CN111929132B - 一种交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂方法。所述基质喷涂方法包括如下步骤:将生物组织制备成组织切片,并置于导电玻片的导电面;在高频振动喷雾器中加入基质溶液;涂覆组织切片的导电玻片贴附于交变电场装置的下电极板上;采用交流电源向两个电极板施加交流电压,即在两个电极板之间形成交变电场,电场交替变化过程中同时进行基质喷涂;采用激光直接照射扫描切片,经质量分析器分析后被质谱检测器检测并记录,然后重构呈现待测分子在组织表面的空间分布图像。采用本发明方法,可最大限度地避免组织表面待测分子空间信息的改变或丢失,提供内源性分子丰度及原位空间分布信息,而且有助于深刻理解并揭示内源性分子的功能及动态变化。
Description
技术领域
本发明涉及一种交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂方法,属于生物技术领域。
背景技术
基质辅助激光解吸/电离质谱成像(Matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,MALDI-MSI)是目前发展较为成熟的成像技术,该技术无需复杂样本前处理,通过基质辅助实现待测分子离子化,离子化过程中产生较少的离子碎片,可实现对较宽质量范围内多种化合物分子的快速分析。目前MALDI-MSI普遍适用于生物组织表面蛋白质、多肽、脂类、能量代谢产物等多种生物分子原位成像表征。尽管在过去的20年里MALDI-MSI技术取得了巨大的进步,但因单个细胞或组织中存在成千上万的生物分子,因此目前得以原位检测和成像的内源性分子仍然非常有限。对于MALDI-MSI技术,基质选择、晶体参数和合适的沉积方法是提升MALDI-MSI图谱质量的关键因素,并与实现高灵敏度、重现性和改进可视化密切相关。因此基于MALDI-MSI的技术研究主要集中于样品制备体系的建立以及优化方面。近年来,随着无溶剂基质干喷涂、基质升华、基质喷涂前的组织预洗、电场辅助基质喷涂等新技术的应用,样品制备优化取得了显著进展。但MALDI-MSI技术的发展与完善还有很长的路要走。
通常,在MALDI-MSI实验中,基质晶体大小对MALDI-MSI空间分辨率有很大的影响。单个晶体尺寸较大容易造成基质结晶均一性不理想(晶体与晶体之间形成空隙,不可避免的会造成脉冲式激光在采集样本时,采集到晶体之间的空隙,从而产生假阴性或假阳性的结果)。因此,在MALDI-MSI样品前处理过程中基质喷涂或包埋方法至关重要,已是近年来各国科研工作者和质谱仪器厂商研究的热点之一。基质喷涂方法主要包括:喷雾法和点样法。两种方法相比,喷雾法在喷雾过程中易产生较大液滴且干燥时间较长,在喷涂与干燥循环交替过程中将导致组织切片表面过湿,从而引起组织切片表面待测分析物位移,另外基质结晶大小、基质层厚度以及同质性易因个人操作而受一定影响。点样法一般获得的基质液滴体积约为80-150皮升(picoliter,pL),可形成直径约为150微米(micron,μm)左右的圆形基质结晶区域,在一定程度上限制了被分析物分子位移现象,但基质斑的大小和间距将导致成像质量较差。目前,较为成熟的基质覆盖方法主要包括手动气喷雾(Airbrush)、压电高频振动喷雾(ImagePrep)、声控微滴喷射、化学打印机喷射和基质升华装置(Sublimation)等。其中Airbrush作为最早应用于MALDI基质喷涂的技术,其原理与常规空气压力喷雾器相似:在有限的空间内,利用气压将基质溶液以相对较小的液滴垂直或倾斜一定角度喷涂于组织切片表面。尽管该喷涂方法操作简便,但因个人操作不同易导致喷涂基质层厚度、均匀度不一致且重复性较差,以及在喷涂干燥循环过程中易使基质与组织表面分子形成的共结晶产生位置迁移。ImagePrep是目前较为成熟的商业化基质喷涂技术,其主要原理是通过电压的改变调节金属薄片高频振动使基质溶液以较小液滴水平喷出,在重力作用下自由沉降于水平放置的组织切片表面,最终基质小液滴与组织切片表面待测分子形成共结晶。虽然该基质喷涂系统在自动化方面具有一定优势,但基质液滴与组织切片表面待测分子形成的共结晶仍有位移现象,且由于水平喷涂样品组织切片表面近端与远端均匀度、基质层厚度存在一定差异,从而对MALDI-MSI图像质量产生一定影响。