BR112012031558B1 - Medição com espectrometria de massa das resistências de beta-lactamase - Google Patents
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Abstract
MEDIÇÃO COM ESPECTROMETRIA DE MASSA DAS RESISTÊNCIAS DE BETA-LACTAMASE. A invenção refere-se à determinação das resistências de micro-organismos que produzem (Beta)-lactamases, em particular "Beta-lactamases de espectro estendido" (ESBL). A invenção fornece um método pelo qual a resistência microbiana poder ser medida de maneira muito simples e rápi-da por meio do efeito catalítico de (Beta)-lactamases produzidas por micróbios sobre antobióticos (Beta)- lactâmicos, que consiste em uma clivagem hidrolítica do anel (Beta)-lactâmico. O método determina a resistência das bactérias poucas horas depois de um substrato adequado, um anti-biótico (Beta)-lactâmico ou um derivado de (Beta)-lactâmicos adaptado, ter sido acrescentado a uma suspensão dos micróbios, por medição direta por espectrometria de massa da quebra do substrato provocada por (Beta)-lactamases.
Description
[0001] A invenção se refere à determinação da resistência de bac térias produtoras de β-lactamases, incluindo "β-lactamases de espectro estendido" (ESBL).
[0002] Muitos tipos de micróbios, principalmente bactérias e fun gos unicelulares, podem ser identificados de maneira fácil e rápida por espectrometria de massa por meio da transferência de pequenas quantidades de micróbios de uma colônia cultivada da forma habitual ou em um meio nutritivo, para uma placa de suporte de amostra de espectrometria de massa, em que são preparados com uma solução de uma substância de uma matriz e medidos com espectrometria de massa após ionização por dessorção a laser assistida por matriz. O espectro de massa apresenta as massas e as intensidades das proteínascaracterísticas, se elas estiverem presentes nos micróbios em concentração suficiente. Esse espectro, que sempre exibe picos de aproximadamente 40 a 80 proteínas dos micróbios por vez, é utilizado para determinar sua identidade por análises de similaridade com milhares de espectros de referência em bibliotecas espectrais correspondentes. Aqui, o termo "identificação"denota uma classificação ta- xonômica, ou seja, a determinação da família, gênero e espécie. A pesquisa está sendo realizada em muitos locais para reunir bibliotecas confiáveis e legalmente aprovadas para utilização médica (as assim chamadas, bibliotecas "validadas") com espectros de referência de milhares de micróbios.
[0003] Esse método de identificação de micróbios provou ser ex traordinariamente bem-sucedido tanto nos estudos, como na rotina diária de muitos laboratórios microbiológicos. É rápido, de baixo custo e tem taxas de erro muito baixas, muito menores do que os métodos convencionais de identificação microbiológica.
[0004] Versões especiais desses métodos podem ser utilizadas para identificar não somente a espécie do micróbio, mas, não raras vezes, também a subespécie e, em alguns casos, até mesmo as cepasespecíficas, se forem diferentes das mais frequentes em termos de massas ou intensidades e, por isso, proteínas detectáveis por es- pectrometria de massa. Para obter uma descrição mais detalhada, consulte o pedido de patente DE 10 2009 032 649 A1 (T. Maier and M. Kostrzewa, 2009, US 2011/0012016 A1; GB 2 471 746 A), por exemplo, que apresenta não somente uma explicação detalhada do método, mas também uma pesquisa de identidade mais refinada.
[0005] A identificação de micróbios desempenha um papel especi al ao lidar com doenças infecciosas, particularmente uma sépsis. Nesse caso, com a finalidade de aplicar o tratamento médico correto imediatamente,é importante ser capaz de identificar muito rapidamente a espécie de patógeno. Identificação por espectrometria de massa foi experimentada e testada também nesses casos, e está a caminho para ganhar aceitação em laboratórios clínicos e microbiológicos.
