DE102018002269B4

DE102018002269B4 - Screeningverfahren für biostimulanzien

Info

Publication number: DE102018002269B4
Application number: DE102018002269.3A
Authority: DE
Inventors: auf Antrag nicht genannt. Erfinder
Original assignee: Bex Biotec & Co KG GmbH; Bex-Biotec & Co KG GmbH
Current assignee: Bex Biotec & Co KG GmbH; Bex-Biotec & Co KG GmbH
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2018-03-20
Publication date: 2024-03-07
Anticipated expiration: 2038-03-21
Also published as: DE102018002269A1; WO2019179656A1

Abstract

Ein Verfahren zur Bewertung, ob eine Substanz ein Biostimulans ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:a) Bereitstellen mindestens zweier Sämlinge oder Pflanzen derselben Spezies und desselben Alters,b1) Inkubieren mindestens eines der Sämlinge oder Pflanzen, die in Schritt a) bereitgestellt wurden, mit einem Kandidaten-Biostimulans über mindestens 1 Stunde,b2) In-Kontakt-Bringen des mindestens einen Sämlings oder der mindestens einen Pflanze nach Schritt b1) mit 8-Amino-5-chlor-7-phenylpyrido-[3,4-d]pyridazin-1,4(2H,3H)dion (L012) und mit einem Auslöser, der die Produktion einer reaktiven Sauerstoffspezies in dem Sämling oder der Pflanze auslöst, um so mindestens eine Probe zu erhalten, wobei der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze mit dem L012 und dem Auslöser gleichzeitig oder versetzt in Kontakt gebracht werden kann,c) Behandeln mindestens eines anderen der mindestens zwei Sämlinge oder Pflanzen, die in Schritt a) bereitgestellt wurden, wie in den Schritten b1) und b2), außer dass in Schritt b1) kein Kandidaten-Biostimulans hinzugefügt wird, um so mindestens eine Referenz zu erhalten,d) Überwachen des oxidativen Ausbruchs der mindestens einen Probe und der mindestens einen Referenz, induziert durch den Auslöser, über ein Zeitintervall von mindestens einer Minute durch Messen der Chemolumineszenz, die von dem L012 erzeugt wird, um so eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für die mindestens eine Probe und eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für die mindestens eine Referenz zu erhalten, unde) Vergleichen der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe mit der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Screeningverfahren für Biostimulanzien, d. h. ein Verfahren zur Bewertung, ob eine Substanz ein Biostimulans ist oder nicht.
Aufgrund der kontinuierlich zunehmenden Weltbevölkerung ist eine Erhöhung der Ernteerträge ein Schwerpunkt der Landwirtschaftsindustrie, um die landwirtschaftlichen Erträge pro Einheit landwirtschaftlicher Fläche so weit zu erhöhen, wie möglich. Biostimulanzien sind eine interessante Klasse von Verbindungen und Mikroorganismen für diesen Zweck, da sie natürliche Pflanzenprozesse stimulieren und dadurch die Aufnahme von Nährstoffen und/oder die Nährstoffeffizienz von Pflanzen erhöhen, die Toleranz der Pflanzen gegenüber abiotischem Stress erhöhen und/oder die Qualität der Ernte verbessern. Aus diesem Grund besteht ein zunehmendes Interesse an Screeningverfahren für Biostimulanzien.
Eine Möglichkeit, um zu bestimmen, ob eine Substanz (im Folgenden auch als Kandidaten-Biostimulans bezeichnet) ein Biostimulans ist oder nicht, besteht darin, eine Vielzahl von Nutzpflanzen oder Zierpflanzen einer Spezies zu züchten, wobei sie mit Biostimulanslösung behandelt werden, die das Kandidaten-Biostimulans einschließt, und den Ernteertrag der so gewässerten Nutzpflanzen mit Nutzpflanzen derselben Spezies zu vergleichen, die unter denselben Bedingungen gezüchtet wurden, außer dass sie ohne das Kandidaten-Biostimulans gewässert wurden. Obwohl solch ein Test, wenn er korrekt durchgeführt wird, es ermöglicht, zuverlässig zu bestimmen, ob und gegebenenfalls bis zu welchem Grad das Kandidaten-Biostimulans ein Biostimulans ist, ist dieses Verfahren jedoch mühsam, zeitaufwendig und nicht geeignet zur parallelen Bewertung einer Vielzahl verschiedener Proben mit vertretbarem Aufwand. Letzteres ist jedoch notwendig, besonders in Fällen, in denen verschiedene Mengen desselben Kandidaten-Biostimulans für eine Spezies von Nutzpflanzen bestimmt werden sollen, in denen das Biostimulanzpotenzial desselben Kandidaten-Biostimulans für mehrere verschiedene Nutzpflanzen bewertet werden soll und/oder in denen mehrere verschiedene Kandidaten-Biostimulanzien im Hinblick auf ihr Biostimulanzpotenzial bewertet werden sollen.
Aus diesem Grund wurden in den letzten Jahren Bioassays zur Bestimmung des Biostimulanzpotenzials von Substanzen vorgeschlagen. Bioassays sind Test in kleinem Maßstab, die die biologische Aktivität von Substanzen durch Bewertung ihrer Wirkung auf lebende Modellorganismen bewerten. Zum Beispiel wurden zu diesem Zweck In-vitro-Wurzelspitzenverlängerungstests und In-vivo-Treibhauswachstums-Bioassays beschrieben. Zum Beispiel beschreiben Kaiser, Menegat und Gerhards in Weed Research, 2013, Band 53, Seiten 399 bis 406, dass ein Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren, in dem empfindliche Sämlinge mit Herbiziden behandelt werden, eine erhöhte Chlorophyll-Fluoreszenz bei Apoptose aufwies als bei resistenten Sämlingen oder unbehandelten Sämlingen.
Alle behandelten Screeningverfahren für Biostimulanzien haben jedoch Nachteile. Entweder sie sind zeitaufwendig und mühsam und/oder sie führen nicht zuverlässig zu korrekten Ergebnissen und/oder sie ermöglichen es nicht, eine Vielzahl von Proben parallel effizient zu testen. Andere Verfahren wiederum sind nur für bestimmte Pflanzen und somit nicht allgemein für eine Vielzahl landwirtschaftlich interessanter Pflanzen geeignet.
Die US 6 210 910 B1 betrifft einen Biosensor-Array, bei der eine Vielzahl von Mikrokavitäten an dem distalen Ende einer entsprechenden Anzahl von optischen Fasern ausgebildet sind, um die separate optische Messung der einzelnen Mikrokavitäten zu ermöglichen. Sie lehrt hierbei das Einbringen einer Vielzahl von Zellen in die jeweiligen Mikrokavitäten, die nach Kontakt mit einem Analyten eine optische Antwortsmessung erlaubt, wie beispielsweise durch einen Chemolumineszenz-Marker möglich ist (Ansprüche 1 und 10).
Die US 6 667 159 B1 betrifft einen Biosensor-Array, bei der eine Vielzahl von Mikrokavitäten an dem distalen Ende einer entsprechenden Anzahl von optischen Fasern ausgebildet sind, um die separate optische Messung der einzelnen Mikrokavitäten zu ermöglichen. Sie lehrt hierbei insbesondere das Einbringen von individuellen Zellen in die jeweiligen Mikrokavitäten, die nach Kontakt mit einer Indikatorverbindung und unter Anwesenheit eines optisch abfragbaren Materials, wie beispielsweise ein Chemolumineszenz-Marker eine Detektion der Reaktion dieser Zelle auf eine chemische oder biologische Stimulation ermöglicht (Ansprüche 1, 6, 8 und 11).