声控微滴喷射器则是通过超声波装置发射强有力的声波能量促使基质溶液表面产生形变,当声波能量到达阈值时微加电压使基质小液滴脱离基质溶液表面由下而上垂直喷射至待测样品组织表面并与组织表面分子形成共结晶。化学打印喷射器基本原理与喷墨打印机类似:将基质溶液以小液滴形式经多喷嘴按一定矩阵点逐点喷射至待测样品组织切片表面,该技术可预选特定区域连续式或随机式喷射基质液滴可对喷涂点具体位置进行精确控制。尽管声控微滴喷射与化学打印喷射装置可精准控制基质液滴喷射至待测组织切片上表面位置,从而有效降低了基质喷涂过程中共结晶位移现象,但以上两种基质喷涂技术在喷涂时易生成较大基质液滴且液滴大小不均一,因此基质液滴与组织切片表面待测分子将形成较大且均匀性较差的共结晶,从而对MALDI-MSI图像分辨率产生一定影响。在众多基质包埋新技术中,基质升华是获得基质晶体尺寸最小且匀质性较好的主要方法。然而,基质升华在样品制备过程中受限于自身特性,需要特定的基质和升华条件,包括基质用量以及升华的温度和时间,导致该技术无法广泛应用于MALDI-MSI研究中。因此,在现有传统方法基础上对MALDI-MSI基质喷涂方法进行全面系统的研究,开发一种更有利于产生尺寸小且均匀的基质沉积喷涂技术是非常有意义的。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型MALDI-MSI基质喷涂方法,该方法提高了基质喷涂技术的重现性,能够获得颗粒较小、均匀分布的共结晶,并最大限度地避免组织表面待测分子空间信息的改变或丢失。
本发明所提供的交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂方法,包括如下步骤:
(1)将生物组织制备成组织切片,并置于导电玻片的导电面上;
(2)在高频振动喷雾器中加入基质溶液;涂覆所述组织切片的所述导电玻片贴附于交变电场装置的下电极板上(优选中间位置),所述导电玻片的非导电面与所述下电极板贴合;
(3)采用交流电源向两个所述电极板施加交流电压,即在两个所述电极板之间形成交变电场,电场交替变化过程中同时进行基质喷涂;
(4)采用激光直接照射扫描切片,经质量分析器分析后被质谱检测器检测并记录,然后重构呈现待测分子在组织表面的空间分布图像。
上述的基质喷涂方法中,步骤(1)中,所述组织切片的厚度为8μm~20μm,优选12μm左右;
优选在冷冻切片机内制备所述组织切片;
所述生物组织包括动物组织、植物组织和微生物组织及其他材料,本发明以动物组织小鼠脑、肝以及植物组织南方红豆杉种子为例说明本发明方法的喷涂效果,但不限于列举组织,对其他动植物、微生物组织具有广泛适用性(如大豆、水稻、岩青兰、玲玲香青、华北蓝盆花、小鼠肾脏、蜜蜂肠、脑、水蛭及癌变组织等)。
所述导电玻片为ITO导电玻片。
上述的基质喷涂方法中,步骤(2)中,所述基质溶液可为本领域常规基质的溶液,本发明以2-巯基苯并噻唑溶液和芥子酸溶液为例说明本发明方法可适用于检测生物小分子端及大分子端化合物,如脂类、多肽及蛋白质等;
所述基质溶液的浓度可为10~25mg/ml;
2-巯基苯并噻唑溶液的浓度可为10~14mg/ml,优选12mg/ml;
所述芥子酸溶液的浓度可为15~25mg/ml,优选20mg/ml;
所述2-巯基苯并噻唑溶液由2-巯基苯并噻唑溶于甲醇、水和甲酸的混合物中得到,所述甲醇、所述水与所述甲酸的体积比优选为80:18:2;
所述芥子酸溶液由芥子酸溶于乙腈、水和三氟乙酸的混合物中得到,所述乙腈、所述水与所述三氟乙酸的体积比优选为50:49.8:0.2。
上述的基质喷涂方法中,步骤(3)中,喷雾效率很大程度上受喷涂高度、干燥时间和喷涂时间因素影响,具体参数经正交试验优化并分析后,所述高频振动喷雾器的喷头至所述下电极板的垂直距离为10~25cm,每喷涂一个循环干燥10~30s,一个喷涂循环为0.5~3s,进行60~80个循环,最佳优化结果为:20cm喷涂高度、20s干燥时间和1s喷雾时间,该结果进一步获得验证。即设定喷雾器喷头至下电极板垂直距离为20cm,每喷涂一个循环干燥20s,一个喷涂循环为1s,并进行60~80循环。