, in welchem 17-β-Östradiol zu einer Endkonzentration von 100 nM hinzugefügt wird.
  • Die 4 ist ein Bild, welches die Ergebnisse einer Messung der Fähigkeit von DHT den Androgenrezeptor zu aktivieren, durch einen Reporter-Test unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle zeigt, welche durch das Einführen von DNA des Plasmids pGL3-MMTV-BSD und DNA des Plasmids pRC/RSV-hAR Kozak hergestellt wurde. Von der linken Seite aus zeigen Säulen ein Feld, in welchem nur DMSO, welches als Lösungsmittel für DHT verwendet wird, hinzugefügt wird (DMSO), ein Feld, in welchem DHT zu einer Endkonzentration von 1 pM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem DHT zu einer Endkonzentration von 10 pM (10 pM DHT) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem DHT zu einer Endkonzentration von 100 pM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem DHT zu einer Endkonzentration von 1 nM (1 nM DHT) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem DHT zu einer Endkonzentration von 10 nM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem DHT zu einer Endkonzentration von 100 nM (100 nM DHT) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem DHT zu einer Endkonzentration von 1 μM hinzugefügt wird.
  • Die 5 ist ein Bild, welches die Ergebnisse einer Messung der Fähigkeit von T3 den Thyroidhormonrezeptor α zu aktivieren, durch einen Reporter-Test unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle zeigt. Von der linken Seite aus zeigen die Säulen ein Feld, in welchem nur DMSO, welches als Lösungsmittel für T3 verwendet wird, hinzugefügt wird (DMSO), ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 10 pM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 100 pM (100 pM T3) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 1 nM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 10 nM (10 nM T3) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 100 nM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 1 μM (1 μM T3) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzugefügt wird.
  • Die 6 ist ein Bild, welches die Ergebnisse einer Messung der Fähigkeit von T3 den Thyroidhormonrezeptor-β zu aktivieren, durch einen Reporter-Test unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle zeigt. Von der linken Seite aus zeigen die Säulen ein Feld, in welchem nur DMSO, welches als Lösungsmittel für T3 verwendet wird, hinzugefügt wird (DMSO), ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 10 pM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 100 pM (100 pM T3) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 1 nM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 10 nM (10 nM T3) hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 100 nM hinzugefügt wird, ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 1 μM (1 μM T3) hinzugefügt wird, und ein Feld, in welchem T3 zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzugefügt wird.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detailliert beschrieben.
  • In der vorliegenden Erfindung bedeutet ein Ligand-gesteuerter Transkriptionskontrollfaktor ein Protein, welches dahingehend funktioniert die Transkription des vorstehend erwähnten Zielgens auf einer DNA zu fördern, wobei das Protein an eine einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor erkennende Sequenz bindet, die in der Transkriptionskontrollregion in einem Zielgen auf einer DNA vorhanden ist, wobei spezifische Beispiele davon Proteine einschließen, welche als intranukleare Hormonrezeptoren von Steroidhormonen wie Östrogen, Androgen, Glucocorticoid und ähnlichem, Thyroidhormonen, fettlöslichen Vitaminen wie Vitamin D3, Retinoin und ähnlichem oder Prostinoid und ähnlichem, Rezeptoren von Insektenhormonen wie den Ecdyson-Rezeptor und ähnlichem, Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor, welcher ein Rezeptor von Dioxin ist, und ähnlichem bezeichnet werden.
  • Zum Beispiel kann die erfindungsgemäßen Zelle durch Gewinnen einer Zelle hergestellt werden, die ein Gen exprimiert, das einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert und eine eingeführte DNA stabil beibehält, die in einem Molekül beide Gene (a) ein Ligand-gesteuertes Reportergen und (b) ein selektives Markergen, das in der Zelle funktionieren kann, umfasst, mit der Maßgabe dass in der Zelle nicht (c) ein Reportergen vorkommt, das stromabwärts von einem Promotor verbunden ist, dessen Transkriptionsaktivität unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors in Kontakt gebracht wird, und welches ein Protein codiert, das von dem Protein, das durch das Reportergen codiert wird, unterschieden werden kann.
  • Wie hier verwendet bedeutet der Ausdruck eine Zelle, die stabil beibehält, dass eine eingeführte DNA nicht in einigen Tagen, zum Beispiel etwa fünf bis sieben Tage, aus einer Zelle herausfällt. Spezifisch kann eine Bedingung genannt werden, unter welcher die eingeführte DNA in ein Chromosom eingefügt wird.
  • Beispiele von Zellen, welche zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle verwendet werden können, schließen tierische Zellen wie Zellen, welche von einem Säuger wie einem Menschen, einer Maus, einer Ratte und ähnlichem gewonnen wurden, Zellen, welche von einem Insekt gewonnen wurden, und ähnliches ein. Im Hinblick auf die Handhabung und Reproduzierbarkeit sind Zellen, welche eine stabile Passage ergeben, bevorzugt. Spezifischere Beispiele davon schließen eine aus dem Menschen gewonnene HeLa-Zelle, aus dem Menschen gewonnene MCF7-Zelle, aus dem Menschen gewonnene HepG2-Zelle, aus der Maus gewonnene NIH3T3-Zelle, aus der Maus gewonnen Hepa1c1c7-Zelle, aus der Ratte gewonnenen H4IIE-Zelle [alle erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC)] und ähnliches ein.
  • In eine Zelle, welche den gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor nicht produziert, wird ein Gen, das den gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, eingeführt, um eine exprimierbare Form davon bereitzustellen. Solch ein Gen, dass einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, kann ein natürlich vorkommendes Gen oder ein Gen sein, welches künstlich verändert worden ist, wie ein Gen, das ein Protein codiert, an welches eine funktionelle Domäne eines anderen Transkriptionskontrollfaktors gebunden ist. Dieses Gen kann auch ein Gen sein, in welchem eine Konsensussequenz von Kozak (Nucleic Acids Res., 12 (1984): 857–872) stromaufwärts von einem Startcodon der Translation ATG verbunden ist. Die DNA eines Gens eines solchen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors kann zum Beispiel durch Entwerfen und Herstellen eines Oligonucleotids zur Vervielfältigung einer DNA, welche so einen Faktor codiert, basierend auf bekannten Nucleotidsequenzen, und durch Durchführung einer Polymerasekettenreaktion (hier nachstehend abgekürzt als PCR), in welcher das hergestellte Oligonucleotid als Primer verwendet wird, hergestellt werden. Dann kann eine hitzeresistente Polymerase, welche für langläufige PCR-Verfahren hergestellt wird, zum Beispiel LA-Taq (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) und ähnliches vorteilhaft in der PCR verwendet werden. Für die in der PCR verwendete Matrizen-DNA wird zum Beispiel eine reverse Transkriptase mit einer kommerziell erhältlichen mRNA, die aus verschiedenen Zellen gewonnen ist, unter Verwendung von Oligo-dT als Primer zur Synthese einer DNA, welche als die Matrize verwendet werden kann, umgesetzt. Alternativ kann auch kommerziell erhältliche cDNA, welche aus verschiedenen Lebewesen gewonnen ist, verwendet werden.
  • Weiterhin kann, wenn als Wirtszelle eine Zelle verwendet wird, welche den gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor herstellt, ein Gen, welches den vorstehend erwähnten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, zur Expression in einer ähnlichen Weise, wie vorstehend beschrieben, in die Zelle hinein eingeführt werden, um die Produktivität des vorstehend erwähnten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zu verstärken. Alternativ kann auch ein Gen, das ein Protein codiert, welches als Funktion hat die Transkriptionsaktivität eines Gens zu verstärken, welches eine Transkriptionskontrolle von dem vorstehend erwähnten Rezeptor erhält, wie zum Beispiel ein Coaktivator und ähnliches eines intranuklearen Hormonrezeptors, auch zur Expression in eine Wirtszelle hinein eingeführt werden, so dass die Fähigkeit zur Transkriptionskontrolle eines endogenen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors verstärkt werden kann.
  • Spezifisch gesagt, wenn der gewünschte Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor zum Beispiel ein Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor ist, als Zelle, welche für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle verwendet wird, können als Beispiel tierische Zellen wie Zellen, welche von Säugern gewonnen wurden, wie Zellen, welche von Insekten gewonnen wurden, und ähnliche verwendet werden, welche sowohl ein Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gen, bevorzugt das vorstehend erwähnte Gen, als auch ein Arnt-Gen [Ah, nuklearer Rezeptor-Translokator, Science 252 (1991): 954–958] exprimieren. Spezifischer gesagt werden für das Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gen endogene Zellen wie eine aus der Maus gewonnene Hepa1c1c7-Zelle, eine aus der Ratte gewonnene H4IIE-Zelle, eine aus dem Menschen gewonnene HepG2-Zelle und ähnliches aufgeführt. Weiterhin kann es im Hinblick auf für das Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gen nicht-endogene Zellen wie eine CV-1-Zelle und ähnliches oder Zellen, in welchen die Expressionsmenge des Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gens klein ist, vorteilhaft sein ein Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gen in die vorstehend erwähnte Zelle, wie vorstehend beschrieben, hinein einzuführen, um die Expressionsmenge des Gens vor der Verwendung zu steigern. Als in eine Zelle hinein einzuführendes Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gen werden ein aus dem Menschen gewonnenes Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gen [Genbank-Zugangsnummer L19872, Mol. Pharmacol. 44 (1993): 911–917], ein aus der Maus gewonnenes Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gen [Genbank-Zugangsnummer M94623, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992): 8185–8189], ein aus der Ratte gewonnenes Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor-Gen (Genbank-Zugangsnummer M94623, Nucleic Acids Res. 22 (1994): 3038–3044] und ähnliches aufgeführt.
  • Eine DNA, die ein Ligand-gesteuertes Reportergen enthält, kann zum Beispiel durch Verbindung einer DNA, die eine Transkriptionskontrollregion besitzt, welche im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor besteht, welcher in der Zelle funktionieren kann, stromaufwärts der DNA eines Reportergens hergestellt werden.
  • In der vorliegenden Erfindung wird typischerweise in eine Wirtszelle mit hoher Frequenz eine DNA sicher hinein eingeführt, welche in einem Molekül (a) ein Reportergen, dass stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor besteht, der in der Zelle funktionieren kann, und (b) ein selektives Markergen, das in der Zelle funktionieren kann, umfasst. Weiterhin wird typischerweise mit hoher Frequenz in eine stabil transformierte Zellen hinein, welche aus den vorstehenden Wirtszellen ausgewählt wird, abhängig von der Charakteristik des selektiven Markers ein Ligand-gesteuertes Reportergen sicher eingeführt.
  • Eine „Erkennungssequenz eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors" ist eine spezifische Nucleotidsequenz, welche in der Transkriptionskontrollregion eines Zielgens vorhanden ist, dessen Expressionsmenge durch einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor gesteuert wird, und, wenn ein Komplex eines Liganden mit einem Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor diese Sequenz erkennt und daran bindet, wird die Transkription eines Zielgens, das stromabwärts davon vorhanden ist, gefördert. Für gewöhnlich kann diese Sequenz manchmal auch basierend auf der Art des entsprechenden Liganden klassifiziert werden und jeweils als Glucocorticoid-gesteuerte Sequenz (GRE: Glucocorticoid-gesteuertes Element, Nature 318 (1985): 635–641), PPRE (Peroxisom-Proliferator-gesteuertes Element, J. Steroid Biochem., Mol. Biol. 51 (1994): 157–166), Östrogen-gesteuerte Sequenz (ERE; Östrogen-gesteuertes Element), Androgen-gesteuerte Sequenz (ARE; Androgen-gesteuertes Element), Thyroidhormon-gesteuerte Sequenz (TRE; Thyroidhormon-gesteuertes Element), Dioxin-gesteuerte Sequenz (DRE; Dioxin-gesteuertes Element, J. Biol. Chem., 263 (1988): 17221–17224), xenobiotisch-gesteuertes Element (XRE) und ähnliches bezeichnet werden. Spezifische Beispiele für die Erkennungssequenz eines Arylkohlenwasserstoff-Rezeptors, welches eine Dioxin-gesteuerte Sequenz ist, schließen Nucleotidsequenzen in stromaufwärts gelegenen 5'-Regionen von Genen, die aus Säugern stammen, wie das Cytochrom P4501A1-Gen [cyp1A1, J. Biol. Chem., 263 (1988) 17221–17224, Nucleic Acids Res., 15 (1987): 4179–4191)], das Gen der Ya-Untereinheit der Glutathion S-Transferase [Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87 (1990): 3826–3830], UDP-Glucuronyltransferase-Gen [J. Biol. Chem., 271 (1996): 3952–3958] und ähnliches ein. Es können auch Nucleotidsequenzen aufgeführt werden, die eine oder mehrere Konsensussequenzen [Kernsequenz: 5'-(T/A)GCGTG, J. Biol. Chem., 271 (1996): 3952–3958] einer Dioxin-gesteuerten Sequenz enthalten. Als Erkennungssequenz eines Östrogenrezeptors, welche eine Östrogen-gesteuerte Sequenz ist, können zum Beispiel Nucleotidsequenzen in der stromaufwärts gelegenen 5'-Region eines Vitellogeningens von Xenopus (Cell, 57: 1139 – 1146) und ähnliches aufgeführt werden. Es können auch Nucleotidsequenzen aufgeführt werden, die eine oder mehrere Konsensussequenzen [5'-AGGTCAnnnTGACCTT-3'] einer Östrogen-gesteuerten Sequenz enthalten.
  • Spezifische Beispiele für die Erkennungssequenz eines Androgenrezeptors schließen die Nucleotidsequenzen im LTR des Maus-Papillomvirus (MMTV) (Gouilleux et al., Nucleic. Acids Research, 19 (1991): 1563–1570) und ähnliches ein, unspezifische Beispiele der Erkennungssequenz eines Thyroidhormonrezeptors schließen Nucleotidsequenzen, angegebenen in Glass C. K. et al., Endocrine Rev., 15 (1994): 391–407, und ähnliches ein. Zur Gewinnung einer ausreichenden Fähigkeit zur Transkriptionskontrolle ist es bevorzugt, dass die wie vorstehend beschriebene Konsensussequenz für gewöhnlich in zwei bis fünf Tandems verbunden ist. Eine DNA, die solche Nucleotidsequenzen besitzt, kann durch chemische Synthese oder durch Vervielfältigung und Clonierung durch PCR-Verfahren und ähnliches hergestellt werden.
  • Der „Minimal-Promotor" ist eine DNA, welche eine Region besitzt, die die Initiationsstelle der Transkription durch RNA-Polymerase II bestimmt, und betrifft die Aufrechterhaltung eines minimalen Transkriptionsniveaus und wird auch als Kern-Promotor bezeichnet. Für gewöhnlich ist der Minimal-Promotor auch eine Region, welche in einem relativ engen Abschnitt in der Nähe die Initiationsstelle der Transkription eines Gens gefunden wird. Als Nucleotidsequenz in so einer Region werden zum Beispiel eine TATA-Box und Nucleotidsequenzen in der Nähe des Initiationspunktes der Transkription aufgeführt, bevorzugt ist eine kurze Nucleotidsequenz von etwa 40 bis 100 Bp und stärker bevorzugt etwa 50 Bp. Spezifische Beispiele davon schließen Nucleotidsequenzen (Genbank Zugangsnummer J00605) von der Base –33 (Initiationspunktes der Transkription ist +1. Hier nachfolgend gleich.) bis zur Base +15 in der stromaufwärts gelegenen 5'-Region des Metallothionein I-Gens der Maus, Nucleotidsequenzen (Genbank Zugangsnummer J00895) von der Base –40 bis zur Base +10 in der stromaufwärts gelegenen 5'-Region des Ovalbumingens des Huhns und ähnliches ein.
  • Die Transkriptionsaktivität des in der erfindungsgemäßen Zelle verwendeten „Minimal-Promotors" ist bevorzugt schwächer als die Transkriptionsaktivität einer DNA-Region, welche zum Beispiel Nucleotidsequenzen von der Base –130 bis zur Base + 53 in der stromaufwärts gelegenen 5'-Region der Thymidinkinase (tk), welche aus dem Herpes simplex-Virus (HSV) stammen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (1981): 1411–1445), enthält, da in diesem Fall die konstitutive Hintergrundaktivität der Transkription bei der Messung der Transkriptionsaktivität abnimmt und der Nachweis der Ligand-gesteuerten Transkriptionsaktivität mit höhere Sensitivität durchgeführt werden kann. DNA, die die Nucleotidsequenz, wie vorstehend beschrieben, enthält, kann zum Beispiel durch chemische Synthese basierend auf der Nucleotidsequenz davon hergestellt werden. Alternativ kann diese DNA zum Beispiel durch Entwurf und Herstellung eines Oligonucleotids zur Vervielfältigung der DNA, welche die Region, wie vorstehend beschrieben, codiert, basierend auf bekannten Nucleotidsequenzen und unter Durchführung einer PCR unter Verwendung des hergestellten Oligonucleotids als Primer hergestellt werden.
  • Der Ausdruck, dass eine „Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor besteht, welcher in der Zelle funktionieren kann" bedeutet eine Transkriptionskontrollregion, die ausschließlich die gewünschte Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einen Minimal-Promotor als das wesentliche, die Transkriptionskontrolle betreffende, funktionale Element enthält und kann zum Beispiel eine Sequenz bedeuten, welche keine anderen funktionalen, die Transkriptionskontrolle einer Erkennungssequenz des anderen Transkriptionskontrollfaktors und ähnliches betreffenden Elemente enthält oder, selbst wenn sie ein solches funktionales Elemente enthält, eine Sequenz, bei welcher die Fähigkeit zur Kontrolle der Transkription durch die vorstehend erwähnte Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und den Minimal-Promotor nicht wesentlich verändert wird.
  • Weiter bedeutet der vorstehend erwähnte Ausdruck ein „Reportergen, das stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist" ein Reportergen, verbunden mit einer Transkriptionskontrollregion, so dass das Reportergen unter der Kontrolle der Transkriptionskontrollregion in einer Wirtszelle, in welche das Gen eingeführt wird, exprimiert wird.
  • Als ein „Reportergen", welches ein Indikator der Transkriptionsaktivität ist, wird ein Gen, dessen Expressionsmenge basierend auf der Enzymaktivität und ähnlichem des Transkriptionsprodukts davon (Reporterprotein) gemessen werden kann, bevorzugt, weil die Messung der Expressionsmenge des Gens einfach ist, wobei Beispielen davon Gene schließen, die Enzymproteine wie Leuchtkäferluciferase, Renilla-Luciferase, β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, alkalische Phosphatase und ähnliches codieren. DNA solch eines Reportergens kann zum Beispiel unter Verwendung eines Restriktionsenzyms zur Spaltung einer DNA aus kommerziell erhältlichen Plasmiden, die solche Reportergene enthalten, und Isolierung der gewünschten DNA genauso wie durch andere ähnliche Verfahren gewonnen werden.
  • Die DNA, welche für die Transformation einer Wirtszelle bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle verwendet wird, schließt zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Reportergenen selektive Markergene, welche in der tierischen Wirtszelle funktionieren können, ein. Das „selektive Markergen" ist ein Gen, das einen Phänotyp codiert, welcher eine Markierung bei der Unterscheidung einer Zelle, welche mit einer das Gen enthaltenden DNA transformiert worden ist, von einer nicht-transformierten Zelle sein kann. Der Ausdruck „welches in einer Zelle funktionieren kann" bedeutet, dass der vorstehend erwähnte Phänotyp in einer Zelle exprimiert werden kann, und es werden zum Beispiel Gene genannt, welche in der Zelle unter Kontrolle eines Promotors exprimiert werde können, welcher in der Zelle die Fähigkeit hat die Transkription zu initiieren, und welche den Phänotyp zur Selektion der Zellen, die in der Zelle wirksam ist, codieren. Als ein für Zellen selektives Markergen, welches in einer Zelle wirksam ist, werden zum Beispiel Gene aufgeführt, welche für die Zelle eine Resistenz gegen Chemikalien, die die Vermehrung der Zelle unterdrücken oder stören, bereitstellen können, wobei spezifische Beispiele dafür Neomycinresistenzgene (Aminoglycosidphosphotransferasegene), Hygromycinresistenzgene (Hygromycinphosphotransferasegene), Blasticidin S-Resistenzgene (Blasticidin S-Desaminasegene) und ähnliches einschließen. Die Blasticidin S-Resistenzgene werden bevorzugt genannt, da die Selektion für transformierte Zellen in einer kürzeren Zeitspanne durchgeführt werden kann. Das Blasticidin S-Resistenzgen kann zum Beispiel aus dem kommerziell erhältlichen Plasmid pUCSV-BSD und ähnlichem gewonnen werden.
