CN115605977A - 使用自动化desi-ms的高通量无标记酶促生物测定 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及使用解吸电喷雾电离‑质谱法(DESI‑MS)的高通量无标记酶促生物测定。
Description
相关申请
本申请要求于2020年5月11日提交的美国临时专利申请序列号63/022,715的权益和优先权，该美国临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。
政府利益
本发明是根据代表国防高级研究计划局(Defense Advanced Projects ResearchAgency)的陆军研究办公室(Army Research Office)授予的W911NF-16-2-0020在政府支持下进行的。政府享有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明总体上涉及使用解吸电喷雾电离-质谱法(DESI-MS)的高通量无标记酶促生物测定。
背景技术
酶是重要的药物靶标。现今许多市售药物通过抑制介导疾病表型的酶发挥作用。酶抑制剂是一类重要的药理药剂。通常这些分子是底物结合的竞争性可逆抑制剂。
为此，酶测定是用于测量细胞活性以及用于监测酶蛋白的重要工具。酶动力学的测量提供了关于酶催化的机制以及酶与底物、抑制剂、药物和药物候选物之间的相互作用的关键信息。
发明内容
本发明提供了一个高通量平台，该平台组合了一组相互关联的方法，其中可以使用质谱法产生发生反应的液滴和薄膜(在某些实施例中任选地加速反应)，同时或随后使用质谱法分析液滴和/或薄膜中的产物分布。此平台对许多不同的化学和生物系统具有广泛的适用性。在本文所描述的实施例中，此平台应用于酶促反应和酶促测定。
在某些方面，本发明提供了用于监测酶促反应的方法。这些方法涉及在底物上制备多个离散斑点。在某些实施例中，该多个离散斑点中的每一个来自酶促反应中的不同时间点。在其它实施例中，对于具有不同抑制剂/再激活剂/底物/酶浓度的不同反应，这些离散斑点中的每一个可以来自同一时间点。例如，基于同一终点的设置对于药物发现更为常见，而基于不同时间点的设置对于生化研究和酶表征更为常见。
这些离散斑点中的每一个可以包括酶促反应的底物和产物。然后，这些方法涉及以下：将来自电离源的排出物依次引导到该多个离散斑点中的每一个上，以从这些离散斑点中的每一个中依次解吸该底物和/或该产物并由这些离散斑点中的每一个依次产生该底物和/或该产物的进入质谱仪的离子；以及依次分析该质谱仪中来自这些离散斑点中的每一个的该底物和/或该产物的该离子，由此监测该酶促反应。如上所述，在某些实施例中，该多个离散斑点中的每一个可以来自在制备步骤之前已经停止的酶促反应中的不同时间点。在其它实施例中，该多个离散斑点中的每一个来自在制备步骤之前尚未停止的酶促反应中的不同时间点。在某些实施例中，将化合物添加到反应混合物中以充当定量的内标物。
在其它方面，本发明提供了用于监测酶促反应的方法，该酶促反应涉及在底物上制备多个离散斑点。在某些实施例中，将化合物添加到反应混合物中以充当定量的内标物。这些离散斑点中的每一个可以包括酶促反应的底物和产物。此类方法另外地涉及以下：将来自电离源的排出物依次引导到该多个离散斑点中的每一个上，以从这些离散斑点中的每一个中依次解吸该底物和/或该产物并由这些离散斑点中的每一个依次产生该底物和/或该产物的进入质谱仪的离子；依次获得该质谱仪中来自这些离散斑点中的每一个的该底物和/或该产物的这些离子的离子强度；以及通过应用校准曲线将来自这些离散斑点中的每一个的该底物和/或该产物的这些离子的离子强度转换为该底物与该产物的浓度比，由此监测该酶促反应。在某些实施例中，该多个离散斑点中的每一个来自在制备步骤之前已经停止的酶促反应中的不同时间点。在其它实施例中，该多个离散斑点中的每一个来自在制备步骤之前尚未停止的酶促反应中的不同时间点。在某些实施例中，这些方法测量的不一定是产物与底物的比率，而是产物和底物中的任一者与内标物的比率。
在上述方法的某些实施例中，该电离源为解吸电喷雾电离(DESI)探针并且该排出物为DESI喷雾。
在上述方法的某些实施例中，该多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括相同的测试化合物。在此类实施例中，该方法进一步包括基于对该酶促反应的进展的监测来确定该测试化合物是否抑制该酶促反应。在此类实施例中，该方法进一步包括基于对该酶促反应的进展的监测来确定该测试化合物抑制该酶促反应的完全程度。在此类实施例中，该酶促反应与生理病状相关，并且确定该测试化合物抑制该酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将该测试化合物开发成治疗该病状的药物。