Die US 6 377 721 B1 betrifft einen Biosensor-Array, bei der eine Vielzahl von Mikrokavitäten an dem distalen Ende einer entsprechenden Anzahl von optischen Fasern ausgebildet sind, um die separate optische Messung der einzelnen Mikrokavitäten zu ermöglichen. Sie lehrt hierbei insbesondere das Einbringen einer Population von Zellen in die Mikrokavitäten, wobei die Zellpopulation mindestens eine erste und zweite Subpopulation umfasst, die in separaten Mikrokavitäten eingebracht worden sind, und wobei jede Subpopulation mit einem eines optisch abfragbaren Materials, wie beispielsweise ein Chemolumineszenz-Marker kodiert ist. Nach Kontakt der jeweiligen Subpopulation mit einem Test-Analyten kann die optische Antwort der Zell-Subpopulation erfasst werden (Ansprüche 1, 13 und 18).
Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Screeningverfahren für Biostimulanzien, d. h. ein Verfahren zur Bewertung bereitzustellen, ob eine Substanz ein Biostimulans ist oder nicht, wobei das Verfahren flexibel und sensitiv und somit für eine Vielzahl landwirtschaftlich interessanter Pflanzen geeignet ist. Außerdem soll das Screeningverfahren einfach und schnell und insbesondere für die Durchführung bei mehreren Sämlingen und/oder Pflanzen parallel geeignet sein. Schließlich soll das Verfahren zu zuverlässigen Ergebnissen führen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe erfüllt, durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Bewertung, ob eine Substanz ein Biostimulans ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) Bereitstellen mindestens zweier Sämlinge oder Pflanzen derselben Spezies und desselben Alters,
b1) Inkubieren mindestens eines der Sämlinge oder einer der Pflanzen, die in Schritt a) bereitgestellt wurden, mit einem Kandidaten-Biostimulans für mindestens 1 Stunde,
b2) In-Kontakt-Bringen des mindestens einen Sämlings oder der mindestens einen Pflanze nach Schritt b1) mit 8-Amino-5-chlor-7-phenylpyrido-[3,4-d]pyridazin-1,4(2H,3H)dion (L012) und mit einem Auslöser, der die Produktion einer reaktiven Sauerstoffspezies in dem Sämling oder der Pflanze induziert, um so mindestens eine Probe zu erhalten, wobei der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze mit dem L012 und dem Auslöser gleichzeitig oder versetzt in Kontakt gebracht werden können,
c) Behandeln mindestens eines anderen der mindestens zwei Sämlinge oder Pflanzen, die in Schritt a) bereitgestellt wurden, wie in den Schritten b1) und b2), außer dass in Schritt b1) kein Kandidaten-Biostimulans hinzugefügt wird, um so mindestens eine Referenz zu erhalten,
d) Überwachen des oxidativen Ausbruchs der mindestens einen Probe und der mindestens einen Referenz, der vom Auslöser induziert wird, über eine Zeitspanne von mindestens einer Minute, vorzugsweise mindestens 5 Minuten, durch Messung der Chemolumineszenz, die vom L012 erzeugt wird, um so eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für die mindestens eine Probe und eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für die mindestens eine Referenz zu erhalten, und
e) Vergleichen der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe mit der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz.

Dieses Verfahren ermöglicht es, zuverlässig zu bestimmen, ob die bewertete Substanz ein Biostimulans ist oder nicht, da damit die Gesundheit und der Ernährungsstatus einer Pflanze, die mit dem Kandidaten-Biostimulans behandelt wird, direkt mit denjenigen einer Pflanze derselben Pflanzenspezies verglichen wird, die nicht mit dem Kandidaten-Biostimulans behandelt wird. Die vorliegende Erfindung nutzt als Indikator für die Gesundheit und den Ernährungsstatus der Pflanze die Stärke des Abwehrsystems der Pflanze und - daher wiederum als Marker - die Rate des oxidativen Ausbruchs nach dem Stimulieren der Pflanze mit einem Auslöser des Abwehrsystems, zum Beispiel mit Flagellin. Flagellin ist ein globuläres Protein, das den Hauptbestandteil von Bakterien-Flagellen darstellt und in großen Mengen in nahezu allen mit einem Flagellum ausgestatteten Bakterien vorhanden ist. Wie andere Auslöser wird auch Flagellin von einem Rezeptor von Pflanzenzellen erkannt, der das Pflanzenabwehrsystem startet, was durch den oxidativen Ausbruch gekennzeichnet ist. Oxidativer Ausbruch ist die schnelle und vorübergehende Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies, die von bestimmten Enzymen gebildet wird und Nikotinamid-adenin-dinukleotidphosphat-, (NADPH)-Oxidase oder -Peroxidase involviert. Die reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species), oftmals als ROS abgekürzt, umfassen im Speziellen Hyperoxid-Anionen (O^2- ), Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und Hydroxylradikale (HO·). Die hergestellten reaktiven Sauerstoffspezies aktivieren die Produktion von antimikrobiellem Phytoalexin und/oder den Tod hypersensitiver Zellen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der oxidative Ausbruch - als Indikator der Gesundheit und des Ernährungsstatus der Pflanze und daher als Indikator des Biostimulanzpotenzials der bewerteten Substanz - bestimmt durch Messen der Chemolumineszenz, die durch das L012 erzeugt wird, wenn es durch ROS oxidiert wird. Ein Vergleich der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe, die mit dem Kandidaten-Biostimulans behandelt wurde, mit der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz, die nicht mit dem Kandidaten-Biostimulans behandelt wurde, ermöglicht es dann zu folgern, ob das Kandidaten-Biostimulans wirklich ein Biostimulans ist oder nicht, und gegebenenfalls, ob das Kandidaten-Biostimulans ein schwaches, mittelstarkes oder starkes Biostimulans ist. Dies basiert auf der Erkenntnis, dass ein Biostimulans den Grad des oxidativen Ausbruchs, d. h. den maximalen Peak des oxidativen Ausbruchs, der während des Zeitintervalls erreicht wird, und/oder das Integral des oxidativen Ausbruchs, der während des Zeitintervalls erreicht wird, erhöht, wie weiter unten detailliert ausgeführt ist.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hat nicht nur den Vorteil, dass damit zuverlässig bestimmt werden kann, ob die bewertete Substanz ein Biostimulans ist oder nicht, sondern auch, dass es für eine Vielzahl landwirtschaftlich interessanter Pflanzen geeignet ist, da je nach der zu bewertenden Pflanzenspezies einfach ein geeigneter Auslöser zum Induzieren der Produktion einer reaktiven Sauerstoffspezies, d.h. zum Induzieren oxidativen Ausbruchs, in dieser Pflanzenspezies ausgewählt werden muss. Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist, dass es im Wesentlichen für alle Arten von Pflanzen und im Speziellen für Dikotyledonen ebenso wie für Monokotyledonen geeignet ist, da L012 ein sehr empfindlicher Marker für reaktive Sauerstoffspezies ist. Schließlich ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur einfach und schnell, sondern insbesondere geeignet, bei mehreren Proben parallel durchgeführt zu werden. Dies liegt daran, dass die Verfahrensschritte b1), b2), c) und d) problemlos in einer Mikrotiterplatte mit mehreren Vertiefungen, zum Beispiel in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen oder sogar mit 384 Vertiefungen durchgeführt werden können. Dadurch können diese Verfahrensschritte außerdem automatisch und kontinuierlich durchgeführt werden. Darüber hinaus ist L012 nicht toxisch für Pflanzen und verfälscht daher nicht die Messung des oxidativen Ausbruchs, selbst nach einem langen Zeitraum. Daher kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung praktischerweise zum Screening einer Vielzahl verschiedener Substanzen parallel und/oder zum Screening einer Substanz mit verschiedenen Pflanzenspezies parallel angewandt werden, wobei diese Screenings als Mehrfachbestimmungen durchgeführt werden können.