[0006] No campo da medicina, no entanto, há não somente o pro blema da rápida identificação, mas também o problema de detecção de resistências aos antibióticos comumente utilizados. Sem conhecer as resistências, o controle rápido da doença não é possível. Portanto, é necessário não apenas fazer uma rápida identificação, mas também determinar e caracterizar prontamente as resistências dos microrganismos. Algumas espécies de micróbios são conhecidas por serem quase totalmente resistentes a determinados antibióticos, deste modo não há razão para determinar a resistência após uma identificação precisa. Na maioria dos casos, no entanto, uma espécie tem cepas que não são resistentes, outras com pouca resistência e há, particularmente, outras ainda, altamente resistentes e com resistências diferentes para diferentes tipos de antibióticos. Por essa razão, é essencial determinar o tipo e o poder da resistência.
[0007] Parece óbvio utilizar espectrômetros de massa, não somen te para identificação taxonômica, mas, além disso, para determinar as resistências de micróbios, especialmente bactérias, a certos antibióticos. No entanto, essa tarefa tem provado ser muito difícil. Embora as resistências devam ser expressas pela presença de proteínas novas ou modificadas, até agora não há provas que seja possível identificá- las diretamente no perfil de proteínas medidas por espectrometria de massa. Afinal, de centenas ou mesmo milhares de proteínas dos micróbios, apenas de 40 a 80 são medidas no espectro de massa. A resistência, portanto, deve ser determinada indiretamente. Uma primeira tentativa para determinação de resistência é apresentada no documento DE 10 2006 021 493 B4 (V. Govorun and J. Franzen; GB 2 438 066 B; US 2008/0009029 A1); porém esse método até agora não ganhouaceitação. O método baseia-se essencialmente em uma alteração nos perfis das proteínas, provocada pela morte celular após a adição de antibióticos, ou na determinação de uma cessação do crescimento em comparação aos micróbios resistentes de referência.
[0008] A resistência antibiótica identifica características de micror ganismos (aqui, predominantemente bactérias) que lhes permitem enfraquecer ou neutralizar completamente o efeito de substâncias com atividade antibiótica. As resistências são agora generalizadas; nos EUA aproximadamente 70% dos germes infecciosos adquiridos em hospitais são resistentes a pelo menos um antibiótico. Os pacientes são frequentemente infectados com cepas de bactérias resistentes a diversos antibióticos (resistência múltipla). Os supergermes são os Staphylococcus aureus resistentes à meticilina, conhecido pela sigla MRSA, as espécies do gênero Pseudomonas, a Escherichia coli com resistência ESBL e a Mycobacterium tuberculosis. Avaliações realizadas pelo Centro de controle e prevenção de doenças CDC (Center for Disease Control and Prevention) consideram que dois milhões de infeçõesforam adquiridas em hospitais nos EUA em 2004, resultando em aproximadamente 90.000 mortes, quantidade muito maior do que o número de mortes provocadas por acidentes de trânsito, domésticos ou industriais.
[0009] Na utilização diária, entende-se geralmente pelo termo an tibióticos, medicamentos ou produtos farmacêuticos para o tratamento das doenças infecciosas bacterianas. O grande sucesso dos antibióticos na medicina começou com a penicilina. O sucesso da penicilina, e também o aparecimento das primeiras resistências, levou os pesquisadores a procurar e constatar muitos outros antibióticos: estreptomi- cina, cloranfenicol, aureomicina, tetraciclina e muitos outros. A maioria dos antibióticos conhecidos hoje é derivada de substâncias naturais. Coloquialmente, a penicilina é hoje em dia sinônimo de antibióticos.
[00010] Penicilina é um antibiótico e-lactâmico. Os β-lactamas agem ligando-se às proteínas carreadoras de penicilina (PBP), uma transpeptidase de peptidoglicano responsável pela formação das cadeias de peptídeos que fortalecem as paredes celulares. As cadeias entre as β-lactamas e as PBP fazem com que as PBP se tornem ineficazes. A falta de quantidades suficientes de PBP eficazes provoca lesões na parede da célula quando as bactérias estão crescendo; assim, a membrana perde o controle de sua permeabilidade e já não pode regular a concentração de citoplasma. Depois de um curto espaçode tempo a bactéria torna-se incapaz de viver. Em condições extremas, é possível observar em laboratório as células de bactérias "estourarem" literalmente. Essa é a maneira como β-lactamas agem como bactericidas.