在其它实施例中，该多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括该酶促反应的酶的抑制剂和测试化合物。在此类实施例中，该方法进一步包括确定该测试化合物是否可以抵消该抑制剂以及重新开始该酶促反应。在此类实施例中，该方法进一步包括基于对该酶促反应的进展的监测来确定该测试化合物抵消该抑制剂的完全程度以及重新开始该酶促反应的完全程度。在此类实施例中，确定该测试化合物抵消该抑制剂的完全程度以及重新开始该酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将该测试化合物开发成抵消该抑制剂的药物。
附图说明
图1描述了高通量平台的概述。
图2描述了高通量平台的另一实施例。
图3A-D描述了使用高通量平台的实施例的示例性工作流程。
图4是示出了使用本文所描述的平台针对对直接来自含有表面活性剂和非挥发性缓冲液两者的生物测定混合物的酶促反应的监测所获得的光谱的代表性实例的图。
图5示出了根据DESI-MS数据(使用离子强度(m/z 104)/(m/z 146+m/z 104)计算的反应的经验进展可以使用测得的离子比与混合物中胆碱与乙酰胆碱的实际浓度比之间的简单校准曲线直接转换为实际反应进展([胆碱]/([乙酰胆碱]+[胆碱])。
图6示出了酶促反应随时间的进展可以通过每1-5分钟猝灭生物测定混合物的等分试样并测量胆碱离子比(使用离子强度(m/z 104)/(m/z 146+m/z 104))很容易地获得。
图7示出了乙酰胆碱酯酶(AChE)的米-曼氏图(Michaelis Menten plot)是使用18个独立的反应进展曲线(独立的一式三份的六种底物浓度：0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、1.0mM)构建的。
图8示出了在使用分别为9μg/mL和5mM的较高浓度的酶和底物的情况下，反应可以在五分钟内完成并且在<15分钟内分析384种抑制反应，同时实现了优异的灵敏度。
图9示出了使用不同的DESI源和不同的质谱仪(Waters源和Synapt G2 qToF)检查了方法的稳健性。
图10的图A-D示出了可以进一步研究所关注的抑制剂(即，与初始高-低筛选中的已知抑制剂相比，这些抑制剂显示出相对较高的活性)。
图11示出了通过同时筛选不同浓度的抑制剂和底物可以实现抑制剂的另外的表征以获得Dixon图，从该图中抑制常数被快速确定为70.0±0.7nM。
图12的图A-C示出了乙酰胆碱酯酶再激活剂可以针对不同的所关注的抑制剂进行筛选，从而表征抑制和再激活两者的动力学。
图13的图A示出了用于评估方法的性能的模拟抑制图。图13的图B示出了对数转换数据示出预期的线性行为(R2＝0.996)。
图14的图A-B示出了仅在添加酶之后的生物测定混合物(图A)和在室温下温育30分钟之后的生物测定混合物(图B)(在0.1M磷酸盐缓冲液中，pH 8，0.1％ BSA)的代表性质谱。
图15的图A示出了用于使用不同的质谱仪(Waters QToF)评估方法的性能的模拟对数抑制图。图15的图B示出了使用QToF仪器通过方法获得的典型光谱。
图16是示出在某些实施例中用于实施本发明的系统和方法的示例性数据分析模块的图示。
具体实施方式
本发明总体上涉及使用解吸电喷雾电离-质谱法(DESI-MS)的高通量无标记酶促生物测定。图1描述了高通量平台的概述。流体处理系统控制样品处理并产生各种大小的微孔板，此处例示为384孔板。流体处理系统使用与微孔板相互作用的钉扎装置以产生离散斑点的底物，例如，使用该钉扎装置。DESI源被整合为系统的一部分并将DESI活性喷雾排出物依次引导到斑点中的每个斑点上。喷雾排出物解吸并电离来自每个斑点的分析物，这些分析物被引导到质谱仪中以进行分析。此高通量系统能够以1秒/反应(或更快)筛选所关注的反应产物并且是一个能够24小时连续操作的系统。图2描述了具有某些另外的特征的高通量平台的另一实施例。图3A-D描述了使用高通量平台的实施例的示例性工作流程。
