DE69733884T2

DE69733884T2 - Modifizierten glucocorticoid rezeptor, fusionsproteinen, und dna sowie diese rezeptorund fusionsproteinen kodierenden

Info

Publication number: DE69733884T2
Application number: DE69733884T
Authority: DE
Inventors: Bertrand Jacques BROCARD; Henri Pierre CHAMBON; Hinrich Gronemeyer; Daniel Metzger; Jean-Claude Nicolas; Sylvie Roux
Original assignee: ASS POUR LE DEV de la RECH EN; Association Pour Le Developpement de la Recherche En Genetique Moleculaire (aderegem)
Current assignee: ASS POUR LE DEV de la RECH EN; Association Pour Le Developpement de la Recherche En Genetique Moleculaire (aderegem)
Priority date: 1996-02-20
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-02-21
Also published as: JP2000505298A; JP3618356B2; ATE301193T1; WO1997031108A1; AU2098997A; FR2745008A1; EP0896620B1; AU707684B2; US6699686B1; DE69733884D1; EP0896620A1; CA2247517A1

Description

Die Erfindung betrifft ein DNA-Fragment, welches einen modifizierten nukleären Rezeptor von Glucocorticoiden (GR) kodiert, und ein DNA-Fragment, welches eine Ligandenbindungsdomäne (LBD) des Rezeptors kodiert, wie auch ein DNA-Fragment, welches ein Fusionsprotein, welches den Rezeptor oder die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors fusioniert mit einem Protein, dessen Aktivität in Gegenwart von Glucocorticoid-Liganden induziert wird, umfasst, kodiert.
Die Erfindung betrifft gleichfalls einen modifizierten nukleären Rezeptor von Glucocorticoiden, insbesondere den modifizierten humanen Rezeptor und dessen modifizierte Ligandenbindungsdomäne, wie auch ein Fusionsprotein, welches den Rezeptor oder die Ligandenbindungsdomäne umfasst.
Die Erfindung betrifft gleichfalls einen konditionellen Expressionsvektor eines Proteins, insbesondere eines in humanen oder tierischen Wirtszellen, insbesondere Säugetierzellen fremden Proteins. Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf ein Verfahren zur Expression eines Proteins in diesen Zellen. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur konditionellen Exzision, Insertion, Inversion oder Translokation eines DNA-Fragments in humanen oder tierischen, insbesondere von Säugetieren stammenden Wirtszellen.
Die Erfindung betrifft außerdem einen Vektor zum Transfer eines DNA-Fragments in die humanen oder tierischen, insbesondere von Säugetieren stammenden Wirtszellen und dessen Verwendung als Arzneimittel, als Werkzeug (Tool) zur Analyse und Untersuchung der Funktion eines Gens wie auch ein Verfahren zur Behandlung von Zellen ex vivo oder in vitro.
Schließlich betrifft die Erfindung die humanen oder tierischen Zellen, die durch einen Expressions- und/oder Transfervektor gemäß der Erfindung transfiziert sind, wie auch die transgenen Tiere, die sich davon ableiten.
Der Rezeptor der Glucocorticoide (GR) ist ein die Transkription von Genen regulierendes Protein, welches die Wirkung der Glucocorticoide in den Zielzellen vermittelt. Der GR und andere Mitglieder der Überfamilie der nukleären Rezeptoren (durch Liganden aktivierte Transkriptionsfaktoren) weisen eine gemeinsame modulare Struktur auf. Die variable N-terminale Region enthält die konstitutive Transaktivierungsaktivität AF-1. Die zentrale DNA-Bindungsdomäne (DBD) ist zwischen den verschiedenen Spezies hochgradig konserviert und erlaubt die Bindung des Rezeptors an sein zugehöriges DNA-Response-Element (im Falle des GR GRE). Die Ligandenbindungsdomäne (LBD), welche sich in der C-terminalen Region des GR befindet, bindet nicht nur den Liganden, sondern umfasst gleichfalls eine Mehrzahl von unterschiedlichen Aktivitäten: eine Oberfläche für die Wechselwirkung mit hsp90 und eine unterschiedliche Oberfläche für die Homodimerisierung, ein Kernlokalisierungssignal und eine ligandenabhängige Transaktivierungsfunktion AF-2 (für die die Synthese betreffenden Veröffentlichungen und Referenzen siehe (1–5)). Die LBD-Domäne ist zwischen den verschiedenen Spezies hoch konserviert. Eine Transaktivierungsfunktion AF-2 wurde in dem C-terminalen Abschnitt von verschiedenen LBD identifiziert (6–10). Die Unversehrtheit des zentralen Abschnitts der AF-2 enthaltenden Region ist für die ligandenabhängige Transkriptionsaktivierung durch die entsprechenden nukleären Rezeptoren und für die Wechselwirkung zwischen dieser Region und zugehörigen intermediären Transkriptionsfaktoren (TIF, gleichfalls als Coaktivatoren oder Mediatoren/Vermittler bezeichnet) erforderlich (11–19). Es ist ein allgemeines Modell vorgeschlagen worden (19), in welchem die Bindung des Liganden eine konformatorische Veränderung der Ligandenbindungsdomäne induziert, indem sie insbesondere die C-terminale Region, welche den zentralen Abschnitt von AF-2 beherbergt, mit eingreifen lässt, wodurch eine Oberfläche für eine wirksame Wechselwirkung mit den TIF erzeugt wird. Die LBD der nukleären Rezeptoren enthalten konservierte Regionen, welche eine kanonische helikale Struktur aufweisen. Diese Strukturdaten haben es erlaubt, ein gemeinsames Alignment (gegenseitige Ausrichtung) für die LBD von allen nukleären Rezeptoren vorzunehmen. Die Helix H12 enthält die Transaktivierungsfunktion AF-2 (19). Die Aminosäuren der Helices H11 und H12 insbesondere der Glucocorticoid-Rezeptoren von verschiedenen Spezies, wie dem Menschen, der Ratte, der Maus und von Xenopus, sind konserviert.
Es sind mehrere Mutationen in der LBD von GR zuvor beschrieben worden. Man kann zwei Haupttypen von Mutationen unterscheiden:

– der erste Typ besteht in Mutationen, die die Bindungsaffinität an den Ligand positiv oder negativ beeinflussen. Beispielsweise erhöhen die Ersetzungen des Cysteinrests 656 durch Glycin in dem GR der Ratte (20) und des Methioninrests 565 durch Arginin oder des Alaninrests 573 durch Glutamin in dem humanen GR (hGR) (21) die Bindungsaffinität an den Liganden und führen zu einer Verschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve für die Transaktivierung in Richtung der niedrigeren Ligandenkonzentrationen. Diese Mutanten werden folglich als „Super-GR" bezeichnet. Ebenso wurde über Mutanten mit einer niedrigeren Ligandenbindungsaffinität berichtet (21–24). Die Mutationen von LBD, die die Liganden-Dosis-Wirkungs-Kurve in Richtung der höheren Ligandenkonzentrationen verschieben, resultieren aus einer veränderten Bindungsaffinität des Hormons (25–26);
– die zweite Gruppe von LBD-Mutanten umfasst jene, welche die Transkriptionsaktivierungsfunktion (AF-2) beeinflussen, ohne die Bindung an den Liganden zu verändern. Als Beispiele kann man Mutationen in der AF-2 enthaltenden Region, die mit einem Verlust oder einer Verringerung des Transaktivierungspotentials verbunden sind, aber die Bindungsaffinität an den Liganden nicht beeinflussen, aufführen (6–10).