[00011] Desde as primeiras aplicações da penicilina, as bactérias desenvolveram cada vez mais diferentes tipos de resistências. Um tipo importante de resistência bacteriana aos e-lactâmicos consiste na formação de enzimas (β-lactamases), que abrem cataliticamente o anel e—lactâmico por hidrólise, e assim torna-o ineficaz. Atualmente são conhecidas mais de 340 variantes de β-lactamases, formadas por muitos tipos de bactérias. Elas podem ser divididas em diferentes categorias de acordo com sua estrutura geral ou como agem. A informação genética para a síntese da enzima, que é inicialmente produzida por mutações, é transmitida por cromossomos ou plasmídeos. As informações plasmidiais podem ser transferidas entre bactérias por vários mecanismos, mesmo por contato entre bactérias de espécies diferentes ("transferência horizontal"). Dependendo da ação das β-lactamases, é feita uma distinção entre penicilinases e cefalosporinases, porém existem ainda outras categorias. O efeito catalítico dessas enzimas faz com que uma pequena quantidade de β-lactamases seja suficiente para destruir grandes quantidades de antibióticos e-lactâmicos.
[00012] Hoje há um grande número de derivados de antibióticos β- lactâmicos, incluindo diversas penicilinas (benzilpenicilinas, penicilinas orais, aminopenicilinas, isoxazolilpenicilinas, ureidopenicilinas), cefa- losporinas, monobactamas e carbapenemas. Essas são geralmente convertidas em um derivado com grupos químicos maiores com a finalidade de impedir estericamente as β-lactamases. β-lactamases de espectro estendido (ESBL), por sua vez, podem clivar uma ampla variedade de antibióticos e-lactâmicos. As ESBL formaram-se inicialmente por pontos mutação de uma β-lactamase. Os genes para as ESBL estão nos plasmídeos, que podem ser transferidos horizontalmente de bactéria para bactéria.
[00013] Bactérias produtoras de ESBL são resistentes às penicilinas, cefalosporinas (gerações 1-4) e monobactamas. A Escherichia coli e a Klebsiella (bactérias Gram-negativas) são as bactérias mais comuns produtoras de genes ESBL, porém microbiologistas estão assistindo a rápida propagação do mecanismo de resistência ESBL com grande preocupação. Além da resistência do Staphylococcus aureus à meticilina (MRSA), ESBL é uma das preocupações que mais afligem a pesquisa sobre infecções.
[00014] Inibidores de β-lactamase são uma ferramenta contra β- lactamases, sendo administrados juntamente com e-lactâmicos para enfraquecer o efeito das β-lactamases que estão presentes nas bactérias. Combinações consagradas são ácido clavulânico + amoxicilina, sulbactam + ampicilina, tazobactam + piperacilina. Nem todas as combinações têm o efeito ideal. Essas ferramentas devem ser usadas somente depois de uma criteriosa identificação das bactérias e criteriosa determinação de sua resistência, visto que pode-se esperar que muito rapidamente elas também tornem-se ineptas.
[00015] Nas décadas de 1970 e 1980 ainda havia uma grande atividade de pesquisa no campo de antibióticos. Embora os antibióticos estejam entre os medicamentos mais comumente prescritos no mundo, no momento atual o desenvolvimento de novos antibióticos diminuiu consideravelmente; com uma fatia de mercado de 13%, eles formam o maior segmento específico de produtos farmacêuticos que usamos. Das aproximadamente 8.000 substâncias antibióticas conhecidas hoje, apenas por volta de 80 são usadas terapeuticamente, especialmente em função dos efeitos colaterais, mas também em função dos custos de aprovação. Na Alemanha, em 2005, de acordo com o Instituto Federal Alemão de Medicamentos e Dispositivos Médicos (BfArM), um total de 2.775 antibióticos foi aprovado, porém esse número cobre apenas cerca de 80 substâncias antibióticas.