Ein Biostimulans ist gemäß der vorliegenden Erfindung als eine Substanz und/oder ein Mikroorganismus definiert, die/der - wenn sie bzw. er bei Pflanzen oder in der Rhizosphäre angewandt wird - natürliche Prozesse stimuliert, um mindestens eines von Folgendem zu verbessern oder davon zu profitieren: die Nährstoffaufnahme der Pflanze, die Nährstoffeffizienz der Pflanze, die Toleranz der Pflanze gegenüber abiotischem Stress und die Erntequalität. Anders als Pestizide, haben Biostimulanzien keine direkte Wirkung auf Schädlinge.
Außerdem ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein Sämling definiert als eine Pflanze nur mit Primärblättern und/oder einem Alter von bis zu zwei Wochen, während eine Pflanze per definitionem Sekundärblätter aufweist und/oder älter ist als zwei Wochen und vorzugsweise älter als vier Wochen und stärker bevorzugt älter als zwei Monate.
Darüber hinaus wird darauf hingewiesen, dass das Kandidaten-Biostimulans eine Substanz oder ein Mikroorganismus oder eine Mischung aus zwei oder mehr Substanzen oder Mikroorganismen sein kann.
Wie oben ausgeführt, ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung keineswegs auf bestimmte Pflanzenspezies beschränkt, sondern für alle Pflanzenspezies geeignet. Zum Beispiel kann der Sämling oder die Pflanze gewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Medicago truncatula, Oryza sativa, Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Phaseolus vulgaris, Pennisetum glaucum, Lolium perenne, Solanum lycopersicum, Ocimum basilicum.
Auch ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung keineswegs auf Pflanzenspezies beschränkt, die ein bestimmtes Alter haben. Zum Beispiel kann der Sämling ein Alter von 5 bis 14 Tagen und vorzugsweise von 7 Tagen haben, und die Pflanze kann ein Alter von 15 Tagen bis 100 Jahren und vorzugsweise von 2 bis 3 Monaten haben.
Außerdem ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung flexibel, was die Menge und Konzentration des Kandidaten-Biostimulans betrifft, das in Schritt b1) verwendet wird. Zum Beispiel kann der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze mit einer Lösung oder Suspension des Kandidaten-Biostimulans in einem geeigneten Medium, wie zum Beispiel Wasser oder einem Kulturmedium, in Kontakt gebracht werden, worin die Konzentration des Biostimulans vorzugsweise 0,001 pg/l bis 1 g/l betragen kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in Schritt a) mindestens zwei Sämlinge derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt, wobei in Schritt b1) mindestens ein Sämling auf einem Kulturmedium mindestens eine Stunde lang, vorzugsweise mindestens 24 Stunden lang, kultiviert wird, und stärker bevorzugt mindestens bis das Primärblatt zu sehen ist, wenn der Sämling eine Monokotyle ist, oder bis die zwei Primärblätter zu sehen sind, wenn der Sämling eine Dikotyle ist, und wobei das Kandidaten-Biostimulans vorzugsweise im Kulturmedium über mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und am stärksten bevorzugt die ganze Zeit vorhanden ist, während derer der mindestens eine Sämling in Schritt b1) kultiviert wird. In dieser Ausführungsform wird der oxidative Ausbruch bei einem jungen Sämling oder einer Pflanze gemessen, so dass der oxidative Ausbruch in Schritt d) unter Verwendung des gesamten Sämlings als Probe überwacht werden kann. Das Kulturmedium kann jedes Medium sein, in dem der Sämling der Pflanzenspezies gut wächst, wie zum Beispiel Pflanzen-Agar. „Monokotyle“ ist eine gebräuchliche Abkürzung für „Monokotyledone“ und „Dikotyle“ ist eine gebräuchliche Abkürzung für „Dikotyledone“.
Gemäß einer alternativen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in Schritt a) mindestens zwei Sämlinge derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt, wobei in Schritt b1) mindestens ein Sämling auf einem Kulturmedium über 2 bis 48 Tage, stärker bevorzugt 4 bis 20 Tage und am stärksten bevorzugt 7 bis 14 Tage, im Falle eines Sämlings, und 3 bis 7 Tage, im Falle einer Pflanze, kultiviert wird, und wobei das Kandidaten-Biostimulans im Kulturmedium vorzugsweise über mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und am stärksten bevorzugt die ganze Zeit vorhanden ist, während derer der mindestens eine Sämling in Schritt b1) kultiviert wird. In dieser Ausführungsform wird der oxidative Ausbruch bei einer älteren und größeren Pflanze gemessen als in der zuvor erwähnten Ausführungsform, so dass der oxidative Ausbruch in Schritt d) unter Verwendung eines Teils eines Pflanzenblatts oder des gesamten Pflanzenblatts als Probe überwacht werden kann.
Gemäß einer weiteren alternativen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in Schritt a) mindestens zwei Pflanzen derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt, und in Schritt b1) wird die mindestens eine Pflanze auf Erde kultiviert und mit einem Bewässerungsmedium mindestens 1 Stunde lang, vorzugsweise mindestens 24 Stunden lang, stärker bevorzugt 2 bis 48 Tage lang, noch stärker bevorzugt 4 bis 20 Tage lang und am stärksten bevorzugt 7 bis 14 Tage lang gewässert, wobei das Kandidaten-Biostimulans vorzugsweise in der Erde und/oder dem Bewässerungsmedium über mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und am stärksten bevorzugt die ganze Zeit vorhanden ist, während derer die mindestens eine Pflanze in Schritt b1) kultiviert wird. In dieser Ausführungsform kann jede Erde verwendet werden, die genügend als Ernährung wirkende Substanzen einschließt, so dass die Pflanzenspezies auf der Erde gut wächst.
In einer Weiterentwicklung des Gedankens der vorliegenden Erfindung wird vorgeschlagen, den mindestens einen Sämling oder die mindestens eine Pflanze in Schritt b2) mit einer wässerigen Lösung von L012 in Kontakt zu bringen, die eine L012-Konzentration zwischen 0,01 und 1 g/l, vorzugsweise zwischen 0,025 und 0,5 g/l, stärker bevorzugt zwischen 0,05 und 0,2 g/l und am stärksten bevorzugt zwischen 0,075 und 0,125 g/l hat. Solche L012-Konzentrationen sind besonders geeignet zur Messung der vom L012 erzeugten Chemolumineszenz in einem Luminometer und somit zur Beobachtung des oxidativen Ausbruchs jeder der mindestens einen Probe und der mindestens einen Referenz über einen geeigneten Zeitraum. Vorzugsweise beträgt der pH-Wert der L012-Lösung 7,5 bis 8,5 und stärker bevorzugt 7,8 bis 8,0, zum Beispiel insbesondere 7,9 , so dass das Pflanzenwachstum nicht beeinflusst wird. Zur Einstellung des gewünschten pH-Werts kann die L012-Lösung einen beliebigen geeigneten Puffer, wie zum Beispiel einen Phosphatpuffer, einschließen. Zum Beispiel kann die L012-Lösung Phosphat Ionen in einer Konzentration von 10 bis 1,000 mM, vorzugsweise 20 bis 100 mM und stärker bevorzugt 40 bis 60 mM umfassen.