Die Fusion der Ligandenbindungsdomäne (LBD) von nukleären Rezeptoren mit heterologen Proteinen hat in zahlreichen Fällen erlaubt, die Aktivität dieser Letzteren zu kontrollieren.
Die Aktivitäten von Myc, c-Abl, Src, erbB1, Raf, E1A Cre und FLP können moduliert werden, indem Fusionsproteine mit der LBD von nukleären Rezeptoren hergestellt werden (27–29). Indessen sind die Liganden dieser Rezeptoren in zahlreichen biologischen Systemen vorhanden, wodurch sie ein Aktivitätsgrundniveau induzieren können. Um solche Probleme zu vermeiden, wurde eine mutierte LBD des Östrogenrezeptors (RE) mit dem Protein c-Myc (30) oder mit den Rekombinasen Cre und FLP (28 und 29) fusioniert.
Die Rekombinasen der Familie der Integrasen λ katalysieren die Exzision, Insertion, Inversion oder die Translokation von DNA-Fragmenten im Bereich von spezifischen Erkennungsstellen der Rekombinasen (31–36). Die Rekombinasen sind in den tierischen Zellen aktiv (35).
Die Rekombinase Cre, eine Integrase von 38 kDa des Bakteriophagen P1, katalysiert die Rekombination zwischen zwei DNA-Sequenzen von 34 Basenpaaren, welche als loxP bezeichnet werden, in Abwesenheit von Cofaktoren (32, 1).
Die Lage auf einem oder mehreren DNA-Molekülen und die Orientierung von loxP-Stellen bezogen aufeinander bestimmen den Funktionstyp der Rekombinase, insbesondere Exzision, Insertion, Inversion oder Translokation, der Rekombinase Cre (1). So ist die Rekombinaseaktivität von Cre eine Inversion, wenn zwei LoxP-Stellen in entgegengesetzter Orientierung auf ein und demselben DNA-Fragment vorliegen, und eine Exzision, wenn die LoxP-Stellen auf ein und demselben DNA-Fragment in direkter Wiederholung vorliegen. Die Aktivität der Rekombinase ist eine Insertion, wenn eine loxP-Stelle auf einem DNA-Fragment vorhanden ist, indem ein DNA-Molekül, wie ein Plasmid, welches eine loxP-Stelle enthält, auf der Höhe dieser loxP-Stelle insertiert werden kann (1). Die Rekombinase Cre kann gleichfalls eine Translokation zwischen zwei Chromosomen induzieren mit der Maßgabe, dass eine loxP-Stelle auf jedem von diesen vorhanden ist (37) (1). Allgemeiner ist die Rekombinase Cre folglich in der Lage, die Rekombination zwischen einem oder mehreren unterschiedlichen DNA-Molekülen zu induzieren, mit der Maßgabe, dass sie Träger von loxP-Stellen sind.
Ebenso ist die Rekombinase FLP, eine Rekombinase von 43 kDa von Saccharomyces cerevisiae, zu der gleichen Wirkungsweise an DNA-Fragmenten, welche FRT-Erkennungsstellen enthalten, in der Lage (34).
Indem ein Fusionsprotein (Chimäre) zwischen der Rekombinase Cre und der C-terminalen Region des humanen Östrogenrezeptors, welche an Position 400 ein Valin enthält, hergestellt wird, erhält man ein Molekül, welches in der Lage ist, in Gegenwart des Liganden des Rezeptors, Östradiol, die zwischen zwei loxP befindlichen DNA-Sequenzen ebenso wie eine der loxP-Stellen herauszuschneiden, wenn jene in direkter Wiederholung vorliegen, wohingegen in Abwesenheit von Ligand die Exzision nicht stattfindet (28).
Die Aktivität der Rekombinase FLP ist gleichfalls regulierbar, indem Chimären zwischen FLP und der Bindungsdomäne von nukleären Rezeptoren hergestellt werden. Indem FLP mit der LBD des Östrogenrezeptors oder des Glucocorticoidrezeptors fusioniert wird, ist die Rekombinaseaktivität in Abwesenheit von Ligand sehr gering, wohingegen sie durch die jeweiligen Liganden der LBD schnell induziert wird (29).
Gleichwohl kann die Verwendung von Fusionsproteinen zwischen Rekombinasen und LBD von nukleären Rezeptoren, um auf kontrollierte Weise zwischen Erkennungsstellen der Rekombinasen gelegene DNA-Fragmente herauszuschneiden, Probleme aufwerfen angesichts dessen, dass die im Tier oder in den Kulturmedien der Zellen vorhandenen Ligandenkonzentrationen ausreichend sein können, um die Rekombinaseaktivität zumindest teilweise zu induzieren.
Die Erfindung stellt ein bei Tieren, insbesondere den Säugetieren, induzierbares Rekombinationssystem bereit dank der Verwendung eines Fusionsproteins, welches hergestellt wird zwischen einer Rekombinase und der Ligandenbindungsdomäne, welche abgeleitet ist von dem Rezeptor der Glucocorticoide, dessen Aktivität durch synthetische Glucocorticoide, nicht aber durch natürliche Glucocorticoide insbesondere in Konzentrationen unter 10^–6 M, d.h. physiologischen Konzentrationen, induzierbar ist.
Um die Induktion der Rekombinaseaktivität des chimären Proteins durch die endogenen Liganden zu vermeiden, setzt sich die Erfindung zum Ziel, tatsächlich eine Mutation in der LBD des Glucocorticoid-Rezeptors bereitzustellen, die es jenem erlaubt, in Gegenwart von synthetischen Glucocorticoid-Liganden stärker aktiviert zu werden als in Gegenwart von natürlichen Glucocorticoid-Liganden in physiologischen Konzentrationen.
Die Erfindung hat tatsächlich einen modifizierten nukleären Glucocorticoid-Rezeptor zum Gegenstand, welcher insbesondere in der Region der Ligandenbindungsdomäne mutiert ist derart, dass die Aktivität des Re zeptors durch einen synthetischen Glucocorticoid-Liganden stärker induzierbar ist als durch einen natürlichen Glucocorticoid-Liganden.
Gemäß der Erfindung versteht man unter „(mutierter) Glucocorticoid-Rezeptor oder (mutierter) Rezeptor der Glucocorticoide, welcher durch einen synthetischen Glucocorticoid-Liganden stärker induzierbar ist als durch einen natürlichen Glucocorticoid-Liganden", dass die Aktivität des mutierten Rezeptors gemäß der Erfindung durch synthetische Glucocorticoid-Liganden stärker induziert wird als durch natürliche Glucocorticoid-Liganden in einer gegebenen Konzentration und dass der mutierte Glucocorticoid-Rezeptor gemäß der Erfindung viel weniger empfindlich ist gegenüber den natürlichen Glucocorticoiden als der Wildtyp-Rezeptor.
Unter „Aktivität des Rezeptors" versteht man hier die transkriptionelle Aktivität des Rezeptors und/oder gegebenenfalls die Regulationsaktivität der Aktivität eines mit dem Rezeptor oder mit der Ligandenbindungsdomäne fusionierten Proteins, die in Gegenwart von Glucocorticoiden induziert wird. Man kann insbesondere die Aktivität eines mit dem Rezeptor oder mit der Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors fusionierten Rekombinaseproteins aufführen.
Unter „natürlichen Glucocorticoiden" versteht man hier durch die Nebennierenrinde sekretierte Steroidhormone, wie Cortisol, Corticosteron oder Aldosteron. Unter „synthetischen Glucocorticoiden" versteht man chemisch synthetisierte Agonisten des Rezeptors für die betreffende Aktivität. Man kann unter jenen Dexamethason, Triamcinolonacetonid, RU 486, RU 28362, Bimedrazol, Fluocinolonacetonid aufführen.
Bestimmte synthetische Liganden werden Agonisten, um eine bestimmte Aktivität des Rezeptors zu induzieren, und Antagonisten bezogen auf eine andere Aktivität des Rezeptors sein. So induziert die Verbindung RU 486 die Aktivität eines mit dem Rezeptor oder mit der Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors fusionierten Rekombinaseproteins, induziert aber nicht die transkriptionelle Aktivität des Rezeptors.
Der synthetische Glucocorticoid-Ligand kann an den nukleären Wildtyp-Rezeptor (nicht mutiert) binden, aber es kann sein, dass der syntheti sche Ligand an den mutierten Rezeptor und nicht an den natürlichen Rezeptor bindet. Es kann auch sein, dass, wenn der synthetische Ligand an den Wildtyp-Rezeptor bindet, die Aktivität von jenem durch eine Bindung an den synthetischen Ligand gleichwohl nicht induziert wird.
Es wurde insbesondere eine Mutation in der LBD-Domäne der nukleären Rezeptoren der Glucocorticoide (Isoleucin→Threonin), gelegen zwischen den Helices H11 und H12 (19), identifiziert. Diese Mutation hat einen Aktivitätsverlust des Rezeptors in Gegenwart von natürlichen Glucocorticoiden zur Folge. Genauer hat dieser zwischen H11 und H12 mutierte Glucocorticoid-Rezeptor in Gegenwart von natürlichen Glucocorticoiden in natürlichen physiologischen Konzentrationen von jenen, insbesondere Konzentrationen unter 10^–6 M, keine oder sehr wenig transkriptionelle Aktivität. Seine Aktivität kann indessen durch synthetische Glucocorticoid-Liganden, insbesondere Dexamethason (dex) induziert werden.
Die Erfindung hat insbesondere einen als hGR (I747/T) bezeichneten mutierten humanen Rezeptor, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er als Sequenz die Aminosäuresequenz des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide vom Wildtyp mit einer Isoleucin→Threonin-Mutation an Position 747 aufweist, und noch spezieller einen modifizierten humanen nukleären Rezeptor, der als Aminosäuresequenz eine Sequenz, im Wesentlichen wie in der IDS (Sequenzbeschreibung) Nr. 1 dargestellt, aufweist, zum Gegenstand.
Die Mutation von Isoleucin 747 zu Threonin in dem C-terminalen Abschnitt der Ligandenbindungsdomäne (LBD) des Rezeptors der Glucocorticoide verändert das Vermögen der natürlichen Liganden, bei diesem Transaktivierungsaktivität zu induzieren. Die natürlichen Glucocorticoide, wie Cortisol, Aldosteron oder Corticosteron, sind bei der Mutante GR (I747/T) sehr schwach aktiv oder vollständig inaktiv, wohingegen synthetische Glucocorticoide, wie Dexamethason (Dex), die durch GR (I747/T) vermittelte Transaktivierung wirksam stimulieren. Gleichwohl wird die entsprechende Ligand-Dosis-Wirkungs-Kurve für die durch Dex induzierte Transaktivierung in Richtung der höheren Konzentrationen verschoben verglichen mit jener, die mit GR vom Wildtyp (TS) erhalten wird. Weder die Verschiebung noch die Unfähigkeit von Cortisol, GR (I747/T) wirksam zu aktivieren, sind auf eine veränderte Bindungsaffinität an den Liganden in vitro zurückzuführen.
Tatsächlich verändert die Mutation in der LBD von GR (I747/T) die Bindungsaffinität an den Liganden in vitro nicht wesentlich. Gleichwohl weist diese Mutante bezogen auf GR TS eine bedeutende Verschiebung der Aktivitätskurve in Richtung der höheren Ligandenkonzentrationen auf. Ebenso haben sogenannte physiologische Konzentrationen von natürlichen Glucocorticoid-Liganden, die ausreichend sind, um GR TS zu aktivieren, bei der GR-Mutante lediglich eine Restaktivität oder keinerlei Aktivität zur Folge.
Diese Mutante unterscheidet sich von den anderen Mutanten der LBD von GR, die zuvor beschrieben worden sind (22, 38), deren veränderte Aktivierungsfunktion eng korreliert ist mit einer Modifikation von deren Bindungseigenschaften an den Liganden in vitro.
Die Erfindung hat auch eine Ligandenbindungsdomäne des nukleären Rezeptors der Glucocorticoide gemäß der Erfindung und insbesondere die Domäne LBD [GR(I747/T)], welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Isoleucin→Threonin-Mutation zwischen den Helices H11 und H12 aufweist, zum Gegenstand. Insbesondere hat sie als Sequenz die Aminosäuresequenz der Ligandenbindungsdomäne des humanen Rezeptors der Glucocorticoide, die im Wesentlichen jene ist, wie sie in der IDS NR. 1 von Aminosäure 532 bis Aminosäure 777 dargestellt ist mit einer Isoleucin→Threonin-Mutation an Position 747.
Die Erfindung stellt gleichfalls ein DNA-Fragment bereit, welches einen modifizierten nukleären Glucocorticoid-Rezeptor, welcher insbesondere in der Region der Ligandenbindungsdomäne (LBD) gemäß der Erfindung mutiert ist, kodiert, wie auch ein DNA-Fragment, welches eine Ligandenbindungsdomäne (LBD) des modifizierten Rezeptors gemäß der Erfindung kodiert, bereit.
Die Erfindung hat folglich genauer ein DNA-Fragment, welches einen nukleären Rezeptor der Glucocorticoide vom Wildtyp mit einer Mutation von Isoleucin zu Threonin, welche sich zwischen den Helices H11 und H12 der Aminosäuresequenz des Rezeptors befindet, kodiert, und noch spezieller ein DNA-Fragment, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Sequenz eine kodierende Sequenz des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen jene, die in der IDS Nr. 1 gezeigt ist, ist, aufweist, zum Gegenstand.
Bei einer Ausführungsweise hat die Erfindung ein DNA-Fragment zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Sequenz die cDNA-Sequenz des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide aufweist, welche im Wesentlichen jene ist, wie sie in der IDS Nr. 1 dargestellt ist, umfassend das Threonin kodierende ACC-Codon an Position 747 der Aminosäuresequenz des Rezeptors.
Ebenso hat die Erfindung ein DNA-Fragment zum Gegenstand, welches die Ligandenbindungsdomäne (LBD) des nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, welche mit einer Isoleucin→Threonin-Mutation, welche sich zwischen den Helices H11 und H12 befindet und insbesondere an einer Position, welche der Position 747 der Aminosäuresequenz des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide entspricht, modifiziert ist, kodiert.
Insbesondere stellt die Erfindung ein DNA-Fragment bereit, welches die Ligandenbindungsdomäne des modifizierten humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide kodiert, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Sequenz eine Sequenz aufweist, die die Aminosäuren der Ligandenbindungsdomäne des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, deren Aminosäuresequenz im Wesentlichen diejenige ist, die in der IDS Nr. 1 von Aminosäure 532 bis Aminosäure 777 angegeben ist, kodiert.
Noch spezieller stellt die Erfindung ein DNA-Fragment bereit, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Sequenz die cDNA-Sequenz aufweist, die die Ligandenbindungsdomäne (LBD) des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, die im Wesentlichen diejenige ist, die in der IDS Nr. 1 von Codon 532 bis Codon 777 angegeben ist mit dem ACC-Codon an Position 747, kodiert.
Die Erfindung hat außerdem ein Vektorsystem zur konditionellen Expression eines Proteins, insbesondere eines fremden Proteins in Wirtszellen, umfassend ein Transkriptionskontrollelement, welches durch einen Komplex, welcher durch einen nukleären Rezeptor der Glucocorticoide und einen Liganden gebildet wird, induzierbar ist, zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:

– ein erstes DNA-Fragment, welches aus einem DNA-Fragment besteht, welches das Protein kodiert, unter der Kontrolle von Elementen, die dessen Expression in den Wirtszellen sicherstellen, wobei die Elemente, die dessen Expression sicherstellen, eine Transkriptionskontrollsequenz (RE), welche durch den erfindungsgemäßen Rezeptor, welcher mit einem synthetischen Glucocorticoid-Liganden komplexiert ist, induzierbar ist, umfassen, und
– ein zweites DNA-Fragment, welches aus einem funktionsfähigen, den Rezeptor gemäß der Erfindung kodierenden DNA-Fragment oder nur einem Teil des Fragments, umfassend die Region, die den Liganden erkennt (LBD), gemäß der Erfindung und der DNA-Bindungsregion (DBD), die an die Transkriptionskontrollsequenz (RE) bindet, besteht,
– wobei das erste und das zweite DNA-Fragment sich auf ein und demselben Vektor oder getrennt auf zwei Vektoren befinden können.

Bei einer Ausführungsweise umfasst das Vektorsystem die cDNA, welche kodiert für:

– die LBD-Region, welche durch Codons angegeben wird, welche die Aminosäuren Nr. 532 bis 777 in der IDS Nr. 1 kodieren, und
– die DBD-Region, welche durch Codons angegeben wird, welche die Aminosäuren Nr. 421 bis 487 in der IDS Nr. 1 kodieren.

Bestimmte Zellen haben endogene GR, die durch natürliche Liganden und synthetische Liganden aktiviert werden können. Wenn man ein gegebenes Gen nach Wunsch in solchen Zellen aktivieren möchte, ohne dass es durch die endogenen Liganden, noch durch die endogene Rezeptoren aktiviert werden kann, ist es erforderlich, dass dieses Gen ein von dem GRE unterschiedliches RE enthält, und einen chimären Aktivator, welcher die entsprechende DBD und eine mutierte LBD gemäß der Erfindung umfasst, einzusetzen. Dieses Gen kann folglich durch synthetische Liganden, aber nicht durch natürliche Liganden aktiviert werden.
Aus diesem Grunde ersetzt man bei einer Ausführungsweise die DNA-Bindungsdomäne (DBD) des Rezeptors der Glucocorticoide durch jene eines anderen Transaktivators, insbesondere jene des Hefe-Proteins Gal4, und man ersetzt die Transkriptionskontrollsequenz (RE) des Rezeptors der Glucocorticoide durch jene eines anderen Transaktivators, insbesondere die 17-mere Sequenz (17m), die durch das Protein Gal4 erkannt wird.
Die Erfindung hat folglich gleichfalls ein Verfahren zur Expression eines fremden Proteins in humanen oder tierischen Zellen, insbesondere von Säugetieren, zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Zellen, die ein Expressionsvektorsystem gemäß der Erfindung enthalten, kultiviert und dass man den synthetischen Liganden in das Kulturmedium hinzusetzt und man dann das synthetisierte Protein gewinnt.
Die synthetischen Glucocorticoid-Liganden diffundieren frei in die Zellen, wenn sie in das Kulturmedium hinzugesetzt oder in ein Tier injiziert werden.
In diesem Verfahren wird man insbesondere einen synthetischen Ligand einsetzen, welcher aus Dexamethason, Triamcinolon-acetonid, RU2836, Bimetrazol, Deacylcortivazol und Fluocinolon-acetonid ausgewählt wird.
Die Erfindung hat außerdem ein Fusionsprotein zum Gegenstand, umfassend einen Rezeptor gemäß der Erfindung oder eine Ligandenbindungsdomäne gemäß der Erfindung und ein Protein, dessen Aktivität stärker induzierbar ist durch Bindung eines synthetischen Glucocorticoid-Liganden als eines natürlichen Glucocorticoid-Liganden an den Rezeptor oder die Ligandenbindungsdomäne (LBD).
Insbesondere hat die Erfindung ein Fusionsprotein zum Gegenstand, welches ein Rekombinase-Protein und insbesondere aus der Familie der λ-Integrasen und noch spezieller das Protein Cre des Bakteriophagen P1 umfasst.
Bei einer Ausführungsweise umfasst das Fusionsprotein den C-terminalen Teil der Gelenkregion D des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide zwischengeschaltet zwischen das Protein Cre und die Ligandenbindungsdomäne des modifizierten Rezeptors gemäß der Erfindung.
Die Rekombinase-Aktivität des Fusionsproteins im eigentlichen Sinne ist ähnlich zu jener von Cre. Sie erlaubt folglich, wie Cre, zwischen loxP-Stellen lokalisierte DNA-Sequenzen herauszuschneiden oder zu invertieren, ein eine loxP-Stelle enthaltendes Plasmid auf der Höhe einer in dem Genom lokalisierten loxP-Stelle zu inserieren oder eine Translokation zwischen zwei Chromosomen, die jeweils eine loxP-Stelle enthalten, auszuführen.
Die Erfindung hat gleichfalls ein fusioniertes Gen zum Gegenstand, welches das Fusionsprotein gemäß der Erfindung kodiert, umfassend ein DNA-Fragment, welches einen modifizierten nukleären Glucocorticoid-Rezeptor oder eine Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors gemäß der Erfindung kodiert, wie auch ein DNA-Fragment, welches ein Protein kodiert, dessen Aktivität man zu regulieren wünscht, wobei die Aktivität induzierbar ist durch Bindung eines synthetischen Glucocorticoid-Liganden an den Rezeptor oder die Ligandenbindungsdomäne, nicht aber durch Bindung eines natürlichen Glucocorticoid-Liganden, wenn das Protein sich an den Rezeptor oder die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors fusioniert befindet.
Insbesondere hat die Erfindung ein fusioniertes Gen zum Gegenstand, umfassend in 5'→3'-Richtung:

– ein DNA-Fragment, welches die Rekombinase Cre des Bakteriophagen P1 kodiert;
– ein DNA-Fragment, welches die Gesamtheit oder einen Teil der Gelenkregion D des nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, einer Region, die sich zwischen der DBD-Domäne und der LBD-Domäne befindet, kodiert, und
– das DNA-Fragment, welches die modifizierte, insbesondere mutierte Ligandenbindungsdomäne (LBD) des nukleären Rezeptors der Glucocorticoide gemäß der Erfindung kodiert.