[00016] Com o passar do tempo, lidar com o problema de microrganismos resistentes a antibióticos como bactericidas ou fungicidas, está se tornando cada vez mais imperativo. Por um lado, há a velocidade com que microrganismos formam resistência a diferentes tipos de antibióticos; por outro lado, cada vez menos novos antibióticos para aplicações médicas estão sendo desenvolvidos. Como muitos novos antibióticos devem ser retirados do mercado após um curto espaço de tempo devido à ineficácia, é cada vez mais difícil e menos rentável para os laboratórios farmacêuticos investirem significativamente no desenvolvimento de novos antibióticos. De acordo com a OMS, entre 1990 e 2005 apenas três novas substâncias antibióticas ativas foram lançadas, em comparação com dez entre 1940 e 1950 e cinco entre 1971 e 1980.
[00017] As razões para o rápido desenvolvimento de resistências são múltiplas: prescrição irresponsável de antibióticos, mesmo quando não há necessidade; tratamentos com uso de bactericidas irresponsavelmente interrompidos antes do agente infeccioso ser completamente exterminado; consumo irresponsável, e muitas vezes puramente preventivo, na agricultura e na pecuária. Todas essas práticas influem na seleção e propagação das espécies resistentes de micróbios em comparação com as espécies não resistentes.
[00018] Celebrados em meados do século passado como a grande esperança na luta contra doenças infecciosas, os antibióticos estão se tornando rapidamente uma ferramenta ineficaz. A única esperança de evitar isso é por meio de administrações dirigidas com tratamentos que devem ser inteiramente concluídos, o que exige a identificação rápida dos patógenos infecciosos, bem como a identificação rápida de suas resistências específicas para os diferentes tipos de antibióticos.
[00019] O objetivo da invenção é fornecer um método por meio do qual uma resistência a diferentes tipos de antibióticos e-lactâmicos, associada à produção de β-lactamase por micróbios, bactérias em es- pecial, possa ser medida por espectrometria de massa de forma simples e rápida.
[00020] A invenção fornece um método por meio do qual uma resistência microbiana em função de β-lactamases pode ser medida muito fácil e rapidamente com um espectrômetro de massa. O método determina a resistência das bactérias algumas horas depois de os micróbios serem associados a um substrato apropriado, um antibiótico β- lactâmico ou um derivado e-lactâmico adaptado, por uma medição direta por espectrometria de massa do ataque hidrolítico de β- lactamases no substrato. O efeito catalítico de β-lactamases produzidas por bactérias sobre o substrato faz com que o anel e-lactâmico se rompa por hidrólise. A quantidade de substrato é diminuída e o produto da clivagem hidrolítica aparece no lugar, sua massa sendo mais pesada em 18 unidades de massa atômica.
[00021] A reação da clivagem enzimática é bastante rápida; desde que não seja impedida pela falta gradual de substrato, dura aproximadamente entre um e cem milissegundos por reação molecular, com diferenças características para diferentes β-lactamases. A medição da velocidade de reação fornece informações iniciais sobre o tipo e poder das β-lactamases.
[00022] Em princípio, a medição pode ser realizada com qualquer espectrômetro de massa, porém é especialmente favorável utilizar o mesmo espectrômetro de massa por tempo de voo MALDI que foi utilizado para a identificação das bactérias. Visto que o processo MALDI (ionização e dessorção a laser assistida por matriz) para a ionização de substâncias na faixa inferior de massa de algumas centenas de unidades de massa atômica gera um fundo químico muito acentuado, é favorável utilizar substratos que se encontram em regiões com baixo fundo. Isso pode ser realizado por meio da produção de substratos adaptados com pesos moleculares entre 700 e 1200 unidades de massa atômica. Também é vantajoso aumentar a afinidade protônica dos substratos, com a finalidade de aumentar seu grau de ionização. No entanto, muitas vezes, é vantajoso ser capaz de utilizar concentrações mais elevadas do substrato para aumentar a sensibilidade. Para que um alto efeito bactericida de alta concentração não mate imediatamente as bactérias, os substratos podem ser adaptados de forma que seu efeito antibiótico, isto é, seu valor de MIC, seja relativamente pequeno. MIC é a "concentração inibitória mínima"para inibição por inibidores de β-lactamase na presença do antibiótico correspondente, e serve como uma medida da força da resistência e da força do antibiótico.
