JP4291161B2 - 生体分子の同定および定量のための方法および装置 - Google Patents
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Description
本発明は一般に、ポリペプチドを同定または定量するための方法および装置に関する。より具体的には、本発明は、多孔性支持体を用いて(例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を用いて)分離されたポリペプチドを同定または定量するのに使用され得る。本発明はまた、タンパク質(例えば、組織切片もしくは器官ブロット(blot)におけるような、膜に吸収されたタンパク質の任意の他の1次元もしくは2次元のタンパク質アレイから、または細菌もしくは組織培養プレート上で増殖させた細胞から、あるいは1次元もしくは2次元ゲルまたはクロマトグラフィー画分由来のタンパク質を含むマイクロタイタープレートから)の分離されていないタンパク質を同定するために使用され得る。分離されたポリペプチドに関する技術は、生化学的研究において特に有用であり、その目標は、同定されるタンパク質の最初の分子量についてのいくつかの情報を保持しながら、生物学的サンプル中の数十〜数百の最も豊富なタンパク質を迅速に同定または定量することである。分離前のポリペプチドをに影響を与えない技術は、任意の2次元タンパク質アレイの異なる切片においてどのタンパク質が最も豊富であるかを決定するのに使用され得る。1つ以上のサンプルからの分離されたタンパク質の相対的な定量化は、分離、電気的ブロッティング、消化および質量分析の前に、タンパク質の安定な同位体標識を用いることによって達成される。
生化学者はしばしば、生物学的サンプルの主要なタンパク質成分を確立することに関心を抱き、そして、通常、実験サンプルとコントロールサンプルとの間で変化したタンパク質を知ることに関心を抱く。最近10年間で、ゲル電気泳動およびその後のペプチド質量フィンガープリンティング(PMF)またはタンデム(MS−MS)質量分析法が、これらの分析を行うための選り抜きの方法になってきた。代表的には、ゲル電気泳動はタンパク質を分離するために行われ、そして、ゲル全体がクマシーブリリアントブルーで染色される。ゲルパターンを調べた後、科学者は、どの切片が分析されるべきであるかを決定する。次いで、手動または自動の方法を用いて、目的のタンパク質を含むゲルの小片を切り取る。数回の洗浄工程の後、ゲル切片全体を別々にプロテアーゼ(通常はトリプシン)で消化し、この消化産物を各ゲル切片から抽出し、濃縮し、脱塩し、そして別々に質量分光分析にかける。質量スペクトルはしばしば、完全に自動化された方法で回収され、そして、自動的なタンパク質同定を行うための専用のソフトウェアが市販されている。最初のサンプル調製工程を行うロボットもまた市販されているが、高価である。さらに、科学者は、全てのこれらの工程の間、各サンプルがどのように元々のゲルと関係していたかを記録しておかなければならない。このことは、混乱の多くの機会をもたらす。多くの場合において、これらのサンプルは、これらのプロセスの間に、異なる程度で、外因性の汚染物質で偶発的に汚染される。これらのプロセスは、代表的には、行うのに数日を必要とし、代表的には、一晩のプロテアーゼ消化の工程を包含する。これらの技術は骨が折れ、かつ高度の操作者の訓練を必要とするので、この種のタンパク質同定は、主に、大きな製薬会社によって、そして、分析される切片毎にかなりの人数の元受け研究者を充てる中核研究室によって行われる。さらに、これらの技術は、切片のすぐ隣にあるタンパク質を同定するためには不十分である。なぜならば、ゲルからのポリペプチドバンドの切り出しは連続的に行わなければならず、そして、この切り出しプロセスは、ゲルを移動させ、引き続く切り出し工程を制御不能にするためである。また、ポリペプチドがチューブ壁に付着する場合、損失が生じる。
1.クマシーまたは銀染色または蛍光染料で染色する方法:現時点で、この方法は、ゲルから過剰な染料を洗い出した後に、可視光または紫外線で可視化されるタンパク質染色化合物を含む溶液にゲルを浸漬する工程を必要とし、このプロセスは、代表的には数十分〜数時間を要する。
本発明は、タンパク質サンプル由来のポリペプチドの同定または定量に関する。1つの実施形態において、タンパク質は、ゲルで分離され、そして、電気的溶出(electroelution)の間に酵素で消化することによってペプチドフラグメントに切断される。次いで、ペプチドフラグメントが複合捕捉膜の表面に堆積され得る。