  • Die „DNA, die in einem Molekül die folgenden Gene (a) und (b) umfasst: (a) ein Reportergen, dass stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor besteht, der in der Zelle funktionieren kann, und (b) ein selektives Markergen, welches in der Zelle funktionieren kann" kann zum Beispiel durch Einfügung dieser Gene in den gleichen Vektor hergestellt werden. Als Vektor werden Plasmide, virale Vektoren, Episomen und ähnliches genannt. Der Vektor ist bevorzugt leicht zu verwenden und kann eine kompakte Größe haben, da es erwünscht ist, eine niedrige Häufigkeit des Herausfallens aus der stabilen Zell-Transformation oder der genetischen Rekombination zwischen Vektoren oder innerhalb eines Vektors zu haben. Zum Beispiel werden Plasmide von etwa 2 kb bis 10 kb aufgeführt. Weiterhin hat der Vektor, da der Arbeitsvorgang des Einfügens von Genen in den Vektor effizient durchgeführt werden kann, wenn E. coli als Wirt verwendet wird, bevorzugt eine zusätzliche Funktionen als ein E. coli-Vektor, er hat nämlich einen Replikationsursprung, ein Chemikalien-Resistenzgen, eine Restriktionsenzymerkennungsstelle zur Insertion eines Gens und ähnliches, welches in E. coli funktionieren kann. Spezifischer gesagt kann eine DNA, welche die vorstehend erwähnte Zusammensetzung hat, zum Beispiel wie folgt hergestellt werden: eine DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche aus der 5'-Region stromaufwärts eines Vitellogeningens von Xenopus gewonnen wurde, in welcher eine Östrogenrezeptor-Erkennungssequenz und ein Minimal-Promotor, gewonnen aus dem Metallothionein I-Gen der Maus, enthalten sind, werden stromaufwärts des Leuchtkäferluciferasegens (Reportergenen), gehalten in einem Plasmid, eingefügt. Weiter kann zum Beispiel ein mit einem frühen SV 40-Promotor verbundenes Blasticidin S-Resistenzgen in das vorstehend erwähnte Plasmid eingefügt werden. Dann wird die so hergestellte DNA durch ein übliches gentechnisches Verfahren in Wirtszellen eingeführt, um transformierte Zellen zu ergeben, aus welchen stabil transformierte Zellen, in welchen die DNA sicher in der Zelle beibehalten wird, gewonnen werden.
  • Weiterhin werden, wenn der gewünschte Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein Östrogenrezeptor, ist als Zelle, welche verwendet werden kann, um die erfindungsgemäße Zelle herzustellen, tierische Zellen wie aus Säugetieren gewonnene Zellen und ähnliches aufgeführt, welche ein Östrogenrezeptorgen exprimieren. Für die Expression eines Östrogenrezeptorgens in einer Wirtszelle kann es vorteilhaft sein, dass dieses Gen in einen Vektor eingeführt wird, so dass es funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden ist, welcher in einer Zelle funktionieren kann, und in die Wirtszelle eingeführt wird. Der Ausdruck „funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden" bedeutet eine Anordnung, in welcher der Promotor gebunden ist, eine Expression in der Wirtszelle zu bewirken. Beispiele für einen Promotor, welcher in tierischen Zellen funktionieren kann, schließen den Roussarkomvirus (RSV)-Promotor, den Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, den frühen oder späten Affen-Virus (SV 40)-Promotor, den Maus-Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor und ähnliches ein. Als Vektor werden Plasmide, die einen Replikationsursprung und ein Chemikalien-Resistenzgen für E. coli und ähnliches enthalten, aufgeführt und kommerziell erhältliche Vektoren zur Expression, die einen Promotor, wie vorstehend beschrieben, haben und stromabwärts davon eine Stelle zur Insertion für ein Gen haben, können verwendet werden. Wenn die DNA eines Vektors, in welche ein Östrogenrezeptorgen, funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden, welcher in tierischen Zellen funktionieren kann, eingeführt worden ist, in eine Wirtszelle eingeführt wird, um stabil transformierte Zellen zu gewinnen, in welchen das Gen sicher darin beibehalten wird, dann kann Zeit zur Durchführung der transienten Einführung eines Gens bei jedem Test gespart werden. Die solch ein Östrogenrezeptorgen enthaltende DNA kann zusammen mit der DNA, die in einem Molekül sowohl ein Ligand-gesteuertes Reportergen als auch ein selektives Markergen enthält, in eine Wirtszelle eingeführt werden oder sie kann getrennt aufeinanderfolgend eingeführt werden. In der solch ein Östrogenrezeptorgen enthaltenden DNA ist die Selektion von transformierten Zellen einfacher, wenn ein selektives Markergen, welches in einer Wirtszelle funktionieren kann und welches einen unterschiedlichen Phänotyp von dem eines selektiven Markergens hat, welches in der DNA enthalten ist, die für die Einführung eines nachstehend beschriebenen Reportergens verwendet wird, in dem gleichen Molekül enthalten ist.
  • Beispiele für das in die Wirtszelle eingeführte Östrogenrezeptorgen schließen cDNA-Gene, gewonnen aus dem menschlichen Östrogenrezeptor α-Gen (Genbank-Zugangsnummer X03635), dem menschlichen Östrogenrezeptor β-Gen (Biochem. Biophysical. Research. Com., 243 (1998): 122–126), dem Östrogenrezeptor α-Gen der Ratte (Genbank Zugangsnummer X61098) dem Östrogenrezeptor β-Gen der Ratte (Genbank-Zugangsnummer U57439), dem Östrogenrezeptor α-Gen der Maus (Genbank-Zugangsnummer M38651) und ähnliches ein. Diese Gene können auch Gene sein, in welchen eine Kozak-Konsensussequenz (Nucleic Acids Res., 12 (1984): 857–872) stromaufwärts von einem Startcodon der Translation ATG verbunden ist.
  • Wenn der gewünschte Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein Androgenrezeptor ist, werden als Zelle, welche für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle verwendet werden kann, tierische Zellen wie von Säugetieren gewonnene Zellen und ähnliches, welche ein Androgenrezeptorgen exprimieren, aufgeführt. Für die Expression eines Androgenrezeptorgens in einer Wirtszelle kann es vorteilhaft sein, dass dieses Gen in einen Vektor eingeführt wird, so dass es funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden ist, welcher in einer Zelle funktionieren kann, und in die Wirtszelle eingeführt wird. Der Ausdruck „funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden" bedeutet eine Anordnung, in welcher der Promotor gebunden ist, eine Expression in der Wirtszelle zu bewirken. Beispiele für einen Promotor, welcher in tierischen Zellen funktionieren kann, schließen den Roussarkomvirus (RSV)-Promotor, den Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, den frühen oder späten Affen-Virus (SV 40)-Promotor, den Maus-Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor und ähnliches ein. Als Vektor werden Plasmide, die einen Replikationsursprung und ein Chemikalien-Resistenzgen für E. coli enthalten, und ähnliches aufgeführt und kommerziell erhältliche Vektoren zur Expression, die einen Promotor, wie vorstehend beschrieben, haben und stromabwärts davon eine Stelle zur Insertion für ein Gen haben, können verwendet werden. Wenn die DNA eines Vektors, in welche ein Androgenrezeptorgen, funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden, welcher in tierischen Zellen funktionieren kann, eingeführt worden ist, in eine Wirtszelle eingeführt wird, um stabil transformierte Zellen zu gewinnen, in welchen das Gen sicher darin beibehalten wird, dann kann Zeit zur Durchführung der transienten Einführung eines Gens bei jedem Test gespart werden. Die solch ein Androgenrezeptorgen enthaltende DNA kann zusammen mit der DNA, die in einem Molekül sowohl ein Ligand-gesteuertes Reportergen als auch ein selektives Markergen enthält, in eine Wirtszelle eingeführt werden oder sie kann getrennt aufeinanderfolgend eingeführt werden. In der solch ein Androgenrezeptorgen enthaltenden DNA ist die Selektion von transformierten Zellen einfacher, wenn ein selektives Markergen, welches in einer Wirtszelle funktionieren kann und welches einen unterschiedlichen Phänotyp von dem eines selektiven Markergens codiert, welches in der DNA enthalten ist, die für die Einführung eines nachstehend beschriebenen Reportergens verwendet wird, in dem gleichen Molekül enthalten ist.
  • Beispiele für das in die Wirtszelle eingeführte Androgenrezeptorgen schließen cDNA-Gene, gewonnen aus einem menschlichen Androgenrezeptor α-Gen (Genbank-Zugangsnummer M23263), dem Androgenrezeptorgen der Ratte (Genbank-Zugangsnummer M23264), dem Androgenrezeptorgen der Maus (Genbank-Zugangsnummer X59592) und ähnliches ein. Diese Gene können auch Gene sein, in welchen eine Kozak-Konsensussequenz (Nucleic Acids Res., 12 (1984): 857–872) stromaufwärts von einem Startcodon der Translation ATG verbunden ist.
  • Wenn der gewünschte Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein Thyroidhormonrezeptor ist, werden als Zelle, welche für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle verwendet werden kann, tierische Zellen wie von Säugetieren gewonnene Zellen und ähnliches, welche ein Thyroidhormonrezeptorgen exprimieren, aufgeführt. Für die Expression eines Thyroidhormonrezeptorgens in einer Wirtszelle kann es vorteilhaft sein, dass dieses Gen in einen Vektor eingeführt wird, so dass dieses Gen funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden ist, welcher in einer Zelle funktionieren kann, und in die Wirtszelle eingeführt wird. Der Ausdruck „funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden" bedeutet eine Anordnung, in welcher der Promotor gebunden ist, eine Expression in der Wirtszelle zu bewirken. Beispiele für einen Promotor, welcher in tierischen Zellen funktionieren kann, schließen den Roussarkomvirus (RSV)-Promotor, den Cytomegalievirus (CMV)-Promotor, den frühen oder späten Affen-Virus (SV 40)-Promotor, den Maus-Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor und ähnliches ein. Als Vektor werden Plasmide, die einen Replikationsursprung und ein Chemikalien-Resistenzgen für E. coli enthalten, und ähnliches aufgeführt und kommerziell erhältliche Vektoren zur Expression, die einen Promotor, wie vorstehend beschrieben haben, und stromabwärts davon eine Stelle zur Insertion für ein Gen haben, können auch verwendet werden. Wenn die DNA eines Vektors, in welche ein Thyroidhormonrezeptorgen, funktionell stromabwärts von einem Promotor verbunden, welcher in tierischen Zellen funktionieren kann, eingeführt worden ist, in eine Wirtszelle eingeführt wird, um stabil transformierte Zellen zu gewinnen, in welchen das Gen sicher darin beibehalten wird, dann kann Zeit zur Durchführung der transienten Einführung eines Gens bei jedem Test gespart werden. Die solch ein Thyroidhormonrezeptorgen enthaltende DNA kann zusammen mit der DNA, die in einem Molekül sowohl ein Ligand-gesteuertes Reportergen als auch ein selektives Markergen enthält, in eine Wirtszelle eingeführt werden oder sie kann getrennt aufeinanderfolgend eingeführt werden. In der solch ein Thyroidhormonrezeptorgen enthaltenden DNA ist die Selektion von transformierten Zellen einfacher, wenn ein selektives Markergen, welches in einer Wirtszelle funktionieren kann und welches einen unterschiedlichen Phänotyp von dem eines selektiven Markergens codiert, welches in der DNA enthalten ist, die für die Einführung eines nachstehend beschriebenen Reportergens verwendet wird, in dem gleichen Molekül enthalten ist.
  • Beispiele für das in eine Wirtszelle eingeführte Thyroidhormonrezeptorgen schließen cDNA-Gene, gewonnen aus dem menschlichen Thyroidhormonrezeptor α-Gen (Genbank-Zugangsnummer M24748), dem menschlichen Thyroidhormonrezeptor β-Gen (Genbank-Zugangsnummer M26747) dem Thyroidhormonrezeptor α-Gen der Ratte (Genbank-Zugangsnummer M18028), dem Thyroidhormonrezeptor β-Gen der Ratte (Genbank-Zugangsnummer M03819) und ähnliches ein. Diese Gene können auch Gene sein, in welchen eine Kozak-Konsensussequenz (Nucleic Acids Res., 12 (1984): 857 – 872) stromaufwärts mit einem Startcodon der Translation ATG davon verbunden ist.
  • In der erfindungsgemäßen Zelle ist eine DNA nicht vorhanden (hiernach bezeichnet als das Zellzahl-Reportergen), welche durch Verbindung der DNA eines Reportergens mit der DNA eines Promotors mit einer Transkriptionsaktivität, die unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor in Kontakt gebracht wird, wobei das Reportergen ein Protein codiert, das von dem Protein unterschieden werden kann, das durch das Reportergen codiert wird, das stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und dem Minimal-Promotor besteht, welcher in der Zelle funktionieren kann.
  • Solch eine Zelle wird für gewöhnlich nicht gewonnen, außer ein nachstehend beschriebener künstlicher Arbeitsvorgang, in welchem ein vorsätzlich eingeführtes Zellzahl-Reportergen eingeführt wird, wird angewendet und die Anwesenheit oder Abwesenheit des Zellzahl-Reportergens kann zum Beispiel durch übliche gentechnische Verfahren wie PCR, Hybridisierung und ähnliches überprüft werden. Weiterhin kann, wenn die Enzymaktivität oder ähnliches des Proteins, das durch das in einem Zellzahl-Reportergen enthaltene Reportergen codiert wird, gemessen wird, dann kann die Zelle auch durch Anwesenheit oder Abwesenheit der Enzymaktivität davon oder ähnliches überprüft werden.
  • Wenn jedoch die Notwendigkeit besteht, die Zahl der Zellen durch Messung der Proteinmenge aus den Zellen zur Gewinnung hoch-genauer, gemessener Werte und ähnliches in Erfahrung zu bringen, kann es vorteilhaft sein, ein Zellzahl-Reportergen in die erfindungsgemäße Zelle getrennt einzuführen und die sich ergebende transformierte Zelle zu verwenden.
  • Als in einem Zellzahl-Reportergen enthaltenes Reportergen ist ein Gen bevorzugt, dessen Expressionsmenge einfach durch die Enzymaktivität des Proteins gemessen wird, das durch das Gen codiert wird, und welches ein unterschiedliches Reportergen ist, das ein Protein codiert, welches von einem Protein, das durch ein Reportergen codiert wird, welches in dem vorstehend erwähnten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor verwendet wird, unterschieden werden kann. Die Unterscheidung kann zum Beispiel durch Unterschiede in der Enzymaktivität, Substratspezifität und ähnliches durchgeführt werden. Die DNA solch eines Reportergens kann zum Beispiel durch Spaltung einer DNA von kommerziell erhältlichen Plasmiden, die diese Reportergene enthalten, unter Verwendung eines Restriktionsenzyms und Isolierung der gewünschten DNA genauso wie durch andere ähnliche Verfahren gewonnen werden.
  • Der „Promotor mit einer Transkriptionsaktivität, die unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor in Kontakt gebracht wird" ist ein Promotor, welcher nicht durch die Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wie vorstehend beschrieben, gesteuert wird und eine konstitutive Transkriptionsfähigkeit besitzt, wobei Beispiele davon einen tk-Promotor, RSV-Promotor, CMV-Promotor und ähnliches einschließen. Die DNA solch eines Promotors kann zum Beispiel durch Spaltung einer DNA von kommerziell erhältlichen Plasmiden, die diese Reportergene enthalten, unter Verwendung eines Restriktionsenzyms und Isolierung der gewünschten DNA genauso wie durch andere ähnliche Verfahren gewonnen werden.
  • Es ist auch möglich, eine ein Zellzahl-Reportergen enthaltende DNA durch Einfügen der DNA des vorstehend erwähnten Reportergens stromabwärts von solch einem Promotor von kommerziell erhältlichen Plasmiden, die den Promotor enthalten, herzustellen.
  • Die gewünschte Zelle kann durch Einfügen der das Ligand-gesteuerte Reportergen enthaltenden DNA und der das Zellzahl-Reportergen enthaltenden DNA in Vektoren wie Plasmide und ähnliches und durch Einführen der Vektoren in die vorstehend erwähnte Zelle durch Selektion von Zellen, in welchen diese Reportergene sicher darin beibehalten werden, hergestellt werden. Spezifisch gesagt werden, wenn der gewünschte Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor ein Arylkohlenwasserstoffrezeptor ist, ein Plasmid, versehen mit einer Leuchtkäferluciferase (Ligand-gesteuerter Transkriptionskontrollfaktor), stromabwärts von einer Nucleotidsequenz verbunden, welche eine Dioxin-gesteuerte Sequenz, gewonnen aus der 5'-Region stromaufwärts vom Cytochrom-P4501A1-Gen und stromabwärts von einer Nucleotidsequenz, die für die Initiation der Transkription notwendig ist und aus der 5'-Region stromaufwärts von einem Ya-Untereinheit-Gen der Glutathion S-Transferase abstammt, welche genauso wie einem Plasmid, versehen mit einem Renilla-Luciferasegen (Zellzahl-Reportergen), stromabwärts von einem tk-Promotor verbunden, hergestellt und diese Plasmide werden in eine Hepa1c1c7-Zelle mit endogenem Arylkohlenwasserstoff-Rezeptorgen eingeführt. In solchen Fällen kann auch ein Expressionsplasmid eines selektiven Markergens wie eines Chemikalien-Resistenzgens und ähnliches gleichzeitig eingeführt werden, um eine einfache Selektion der Zellen, in welche diese Reportergene eingeführt wurden, bereitzustellen. Beispiele des Chemikalien-Resistenzgens, welches, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden kann, schließen ein Neomycinresistenzgen (Aminoglycosidphosphotransferase), ein Blasticidin S-Resistenzgen, ein Hygromycinresistenzgen und ähnliches ein.