[00023] Uma modalidade vantajosa de um substrato recebe por ligação covalente uma etiqueta de seis histidinas (6*His-tag) a uma β- lactama, por exemplo. Uma 6*His-tag que consiste em uma cadeia de seis moléculas de histidina, aumenta a massa molecular em aproximadamente 800 unidades de massa atômica, melhora a afinidade pro- tônica e torna possível a extração do substrato e seu produto de clivagem na forma pura de reação líquida. Essa extração pode, por exemplo, ser efetuada com o auxílio de esferas magnéticas disponíveis no mercado, em que há um quelato carregado com íons de níquel que se liga reversivelmente a uma 6*His-tag. A preparação da amostra MAL- DI pode ser então realizada, cuja substância matriz contém o substrato remanescente e seu produto de clivagem em uma forma altamente enriquecida e purificada, permitindo, portanto, uma medição muito sensível.
[00024] É possível, especialmente, desenvolver ensaios específicos de resistências variadas, com a introdução de diversos tipos de substratos, com os diferentes substratos sendo adaptados de tal maneira e introduzidos em tais concentrações, que seu padrão de quebra possi- bilite a identificação da categoria e também a força da ação das β- lactamases. Os substratos podem imitar a acessibilidade ao anel β- lactâmico de diferentes grupos de antibióticos, por exemplo.
[00025] O espectro de massa superior na Figura 1 exibe o efeito da mistura da ampicilina, com massa molar de 349,41 unidades de massa atômica, a uma suspensão de E. coli da cepa DH5alfa que não tem nenhuma resistência. Não há nenhuma quebra, seja da ampicilina (nesse caso, massa de 350 unidades de massa atômica), ou do sal de sódio de ampicilina (massa de 372 unidades de massa atômica). O espectro de massa inferior, por outro lado, exibe o efeito de uma cepa de E. coli com mecanismo de resistência ESBL à ampicilina e ao sal de sódio: ambos são quebrados, resultando em produtos de hidrólise de massas 368 e 390 unidades de massa atômica.
[00026] A invenção fornece um método muito simples e rápido de determinar resistências microbianas com base na produção de β- lactamases por micróbios, especialmente por bactérias.
[00027] O método basicamente adiciona um ou mais substratos adequados a uma suspensão de bactérias. Os substratos podem ser antibióticos e-lactâmicos ou derivados de e-lactâmicos, de preferência adaptados. Se as bactérias têm uma resistência de β-lactamase, pelo menos um substrato é quebrado pela β-lactamase em condições adequadas de incubação no período de minutos a horas, com abertura por hidrólise do anel e-lactâmico. Essa quebra hidrolítica do substrato pelasβ-lactamases pode ser medida diretamente por espectrometria de massa. A quantidade de substrato diminui e é substituído pelo produto da clivagem hidrolisada, cuja massa é de 18 unidades de massa atômica mais pesada.
[00028] Na Figura 1, essa quebra, que ocorre apenas quando existe uma resistência, é mostrada usando o antibiótico e-lactâmico ampicili- na em dois espectros de massa. O espectro de massa superior mostra o resultado da mistura da ampicilina, com uma massa molar de 349,41 unidades de massa atômica, a uma suspensão de E. coli da cepa DH5alfa. Essa cepa não tem resistência alguma. Portanto, nenhuma quebra, seja da ampicilina (visível aqui na massa de 350 unidades de massa atômica), ou do sal sódico de ampicilina (com massa de 372 unidades de massa atômica) é observada. O espectro de massa inferior, por outro lado, exibe o efeito de uma cepa de E. coli com mecanismo de resistência ESBL à ampicilina e ao sal de sódio: ambos são quebrados, resultando em produtos de hidrólise de massas 368 e 390 unidades de massa atômica.