本発明は、切断試薬の固定化のため、および複合捕捉膜を形成するための改善した方法および装置を提供する。これは、切断されるべきポリペプチドが、1方向または2方向でのいずれかで、不連続にではなく、1つの経路で連続して切断試薬と接触して通貨することを可能にする。さらに、公開PCT特許出願WO 00/45168号に以前に記載されているように、電気的ブロッティングの前に分離ゲル中で消化プロセスを開始する必要はない。
a)ゲルに隣接して少なくとも1つの親水性膜を提供する工程であって、この親水性膜には、ポリペプチドを切断し得る少なくとも1種の試薬が固定化されている。プロテアーゼの場合、この親水性膜は、プロテアーゼの自己消化を最小にしながら、高濃度のプロテアーゼを堆積するために、高い塩濃度およびプロテアーゼインヒビターの添加で処理される。
e)分離の前に、質量分析法により区別され得る安定同位体を差次的に含有する試薬でタンパク質を標識することによって、同定されるポリペプチドの相対的定量を提供する工程。例えば、インタクトなタンパク質は、N−ヒドロキシスクシニミル(hydroxysuccinimyl)−アセテート(NHSA)で処理され得、これは、リジン側鎖と反応する。NHSAは、3つの重水素原子または3つの水素原子のいずれかを含有するアセテート標識基で合成され得る。次いで、これらのサンプルは、ゲル電気泳動、消化、捕捉およびMS分析の前に一緒に混合される。次いで、実験サンプルと比較したコントロール中のタンパク質の相対量が、MSによって測定されるような各ペプチド対の相対強度を測定することによって推論され得る。各タンパク質について、検出されるペプチドの大半は、これらの対の形態(主な例外は、アルギニン残基で終止し、また、アルギニン残基により先行されるペプチドである)であり、これは、各タンパク質の発現レベルは、多くの個々のペプチド測定値に基づくことを意味する。
a)少なくとも1つの親水性膜であって、その上に、ポリペプチドを切断し得る少なくとも1種の試薬を固定化し、この切断試薬は、切断されるべきポリペプチドの通過を許容するのに十分高い活性を有し、そこからこの親水性膜を介して1つの経路でペプチドフラグメントを生じる、親水性膜;および
b)電気的ブロッティングによって膜上にポリペプチドのフラグメントを受けそして捕捉するのに適した複合捕捉膜であって、この複合捕捉膜は、化学的に改変され、その結果、捕捉されたフラグメントがその表面上に濃縮される、複合捕捉膜。
(化学物質)
ポリエーテルスルホンを含有するGelman US450膜をPall Life Sciences(Ann Arbor,MI)から購入した。低範囲SDS−PAGE標準PVDF膜をBio−Rad(Richmond,Calif.,USA)から購入した。トリフルオロ酢酸(TFA)、TrisおよびトリプシンをSigma(St−Louis,Mo.,USA)から購入した。このトリプシンは、ウシの膵臓由来であり、そして、L−1−トシルアミド−2−フェニルエチルクロロメチルケトン(TPCK)で処理して、通常トリプシンに存在するキモトリプシン様活性を低減させた。アセトトリル(HPLCグレード)、塩化カルシウム、エタノールアミン、グリシンおよびL−BAPNA(N−ベンゾイル−L−アルギニン−4−ニトロアニリドヒドロクロリド)をまたSigmaから購入した。
1次元 PAGE法のために、Mini−Protean II電気泳動装置(Bio−Rad,Richmond,Calif.,USA)を用いた。BioRad製の10%ポリアクリルアミドゲルを用いて、Laemmli、Nature 277:680−685 1970に記載されるような方法に本質的に従って、SDS−PAGEを行った。mini whole gel eluter(Bio−Rad)を用いて電気的に溶出したタンパク質を回収した。用いたタンパク質サンプルは、Sigma製の広範囲SDS−PAGE標準であった。これらは、ダイズトリプシンインヒビター(20.1kDa)、ウシ炭酸脱水酵素(28.9kDa)、トリオブアルブミン(42.7kDa)、ウシ血清アルブミン(66.4kDa)、E.coli β−ガラクトシダーゼ(116kDa)およびミオシン(205kDa)であった。フルオレセインイソチオシアネートで標識することによってFITC−BSAを蛍光にした。FITC標識化BSAを用いてゲル電気泳動への暴露後のタンパク質の消化および移動を、定性的および定量的に評価した。タンパク質の移動は、100Vで60〜90分間、単一のレーンで行った。