Und noch spezieller hat die Erfindung ein fusioniertes Gen zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Sequenz eine Sequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz der IDS Nr. 2 kodiert, umfassend:

– die Aminosäuren 1 bis 343, die der Rekombinase Cre entsprechen;
– die Aminosäuren 346 bis 377, die der C-terminalen Region der Region D des humanen Rezeptors der Glucocorticoide entsprechen;
– die Aminosäuren 378 bis 623, die der LBD [GR(I747/T)] entsprechen.

Bei einer besonderen Ausführungsweise weist das fusionierte Gen als Sequenz im Wesentlichen die Sequenz Cre-LBD[GR(I747/T)], wie sie in der IDS Nr. 2 angegeben ist, deren Aminosäuren 626 bis 667 der Region F des humanen Rezeptors der Östrogene entsprechen, auf.
Die Erfindung hat gleichfalls einen Vektor für die Expression des Fusionsproteins, welches durch das erfindungsgemäße fusionierte Gen kodiert wird, in tierischen, insbesondere von Säugetieren stammenden Wirtszellen zum Gegenstand, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er das fusionierte Gen gemäß der Erfindung, welches unter die Kontrolle von Expressionselementen, welche dessen Expression in den Wirtszellen sicherstellen, gestellt ist, umfasst. Der Vektor für die Expression des Fusionsproteins kann gleichfalls ein Vektor für die Integration in das Genom der Wirtszellen sein.
In den erfindungsgemäßen Vektoren ist es, um den Rezeptor, die LBD oder das Fusionsprotein gemäß der Erfindung zu exprimieren, erforderlich, dass die DNA-Fragmente, die diese Moleküle kodieren, unter die Kontrolle von Regulationssequenzen, insbesondere Promotor/Enhancer-Sequenzen gestellt sind. Man kann insbesondere Promotor/Enhancer-Sequenzen des SV₄₀-Virus einsetzen.
Die Erfindung hat außerdem ein Verfahren zur konditionellen Rekombination, insbesondere Exzision, Insertion, Inversion oder Translokation auf der Höhe eines DNA-Fragments, welches eine oder zwei spezifische Erkennungsstellen für ein Rekombinase-Protein enthält, in humanen oder tierischen, insbesondere von Säugetieren stammenden Wirtszellen zum Gegenstand, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Schritte umfasst, in welchen:

1) man ein Fusionsprotein gemäß der Erfindung oder einen Expressionsvektor des Fusionsproteins gemäß der Erfindung in die Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Fusionsproteins gemäß der Erfindung erlauben, einführt und
2) man das Fusionsprotein mit einem synthetischen Glucocorticoid-Liganden komplexiert, indem man den Liganden in Gegenwart der Wirtszellen bringt.