[00029] A ampicilina é um produto farmacêutico semissintético de atividade antibiótica pertencente ao grupo dos antibióticos β- lactâmicos (penicilinas). É conhecido como um antibiótico de largo espectro em função de sua eficácia contra patógenos Gram-positivos e alguns bastonetes Gram-negativos. Em termos químicos, a ampicilina é uma aminopenicilina.
[00030] Como com todos os antibióticos e-lactâmicos, o efeito bac- tericida (que destrói as bactérias) da ampicilina tem como base o bloqueio de uma enzima, a D-alanina transpeptidase, que está presente em diferentes bactérias em diferentes formas. Essa enzima é necessária para a formação de uma parede celular nova e firme na fase da divisão ou crescimento das bactérias. Essas transpeptidases também são chamadas de proteínas ligadoras de penicilina (PBP). O bloqueio ocorre por acoplamento, com o anel e-lactâmico atuando na estrutura receptora por ter o padrão de acoplamento. O acoplamento impede a nova síntese de paredes celulares rígidas. As células são, portanto, incapazes de dividir, mas continuam a viver por um tempo até que seu crescimento resulte em um número suficientemente elevado de lesões da parede celular para provocar a morte da célula. Contudo, a divisão e crescimento das células humanas não são impedidos, pois as células humanas possuem apenas uma membrana celular, mas sem parede celular e, portanto, nenhuma transpeptidase correspondente.
[00031] No exemplo exibido na Figura 1, 10 microlitros de solução de ampicilina com uma concentração de 10 miligramas por mililitro de água foram adicionados em um tubo de ensaio de Eppendorf. Três colônias da bactéria a ser testada foram escolhidas, e foram colocadas de volta em suspensão nos 10 microlitros de solução de ampicilina. Os vasos foram incubados durante três horas a 37°C sob agitação. Após a incubação, eles foram centrifugados por dois minutos em 13.000 rotações por minuto, para separar as células. A ampicilina restante e o produto de reação hidrolisada estão agora no sobrenadante.
[00032] Em princípio, a medição pode ser realizada com qualquer espectrômetro de massa, porém é especialmente favorável ser capaz de utilizar o mesmo espectrômetro de massa por tempo de voo MALDI que foi utilizado para a identificação das bactérias. Para este fim, 1,5 microlitro do sobrenadante foi aplicado sobre o suporte de amostra es- pectrométrica de massa. Após a secagem, as amostras foram cobertas com um microlitro de uma solução matriz. A matriz usada foi o ácido α-ciano-4-hidroxicinaminico (HCCA) em uma concentração de 10 miligramas por mililitro em uma mistura de água, 50% de cianeto de metilo acetonitrilo e 2,5% de ácido trifluoroacético. Após a secagem, um espectro de massa é adquirido a partir desse preparo no espec- trômetro de massa por tempo de voo MALDI da forma habitual.
[00033] A concentração de ampicilina utilizada como substrato para este exemplo é extraordinariamente alta, mais de mil vezes maior do que seria necessário para um tratamento terapêutico. O fato dessa quantidade de ampicilina ser quebrada, demonstra a extraordinária eficácia das β-lactamases de espectro estendido (ESBL). Dificilmente pode-se supor que as bactérias sobreviverão a essa alta concentração por um longo tempo; no entanto, a pequena quantidade de β- lactamase expelido durante seu tempo de vida é suficiente para quebrar cataliticamente a grande quantidade de substrato. A alta concentração foi escolhida de modo que os sinais possam ser observados claramente acima do alto fundo químico que há nesse intervalo de massa. A concentração poderia ser um fator 100 vezes menor se um substrato no intervalo de aproximadamente 800 a 1000 unidades de massa atômica pudesse ser utilizado, realizáveis por substratos adaptados com alto peso molecular.
[00034] Também é vantajoso aumentar a afinidade protônica dos substratos, com a finalidade de aumentar o rendimento de ionização. As β-lactamas com suas baixas massas não têm uma afinidade protô- nica alta; portanto, apenas pequenas proporções delas são ionizadas no processo de ionização. A sensibilidade pode ser aumentada em 10 vezes, inserindo aminoácidos com afinidade protônica alta, por exemplo.