ベンズアミジンHCl(2mg/ml)、TPCK処理したトリプシン(1mg/ml)およびNaBH3CN(10mg/ml)を0.5M Na2SO4、100mM Na2HPO4、pH7.4に溶解し、Gelman/Pall US450ポリエーテルスルホン膜cm2あたり0.1mlでコーティングした。このアルデヒド活性化膜は、最近紹介されている、市販の改変ポリエーテルスルホン膜である。これらの基は、タンパク質またはペプチド由来のアミン基のようなヌクレオフィルに対して反応性である。等量の1.5M Na2SO4、100mM Na2HPO4、pH7.4の緩衝液を加え、そして、室温で16〜18時間、75rpmで揺らしながら反応させた。0.2MTrisおよび5mg/ml NaBH3CNを添加することによってキャップ化を達成した。この膜を湿った状態で冷蔵保存するか、またはグリセロール溶液を使用して乾燥させた。
直径8mmのトリプシン消化膜のディスク(0.5cm2)を3mlの0.92mM BAPNAに添加し、軌道混合器上で、室温で30分間インキュベートした。反応を0.5mlの30% 酢酸でクエンチし、トリプシン活性を410nmでモニタリングし、そして、既知のトリプシン活性の溶液と比較した。
Immobilon CD(第4級アンモニウム官能基を有するPVDF膜であり、Millipore Corporation (Bedford,MA)から市販されている)を、20mg/ml ニトロセルロース、10mg/ml HCCA、50% イソプロパノールおよび50% アセトンの溶液に浸漬した。次いで、膜を完全に乾燥させ、トランスブロッティング緩衝液(以下に記載する)で再び湿らせた。
電気的ブロッティングの間にタンパク質の酵素的消化を行うために、7層までのトリプシン固定化膜を、トランスブロット−消化サンドイッチ(図1および2aおよび2b)を作製するための回収表面として、ポリアクリルアミドゲル(タンパク質の供給源)と複合捕捉膜との間に配置した。電気的ブロッティングトランスファー手順の後、消化されたタンパク質のフラグメントが回収される複合性の収集膜を、MS分析の前に、脱イオン水で10〜30分間洗浄した。
目的の領域を含む複合捕捉膜の小片(1×1mm)および大きな片(少なくとも40mm四方)を複合性の捕捉収集膜から切り出し、適切なサンプルMALDIプレートに、硬化接着剤またはシリコーン真空グリースで固定した。さらなるマトリクスを以下のようにして捕捉膜に添加した:50%アセトニトリル、0.1% TFA溶液中1μlの10mg/ml HCCAを陰極の複合捕捉膜に添加したか、あるいは、MALDIプレートに付着させる前に、さらなるマトリクス溶液を捕捉膜に噴霧した。
複合性の膜を、337nmの窒素レーザーを備えるMALDI−TOF質量分析計Voyager STRまたはVoyager DE−PRO(Applied Biosystems,Framingham,MA,USA)で分析した。この分析計は、20kVの加速された電圧、125nsのイオン抽出遅延時間および800Daで固定化された低質量ゲートで、反射体モードにて使用した。レーザー出力は、分子イオン生成の閾値をわずかに超えて設定した。任意の平滑化手順を行うことなく、10〜1000回の連続したレーザー発射の刺激によってスペクトルを得た(図4)。図6aについて、直交性のMALDIイオン源を備えるQSTAR PULSARハイブリッドQ−TOF MS(Applied Biosystems)上でスペクトルを得;図6bについては、4700 Protein Analyzer(Applied Biosystems)上でスペクトルを得た。
1) まず、1次元ゲルまたは2次元ゲルを作動させる
2) ゲル、切断膜、捕捉膜およびフィルターペーパーパッドをトランスファー緩衝液に2〜5分間浸す
3) 以下の順序で、陰極の最下層から開始するサンドイッチを調製する:フィルターペーパーパッド、捕捉膜、切断膜、ゲル、フィルターペーパーパッド
4) 組み立て、そして7Vで3.5時間トランスファーする
5) 分解し、捕捉膜を水でリンスし、マトリクス溶液で乾式噴霧する
6) 捕捉膜を乾燥させ、そして、真空グリースでMALDIプレートに適用する
7) MALDI−TOF MSにて走査する(250μmの分解能、20Hzのレーザーで、161スペクトルを得るのに、1レーンあたり約20分)
(結果)
トリプシンは、Gelman US450アルデヒド活性化膜に共有結合した。表面の酵素密度をBAPNA試験によって、cm2あたり4.6〜10.9μgの活性トリプシンであると決定した。4℃で1ヶ月までの期間、20%グリセロールを含むTris−HCl/CaCl2/NaN3溶液中に保存される場合、トリプシンが結合したGelman US450膜の活性は安定なままであった。
(表1)
# タンパク質リスト順序
acc Swiss Prot受入番号
accM 代替的なSwissProtの受入番号(低いランクのタンパク質に
対する)
#m 代替的な受入番号についてのタンパク質リスト番号