Gemäß einer ersten speziellen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in Schritt a) mindestens zwei Sämlinge derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt, während in Schritt b2) der mindestens eine Sämling mit einer wässerigen Lösung von L012 bedeckt wird. Diese Ausführungsform ist besonders geeignet, wenn in Schritt b1) der mindestens eine Sämling auf einem Kulturmedium kultiviert wird, bis das Primärblatt zu sehen ist, wenn der Sämling eine Monokotyle ist, oder bis die zwei Primärblätter zu sehen sind, wenn der Sämling eine Dikotyle ist, so dass der oxidative Ausbruch an einem jungen Sämling oder einer jungen Pflanze gemessen wird und in Schritt d) unter Verwendung des ganzen Sämlings als Probe überwacht werden kann.
Ein geeignetes spezifisches Protokoll für diese Ausführungsform für Dikotylen-Sämlinge ist wie folgt: Kultivieren eines oder mehrerer Sämlinge unter sterilen Bedingungen in einer Mikrotiterplatte, zum Beispiel in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, wobei natürlich jeder Sämling in einer eigenen Vertiefung wächst, auf Pflanzenagar mit einer Konzentration von 2 bis 40 g/l, vorzugsweise 5 bis 12 g/l, zum Beispiel 8 g/l, unter Hinzufügen des Kandidaten-Biostimulans in einer Konzentration von 0,001 pg/l bis 1 g/l g/l über ungefähr eine Woche, bis die zwei Primärblätter zu sehen sind. Danach Hinzufügen einer wässerigen Lösung von L012 in jede Vertiefung bei einer L012-Konzentration von 0,05 bis 0,15 g/l, zum Beispiel 0,1 g/l, die weiter 10 bis 100 mM, zum Beispiel 50 mM, Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,9 einschließt, bis der Sämling bedeckt ist. Dann Inkubieren der Platte über 4 bis 24 Stunden im Dunkeln und anschließend Hinzufügen eines bekannten Auslösers in ausreichender Konzentration in jede Vertiefung, zum Beispiel 5 bis 40 µM, zum Beispiel 20 µM, Flagellin. Überwachen des oxidativen Ausbruchs mit Hilfe eines Mikroplatten-Luminometers (zum Beispiel: Luminoskan Ascent Thermo Fischer) durch Messen jeder Vertiefung 3 Sekunden pro Vertiefung alle 3 Minuten über einen Zeitraum von 1 bis 10 Stunden.
Ein geeignetes spezifisches Protokoll für diese Ausführungsform bei Monokotylen-Sämlingen ist damit identisch, außer dass die einen oder mehreren Sämlinge gezüchtet werden, bis das Primärblatt zu sehen ist, und außer dass nach Inkubation im Dunkeln ein bekannter Auslöser gemeinsam mit Peroxidase in jede Vertiefung gegeben wird, wobei die Peroxidasekonzentration 0,05 bis 0,15 g/l, zum Beispiel 0,1 g/l, beträgt.
Gemäß einer zweiten speziellen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in Schritt a) mindestens zwei Sämlinge oder Pflanzen derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt, wobei in Schritt b2) mindestens ein Teil eines Blattes des mindestens einen Sämlings oder der mindestens einen Pflanze mit einer wässerigen Lösung von L012 in Kontakt gebracht wird. Diese Ausführungsform ist besonders geeignet, wenn in Schritt b1) mindestens ein Sämling mehr als 7 bis 14 Tage lang kultiviert wird oder mindestens eine Pflanze ungefähr 3 bis 7 Tage lang kultiviert wird. Dann hat die Pflanze ausreichend Blätter entwickelt, so dass der oxidative Ausbruch in Schritt d) durch Verwendung eines Teils eines Pflanzenblattes oder des ganzen Pflanzenblattes als Probe überwacht werden kann.
Ein geeignetes spezifisches Protokoll für diese Ausführungsform für Dikotylen-Sämlinge ist wie folgt: Kultivieren eines oder mehrerer Sämlinge auf Pflanzenagar bei einer Konzentration von 2 bis 40 g/l, vorzugsweise 5 bis 12 g/l, zum Beispiel 8 g/l, unter Hinzufügen des Kandidaten-Biostimulans mit einer Konzentration von 0,001 µg/l bis 1 g/l über 7 bis 14 Tage. Anschließendes Ausschneiden eines Teils eines Blattes in einer geeigneten Größe, so dass der Blattteil in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, zum Beispiel einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, gelegt werden kann, und Legen der Blattteile jedes Sämlings in eine Vertiefung der Mikrotiterplatte. Dann Auffüllen jeder Vertiefung mit Wasser und Inkubieren der Platte über Nacht. Anschließendes Ersetzen des Wassers in jeder Vertiefung durch eine wässerige Lösung von L012 mit einer L012-Konzentration von 0,05 bis 0,15 g/l, zum Beispiel 0,1 g/l, die weiter 10 bis 100 mM, zum Beispiel 50 mM, Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,9 einschließt und weiter einen geeigneten Auslöser in ausreichender Konzentration, zum Beispiel 5 bis 40 µM, zum Beispiel 20 µM Flagellin, einschließt. Überwachen des oxidativen Ausbruchs mit Hilfe eines Mikroplatten-Luminometers (zum Beispiel: Luminoskan Ascent Thermo Fischer) durch Messen jeder Vertiefung 5 Sekunden pro Vertiefung alle 8 Minuten über 1 bis 10 Stunden.
Ein geeignetes spezifisches Protokoll für diese Ausführungsform für Monokotylen-Sämlinge ist damit identisch, außer dass die Lösung, die L012 und Auslöser einschließt, weiter Peroxidase in einer Konzentration von 0,05 bis 0,15 g/l, zum Beispiel 0,1g/l, einschließt. Anstelle von Flagellin kann auch jeder andere geeignete Auslöser verwendet werden, zum Beispiel Chitosan in einer Konzentration von zum Beispiel 0,01 bis 0,1g/l, zum Beispiel 0,05 g/l.
Ein geeignetes spezifisches Protokoll für diese Ausführungsform für monokotyle Pflanzen ist identisch mit dem oben ausgeführten Protokoll für Monokotylen-Sämlinge, außer dass die Pflanze(n) 3 bis 7 Tage lang auf Erde kultiviert wird/werden unter Bewässerung mit Wasser, das das Kandidaten-Biostimulans in einer Konzentration von 0,001 pg/l bis 1 g/l einschließt. In ähnlicher Weise ist ein geeignetes spezifisches Protokoll für diese Ausführungsform für dikotyle Pflanzen identisch mit dem oben ausgeführten Protokoll für dikotyle Sämlinge, außer dass die Pflanze (n) 3 bis 7 Tage lang auf Erde kultiviert wird/werden unter Bewässerung mit Wasser, das das Kandidaten-Biostimulans in einer Konzentration von 0,001 pg/l bis 1 g/l g/l einschließt.