  • Um die DNA eines mit beiden vorstehend erwähnten Reportergenen versehenen Plasmids in zum Beispiel Zellen, die aus Säugetieren gewonnen wurden, einzuführen, werden zum Beispiel die Zellen als erstes in ein Kulturgefäß gesetzt (105 bis 105 Zellen/Schale von 6 bis 7 cm Durchmesser) und über einige Stunden bis zu etwa über Nacht bei 37°C unter den Bedingungen von 5% CO2 und gesättigter Feuchtigkeit unter Verwendung eines etwa 5 bis 10% (Gew./Vol.) Serum enthaltenden α-MEM-Mediums gezüchtet. In die so gezüchtete Zellen wird Plasmid-DNA, versehen mit Reportergenen, eingeführt. Als Verfahren zur Einführung von DNA in eine Zelle werden ein übliches Lipofektions-Verfahren, ein DEAE-Dextran-Verfahren, ein Calciumphosphat-Verfahren, ein Elektroporations-Verfahren und ähnliches aufgeführt. Spezifisch gesagt, wenn ein kommerziell erhältliches Lipofektin (hergestellt durch GIBCO-BRL) verwendet wird, ist es vorteilhaft, dass ein Arbeitsvorgang entsprechend der angehängten Anleitung durchgeführt wird und dass die Menge der eingeführten Plasmid-DNA, die Menge eines Lipofektins, die Art der Zelle, die Zahl der Zellen und ähnliches im Voraus untersucht werden und die optimalen Bedingungen bestimmt werden. Wenn ein ein Chemikalien-Resistenzgen enthaltendes Plasmid zusammen mit einem Plasmid, das mit einem Reportergen versehen ist, eingeführt wird, kann es vorteilhaft sein, dass die Menge von DNA eines ein Chemikalien-Resistenzgen enthaltenden Plasmids etwa 1/5 bis 1/10 der Menge der DNA des mit einem Reportergen versehenen Plasmids ist. Als Plasmid-DNA wird DNA, die durch ein CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren aufgereinigt wurde, oder DNA, welche eine entsprechende Reinheit hat, verwendet und es kann auch möglich sein eine Plasmid-DNA zu verwenden, die durch vorangehende Spaltung mit einem Restriktionsenzym, welches keine Erkennungsstelle in für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle notwendigen Regionen (eine Erkennungssequenz eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, ein Promotor, ein Reportergen, ein selektives Markergen und ähnliches) hat, linearisiert wurde. Nach Einführung einer Plasmid-DNA in die Zelle wird das Medium durch ein Serum enthaltendes Medium ersetzt und die Züchtung wird etwa über Nacht bis zwei Tage fortgesetzt. Als nächstes wird die Zelle aus dem Kulturgefäß durch Trypsin-Behandlung oder ähnliches entsprechend einem üblichen Verfahren entfernt und in ein neues Kulturgefäß übertragen. Direkt nach der Durchführung des Transfers oder nach Züchtung für ein bis zwei Tage wird das Medium durch ein Medium ersetzt, welches Bedingungen hat, die einem in die Zelle eingeführten selektiven Markergen entsprechen, und die Züchtung wird in dem Medium fortgesetzt, welches einem selektiven Markergen entsprechende Bedingungen hat, bis nicht-transformierte Zellen verschwinden und von den transformierten Zellen ausgehende Kolonien eine angemessene Größe erreichen. Während dieses Verfahrens wird ggf. ein Austausch der Kultur mit einer Häufigkeit von ein- bis zweimal pro Woche durchgeführt. Durch Durchführung solcher Verfahren kann die Zelle, welche das Reportergen sicher darin beibehält, gewonnen werden, so dass die stabil transformierte Zelle gewonnen werden kann. Ggf. kann der vorstehend beschriebene Arbeitsvorgang zur Einführung eines Reportergens wiederholt werden. Um zu überprüfen, dass das eingeführte Reportergen in der Zelle sicher beibehalten wird, kann es vorteilhaft sein, die DNA dieser Zelle entsprechend üblichen gentechnischen Verfahren zu präparieren und die Anwesenheit des Reportergens durch Anwendung eines Verfahrens wie einer PCR, eines Southern-Hybridisierungsverfahrens und ähnliches unter Verwendung eines DNA-Fragmentes, das einen Teil der Nucleotidsequenz des eingeführten Reportergens oder ähnliches besitzt, als Primer oder als Sonde.
  • Als nächstes ist es möglich, bevorzugte Zellen für das Messen der Agonist- oder Antagonist-Aktivität einer chemischen Substanz mittels der die Transkription fördernden Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors unter Nutzung der Ligand-Steuerbarkeit der Expressionsmenge des Reportergens in der so gewonnenen Zelle als Indikator auszuwählen. Spezifisch gesagt wird zuerst die so gewonnene Kolonie in mehrere Teile aufgeteilt und erneut angeimpft, den Zellen wird erlaubt zu wachsen, eine Lösung des Liganden des gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors wird einem Teil der gewachsenen Zellen hinzugefügt (Feld der Zugabe des Liganden) und über etwa vier Stunden bis zwei Tage gezüchtet und dann werden die Expressionsmengen des Ligand-gesteuerten Reportergens und des Zellzahl-Reportergens gemessen. Weiterhin wird als Kontrolle nur das Lösungsmittel, das für die Herstellung der vorstehend erwähnten Ligand-Lösung verwendet wurde, zu einem anderen Teil der vorstehend erwähnten Zellen hinzugefügt (Kontrollfeld) und in einer ähnlichen Weise gezüchtet, so dass die Expressionsmengen der jeweiligen Reportergene gemessen werden.
  • Obwohl das Verfahren zur Messung der Expressionsmenge eines Reportergens auch von der Art des verwendeten Reportergens abhängt, wird in üblichen Fällen ein Zell-Lyse-Wirkstoff der Zielzelle hinzugefügt, welche gemessen werden soll, um eine Zellextrakt-Lösung herzustellen, und die Menge der in der sich ergebenden extrahierten Lösung enthaltenen Proteine, welche durch das Reportergen codiert werden, wird gemessen. Wenn zum Beispiel ein durch das Reportergen codierte Protein eine Enzymaktivität hat, wird es einem für dieses Enzym spezifischen Substrat erlaubt sich mit der aus den Zellen extrahierten Lösung umzusetzen, die durch das Reportergen codierte Proteine enthält, und die Menge des verbleibenden Substrats und die Menge des Reaktionsprodukts werden unter Verwendung der Menge der Lichtemission, der Fluoreszenzabsorption oder der Absorption oder ähnlichem als Indikatoren gemessen. Spezifisch gesagt tritt die Lichtemission im Fall der Verwendung eines Luciferasegens als Reportergen, wenn Luciferin, welches ein Substrat der Luciferase ist, mit einer Zellextrakt-Lösung umgesetzt wird, in einer Stärke proportional zu der Menge der Luciferase in der aus den Zellen extrahierten Lösung auf. Deshalb kann durch Messung dieser Lichtemissionsstärke durch ein Messgerät wie einem Luminometer und ähnlichem die Menge von Luciferase in der aus den Zellen extrahierten Lösung und die Expressionsmenge eines Luciferasegens bestimmt werden.
  • Hinsichtlich der Expressionsmengen eines Reportergens wird durch Subtraktion der Expressionsmenge in einem Kontrollfeld von der Expressionsmenge in einem Feld der Zugabe des Liganden die Zunahme in der Expressionsmenge des Reportergens durch Kontakt mit dem Liganden bestimmt. Dann können Zellen ausgewählt werden, in welchen die Zunahme der Expressionsmenge eines Reportergens durch Kontakt mit dem Liganden wenigstens zweifach, bevorzugt zehnfach oder mehr der Expressionsmenge in einem Kontrollfeld ist. Weiterhin können in dem Fall, wo die erfindungsgemäße Zelle ein Zellzahl-Reportergen umfasst, da es bevorzugt ist, dass die Expressionsmenge eines Zellzahl-Reportergens nicht durch Kontakt mit dem Liganden variiert, vorteilhafterweise Zellen ausgewählt werden, in welchen die Zunahme der Expressionsmenge eines Zellzahl-Reportergens durch Kontakt mit dem Liganden wenigstens die Hälfte oder weniger der Zunahme in der Expressionsmenge eines Ligand-gesteuerten Reportergens durch Kontakt mit dem gleichen Liganden ist. Weiterhin werden, wenn in der so erhaltenen Kolonie keine gleichförmig transformierte Zelle vorhanden ist, die Zellen verdünnt und weiter gezüchtet und es werden Kolonien, welche gleichförmig transformierte Zellen besitzen, ausgewählt.
  • Um die erfindungsgemäße Zelle herzustellen, kann es vorteilhaft sein, dass die, wie vorstehend beschrieben, hergestellte „DNA, die in einem Molekül die folgenden Gene (a) und (b) umfasst: (a) ein Reportergen, dass stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor besteht, der in der Zelle funktionieren kann, und (b) ein selektives Markergen, dass in der Zelle funktionieren kann" in die Wirtszelle eingeführt wird und stabil transformierte Zellen gewonnen werden. Spezifisch gesagt werden als erstes Wirtszellen wie eine MCF7-Zelle und ähnliches in eine Schale überführt (105 bis 107 Zellen/Schale von 6 bis 7 cm Durchmesser) und über etwa einige Stunden bis über Nacht bei 37°C unter Bedingungen von 5% CO2 und gesättigter Feuchtigkeit unter Verwendung eines etwa 5 bis 10% (Gew./Vol.) Serum enthaltenden α-MEM-Mediums gezüchtet. In die so gezüchteten Zellen wird die vorstehend genannte DNA eingeführt. Als Verfahren zur Einführung von DNA werden übliche Verfahren wie ein übliches Elektroporations-Verfahren, ein Calciumphosphat-Verfahren, ein Lipofektions-Verfahren und ähnliches aufgeführt. Spezifisch gesagt ist es vorteilhaft, wenn ein kommerziell erhältliches Lipofectamin (hergestellt durch GIBCO) verwendet wird, dass ein Arbeitsvorgang entsprechend der angehängten Anleitung durchgeführt wird. Und es ist vorteilhaft, dass die Menge des Lipofectamins basierend auf der Zellmenge, die Menge der eingeführten DNA und ähnliches im Voraus untersucht werden und dass die optimalen Bedingungen bestimmt werden. Die Reinheit einer in eine Wirtszelle eingeführten DNA ist wünschenswerterweise die Reinheit einer Plasmid-DNA, die durch ein CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren aufgereinigt wurde, oder annähernd eine gleichwertige Reinheit. Hinsichtlich der Form einer DNA, die in eine Wirtszelle eingeführt wird, kann die DNA eines Plasmids, versehen mit dem Ligand-gesteuerten Reportergen und dem selektiven Markergen, wie vorstehend beschrieben, auch intakt in der Form eines Rings in eine Wirtszelle eingeführt werden, in üblichen Fällen kann es jedoch vorteilhaft sein, dass die DNA durch Schnitt an einer Restriktionsenzym-Stelle linearisiert wird, die in einer Region vorhanden ist, die keine Wirkung auf die Expression eines jeden Gens ausübt, welches in die Wirtszelle eingeführt wird.
  • Um eine stabil transformierte Zelle zu erhalten, wird als erstes eine Zelle, in welche die DNA, wie vorstehend beschrieben, eingeführt worden ist, ohne jegliche zusätzliche Behandlung für etwa einen Tag in einer üblichen Zell-Züchtungslösung (Medium) gezüchtet. Dann wird die Zelle entsprechend einem gewöhnlichen Verfahren entfernt (Trypsin-Behandlung und ähnliches) und erneut übertragen und dann wird direkt die Züchtung unter selektiven Bedingungen entsprechend dem in eine Wirtszelle eingeführten, für Zellen selektiven Markergen begonnen. Es wird nämlich, wenn das für die Zelle selektive Markergen ein Chemikalien-Resistenzgen ist, die Chemikalie, gegen welche die transformierte Zelle resistent ist, dem Medium hinzugefügt und die Züchtung wird in Anwesenheit der Chemikalie fortgesetzt, bis eine von der transformierten Zelle abstammende Kolonie eine angemessene Größe erreicht, wie etwa über ein bis zwei Wochen. Während dieses Verfahrens kann ggf. ein Austausch mit neuem Medium, welchem die Chemikalie hinzugefügt wird, in einer Häufigkeit von ein- bis dreimal pro Woche durchgeführt werden. Durch Gewinnen der so erhaltenen Kolonie wird eine stabil transformierte Zelle erhalten.
  • Nachdem die gewonnene Kolonie in einige Portionen geteilt und erneut angeimpft worden ist, wird es den Zellen erlaubt zu wachsen, dann wird eine Lösung, welche einen Liganden des gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors enthält, zu einer Portion der gezüchteten Zellen hinzugefügt, dann wird über etwa 24 Stunden gezüchtet, so dass die Expressionsmengen des Ligand-gesteuerten Reportergens gemessen werden können. Weiterhin werden als Kontrollen die Expressionsmengen von Systemen, welchen nur ein Lösungsmittel hinzugefügt wird, gemessen. Obwohl das Verfahren zur Messung der Expressionsmenge eines Ligand-gesteuerten Reportergens von der Art des verwendeten Reportergens abhängt, wird in üblichen Fällen, außer in Fällen, in welchen ein Reportergenprodukt in ein Medium sezerniert wird, die Plasmamembran der Zelle durch Behandlung mit einem Zelllyse-Wirkstoff, Ultraschallbehandlung und ähnliches aufgebrochen, um eine aus Zellen extrahierte Lösung herzustellen und das Reportergenprodukt, welches in dieser aus Zellen extrahierten Lösung enthalten ist, zu quantifizieren. Wenn zum Beispiel das Reportergenprodukt ein Enzymprotein ist, wird das Enzymproteine in der extrahierten Lösung mit einem Substrat, welches für dieses Enzym spezifisch ist, umgesetzt und die Enzymaktivität durch das Reportergenprodukt wird durch Messung der Menge der Lichtemissionsmenge, Fluoreszenzmenge, Absorption und ähnliches quantifiziert und wird als ein Indikator für die Menge des Reportergenprodukts und in Fortführung als Anhalt für die Expressionsmenge des Reportergens verwendet. Es werden Zellen gewonnen, in welchen die Expressionsmenge eines Reportergens in dem System, in welchem es einer Zelle erlaubt wird, mit einem Liganden Kontakt zu haben, wenigstens die zweifache, bevorzugt die fünffache oder mehr basierend auf der Expressionsmenge des Reportergens in dem System, in welchem nur ein Lösungsmittel hinzugefügt wird, ist. Wenn in der so erhaltenen Kolonie keine gleichförmig transformierten Zellen enthalten sind, werden die Zellen verdünnt und weiter gezüchtet und Kolonien, welche gleichförmig transformierte Zellen haben, werden ausgewählt.
  • Die erfindungsgemäße Zelle, welche, wie vorstehend beschrieben, erhalten wird, kann zum Beispiel verwendet werden, um eine chemische Substanz, die eine Agonist-Wirkung, und eine chemische Substanz, die eine Antagonist-Wirkung gegenüber einem Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor zeigt, zu identifizieren.
  • Spezifisch gesagt werden die erfindungsgemäßen Zellen als erstes in ein Zellkulturgefäß gesetzt und gezüchtet. Wenn zum Beispiel eine 6-Mulden-Platte verwendet wird, kann es vorteilhaft sein, dass Zellen in einer Zahl von etwa 103 bis 2 × 104 pro Mulde dorthinein gesetzt werden und für etwa einige Stunden bis über Nacht gezüchtet werden. Weiterhin kann es auch zulässig sein, wenn ein Medium, welchem Serum hinzugefügt wurde, verwendet wird, dass das zu einem Medium hinzuzufügende Serum zum Beispiel mit Aktivkohle und ähnlichem behandelt wird, um vorab einen im Serum enthaltenen Liganden zu entfernen. Dann wird die chemische Substanz dieser Zellkulturlösung hinzugefügt. Wenn die Agonist-Aktivität der chemischen Substanz gemessen wird, wird eine Lösung, welche die chemische Substanz aufgelöst in dem Lösungsmittel besitzt, oder nur das Lösungsmittel der vorstehend erwähnten Zellkulturlösung hinzugefügt, so dass die Volumen-Endkonzentration des Lösungsmittels in der Kulturlösung etwa 0,5% bis 2% ist. Weiterhin wird, wenn die Agonist-Aktivität einer chemischen Substanz gemessen wird, ein System hergestellt, das durch Hinzufügen einer Lösung, hergestellt durch Lösen eines Liganden des gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors (im Falle eines Arylkohlenwasserstoff-Rezeptors der Ligand davon, zum Beispiel Dioxin, im Falle eines Östrogenrezeptors, welcher einer der intranuklearen Hormonrezeptoren ist, der Ligand davon, zum Beispiel 17-β-Östradiol, im Falle eines Androgenrezeptors, welcher einer der intranuklearen Hormonrezeptoren ist, der Ligand davon, zum Beispiel Dihydrotestosteron (hiernach abgekürzt als DHT), im Falle eines Thyroidhormonrezeptors, welcher einer der intranuklearen Hormonrezeptoren ist, der Ligand davon, zum Beispiel 3,3',5-Trijodo-L-Thyronin (3,5,3') (hiernach abgekürzt als T3), und ähnliches) in einem Lösungsmittel, zu der vorstehend erwähnten Kulturlösung hergestellt wird, so dass die Konzentration des Liganden in der Kulturlösung für gewöhnlich nahe dem EC50 ist, und es wird ein System hergestellt, welches durch weiteres Hinzufügen einer chemischen Substanz zu dem vorstehend erwähnten System erhalten wird. Das zu der Kulturlösung, wie vorstehend beschrieben, hinzuzufügende Lösungsmittel verwendet zum Beispiel üblicherweise destilliertes Wasser, Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethanol und ähnliches. Wenn eine chemische Substanz in Form einer wässrigen Lösung hinzugefügt wird, kann es vorteilhaft sein, dass diese wässrige Lösung durch Filtration durch einen Filter, der eine Porengröße von 20 μm oder weniger hat, und ähnliches sterilisiert wird und dann dem Kultursystem hinzugefügt wird.
  • Nachdem die vorstehend erwähnte Zelle zum Beispiel für einige Stunden bis 72 Stunden gezüchtet wurde, wird dann die Expressionsmenge eines Reportergens, wie vorstehend beschrieben, gemessen. Wenn zum Beispiel das Reportergen ein Leuchtkäferluciferasegen ist, wird zuerst der Kulturüberstand entfernt, die an die Gefäßwände adhärierenden Zellen werden dann mit PBS (–) und ähnliches gewaschen und ein Zelllyse-Wirkstoff und ähnliches wird den Zellen hinzugefügt, um die Zellen aufzubrechen, um ein aus den Zellen extrahiertes Produkt herzustellen. Dieses aus den Zellen extrahierte Produkt wird als Probe mit Luciferase, welches ein Reportergenprodukt darin ist, mit Luciferin umgesetzt, welches ein Substrat für Luciferase ist, und die erhaltenen Menge der Lichtemission wird quantifiziert. Im Testsystem zur Messung der Agonist-Aktivität einer chemischen Substanz wird, wenn die Luciferaseaktivität pro Zelle in einer Zelle eines Systems, in welchem die chemische Substanz hinzugefügt wird, höher ist als in einer Zelle des Systems, in welchen nur ein Lösungsmittel hinzugefügt wird, wie wenn die Menge eines Reportergenprodukts größer ist, angenommen, dass diese chemische Substanz eine Agonist-Aktivität gegenüber dem Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor zeigt. Weiterhin wird in einem Testsystem zur Messung der Antagonist-Aktivität einer chemischen Substanz, wenn die Luciferaseaktivität einer Zelle des Systems, in welchem der Ligand und die chemische Substanz hinzugefügt werden, im Vergleich mit der Luciferaseaktivität einer Zelle des Systems, in welchem nur ein Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors nach dem Test hinzugefügt wird, niedriger ist, angenommen, dass die chemische Substanz eine Antagonist-Aktivität gegenüber dem Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor hat.
  • Wenn in dem wie vorstehend beschriebenen System zur Untersuchung eine chemische Substanz eine nicht-spezifische Toxizität in einer Zelle zeigt, kann die Transkriptionsaktivität eines Reportergens manchmal unabhängig von der Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zur Transkriptionskontrolle abnehmen. Weiterhin kann, wenn eine chemische Substanz eine nicht-spezifische transkriptionsfördernde Wirkung oder die Transkription unterdrückende Wirkung auf einen Minimal-Promotor zeigt, die Transkriptionsaktivität eines Reportergens manchmal unabhängig von der Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zur Transkriptionskontrolle zunehmen oder abnehmen. Dann kann es ggf. auch zulässig sein zum Beispiel eine Zelle herzustellen, welche stabil mit einem Reportergenen transformiert ist, das funktionell mit einem Promotor verbunden ist, der die Funktion hat ein Gen konstitutiv zu transkribieren, und dies dann als Vergleichskontrolle gegen die erfindungsgemäße Zelle zu verwenden. Spezifisch gesagt wird zum Beispiel eine DNA, die ein Reportergenen enthält, das funktionell mit einem RSV-Promotor, TK-Promotor oder ähnlichem verbunden ist, hergestellt und Wirtszellen werden dann stabil mit der DNA transformiert. Unter den sich ergebenden Kolonien werden Zellen, die ein Reportergen konstitutiv und stabil exprimieren, (hiernach bezeichnet als Kontrollzelle) ausgewählt. Dieser Zelle wird es erlaubt Kontakt mit einer chemischen Substanz in einer ähnlichen Weise, wie vorstehend beschrieben, zu haben und die Expressionsmenge des Reportergens wird quantifiziert. Wenn die Expressionsmenge eines Reportergens der Zelle durch Kontakt der chemischen Substanz abnimmt oder zunimmt, wird angedeutet, dass diese chemische Substanz eine nicht-spezifische Wirkung auf eine Zelle oder einen Promotor zeigt. Dann kann es auch zulässig sein, dass die Ergebnisse eines Tests unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle in angemessener Weise basierend auf solchen Ergebnissen korrigiert werden und die wie vorstehend beschriebene Wirkung einer chemischen Substanz auf einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor bewertet werden kann.