阳极的工作电压120V,阴极工作电压60V,一个周期是阳极交变电压从正的最大值(120V)到零,阴极交流电压从零到正的最大值(60V),电压反转每0.5s发生一次;电压反转前,阳极电压为120V,阴极电压为0V;电压反转后,阳极电压变为0V,阴极电压变为60V。交变电压加载优选方式具体如下:1、正离子模式时,上电极板(阴极)加载电压0V,下电极板(阳极)加载电压+120V,持续0.5s;然后上电极板(阴极)加载电压+60V,下电极板(阳极)加载电压0V,持续0.5s;完成上述电压转变加载为一个周期,如此循环往复,不断进行周期性电压加载。2、负离子模式时,上电极板(阳极)加载电压+120V,下电极板(阴极)加载电压0V,持续0.5s;然后上电极板(阳极)加载电压0V,下电极板(阴极)加载电压+60V,持续0.5s;完成上述电压转变加载为一个周期,如此循环往复,不断进行周期性电压加载。
本发明方法中,MALDI-MSI采用SmartBeamTM-Ⅱ固体激光器,其在355nm和2000Hz模式下,所有质谱均在质荷比(m/z)200~3500的质量范围内采集,数据采集大小为512kb/s。轮廓数据采集时,对于每个样本MALDI-MS记录了100次随机扫描累加(500次激光激发/扫描)。成像数据采集时,激光光栅步长(即,激光灼蚀点与点间的距离)为100μm,每个像素矩阵位置(即,每个激光灼蚀点)累加5次扫描(500次激光激发/扫描)。
本发明提供的交变电场耦合高频振动喷涂方法对MALDI基质具有很好的喷涂效果,基质结晶大小为2~4μm,且具有均一性,可在组织水平上同时获得样本表面大量分子组成、丰度及原位空间分布信息。
本发明方法中,交变电场在MALDI-MSI基质喷涂过程中主要用于产生交变电场,使高频振动喷雾器所喷涂基质在交变电场电场力的作用对组织表面分子进行反复微萃取,从而提高MALDI-MS对低丰度分子的高效检测。
本发明提供的基质喷涂方法采用高频振动诱导液滴喷射方法,与其它传统方法相比,操作简便易行,对基质本身理化性质要求较低,且能够达到传统方法不可比拟的基质晶体尺寸与均一性。此外,交变电场的应用,能够不断使内源性分子原位富集到组织表面,与基质形成共结晶,从而易于检测生物内源性分子原位分布并能够最大限度检测其数量。由于组织表面原位富集内源性分子增多,多种低丰度、难电离分子能够被较好地检测,因此,采用本发明方法,可最大限度地避免组织表面待测分子空间信息的改变或丢失,提供内源性分子丰度及原位空间分布信息,而且有助于深刻理解并揭示内源性分子的功能及动态变化。
附图说明
图1为本发明交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂方法的流程示意图。
图2为正交试验法优化喷涂条件设计及结果。
图3为正交试验法优化外加电场条件设计及结果。
图4为采用AEF-HFVAMC(本发明喷涂方法)、MCAEF和airbrush三种基质喷涂方法在正离子模式下对比鼠脑组织切片中低分子量化合物、脂质、蛋白的原位表征质谱图。
图5为采用AEF-HFVAMC(本发明喷涂方法)、MCAEF和airbrush三种基质喷涂方法对鼠脑分别进行成像对比图。
图6为采用AEF-HFVAMC(本发明喷涂方法)、MCAEF和airbrush三种基质喷涂方法在正离子模式下对比南方红豆杉种子组织切片中低分子量化合物、脂质、蛋白的原位表征质谱图。
图7为采用AEF-HFVAMC(本发明喷涂方法)、MCAEF和airbrush三种基质喷涂方法为分别对南方红豆杉种子成像对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、新型基质喷涂方法在动植物成像中的应用
一、试验材料
2-MBT、SA均购自北京百灵威科技有限公司。色谱级乙腈、色谱级甲醇、三氟乙酸、甲酸、苏木精和伊红(Hematoxylin-eosin staining,H&E),购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,密苏里州)。整个实验过程中使用的超纯水是从Millipore公司(美国)生产的milli-Q系统中获得。
电压可调电源供应器购自B&K Precision公司,型号为1672。Autoflex speed基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪购自德国布鲁克公司。