DESI是一种环境电离方法，其允许从样品中直接电离物种，并且描述于Takats等人,《科学(Science)》,306:471-473,2004和Takats,美国专利第7,335,897号中，该文献中的每个文献的内容通过引用整体并入本文。例如，DESI-MS成像描述于例如Eberlin等人,(《生物化学与生物物理学报(Biochimica Et Biophysica Acta)》2011,1811(11):946-960)和Cooks RG等人,(《法拉第讨论(Faraday Discussions)》2011,149:247-267)，这些文献中的每个文献的内容通过引用整体并入本文。
如上所述，此平台对许多不同的化学和生物系统具有广泛的适用性。例如，能力集包含基于测得的质谱以进行以下的能力：(i)使用DESI以高速读取微阵列的内容并捕获此信息并将其自动处理；(ii)在使阵列中的样品暴露于化学试剂或生物药剂之后，使用DESI以高速重新读取微阵列的内容；(iii)使用DESI以使存在于微阵列中的化合物的混合物反应，并且同时记录二级DESI液滴的质谱以表征反应产物；(iv)使用具有添加在喷雾中的试剂的DESI(反应性DESI)以使阵列中的化合物反应(衍生化)，并且同时记录二级液滴的质谱以表征衍生化化合物；以及(v)使用DESI以阵列形式表征生物标志物和组织的其它特征。在一些情况下，DESI分析条件可以被选择成最小化二级微液滴中加速反应的可能性。在一些情况下，到达MS入口的样品和其它分析参数可以被选择成最大化此类加速反应发生的可能性。
根据使用DESI以高速读取微阵列内容获得的信息允许进行以下：(i)优化合成条件以在使用流动化学或常规批量合成放大所研究的反应时获得最大产率和/或产物纯度；(ii)通过将反应中间体表征为将促进任何规模的反应的另外的信息途径，对一系列条件下的反应机制进行系统研究；(iii)从接收器表面上的液滴反应中收集少量合成产物；(iii)测量通过荧光测量收集的少量材料的细胞毒性，这在现有技术中是众所周知的；(iv)通过独立MS和/或MS/MS测量表征所收集的产物的纯度；(v)在数据库中汇编少量所收集的新化合物的光学光谱和MS/MS光谱以用于法医和其它用途；(vi)在使所收集的产物暴露于酶或受体或其它底物之后，通过无标记MS测量结合测定；以及(vii)使用针对所收集的产物的生物活性测量结果来确定结构/活性关系。某些实施例集中于在将所收集的产物暴露于酶或受体或其它底物之后通过无标记MS测量结合测定。
本文所描述的平台用于以高通量和无标记的方式进行酶促生物测定(图4)。最初的工作集中于研究乙酰胆碱酯酶(AChE)测定，该测定与阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)的药物发现以及针对化学战剂的对抗措施的开发的背景相关。为了进行生物测定，同时监测酶促反应的底物(乙酰胆碱，m/z 146)和产物(胆碱，m/z 104)。在用ACN(最终浓度的至多50％)淬灭并钉扎(50nL)在PTFE涂覆的载玻片上之后，使用DESI-MS(喷雾溶剂:MeOH-ACN：1:1)直接从生物测定混合物(酶，磷酸盐缓冲液，0.1M，pH 8、0.1％ BSA)中进行分析。每个样品(斑点)的有效分析时间少至0.3秒，以使得可以在7分钟内完全分析384个样品阵列。动力学研究很容易通过在固定时间间隔(通常为1-2分钟)之后淬灭等分试样来进行。该图说明了在所关注m/z范围内获得的光谱的质量，以及整个反应过程中产物和底物的行为。根据研究目的，通过选择适当量的酶和底物，可以优化反应完成时间。
图5示出了根据DESI-MS数据(使用离子强度(m/z 104)/(m/z 146+m/z 104)计算的反应的经验进展可以使用测量的离子比与混合物中胆碱与乙酰胆碱的实际浓度比之间的简单校准曲线直接转换为实际反应进展([胆碱]/([乙酰胆碱]+[胆碱])。此处示出的校准曲线是使用6种不同总浓度的独立溶液(范围：0.4-1.0mM)构建的，其经历与生物测定样品所经历的程序相同的程序(ACN添加和钉扎)。应注意，用于分析的材料量为约100-300pg。每个数据点表示六种溶液的平均值，每种溶液在不同的三天内被分析四次，每种浓度比进行总共72次测量。每日校准(246个斑点)的采集时间为大约5分钟。此校准允许直接确定酶促反应的动力学参数而无需经标记的化合物(氘化标准物或非天然底物)。
图6示出了酶促反应随时间的进展可以通过每1-5分钟猝灭生物测定混合物的等分试样并测量相对于乙酰胆碱+胆碱的胆碱离子比很容易地获得。对于动力学测定，将反应温育50分钟，其中底物浓度保持处于0.4mM至1mM，而酶浓度设置为180ng/mL。使用图5所示的校准曲线将曲线的线性部分转换为胆碱浓度。应注意，仅使用校准范围内的浓度。经校准的结果(插图)用于测定反应的v0。所示数据来自于单一混合物的八个仪器复制品(128个斑点)，在小于2.5分钟的时间内获取。