#r 強度によりソートした質量のランク;1が最も強い質量である
int 質量の強度
tri 強度、ChemScoreおよびペプチドレベルでの質量誤差を組み
合わせた適合性のための複合的スコア
ch ペプチドのChemScore
theo その配列に基づいたペプチドの分子量
maldi 質量の測定された分子量
ppm 「theo」と「maldi」との間の100万あたりの部分の誤差
< タンパク質配列中の予定のペプチドの直前のアミノ酸
sequence ペプチドの配列
> タンパク質配列中のペプチドの後のアミノ酸
mod ペプチド中の残基への改変の略称
p ペプチド中で切断し損ねたトリプシンの数
(表2)
# タンパク質リスト順序
acc Swiss Prot受入番号
タンパク質 タンパク質の名前
mw タンパク質の分子量
m タンパク質に対して適合するペプチドの数
tri 強度、ChemScoreおよびタンパク質レベルでの質量誤差を組
み合わせた適合性のための複合的スコア
% Ch タンパク質と適合したChemScoreの百分率
% I 適合した強度の百分率
ppw 適合したペプチドについての強度−加重平均ppm誤差
Claims (21)
- タンパク質サンプルからポリぺプチドを同定および定量するための方法であって、該方法は、以下:
該タンパク質サンプルからポリぺプチドを分離して、該ポリぺプチドを含む支持体を提供する工程;
該支持体に隣接する少なくとも1つの消化膜を提供する工程であって、ここで、少なくとも1つのポリぺプチド切断試薬が、該ポリぺプチドが該膜を1度通過した後に該サンプル中のポリぺプチドのその後の同定を可能にするのに十分な量のポリぺプチドを消化する有効量で該消化膜に固定されている、工程;
少なくとも1つの捕捉膜を提供する工程であって、該捕捉膜は、該少なくとも1つの消化膜から、電気的ブロッティングの間に、該ポリペプチドのペプチドフラグメントの移動方向において、下流にある、工程;
該ポリペプチドを、該支持体から該少なくとも1つの消化膜を通って電気的ブロッティングする、工程;
該少なくとも1つの捕捉膜において該フラグメントを回収する工程;および
該回収したフラグメントを、MALDI−TOF質量分析法によって同定または定量する工程であって、MALDIマトリクス材料が、電気的ブロッティングの前に該捕捉膜に添加される、工程
を包含する、方法。 - 指向された前記フラグメントからポリぺプチドを同定する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記支持体が電気泳動ゲルである、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉膜にセルロースを添加することによってペプチド捕捉を促進するように該膜を改変する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記MALDIマトリクス材料が、α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリぺプチドへと分離する前に、前記タンパク質を安定な重同位体で標識する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記切断試薬は、前記消化膜に共有結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記消化膜が、改変PVDF膜および改変ポリエーテルスルホン膜からなる群より選択され、そして前記切断試薬がプロテアーゼである、請求7に記載の方法。
- 前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項8に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記切断試薬が、前記有効量で前記消化膜に固定され、該固定は、以下:
塩、プロテアーゼインヒビターを添加し、そして、該膜と該切断試薬とを反応させてシッフ塩基を生成する工程;
還元剤を用いて該シッフ塩基を還元する工程;および
該膜から該プロテアーゼインヒビターを取り除く工程;
による、方法。 - 前記膜の表面において残った活性基をキャップする工程をさらに包含する、請求項10に記載の方法。