南方红豆杉种子取自江西省九江市。
大鼠大脑、大鼠肝脏经当地伦理委员会批准,按照标准程序从一只8周大的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,上海,中国)体内分离。所有组织标本均在液氮中快速冷冻。储存在-80℃,在进一步使用之前避免碎裂。
二、试验方法
1、大鼠肝脏,大脑,南方红豆杉种子切片制备
大鼠处死并解剖,处死方法为脊椎脱臼法,开颅取出全脑即可。随后剪开大鼠腹部,取出完整肝脏。
选取饱满的南方红豆杉种子,去壳。
将制备好的生物组织放入冷冻切片机内,在-20℃的条件下得到厚度为12μm的平行切片。
2、制备基质溶液
2-MBT(2-巯基苯并噻唑)加入到甲醇:水:甲酸混合溶液中(80:18:2,v/v/v)配制12mg/mL的2-MBT溶液。
SA(芥子酸)加入到乙腈:水:甲酸混合溶液中(50:49.8:0.2,v/v/v)配制20mg/mL的SA溶液。
3、交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂
如图1所示,本发明交变电场与高频振动相结合的MALDI-MSI基质喷涂方法的示意图,采用的喷涂装置包括电源供应器1、电路板2、高频振动雾化板3、电极板4和电极板5:在电极板5上放置有组织切片6,其中,组织切片6放置于ITO的导电面上,ITO的非导电面与电极板5接触,高频振动喷涂装置设置在电极板4与5之间且位于组织样品6的左上方,高频振动喷涂装置内含电路板,高频振动雾化板3。使用高频振动喷雾器将MALDI基质喷涂在组织切片上。
在高频振动喷雾器进行基质喷涂的整个过程中,组织切片被安装在喷涂了ITO的显微玻片导电侧。组织安装的导电玻片作为正极片或负极片平行放置在喷雾器腔内。在基质喷涂过程中,两个电极板由交流电源施加交流电压,形成两个极板4和5之间的交变电场。每个极板上的极性取决于随后的MS检测模式,在这一过程中,交变电场驱动的微萃取不断地使基体层丰富,并以一定的间隔反向进行。
本发明对基质喷涂参数进行了优化,优化试验设计如图2和图3所示,图2为正交试验法优化喷涂条件,测试了三个变量(喷涂高度、干燥时间和喷涂时间)以及每个变量的三个水平,检测到的结果是9个独立检测结果的平均数(n=3×3);图注a:喷涂高度即为喷口到下电极板的垂直距离。图3为正交试验法优化外加电场条件,测试了三个变量(阳极电压、阴极电压和转换时间)以及每个变量的三个水平。检测到的结果是9个独立检测结果的平均数(n=3×3);注:b即为阴阳极电压反转发生一次所需时间。经正交试验分析后将其设定为20cm的喷涂高度、20s的干燥时间和1s的喷雾时间。即设定喷雾器喷头至下电极板的垂直距离为20cm,每喷涂一个循环干燥20s,一个喷涂循环为1s,并进行60~80循环。阳极工作电压120V,阴极工作电压60V,一个周期是阳极交变电压从正的最大值(120V)到零,阴极交流电压从零到正的最大值(60V),电压反转每0.5s发生一次;电压反转前,阳极电压为120V,阴极电压为0V;电压反转后,阳极电压变为0V,阴极电压变为60V。
4、质谱数据分析及成像
Autoflex speed基质辅助电离质谱仪配有SmartBeamTM-Ⅱ固体激光器,在355nm和2000Hz模式下运行。所有质谱均在m/z 100~3500的质量范围内采集,数据采集大小为512kb/s。轮廓数据采集时,对于每个样本MALDI-MS记录了100次随机扫描累加(500次激光激发/扫描)。成像数据采集时,激光光栅步长(即,激光灼蚀点与点间的距离)为100μm,每个像素矩阵位置(即,每个激光灼蚀点)累加5次扫描(500次激光激发/扫描)。随后分析采用的是Bruker’s FlexImaging 4.1软件,用钢笔标记点,以确保激光在光谱采集时的正确定位。
5、成像对比实验
采用交变电场辅助基质喷涂方法(AEF-HFVAMC,即本发明喷涂方法)、MCAEF(一种新型电场辅助基质喷涂方法,是基于商业化、自动化基质喷涂技术ImagePrep的基础上,在基质喷涂仓内通过施加均匀电场来辅助基质喷涂(电场恒定没有周期性变化),并与组织表面分子形成大小均匀、匀质且高重复性的共结晶)以及airbrush(即手动气喷雾,其原理与常规空气压力喷雾器相似,在有限的空间内利用气压将基质溶液以相对较小的液滴垂直或倾斜一定角度喷涂于组织切片表面)对大鼠脑以及南方红豆杉种子进行对比实验,获得组织样品的质谱信息,最终通过质谱成像软件,获得组织的质谱成像图,如图4-图7所示。