  • Wie vorstehend beschrieben, kann die Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors erhält, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle in der Anwesenheit verschiedener chemischer Substanzen gemessen werden und die Wirkung der chemischen Substanz auf den Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor kann basierend auf dieser Messung bewertet werden und ein Agonist und Antagonist gegen den Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor können identifiziert werden. Solche Bewertungs- und Identifizierungsverfahren können zum Nachweis von endokrinen Störstoffen und ähnlichem, die die vorliegende Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollwirkung haben, und für eine Suche nach aktiven Bestandteil von Arzneimitteln, die auf einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor zielgerichtet sind, verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäße Zelle ist kryokonservierbar und kann ggf. für die Verwendung aktiviert werden. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle können im Vergleich zu dem Fall der Verwendung einer Zelle, in welche ein Ligand-gesteuertes Reportergenen transient eingeführt worden ist, komplizierte Arbeitsvorgänge wie die Einführung eines Gens, die Selektion von Zellen und ähnliches in jedem Test ausgeschlossen werden. Weiterhin können in dem Test Zellen verwendet werden, die eine spezifizierte Fähigkeit haben, so dass Messungen mit einer ausgezeichneten Reproduzierbarkeit möglich sind. Konsequenterweise ist die erfindungsgemäße Zelle ebenfalls für zum Beispiel die Durchführung einer Suche nach, eines Nachweises und ähnliches einer chemischen Substanz, wie vorstehend beschrieben, durch ein automatisiertes Durchmusterungsverfahren in großem Maßstab wie eine Hochdurchsatz-Durchmusterung und ähnliches nützlich.
  • Die folgenden Beispiele und Test-Beispiele werden die vorliegende Erfindung weiter im Detail darstellen, begrenzen deren Umfang aber nicht.
  • Beispiel 1
  • (Herstellung von DNA (Plasmid), die in einem Molekül sowohl, das Ligand-gesteuerte Reportergen als auch das selektive Markergen umfasst)
  • (1) Eine Erkennungssequenz eines Arylkohlenwasserstoff-Rezeptors enthaltendes Plasmid
  • Die genomische DNA wurde aus einer aus Menschen gewonnenen Hep G2-Zelle unter Verwendung eines Isogen-Reagens (hergestellt durch Nippon Gene) entsprechend einem Verfahren aufgereinigt, das in dem an das Reagenz angehängten Protokoll beschrieben war. Eine PCR wurde unter Verwendung des gereinigten Genoms als Matrize und Verwendung eines Vorwärts-Primers:
    Figure 00360001
    und eines reversen Primers:
    Figure 00360002
    zur Vervielfältigung einer DNA durchgeführt, welche eine Nucleotidsequenz (J. Biochem., 110 (1991) 232–236) 750 Bp bis 1370 Bp stromaufwärts von der stromaufwärts gelegenen TATA-Box eines menschlichen CYP1A1-Gens besitzt, welche XRE enthält, welches eine Erkennungssequenz für einen Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor ist. Die amplifizierte DNA wurde gewonnen und die Enden wurden unter Verwendung eines Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) (hiernach wird diese DNA als XRE-DNA bezeichnet) in glatte Enden überführt.
  • Zwei Oligonucleotide;
    Figure 00360003
    die aus Nucleotidsequenzen zusammengesetzt sind, die von einer Nucleotidsequenz nahe der TATA-Box eines Metallothionein I-Gens aus der Maus und von der Leadersequenz (Genbank-Zugangsnummer J00605) abstammen, wurden aneinandergelagert, um eine doppelsträngige DNA zu erhalten und es wurde der T4- Polynucleotidkinase erlaubt darauf einzuwirken, um beide Enden davon zu phosphorylieren (hiernach wird diese DNA als TATA-DNA bezeichnet). Andererseits wurde ein Plasmid pGL3 (hergestellt durch Promega), welches eine Leuchtkäferluciferasegen enthält, mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII gespalten, dazu wurde weiter bakterielle alkalische Phosphatase (BAP) hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Dann wurde diese inkubierte Lösung einer Elektrophorese unter Verwendung einer Agarose, welche einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen, um DNA zu gewinnen, die eine elektrophoretische Bewegung entsprechend der Länge des BglII-HindIII-Fragmentes zeigt, das ein aus pGL3 stammendes Luciferasegen enthält. Etwa 100 ng dieser DNA und 1 μg der vorstehend erwähnten TATA-DNA wurden gemischt und über eine T4-Ligase verbunden, um das Plasmid pGL3-TATA herzustellen.
  • Dann wurde pGL3-TATA mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut, dazu wurde weiter BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Diese inkubierte Lösungen wurde unter Verwendung eines Agarosegels, welches einen niedrigen Schmelzpunkt hat, einer Elektrophorese unterzogen, um eine DNA in den Bandenbereichen aus diesem Gel zu gewinnen. Nachdem etwa 100 ng dieser DNA und etwa 1 μg der vorstehend erwähnten XRE-DNA gemischt und mit T4-Ligase umgesetzt worden waren, wurde die Reaktionslösung in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt (hergestellt durch TOYOBO). Die DNA der jeweiligen Plasmide, enthalten in einigen Kolonien von E. coli, welche eine Ampicillinresistenz zeigten, wurde gereinigt und wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und XhoI gespalten, so dass die gespaltene Lösung durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht wurde. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher eine Kopie von etwa 600 Bp DNA, entsprechend der XRE-DNA, in die SmaI-Stelle von pGL3-TATA eingeführt worden war, wurde ausgewählt und als pGL3-TATA-1A1 benannt.
  • Dann wurde ein Plasmid pUCSV-BSD (gekauft von FUNAKOSHI) mit BamHI gespalten, um eine DNA herzustellen, die eine ein Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette codiert. Diese DNA wurde mit jener DNA gemischt, welche durch Spaltung und BAP-Behandlung des vorstehend erwähnten Plasmids pGL3-TATA-1A1 erhalten wurde, um ein Gemisch zu erhalten, welches mit einer T4-Ligase umgesetzt wurde, und die umgesetzte Lösung wurde dann in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt (hergestellt durch TOYOBO). Aus den sich ergebenden ampicillinresistenten E. coli-Clonen wurden Plasmid-DNAs hergestellt und mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, so dass die gespaltene Lösung durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht wurde. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher die das Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette in die BamHI-Schnittstelle des Plasmids pGL3-TATA-1A1 eingeführt worden war, wurde ausgewählt und als Plasmid pGL3-TATA-1A1-BSD benannt.
  • (2) Ein die Erkennungssequenz eines Östrogenrezeptors enthaltendes Plasmid
  • Ein Oligonucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz (5'-TCGACAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAG-3') im Bereich stromaufwärts eines aus Xenopus gewonnenen Vitellogeningens, enthaltend eine Erkennungssequenz eines Östrogenrezeptors, und ein Oligonucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz komplementär zu der vorstehend erwähnten Nucleotidsequenz, wurden durch einen DNA-Syntheseautomaten synthetisiert und die Produkte wurden aneinandergelagert, um eine doppelsträngige DNA zu erhalten (hiernach bezeichnet als ERE-DNA), dann wurde eine T4-Ligase mit der DNA umgesetzt, um es der doppelsträngigen DNA zu erlauben sich im Tandem zu verbinden, es wurde der T4-Polynucleotidkinase erlaubt darauf zu wirken, um beide Enden zu phosphorylieren.
  • Dann wurde das Plasmid pGL3-TATA, das wie in dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde (1), mit dem Restriktionsenzym SmaI gespalten, dazu wurde weiter BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Diese inkubierte Lösung wurde einer Gelelektrophorese mit einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt unterzogen, um die DNA im Bandenbereichen aus dem Gel zu gewinnen. Etwa 100 ng dieser DNA und etwa 1 μg der vorstehend erwähnten DNA, erhalten durch Bindung der ERE-DNA im Tandem und Phosphorylieren der Enden davon, wurden gemischt um ein Gemisch zu erhalten, welches mit einer T4-Ligase umgesetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt (hergestellt durch TOYOBO). Die DNAs der jeweiligen Plasmide, enthalten in einigen Kolonien von E. coli, welche eine Ampicillinresistenz zeigten, wurden gereinigt und wurden mit den Restriktionsenzymen KpnI und XhoI gespalten, und die gespaltene Lösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher fünf Kopien von ERE-DNAs im Tandem in die SmaI-Stelle von pGL3-TATA eingeführt worden waren, wurde ausgewählt und als pGL3-TATA-EREx5 benannt.
  • Dann wurde ein Plasmid pUCSV-BSD (gekauft von FUNAKOSHI) mit BamHI gespalten, um DNA herzustellen, die eine ein Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette codiert. Diese DNA wurde mit einer DNA gemischt, die durch die Spaltung mit BamHI und die Behandlung mit BAP des vorstehend erwähnten Plasmids pGL3-TATA-EREx5 erhalten wurde, um ein Gemisch zu erhalten, welches mit einer T4-Ligase umgesetzt wurde, und die Reaktionslösung wurde dann in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt. Aus den sich ergebenden ampicillinresistenten E. coli-Clonen wurden Plasmid-DNAs hergestellt und mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, und die gespaltene Lösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher die das Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette in die BamHI-Schnittstelle des Plasmids pGL3-TATA-EREx5 eingeführt worden war, wurde ausgewählt und als Plasmid pGL3-TATA-EREx5-BSD benannt.
  • Beispiel 2
  • (Herstellung einer DNA (Plasmid) die in dem gleichen Molekülen sowohl, ein Ligand-gesteuertes Reportergen als auch ein selektives Markergen umfasst)
  • Zuerst wurden ein Vorwärts-Primer: 5'-CGGCAGATCTTCTTTAGTTCTATGATGACAC-3' und ein reverser Primer: 5'-CGGAAGCTTGATCTGCGGCACGCTGTTGA-3' basierend auf dem Abschnitt des HSV-tk-Promotors eines pTKβ-Plasmids (hergestellt durch Clone Tech) entworfen und durch einen DNA-Syntheseautomaten synthetisiert. Unter Verwendung dieser zwei Primer wurde eine PCR unter Verwendung von 1 ng des Plasmids pTKβ als Matrize durchgeführt, um eine 185 Bp-DNA zu erhalten, die eine Nucleotidsequenz von der Base –131 (der Startpunkt der Transkription ist +1) bis zur Base +54 in der HSV-tk-Promotorregion enthält. Abschnitte nahe dem 5'-Ende und dem 3'-Ende dieser DNA enthielten die Erkennungsstelle von BglII bzw. die Erkennungsstelle von HindIII, die durch die vorstehend erwähnten PCR-Primer eingeführt wurden. Dann wurde diese DNA mit BglII und HindIII gespalten und dann einer Gelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat [NusieveGTG (hergestellt durch FMC)], unterzogen, um die DNA aus dem Gel zu gewinnen. Andererseits wurde ein Plasmid pGL (hergestellt durch Promega), das eine Leuchtkäferluciferasegen enthält, mit BglII und HindIII gespalten, dazu wurde weiter bakterielle alkalische Phosphatase (BAP) hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Dann wurde diese inkubierte Lösung einer Elektrophorese unter Verwendung einer Agarose, welche einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und DNA, die eine elektrophoretische Bewegung entsprechend der Länge BglII-HindIII-Fragmentes zeigt, das ein aus pGL3 stammendes Luciferasegen enthielt, wurde gewonnen. Etwa 100 ng dieser DNA wurden mit etwa 1 μg der vorstehend erwähnten DNA von etwa 200 Bp, die die, wie vorstehend beschrieben, hergestellte HSV-tk-Promotorregion enthielt, gemischt, was mit einer T4-Ligase umgesetzt wurde und in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle (hergestellt durch TOYOBO) eingeführt wurde. Ein Plasmid wurde aus dem sich ergebenden ampicillinresistenten Clon hergestellt und daraus wurde ein Plasmid ausgewählt, in welchem eine Kopie des HSV-tk-Promotors zwischen die BglII-HindIII-Stellen von pGL3 eingeführt worden war, und wurde pGL3-tk genannt.
  • Eine T4-Ligase wurde mit der entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 (2) hergestellten ERE-DNA umgesetzt, was der doppelsträngigen DNA erlaubte im Tandem zu binden, und der T4-Polynucleotidkinase wurde erlaubt darauf zu wirken, um die beiden Enden zu phosphorylieren.
  • Das vorstehend erwähnte pGL3-tk wurde mit einem Restriktionsenzym, SmaI, gespalten, dazu wurde weiter BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 65°C über 1 Stunde gehalten. Diese inkubierte Lösung wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines Agarosegels mit einem niedrigen Schmelzpunkt unterzogen, um DNA im Bandenbereichen aus dem Gel zu gewinnen. Etwa 100 ng dieser DNA und etwa 1 μg der vorstehend erwähnten DNA, welche im Tandem gebunden wurde und deren Enden phosphoryliert wurden, wurden gemischt, um ein Gemisch zu erhalten, welches mit einer T4-Ligase umgesetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt (hergestellt durch TOYOBO). Die DNAs der jeweiligen Plasmide, enthalten in einigen Kolonien von E. coli, welche Ampicillinresistenz zeigten, wurden gereinigt und wurden mit den Restriktionsenzymen KpnI und XhoI gespalten, und die gespaltene Lösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher fünf Kopien von ERE-DNAs im Tandem in die SmaI-Stelle von pGL3-tk eingeführt worden waren, wurde ausgewählt und als pGL3-tk-EREx5 benannt.
  • Dann wurde ein Plasmid pUCSV-BSD (gekauft von FUNAKOSHI) mit BamHI gespalten, um DNA herzustellen, die eine ein Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette codiert. Diese DNA wurde mit DNA gemischt, die durch die Spaltung mit BamHI und die Behandlung mit BAP des vorstehend erwähnten Plasmids pGL3-tk-EREx5 erhalten wurde, um ein Gemisch zu erhalten, welches mit einer T4-Ligase umgesetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt. Aus den sich ergebenden ampicillinresistenten E. coli-Clonen wurden Plasmid-DNAs hergestellt, welche mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten wurden, und die gespaltene Lösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher die das Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette in die BamHI-Schnittstelle des Plasmids pGL3-tk-EREx5 eingeführt worden war, wurde ausgewählt und als Plasmid pGL3-tk-EREx5-BSD benannt. Dieses Plasmid wurde in den nachstehenden vergleichenden Tests verwendet.
  • Beispiel 3
  • (Herstellung eines einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor exprimierenden Plasmids)
  • (1) Östrogenrezeptor α exprimierendes Plasmid
  • Ein Vorwärts-Primer: 5'-CCTGCGGGGACACGGTCTGCACCCTGCCCGCGGCC-3' und ein reverser Primer: 5'-CAGGGAGCTCTCAGACTGTGGCAGGGAAACCCTCT-3' wurden basierend auf der Nucleotidsequenz eines Östrogenrezeptor α-Gens, publiziert unter der Genbank-Zugangsnummer M12674, entworfen und wurden durch einen DNA-Syntheseautomaten (Modell 394, hergestellt durch Applied Biosystems) synthetisiert, um eine einen menschlichen Östrogenrezeptor α codierende cDNA zu erhalten.
  • Dann wurden die vorstehend erwähnten Primer, jeder in einer Menge von 10 pMol, zu 10 ng einer menschlichen Leber-cDNA (Quick Clone cDNA #7113, hergestellt durch Clone Tech) als Matrize hinzugefügt und eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung einer LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) und dem mit dem Enzym versetzten Puffer in einer Menge der Reaktionslösung von 50 μl durchgeführt. In dieser Reaktion wurde die Reaktionslösung unter Verwendung des PCR-Systems 9700 (hergestellt durch Applied Biosystems) über 1 Minute bei 95°C gehalten und dann über 3 Minuten bei 68°C gehalten und dieser Zyklus wurde 35-mal wiederholt. Dann wurde die gesamte Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen. Es wurde bestätigt, dass die Bande, die die von bekannten Sequenzen erwartete Größe hatte, amplifiziert worden war und die DNA wurde dann aus der Bande gewonnen und es wurde eine Probe für die direkte Sequenz unter Verwendung dieser DNA und des Die Terminator Sequence-Kits FS (hergestellt durch Applied Biosystems) präpariert. Dies wurde einer Untersuchung der Nucleotidsequenz unter Verwendung eines Auto Sequencer (Modell 377, hergestellt durch Applied Biosystems) unterzogen, um die Nucleotidsequenz zu bestätigen.
  • Eine PCR unter Verwendung eines Vorwärts-Primers: 5'-CCCAGCCACCATGACCATGACCCTCCACACCAAAGCATCT-3' und eines reversen Primers: 5'-CAGGGAGCTCTCAGACTGTGGCAGGGAAACCCTCT-3' wurde unter Verwendung von etwa 100 ng der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen DNA als Matrize durchgeführt, um eine DNA herzustellen, die eine Kozak-Konsensussequenz direkt stromaufwärts von dem Startcodon der Translation ATG eines Östrogenrezeptor α-Gens enthielt. Es wurden nämlich 0,1 μg einer Östrogenrezeptor α-cDNA als Matrize, LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.), dem Enzym hinzugefügter Reaktionspuffer und die vorstehend erwähnten Primer, jeder in 10 pMol, gemischt, um eine Reaktionslösung in einer Menge von 50 μl zu erhalten und diese Lösung wurde bei 95°C über 1 Minute und dann bei 68°C über 3 Minuten gehalten und dieser Zyklus wurde 20-mal wiederholt. Das so vervielfältigte Produkt wurde aufgetrennt und durch ein Niedrigtemperatur-Agaroselektrophoreseverfahren gewonnen. Dann wurden etwa 1 μg dieses Produkts mit einem DNA Blunting Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um die Enden davon glatt zu machen, und wurde zur Phosphorylierung der Enden davon mit T4-Polynucleotidkinase umgesetzt. Diese DNA wurde mit Phenol behandelt und wurde durch ein Ethanol-Fällungsverfahren gereinigt und das gesamte, gereinigte Produkt wurde als DNA-Insertion zur Herstellung eines nachstehenden Expressionsplasmids verwendet.
  • Ein pRC/RSV (hergestellt durch Invitrogen), enthaltend einen RSV-Promotor und ein Neomycinresistenzgen, wurde mit einem Restriktionsenzym HindIII gespalten, dazu wurde weiter BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Dann wurde dies durch Behandlung mit Phenol und Fällung mit Ethanol gereinigt und die Enden davon wurden dann durch Behandlung mit einem DNA Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) glatt gemacht und einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die eine niedrigere Schmelztemperatur hat (Agarose L, hergestellt durch Nippon Gene) unterzogen und die DNA wurde aus dem Bandenbereich gewonnen. Etwa 100 ng der gewonnenen Vektor-DNA und die gesamte Menge des vorstehend erwähnten Isocyanats wurden gemischt, dem wurde eine T4-Ligase hinzugefügt und dies wurde umgesetzt. Diese Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt und Plasmid-DNA wurde dann aus einer Kolonie präpariert, die Ampicillinresistenz zeigte, und die Nucleotidsequenz davon wurde durch ein Farbstoff-Terminator-Verfahren unter Verwendung eines Auto Sequencer vom Typ ABI Modell 377 bestimmt. Die sich ergebende Nucleotidsequenz wurde mit einer Nucleotidsequenz verglichen, die in der vorstehend erwähnten direkten Sequenz erhalten wurde, und ein Plasmid, bei welchem eine vollständige Übereinstimmung zwischen den Nucleotidsequenzen in der Translationsregion bestätigt wurde, wurde ausgewählt und als pRC/RSV-hERα Kozak benannt.