Wie oben ausgeführt, ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bezüglich des in Schritt b2) hinzugefügten Auslösers nicht eingeschränkt, außer dass der Auslöser in der Lage sein muss, die Produktion von ROS im Sämling bzw. in der Pflanze zu induzieren, d. h. das Abwehrsystem des Sämlings bzw. der Pflanze auszulösen. Je nach Pflanzenspezies kann der Auslöser gewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Ulvan, Chitosan, Chitin, Flagellin, Oligosacchariden, Polysacchariden, Pflanzenhormonen, wie zum Beispiel Salicylsäure und Jasmonaten, Membranproteinen, Pilzsterinen und willkürlichen Kombinationen von zwei oder mehr der oben erwähnten Verbindungen.
Der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze kann in Schritt b2) mit dem L012 und mit dem Auslöser gleichzeitig oder versetzt in Kontakt gebracht werden.
Vorzugsweise wird in Schritt b2) ein Sämling inkubiert, nachdem er für für 1 bis 48 Stunden, vorzugsweise 2 bis 36 Stunden und stärker bevorzugt 4 bis 24 Stunden, im Dunkeln mit der wässerigen Lösung von L012 bedeckt wurde, dann wird der Auslöser zu der wässerigen Lösung in einer Menge hinzugefügt, die ausreicht, um den oxidativen Ausbruch auszulösen. Diese Ausführungsform ist besonders dann bevorzugt, wenn in Schritt b1) der mindestens eine Sämling auf einem Kulturmedium kultiviert wird, bis das Primärblatt zu sehen ist, wenn der Sämling eine Monokotyle ist, oder bis die zwei Primärblätter zu sehen sind, wenn der Sämling eine Dikotyle ist, so dass der oxidative Ausbruch an einem jungen Sämling oder einer jungen Pflanze gemessen wird und so in Schritt d) überwacht werden kann, indem der ganze Sämling als Probe verwendet wird, zum Beispiel indem er mit einer wässerigen Lösung von L012 bedeckt wird.
Alternativ wird mindestens ein Sämling oder mindestens eine Pflanze in Schritt b2) mit einer wässerigen Lösung von L012 inkubiert, die weiter den Auslöser in einer Menge enthält, die ausreicht, um oxidativen Ausbruch auszulösen. Diese Ausführungsform wird insbesondere bevorzugt, wenn in Schritt b1) mindestens ein Sämling für mehr als 7 bis 14 Tage oder mindestens eine Pflanze für ungefähr 3 bis 7 Tage kultiviert wird, so dass sie ausreichend entwickelte Blätter hat, damit der oxidative Ausbruch in Schritt d) unter Verwendung eines Teils eines Pflanzenblatts oder des gesamten Pflanzenblatts als Probe überwacht werden kann. In dieser Ausführungsform wird vorzugsweise ein Scheibchen mit geeigneter Größe aus dem Blatt ausgeschnitten und vorzugsweise mit Wasser in der Vertiefung einer Mikrotiterplatte über Nacht inkubiert, bevor das Wasser durch eine wässerige Lösung ersetzt wird, die L012 mit einer L012-Konzentration von 0,05 bis 0,15 g/l, zum Beispiel 0,1 g/l, einschließt und die weiter 10 bis 100 mM, zum Beispiel 50 mM, Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,9 und weiter einen geeigneten Auslöser in ausreichender Konzentration, wie zum Beispiel 5 bis 40 µM, zum Beispiel 20 µM Flagellin, einschließt.
Die zwei oben erwähnten Ausführungsformen sind besonders geeignet, wenn in Schritt a) Sämlinge oder Pflanzen einer Dikotyle bereitgestellt werden.
Wenn in Schritt a) Sämlinge oder Pflanzen einer Monokotyle bereitgestellt werden, wird bevorzugt, dass in Schritt b2) der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze mit dem Auslöser gemeinsam mit Peroxidase in Kontakt gebracht wird, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 und 1 g/l, stärker bevorzugt zwischen 0,025 und 0,5 g/l, noch stärker bevorzugt zwischen 0,05 und 0,2 g/l und am stärksten bevorzugt zwischen 0,075 und 0,125 g/l. Dies wird bevorzugt, da bei der Messung des oxidativen Ausbruchs gemäß Schritt d) bei der Verwendung von L012 allein nur relativ geringe Chemolumineszenzwerte erzielt werden. Dies liegt an den strukturellen Unterschieden zwischen Dikotylen einerseits und Monokotylen andererseits. Monokotylen und Dikotylen unterscheiden sich nicht nur in ihrer namensgebenden Anzahl von Keimblättern (eins bei Monokotylen und zwei bei Dikotylen), sondern auch in ihrer gesamten Struktur. Monokotylen haben eine relativ lineare und parallele Struktur in den Blättern sowie in den Blattvenen, während Dikotylen eher runde Strukturen und verzweigte Blattvenen haben. Sie unterscheiden sich auch in der Molekularstruktur der Zellwandzusammensetzung und hauptsächlich durch die Fülle an Pektin in Dikotylen, sowie in der Vernetzung der Polysaccharide Xyloglukan bei Dikotylen und Glucuronoarabinoxylan bei Monokotylen. Monokotylen und Dikotylen unterscheiden sich darüber hinaus auch in den Mechanismen, die dem oxidativen Ausbruch zugrunde liegen. Während Dikotylen NADPH-Oxidase zur Produktion von ROS nutzen, sind Monokotylen hauptsächlich auf Peroxidasen angewiesen. Die Zugabe von Peroxidase zu Monokotylen erhöht so die Empfindlichkeit der Prüfung der vorliegenden Erfindung, so dass sie für Monokotylen ebenso geeignet ist wie für Dikotylen. Die Peroxidase wird vorzugsweise gleichzeitig mit dem Auslöser hinzugefügt. Es ist jedoch auch möglich, dass die Peroxidase und der Auslöser versetzt hinzugegeben werden.
In einer Weiterentwicklung des Gedankens der vorliegenden Erfindung wird vorgeschlagen, in Schritt d) die oxidativen Ausbrüche der mindestens einen Probe und der mindestens einen Referenz in einem Luminometer über ein Zeitintervall von mindestens 5 Minuten, vorzugsweise mindestens 10 Minuten, stärker bevorzugt mindestens 30 Minuten und am stärksten bevorzugt 1 bis 10 Stunden zu überwachen. Zum Beispiel kann ein Luminoskan Ascent Thermo Fischer-Luminometer verwendet werden.
Außerdem wird es bevorzugt, in Schritt d) die oxidativen Ausbrüche der mindestens einen Probe und der mindestens einen Referenz in einem Luminometer zu messen, wobei die Chemolumineszenz während des Zeitintervalls vorzugsweise alle 1 bis 10 Minuten für 1 bis 10 Sekunden pro Messung und stärker bevorzugt alle 2 bis 9 Minuten für 2 bis 6 Sekunden pro Messung bei einer Wellenlänge von 400 bis 600 nm, zum Beispiel 430 nm, gemessen wird.