[00035] No entanto, muitas vezes é vantajoso utilizar concentrações mais altas de substrato para aumentar ainda mais a sensibilidade. Porém, para evitar que essas bactérias com β-lactamases menos fortes sejam mortas imediatamente por uma elevada eficácia bactericida, os substratos podem ser adaptados de maneira que seu efeito antibiótico, isto é, seu valor MIC, seja relativamente pequeno. A eficácia do antibiótico geralmente já diminui com o aumento do tamanho das moléculas, pois elas são impedidas significativamente de penetrar através dos poros na parede celular em bactérias.
[00036] Além disso, é vantajoso adaptar os substratos de maneira que elas possam ser completa e facilmente extraídos do sobrenadan- te. Para este fim, podem ser providenciados grupos de âncora em que parceiros imobilizados possam ser utilizados para extraí-las. O aco- plamento de um grupo biotina ao substrato é descrito aqui como um primeiro exemplo. O substrato e o produto de degradação podem ser extraídos do sobrenadante pela estreptavidina que está imobilizada nas paredes. Desde que a ligação entre a biotina e a estreptavidina é reversível, o substrato e seu produto de degradação podem ser processados e medidos após serem enriquecidos da maneira conhecida. Receptáculos adequados cujas paredes interiores são revestidas com estreptavidina são comercialmente disponíveis, assim como as micro- partículas revestidas, como por exemplo as esferas magnéticas.
[00037] Uma modalidade particularmente vantajosa de um substrato extraível é dada pela ligação covalente de uma 6*His-tag a uma β- lactama, por exemplo. Uma 6*His-tag é composta por seis moléculas de histidina, que aumenta o peso molecular em aproximadamente 800 unidades de massa atômica, melhora a afinidade protônica e proporciona um processo fácil para a extração do substrato e seu produto de clivagem do líquido da reação. Essa extração pode ser realizada, por exemplo, com esferas magnéticas. Esferas magnéticas revestidas com quelatos são comercialmente disponíveis. Esses quelatos podem ser carregados com íons de níquel. Os íons de níquel se ligam reversivel- mente às 6*His-tags. Isso torna fácil a realização de um preparo de amostra MALDI da forma conhecida, com as amostras contendo apenas o substrato remanescente e seu produto de clivagem em uma forma purificada, fixos em cristais da substância matriz, o que permite uma medida muito sensível.
[00038] A reação enzimática de clivagem de β-lactamases é bastante rápida; desde que não seja impedida pela falta gradual de substrato, leva aproximadamente entre um e cem milissegundos por reação molecular. As diferenças características nas velocidades de reação de diferentes β-lactamases podem ser medidas, e fornecem informações sobre o poder da β-lactamase e, portanto, também indicam o tipo de β- lactamase. No caso mais favorável, a velocidade de reação pode ser medida em um espectro de massa único. Se a incubação for interrompida depois de exatamente meia hora, por exemplo, a relação entre o substrato remanescente e o produto de degradação pode ser usada para fazer a leitura da velocidade de reação se o método estiver calibrado em conformidade.
[00039] Uma outra modalidade vantajosa consiste em usar diversos substratos diferentes, adaptados em um único ensaio de resistências variadas. Os substratos podem, por exemplo, ser fornecidos com diferentes tipos de impedimentos estéricos ao ataque de β-lactamases, da forma como estão presentes em diferentes antibióticos. Do padrão da quebra e sua velocidade pode-se tirar conclusões sobre o tipo de β- lactamases e a eficácia de diferentes tipos de antibióticos. Usando substratos adequados e escolhendo as concentrações corretas, é possível determinar quão eficazes são as β-lactamases. Um exemplo simples para a quebra simultânea de dois substratos (ampicilina e seu sal de sódio) está representado na Figura 1, embora nenhum substrato preparado sob medida com diferentes resistências contra a quebra tenha sido utilizado nesse caso.