  • Beispiel 4
  • (Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • Die DNA des in Beispiel 1 (2) hergestellten Plasmids pGL3-TATA-EREx5-BSD oder des in Beispiel 2 hergestellten Plasmids pGL3-tk-EREx5-BSD und DNA des in Beispiel 3 hergestellten Expressionsplasmids pRC/RSV-hERα Kozak wurden jeweils linearisiert und in eine NIH3T3-Zelle eingeführt und es wurde eine Zelle hergestellt, welche zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle durch einen Östrogenrezeptor erhält, verwendet werden kann.
  • Zuerst wurden die DNA des Plasmids pGL3-TATA-EREx5-BSD, die DNA des Plasmids pGL3-tk-EREx5-BSD und die DNA des Plasmids pRC/RSV-hERα Kozak alle mit SalI gespalten.
  • NIH3T3-Zellen wurden unter Verwendung einer Schale (hergestellt durch Falcon), die einen Durchmesser von etwa 10 cm hatte, in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C unter Verwendung von 10% FBS (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthaltendem DMEM-Medium gezüchtet. Etwa 5 × 105 Zellen wurden gezüchtet und am nächsten Tag wurden in diese Zellen DNAs der vorstehend erwähnten, linearisierten Plasmide durch ein Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Lipofectamin (hergestellt durch GIBCO) in der folgenden Kombination eingeführt: (1) pGL3-TATA-EREx5-BSD und pRC/RSV-hERα Kozak und (2) pGL3-tk-EREx5-BSD und pRC/RSV-hERα Kozak. Bedingungen des Lipofektionsverfahren schließen entsprechend der Beschreibung eines an das Lipofectamin angehängten Handbuchs eine Behandlungszeit von fünf Stunden, eine Gesamtmenge der linearisierten Plasmid-DNAs von 7 μg (jeweils 3,5 μg)/Schale und eine Menge von Lipofectamin von 42 μl/Schale ein. Nach der Lipofektionsbehandlung wurde das Medium mit 10% FBS enthaltendem DMEM-Mediums ergänzt und wurde über etwa 36 Stunden gezüchtet. Dann wurde die Zelle durch eine Trypsinbehandlung von der Schale entfernt und gewonnen und wurde dann in ein Kulturgefäß, umfassend ein G418 in einer Endkonzentration von 800 μg/ml und Blasticidin S in einer Endkonzentration von 16 μg/ml enthaltendes Medium, übertragen und etwa einen Monat gezüchtet, wobei das Medium alle drei bis vier Tage durch neues Medium (die vorstehend erwähnten, selektiven Chemikalien enthaltend) ausgetauscht wurde. Die auftretenden Zellkolonien, welche einen Durchmesser von einem Millimeter bis mehrere Millimeter hatten, wurden jeweils auf eine 96-Mulden-Platte (hergestellt durch Bell Told) übertragen, in welche das Medium vorangehend aufgeteilt und gegossen wurde, und wurden weiter gezüchtet. Wenn sich die Zellen in einem Ausmaß vermehrten, dass sie die Hälfte oder mehr der Bodenoberfläche der Mulde besetzten (etwa fünf Tage nach der Übertragung), wurden die Zellen durch Trypsinbehandlung entfernt und gewonnen und in drei Portionen aufgeteilt und in drei neue 96-Mulden-Sichtplatten übertragen. Auf einer Platte wurden als Masterplatte Passage und Züchtung fortgesetzt. Auf einer der verbleibenden zwei Platten wurde 17-β-Östradiol, aufgelöst in DMSO, zu einer Endkonzentration von 10 nM hinzugefügt und auf anderen Platte wurde DMSO des gleichen Volumens wie jenes des vorstehend erwähnten 17-β-Östradiol-Lösung hinzugefügt und beide wurden über zwei Tage gezüchtet. Dann wurde bei diesen zwei Platten das Medium aus der Mulde entfernt, an die Gefäßwände adhärierende Zellen wurden zweimal mit PBS (–) gewaschen, dann wurde fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und dies wurde über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platten wurden in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink), wurden automatisch aufgeteilt und dazugegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen.
  • Unter den durch Einführung der DNA von (1) pGL3-TATA-EREx5-BSD und pRC/RSV-hERα Kozak erhaltenen transformierten Zellen wurden 288 Clone dem vorstehend erwähnten Test unterzogen. Im Hinblick auf das Verhältnis der Luciferaseaktivität in einem System, das 10 nM von hinzugefügtem 17-β-Östradiol enthält, zu der Luciferaseaktivität eines Systems, das kein hinzugefügtes 17-β-Östradiol enthält, war die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht mehr als 2-fach besitzt 50, die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 2-fach und nicht mehr als 5-fach besitzt war 40, die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 5-fach und nicht mehr als 10-fach besitzt, war 56, die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 10-fach und nicht mehr als 50-fach besitzt, war 118, die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 50-fach und nicht mehr als 100-fach besitzt, war 15 und die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 100-fach besitzt, war neun.
  • Andererseits wurden unter den durch Einführung der DNA von (2) pGL3-tk-EREx5-BSD und pRC/RSV-hERα Kozak erhaltenen transformierten Zellen 192 Clone dem vorstehend erwähnten Test unterzogen. Im Hinblick auf das Verhältnis der Luciferaseaktivität in einem System, das 10 nM von hinzugefügtem 17-β-Östradiol enthält, zu der Luciferaseaktivität eines Systems, das kein hinzugefügtes 17-β-Östradiol enthält, war die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht mehr als 2-fach besitzt, 100, die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 2-fach und nicht mehr als 5-fach besitzt, war 64, die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 5-fach und nicht mehr als 10-fach besitzt, war 25, die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 10-fach und nicht mehr als 50-fach besitzt, war 3, die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 50-fach und nicht mehr als 100-fach besitzt, war 0 und die Zahl der Clone, die ein Verhältnis von nicht weniger als 100-fach besitzt, war 0.
  • Beispiel 5
  • (Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • Die DNA des in Beispiel 1 (1) hergestellten Plasmids pGL3-TATA-1A1-BSD wurde linearisiert und in die aus dem Menschen gewonnene MCF-7-Zelle eingeführt, welche einen Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor exprimiert, um eine erfindungsgemäßen Zelle herzustellen, welche zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens verwendet werden kann, das die Transkriptionskontrolle durch den Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor erhält.
  • Zuerst wurde die DNA des Plasmids pGL3-TATA-1A1-BSD mit SalI gespalten.
  • Weiterhin wurde eine MCF-7-Zelle unter Verwendung einer Schale (hergestellt durch Falcon), die einen Durchmesser von etwa 10 cm hatte, in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C unter Verwendung von 10% FBS enthaltendem DMEM-Mediums (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) gezüchtet. Etwa 5 × 105 Zellen wurden gezüchtet und am nächsten Tag wurde in diese Zelle DNA des vorstehend erwähnten, linearisierten Plasmids pGL3-TATA-1A1-BSD durch ein Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Lipofectamin (hergestellt durch GIBCO) eingeführt. Bedingungen des Lipofektionsverfahren schließen entsprechend der Beschreibung eines an das Lipofectamin angehängten Handbuchs eine Behandlungszeit von fünf Stunden, eine Gesamtmenge der linearisierten Plasmid-DNAs von 7 μg/Schale, und eine Menge von Lipofectamin von 56 μl/Schale ein. Nach der Lipofektionsbehandlung wurde das Medium mit 10% FBS enthaltendem DMEM-Medium ergänzt und wurde über etwa 36 Stunden gezüchtet. Dann wurde die Zelle durch eine Trypsinbehandlung von der Schale entfernt und gewonnen und wurde dann in ein Kulturgefäß, umfassend ein Medium, enthaltend eine hinzugefügte, für Zellen selektive Chemikalie, Blasticidin S, in einer Endkonzentration von 16 μg/ml, übertragen und etwa eineinhalb Monate gezüchtet, während das Medium alle drei bis vier Tage durch neues Medium (die selektive Chemikalie enthaltend) ausgetauscht wurde. Die auftretenden Zellkolonien, welche einen Durchmesser von einem Millimeter bis mehrere Millimeter hatten, wurden jeweils auf eine 96-Mulden-Platte (hergestellt durch Bell Told) übertragen, in welche das Medium vorangehend aufgeteilt und gegossen wurde, und dies wurde weiter gezüchtet. Wenn sich die Zellen in einem Ausmaß vermehrten, dass sie die Hälfte oder mehr der Bodenoberfläche der Mulde besetzten (etwa fünf Tage nach der Übertragung), wurden die Zellen durch Trypsinbehandlung entfernt und gewonnen und in drei Portionen aufgeteilt und in drei neue 96-Mulden-Sichtplatten übertragen. Auf einer Platte wurden als Masterplatte Passage und Züchtung fortgesetzt. Auf einer der verbleibenden zwei Platten wurde 3-Methylcholanthren, aufgelöst in DMSO, zu einer Endkonzentration von 50 nM hinzugefügt und auf der anderen Platte wurde DMSO des gleichen Volumens wie jenes der 3-Methylcholanthren-Lösung hinzugefügt und beide wurden über zwei Tage gezüchtet. Dann wurde bei diesen zwei Platten das Medium aus der Mulde entfernt, an die Gefäßwände adhärierende Zellen wurden zweimal mit PBS (–) gewaschen, dann wurde fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und dies wurde über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platten wurden in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink), wurden automatisch aufgeteilt und dazugegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Eine Zelle die eine 2-fache oder höhere Luciferaseaktivität in dem System, welches hinzugefügtes 3-Methylcholanthren enthält, als in dem System, welches kein hinzugefügtes 3-Methylcholanthren enthält, bereitstellt, wurde ausgewählt.
  • Beispiel 6
  • Herstellung eines Reporterplasmids zum Erhalt einer Kontrollzelle
  • (1) Plasmid, in welchem das Reportergen unter Kontrolle eines TK-Promotors verbunden ist
  • Zuerst wurde ein Plasmid pRL-TK (hergestellt durch Promega) mit HindIII und BglII gespalten und wurde einer Elektrophorese unter Verwendung einer Agarose, welche einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und eine 760 Bp-DNA, welche einen TK-Promotor enthält, wurde gewonnen. Dann wurde das Plasmid pGL3 mit HindIII und BglII gespalten, dazu wurde weiterhin BAP hinzugefügt, und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten und diese inkubierte Lösung wurde einer Gelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat, unterzogen, um DNA zu gewinnen, die eine elektrophoretische Bewegung entsprechend der Länge eines BglII-HindIII-Fragmentes, das ein von pGL3 abgeleitetes Luciferasegen enthält, zeigt. Etwa 0,1 μg dieser DNA wurden mit etwa 0,2 μg von der vorstehend erwähnten DNA, die einen TK-Promotor enthält, gemischt und das Gemisch wurde mit einer T4-Ligase umgesetzt und in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt (hergestellt durch TOYOBO). Plasmid-DNA wurde aus dem sich ergebenden ampicillinresistenten Clon präpariert und wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII gespalten und die gespaltene Lösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, das ein Struktur besitzt, in welcher die vorstehend beschriebene, einen TK-Promotor enthaltende DNA zwischen die HindIII-Stelle und die BglII-Stelle von pGL3 eingeführt worden war, wurde ausgewählt und wurde als Plasmid pGL3-TK benannt. Dann wurde die DNA von diesem pGL3-TK mit BamHI gespalten, dazu wurde weiterhin BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten und diese inkubierte Lösung wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines Agarosegels, das einen niedrigen Schmelzpunkt hat, unterzogen und der Nachweis einer einzelnen Bande wurden bestätigt und die DNA wurde aus dem Gel aus dem Bandenbereich gewonnen. Ein Plasmid, das eine Struktur hat, in welcher eine ein Blasticidin S-Desaminase-Gen exprimierende Kassette durch Verbindung über eine T4-Ligase in die BamHI-Schnittstelle von pGL3 eingeführt worden war, und die vorstehend erwähnte DNA mit der DNA, die eine ein Blasticidin S-Desaminase-Gen exprimierende Kassette codiert, welche durch Spaltung des Plasmids pUCSV-BSD (gekauft von FUNAKOSHI) mit BamHI präpariert worden war, wurden ausgewählt, um ein Plasmid pCL3-TK-BSD zu erhalten.
  • (2) Plasmid, in welchem ein Reportergen unter Transkriptionskontrolle eines RAV-Promotors verbunden ist
  • Zuerst wurde ein Plasmid pRC/RSV mit BglII und HindIII gespalten, einer Elektrophorese unter Verwendung einer Agarose, welche einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und eine 594 Bp-DNA, welche einen RSV-Promotor enthält, wurde gewonnen. Dann wurde das Plasmid pGL3 mit HindIII und BglII gespalten, dazu wurde weiterhin BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten und diese inkubierte Lösung wurde einer Gelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat, unterzogen, um DNA zu gewinnen, die eine elektrophoretische Bewegung entsprechend der Länge eines BglII-HindIII-Fragmentes, das ein von pGL3 abgeleitetes Luciferasegen enthält, zeigt. Etwa 0,1 μg dieser DNA wurden mit etwa 1 μg von der vorstehend erwähnten DNA, die einen RSV-Promotor enthält, gemischt und mit einer T4-Ligase umgesetzt und dann in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt (hergestellt durch TOYOBO). Plasmid-DNA wurde aus dem sich ergebenden, ampicillinresistenten Clon präpariert und wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII gespalten und die gespaltene Lösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, das eine Struktur besitzt, in welcher die vorstehend beschriebene, einen RSV-Promotor enthaltende DNA zwischen die HindIII-Stelle und die BglII-Stelle von pGL3 eingeführt worden war, wurde ausgewählt und wurde als Plasmid pGL3-RSV benannt. Dann wurde dieses Plasmid mit BamHI gespalten, zu dem wurde weiterhin BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten, dann wurde diese inkubierte Lösung einer Elektrophorese unter Verwendung eines Agarosegels, das einen niedrigen Schmelzpunkt hat, unterzogen und der Nachweis einer einzelnen Bande wurde bestätigt, bevor die DNA aus dem Gel aus dem Bandenbereich gewonnen wurde. Ein Plasmid, das eine Struktur hat, in welcher eine ein Blasticidin S-Desaminase-Gen exprimierende Kassette durch Verbindung über eine T4-Ligase in die BamHI-Schnittstelle von pGL3-RSV eingeführt worden war, die vorstehend erwähnte DNA mit DNA, die eine ein Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette codiert, welche durch Spaltung des Plasmids pUCSV-BSD (gekauft von FUNAKOSHI) mit BamHI präpariert worden war, wurde ausgewählt, um ein Plasmid pCL3-RSV-BSD zu erhalten.
  • Beispiel 7
  • (Produktion einer Kontrollzelle)
  • Es wurde jeweils das in Beispiel 6 (1) hergestellte Plasmid pGL3-TK mit SalI gespalten und das in Beispiel 6 (2) hergestellte Plasmid pGL3-RSV mit XhoI gespalten.
  • Eine HeLa-Zelle wurde unter Verwendung einer Schale (hergestellt durch Falcon), die einen Durchmesser von etwa 10 cm hat, in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C unter Verwendung von 10% FBS (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthaltendem DMEM-Mediums gezüchtet. Etwa 5 × 105 Zellen wurden gezüchtet und am nächsten Tag wurde in diese Zelle das vorstehend erwähnte, linearisierte Plasmid pGL-3-RSV oder pGL3-TK durch ein Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Lipofectamin (hergestellt durch GIBCO) eingeführt. Bedingungen des Lipofektionsverfahrens schließen entsprechend der Beschreibung eines an das Lipofectamin angehängten Handbuchs eine Behandlungszeit von fünf Stunden, eine Gesamtmenge der linearisierten Plasmid-DNA von 7 μg/Schale und eine Menge von Lipofectamin von 21 μl/Schale ein. Nach der Lipofektionsbehandlung wurde das Medium durch 10% FBS enthaltendes DMEM-Medium ersetzt und wurde über etwa 36 Stunden gezüchtet. Dann wurde die Zelle durch eine Trypsinbehandlung von der Schale entfernt und gewonnen und wurde dann in ein Kulturgefäß, umfassend ein Medium, enthaltend die hinzugefügte, für Zellen selektive Chemikalie Blasticidin S in einer Endkonzentration von 16 μg/ml, übertragen und einen Monat gezüchtet, während das Medium alle drei bis vier Tage mit einem neuem Medium (die selektive Chemikalie enthaltend) ausgetauscht wurde. Die aufgetretenen Zellkolonien, welche einen Durchmesser von einem Millimeter bis mehrere Millimeter hatten, wurden jeweils auf eine 96-Mulden-Platte (hergestellt durch Bell Told) übertragen, in welche das Medium vorangehend aufgeteilt und gegossen wurde, und dies wurde weiter gezüchtet. Wenn sich die Zelle in einem Ausmaß vermehrte, dass sie die Hälfte oder mehr der Bodenoberfläche der Mulde besetzte (etwa fünf Tage nach der Übertragung), wurde die Zelle durch Trypsinbehandlung entfernt und gewonnen und in zwei Portionen aufgeteilt und in zwei neue 96-Mulde-Sichtplatten übertragen. Auf einer Platte wurden als Masterplatte Passage und Züchtung fortgesetzt. Auf einer der verbleibenden zwei Platten wurde das Medium aus der Mulde entfernt, an die Gefäßwände adhärierende Zellen wurden zweimal mit PBS (–) gewaschen, dann wurde fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und dies wurde über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platten wurden in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink) wurden automatisch aufgeteilt und dazugegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Ein Clon, welcher eine Luciferaseaktivität zeigt, welche einen höheren gemessenen Lichtemissionswert bereitstellt als jene in einer Mulde, die nur ein hinzugefügtes Messreagenz enthält, wurde als Kontrollzelle ausgewählt.
  • Testbeispiel 1
  • (Reportertest unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • Ein Medium, welches durch die Zugabe eines mit künstlicher Kohle und mit Dextran behandelten FBS, um eine Endkonzentration von 10% zu ergeben, zu einem von Phenolrot freien MEM-Medium (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) hergestellt wurde, wurde verwendet und eine, wie in Beispiel 4 oder 5 beschrieben, hergestellte erfindungsgemäße Zelle wurde mit etwa 2 × 104 Zellen/Mulde zu einer für die Messung der Luciferase-Lichtemission und zur Züchtung verwendeten 96-Mulden-Platte (#3903, hergestellt durch Corning Coaster) hinzugefügt und dies wurde über Nacht gezüchtet. Dann wurde dieser Zelle eine in DMSO gelöste chemische Substanz hinzugefügt. Darin wurde die Lösung zum Auflösen hergestellt und hinzugefügt, so dass die Endkonzentration der chemischen Substanz sich schrittweise durch die jeweiligen Testabschnitte änderte, in welchen die DMSO-Mengen in der Kulturlösung in allen Testabschnitten am Ende bei 0,1% übereinstimmten. Ein Kontrollabschnitt, dem nur ein Lösemittel (DMSO) hinzugefügt wurde, wurde als ein System bereitgestellt, das keine hinzugefügte chemische Substanz enthielt, und es wurde auch ein positiver Kontrollabschnitt bereitgestellt, der eine hinzugefügte positive chemische Kontrollsubstanz enthielt.
  • Die die hinzugefügte chemische Substanz enthaltende Zelle wurde gezüchtet und das Medium wurde 36 Stunden nach Zugabe der chemischen Substanz entfernt und die Zelle wurde zweimal mit PBS (–) gewaschen und fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) wurde in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und dies wurde über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platten wurden in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink), wurden automatisch aufgeteilt und hineingegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen.