Vorzugsweise wird die gemessene Chemolumineszenz auf die y-Achse und die Zeit auf die x-Achse aufgetragen, so dass eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für die mindestens eine Probe und eine entsprechende Kurve für die mindestens eine Referenz gewonnen werden. Die auf die y-Achse aufgetragene gemessene Chemolumineszenz kann passend als relative Lichteinheiten in Prozent ausgedrückt werden, wobei 100% der Maximalwert von Lichteinheiten ist, der während des Überwachungsprozesses in Schritt d) gewonnen wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt e) das Integral des gemessenen oxidativen Ausbruchs während des Zeitintervalls der in Schritt d) gewonnen Kurven für die mindestens eine Probe und für die mindestens eine Referenz berechnet, so dass ein numerischer Integralwert des oxidativen Ausbruchs für die Probe und ein numerischer Integralwert des oxidativen Ausbruchs für die Referenz gewonnen werden. Der Vergleich beider numerischer Integralwerte ermöglicht es dann zu bestimmen, ob das Kandidaten-Biostimulans wirklich ein Biostimulans ist oder nicht, und wenn ja, ob das Kandidaten-Biostimulans ein schwaches, mittleres oder starkes Biostimulans ist. Das Integral wird durch Standardverfahren bestimmt, zum Beispiel graphisch durch Unterteilen der Fläche unterhalb der Kurve in kleine Rechtecke und anschließendes Summieren der Flächen aller Rechtecke.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Kandidaten-Biostimulans als Biostimulans betrachtet, wenn der numerische Integralwert des oxidativen Ausbruchs der Probe sich um mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am stärksten bevorzugt mindestens 75% vom numerischen Integralwert des oxidativen Ausbruchs der Referenz unterscheidet. Wenn die Differenz der Zahlenwerte 10 bis 25% beträgt, wird das Biostimulans als schwaches Biostimulans betrachtet, während das Biostimulans als mittleres Biostimulans betrachtet wird, wenn die Differenz mehr als 25 bis 75% beträgt und das Biostimulans als starkes Biostimulans betrachtet wird, wenn die Differenz mehr als 75% beträgt.
Alternativ oder zusätzlich hierzu wird das Kandidaten-Biostimulans als Biostimulans betrachtet, wenn mindestens eines der drei folgenden Kriterien erfüllt ist:

i) der maximale numerische Zahlenwert der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe ist mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am stärksten bevorzugt mindestens 75% höher als der maximale Zahlenwert der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz,
ii) die Breite der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe ist mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am stärksten bevorzugt mindestens 75% höher als die Breite der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz, wobei die Breite der Kurven die Länge einer Linie ist, die den Punkt der Kurve, an dem zum kleinsten Zeitpunkt der Zahlenwert für den oxidativen Ausbruch 10% des maximalen Zahlenwerts für den oxidativen Ausbruch beträgt, und den Punkt der Kurve verbindet, zu dem zum höchsten Zeitpunkt der Zahlenwert für den oxidativen Ausbruch 10% des maximalen Zahlenwerts für den oxidativen Ausbruch beträgt,
iii) der Interal-Zahlenwert des gemessenen oxidativen Ausbruchs während des Zeitintervalls der Probe ist mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am stärksten bevorzugt mindestens 75% höher als der Integral-Zahlenwert des gemessenen oxidativen Ausbruchs während des Zeitintervalls der Referenz.

Wenn irgendeine der Differenzen für die Kriterien i) bis iii) 10 bis 25% beträgt, wird das Biostimulans als schwaches Biostimulans betrachtet, während das Biostimulans als mittleres Biostimulans betrachtet wird, wenn der Unterschied mehr als 25 bis 75% beträgt und das Biostimulans als starkes Biostimulans betrachtet wird, wenn der Unterschied mehr als 75% beträgt.
Alternativ hierzu wird das Kandidaten-Biostimulans als Biostimulans betrachtet, wenn der maximale Zahlenwert der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe früher erreicht wird als der maximale Zahlenwert der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz. In dieser Ausführungsform kann die Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe dieselbe Form haben wie diejenige der Referenz, ist aber auf der x-Achse nach links verschoben. Auch die Integrale beider Kurve können in dieser Ausführungsform identisch sein. Es ist in dieser Ausführungsform jedoch auch möglich, dass die Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe eine andere Form hat als diejenige der Referenz hat, und/oder dass das Integral der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe höher ist als dasjenige der Referenz.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Mehrfachbestimmung mit den Proben und den Referenzen durchgeführt. Genauer können in Schritt a) 4 bis 20, vorzugsweise 6 bis 12 und stärker bevorzugt 6 oder 10 Sämlinge oder Pflanzen bereitgestellt werden, und jeder der Schritte b1) und b2) wird mit 2 bis 10, vorzugsweise 3 bis 6 und stärker bevorzugt 3 oder 5 Sämlingen oder Pflanzen durchgeführt, um so eine entsprechende Anzahl an Proben zu erhalten, und Schritt c) wird mit 2 bis 10, vorzugsweise 3 bis 6 und stärker bevorzugt 3 oder 5 Sämlingen oder Pflanzen durchgeführt, um so eine entsprechende Anzahl von Referenzen zu erhalten, und in Schritt d) wird bei jeder der Proben und bei jeder der Referenzen der oxidative Ausbruch gemessen, wobei für die gemessenen Zahlenwerte, die bei den Proben gewonnen werden, der Durchschnitt berechnet wird, und bei den gemessenen Zahlenwerten, die bei den Referenzen gewonnen werden, der Durchschnitt berechnet wird, um so eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für alle Proben und eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für alle Referenzen zu erhalten.
Vorzugsweise werden zumindest Schritt d) und vorzugsweise die Schritte b1), b2), c) und d) in einer Mikrotiterplatte mit mehreren Vertiefungen durchgeführt. Dadurch können eine Vielzahl von Sämlingen und/oder Pflanzen schnell und einfach und sogar kontinuierlich und automatisiert parallel gemessen werden, so wie zum Beispiel 2 bis 1.000, vorzugsweise 20 bis 500, zum Beispiel 96 oder 384 Sämlinge und/oder Pflanzen parallel. So können mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl verschiedener Kandidaten-Biostimulanzien für eine Pflanzenspezies oder eine Vielzahl von Konzentrationen eines Kandidaten-Biostimulans für eine Pflanzenspezies oder ein Kandidaten-Biostimulans für eine Vielzahl verschiedener Pflanzenspezies oder auch eine Vielzahl verschiedener Kandidaten-Biostimulanzien für eine Vielzahl verschiedener Pflanzenspezies, selbst mit Mehrfachbestimmungen, parallel bewertet werden.
Im Folgenden ist die vorliegende Erfindung mit Hilfe von Figuren beschrieben, welche die vorliegende Erfindung verdeutlichen, aber nicht einschränken.

1 zeigt schematisch eine exemplarische Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für eine Pflanzenspezies.
2 zeigt schematisch eine Kurve (S) des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für eine Pflanzenspezies, die mit einem Biostimulans handelt wurde, und eine Kurve (R) des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für dieselbe Pflanzenspezies, die nicht mit einem Biostimulans behandelt wurde, gewonnen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wobei beide Kurven in einem Diagramm zusammengefasst sind.
3 zeigt schematisch eine andere Kurve (S) des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für eine Pflanzenspezies, die mit einem Biostimulans behandelt wurde, und eine Kurve (R) des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für dieselbe Pflanzenspezies, die nicht mit einem Biostimulans behandelt wurde, gewonnen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wobei beide Kurven in einem Diagramm zusammengefasst sind.
4 zeigt schematisch eine andere Kurve (S) des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für eine Pflanzenspezies, die mit einem Biostimulans behandelt wurde, und eine Kurve (R) des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für dieselbe Pflanzenspezies, die nicht mit einem Biostimulans behandelt wurde, gewonnen mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wobei beide Kurven in einem Diagramm zusammengefasst sind.