Die Erfindung stellt folglich ein Verfahren zur konditionellen Deletion eines DNA-Fragments bereit, in welchem man ein Exzisionsverfahren gemäß der Erfindung ausführt und in welchem das herauszuschneidende DNA-Fragment zwischen zwei Erkennungsstellen für ein Rekombinase-Protein, die in direkter Wiederholung orientiert sind, integriert ist. Insbesondere kann das DNA-Fragment derart ausgewählt werden, dass die Exzision des DNA-Fragments die Inaktivierung des Gens zur Folge hat. Die Exzision des DNA-Fragments kann gleichfalls die Synthese eines funktionsfähigen Proteins erlauben, wenn das Fragment beispielsweise ein Stop-Codon oder ein Polyadenylierungssignal enthält.
Bei einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung sind die spezifischen Erkennungsstellen des Rekombinase-Proteins die loxP-Stellen und das Rekombinase-Protein ist das Protein Cre des Bakteriophagen P₁.
Das DNA-Fragment, das man zu rekombinieren, insbesondere herauszuschneiden wünscht, und die spezifische(n) Erkennungsstelle(n) eines Rekombinase-Proteins können sich auf einem Plasmid-Vektor oder viralen Vektor befinden oder in das Chromosom der Wirtszellen integriert sein.
Die Integration eines Gens, welches loxP-Stellen trägt, in ein Genom kann zufallsgesteuert oder zielgerichtet erfolgen. Insbesondere kann die Integration der spezifischen Erkennungsstellen für das Rekombinase-Protein, insbesondere der loxP-Stelle(n) für die Rekombinase Cre, durch homologe Rekombination des Gens, welches das herauszuschneidende oder zu invertierende (2 loxP-Stellen) bzw. zu inserierende oder zu translozierende (1 loxP-Stelle) DNA-Fragment umfasst, mit einem modifizierten Gen, welches das herauszuschneidende DNA-Fragment, welches 5' und/oder 3' von der oder den Rekombinase-Erkennungsstelle(n), abhängig von der gewünschten Anwendung, insbesondere den loxP-Stellen flankiert wird, umfasst, erfolgen.
Es wurde ein chimäres Protein, Cre-LBD[GR(I747/T)] mit der IDS Nr. 2 konstruiert, welches aus der Rekombinase Cre fusioniert mit der LBD von GR (I747/T) besteht. Das Fusionsprotein Cre-LBD[GR(I747/T)] erlaubt, eine Rekombination zwischen loxP-Stellen in einer Säugetier-Zelle infolge einer Behandlung durch synthetische Glucocorticoide auszuführen. In Abwesenheit einer Behandlung oder in Gegenwart von Konzentrationen von natürlichen Glucocorticoiden, die bis zu 10^–6 M gehen, wird keinerlei Exzision beobachtet. Diese Chimäre ist in der Lage, die DNA-Sequenzen herauszuschneiden, die sich zwischen loxP-Stellen befinden, die vorab in das Genom von F9-Zellen (Maus-Embryokarzinom) integriert worden sind oder vorhanden sind auf einem Plasmid nach Transfektion dieser Zellen mit einem Cre-LBD[GR(I747/T)] exprimierenden Vektor in Folge einer Behandlung mit 10^–6 M oder 10^–7 M Dex, wohingegen Cortisol in solchen Konzentrationen keine Rekombinase-Aktivität induziert. Wie bereits erwähnt, kann der Expressionsvektor Cre-LBD[GR(I747/T)] gleichfalls ein Vektor für die Integration in das Genom der Wirtszellen sein.
Dieses System erlaubt folglich, die Rekombinase-Aktivität eines chimären Proteins zu einem gegebenen und ausgewählten Zeitpunkt freizusetzen. Das Fusionsprotein Cre-LBD[GR(I747/T)] kann in loxP-Stellen enthaltenden Zellen exprimiert werden, ohne den Genort, welcher die loxP-Stellen enthält, zu modifizieren. Die Rekombination auf der Höhe der loxP-Stellen findet einzig nach Behandlung mit synthetischen Glucocorticoiden statt. Außerdem kann man, indem man das Fusionsprotein Cre-LBD[GR(I747/T)] in einem Tier unter der Kontrolle eines Promotors mit Zellspezifität exprimiert, eine Rekombination zwischen loxP-Stellen spezifisch in diesen Zellen erhalten.
Die Erfindung hat gleichfalls einen Vektor für den Transfer eines DNA-Fragments in humane oder tierische Wirtszellen, insbesondere Säugetier-Wirtszellen, zum Gegenstand, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein zu transferierendes DNA-Fragment, welches spezifische Erkennungsstellen für die Rekombinase, insbesondere zwei loxP-Stellen, die in direkter Wiederholung orientiert sind, umfasst, und eine Expressionskassette eines fusionierten Gens gemäß der Erfindung umfasst. Geeigneterweise befinden sich die beiden Stellen an jedem Ende des DNA-Fragments.
Das fusionierte Gen ist vorzugsweise unter die Kontrolle von spezifischen Expressionselementen der Wirtszellen gestellt; insbesondere umfasst es die Sequenz des Plasmids pCre-LBD[GR(I747/T)] mit der IDS Nr. 3.
In dem erfindungsgemäßen Exzisionsverfahren kann das herauszuschneidende DNA-Fragment in die Wirtszellen vor, zur gleichen Zeit wie oder nach dem Schritt der Einführung des Fusionsproteins oder eines Transfervektros transferiert werden.
Der erfindungsgemäße Transfervektor kann ein Plasmidvektor oder ein viraler Vektor sein. Die Transferweise variiert abhängig von der Art der Zielzelle und der angestrebten Wirksamkeit.
Wenn das Material in Keimzellen transferiert wird, setzt man vorzugsweise die Mikroinjektion in den männlichen Pronukleus einer befruchteten Eizelle ein. Um die DNA in pluripotente embryonale Zellen (ES-Zellen) einzuführen, wird die geeignete Technik vielmehr die Elektroporation oder die Verwendung von retroviralen Vektoren sein.
Bei Experimenten, die an somatischen Zellen ausgeführt werden, strebt man an, eine maximale Wirksamkeit zu erzielen, daher die präferentielle Verwendung von viralen Vektoren: hauptsächlich Retroviren und Adenoviren. Diese Viren müssen fehlerhaft sein, insbesondere für eine Anwendung im Bereich der Humanmedizin, um eine jegliche Vermehrung und ein jegliches Reversionsrisiko zu verhindern.
Nach der Integration oder fehlenden Integration dieser Art von Vektoren in das Genom erlaubt das Cre-lox-System, bestimmte virale Sequenzen herauszuschneiden, die gegebenenfalls ein Risiko, was die spätere Vermehrung des Virus angeht, aufweisen könnten. Dies ist sehr vorteilhaft für die Verwendung solcher Vektoren im Bereich der Gentherapie. Vektoren, die eine Expressionskassette des Gens Cre-LBD[GR(I747/T)] und lox-Stellen, die ein potentiell „gefährliches" Gen einrahmen, und diese Kassette enthalten, erlauben, gegebenenfalls nach Integration in das Genom des rekombinierten Virus, diese Elemente zu entfernen. Umgekehrt kann man gleichfalls ein Gen aktivieren, das man in inaktiver Form integriert hat. Diese Aktivierung kann aus der Deletion eines Fragments des Gens, beispielsweise eines Stop-Codons oder eines Polyadenylierungssignals, das von loxP-Stellen eingerahmt wird, resultieren.
Wenn man genetisches Material in eine Zelle zu transferieren wünscht, setzt man im Allgemeinen Konstrukte ein, welche das zu transferierende Gen, zu welchem man gegebenenfalls ein Hilfsgen, welches einen Selektionsvorteil verleiht (beispielsweise das neo-Gen, welches Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleiht), hinzufügt, umfassen.
Die Selektionsmarker können gleichfalls durch das erfindungsgemäße Exzisionsverfahren herausgeschnitten werden.
Unter Verwendung von klassischen Techniken kann man Gene von Säugetieren, insbesondere von der Maus, durch homologe Rekombination modifizieren. Eine loxP-Stelle kann in ein Gen, welches man zu modifizieren wünscht, eingeführt werden oder zwei loxP-Stellen können Sequenzen, die man zu modifizieren wünscht, einrahmen. Insbesondere kann der Selektionsmarker, der eingesetzt wird, um zu ermöglichen, die Ereignisse von homologer Rekombination zu identifizieren, störend sein und kann zunächst entfernt werden, sofern erforderlich, wenn er selbst von Rekombinase-Erkennungsstellen, wie loxP- oder FRT-Stellen, eingerahmt ist, indem das entsprechende Rekombinase-Protein durch Mikroinjektion eingeführt wird, indem die Zellen, insbesondere ES-Zellen, mit einem Expressionsvektor für ein Rekombinase-Protein transfiziert werden oder indem Mäuse, die den Selektionsmarker trage, mit Mäusen, welche die gewünschte Rekombinase, insbesondere die Rekombinase Cre, exprimieren, gekreuzt werden. Dies erlaubt, Mäuse zu erhalten, deren einzige Modifikation im Bereich des modifizierten Genorts die Insertion von Erkennungsstellen, wie loxP, ist. Diese Mäuse können in der Folge mit Mäusen, welche Cre-LBD[GR(I747/T)] exprimieren, gekreuzt werden, und die Modifikation des Genorts durch Behandlung mit dem Ligand, wie Dex, erzielt werden. Dies erlaubt, ein Gen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu inaktivieren oder zu modifizieren, und folglich die Funktion dieser Gene zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Entwicklung zu untersuchen. Dies ist besonders interessant für die Untersuchung von Genen, die für einen guten Ablauf der Embryonalentwicklung unabdingbar sind. Tatsächlich haben in bestimmten Fällen die klassischen Techniken der homolo gen Rekombination den Tod des Embryos zur Folge und erlauben nicht, die Funktion des Gens in späteren Stadien zu untersuchen.
Der Transfer von Genen in eine gegebene Zelle ist die Basis der Gentherapie. Die in dieser Hinsicht wirkungsvollsten Vektoren sind virale Vektoren, insbesondere retrovirale oder adenovirale Vektoren (39). Die Erfindung hat folglich gleichfalls einen erfindungsgemäßen Transfervektor, welcher das zu transferierende DNA-Fragment, umfassend zwei loxP-Stellen, welche in direkter Wiederholung angeordnet sind, umfasst, für eine Verwendung als Arzneimittel in der Gentherapie, wenn jener in Verbindung mit einem synthetischen Glucocorticoid-Liganden, wie Dexamethason, verabreicht wird, zum Gegenstand.
Diese Art von Vektor erlaubt, das gewünschte DNA-Fragment, umfassend zwei spezifische Rekombinase-Erkennungsstellen, in ein Gen derart zu transferieren, dass die zwischen den beiden loxP-Stellen befindlichen DNA-Sequenzen konditional nach Verabreichung des synthetischen Glucocorticoid-Liganden herausgeschnitten werden können.
Die Erfindung stellt außerdem humane oder tierische, insbesondere von Säugetieren stammende Zellen, die durch einen Vektor für die Expression und den Transfer eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins transfiziert sind, oder humane oder tierische, insbesondere von Säugetieren stammende Zellen, in welche ein DNA-Fragment mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Transfervektors transferiert worden ist, oder ferner humane oder tierische, insbesondere von Säugetieren stammende Zellen, welche konstitutiv das erfindungsgemäße Fusionsprotein exprimieren, bereit.
Die Erfindung hat schließlich zum ergänzenden Gegenstand ein transgenes Tier, insbesondere Maus, welche(s) ein funktionsfähiges Gen des erfindungsgemäßen Fusionsproteins, welches insbesondere in eines von dessen bzw. deren Chromosomen integriert ist, umfasst.
Oder ferner ein transgenes Tier, welches ein funktionsfähiges Gen des erfindungsgemäßen Fusionsproteins umfasst, in welchem ein Gen von Interesse durch Insertion von einer oder mehreren loxP-Stelle(n), die insbesondere in ein oder mehrere Chromosomen integriert ist bzw. sind, modifiziert ist.
Die Erfindung hat schließlich die Verwendung eines Expressions- oder Transfervektors, von Zellen oder eines Tiers gemäß der Erfindung als Werkzeug (Tool) zur Analyse oder Untersuchung der Funktion oder Funktionsweise eines gegebenen Gens einer Wirtszelle und ein Verfahren zur Behandlung von Zellen ex vivo oder in vitro, welches das Ausführen eines Exzisions-, Insertions-, Inversions- oder Translokationsverfahrens gemäß der Erfindung und die Verwendung eines erfindungsgemäßen Expressions- oder Transfervektors umfasst, zum Gegenstand.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden im Lichte der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich.
Die IDS Nr. 1 repräsentiert die Nukleotid- und Peptidsequenzen von GR(I747/T) mit der den AS 421–487 entsprechenden DBD und der den AS 532–777 entsprechenden LBD.
Die IDS Nr. 2 repräsentiert die Nukleotid- und Peptidsequenzen von Cre-LBD[GR(I747/T)].
Die Nukleotide 1–1029 kodieren die Rekombinase Cre (AS 1–343).
Die Nukleotide 1036–1131 kodieren die C-terminale Region der Region D des humanen Rezeptors der Glucocorticoide [AS 500–531 von GR(I747/T); AS 346–377 von Cre-LBD[GR(I747/T)].
Die Nukleotide 1132–1869 kodieren die LBD von GR(I747/T) [RS 532–777 von GR(I747/T); AS 378–623 von Cre-LBD[GR(I747/T)].
Die Nukleotide 1876–2001 kodieren die Region F des humanen Rezeptors der Östrogene [RS 554–595 von HEG0; AS 626–667 von Cre-LBD[GR(I747/T)].
Die Nukleotide 1777–1779 entsprechen der Mutation, die Isoleucin durch ein Threonin ersetzt.
Die IDS Nr. 3 repräsentiert die Nukleotidsequenz des Plasmids pCre-LBD[GR(I747/T)].
Die IDS Nr. 4 bis 17 repräsentieren die Nukleotidsequenzen der verschiedenen Oligonukleotide, die gemäß der Erfindung eingesetzt werden.
Die 1 ist eine schematische Darstellung von Rekombinase-Aktivitäten von Cre.
Die 2 repräsentiert die transkriptionelle Aktivität eines mutierten GR-Rezeptors und des GR-Rezeptors vom Wildtyp in Reaktion auf Dexamethason und das Bindungsvermögen von Dexamethason an die beiden Rezeptoren.
Die 3 repräsentiert eine Scatchard-Analyse der Bindung von [³H]-Dexamethason an den Rezeptor vom Wildtyp und die Rezeptormutante I747/T.
Die 4 repräsentiert die Kompetition durch RU 486 der Dex-Bindungs- und Transaktivierungsaktivitäten des Rezeptors vom Wildtyp (TS) und GR(I747/T).
Die 5 ist eine schematische Darstellung der Proteine Cre, hER, Cre-ER, hGR und Cre-LBD[GR(I747/T)].
Die 6 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pCre-LBD[GR(I747/T)]
Die 7 repräsentiert die Nukleotidsequenz von pCre-LBD[GR(I747/T)] und die Peptidsequenz von Cre-LBD[GR(I747/T)].
Die 8 repräsentiert die PCR-Strategie, die eingesetzt wurde, um die Wildtyp-, mutierten und rekombinierten Allele in dem Rekombinase-Aktivitätstest von Cre-LBD[GR(I747/T)] nachzuweisen.
Die 9 repräsentiert die PCR-Analyse der Exzision der zwischen den loxP-Stellen gelegenen Sequenzen nach transitorischer Transfektion von RXRα^+/–(LNL)-Mäusezellen durch pCre-LBD[GR(I747/T)] ohne Zugabe von Ligand oder behandelt mit Cortisol (10^–6 M) oder Dexamethason (10^–6 M).
Die 10 repräsentiert die PCR-Analyse der Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] in den RXRα^+/–(LNL): Cre-GR(I747/T)-Zellen, die nicht behandelt oder mit Cortisol oder Dexamethason in einer Konzentration von 10^–6 M behandelt worden sind.
Die 11 rekapituliert die Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] in der RXRα^+/–(LNL)-Linie, welche die Rekombinase konstitutiv exprimiert, in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von verschiedenen Liganden.
Die 12 repräsentiert die PCR-Analyse der Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)], induziert durch synthetische Liganden trotz des Vorhandenseins von natürlichen Liganden.
Die 13 repräsentiert den Test der Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] in humanen HeLa-Zellen.
Die 14 ist eine schematische Darstellung des Transgens Cre-LBD[GR(I747/T)]. Der Teil (a) steht für das DNA-Fragment, welches die kodierende Sequenz des Gens Cre-LBD[GR(I747/T)] enthält, welches verwendet wird, um transgene Mäuse zu erzeugen, und der Teil (b) repräsentiert die genomische Struktur des Allels RXRα vom Wildtyp, des Zielallels RXRα^ΔAF2(LNL) und des Exzisions-Allels RXRα^ΔAF2(L) wie auch die PCR-Strategie für die Analyse der Exzision des Markers.
Die 15 repräsentiert die PCR-Analyse der Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] bei der mit Dexamethason behandelten Maus.
BEISPIEL 1: Ersetzen von Isoleucin 747 durch Threonin in dem humanen nukleären Rezeptor der Glucocorticoide
Es wurde eine humane GR-Mutante erhalten, welche eine einzige Aminosäureersetzung, jene des Rests Isoleucin 747 durch einen Threoninrest, lokalisiert zwischen den Helices H11 und H12, in dem C-terminalen Teil der Ligandenbindungsdomäne umfasst. Diese Mutation ist spontan in den von HG1 abgeleiteten Vektoren aufgetreten (40). Diese Mutante unter scheidet sich von den anderen Mutanten der LBD von GR, die zuvor beschrieben worden sind (22, 38), bei denen die veränderte Aktivierungsfunktion eng mit einer Modifikation von deren Ligandenbindungseigenschaften in vitro korreliert ist.
1. Mutation in dem humanen GR
Der Expressionsvektor des humanen GR vom Wildtyp (pSG5HG0) wurde erhalten, indem das BamHI-Fragment von ungefähr 2,9 kb (welches das offene Leseraster von hGR vom Wildtyp enthielt), isoliert aus dem zuvor beschriebenen Vektor HG0 (40), in die BamHI-Stelle des Expressionsvektors pSG5 (41) kloniert wurde.
Alle DNA-Konstruktionen wurden mittels klassischer Techniken (42) ausgeführt. Der Expressionsvektor GR(I747/T)hGr, welcher eine Mutante, welche die Mutation I 747 → T trägt, kodiert, wurde ausgehend von dem Fragment aus dem PstI-PflMI-Verdau des mutierten Expressionsvektors HG1 (40), welches in die entsprechenden PstI- und PflMI-Stellen von pSG5HG0 ligiert worden war, erhalten.
Zusätzlich zu der in HG1 vorhandenen Mutation des Isoleucinrests 747 zu einem Threoninrest enthält diese Mutante gleichfalls eine Mutation der EcoRI-Stelle, die keine Veränderung der Peptidsequenz zur Folge hat.
Das Vorhandensein der Mutation wurde durch Sequenzierung bestätigt (Protokoll Sequenase 2.0, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH).
2. Ergebnisse
2.1. Das Ersetzen von Isoleucin 747 durch Threonin führt zu einer Verschiebung der Dexamethason-Dosis-Wirkungs-Kurve für die Transaktivierung, ohne die Ligandenbindungsaffinität deutlich zu beeinflussen.
Es wurden die Transkriptionscharakteristiken von hGR vom Wildtyp (TS) und einer Mutante, in welcher das Isoleucin 747 durch Threonin ersetzt worden war [bezeichnet nachfolgend als GR(I747/T)], verglichen. Die Rezeptoren wurden transitorisch in CV-1-Zellen, denen GR fehlte, gleichzeitig mit einem Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des Promotors der Tyrosinaminotransferase (pTAT-tk-Luc) exprimiert. Die
2 zeigt die entsprechenden Wirkungskurven in Abhängigkeit von der verwendeten Ligandendosis, welche erlauben, die EC₅₀-Werte (die Ligandenkonzentration, welche 50% der maximalen Transkriptionswirkung oder -reaktion liefert) zu bestimmen. Die Dosis-Wirkungs-Kurve für hGR TS weist eine maximale Wirkung bei 10^–8 M Dex und eine Wirkung, welche gleich der Hälfte der maximalen Wirkung ist, bei 4 × 10^–10 M auf, wohingegen die Transkriptionswirkungskurve der Mutante GR(I747/T) deutlich in Richtung der höheren Ligandenkonzentrationen verschoben ist, was 100-fach höhere Werte der EC₅₀ für Dex (4 × 10^–8 M) zur Folge hat (siehe nachfolgende Tabelle I). Die maximale Stimulation, die durch GR(I747/T) vermittelt wird, wurde bei ungefähr 10^–6 M Dex erzielt. Gleichwohl ist es wichtig, festzuhalten, dass der Rezeptor GR(I747/T) in der Lage ist, die Transkription von pTAT-tk-Luc in dem gleichen Ausmaß wie der GR TS zu aktivieren. Folglich verringert das Ersetzen des Isoleucinrests durch Threonin an Position 747 nicht die Fähigkeit des GR, die Transkription zu aktivieren, sondern hat spezifisch die Empfindlichkeit der Wirkung gegenüber dem Liganden modifiziert.
Die Wirkung dieser Mutation ist unabhängig von der N-terminalen A/B-Region und von deren assoziierter Transaktivierungsfunktion AF-1. Die Deletionsmutanten, denen AF-1 fehlt, die aber die Mutation I747/T enthalten, [ΔA/B-GR(I747/T)] benötigen 3 × 10^–8 M Dex für eine Stimulation, welche die Hälfte der maximalen Stimulation darstellt, wohingegen nur 6 × 10^–10 M ausreichend sind für ΔA/B-GR, welcher von TS abgeleitet ist (Daten nicht gezeigt; siehe gleichfalls die Tabelle II für die entsprechenden GAL-Chimären). So übt die Mutation I747/T eine ähnliche Wirkung auf den vollständigen GR und den GR mit N-terminaler Deletion aus. Man kann daraus schließen, dass die beobachtete Verschiebung bei der von der Ligandendosis abhängigen Wirkung nicht die Folge einer modifizierten Wechselwirkung zwischen AF-1 und AF2 ist.
Um die Auswirkung der Mutation I747/T auf die Bindung des Liganden zu bestimmen, wurde die Bindung von Dex in einem Zytosol von Cos-7-Zellen, welche transitorisch die hGR-Mutante und den hGR vom Wildtyp exprimieren, gemessen. Die ausgehend von einer Scatchard-Analyse erhaltenen K_d-Werte sind sehr ähnlich, denn die Mutante I747/T manifestiert eine lediglich zweifach geringere Affinität für Dex als der GR TS (3). So kann die Größenordnung der Verschiebung der Dosis- Wirkungs-Kurven in Richtung der hohen Konzentrationen von hGR (I747/T) bezogen auf den hGR TS (ungefähr 100-fach) kaum aus einer Verringerung der Affinität für den Liganden des mutierten hGR (nur Faktor 2; vergleiche die 2 und 3) resultieren.