  • Die Agonist-Aktivität von Genistein gegenüber dem Östrogenrezeptor α wurde unter Verwendung der in Beispiel 4 hergestellten erfindungsgemäßen Zelle gemessen. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Es wurde eine Zunahme der Luciferaseaktivität durch Zugabe von Genistein bei einer Endkonzentration von 1 μM erkannt.
  • So kann die Agonist-Aktivität einer chemischen Substanz gegenüber dem gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor gemessen werden.
  • Andererseits kann die Antagonist-Aktivität der chemischen Substanz gegenüber dem gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor durch Hinzugeben eines Liganden des gewünschten Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zu jedem Testabschnitt, um eine Konzentration um den EC50-Wert herum zu ergeben, zusammen mit der chemischen Substanz und durch Durchführung des Test in einer ähnlichen Weise, wie vorstehend beschrieben, gemessen werden.
  • Weiterhin kann es auch zulässig sein, dass eine ähnliche Messung unter Verwendung der, wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellten Kontrollzelle durchgeführt wird und die Testergebnisse, die wie vorstehend beschrieben, erhalten wurden, basierend auf den Messergebnissen korrigiert werden.
  • Beispiel 8
  • (Herstellung eines einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor exprimierenden Plasmids)
  • (1) Östrogenrezeptor β
  • Um eine cDNA, welche den 530 Aminosäuren umfassenden menschlichen Östrogenrezeptor β codiert, zu erhalten, wurden ein Vorwärts-Primer: 5'-TTGAGTTACTGAGTCCGATGAATGTGCTTGCTCTG-3' und ein reverser Primer: 5'-AAATGAGGGACCACACAGCAGAAAGATGAAGCCCA-3' entworfen und mit einem DNA-Syntheseautomaten (Modell 394, hergestellt durch Applied Biosystems) synthetisiert.
  • Dann wurden die vorstehend erwähnten Primer, jeder in einer Menge von 10 pMol, zu 10 ng menschlicher Gehirn-cDNA (Quick clone cDNA #7187-1, hergestellt durch Clone Tech) als Matrize hinzugefügt und es wurde eine PCR-Reaktion unter Verwendung einer LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) und eines mit dem Enzym versetzten Puffers in einer Menge der Reaktionslösung von 50 μl durchgeführt. In dieser Reaktion wurde die Reaktionslösung unter Verwendung eines PCR Systems 9700 (hergestellt durch Applied Biosystems) über 1 Minute bei 95°C gehalten und dann über 3 Minuten bei 68°C gehalten und dieser Zyklus wurde 35 Mal wiederholt. Dann wurde die gesamte Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene) unterzogen. Es wurde bestätigt, dass die Bande, die eine von der bekannten Sequenz erwartete Größe hatte, amplifiziert worden war und die DNA wurde dann aus der Bande gewonnen und es wurde eine Probe für die direkte Sequenz unter Verwendung dieser DNA und des Die Terminator Sequence-Kits FS (hergestellt durch Applied Biosystems) präpariert. Dies wurde einer Untersuchung der Nucleotidsequenz unter Verwendung eines Auto Sequencer (Modell 377, hergestellt durch Applied Biosystems) unterzogen, um die Nucleotidsequenz zu bestätigen.
  • Eine PCR unter Verwendung eines Vorwärts-Primers: 5'-GCCGCGGCCGCCCAGCCACCATGGATATAAAAAACTCACCATCTAGCCTTAATTC-3' und eines reversen Primers: 5'-GGGTCTAGAAATGAGGGACCACACAGCAGAAAGATGAAGCCCA-3' wurde unter Verwendung von etwa 100 ng der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen DNA als Matrize durchgeführt, um eine DNA herzustellen, die eine Kozak-Konsensussequenz direkt stromaufwärts von dem Startcodon der Translation ATG eines Östrogenrezeptor β-Gens enthält. Es wurden nämlich 0,1 μg einer Östrogenrezeptor α-cDNA als Matrize, LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.), mit dem Enzym versetzter Reaktionspuffer und die vorstehend erwähnten Primer, jeder zu 10 pMol, gemischt, um eine Reaktionslösung in reiner Menge von 50 μl zu erhalten, und die Lösung wurde bei 95°C über 1 Minute und dann bei 68°C über 3 Minuten gehalten und dieser Zyklus wurde 20 Mal wiederholt. Das so vervielfältigte Produkt wurde aufgetrennt und durch ein Niedrigtemperatur-Agarosegelelektrophoreseverfahren gewonnen. Dann wurde etwa 1 μg dieses Produkts mit einem DNA Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um die Enden davon glatt zu machen, und wurde zur Phosphorylierung der Enden davon mit T4-Polynucleotidkinase umgesetzt. Diese DNA wurde mit Phenol behandelt und wurde dann durch ein Ethanol-Fällungsverfahren gereinigt und das gesamte gereinigte Produkt wurde als DNA-Insertion zur Herstellung eines Expressionsplasmids verwendet.
  • pRC/RSV (hergestellt durch Invitrogen), enthaltend einen RSV-Promotor und ein Neomycinresistenzgen, wurde mit einem Restriktionsenzym HindIII gespalten, dazu wurde weiter BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Dann wurde dies durch Behandlung mit Phenol und Fällung mit Ethanol gereinigt und die Enden davon wurden dann durch Behandlung mit einem DNA Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) glatt gemacht und einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die eine niedrigere Schmelztemperatur hat (Agarose L, hergestellt durch Nippon Gene) unterzogen und eine DNA wurde aus dem Bandenbereich gewonnen. Etwa 100 ng der gewonnenen Vektor-DNA und die gesamte Menge der vorstehend erwähnten DNA-Insertion wurden gemischt, dem wurde eine T4-Ligase hinzugefügt und dies wurde umgesetzt. Diese Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt und Plasmid-DNA wurde dann aus der Kolonie präpariert, die Ampicillinresistenz zeigte, und die Nucleotidsequenz davon wurde durch ein Farbstoff-Terminator-Verfahren unter Verwendung eines Auto Sequencer vom Typ ABI Modell 377 bestimmt. Die sich ergebende Nucleotidsequenz wurde mit einer Nucleotidsequenz verglichen, die in der vorstehend erwähnten, direkten Sequenz erhalten wurde, und ein Plasmid, bei welchem eine vollständige Übereinstimmung zwischen den Nucleotidsequenzen in der Translationsregion bestätigt wurde, wurde ausgewählt und als pRC/RSV-hER1β Kozak benannt.
  • Beispiel 9
  • (Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • (2) Östrogenrezeptor β
  • DNA des in Beispiel 1(2) hergestellten Plasmids pGL3-TATA-EREx5-BSD und DNA des in Beispiel 8 hergestellten Expressionsplasmids pRC/RSV-hER-β Kozak wurden jeweils linearisiert und in die aus dem Menschen gewonnene HeLa-Zelle eingeführt, um eine erfindungsgemäßen Zelle zu erhalten, welche zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, dass die Transkriptionskontrolle durch den Östrogenrezeptor β erhält, verwendet werden kann. Es wurde nämlich ein ähnliches Verfahren wie in Beispiel 4 durchgeführt, außer dass ein Expressionsplasmid pRC/RSV-hER-β Kozak des Östrogenrezeptors β anstatt des Expressionsplasmids pRC/RSV-hER-α Kozak des Östrogenrezeptors α in Beispiel 4 verwendet wurde. Die Luciferaseaktivität der sich ergebenden transformierten Zellen wurde in der Anwesenheit von 17-β-Östradiol wie in Beispiel 4 und in der Abwesenheit von 17-β-Östradiol gemessen und es wurde eine Zelle ausgewählt, welche eine zweifache oder höhere Luciferaseaktivität in einem System zeigte, das zugesetztes 17-β-Östradiol enthielt, gegenüber einem System, das kein zugesetztes 17-β-Östradiol enthielt.
  • Testbeispiel 2
  • (Reportertest unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • Ein Medium, welches durch die Zugabe eines mit künstlicher Kohle und mit Dextran behandelten FBS, um eine Endkonzentration von 10% zu ergeben, zu einem von Phenolrot freien MEM-Medium (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) hergestellt wurde, wurde verwendet und eine, wie in Beispiel 4 oder 10 beschrieben, hergestellte erfindungsgemäße Zelle wurde mit etwa 2 × 104 Zellen/Mulde zu einer für die Messung der Luciferase-Lichtemission und zur Züchtung verwendeten 96-Mulden-Platte (#3903, hergestellt durch Corning Coaster) hinzugefügt und dies wurde über Nacht gezüchtet. Dann wurde dieser Zelle in DMSO gelöstes 17-β-Östradiol hinzugefügt. Darin wurde die Lösung zum Auflösen hergestellt und hinzugefügt, so dass die Endkonzentration von 17-β-Östradiol jeweils 10-fach durch die jeweiligen Testabschnitte zunahm, in welchen die DMSO-Mengen in der Kulturlösung in allen Testabschnitten am Ende bei 0,1% übereinstimmten. Ein Kontrollabschnitt, dem nur ein Lösungsmittel (DMSO) hinzugefügt wurde, wurde als ein System bereitgestellt, das keine hinzugefügte chemische Substanz enthielt.
  • Diese Zellen wurden gezüchtet und das Medium wurde 36 Stunden nach Zugabe von 17-β-Östradiol entfernt und die Zellen wurden zweimal mit PBS (–) gewaschen und fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) wurde in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und diese wurde über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platte wurde in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink), wurden automatisch aufgeteilt und hineingegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Eine Zunahme in der Luciferaseaktivität zusammen mit einer Zunahme in der Konzentration von der Zelle zugesetztem 17-β-Östradiol wurde sowohl in der erfindungsgemäßen Zelle zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle von einem Östrogenrezeptor α erhielt, als auch in der erfindungsgemäßen Zelle zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle von einem Östrogenrezeptor β erhielt, erkannt.
  • In einer ähnlichen Weise, wie vorstehend beschrieben, kann die Agonist-Aktivität einer chemischen Substanz gegenüber dem gewünschten Östrogenrezeptor durch die Zugabe einer chemischen Substanz anstatt von 17-β-Östradiol zu jedem Testabschnitt und Durchführung des Tests gemessen werden.
  • Andererseits kann die Antagonist-Aktivität einer chemischen Substanz gegenüber dem gewünschten Östrogenrezeptor durch Zugabe von 17-β-Östradiol zusammen mit einer chemischen Substanz zu jedem Testabschnitt, um so eine Konzentration um den EC50-Wert zu ergeben, und Durchführung des Tests in einer ähnlichen Weise, wie vorstehend beschrieben, gemessen werden.
  • Beispiel 10
  • (Herstellung einer DNA (Plasmid), umfassend in einem Molekül das Ligand-gesteuerte Reportergen und das selektive Markergen)
  • Die DNA, die in einem Bereich eine aus dem LTR eines Mause-Brusttumor-Virus (MMTV) gewonnene Androgenrezeptorerkennungssequenz enthält, wurde hergestellt. Das Plasmid pMSG (hergestellt durch Pharmacia) wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und SacI gespalten, um eine DNA von 1080 Bp zu erhalten, die einem Teil der MMTV-LTR-Region entspricht (hiernach bezeichnet als ARE-A DNA). Weiter wurde das Plasmid pMSG mit den Restriktionsenzymen HindIII und SmaI gespalten, um eine DNA von 1463 Bp zu erhalten, die einen Teil der MMTV-LTR-Region entspricht (hiernach bezeichnet als ARE-B DNA). Beide DNAs wurden mit einem Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt.
  • Zwei Oligonucleotide;
    Figure 00590001
    die Nucleotidsequenzen besitzen, die aus einer Nucleotidsequenz nahe der TATA-Box eines Metallothionein-I-Gens der Maus und aus der Leadersequenz abgeleitet wurden, wurden aneinandergelagert, um eine doppelsträngige DNA zu erhalten, und es wurde der T4-Polynucleotidkinase erlaubt darauf zu wirken um beide Enten davon zu phosphorylieren (hiernach wird diese DNA als TATA-DNA bezeichnet). Andererseits wurde ein Plasmid pGL3 (hergestellt durch Promega), das ein Leuchtkäferluciferasegen enthielt, mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII gespalten, dazu wurde weiterhin bakterielle alkalische Phosphatase (BAP) hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Danach wurde diese inkubierte Lösung einer Elektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und die DNA wurde aus dem Bandenbereich aus dem Gel gewonnen. Etwa 100 ng dieser DNA und 1 μg der vorstehend erwähnten TATA-DNA wurden gemischt und über T4-Ligase verbunden, um ein Plasmid pGL3-TATA herzustellen.
  • Dann wurde das pGL3-TATA mit einem Restriktionsenzym SmaI gespalten, dazu wurde weiterhin BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Diese inkubierte Lösung wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines Agarosegels, das einen niedrigen Schmelzpunkt hat, unterzogen und die DNA wurde aus den Bandenbereichen aus dem Gel gewonnen. Etwa 100 ng dieser DNA und etwa 1 μg der vorstehend erwähnten ARE-A-DNA wurden gemischt und mit T4-Ligase umgesetzt und dann wurde die Reaktionslösung in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt (hergestellt durch TOYOBO). Die DNA des jeweiligen Plasmids, enthalten in einigen Kolonien von E. coli, welche Ampicillinresistenz zeigten, wurde gereinigt und wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und XhoI gespalten, und die gespaltene Lösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher eine Kopie der ARE-A-DNA in die SmaI-Stelle von pGL3-TATA eingeführt worden waren, wurde ausgewählt und als pGL3-TATA-MMTV benannt.
  • Andererseits wurde ein Plasmid pGL3 (hergestellt durch Promega), das ein Leuchtkäferluciferasegen enthielt, mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII gespalten, dazu wurde weiterhin bakterielle alkalische Phosphatase (BAP) hinzugefügt und dieses Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten und dies wurde weiter mit einem Blunting Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt. Danach wurde diese DNA einer Elektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und die DNA wurde aus dem Bandenbereich aus dem Gel gewonnen. Etwa 100 ng dieser DNA und 1 μg der vorstehend erwähnten ARE-B-DNA wurden gemischt und über T4-Ligase verbunden und die Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt. Die DNA des jeweiligen Plasmids, enthalten in einigen Kolonien von E. coli, welche Ampicillinresistenz zeigten, wurde gereinigt und wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und ClaI gespalten, und die gespaltene Lösung wurde durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher nur eine Kopie der ARE-B-DNA zwischen die BglII-Stelle und die HindIII-Stelle des pGL3-Vektors eingeführt worden waren, wurde ausgewählt und als pGL3-MMTV benannt.
  • Dann wurde ein Plasmid pUCSV-BSD (gekauft von FUNAKOSHI) mit BamHI gespalten, um eine DNA herzustellen, die eine ein Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette codiert. Diese DNA wurde mit DNA gemischt, welche durch Spaltung mit BamHI und die BAP-Behandlung des vorstehend erwähnten Plasmids pGL3-TATA-MMTV oder pGL3-MMTV erhalten wurde, um ein Gemisch zu erhalten, welches mit einer T4-Ligase umgesetzt wurde, und die Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt. Aus den sich ergebenden ampicillinresistenten E. coli-Clonen wurde Plasmid-DNA hergestellt, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten und die gespaltenen Lösungen wurden durch eine Agarose-Gelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher die das Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette in die BamHI-Schnittstelle eingeführt worden war, wurde ausgewählt und als Plasmid pGL3-TATA-MMTV-BSD bzw. pGL3-MMTV-BSD benannt.
  • Beispiel 11
  • (Herstellung eines Plasmids, das einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor exprimiert)
  • (1) Androgenrezeptor-Expressionsplasmid
  • Ein Vorwärts-Primer: 5'-GAGGCGGGGTAAGGGAAGTAGGTGGAAGATTCAGC-3'
    und ein reverser Primer: 5'-GGGTGGGGAAATAGGGTTTCCAATGCTTCACTGGG'-3' wurden basierend auf der Nucleotidsequenz eines Östrogenrezeptorgens, publiziert unter der Genbank-Zugangsnummer M23263, entworfen und wurden durch einen DNA-Syntheseautomaten (Modell 394, hergestellt durch Applied Biosystems) synthetisiert, um eine einen menschlichen Androgenrezeptor codierende cDNA zu erhalten.
  • Dann wurden die vorstehend erwähnten Primer, jeder in einer Menge von 10 pMol, zu 10 ng einer menschlichen Prostata-cDNA (Quick Clone cDNA #7123-1, hergestellt durch Clone Tech) als Matrize hinzugefügt und eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung einer LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) und eines dem Enzym zugesetzten Puffers in einer Menge der Reaktionslösung von 50 μl durchgeführt. In dieser Reaktion wurde die Reaktionslösung unter Verwendung eines PCR-Systems 9700 (hergestellt durch Applied Biosystems) über 1 Minute bei 95°C gehalten und dann über 3 Minuten bei 68°C gehalten und dieser Zyklus wurde 35 Mal wiederholt. Dann wurde die gesamte Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen. Es wurde durch eine Ethidiumbromidfärbung bestätigt, dass die Bande, die die von bekannten Sequenzen erwartete Größe hatte, amplifiziert worden war und die DNA wurde aus der Bande gewonnen und es wurde eine Probe für die direkte Sequenz unter Verwendung dieser DNA und des Die Terminator Sequence-Kits FS (hergestellt durch Applied Biosystems) präpariert. Dies wurde einer Untersuchung der Nucleotidsequenz unter Verwendung eines Auto Sequencer (Modell 377 hergestellt durch Applied Biosystems) unterzogen, um die Nucleotidsequenz zu bestätigen.
  • Eine PCR unter Verwendung eines Vorwärts-Primers: 5'-CCCAGCCACCATGGAAGTGCAGTTAGGGCTGGGAAGGGTC-3' und eines reversen Primers: 5'-GGGTGGGGAAATAGGGTTTCCAATGCTTCACTGGG-3' wurde unter Verwendung von etwa 100 ng der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen DNA als Matrize durchgeführt, um eine DNA herzustellen, die eine Kozak-Konsensussequenz direkt stromaufwärts von dem Startcodon der Translation ATG eines Androgenrezeptorgens hinzugefügt enthält. Es wurden nämlich 0,1 μg einer Androgenrezeptor-cDNA als Matrize, LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.), mit Enzym versetzter Reaktionspuffer und die vorstehend erwähnten Primer, jeder zu 10 pMol, gemischt, um eine Reaktionslösung in einer Menge von 50 μl zu erhalten, und die Lösung wurde bei 95°C über 1 Minute gehalten und dann bei 68°C über 3 Minuten gehalten und dieser Zyklus wurde 20-mal wiederholt. Das so gewonnene, vervielfältigte Produkt wurde aufgetrennt und durch ein niedrigtemperatur-Agarosegelelektrophoreseverfahren gewonnen. Dann wurde etwa 1 μg dieses Produkts mit einem DNA Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um die Enden davon glatt zu machen, welche zur Phosphorylierung der Enden davon mit T4-Polynucleotidkinase umgesetzt wurden. Diese DNA wurde mit Phenol behandelt und wurde durch ein Ethanol-Fällungsverfahren gereinigt und das gesamte gereinigte Produkt wurde als DNA-Insertion zur Herstellung eines nachstehenden Expressionsplasmids verwendet.