6、对比结果比较
采用三种基质喷涂方法对大鼠脑以及南方红豆杉种子进行MALDI-MSI研究,结果如图4-图7所示。
由图4和图6可以看出,三种基质喷涂方法均可检测到生物组织中的内源性分子,但运用交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂技术得到的离子信号检测数量更多,信号峰强度更强,增强2~3倍左右,表明本发明方法具有较为广泛的适用性,低分子量化合物、脂质和蛋白质检测较其他两种技术均取得较好效果。
由图5和图7可以看出,交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂技术能够检测到低丰度分子并进行成像,显示出较高的对比度,另外两种技术则无法达到此效果,这意味着“微萃取”促进内源性分子大量扩散到基质晶体中,与基质分子形成共结晶。以便于接下来的激光解析离子化过程。
交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂技术适用范围广,动植物均可实现可视化,如图6和图7所示,交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂技术在红豆杉组织切片中显示出更好的内源性分子检测能力。低分子量化合物如2-异丙基-1,4-己二烯(m/z125.10),其空间分布在南方红豆杉种子胚乳部分能够更清晰地观察到,此外,与低分子量化合物的情况相同,由于使用了交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂方法,脂类和蛋白的检测以及空间可视化水平得到了显著提高。最后,在交变电场反复微萃取、高频振动产生小液滴的过程中,与其他两种方法相比没有产生位移现象。因此,在使用常规基质及相同质谱仪器条件下,本发明方法与其他两种基质喷涂方法相比,可显著提高化合物检测数量、离子信号强度及成像质量。
Claims (3)
1.一种交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂方法,包括如下步骤:
(1)将生物组织制备成组织切片,并置于导电玻片的导电面;
(2)在高频振动喷雾器中加入基质溶液;涂覆所述组织切片的所述导电玻片贴附于交变电场装置的下电极板上,所述导电玻片的非导电面与所述下电极板贴合;
(3)采用交流电源向所述交变电场装置的两个电极板施加交流电压,即在两个所述电极板之间形成交变电场,电场交替变化过程中同时进行基质喷涂;
(4)采用激光直接照射扫描切片,经质量分析器分析后被质谱检测器检测并记录,然后重构呈现待测分子在组织表面的空间分布图像;
步骤(1)中,所述组织切片的厚度为8~20μm;
步骤(2)中,所述基质溶液的浓度为10~25mg/ml;
步骤(3)中,所述基质喷涂的条件如下:
所述高频振动喷雾器的喷头至所述下电极板的垂直距离为10~25cm,每喷涂一个循环干燥10~30s,一个喷涂循环为0.5~3s,进行60~80个循环;
所述交流电压的条件如下:
阳极工作电压为120V,阴极工作电压60V,每个循环电压发生反转,交变电压加载操作如下:
正离子模式时,作为阴极的上电极板加载电压为0V,作为阳极的下电极板加载电压为+120V,持续0.5s;然后上电极板加载电压+60V,下电极板加载电压0V,持续0.5s;完成上述电压转变加载为一个周期,如此循环往复,不断进行周期性电压加载;
负离子模式时,作为阳极的上电极板加载电压+120V,作为阴极的下电极板加载电压0V,持续0.5s;然后上电极板加载电压0V,下电极板加载电压+60V,持续0.5s;完成上述电压转变加载为一个周期,如此循环往复,不断进行周期性电压加载。
2.根据权利要求1所述的基质喷涂方法,其特征在于:所述导电玻片为ITO导电玻片。
3.一种如权利要求1所述的交变电场耦合高频振动辅助基质喷涂方法在MALDI-MSI基质喷涂过程中的应用。
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