2.2. hGR(I747/T) spricht auf die natürlichen Liganden nicht an.
Um die Bindungseigenschaften der Mutante I747/T mehr zu charakterisieren, wurde dabei die Aktivierung durch verschiedene bekannte synthetische Agonisten für den GR TS (Triamcinolonacetonid, RU28362, Bimedrazol), einen partiellen Agonisten (Fluocinolonacetonid) und natürliche Glucocorticoide (Cortisol, Corticosteron) verglichen. Bei dem mutierten Rezeptor liefern Triamcinolonacetonid und RU28362 die gleiche Transaktivierung wie bei dem Wildtyp-Rezeptor, wohingegen Bimedrazol und Fluocinolonacetonid eine höhere Aktivität manifestierten (Tabelle I). Für alle diese Analoga zeigt die Mutante I747/T eine Verschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve in Richtung der höheren Ligandenkonzentrationen, auch wenn diese Verschiebung für Liganden mit hoher Affinität weniger ausgeprägt ist (Tabelle 2).
Die natürlichen Liganden, wie Cortisol oder Corticosteron oder Aldosteron, der natürliche Ligand des Mineralcorticoid-Rezeptors, binden an den GR mit einer geringeren Affinität als Dex. Bei dem GR vom Wildtyp sind diese Liganden ebenso wirksam wie Dex, um das Luciferase-Reportersystem zu stimulieren (Tabelle I). Gleichwohl ist in Gegenwart dieser natürlichen Liganden und in bemerkenswertem Gegensatz zu den mit Dex beobachteten Wirkungen die Transaktivierung durch die Mutante I747/T stark verringert (Cortisol) oder unterdrückt (Corticosteron, Aldosteron).
2.3. Ähnliche Agonisten- und Antagonisten-Aktivitäten von RU486 bei dem hGR vom Wildtyp und der hGR-Mutante
RU486 ist ein starker Inhibitor der Expression der von Glucocorticoiden abhängigen Gene. In Gegenwart dieses Antagonisten wird die AF-2-Funktion des GR blockiert, aber man konnte eine bestimmte, von AF1 abhängige Agonistenaktivität beobachten [(43) und Referenzen, die darin enthalten sind). Eine Mutation oder eine Deletion des C-terminalen Abschnitts der LBD kann die Reaktion auf Agonisten/Antagonisten-Liganden verändern, obgleich die Rollen von AF-1 und AF-2 in den aufgeführten Untersuchungen (44–46) nicht klar definiert werden.
Um die relative Bindungsaffinität von RU486 für die Mutante I747/T und den Wildtyp zu testen, wurde die Fähigkeit von RU486 untersucht, in einen Wettbewerb mit Dex bezüglich der Bindung an die Rezeptoren einzutreten. Mit der hGR-Mutante oder dem TS-hGR transfizierte Zellen wurden mit 10 nM [³H]-Dex, einer ausreichenden Konzentration, um im Wesentlichen mutierte Rezeptoren und TS-Rezeptoren, die mit Dex komplexiert sind, zu erzeugen, entsprechend den in vitro-Ligandenbindungsassays (siehe oben) und steigenden Konzentrationen von RU486 behandelt (4). Es wurden für die beiden Rezeptoren sehr ähnliche IC₅₀-Werte (die Antagonistenkonzentration, welche 50% der maximalen Transaktivierung blockiert) erhalten (10^–8 M für den hGR TS und 6 × 10^–9 M für die hGR-Mutante). Diese Ergebnisse stimmen überein mit den Dex-Bindungsversuchen und zeigen, dass die Bindungsaffinitäten an Dex und RU486 durch die Mutation I747/T nicht modifiziert werden.
2.4. Die Verschiebung der Transkriptionsaktivität des mutierten Rezeptors ist unabhängig von dem Promotor
Die oben beschriebenen Ergebnisse wurden in transfizierten Zellen erhalten, indem ein Reportergen verwendet wurde, welches ein Promotorfragment des TAT-Gens, welches zwei auf Glucocorticoide ansprechende Elemente (GRE; „glucocorticoid response elements") aufwies, enthielt. Um zwischen einer Modifikation der ureigenen Transaktivierungseigenschaften des Rezeptors und einer Modifikation der kooperativen Aktivität, welche aus der Bindung von mehreren Rezeptormolekülen resultiert, zu unterscheiden, wurden die Transkriptionsaktivitäten des mutierten Rezeptors GR(I747/T) und des Rezeptors vom Wildtyp verglichen unter Verwendung eines synthetischen Promotors, welcher ein einziges, palindromisches und perfektes GRE enthielt. Die entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven weisen die gleichen Profile wie jene, die mit dem TAT-Promotor erhalten wurden, auf. Die der Hälfte der maximalen Wirkung entsprechende Wirkung wird bei 10^–10 M für den GR TS und bei 2 × 10^–8 M für GR(I747/T) erhalten (Tabelle II). Dies zeigt an, dass die bei der Rezeptormutante beobachtete Verschiebung die ureigenen Transaktivierungseigenschaften der Mutante GR(I747/T) reflektiert und nicht das Ergebnis einer Veränderung der Kooperation zwischen den Rezeptoren ist.
Das Ersetzen der DNA-Bindungsdomäne von GR durch die 147 ersten Aminosäuren des Transaktivators von Gal4 aus der Hefe liefert ein hybrides Aktivatorprotein mit einer neuen Promotorspezifität. Die Gal4-GR-Hybride bestehen aus einer DNA-Bindungsdomäne (DBD) von Gal4 (1–147) fusioniert mit der LBD von hGR TS oder der hGR-Mutante. Deren Fähigkeiten, die Transkription zu aktivieren, wurden in transitorischen Transfektionsassays in HeLa-Zellen getestet. Es wurde die gleiche Verschiebung wie bei der vollständigen Mutante GR(I747/T) festgestellt (Tabelle II). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verschiebung der Transkriptionswirkung abhängig von der Dosis des Liganden unabhängig vom Promotor und von einem „Response-Element" (RE) ist. Außerdem ist diese Wirkung offensichtlich nicht spezifisch für die eingesetzten Stämme von Zellen, da man dies zugleich in humanen HeLa-Zellen und Cos-Affenzellen festgestellt hat. Um eine mögliche Beteiligung von Faktoren, die an den tk-Promotor oder β-Globin des Reportergens binden (47), besser auszuschließen, wurde ein Reportergen verwendet, welches ein Gal4-Response-Element, welches einem Minimalpromotor vorangeht, enthält. Obgleich die Transaktivierung durch das chimäre Gal4-Protein bei diesem minimalen Reportergen verringert war, konnte man noch eine Verschiebung der Wirkungskurve in Richtung der steigenden Dosen für das mutierte chimäre Protein Gal4-GR(I747/T) beobachten (Tabelle II).
2.5. Transkriptionsaktivität des mutierten GR-Rezeptors und des Rezeptors vom Wildtyp in Reaktion auf Dexamethason (2)
CV-1-Zellen wurden transitorisch mit 0,5 μg von Expressionsvektoren von GR vom Wildtyp (☐) oder von GR(I747T) (o), 2,5 μg pTAT-tk-Luc als Reporterplasmid und 0,5 μg pCMV-βGal als interner Vergleich transfiziert. Nach der Transfektion ließ man die Zellen 24 h mit steigenden Konzentrationen von Dex inkubieren und man unterwarf diese dann einem Assay der β-Galactosidase- und Luciferase-Aktivitäten, wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Die Luciferase-Aktivität wurde mittels der β-Galactosidase-Aktivität normalisiert und der in Abwesenheit von Ligand erhaltene Wert wurde für jeden Punkt abgezogen. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der maximalen Luciferase-Aktivität, welche für jeden Rezeptor erhalten wurde, ausgedrückt. Jeder Punkt ist der Mit telwert ± Standardabweichung des Mittelwerts von vier getrennten Bestimmungen, die doppelt ausgeführt wurden. Die Bindungsanalysen bei Sättigung erfolgten mit Zytosolen, welche von Cos-7-Zellen stammten, die mit 40 μg Expressionsvektor von hGR vom Wildtyp (☐) oder von hGR(I747/T) (•) transfiziert worden waren, mit 20 μg pCMV-βGal, welches man eine Nacht bei 4°C in Gegenwart von steigenden Konzentrationen von [³H]-Dexamethason ± einem 100-fachen Überschuss von strahlungsinertem Dex inkubieren ließ. Das gebundene [³H]-Steroid wurde nach Behandlung mittels mit Dextran überzogener Kohle gemessen. Die dargestellten Ergebnisse sind jene eines einzigen Versuchs, der doppelt ausgeführt wurde und drei separate Versuche repräsentierte. Die Sättigungskurven der Bindung von [³H]-Dexamethason sind als Prozentsatz des maximalen Bindungsvermögens, welches für jeden Rezeptor erhalten wurde, dargestellt. Das Bindungsvermögen der Mutante GR(I747/T) ist verringert, wobei es ungefähr 40–60% von jenem des hGR vom Wildtyp erreicht (623 ± 65 fmol/mg Protein verglichen mit 1340 ± 285 fmol/mg Protein).
2.6. Scatchard-Analyse der Bindung von [³H]-Dexamethason an die Rezeptoren vom Wildtyp und der I747/T-Mutante (3).
Es wurde die Scatchard-Analyse auf die Bindung, ausgeführt wie in der 2 beschrieben, angewendet. Die apparente Dissoziationskonstante der Mutante GR(I747/T) (o) ist lediglich zweimal höher als jene des hGR vom Wildtyp (☐) (K_d = 5,1 ± 1,9 verglichen mit 2,7 ± 1,3 nM).
2.7. Tabelle I Transkriptionsaktivitäten und EC₅₀ von verschiedenen Steroiden mit hGR vom Wildtyp und hGR(I747/T)
Die Cotransfektionen wurden vorgenommen und die Dosis-Wirkungs-Kurven konstruiert, wie in der 2 beschrieben. Es wurden Triamcinolonacetonid (TA), RU28362, Fluocinolonacetonid (Fluocinolon), Cortisol, Corticosteron und Aldosteron in sechs steigenden Konzentrationen doppelt getestet. Die Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitätsassays wurden ausgeführt, wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. In dieser Tabelle sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Versuchen angegeben. nm = nicht messbar.
2.8. Kompetition der Dex-Bindungsaktivitäten und der Transaktivierungsaktivitäten durch RU486 (4).
Mit dem hGR vom Wildtyp (☐) oder der I747T-Mutante (•) transfizierte Cos-7-Zellen ließ man 1 h bei 37°C mit 10 nM [3H]-Dexamethason allein oder in Gegenwart der angegebenen Konzentration von nicht-markiertem RU486 inkubieren, wie in „Materialien und Methoden" beschrieben. Die Daten sind ausgedrückt als Prozentsatz der spezifischen Bindung, die bei der keiner Kompetition unterworfenen Vergleichsprobe beobachtet wurde. Diese Daten repräsentieren den Mittelwert von für jede Antagonisten-Konzentration doppelt ausgeführten Bestimmungen.
Die Antagonisten-Aktivität wurde an CV-1-Zellen, die, wie in 4 beschrieben, transfiziert und die gleichzeitig mit 10^–7 M Dex und der angegebenen Konzentration von RU486 24 h vor der Ernte für den Assay der Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitäten behandelt worden waren, bestimmt. 100 Aktivität werden für jeden Rezeptor als Luciferase-Aktivität der mit Dex allein behandelten Zellen definiert. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert von wenigstens zwei unabhängigen Versuchen, die doppelt ausgeführt wurden. (☐): hGR vom Wildtyp; (o) Mutante I747T.
2.9. Tabelle II Mit verschiedenen Reportergenen erhaltene EC₅₀
HeLa-Zellen (für die Gal4-Chimären) oder CV-1-Zellen wurden transitorisch mit verschiedenen Expressionsvektoren und Reportergenen cotransfiziert. Die Effizienz der Transfektion wurde standardisiert, indem mit 0,5 μg pCMV-βgal-Vektor cotransfiziert wurde. Die Zellen wurden 24 h mit steigenden Konzentrationen von Dexamethason behandelt. Die Luciferase- und β-Galactosidase-Assays wurden ausgeführt, wie in "Materialien und Methoden" beschrieben. Die Luciferase-Aktivität wird ausgedrückt als Prozentsatz der maximalen Aktivität, welche für jeden Rezeptor und jedes Reportergen erhalten wird. Die EC₅₀-Werte wurden graphisch bestimmt.
2.10. Rekapitulation
Die Mutation des Isoleucins 747 des humanen Rezeptors der Glucocorticoide zu Threonin führt zu einer sehr starken Verringerung, ja sogar einer Vernichtung der Transaktivierungsaktivität des Rezeptors in Gegenwart von natürlichen Glucocorticoiden, wohingegen bei ähnlichen Konzentrationen synthetische Glucocorticoide die Transaktivierungsaktivität dieses mutierten Rezeptors wirksam stimulieren.
Es ist wichtig, zu unterstreichen, dass hGR(I747/T) bei einer hohen Konzentration von Dex vollständig anspricht, was anzeigt, dass er im Prinzip ebenso wirksam zur Transaktivierung in der Lage ist wie sein Gegenstück vom Wildtyp. Folglich wird die transkriptionelle Aktivierungsfunktion von AF-2 selbst offensichtlich durch die Mutation nicht verändert, wie dies bei Rezeptoren, die Mutationen in dem zentralen Abschnitt von AF-2 umfassen, der Fall ist (siehe die Einführung bezüglich der Referenzen).
3. Materialien und Methoden
3.1. Zellkulturen und Transfektion
Die CV-1- und Cos-7-Zellen wurden in durch Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), welches 10% (Vol./Vol.) fötales Kälberserum (SVF) (Gibco, Grand Island, NY) enthält, in einer 5% CO₂ enthaltenden befeuchteten Atmosphäre kultiviert. Die HeLa-Zellen wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Die transitorischen Transfektionen wurden in Mehrfachplatten mit 6 Vertiefungen gemäß der Vorgehensweise mittels Calciumphosphat, wie bereits beschrieben (42), ausgeführt. Ein rekombinantes Referenzplasmid, pCMV-βGal, welches die bakterielle β-Galactosidase exprimiert, wurde gleichzeitig mit dem Expressionsvektor des Rezeptors und dem entsprechenden Reportergen durch Transfektion eingeführt, um etwaige Variationen der Effizienz der Transfektion zu korrigieren. Der Niederschlag wurde durch Waschen nach 24 h entfernt und die Zellen wurden in DMEM ohne SVF, welches aber Hormon enthielt, gehalten. Nach weiteren 24 h wurden die Zellen gespült und 15 min mit 0,3 ml Lyse-Puffer [25 mM Tris-Phosphat, pH 7,8, 8 mM MgCl₂, 1% Triton X100, 10% Glycerol (48)] lysiert. Die entsprechende Luciferase-Aktivität wurde an einer Aliquot-Fraktion (0,1 ml) durch Auswertung des Lumineszenz-Peaks (für eine Integrationszeit von 15 s) nach Einspritzen von 0,1 ml 1 mM Luciferin in einem LKB-Luminometer bestimmt. Die β-Galactosidase wurde durch die von Bocquel et al. modifizierte Methode (49) für die Kontrolle der Effizienz von jeder Transfektion bestimmt.
3.2. Verwendete Plasmide
Die GR mit N-terminaler Deletion, ΔA/B-GR oder ΔA/B-GR51747/T), die allein die Aminosäuren 368 bis 777 exprimieren, wurden ausgehend von dem Fragment des PstI-PflMI-Verdaus des Expressionsvektors HG0 bzw. pGR(I747/T), Ligierung in die entsprechenden Stellen von HG8 (49) erhalten. Das Plasmid pGAL-GR (Geschenk von T. Lerouge) wurde aus der DNA-Bindungsdomäne des Proteins Gal4 aus der Hefe (AS 1–147) und der Hormonbindungsdomäne von GR (A500-777) gebildet; pGal-GR(I747/T) wurde durch Insertion der Mutation in pGal-GR konstruiert.
Das Reportergen pTAT-tk-Luc wurde von D. Gagne bereitgestellt und war, wie folgt, konstruiert worden: es wurde zuallererst ein intermediäres Plasmid pTAT durch Insertion des EcoRI-BamHI-Segments von 966 bp, welches aus pKT531 [großzügigerweise von T. Grande bereitgestellt (50)] stammte, in die entsprechenden Stellen des Vektors pUC19 (Pharmacia) erzeugt. Das Fragment, welches die Luciferase von Luciol kodierende Sequenz und den Thymidinkinase-Minimalpromotor (tk), welcher aus dem Herpes simplex-Virus stammt, enthielt, wurde isoliert in Form eines BamHI-Fragments ausgehend von pvit-tk-Luc (51) und strangabwärts von dem TAT-Promotor in die entsprechende Stelle von pTAT inseriert. Das Reporterplasmid pGRE-tk-Luc wurde durch Ligation des Fragments aus dem HindIII-BglII-Verdau von pGRE-tk-CAT (52), welches ein synthetisches GRE (AGAACAcagTGTTCT) strangaufwärts von dem tk-Minimalpromotor enthält, in die HindIII-BglII-Stellen von pLuc (53) konstruiert. Das Reportergen p(17M)₅-βGlob-Luc war zuvor beschrieben worden (54). Das Reporterplasmid p(17M)₅-tata-Luc war ausgehend von dem Plasmid p(17M)₅-tata-CAT (55) durch Verdau durch XhoI-BamHI und Isolierung des p(17M)₅-tata enthaltenden Fragments konstruiert worden. Dieses Fragment wurde dann in den Vektor pGL₂ (Promega), welcher durch die gleichen Restriktionsenzyme verdaut worden war, inseriert.
Der Expressionsvektor der β-Galactosidase pCMV-βGal enthält die β-Galactosidase kodierende Sequenz unter der Kontrolle des starken konstitutiven Promotors des Zytomegalievirus (CMV).
3.3. Bindungsversuch an ein Hormon
Mit pCMV-βGal und hGR vom Wildtyp oder der Mutante I747/T transfizierte Cos-7-Zellen wurden 48 h nach der Transfektion in eine salzhaltige, mit Phosphat gepufferte Lösung (STP) durch Abkratzen mit Hilfe eines Gummispatels geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit eisgekühlter STP gewaschen. Alle Schritte der Herstellung von Zytosolen wurden bei 4°C ausgeführt. Die Zellen wurden in 3 Volumen Bindungspuffer [Na-HEPES 20 mM, pH 7,3, Natriummolybdat 20 mM und EDTR 5 mM (22)] und mit Proteaseinhibitoren [Leucopeptin (5 μg/ml), Aprotinin (5 μg/ml), PMSF (40 μg/ml) und Pepstatin A (5 μg/ml)] resuspendiert und man stellte sie 15 min auf Eis. Die Zellen wurden dann durch 30–40 Kolbenhübe in einem Dounce-Glashomogenisator lysiert und das resultierende Homogenisat wurde dann bei 110000 g 30 min zentrifugiert. Der Überstand, welcher als Zytosol bezeichnet wird, wurde unverzüglich für den Bindungsversuch an ein Hormon verwendet. Die Proteinkonzentrationen wurden durch quantitative Proteinbestimmung nach Biorad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) bestimmt. Für den Bindungsversuch an ein Hormon ließ man eine Nacht bei 4°C ein Zytosol, welches 1–3 mg Proteine/ml enthielt, mit [³H]-Dex (49 Ci/mmol; Radiochemical Center, Amersham, England) oder Cortisol (67 Ci/mmol; Radiochemical Center, Amersham, England) ohne (gesamte Bindung) oder mit (nicht-spezifische Bindung) einem 100-fachen Überschuss von strahlungsinerter Verbindung (10^–5 M, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) inkubieren. Die Proben wurden dann mit 1 Volumen Kohle-Dextran (5% Kohle, 0,5% Dextran in der Bindungslösung) 15 min auf Eis unter konstanter Bewegung behandelt, dann unterwarf man sie einer 10-minütigen Zentrifugation bei 12000 g. Der gebundene [³H]-Ligand wurde in einem Aliquot-Anteil des Überstands durch Szintillationszählung gemessen. Die Dissoziationskonstante im Gleichgewicht (Kd) des Rezeptors für das Dexamethason oder das Cortisol wurde durch Scatchard-Analyse bestimmt.
Für die Analyse der kompetitiven Bindung ließ man die Zytosole mit 10 nM [³H]-Dex und unterschiedlichen Konzentrationen von kompetitiven, nicht-radioaktiven Steroiden unter den gleichen Bedingungen wie zuvor inkubieren. Nach Behandlung mit Kohle-Dextran und Szintillationszählung wurde die spezifische Bindung ausgedrückt als Prozentsatz der keiner Kompetition unterworfenen Vergleichsprobe und abhängig von der Konzentration des zur Kompetition eingesetzten Steroids aufgetragen. Kompetitive Bindungsassays in gesamten Zellen wurden an 10⁶ Zellen ausgeführt, die man 1 h bei 37°C mit 10 nM [³H]-Dex und unterschiedlichen Konzentrationen von kompetitierenden Steroiden inkubieren ließ. Nach Beschallung in 1 ml KCl-Puffer (1,5 mM EDTR, 20 mM Tris·HCl, pH 7,4, KCl 0,5 M) entfernte man das nicht gebundene Steroid durch Hinzufügung von zwei Volumen von mit Dextran überzogener Kohle in KCl-Puffer mit Gelatine (0,05% Dextran, 0,5% Kohle, 0,1% Gelatine). Man ließ die Mischung 30 min bei 4°C inkubieren und man zentrifugierte sie bei 3000 g 5 min. Die Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung in flüssigem Zustand bestimmt und sie wurde in einer Kurve wie zuvor die spezifische Bindung aufgetragen.
BEISPIEL 2: Chimäre Cre-Rekombinase, deren Aktivität durch synthetische Glucocorticoide, nicht aber durch natürliche Glucocorticoide induzierbar ist.
1. Material und Methoden
1.1. Konstruktion des Vektors pCre-LBD[Gr(I1747)T)]
Ein ClaI-XbaI-Fragment von ungefähr 1300 Basenpaaren (bp), welches die die Ligandenbindungsdomäne des humanen Rezeptors der Glucocorticoide kodierende Sequenz enthält, wurde aus dem Plasmid HG1 isoliert (siehe Beispiel 1 (40)) und dessen Enden wurden durch die T4-Polymerase aufgefüllt. Dieses Fragment wurde derart mutiert, dass die ein Isoleucin an Position 747 des Wildtyp-Rezeptors (56) kodierenden Nukleotide ATT durch die Nukleotide ACC, welche ein Threonin kodieren, ersetzt wurden. Dieses mutierte Fragment wurde in den Vektor pCre-ER (28), der durch XhoI und PstI verdaut worden ist, dessen Enden gleichfalls durch die T4-Polymerase aufgefüllt worden sind, kloniert [Plasmid pCre + GR(I747/T) + F; kodierende Sequenz der LBD von hGR(I747/T) in der gleichen Orientierung wie jene von Cre]. pCRE – LBD[GR(I747/T)] wurde erhalten durch zielgerichtete Mutagenese, ausgeführt an der einzelsträngigen DNA, die ausgehend von dem Plasmid pCre + GR(I747/T) + F hergestellt worden war, mit den Synthese-Oligonukleotiden:

– SG52 (5'-CTGGAAGATGGCGATCTCGAGATTCAGCAGGCCACT-3')
– SG53 (5'-CTGTTTCATCAAAAGGGTACCAGCCGTGGAGGGGCAT-3')

5

6

7

1.2. Mutation des Gens RXRα.
Der Vektor (pRXRα^(LNL), welcher eingesetzt wird, um das Gen RXRα (58) durch homologe Rekombination in F9-Zellen zu mutieren, wurde auf die folgende Weise konstruiert:
Ein λ-Phage, welcher ein genomisches Fragment von 11,8 kb, umfassend die Exons 2, 3 und 4 von RXRα, enthielt, wurde ausgehend von einer genomischen Bank, welche mit genomischer DNA aus dem Mäuse-Embryokarzinom P19, kloniert in den Vektor λ EMBL3, hergestellt worden war, isoliert. Ein isoliertes SalI-Fragment dieses Phagen (dessen Enden durch die T4-Polymerase aufgefüllt worden waren) wurde in die Bam-HI-Stelle (nach Behandlung mit der T4-Polymerase) eines Derivats des Vektors pBluescriptIISK+ (Stratagene) subkloniert. In diesem Derivat war die XhoI-Stelle supprimiert worden. Eine XhoI-Stelle war in das Exon 4 von RXRα auf der Höhe der AccI-Stelle, entsprechend dem Nukleotid 535 der cDNA von RXRα (die Sequenz der cDNA von RXRα ist in Genbank mit der Referenz: M 84817 angegeben), eingeführt worden, indem in die AccI-Stelle die folgenden synthetischen Oligonukleotide kloniert wurden:

– 5'-ATTATTATTACTCGAGTGATGATG-3' und
– 5'-ATCATCATCATCCGAGTAATAATA-3'.

Schließlich wurde das XhoI-Fragment, enthaltend die Expressionskassette des Neomycinresistenzgens umgeben von loxP-Stellen, welche aus dem Vektor pHR56 (28) isoliert worden war, in die XhoI-Stelle des vorangegangenen Vektors kloniert.
Die Mutation eines Allels des RXRα-Gens in F9-Zellen wurde durch homologe Rekombination mit Hilfe des Vektors pRXRα(LNL) (28) ausgeführt. Diese Linie wird als RXRα^+/–(LNL) bezeichnet.
1.3. Expression von Cre-LBD[GR(I747/T)] in Zellen, welche ein modifiziertes DNA-Fragment umfassen: RXRα^(LNL)

– Transitorische Transfektion: 5 × 10⁶ RXRα^+/–(LNL)-Zellen oder HeLa-Zellen, die in 500 μl PBS resuspendiert worden waren, wurden mit 5 μg Plasmid pCre-LBD[GR(I747/T)] (gegebenenfalls cotransfiziert mit 5 μg des Vektors pRXRα^(LNL) für die HeLa-Zellen] mit Hilfe eines Elektroporationsgeräts (Bio-Rad „gene pulser"), welcher auf 200 V und 960 μF eingeregelt worden war, einer Elektroporation unterzogen. Die Zellen wur den dann zu 10 Zellen pro Vertiefung von 100 mm ausgesät und, sofern erforderlich, mit Liganden behandelt.
– Stabile Transfektion: 5 × 10⁶ RXRα^+/–(LNL)-Zellen, die in 500 μl PBS resuspendiert worden waren, wurden mit 5 μg pCre-LBD[GR(I747/T)] und 1 μg pPGK-Hyg (59), verdaut durch SalI bzw. PvuII, mit Hilfe eines Elektroporationsgeräts (Bio-Rad „gene pulser"), welcher auf 200 V und 960 μF eingeregelt worden war, einer Elektroporation unterzogen. Die resistenten Klone wurden gemäß der von Metzger et al. (28) beschriebenen Vorgehensweise erhalten.