  • pRC/RSV (hergestellt durch Invitrogen), enthaltend einen RSV-Promotor und ein Neomycinresistenzgen, wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten, dazu wurde weiter BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Dann wurde dies durch Behandlung mit Phenol und Fällung mit Ethanol gereinigt und die Enden davon wurden durch Behandlung mit einem DNA Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) glatt gemacht und einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die eine niedrigere Schmelztemperatur hat (Agarose L, hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und die DNA wurde aus dem Bandenbereich aus dem Gel gewonnen. Etwa 100 ng der gewonnenen Vektor-DNA und die gesamte Menge der vorstehend erwähnten DNA-Insertion wurden gemischt, dem wurde eine T4-Ligase hinzugefügt und das Ganze wurden umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt und die Plasmid-DNA wurde dann aus einer Kolonie präpariert, die Ampicillinresistenz zeigte, und die Nucleotidsequenz davon wurde durch ein Farbstoff-Terminator-Verfahren unter Verwendung eines ABI-Auto Sequencer vom Typ Modell 377 bestimmt. Die sich ergebende Nucleotidsequenz wurde mit einer Nucleotidsequenz verglichen, die in der vorstehend erwähnten direkten Sequenz erhalten wurde, und ein Plasmid, bei welchem eine vollständige Übereinstimmung zwischen den Nucleotidsequenzen in der Translationsregion bestätigt wurde, wurde ausgewählt und als pRC/RSV-hAR Kozak benannt.
  • Beispiel 12
  • (Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • DNA des in Beispiel 10 hergestellten Plasmids pGL3-TATA-MMTV-BSD oder des Plasmids pGL3-MMTV-BSD bzw. die DNA des in Beispiel 11 produzierten Expressionsplasmids pRC/TSV-hAR Kozak des Androgenrezeptors wurden linearisiert und in eine aus Mensch gewonnene HeLa-Zelle eingeführt und es wurde eine Zelle hergestellt, welche zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle durch einen Androgenrezeptor erhält, verwendet werden kann.
  • Zuerst wurden die DNA des Plasmids pGL3-TATA-MMTV-BSD, die DNA des Plasmids pGL3-MMTV-BSD und die DNA des Plasmids pRC/RSV-hAR Kozak alle mit SalI gespalten.
  • Die HeLa-Zelle wurden unter Verwendung einer Schale (hergestellt durch Falcon), die einen Durchmesser von etwa 10 cm hatte, in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C unter Verwendung von 10% FBS (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthaltenden DMEM-Mediums gezüchtet. Etwa 5 × 105 Zellen wurden gezüchtet und am nächsten Tag wurden in diese Zellen DNAs der vorstehend erwähnten, linearisierten Plasmide durch ein Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Lipofectamin (hergestellt durch GIBCO) in der folgenden Kombination eingeführt: (1) pGL3-TATA-MMTV-BSD und pRC/RSV-hAR Kozak und (2) pGL3-MMTV-BSD und pRC/RSV-hAR Kozak. Bedingungen des Lipofektionsverfahren schließen entsprechend der Beschreibung eines an das Lipofectamin angehängten Handbuchs eine Behandlungszeit von fünf Stunden, eine Gesamtmenge der linearisierten Plasmid-DNAs von 7 μg (jeweils 3,5 μg)/Schale und eine Menge von Lipofectamin von 21 μl/Schale ein. Nach der Lipofektionsbehandlung wurde das Medium durch 10% FBS enthaltendem DMEM-Medium ersetzt und wurde über etwa 36 Stunden gezüchtet. Dann wurde die Zelle durch eine Trypsinbehandlung von der Schale entfernt und gewonnen und wurde dann in ein Kulturgefäß, umfassend ein Medium, das in einer Endkonzentration von 800 μg/ml hinzugefügtes G418 und in einer Endkonzentration von 16 μg/ml hinzugefügtes Blasticidin S enthielt, übertragen und etwa einen Monat gezüchtet, während das Medium alle drei bis vier Tage mit neuem Medium (die vorstehend erwähnte selektive Chemikalie enthaltend) ausgetauscht wurde. Die auftretenden Zellkolonien, welche einen Durchmesser von einem Millimeter bis mehrere Millimeter hatten, wurden jeweils auf eine 96-Mulden-Platte (hergestellt durch Bell Told) übertragen, in welche das Medium vorangehend aufgeteilt und gegossen wurde, und wurden weiter gezüchtet. Wenn sich die Zellen in einem Ausmaß vermehrten, dass sie die Hälfte oder mehr der Bodenoberfläche der Mulde besetzten (etwa fünf Tage nach der Übertragung), wurde die Zelle durch Trypsinbehandlung entfernt und gewonnen und in drei Portionen aufgeteilt und in drei neue 96-Mulden-Sichtplatten übertragen. Auf einer Platte wurden als Masterplatte Passage und Züchtung fortgesetzt. Auf einer der verbleibenden zwei Platten wurde DHT, aufgelöst in DMSO, zu einer Endkonzentration von 10 nM hinzugefügt und auf der anderen Platte wurde DMSO des gleichen Volumens wie jenes der vorstehend erwähnten DHT-Lösung hinzugefügt und beide wurden über zwei Tage gezüchtet. Dann wurde bei diesen zwei Platten das Medium aus der Mulde entfernt, an die Gefäßwände adhärierende Zellen wurden zweimal mit PBS (–) gewaschen, dann wurde fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und wurde über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platten wurden in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink), wurden automatisch aufgeteilt und hineingegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Eine Zelle, die eine zweifache oder höhere Luciferaseaktivität in dem System, welches hinzugefügtes DHT enthält, als in dem System, welches kein hinzugefügtes DHT enthält, bereitstellt, wurde ausgewählt.
  • Testbeispiel 3
  • (Reportertest unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • Ein Medium, welches durch die Zugabe eines mit künstlicher Kohle und mit Dextran behandelten FBS, um eine Endkonzentration von 10% zu ergeben, zu einem von Phenolrot freien MEM-Medium (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) hergestellt wurde, wurde verwendet und eine durch Einführung der DNA des Plasmids pGL3-MMTV-BSD und der DNA des Plasmids pRC/RSV-hAR Kozak in Beispiel 12 hergestellte, erfindungsgemäße Zelle wurde mit etwa 2 × 104 Zellen/Mulde zu einer für die Messung der Luciferase-Lichtemission und zur Züchtung verwendeten 96-Mulde-Platte (#3903, hergestellt durch Corning Coaster) hinzugefügt und wurde über Nacht gezüchtet. Dann wurde dieser Zelle in DMSO gelöstes DHT hinzugefügt. Darin wurde die Lösung zum Auflösen hergestellt und hinzugefügt, so dass die Endkonzentration von DHT jeweils 10-fach durch die jeweiligen Testabschnitte zunahm und die DMSO-Mengen in der Kulturlösung in allen Testabschnitten am Ende bei 0,1% übereinstimmten. Ein nur hinzugefügtes Lösungsmittel (DMSO) enthaltender Kontrollabschnitt wurde als ein System bereitgestellt, das kein hinzugefügtes DHT enthält.
  • Diese Zellen wurden gezüchtet und das Medium wurde 36 Stunden nach Zugabe von DHT entfernt und die Zelle wurde zweimal mit PBS (–) gewaschen und fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) wurde in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und wurde über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platte wurde in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink), wurden automatisch aufgeteilt und dazugegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt. Eine Zunahme in der Luciferaseaktivität zusammen mit einer Zunahme in der Konzentration von der Zelle zugesetztem DHT wurden in der erfindungsgemäßen Zelle zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle von einem Androgenrezeptor erhält, erkannt.
  • In der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, kann die Agonist-Aktivität einer chemischen Substanz gegenüber einem Androgenrezeptor durch die Zugabe einer chemischen Substanz anstatt von DHT zu jedem Testabschnitt und die Durchführung des vorstehend erwähnten Tests in einer ähnlichen Weise gemessen werden.
  • Andererseits kann die Antagonist-Aktivität einer chemischen Substanz gegenüber den gewünschten Androgenrezeptor durch Zugabe von DHT zusammen mit einer chemischen Substanz zu jedem Testabschnitt, um so eine Konzentration um den EC50-Wert zu ergeben, und Durchführung des Tests in einer ähnlichen Weise, wie vorstehend beschrieben, gemessen werden.
  • Beispiel 13
  • (Herstellung einer DNA (Plasmid), die in einem Molekülen das Ligand-gesteuerte Reportergen und ein selektives Markergen umfasst)
  • Ein Oligonucleotid, das eine Erkennungssequenz (TRE) eines Thyroidrezeptors enthaltende Nucleotidsequenz (5'-CAAGGGGATCCAGCTTGACCTGACGTCAGGTCAAGTCG-3' umfasst, und ein Oligonucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz komplementär zu der vorstehend erwähnten Nucleotidsequenz, wurden durch einen DNA-Syntheseautomaten synthetisiert und die Produkte wurden aneinandergelagert, um eine doppelsträngige DNA zu erhalten (hiernach bezeichnet als TRE-DNA), und eine T4-Ligase wurde mit der DNA umgesetzt, um es der doppelsträngigen DNA zu erlauben sich im Tandem zu verbinden, es wurde einer T4-Polynucleotidkinase erlaubt darauf zu wirken, um beide Enden davon zu phosphorylieren.
  • Zwei Oligonucleotide;
    Figure 00670001
    die Nucleotidsequenzen besitzen, die aus einer Nucleotidsequenz nahe der TATA-Box eines Metallothionein-I-Gens der Maus und aus der Leadersequenz abgeleitet wurden, wurden aneinandergelagert, um eine doppelsträngige DNA zu erhalten, und es wurde einer T4-Polynucleotidkinase erlaubt darauf zu wirken, um beide Enden davon zu phosphorylieren (hiernach wird diese DNA als TATA-DNA bezeichnet). Andererseits wurde ein Plasmid pGL3 (hergestellt durch Promega), das ein Leuchtkäferluciferasegen enthält, mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII gespalten, dazu wurde weiterhin bakterielle alkalische Phosphatase (BAP) hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Danach wurde diese inkubierte Lösungen einer Elektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und die DNA wurde aus dem Bandenbereich aus dem Gel gewonnen. Etwa 100 ng dieser DNA und 1 μg der vorstehend erwähnten TATA-DNA wurden gemischt und über T4-Ligase verbunden, um ein Plasmid pGL3-TATA herzustellen.
  • Dann wurde das pGL3-TATA mit dem Restriktionsenzym SmaI gespalten, dazu wurde weiterhin BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Diese inkubierte Lösung wurde einer Elektrophorese unter Verwendung eines Agarosegels, das einen niedrigen Schmelzpunkt hat, unterzogen und die DNA wurde aus dem Bandenbereich aus dem Gel gewonnen. Etwa 100 ng dieser DNA und etwa 1 μg der vorstehend erwähnten TRE-DNA, welche in Tandem verbunden worden war und von welcher die Enden phosphoryliert worden waren, wurden gemischt und mit einer T4-Ligase umgesetzt und die Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt (hergestellt durch TOYOBO). Die DNA der jeweiligen Plasmide, enthalten in einigen Kolonien von E. coli, welche Ampicillinresistenz zeigten, wurde gereinigt und wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und XhoI gespalten, und die gespaltene Lösung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese untersucht. Ein Plasmid, welches eine Struktur hatte, in welcher fünf Kopien der TRE-DNAs im Tandem in die SmaI-Stelle von pGL3-TATA eingeführt worden waren, wurde ausgewählt und als pGL3-TATA-TREx5 benannt.
  • Dann wurde dieses pGL3-TATA-TREx5 mit SalI gespalten, dann wurden die Enden davon mit einem Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) glatt gemacht. Getrennt davon wurde eine ein Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette (BamHI-BamHI-Fragment), gewonnen aus pUCSV-BSD (gekauft von FUNAKOSHI), in einer ähnlichen Weise glatt gemacht und wurde über eine T4-Ligase mit dem vorstehend erwähnten Plasmid mit glatten Enden verbunden und dies wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt. Aus den sich ergebenden E. coli-Clonen, welche eine Ampicillinresistenz zeigten, wurde DNA isoliert, um ein als pGL3-TATA-TREx5-BSD benanntes Plasmid zu erhalten, das eine Struktur hat, in welcher eine ein Blasticidin S-Deaminase-Gen exprimierende Kassette in die glatt gemachte BamHI-Stelle eingeführt worden war.
  • Beispiel 14
  • (Herstellung eines einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor exprimierenden Plasmids)
  • (1) Thyroidhormonrezeptor α-Expressionsplasmid
  • Ein Vorwärts-Primer: 5'-TGGAATTGAAGTGAATGGAACAGAAGCCAAGCAAGGT-3'
    und ein reverser Primer: 5'-TGGCCGCCTGAGGCTTTAGACTTCCTGATCCTCAA-3' wurden basierend auf der Nucleotidsequenz eines Thyroidhormonrezeptor α-Gens, publiziert unter der Genbank-Zugangsnummer M24748, entworfen und wurden durch einen DNA-Syntheseautomaten (Modell 394, hergestellt durch Applied Biosystems) synthetisiert, um eine einen menschlichen Thyroidhormonrezeptor α codierende cDNA zu erhalten.
  • Dann wurden die vorstehend erwähnten Primer, jeder in einer Menge von 10 pMol, zu 10 ng einer menschlichen Leber-cDNA (Quick Clone cDNA #7113, hergestellt durch Clone Tech) als Matrize hinzugefügt und eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung einer LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) und eines mit dem Enzym versetzten Puffers in einer Menge der Reaktionslösung von 50 μl durchgeführt. In dieser Reaktion wurde die Reaktionslösung unter Verwendung eines PCR-Systems 9700 (hergestellt durch Applied Biosystems) über 1 Minute bei 95°C gehalten und dann über 3 Minuten bei 68°C gehalten und dieser Zyklus wurde 35 Mal wiederholt. Dann wurde die gesamte Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen. Es wurde bestätigt, dass die Bande, die eine von der bekannten Sequenz erwartete Größe hatte, amplifiziert worden war und die DNA wurde aus der Bande gewonnen und es wurde eine Probe für die direkte Sequenz unter Verwendung dieser DNA und des Die Terminator Sequence-Kits FS (hergestellt durch Applied Biosystems) hergestellt. Dies wurde einer Untersuchung der Nucleotidsequenz unter Verwendung eines Auto Sequencer (Modell 377, hergestellt durch Applied Biosystems) unterzogen, um die Nucleotidsequenz zu bestätigen.
  • Eine PCR unter Verwendung eines Vorwärts-Primers: 5'-CCCAGCCACCATGGAACAGAAGCCAAGCAAGGTGGAGTGT-3' und eines reversen Primers:
    5'-TGGCCGCCTGAGGCTTTAGACTTCCTGATCCTCAA-3' wurde unter Verwendung von etwa 100 ng der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen DNA als Matrize durchgeführt, um eine DNA herzustellen, die eine Kozak-Konsensussequenz direkt vor dem Startcodon der Translation ATG eines Thyroidhormonrezeptor α-Gens hinzugefügt enthält. Es wurden nämlich 0,1 μg einer Thyroidhormon α-cDNA als Matrize, LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.), mit dem Enzym versetzter Reaktionspuffer und die vorstehend erwähnten Primer, jeder zu 10 pMol, gemischt, um eine Reaktionslösung in einer Menge von 50 μl zu erhalten, und die Lösung wurde bei 95°C über 1 Minute gehalten und dann bei 68°C über 3 Minuten gehalten und dieser Zyklus wurde 20 Mal wiederholt. Das so erhaltene, so vervielfältigte Produkt wurde aufgetrennt und durch ein Gelelektrophoreseverfahren mit Niedrigtemperatur-Agarose gewonnen. Dann wurden etwa 1 μg dieses Produkts mit einem DNA Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um die Enden davon glatt zu machen, und diese wurden zur Phosphorylierung der Enden davon mit T4-Polynucleotidkinase umgesetzt. Diese DNA wurde mit Phenol behandelt und durch ein Ethanol-Fällungsverfahren gereinigt und das gesamte gereinigte Produkt wurde als DNA-Insertion zur Herstellung eines Expressionsplasmids verwendet.
  • pRC/RSV (hergestellt durch Invitrogen), enthaltend einen RSV-Promotor und ein Neomycinresistenzgen, wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten, dazu wurde weiter BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Dann wurde dies durch Behandlung mit Phenol und Fällung mit Ethanol gereinigt und die Enden davon wurden durch Behandlung mit einem Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) glatt gemacht und dies wurde einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die eine niedrige Schmelztemperatur hat (Agarose L, hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und DNA wurde aus dem Bandenbereich gewonnen. Etwa 100 ng der gewonnenen Vektor-DNA und die gesamte Menge der vorstehend erwähnten DNA-Insertion wurden gemischt, dem wurde eine T4-Ligase hinzugefügt und sie wurden umgesetzt. Diese Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt und die Plasmid-DNA wurde aus einer Kolonie präpariert, die Ampicillinresistenz zeigte, und die Nucleotidsequenz davon wurde durch ein Farbstoff-Terminator-Verfahren unter Verwendung eines ABI-Auto Sequencer vom Typ Modell 377 bestimmt. Die sich ergebende Nucleotidsequenz wurde mit einer Nucleotidsequenz verglichen, die in der vorstehend erwähnten direkten Sequenz erhalten wurde, und ein Plasmid, bei welchem eine vollständige Übereinstimmung zwischen den Nucleotidsequenzen in der Translationsregion bestätigt wurde, wurde ausgewählt und als pRC/RSV-hTR-α Kozak benannt.
  • (2) Thyroidhormonrezeptor β-Expressionsplasmid
  • Ein Vorwärts-Primer: 5'-TTACTAACCTATAACCCCCAACAGTATGACAGAAA-3'
    und ein reverser Primer: 5'-CAGTCTAATCCTCGAACACTTCCAGGAACAAAGGG-3' wurden basierend auf der Nucleotidsequenz eines Thyroidhormonrezeptor β-Gens, publiziert unter der Genbank-Zugangsnummer M26747, entworfen und wurden durch einen DNA-Syntheseautomaten (Modell 394, hergestellt durch Applied Biosystems) synthetisiert, um eine einen menschlichen Thyroidhormonrezeptor-β codierende cDNA zu erhalten.
  • Dann wurden die vorstehend erwähnten Primer, jeder in einer Menge von 10 pMol, zu 10 ng einer menschlichen Leber-cDNA (Quick Clone cDNA #7113, hergestellt durch Clone Tech) als Matrize hinzugefügt und eine PCR-Reaktion wurde unter Verwendung einer LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) und eines mit dem Enzym versetzten Puffers in einer Menge der Reaktionslösung von 50 μl durchgeführt. In dieser Reaktion wurde die Reaktionslösung unter Verwendung eines PCR-Systems 9700 (hergestellt durch Applied Biosystems) über 1 Minute bei 95°C gehalten und dann über 3 Minuten bei 68°C gehalten und dieser Zyklus wurde 35 Mal wiederholt. Dann wurde die gesamte Reaktionslösung einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die einen niedrigen Schmelzpunkt hat (Agarose L; hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen. Es wurde bestätigt, dass die Bande, die eine von der bekannten Sequenz erwartete Größe hatte, amplifiziert worden war und dann wurde die DNA aus der Bande gewonnen und es wurde eine Probe für die direkte Sequenz unter Verwendung dieser DNA und des Die Terminator Sequence-Kits FS (hergestellt durch Applied Biosystems) präpariert. Dies wurde einer Untersuchung der Nucleotidsequenz unter Verwendung eines Auto Sequencer (Modell 377, hergestellt durch Applied Biosystems) unterzogen, um die Nucleotidsequenz zu bestätigen.
  • Eine PCR unter Verwendung eines Vorwärts-Primers: 5'-CCCAGCCACCATGACAGAAAATGGCCTTACAGCTTGGGAC-3' und eines reversen Primers: 5'-CAGTCTAATCCTCGAACACTTCCAGGAACAAAGGG-3' wurde unter Verwendung von etwa 100 ng der, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen DNA als Matrize durchgeführt, um eine DNA herzustellen, die eine Kozak-Konsensussequenz direkt vor dem Startcodon der Translation ATG eines Thyroidhormonrezeptor β-Gens enthält. Es wurden nämlich 0,1 μg einer Thyroidhormon β-cDNA als Matrize, LA-Taq-Polymerase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.), mit Enzym versetzter Reaktionspuffer und die vorstehend erwähnten Primer, jeder in 10 pMol, gemischt, um eine Reaktionslösung in einer Menge von 50 μl zu erhalten, und die Lösung wurde bei 95°C über 1 Minute gehalten und dann bei 68°C über 3 Minuten gehalten und dieser Zyklus wurde 20 Mal wiederholt. Das so erhaltene, so vervielfältigte Produkt wurde aufgetrennt und durch ein Niedrigtemperatur-Agarosegel-Elektrophoreseverfahren gewonnen. Dann wurde etwa 1 μg dieses Produkts mit einem DNA Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um die Enden davon glatt zu machen, und wurde zur Phosphorylierung der Enden davon mit T4-Polynucleotidkinase umgesetzt. Diese DNA wurde mit Phenol behandelt und durch ein Ethanol-Fällungsverfahren gereinigt und das gesamte gereinigte Produkt wurde als DNA-Insertion zur Herstellung eines Expressionsplasmids verwendet.