1 zeigt schematisch die Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit, resultierend aus Schritt d) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. Die gemessene Chemolumineszenz wird auf die y-Achse und die Zeit auf die x-Achse aufgetragen, was in der Kurve S des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für die mindestens eine Probe sowie in einer entsprechenden Kurve R für die mindestens eine Referenz resultiert. Die auf die y-Achse aufgetragene gemessene Chemolumineszenz wird als relative Lichteinheiten in Prozent ausgedrückt, wobei 100% der Maximalwert M von Lichteinheiten ist, der während der Überwachung in Schritt d) gewonnen wird. Die Fläche unterhalb der Kurve ist das Integral des gemessenen oxidativen Ausbruchs während des Zeitintervalls der Probe. Die Breite W der Kurve ist die Länge der Linie, die den Punkt der Kurve, an dem zur ersten Zeit der Zahlenwert für den oxidativen Ausbruch 10% des maximalen Zahlenwerts für den oxidativen Ausbruch beträgt, und den Punkt der Kurve, bei dem zur letzten Zeit der Zahlenwert für den oxidativen Ausbruch 10% des maximalen Zahlenwerts für den oxidativen Ausbruch beträgt, verbindet.
2 zeigt schematisch eine Kurve S des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für eine Pflanzenspezies, die mit einem Biostimulans behandelt wurde, und eine Kurve R des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für dieselbe Pflanzenspezies, die nicht mit einem Biostimulans behandelt wurde, resultierend aus einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wobei beide Kurven in einem Diagramm vergleichend zusammengefasst worden sind. Die Kurve S der Probe hat einen höheren Maximalwert M als die Kurve R der Referenz. Außerdem ist das Integral der Kurve S der Probe höher als dasjenige der Kurve R der Referenz. Daher ist das Kandidaten-Biostimulans dieser Ausführungsform tatsächlich ein Biostimulans.
3 zeigt schematisch eine Kurve S des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für eine Pflanzenspezies, die mit einem Biostimulans behandelt wurde, und eine Kurve R des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für dieselbe Pflanzenspezies, die nicht mit einem Biostimulans behandelt wurde, resultierend aus einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wobei beide Kurven in einem Diagramm vergleichend zusammengefasst sind. Die Kurve S der Probe hat einen niedrigeren Maximalwert M als die Kurve R der Referenz. Das Integral der Kurve S der Probe ist jedoch höher als dasjenige der Kurve R der Referenz und die Breite W der Kurve S der Probe ist größer als diejenige der Kurve R der Referenz. Somit ist das Kandidaten-Biostimulans dieser Ausführungsform tatsächlich ein Biostimulans.
4 zeigt schematisch eine Kurve S des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für eine Pflanzenspezies, die mit einem Biostimulans behandelt wurde, und eine Kurve R des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für dieselbe Pflanzenspezies, die nicht mit einem Biostimulans behandelt wurde, resultierend aus einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wobei beide Kurven in einem Diagramm vergleichend zusammengefasst sind. Die Kurve S der Probe hat einen höheren Maximalwert M als die Kurve R der Referenz. Außerdem ist das Integral der Kurve S der Probe höher als dasjenige der Kurve R der Referenz und die Breite W der Kurve S der Probe ist größer als diejenige der Kurve R der Referenz. Somit ist das Kandidaten-Biostimulans dieser Ausführungsform tatsächlich ein Biostimulans.
Bezugszeichen

M: Maximalwert der gemessenen Chemolumineszenz
R: Referenz
S: Probe
W: Breite der Kurve

Claims

Ein Verfahren zur Bewertung, ob eine Substanz ein Biostimulans ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellen mindestens zweier Sämlinge oder Pflanzen derselben Spezies und desselben Alters, b1) Inkubieren mindestens eines der Sämlinge oder Pflanzen, die in Schritt a) bereitgestellt wurden, mit einem Kandidaten-Biostimulans über mindestens 1 Stunde, b2) In-Kontakt-Bringen des mindestens einen Sämlings oder der mindestens einen Pflanze nach Schritt b1) mit 8-Amino-5-chlor-7-phenylpyrido-[3,4-d]pyridazin-1,4(2H,3H)dion (L012) und mit einem Auslöser, der die Produktion einer reaktiven Sauerstoffspezies in dem Sämling oder der Pflanze auslöst, um so mindestens eine Probe zu erhalten, wobei der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze mit dem L012 und dem Auslöser gleichzeitig oder versetzt in Kontakt gebracht werden kann, c) Behandeln mindestens eines anderen der mindestens zwei Sämlinge oder Pflanzen, die in Schritt a) bereitgestellt wurden, wie in den Schritten b1) und b2), außer dass in Schritt b1) kein Kandidaten-Biostimulans hinzugefügt wird, um so mindestens eine Referenz zu erhalten, d) Überwachen des oxidativen Ausbruchs der mindestens einen Probe und der mindestens einen Referenz, induziert durch den Auslöser, über ein Zeitintervall von mindestens einer Minute durch Messen der Chemolumineszenz, die von dem L012 erzeugt wird, um so eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für die mindestens eine Probe und eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für die mindestens eine Referenz zu erhalten, und e) Vergleichen der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe mit der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Sämling oder die Pflanze gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Medicago truncatula, Oryza sativa, Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Phaseolus vulgaris, Pennisetum glaucum, Lolium perenne, Solanum lycopersicum und Ocimum basilicum.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt a) mindestens zwei Sämlinge derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt werden, wobei in Schritt b1) mindestens ein Sämling für mindestens eine Stunde auf einem Kulturmedium kultiviert wird, vorzugsweise für mindestens 24 Stunden und stärker bevorzugt mindestens bis das Primärblatt zu sehen ist, wenn der Sämling eine Monokotyle ist, oder bis die zwei Primärblätter zu sehen sind, wenn der Sämling eine Dikotyle ist, und wobei das Kandidaten-Biostimulans im Kulturmedium für mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und am stärksten bevorzugt die ganze Zeit vorhanden ist, während derer der mindestens eine Sämling in Schritt b1) kultiviert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt a) mindestens zwei Sämlinge derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt werden, worin in Schritt b1) mindestens ein Sämling mindestens eine Stunde lang, vorzugsweise mindestens 24 Stunden lang, stärker bevorzugt 2 bis 48 Tage lang, noch stärker bevorzugt 4 bis 20 Tage lang und am stärksten bevorzugt 7 bis 14 Tage lang auf einem Kulturmedium kultiviert wird, und worin das Kandidaten-Biostimulans im Kulturmedium über mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und am stärksten bevorzugt die ganze Zeit vorhanden ist, während derer der mindestens eine Sämling in Schritt b1) kultiviert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt a) mindestens zwei Pflanzen derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt werden, worin in Schritt b1) die mindestens eine Pflanze auf Erde kultiviert und mit einem Wässerungsmedium mindestens eine Stunde lang, vorzugsweise mindestens 24 Stunden lang, stärker bevorzugt 2 bis 48 Tage lang, noch stärker bevorzugt 4 bis 20 Tage lang und am stärksten bevorzugt 7 bis 14 Tage lang im Falle eines Sämlings, und 3 bis 7 Tage lang im Falle einer Pflanze gewässert wird, und wobei das Kandidaten-Biostimulans vorzugsweise in der Erde und/oder dem Bewässerungsmedium über mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, noch stärker bevorzugt mindestens 90% und am stärksten bevorzugt die ganze Zeit vorhanden ist, während derer die mindestens eine Pflanze in Schritt b1) kultiviert wird.