- 前記捕捉膜の不連続ゾーン上に前記フラグメントの捕捉したものを収束させる工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記フラグメントを、前記支持体と前記捕捉膜との間に非伝導性シートを提供することによって該捕捉膜の不連続ゾーンに収束させ、該シートは、該フラグメントが流れる少なくとも1つのスリットまたはホールを有する、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記消化膜と前記捕捉膜との間に中間捕捉膜を提供して前記ポリぺプチドのサブセットを捕捉する工程を包含する、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、ポリぺプチドの前記捕捉されたサブセットを解放する工程および第2の捕捉膜に該サブセットを電気的ブロッティングする工程をさらに包含する、方法。
- 前記支持体が切断試薬を含まない、請求項1に記載の方法。
- 複数の隣接する消化膜が存在する、請求項1に記載の方法。
- タンパク質を含む組織サンプルから直接的にポリぺプチドを同定および定量するための方法であって、該方法は、以下:
タンパク質を含む該組織を提供する工程;
該組織に隣接する少なくとも1つの消化膜を提供する工程であって、ここで、少なくとも1つのポリぺプチド切断試薬が、該サンプル中の電気的ブロッティングされたポリぺプチドが膜を1度通過した後に、該ポリぺプチドのその後の同定を可能にするのに十分な量のポリぺプチドを消化する有効量で該消化膜に固定されている、工程;
少なくとも1つの捕捉膜を提供する工程であって、該捕捉膜は、前記少なくとも1つの消化膜から、電気的ブロッティングの間に、該ポリペプチドのペプチドフラグメントの移動方向において、下流にある、工程;
該少なくとも1つの消化膜を通って、該組織サンプルから該ポリペプチドを電気的ブロッティングする工程;
該少なくとも1つの捕捉膜において該フラグメントを回収する工程;および
該回収したフラグメントを、MALDI−TOF質量分析法によって同定または定量する工程であって、MALDIマトリクス材料が、電気的ブロッティングの前に該捕捉膜に添加される、工程;
を包含する、方法。 - タンパク質サンプルからポリぺプチドを同定または定量するための方法であって、該方法は、以下:
該タンパク質サンプルからポリぺプチドを分離して該ポリぺプチドを含む支持体を提供する工程;
該支持体に隣接する少なくとも1つの消化膜を提供する工程であって、ここで、少なくとも1つのポリぺプチド切断試薬が、該消化膜に固定されている、工程;
少なくとも1つの捕捉膜を提供する工程であって、該捕捉膜は、該少なくとも1つの消化膜から、電気的ブロッティングの間に該ポリペプチドのペプチドフラグメントの移動方向において、下流にあり、該捕捉膜がニトロセルロースおよびMALDIマトリクス材料を用いて改変される、工程;
該少なくとも1つの消化膜を介して該支持体から該ポリぺプチドを電気的ブロッティングして、該ポリぺプチドをフラグメントに効率的に切断する工程;
該少なくとも1つの改変された捕捉膜上に該フラグメントを回収する工程;ならびに
該回収されたフラグメントを、MALDI−TOF質量分析法によって同定または定量する工程であって、MALDIマトリクス材料が、電気的ブロッティングの前に該捕捉膜に添加される、工程
を包含する、方法。 - 前記MALDIマトリクス材料がα−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸を含む、請求項19に記載の方法。
- タンパク質サンプルからポリぺプチドを同定または定量するための方法であって、該方法は、以下:
該タンパク質サンプルからポリぺプチドを分離して該ポリぺプチドを含む支持体を提供する工程;
該支持体に隣接する少なくとも1つの消化膜を提供する工程であって、ここで、少なくとも1つのポリぺプチド切断試薬が、該消化膜に固定されている、工程;
該少なくとも1つの捕捉膜を提供する工程であって、該捕捉膜は、該少なくとも1つの消化膜から、電気的ブロッティングの間に該ポリぺプチドのペプチドフラグメントの移動方向において下流にある、工程;
該支持体と該捕捉膜との間に非伝導性シートを提供する工程であって、該シートは、該シートが、該フラグメントが流れる少なくと1つのスリットまたはホールを有する、工程;
少なくとも1つの消化膜を通って該支持体から該ポリペプチドを電気的ブロッティングして、該ポリペプチドをフラグメントへと効率的に切断する工程;
該フラグメントを、該少なくとも1つのスリットまたはホールを通って流し、そして、該少なくとも1つの捕捉膜の不連続領域上に回収する工程;および
該回収したフラグメントを、MALDI−TOF質量分析法によって同定または定量する工程であって、MALDIマトリクス材料が、電気的ブロッティングの前に該捕捉膜に添加される、工程
を包含する、方法。
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