  • pRC/RSV (hergestellt durch Invitrogen), enthaltend einen RSV-Promotor, und ein Neomycinresistenzgen wurde mit einem Restriktionsenzym HindIII gespalten, dazu wurde dann weiter BAP hinzugefügt und das Gemisch wurde über 1 Stunde bei 65°C gehalten. Dann wurde dies durch Behandlung mit Phenol und Fällung mit Ethanol gereinigt und die Enden davon wurden durch Behandlung mit einem Blunting-Kit (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) glatt gemacht und dies wurde einer Agarosegelelektrophorese unter Verwendung einer Agarose, die eine niedrige Schmelztemperatur hat (Agarose L, hergestellt durch Nippon Gene), unterzogen und die DNA wurde aus dem Bandenbereich gewonnen. Etwa 100 ng der gewonnenen Vektor-DNA und die gesamte Menge der vorstehend erwähnten Isocyanats wurden gemischt, dem wurde eine T4-Ligase hinzugefügt und das Ganze wurde umgesetzt. Diese Reaktionslösung wurde in eine kompetente E. coli DH5α-Zelle eingeführt und die Plasmid-DNA wurde dann aus einer Kolonie präpariert, die Ampicillinresistenz zeigte, und die Nucleotidsequenz davon wurde durch ein Farbstoff-Terminator-Verfahren unter Verwendung eines ABI-Auto Sequencer vom Typ Modell 377 bestimmt. Die sich ergebende Nucleotidsequenz wurde mit einer Nucleotidsequenz verglichen, die in der vorstehend erwähnten, direkten Sequenz erhalten wurde, und ein Plasmid, bei welchem eine vollständige Übereinstimmung zwischen den Nucleotidsequenzen in der Translationsregion bestätigt wurde, wurde ausgewählt und als pRC/RSV-hTRβ Kozak benannt.
  • Beispiel 15
  • (Herstellung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • (1) Thyroidhormonrezeptor α
  • DNA des in Beispiel 1 hergestellten Plasmids pGL3-TATA-TREx5-BSD und die DNA des in Beispiel 2 hergestellten Expressionsplasmids pRC/RSV-hTRα Kozak des Thyroidhormonrezeptors α wurden jeweils linearisiert und in eine aus dem Menschen gewonnene HeLa-Zelle eingeführt und es wurde eine Zelle hergestellt, welche zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle durch einen Thyroidhormonrezeptor α erhält, verwendet werden kann.
  • Zuerst wurde die DNA des Plasmids pGL3-TATA-TREx5-BSD mit NotI gespalten und die DNA des Plasmids pRC/RSV-hTRα Kozak wurde mit SalI gespalten.
  • Die HeLa-Zelle wurden unter Verwendung einer Schale (hergestellt durch Falcon), die einen Durchmesser von etwa 10 cm hatte, in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C unter Verwendung von 10% FBS (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthaltenden DMEM-Medium gezüchtet. Etwa 5 × 105 Zellen wurden gezüchtet und am nächsten Tag wurden in diese Zellen gleichzeitig DNA des Plasmids pGL3-TATA-TREx5-BSD und DNA des Plasmids pRC/RSV-hTRα Kozak, jedes, wie vorstehend beschrieben, linearisiert, durch ein Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Lipofectamin (hergestellt durch GIBCO) eingeführt. Bedingungen des Lipofektionsverfahren schließen entsprechend der Beschreibung des an das Lipofectamin angehängten Handbuchs eine Behandlungszeit von fünf Stunden, eine Gesamtmenge der linearisierten Plasmid-DNAs von 7 μg (jeweils 3,5 μg)/Schale und eine Menge von Lipofectamin von 21 μl/Schale ein. Nach der Lipofektionsbehandlung wurde das Medium durch 10% FBS enthaltendes DMEM-Medium ersetzt und die Züchtung erfolgte über etwa 36 Stunden. Dann wurde die Zelle durch eine Trypsinbehandlung von der Schale entfernt und gewonnen und in ein Kulturgefäß, umfassend ein Medium, das in einer Endkonzentration von 800 μg/ml hinzugefügtes G418 und in einer Endkonzentration von 16 μg/ml hinzugefügtes Blasticidin S enthielt, übertragen und etwa einen Monat gezüchtet, während das Medium alle drei bis vier Tage durch neues Medium (die vorstehend erwähnte selektive Chemikalie enthaltend) ausgetauscht wurde. Die auftretenden Zellkolonien, welche einen Durchmesser von einem Millimeter bis mehrere Millimeter hatten, wurden jeweils auf eine 96-Mulden-Platte (hergestellt durch Bell Told) übertragen, in welche das Medium vorangehend aufgeteilt und gegossen wurde, und wurden weiter gezüchtet. Wenn sich die Zellen in einem Ausmaß vermehrten, dass sie die Hälfte oder mehr der Bodenoberfläche der Mulden besetzten (etwa fünf Tage nach der Übertragung), wurde die Zelle durch Trypsinbehandlung entfernt und gewonnen und in drei Portionen aufgeteilt und in drei neue 96-Mulden-Sichtplatten übertragen. Auf einer Platte wurden als Masterplatte Passage und Züchtung fortgesetzt. Auf einer der verbleibenden zwei Platten wurde T3, aufgelöst in DMSO, zu einer Endkonzentration von 1 μM hinzugefügt und auf der anderen Platte wurde DMSO des gleichen Volumens wie jenes der vorstehend erwähnten T3-Lösung hinzugefügt und beide wurden über zwei Tage gezüchtet. Dann wurde bei diesen zwei Platten das Medium aus der Mulde entfernt, an die Gefäßwände adhärierende Zellen wurden zweimal mit PBS (–) gewaschen und fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) wurde in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platten wurden in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink), wurden automatisch aufgeteilt und dazugegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Eine Zelle, die eine 2-fache oder höhere Luciferaseaktivität in dem System, welches hinzugefügtes T3 enthält, als in dem System, welches kein hinzugefügtes T3 enthält, bereitstellt, wurde ausgewählt.
  • (2) Thyroidhormonrezeptor-β
  • DNA des in Beispiel 1 hergestellten Plasmids pGL3-TATA-TREx5-BSD und die DNA des in Beispiel 2 hergestellten Expressionsplasmids pRC/RSV-hTRβ Kozak des Thyroidhormonrezeptors β wurden jeweils linearisiert und in eine aus dem Menschen gewonnene HeLa-Zelle eingeführt und es wurde eine Zelle hergestellt, welche zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle durch einen Thyroidhormonrezeptor β erhält, verwendet werden kann.
  • Zuerst wurde die DNA des Plasmids pGL3-TATA-TREx5-BSD mit NotI gespalten und die DNA des Plasmids pRC/RSV-hTRβ Kozak wurde mit SalI gespalten.
  • Die HeLa-Zelle wurden unter Verwendung einer Schale (hergestellt durch Falcon), die einen Durchmesser von etwa 10 cm hatte, in der Anwesenheit von 5% CO2 bei 37°C unter Verwendung von 10% FBS (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) enthaltendem DMEM-Medium gezüchtet. Etwa 5 × 105 Zellen wurden gezüchtet und am nächsten Tag wurden in diese Zellen gleichzeitig DNA des Plasmids pGL3-TATA-TREx5-BSD und DNA des Plasmids pRC/RSV-hTRβ Kozak, jedes, wie vorstehend beschrieben, linearisiert, durch ein Lipofektionsverfahren unter Verwendung von Lipofectamin (hergestellt durch GIBCO) eingeführt. Bedingungen des Lipofektionsverfahren schließen entsprechend der Beschreibung des an das Lipofectamin angehängten Handbuchs eine Behandlungszeit von fünf Stunden, eine Gesamtmenge der linearisierten Plasmid-DNAs von 7 μg (jeweils 3,5 μg)/Schale und eine Menge von Lipofectamin von 21 μl/Schale ein. Nach der Lipofektionsbehandlung wurde das Medium durch 10 FBS enthaltendes DMEM-Medium ersetzt und die Züchtung erfolgte über etwa 36 Stunden. Dann wurde die Zelle durch eine Trypsinbehandlung von der Schale entfernt und gewonnen und in ein Kulturgefäß, umfassend ein Medium, das in einer Endkonzentration von 800 μg/ml G418 umfassend und Blasticidin S hinzugefügt zu einer Endkonzentration von 16 μg/ml enthaltendes Medium übertragen und etwa einen Monat gezüchtet, während das Medium alle drei bis vier Tage mit neuem Medium (die vorstehend erwähnte selektive Chemikalie enthaltend) ausgetauscht wurde. Die auftretenden Zellkolonien, welche einen Durchmesser von einem Millimeter bis mehrere Millimeter hatten, wurden jeweils auf eine 96-Mulden-Platte (hergestellt durch Bell Told) übertragen, in welche das Medium vorangehend aufgeteilt und gegossen wurde, und wurden weiter gezüchtet. Wenn sich die Zelle in einem Ausmaß vermehrte, dass sie die Hälfte oder mehr der Bodenoberfläche der Mulden besetzte (fünf Tage nach der Übertragung), wurde die Zelle durch Trypsinbehandlung entfernt und gewonnen und in drei Portionen aufgeteilt und in drei neue 96-Mulden-Sichtplatten übertragen. Auf einer Platte wurden als Masterplatte die Passage und Züchtung fortgesetzt. Auf einer der verbleibenden zwei Platten wurde T3, aufgelöst in DMSO, zu einer Endkonzentration von 1 μM hinzugefügt und auf der anderen Platte wurde DMSO des gleichen Volumens wie jenes der vorstehend erwähnten T3-Lösung hinzugefügt und beide wurden über zwei Tage gezüchtet. Dann wurde bei diesen zwei Platten das Medium aus der Mulde entfernt, an die Gefäßwände adhärierende Zellen wurden zweimal mit PBS (–) gewaschen und fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Ink) wurde in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platten wurden in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Ink), wurden automatisch aufgeteilt und dazugegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Eine Zelle, die eine 2-fache oder höhere Luciferaseaktivität in dem System, welches hinzugefügtes T3 enthält, als in dem System, welches kein hinzugefügtes T3 enthält, bereitstellt, wurde ausgewählt.
  • Testbeispiel 4
  • (Reportertest unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zelle)
  • Ein Medium, welches durch die Zugabe eines mit künstlicher Kohle und mit Dextran behandelten FBS, um eine Endkonzentration von 10% zu ergeben, zu einem von Phenolrot freien MEM-Medium (hergestellt durch Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) hergestellt wurde, wurde verwendet und eine, wie in Beispiel 15 beschrieben, hergestellte erfindungsgemäße Zelle wurde mit etwa 2 × 104 Zellen/Mulde zu einer für die Messung der Luciferase-Lichtemission und zur Züchtung verwendeten 96-Mulde-Platte (#3903, hergestellt durch Corning Coaster) hinzugefügt und dies wurde über Nacht gezüchtet. Dann wurde dieser Zelle in DMSO gelöstes T3 hinzugefügt. Darin wurde die Lösung zum Auflösen hergestellt und hinzugefügt, so dass die Endkonzentration von T3 jeweils 10-fach durch die jeweiligen Testabschnitte zunahm und die DMSO-Mengen in der Kulturlösung in allen Testabschnitten am Ende bei 0,1% übereinstimmten. Ein nur hinzugefügtes Lösungsmittel (DMSO) enthaltender Kontrollabschnitt wurde als ein System bereitgestellt, das kein hinzugefügtes T3 enthält.
  • Diese Zellen wurden gezüchtet und das Medium wurde 36 Stunden nach Zugabe von T3 entfernt und die Zelle wurde zweimal mit PBS (–) gewaschen und dann wurde fünffach verdünntes PGC 50 (hergestellt durch Toyo Irak) in einer Menge von 20 μl pro Mulde hinzugefügt und über 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Diese Platte wurde in ein Luminometer LB96P (hergestellt durch Bell Told), ausgestattet mit einem automatisierten Enzymsubstrat-Injektor, gesetzt und 50 μl einer Substratlösung, PGL100 (hergestellt durch Toyo Irak), wurden automatisch aufgeteilt und dazu gegossen und die Luciferaseaktivität wurde gemessen. Die Ergebnisse werden in 5 und 6 gezeigt. Eine Zunahme in der Luciferaseaktivität zusammen mit einer Zunahme in der Konzentration von der Zelle zugesetztem T3 wurde sowohl in der erfindungsgemäßen Zelle zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle von einem Thyroidhormonrezeptor α erhält, als auch in der erfindungsgemäßen Zelle zur Messung der Transkriptionsaktivität eines Gens, das die Transkriptionskontrolle von einem Thyroidhormonrezeptor β erhält, erkannt.
  • In der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, kann die Agonist-Aktivität einer chemischen Substanz gegenüber dem gewünschten Thyroidhormonrezeptor durch die Zugabe einer chemischen Substanz anstatt von T3 zu jedem Testabschnitt und Durchführung des vorstehend erwähnten Tests in einer ähnlichen Weise gemessen werden.
  • Andererseits kann die Antagonist-Aktivität einer chemischen Substanz gegenüber dem gewünschten Thyroidhormonrezeptor durch Zugabe von T3 zusammen mit einer chemischen Substanz zu jedem Testabschnitt, um so eine Konzentration um den EC50-Wert zu ergeben, und Durchführung des Tests in einer ähnlichen Weise, wie vorstehend beschrieben, gemessen werden.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Zelle bereitzustellen, welche dazu verwendet werden kann, die Wirkung einer chemischen Substanz auf die Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zu beurteilen.

Claims (11)

  1. Tierische Zelle, die ein Gen exprimiert, das einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, und die stabil transformiert ist mit einer DNA, die in einem Molekül beide der folgenden Gene (a) und (b) umfasst: (a) ein Reportergen, das stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor besteht, der in der Zelle funktionieren kann; und (b) ein selektives Markergen, das in der Zelle funktionieren kann; mit der Maßgabe, dass das folgende Gen (c): (c) ein Reportergen, das stromabwärts von einem Promotor mit einer Transkriptionsaktivität verbunden ist, die unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor in Kontakt gebracht wird, wobei das Reportergen (c) ein Protein codiert, das von dem Protein, das durch das Gen (a) codiert wird, unterschieden werden kann, in der Zelle nicht vorkommt.
  2. Zelle gemäß Anspruch 1, wobei der Minimal-Promotor im Wesentlichen aus einer TATA-Box besteht.
  3. Zelle gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Ligand-gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor einer ist, der aus einem Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor, intranuklearen Hormonrezeptor, Östrogenrezeptor, Androgenrezeptor und Thyroidhormonrezeptor ausgewählt ist.
  4. Tierische Zelle, die einen Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor und einen Arnt-Rezeptor exprimiert, und die stabil transformiert ist mit einer DNA, die in einem Molekül beide der folgenden Gene (a) und (b) umfasst: (a) ein Reportergen, das stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Arylkohlenwasserstoff-Rezeptors und einem Minimal-Promotor, der in der Zelle funktionieren kann, besteht; und (b) ein selektives Markergen, das in der Zelle funktionieren kann; mit der Maßgabe, dass das folgende Gen (c): (c) ein Reportergen, das stromabwärts von einem Promotor mit einer Transkriptionsaktivität verbunden ist, die unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor in Kontakt gebracht wird, wobei das Reportergen (c) ein Protein codiert, das von dem Protein, das durch das Gen (a) codiert wird, unterschieden werden kann, in der Zelle nicht vorkommt.
  5. Verwendung einer tierischen Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zum Evaluieren einer Agonist-Aktivität oder Antagonist-Aktivität einer chemischen Substanz über die transkriptionsfördernde Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors in einem Reporter-Test durch Messen der Menge eines Reportergens unter der Transkriptionskontrolle des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors.
  6. Verfahren zur Evaluierung einer chemischen Substanz, Agonist-Aktivität zu haben, über die Transkriptions-fördernde Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wobei das Verfahren umfasst: (i) das Züchten einer tierischen Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in Anwesenheit der chemischen Substanz; (ii) das Messen der Expressionsmenge eines Reportergens in der Zelle; und (iii) das Bewerten der chemischen Substanz, Agonist-Aktivität zu haben über die Transkriptions-fördernde Fähigkeit des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wenn der gemessene Wert der Expressionsmenge des Reportergens, das in die Zelle eingeführt wurde, größer ist als der gemessene Wert der Expressionsmenge des Reportergens in Abwesenheit der chemischen Substanz.
  7. Verfahren zur Evaluierung einer chemischen Substanz, Antagonist-Aktivität zu haben, über die Transkriptions-fördernde Fähigkeit eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wobei das Verfahren umfasst: (i) das Züchten einer tierischen Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in Anwesenheit der chemischen Substanz und eines Liganden des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors; (ii) das Messen der Expressionsmenge eines Reportergens in der Zelle; und (iii) das Bewerten der chemischen Substanz, Antagonist-Aktivität zu haben, über die Transkriptions-fördernde Fähigkeit des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors, wenn der gemessene Wert der Expressionsmenge des Reportergens, das in die Zelle eingeführt wurde, kleiner ist als der gemessene Wert der Expressionsmenge des Reportergens in Anwesenheit des Liganden und in Abwesenheit der chemischen Substanz.
  8. Mess-Kit, der eine tierische Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
  9. Verfahren zum Erhalt einer tierischen Zelle zum Messen der Fähigkeit, die Aktivität eines Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors zu kontrollieren, wobei das Verfahren umfasst: (i) das Einführen einer DNA, die in einem Molekül beide der folgenden Gene (a) und (b) umfasst, in eine tierische Zelle: (a) ein Reportergen, das stromabwärts von einer Transkriptionskontrollregion verbunden ist, wobei die Transkriptionskontrollregion im Wesentlichen aus einer Erkennungssequenz des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktors und einem Minimal-Promotor, der in der Zelle funktionieren kann, besteht; und (b) ein selektives Markergen, das in der Zelle funktionieren kann; wobei die tierische Zelle eine tierische Zelle ist, die eine DNA umfasst, die ein Gen umfasst, das einen Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, die vorher, nachher oder während der gleichen Zeit des obenstehenden Schritts (i) dahinein eingeführt wurde oder die natürlicherweise die Fähigkeit hat, das Gen, das den Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, zu exprimieren, mit der Maßgabe, dass ein Reportergen (c), das stromabwärts von einem Promotor mit einer Transkriptionsaktivität verbunden ist, die unverändert ist, wenn der gesteuerte Transkriptionskontrollfaktor mit einem Ligand des Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor in Kontakt gebracht wird, wobei das Reportergen (c) ein Protein codiert, das von dem Protein, das durch das Gen (a) codiert wird, unterschieden werden kann, in der Zelle nicht vorkommt; und (ii) das Gewinnen von der transformierten Zelle, die aus Schritt (i) erhalten wurde, einer transformierten Zelle, die die eingeführte DNA darin stabil beibehält.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Zelle eine tierische Zelle ist, umfassend eine DNA, die ein Gen umfasst, das den Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, die vorher, nachher oder zur gleichen Zeit von Schritt (i) dahinein eingeführt wurde.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die DNA, die ein Gen umfasst, das den Ligand-gesteuerten Transkriptionskontrollfaktor codiert, in einem Molekül ein selektives Markergen umfasst, das in der Zelle funktionieren kann und das einen Phänotyp codiert, der unterschiedlich zu dem von Gen (b) ist.
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