1.4. „PCR"-Amplifizierung einer Region von genomischer DNA, welche in dem Exon 4 von RXRα lokalisiert ist.
Die DNA-Amplifizierungen erfolgten unter Verwendung der „Polymerase Chain Reaction" (PCR; Polymerasekettenreaktion)-Technik gemäß dem von Chen und Evans (60) beschriebenen Protokoll. Die verwendeten Primer sind: SB211 und PZ105, die als Nukleotidsequenz 5'-GGCAAACACTATGG-3' bzw. 5'-TTGCGTACTGTCCTCTT-3' aufweisen. Nach Denaturierung während 8 min bei 94°C werden 2,5 Einheiten Taq-Polymerase zugesetzt. Die Amplifizierung erfolgt unter Ausführung von 35 Zyklen (30 s bei 94°C, 30 s bei 50°C), gefolgt von einem Zyklus (30 s bei 94°C, 30 s bei 50°C, 5 min bei 72°C), dessen Produkt bei 4°C aufbewahrt wird.
Die Reaktionsprodukte werden auf einem Polyacrylamidgel (10%) oder Agarosegel (2,5%) aufgetrennt. Die DNA wird durch UV nach einer Anfärbung mit Ethidiumbromid oder durch Southern-Blot (42) sichtbar gemacht.
1.5. Exzisionstest der zwischen den LoxP-Stellen gelegenen Sequenzen
Die DNA von RXRα^+/–(LNL)-Zellen, die mit pCre-LBD[GR(I747/T)] oder dem Ausgangsvektor pSG5 transfiziert worden waren, die mit Cortisol (10^–6 M) oder Dexamethason (10^–6 M) 72 h behandelt oder nicht behandelt worden waren, wurde einer PCR-Reaktion gemäß der in 8 beschriebenen Strategie unterworfen. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem Acrylamidgel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Bahn M auf der 9 entspricht der Auftragung des durch HinfI verdauten pBR322-Größenmarkers. Die Position der Wildtyp-Allele und des rekombinierten Allels ist angegeben.
1.6. PCR-Analyse der Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] in der Linie RXRα^+/–(LNL), welche das chimäre Protein auf konstitutive Weise exprimiert.
Für die 10 diente die ausgehend von RXRα^+/–(LNL):Cre-GR(I747/T)-Zellen, die mit Cortisol (10^–6 M) oder Dexamethason (10^–6 M) 72 h behandelt oder nicht behandelt worden waren, hergestellte DNR als Matrize, um eine PCR-Amplifizierung gemäß der in 8 beschriebenen Vorgehensweise auszuführen. Die amplifizierte DNA wurde auf einem Acrylamidgel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Bahnen 1, 2, 3 und 4 enthalten die PCR-Produkte, die mit dem DNA-Extrakt von Wildtyp-F9-Zellen (WT), RXRα^+/–(LNL)-, RXRα^+/–(L)- bzw. C2RXRα^{–(L)/–(L)}-Zellen (73) hergestellt worden sind. Die Bahn 8 enthält einen Größenmarker (1 kb-Leiter; Gibco BRL).
In der 11 diente die ausgehend von RXRα^+/–(LNL):Cre-GR(I747/T)-Zellen, die mit Aldosteron, Cortisol, Corticosteron, Dexamethason, Triamcinolonacetonid oder RU486 in Konzentrationen, die von 10^–9 M bis 10^–6 M gingen, behandelt oder nicht behandelt worden waren, hergestellte DNA als Matrize, um eine PCR-Amplifizierung gemäß der in 8 beschriebenen Vorgehensweise auszuführen. Die amplifizierte DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt und gemäß der Southern-Technik analysiert. Die amplifizierten Fragmente, welche den Wildtyp-Allelen und dem rekombinierten Allel entsprachen, wurden durch Hybridisierung mit Hilfe des Synthese-Oligonukleotids (5'-AAGAAGCCCTTGCAGCCCTC-3'), welches am 5'-Ende durch T4-Polynukleotidkinase radioaktiv markiert worden war, detektiert. Das Signal wurde sichtbar gemacht und quantifiziert mit Hilfe eines „Phospho-Imager" (Fujix bas2000).
Für die 12 wurden RXRα^+/–(LNL):Cre-GR(I747/T)-Zellen 72 h in einem Kulturmedium kultiviert, zu welchem drei natürliche Liganden (Aldosteron, Cortisol und Corticosteron) in einer Konzentration von 10^–9 M oder 10^–8 M und Dexamethason (10^–7 oder 10^–6 M), wie angegeben, hinzugesetzt worden waren. Das rekombinierte Allel wurde gemäß der in 8 beschriebenen Vorgehensweise detektiert. Die amplifizierte DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt und gemäß der Southern-Technik analysiert. Die amplifizierten Fragmente, die dem rekombinierten Allel entsprechen, wurden durch Autoradiographie nach einer Hybridisierung mit dem Synthese-Oligonukleotid, 5'-AATTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTC-3' (welches eine loxP-Stelle enthält), welches am 5'-Ende durch die T4-Polynukleotidkinase mit ³²Phosphor radioaktiv markiert worden war, detektiert.
Für die 13 wurden HeLa-Zellen durch die Plasmide RXRα^+/–(LNL) und pCre-LBD[GR(I747/T)] cotransfiziert, dann 72 h mit oder ohne Hinzufügung der angegebenen Liganden in der Konzentration von 10^–7 M kultiviert. Die DNA dieser Zellen wurde dann einer PCR-Amplifizierung gemäß der beschriebenen Strategie unterworfen. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem Acrylamidgel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Bahn 1 entspricht der Auftragung des „1 kb-Ladder"-Größenmarkers (1 kb-Leiter, GibcoBRL).
2. Ergebnisse
Um eine Cre-Rekombinase zu exprimieren, deren Aktivität durch synthetische Liganden des Rezeptors der Glucocorticoide, aber nicht durch natürliche Glucocorticoid-Liganden bei „physiologischen" Konzentrationen induzierbar ist, wurde ein Expressionsvektor, pCre-LBD[GR(I747/T)], konstruiert, welcher von dem Vektor pCre-ER (28) abgeleitet ist, indem die DNA-Sequenz, welche die Aminosäuren 344–618, enthaltend die LBD des Rezeptors der Östrogene (RE), kodiert, durch jene, welche die Aminosäuren 500–777 eines mutierten Rezeptors der Glucocorticoide (GR), welcher die mutierte Bindungsdomäne (LBD) von GR(I747/T) enthält, kodiert, ersetzt wird. Die Konstruktion dieses Plasmids führte zu der Insertion der Sequenz GGTACC, welche die Aminosäuren Gly-Thr kodiert, an Position 624–625 von Cre-LBD[GR(I747/T)] (7).
Die Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] wurde in einer RXRα^+/–(LNL)-Mäusezelllinie getestet. Diese Linie wurde erhalten, indem durch homologe Rekombination das TK-neo-Gen, welches von loxP-Stellen (in direkter Wiederholung) (LNL) eingerahmt wird, in Exon 4 eines Allels des RXRα-Gens (28) integriert wird. Das TK-neo-Gen ist ein chimäres Gen, welches die Expression eines Thymidinkinase/Neomycinresistenzgen-Fusinosproteins erlaubt. Die Elektroporation dieser Linie mit dem Vektor pCre-LBD[GR(I747/T)] hat erlaubt, dessen Rekombinase-Aktivität ohne Hinzufügung von Ligand oder nach Zugabe von Cortisol (natürlicher Ligand) oder von Dexamethason auszuwerten (9) (Dex; synthetischer Ligand). Die DNA der so behandelten Zellen wird tatsächlich einer PCR mit synthetischen Oligonukleotiden, die in Exon 4 lokalisiert sind, einem strangaufwärts von der AccI-Stelle, einem anderen strangabwärts von dieser Stelle, unterworfen. Die Größe der mit diesem Paar von Oligonukleotiden erhaltenen PCR-Fragmente beträgt 65 bp für das Wildtyp-Allel, 3345 bp für das mutierte Allel (nach Integration von LNL) und 191 bp für das rekombinierte Allel (nach Exzision der zwischen den beiden lox-Stellen gelegenen Sequenzen und einer der lox-Stellen, siehe 8). Nach einer Behandlung der transfizierten Zellen mit Dexamethason (10^–6 M) wird ein Fragment von 191 bp beobachtet, welches die Anwesenheit von Sequenzen, die dem rekombinierten Allel entsprechen, reflektiert, wohingegen in Abwesenheit einer Behandlung oder nach einer Behandlung mit Cortisol (10^–6 M) keinerlei Fragment dieser Größe beobachtet wird. Diese Ergebnisse zeigen folglich, dass die Rekombinase-Aktivität des untersuchten Fusionsproteins induziert werden kann, indem Zellen, die dieses Protein exprimieren, mit einem synthetischen Ligand des GR, wie Dexamethason, nicht aber mit einem natürlichen Ligand, wie Cortisol, in einer Konzentration von 10^–6 M behandelt werden.
Es wurde gleichfalls eine RXRα^+/–(LNL)-Linie etabliert, welche konstitutiv Cre-LBD[GR(I747/T)] exprimiert, indem die Expressionskassette des Cre-LBD[GR(I747/T)]-Gens mit einem Vektor, welcher das Hygromycinresistenzgen exprimiert, cointegriert wird (RXRα^+/–(LNL):Cre-GR(I747/T); siehe „Material und Methoden"; Daten nicht gezeigt). Die Rekombinase-Aktivität wurde nach einer Behandlung dieser Zellen mit Dex (10^–6 M) während 72 h getestet. Die Analyse der PCR-Produkte, ausgeführt an der DNA dieser Zellen, enthüllt ein Fragment von 191 bp, welches dem rekombinierten Allel entspricht, einzig nach Behandlung mit Dex ( 10).
So wird gezeigt, dass Cre-LBD[GR(I747/T)] ohne Hinzufügung von Ligand oder in Gegenwart von Cortisol in einer Konzentration von 10^–6 M inaktiv, aber in Gegenwart von Dex aktiv ist, wenn seine Expressionskassette in das Genom integriert wird.
Es wurde gleichfalls die Wirkungskinetik der Rekombinase ausgewertet: ihre Aktivität ist nach 12 h Behandlung mit Dexamethason in einer Konzentration von 10^–6 M nachweisbar, sie ist aber nach 72 h Behandlung viel stärker (Ergebnisse nicht gezeigt).
Die Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] wurde auch nach der Hinzufügung von unterschiedlichen Konzentrationen von Liganden getestet. In den mit Aldosteron, mit Cortisol oder mit Corticosteron (wobei die Konzentration der Liganden von 10^–9 bis 10^–6 M ging) behandelten RXRα^+/–(LNL):Cre-GR(I747/T)-Zellen konnte keinerlei Rekombinase-Aktivität beobachtet werden, wohingegen in Gegenwart von Dex, von Triamcinolonacetonid oder von RU486 eine Rekombinase-Aktivität ab 10^–9 M beobachtet wird (11).
Es wurde gleichfalls mit Hilfe dieser Zelllinie gezeigt, dass die Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] durch synthetische Liganden induziert werden kann, sogar wenn die Zellen in Gegenwart von natürlichen Liganden (Aldosteron, Cortisol und Corticosteron) in einer Konzentration von 10^–9 oder 10^–8 M kultiviert werden. Die Exzision der zwischen den loxP-Stellen gelegenen Sequenzen wird nach einer 72-stündigen Behandlung mit Dexamethason in einer Konzentration von 10^–7 M oder 10^–6 M erhalten (12).
Die Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] wurde schließlich in humanen Zellen getestet: HeLa-Zellen wurden transitorisch mit den Vektoren pCre-LBD[GR(I747/T)] und pRXRα^(LNL) cotransfiziert, dann entweder ohne Hinzufügung von Ligand oder in Gegenwart der in der 13 angegebenen Liganden kultiviert. Wie bei den F9-Zellen wird eine Bande von 191 bp, welche dem rekombinierten Fragment entspricht, ausgehend von DNA, welche aus den mit synthetischen Liganden (Dexamethason, Triamcinolonacetonid oder RU486 in einer Konzentration von 10^–7 M) behandelten Zellen isoliert wird, amplifiziert, wohingegen ohne Hinzufügung von Ligand oder in Gegenwart von natürlichen Liganden, wie Aldosteron, Corticosteron oder Cortisol in den gleichen Konzentrationen nur das dem Wildtyp-Allel entsprechende Fragment detektiert werden kann.
Diese Ergebnisse zeigen folglich, dass die Rekombinase-Aktivität des Fusionsproteins Cre-LBD[GR(I747/T)] durch synthetische Liganden des Rezeptors der Glucocorticoide induziert wird, wohingegen sie gegenüber den natürlichen Liganden, wie Cortisol, Corticosteron oder Aldosteron, sogar bei so hohen Konzentrationen wie 10^–6 M unempfindlich ist. Außerdem behindert die Anwesenheit von natürlichen Liganden nicht die Induktion der Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] durch die synthetischen Liganden.
BEISPIEL 3: Induktion der Aktivität einer chimären Cre-Rekombinase bei der Maus
1. Material und Methoden
1.1. Konstruktion von Plasmiden und Etablierung von transgenen Mäusen
Der Vektor pCMVCre-LBD[GR(I747/T)] wurde konstruiert, indem das EcoRI-Fragment von 2 kb, welches aus pCre-LBD[GR(I747/T)] isoliert wird, in die EcoRI-Stelle von pMGSVl (60) kloniert wird. Das PvuII-Fragment von 4,64 kb, welches aus pCMVCre-LBD[GR(I747/T)] isoliert wird, wurde in F1-Zygote (C57BL/6 × SJL) in einer Konzentration von 4 ng/μl injiziert, um transgene Mäuse gemäß der klassischen Vorgehensweise (61) zu erzeugen.
1.2. PCR-Bedingungen
Die Amplifizierungen durch PCR wurden ausgeführt in einer Pufferlösung, welche 10 mM Tris-HCl (pH = 8,8), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 0,25 μM von jedem Primer, 2 Einheiten Taq-Polymerase und 1 μg genomische DNA als Matrize enthielt. Nach 30 Zyklen (30 s bei 94°C, 30 s bei 55°C, 1 min bei 72°C), dann 1 Zyklus (30 s bei 90°C, 30 s bei 55°C, 5 min bei 72°C) wurden die Amplifizierungsprodukte auf einem 2,2%-igen Agarosegel, welches mit Ethidiumbromid angefärbt wurde, aufgetrennt.
1.3. Analyse des Genotyps der Mäuse
Das Transgen Cre-LBD[GR(I747/T)] und die Allele vom Wildtyp und das Exzisions-Allel RXRα^ΔAF2(LNL) wurden durch PCR detektiert. Die Detektion des Transgens Cre-LBD[GR(I747/T)] erfolgte mit Hilfe der Nukleotidprimer 5'-ATCCGAAAAGAAAACGTTGA-3' und 5'-ATCCAGGTTACGGATATAGT-3', jene der Allele des Gens RXRα dank der Primer 5'-GGTTCTCCGGCCGCTTGGGT-3' und 5'-GAAGGCGATGCGCTGCGAAT-3'. Auf die gleiche Weise wurde die Exzision des von loxP-Stellen eingerahmten tk-neo-Markers durch PCR mit Hilfe der Primer A (5'-CAAGGAGCCTCCTTTCTCTA-3') und B (5'- CCTGCTCTACCTGGTGACTT-3') verfolgt. Diese Primer amplifizieren ein DNA-Fragment von 156 Basenpaaren ausgehend von dem Allel vom Wildtyp und ein Fragment von 190 Basenpaaren ausgehend von dem Exzisions-Allel RXRα^ΔAF2(L).
2. Ergebnisse
Die Rekombinase-Aktivität von Cre-LBD[GR(I747/T)] wurde gleichfalls bei der Maus getestet. So wurden transgene Mäuse, die das Fusionsprotein Cre-LBD[GR(I747/T)] unter der Kontrolle des Promotors des „major IE"-Gens des humanen Zytomegalievirus exprimierten, etabliert. Die Struktur des Transgens ist in der 14a gezeigt. Es enthält die Aktivator/Promotor-Sequenzen des „major IE"-Gens des humanen Zytomegalievirus, ein Intron des Gens des β-Globins vom Kaninchen, die kodierenden Sequenzen von Cre-LBD[GR(I747/T)] und das Polyadenylierungssignal des Simian Virus SV40. Die Transkriptionsstartstelle ist durch einen Pfeil angegeben. Diese Mäuse wurden dann mit „Reporter"-Mäusen gekreuzt, um darin die Existenz einer induzierten Rekombinase-Aktivität zu zeigen. Diese „Reporter"-Linie enthält eine Insertion des Selektionsmarkers tk-neo, eingerahmt von loxP-Stellen, in dem zwischen den Exons 8 und 9 des RXRα-Gens gelegenen Intron auf einem von deren beiden [RXRα^ΔAF2(LNL)]-Allelen. Nach Rekombination des tk-neo-Markers bleibt eine loxP-Stelle an Ort und Stelle zurück und bildet das Exzisions-Allel RXRα^ΔAF2(L). Das RXRα-Allel vom Wildtyp und das Exzisions-Allel können gleichzeitig durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines geeigneten Primerpaars A und B detektiert werden. Die 14b zeigt schematisch diese PCR-Strategie durch Angabe der Primer A und B wie auch von bestimmten Restriktionsstellen.