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, wobei in Schritt b2) der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze mit einer wässerigen Lösung von L012 in Kontakt gebracht wird, die eine L012-Konzentration zwischen 0,01 und 1 g/l, vorzugsweise zwischen 0,025 und 0,5 g/l, stärker bevorzugt zwischen 0,05 und 0,2 g/l und am stärksten bevorzugt zwischen 0,075 und 0,125 g/l, hat, worin die wässerige Lösung vorzugsweise weiter Phosphationen in einer Konzentration von 10 bis 1.000 mM, vorzugsweise 20 bis 100 mM und am stärksten bevorzugt 40 bis 60 mM umfasst und einen pH-Wert von 7,5 bis 8,5 und vorzugsweise 7,8 bis 8,0 hat.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 und 6, wobei in Schritt a) mindestens zwei Sämlinge derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt werden, worin in Schritt b2) der mindestens eine Sämling mit einer wässerigen Lösung von L012 bedeckt wird.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei in Schritt a) mindestens zwei Sämlinge oder Pflanzen derselben Spezies und desselben Alters bereitgestellt werden, worin in Schritt b2) mindestens ein Teil eines Blattes des mindestens einen Sämlings oder der mindestens einen Pflanze mit einer wässerigen Lösung von L012 in Kontakt gebracht wird.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, wobei in Schritt b2) der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze mit einem Auslöser in Kontakt gebracht wird, der gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ulvan, Chitosan, Chitin, Flagellin, Oligosacchariden, Polysacchariden, Pflanzenhormonen, wie zum Beispiel Salicylsäure und Jasmonaten, Membranproteinen, Pilzsterinen und willkürlichen Kombinationen aus zwei oder mehr der oben erwähnten Verbindungen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei in Schritt b2) der mindestens eine Sämling inkubiert wird, nachdem er mit der wässerigen Lösung von L012 1 bis 48 Stunden lang, vorzugsweise 2 bis 36 Stunden lang und stärker bevorzugt 4 bis 24 Stunden lang im Dunkeln bedeckt wurde, und dann der Auslöser zur wässerigen Lösung in einer Menge hinzugegeben wird, die ausreicht, um den oxidativen Ausbruch auszulösen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei in Schritt b2) die wässerige Lösung von L012, mit welcher das Blatt in Kontakt gebracht wird, weiter den Auslöser in einer Menge enthält, die ausreicht, um den oxidativen Ausbruch auszulösen.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, wobei in Schritt a) Sämlinge oder Pflanzen einer Dikotyle bereitgestellt werden.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, wobei in Schritt a) Sämlinge oder Pflanzen einer Monokotyle bereitgestellt werden und worin in Schritt b2) der mindestens eine Sämling oder die mindestens eine Pflanze mit dem Auslöser in Kontakt gebracht wird, gemeinsam mit Peroxidase vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 und 1 g/l, stärker bevorzugt zwischen 0,025 und 0,5 g/l, noch stärker bevorzugt zwischen 0,05 und 0,2 g/l und am stärksten bevorzugt zwischen 0,075 und 0,125 g/l.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, wobei in Schritt d) die oxidativen Ausbrüche der mindestens einen Probe und der mindestens einen Referenz in einem Luminometer über ein Zeitintervall von mindestens 5 Minuten, vorzugsweise mindestens 10 Minuten, stärker bevorzugt mindestens 30 Minuten und am stärksten bevorzugt 1 bis 10 Stunden überwacht werden.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, wobei in Schritt d) die oxidativen Ausbrüche der mindestens einen Probe und der mindestens einen Referenz in einem Luminometer überwacht werden, worin die Chemolumineszenz während des Zeitintervalls vorzugsweise alle 1 bis 10 Minuten für 1 bis 10 Sekunden pro Messung und stärker bevorzugt alle 2 bis 9 Minuten für 2 bis 6 Sekunden pro Messung bei einer Wellenlänge von 400 bis 600 nm gemessen wird.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, wobei in Schritt e) das Integral des gemessenen oxidativen Ausbruchs während des Zeitintervalls für die mindestens eine Probe und für die mindestens eine Referenz berechnet wird, um so einen Integral-Zahlenwert des oxidativen Ausbruchs für die Probe und einen Integral-Zahlenwert des oxidativen Ausbruchs für die Referenz zu erhalten.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Kandidaten-Biostimulans als Biostimulans betrachtet wird, wenn der Integral-Zahlenwert des oxidativen Ausbruchs der Probe sich um mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am stärksten bevorzugt mindestens 75% vom Integral-Zahlenwert des oxidativen Ausbruchs der Referenz unterscheidet.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, wobei das Kandidaten-Biostimulans als Biostimulans betrachtet wird, wenn mindestens eines der drei folgenden Kriterien erfüllt ist: i) der maximale Zahlenwert der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe liegt mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am stärksten bevorzugt mindestens 75% über dem maximalen Zahlenwert der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz, ii) die Breite der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Probe ist mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am stärksten bevorzugt mindestens 75% größer als die Breite der Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit der mindestens einen Referenz, worin die Breite der Kurven die Länge einer Linie ist, die den Punkt der Kurve, an dem zur kleinsten Zeit der Zahlenwert für den oxidativen Ausbruch 10% des maximalen Zahlenwerts für den oxidativen Ausbruch beträgt, und den Punkt der Kurve miteinander verbindet, an dem zum größten Zeitpunkt der Zahlenwert für den oxidativen Ausbruch 10% des maximalen Zahlenwerts für den oxidativen Ausbruch beträgt, iii)der Integral-Zahlenwert des gemessenen oxidativen Ausbruchs während des Zeitintervalls der Probe mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 25%, stärker bevorzugt mindestens 50% und am stärksten bevorzugt mindestens 75% höher ist als der Integral-Zahlenwert des gemessenen oxidativen Ausbruchs während des Zeitintervalls der Referenz.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, worin in Schritt a) 4 bis 20, vorzugsweise 6 bis 12 und stärker bevorzugt 6 oder 10 Sämlinge oder Pflanzen bereitgestellt werden, worin jeder der Schritte b1) und b2) mit 2 bis 10, vorzugsweise 3 bis 6 und stärker bevorzugt 3 oder 5 Sämlingen oder Pflanzen durchgeführt wird, um so eine entsprechende Anzahl von Proben zu erhalten, worin Schritt c) mit 2 bis 10, vorzugsweise 3 bis 6 und stärker bevorzugt 3 oder 5 Sämlingen oder Pflanzen durchgeführt wird, um so eine entsprechende Anzahl von Referenzen zu erhalten, worin in Schritt d) für jede der Proben und für jede der Referenzen der oxidative Ausbruch gemessen wird, wobei die gemessenen Zahlenwerte, die für die Proben gewonnen werden, gemittelt werden, und die gemessenen Zahlenwerte, die für die Referenzen gewonnen werden, gemittelt werden, um so eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für alle Proben und eine Kurve des oxidativen Ausbruchs über die Zeit für alle Referenzen zu erhalten.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, worin mindestens Schritt d) und vorzugsweise die Schritte b1), b2), c) und d) in einer Mikrotiterplatte mit mehreren Vertiefungen durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß einem beliebigen der obigen Ansprüche, worin das Verfahren parallel für 2 bis 1.000, vorzugsweise für 20 bis 500, zum Beispiel 96 oder 384 Sämlinge oder Pflanzen durchgeführt wird.