[00040] Em particular, a medição da resistência microbiana pode ser utilizada para os micróbios que podem ser obtidos em forma pura a partir do sangue ou de culturas de sangue, como explicado no DE 10 2009 033 368 A1 (T. Maier; WO 2011/006911 A3), por exemplo.
[00041] Em vez de uma ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) em um espectrômetro de massa por tempo de voo MALDI, obviamente é possível utilizar outros tipos de ionização, como ionização por eletropulverização (ESI) e outros tipos de espectrôme- tros de massa, como, por exemplo, o espectrômetro de massa por tempo de voo com injeção de íon ortogonal (OTOF), espectrômetros de massa de ressonância ciclotrônica de íons (ICR-MS), espectrôme- tros de massa eletrostáticos Kingdon, ou em particular, espectrômetros de massa de armadilha de íons de baixo custo, para analisar a quebra do substrato. Especialistas da área estão familiarizados com todos esses espectrômetros de massa e métodos de ionização, assim, evitaremos aqui explicações detalhadas.
[00042] Uma opção particularmente adequada para medir a quebra do substrato e o aumento do produto de quebra é um espectrômetro de massa triplo quádruplo, que essencialmente faz somente uma medida comparativa do substrato e do produto de quebra. Esse espec- trômetro de massa triplo quádruplo pode alcançar uma sensibilidade extremamente elevada, de forma que quantidades muito pequenas de substrato são suficientes para esse método.
[00043] A fim de simplificar a determinação da resistência, alguns ou todos os materiais necessários podem ser fornecidos em pacotes estéreis de consumíveis (kits). Em particular, pacotes de consumíveis podem conter quantidades exatas de substratos adaptados e, se necessário, também as substâncias matrizes correspondentes. Além disso, eles podem conter suportes descartáveis de amostra de espectro- metria de massa MALDI. Os pacotes de produtos de consumíveis podem ser produzidos comercialmente.
[00044] Os espectros de massa podem ser avaliados visualmente e também por meio de programas de computador adequados. É possível desenvolver e utilizar programas para a avaliação dos ensaios de resistências variadas. Esses programas podem determinar imediatamente o tipo e a força da resistência de β-lactamase dos micróbios a partir do padrão de quebra, e apresentar os tratamentos sugeridos.
Claims (14)
1. Método para determinação uma resistência e-lactâmica microbiana, com base na produção de β-lactamases pelos micróbios, caracterizado pelo fato de que os micróbios são colocados junto a um substrato e a quebra enzimática do substrato pelas β-lactamases dos micróbios é medida por espectrometria de massa por meio da aquisição de um espectro de massa do substrato remanescente e do produto de degradação.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas do substrato contêm um anel β- lactâmico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o substrato é um antibiótico e-lactâmico ou um derivado e-lactâmico.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato apresenta um peso molecular entre 700 e 1200 unidades de massa atômica.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato apresenta apenas um efeito antibiótico fraco.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as moléculas do substrato apresentam um grupo âncora, que pode ser usado para extraí-las das soluções.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o grupo âncora é o grupo biotina ou uma 6*His-tag.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quebra dos diversos tipos de substrato é medida simultaneamente.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que diferentes tipos de substrato são adaptados de modo que seu padrão de quebra permita identificar as diferentes categorias de β-lactamases.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que diferentes substratos em torno do anel e-lactâmico imitam as formas estéricas de diferentes antibióticos.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as velocidades de reação da quebra dos substratos são medidas.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os micróbios foram obtidos a partir de sangue ou de uma cultura de sangue.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as quantidades de substrato remanescentes e seu produto de quebra são medidas por espectrometria de massa com ionização e dessorção a laser assistida por matriz.
14. Método para determinação da resistência e-lactâmica microbiana, com base na produção de β-lactamases pelos micróbios, caracterizado pelo fato de que compreendendo as seguintes etapas: (a) inclusão de micróbios em uma solução de pelo menos um substrato, que pode ser quebrado por β-lactamases, (b) incubação da solução a uma temperatura específica por um tempo determinado, (c) separação da solução com o substrato remanescente e seu produto de quebra dos micróbios, e (d) aquisição de um espectro de massa da solução.
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