Die aus der Kreuzung von Cre-LBD[GR(I747/T)]-Mäusen und „Reporter"-Mäusen, die oben beschrieben worden sind, hervorgehenden Abkömmlinge, welche zugleich das Cre-LBD[GR(I747/T)]-Transgen und das [RXRα^ΔAF2(LNL)]-Allel enthalten, wurden identifiziert, indem ihr Genotyp ausgehend von einer Schwanz-Biopsie ermittelt wurde. Eine von diesen Mäusen unterzog sich im Alter von vier Wochen einer täglichen intraperitonealen Injektion von 0,3 mg Dexamethason, verdünnt in 100 μl Pflanzenöl, während fünf Tagen. Eine Schwanz-Biopsie wurde am Tag vor der ersten Injektion sowie an dem der fünften Injektion folgenden Tag entnommen. Die ausge hend von diesen Probennahmen isolierte DNA wurde durch PCR mit Hilfe der Oligonukleotide A und B (15, Bahnen 2 und 3) analysiert, um zu bestimmen, ob die Behandlung die Deletion des tk-neo-Markers induziert. Die Bahn 1 entspricht einer Kontrollreaktion, welche ohne DNA ausgeführt wurde. Die Position der ausgehend von dem RXRα-Allel vom Wildtyp und dem Exzisions-Allel RXRα^ΔAF2(L) amplifizierten PCR-Produkte ist angegeben. Der Größenmarker (Bahn 4) entspricht der 1 kb-Leiter (GibcoBRL). Die Größe der Fragmente ist in Basenpaaren angegeben. Nach der 15 hat die induzierte Exzision nach Behandlung der getesteten Maus mit Dexamethason sehr wohl stattgefunden. Tatsächlich enthüllt die Analyse der aus dem Schwanz vor der Behandlung amplifizierten DNA-Fragmente lediglich das Vorhandensein des RXRα-Allels vom Wildtyp, wohingegen die Analyse des Schwanzes derselben Maus nach der Behandlung das Vorhandensein des Exzisions-Allels RXRα^ΔAF2(LNL) anzeigt (15). So erweist sich, dass die chimäre Rekombinase Cre-LBD[GR(I747/T)] keinerlei konstitutive Basisaktivität in Gegenwart der endogenen Liganden aufweist. Sie wird indessen bei der Maus induziert und aktiviert durch eine Behandlung mit Dexamethason.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Fragment, welches einen nukleären Rezeptor der Glucocorticoide vom Wildtyp mit einer Isoleucin→Threonin-Mutation, welche sich zwischen den Helices H11 und H12 der Aminosäuresequenz des humanen Rezeptors vom Wildtyp befindet, kodiert derart, dass die Aktivität des Rezeptors durch einen synthetischen Glucocorticoid-Liganden stärker induzierbar ist als durch einen natürlichen Glucocorticoid-Liganden.
DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Sequenz eine Sequenz aufweist, die den humanen nukleären Rezeptor der Glucocorticoide, dessen Aminosäuresequenz im Wesentlichen diejenige ist, die in der IDS Nr. 1 angegeben ist, kodiert.
DNA-Fragment nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als Sequenz die cDNR-Sequenz des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, die im Wesentlichen diejenige ist, die in der IDS Nr. 1 angegeben ist, aufweist.
DNA-Fragment, welches die Ligandenbindungsdomäne (LBD) des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide vom Wildtyp mit einer Isoleucin→Threonin-Mutation an einer Position, welche der Position 747 der Aminosäuresequenz des vollständigen Rezeptors entspricht, kodiert.
DNA-Fragment, welches die Ligandenbindungsdomäne des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide kodiert, nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es als Sequenz eine Sequenz aufweist, die die Aminosäuren der Ligandenbindungsdomäne des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, deren Aminosäuresequenz im Wesentlichen diejenige ist, die in der IDS Nr. 1 von Aminosäure 532 bis Aminosäure 777 angegeben ist, kodiert.
DNA-Fragment nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es als Sequenz die Sequenz aufweist, die die Ligandenbindungsdomäne (LBD) des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, die im Wesentlichen diejenige ist, die in der IDS Nr. 1 von Codon 532 bis Codon 777 angegeben ist, kodiert.
Modifizierter nukleärer Rezeptor der Glucocorticoide, wobei der modifizierte Rezeptor als Sequenz die Aminosäuresequenz des humanen Wildtyp-Rezeptors mit einer Isoleucin→Threonin-Mutation, welche sich zwischen den Helices H11 und H12 befindet, derart, dass die Aktivität des Rezeptors durch einen synthetischen Glucocorticoid-Liganden stärker induzierbar ist als durch einen natürlichen Glucocorticoid-Liganden, aufweist.
Nukleärer Rezeptor der Glucocorticoide nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er als Aminosäuresequenz eine Sequenz, die im Wesentlichen diejenige ist, die in der IDS Nr. 1 angegeben ist, aufweist.
Ligandenbindungsdomäne des nukleären Rezeptors der Glucocorticoide nach Anspruch 7 oder 8.
Ligandenbindungsdomäne des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide LBD [GR(I747/T)], dadurch gekennzeichnet, dass sie als Sequenz die Aminosäuresequenz der Ligandenbindungsdomäne des humanen Rezeptors der Glucocorticoide, die im Wesentlichen diejenige ist, die in der IDS Nr. 1 von Aminosäure 532 bis Aminosäure 777 angegeben ist, aufweist.
Vektorsystem zur konditionalen Expression eines Proteins, insbesondere eines fremden Proteins in Wirtszellen, umfassend ein Transkriptionskontrollelement, welches durch einen Komplex, welcher durch einen nukleären Rezeptor der Glucocorticoide und einen Liganden gebildet wird, induzierbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – ein erstes DNA-Fragment, welches aus einem DNA-Fragment besteht, welches das Protein kodiert, unter der Kontrolle von Elementen, die dessen Expression in den Wirtszellen sicherstellen, wobei die Elemente, die dessen Expression sicherstellen, eine Transkriptionskontrollsequenz (RE), welche durch den Rezeptor nach Anspruch 7 oder 8, welcher mit einem synthetischen Glucocorticoid-Liganden komplexiert ist, induzierbar ist, umfassen, und – ein zweites DNA-Fragment, welches aus einem funktionsfähigen, den Rezeptor kodierenden DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder nur einem Teil des Fragments, umfassend die Region, die den Liganden erkennt (LBD), nach einem der Ansprüche 4 bis 6 und der DNA-Bindungsregion (DBD), die an die Transkriptionskontrollsequenz (RE) bindet, besteht, – wobei das erste und das zweite DNA-Fragment sich auf ein und demselben Vektor oder getrennt auf zwei Vektoren befinden können.
Vektorsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es die cDNA umfasst, welche kodiert für: – die LBD-Region, welche durch Codons angegeben wird, welche die Aminosäuren Nr. 532 bis 777 in der IDS Nr. 1 kodieren, und – die DBD-Region, welche durch Codons angegeben wird, welche die Aminosäuren Nr. 421 bis 487 in der IDS Nr. 1 kodieren.
Vektorsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die die DNA-Bindungsdomäne (DBD) des Rezeptors der Glucocorticoide kodierende Sequenz durch jene eines anderen Transaktivators, insbesondere jene des Hefe-Proteins Gal4, ersetzt und man die Transkriptionskontrollsequenz (RE) des Rezeptors der Glucocorticoide durch jene, die durch den anderen Transaktivator erkannt wird, insbesondere die Sequenz 17m, die durch den Transaktivator Gal 4 erkannt wird, ersetzt.
Verfahren zur Expression eines fremden Proteins in humanen oder tierischen Zellen, insbesondere von Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen, die ein Vektorsystem nach einem der Ansprüche 11 bis 13 enthalten, kultiviert und dass man den synthetischen Liganden in das Kulturmedium hinzusetzt und man dann das synthetisierte Protein gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der synthetische Ligand aus Dexamethason, Triamcinolon-acetonid, RU28362, Bimetrazol, Deacylcortivazol und Fluocinolon-acetonid ausgewählt wird.
Fusioniertes Gen, umfassend ein DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und ein DNA-Fragment, welches ein Protein kodiert, dessen Aktivität man zu regulieren wünscht, wobei die Aktivität stär ker induzierbar ist durch Bindung eines synthetischen Glucocorticoid-Liganden als eines natürliche Glucocorticoid-Liganden an den Rezeptor oder die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors, wenn das Protein sich an den Rezeptor oder die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors fusioniert befindet.
Fusioniertes Gen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Rekombinase-Protein ist.
Fusioniertes Gen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein eine Rekombinase aus der Familie der λ-Integrasen ist.
Fusioniertes Gen nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Rekombinase-Protein die Rekombinase Cre des Bakteriophagen P1 ist.
Fusioniertes Gen nach Anspruch 19, umfassend ein DNA-Fragment, welches das Rekombinase-Protein Cre des Bakteriophagen P1 kodiert, und das DNA-Fragment, welches die Ligandenbindungsdomäne des modifizierten humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
Fusioniertes Gen nach Anspruch 20, umfassend in der 5'→3'-Richtung: – ein DNA-Fragment, welches die Rekombinase Cre des Bakteriophagen P1 kodiert; – ein DNA-Fragment, welches die Gesamtheit oder einen Teil der Gelenkregion D des nukleären Rezeptors der Glucocorticoide, einer Region, die sich zwischen der DBD-Domäne und der LBD-Domäne befindet, kodiert, und – das DNA-Fragment, welches die modifizierte, insbesondere mutierte Ligandenbindungsdomäne (LBD) des nukleären Rezeptors der Glucocorticoide nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
Fusioniertes Gen nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es als Sequenz eine Sequenz aufweist, die die Aminosäuren der IDS Nr. 2 kodiert, umfassend: – die Aminosäuren 1 bis 343, die der Rekombinase Cre entsprechen; – die Aminosäuren 346 bis 377, die der C-terminalen Region der Region D des humanen Rezeptors der Glucocorticoide entsprechen; – die Aminosäuren 378 bis 623, die der LBD [GR(I747/T)] entsprechen.
Fusioniertes Gen nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen die Sequenz Cre-LBD[GR(I747/T)], wie sie in der IDS Nr. 2 angegeben ist, deren Aminosäuren 626 bis 667 der Region F des humanen Rezeptors der Östrogene entsprechen, aufweist.
Vektor für die Expression des Fusionsproteins, welches durch das fusionierte Gen nach einem der Ansprüche 16 bis 23 kodiert wird, in tierischen, insbesondere von Säugetieren stammenden Wirtszellen, dadurch gekennzeichnet, dass er das fusionierte Gen nach einem der Ansprüche 16 bis 23, welches unter die Kontrolle von Expressionselementen, welche dessen Expression in den Wirtszellen sicherstellen, gestellt ist, umfasst.
Fusionsprotein, umfassend einen Rezeptor nach Anspruch 7 oder 8 oder eine Ligandenbindungsdomäne nach Anspruch 9 oder 10 und ein Protein, dessen Aktivität stärker induzierbar ist durch Bindung eines synthetischen Glucocorticoid-Liganden als eines natürlichen Glucocorticoid-Liganden an den Rezeptor oder die Ligandenbindungsdomäne (LBD).
Fusionsprotein nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Rekombinase-Protein ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Rekombinase-Protein aus der Familie der λ-Integrasen ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekombinase das Protein Cre des Bakteriophagen P1 ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 28, welches außerdem den C-terminalen Teil der Gelenkregion D des humanen nukleären Rezeptors der Glucocorticoide zwischengeschaltet zwischen das Protein Cre und die Ligandenbindungsdomäne des modifizierten Rezeptors nach Anspruch 9 oder 10 umfasst.
Verfahren zur konditionalen Rekombination, insbesondere Exzision, Insertion, Inversion oder Translokation auf der Höhe eines DNA-Fragments, welches ein oder zwei spezifische Erkennungsstellen für ein Rekombinase-Protein in tierischen Wirtszellen enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, in welchen: 1) man ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 26 bis 29 oder einen Expressionsvektor des Fusionsproteins nach Anspruch 24 in die Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 26 bis 29 erlauben, einführt und 2) man das Fusionsprotein mit einem synthetischen Glucocorticoid-Liganden komplexiert, indem man den Liganden in Gegenwart der Wirtszellen bringt.
Verfahren zur konditionalen Deletion eines DNA-Fragments in einem Gen, in welchem man ein Exzisionsverfahren nach Anspruch 30 ausführt und in welchem das herauszuschneidende DNA-Fragment zwischen zwei Erkennungsstellen für ein Rekombinase-Protein, die in direkter Wiederholung orientiert sind, integriert ist.
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Erkennungsstellen für ein Rekombinase-Protein die loxP-Stellen sind und das Rekombinase-Protein das Protein Cre des Bakteriophagen P1 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment, das man herauszuschneiden wünscht, und die spezifischen Erkennungsstellen für ein Rekombinase-Protein sich auf einem Plasmid-Vektor oder viralen Vektor befinden oder in ein Chromosom der Wirtszellen integriert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Integration der spezifischen Erkennungsstellen für das Rekombinase-Protein, insbesondere der loxP-Stelle(n), erfolgt durch homologe Rekombination des Gens, welches das zu inserierende oder zu translozierende bzw. herauszuschneidende oder zu invertierende DNA-Fragment umfasst, mit einem modifizierten Gen, welches das DNA-Fragment, welches 5' und/oder 3' von der oder den Rekombinase- Erkennungsstelle(n), insbesondere der oder den loxP-Stelle(n) flankiert wird, umfasst.
Vektor für den Transfer eines DNA-Fragments in humane oder tierische Wirtszellen, insbesondere Säugetier-Wirtszellen, dadurch gekennzeichnet, dass er ein zu transferierendes DNA-Fragment, welches spezifische Erkennungsstellen für die Rekombinase, insbesondere zwei loxP-Stellen, die in direkter Wiederholung orientiert sind, umfasst, und eine Expressionskassette eines fusionierten Gens nach einem der Ansprüche 16 bis 23 umfasst.
Vektor nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass das fusionierte Gen unter die Kontrolle von spezifischen Expressionselementen der Wirtszellen gestellt ist.
Vektor nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass er die Sequenz des Plasmids pCre-LBD[GR(I747/T)] der IDS Nr. 3 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass das herauszuschneidende DNA-Fragment transferiert, insbesondere in das Chromosom der Zellen integriert worden ist mit Hilfe eines Transfervektors nach Anspruch 35.
Vektor nach Anspruch 24 oder 35 für eine Verwendung als Arzneimittel bei einer Gentherapie in Kombination mit einem synthetischen Glucocorticoid-Liganden, insbesondere Dexamethason.
Humane oder tierische Zelle in vitro, insbesondere Säugetierzelle, welche durch einen Vektor zur Expression eines Fusionsproteins nach Anspruch 24 transfiziert ist.
Humane oder tierische Zelle in vitro, in welche ein DNA-Fragment mit Hilfe eines Vektors nach Anspruch 35 oder 36 transferiert worden ist.
Tierische Zelle in vitro, insbesondere Säugetierzelle, welche konstitutiv das Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 25 bis 29 exprimiert.
Transgenes Tier mit Ausnahme des Menschen, insbesondere Maus, welche(s) ein funktionsfähiges Gen des Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 25 bis 29, welches insbesondere in eines von dessen bzw. deren Chromosomen integriert ist, umfasst.
Transgenes Tier nach Anspruch 43, in welchem ein Gen von Interesse durch Insertion von einer oder mehreren loxP-Stelle(n), die insbesondere in ein oder mehrere von dessen Chromosomen integriert ist bzw. sind, modifiziert ist.
Verwendung eines Vektors, von Zellen oder eines Tiers mit Ausnahme des Menschen nach einem der Ansprüche 42 bis 44 als Tool zur Analyse oder Untersuchung der Funktion oder Funktionsweise eines gegebenen Gens einer Wirtszelle.
Verfahren zur Behandlung von Zellen ex vivo oder in vitro, welches das Ausführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 30 bis 34 oder 38 und die Verwendung eines Vektors nach Anspruch 39 umfasst.