图7示出了AChE的米-曼氏图是使用18个独立的反应进展曲线(独立的一式三份的六种底物浓度：0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、1.0mM)构建的。该曲线用于估计系统的米-曼氏常数为0.203±0.006mM，其在文献所报告的值的范围内(0.08mM至0.23mM)。通过测量每个反应进展曲线中每个数据点的八个仪器复制品，构建该图需要对2304个斑点进行分析，这可以在大约30分钟内容易地完成。应注意，所有样品的温育(50分钟)可以同时进行，因此反应的动力学表征需要总共仅80分钟。
图8示出了在使用分别为9μg/mL和5mM的较高浓度的酶和底物的情况下，反应可以在五分钟内完成，并且同时实现了优异的灵敏度。在这些条件下，34种化合物被测试为AChE的潜在抑制剂：1种已知的强抑制剂(新斯的明(neostigmine))、17种天然产物和16种滥用药物。在两种不同浓度(高和低：0.6mM和0.06mM)下对化合物进行测试，并且在同一测定中分析阳性对照和阴性对照两者。所有样品均以一式四份的形式进行分析(总共280个斑点)，整组所需的分析时间小于6分钟。应注意，如果没有分析复制品，可以在总共小于15分钟的时间内对384种抑制剂进行全部测试(5分钟温育+7分钟分析+2分钟数据处理)。
使用不同的DESI源和不同的质谱仪(Waters源和Synapt G2 qToF)检查了方法的稳健性(图9)。抑制测定的结果几乎与图8的热图所示的结果相同(Prosolia源和ThermoLTQ离子阱)。
可以进一步研究所关注的抑制剂(即，与初始高-低筛选中的已知抑制剂相比，这些抑制剂显示出相对较高的活性)(图10A-D)。从筛选的34种化合物原始组中选择了四种—新斯的明、羟考酮(oxycodone)、氢可酮(hydrocodone)和咖啡因(caffeine)—并获得了其全部剂量-应答曲线。根据这些曲线，在特定测定条件下，发现这些化合物新斯的明、羟考酮、氢可酮和咖啡因的IC50值分别为5.9μM、0.122μM、116μM和71μM，这与预期趋势相符合。这些剂量-应答曲线中的每一个表示三个独立溶液的平均值，其中每种独立溶液有八个仪器复制品。总共分析了1536个反应以获得此处所呈现的四个曲线，总分析需要大约25分钟。
通过同时筛选不同浓度的抑制剂和底物可以实现抑制剂的另外的表征以获得Dixon图(图11)。新斯的明被选择成进行此另外的表征。此Dixon图需要确定24个独立的进展曲线：对抑制剂(0nM、40nM、100nM、200nM)和底物(0.6nM、0.8nM、1.0mM)的12种浓度组合进行重复测量。这需要在大约35分钟内对3072个斑点进行分析，同时温育时间为50分钟。如所预期的，图中线交叉的位置表明新斯的明是竞争性抑制剂。其抑制常数被确定为70.0±0.7nM，该值与所报告的此酶抑制剂复合物的值相当。
图12示出了可以研究酶促抑制-再激活过程的动力学。该图示出了乙酰胆碱酯酶在与5μM敌敌畏(图A)、0.25μM毒死蜱氧化物(chlorpyrifos-oxon)(图B)和0.75μM对氧磷(图C)一起温育过程中的抑制，以及由于添加商业再激活剂(2-解磷定(2-pralidoxime)，100μM)而引起的酶再激活。肟再激活剂的添加由图中的实心灰线表示。在用敌敌畏、毒死蜱氧化物和对氧磷抑制之后，再激活效率分别为45％±2％、87％±5％和76％±3％。
系统架构
在某些实施例中，可以使用自动化系统和计算装置来执行本发明的系统和方法。具体地，本文所描述的本发明的各方面可以使用任何类型的计算装置，如计算机来执行，该计算装置包含处理器，例如中央处理单元，或计算装置的任何组合，其中每个装置执行过程或方法的至少一部分。在一些实施例中，本文所描述的系统和方法可以使用手持装置控制，例如，智能平板计算机、或智能手机或为系统生产的专用装置。
本发明的系统和方法可以使用软件、硬件、固件、硬接线或其中任何项的组合来执行。实施功能的特征也可以物理地定位于不同的位置处，包含分布成在不同的物理位置处实施功能的部分(例如，成像设备在一个房间并且主机工作站在另一个房间，或在单独的建筑物中，例如，具有无线或有线连接)。
举例来说，适合于执行计算机程序的处理器包含通用微处理器和专用微处理器两者、以及任何类型的数字计算机的任何一个或多个处理器。通常，处理器将从只读存储器或随机存取存储器或两者接收指令和数据。计算机的基本元件是用于执行指令的处理器以及用于存储指令和数据的一个或多个存储器装置。通常，计算机还将包含用于存储数据的一个或多个大容量存储装置(例如，磁盘、磁光盘或光盘)或者被操作地耦接以从大容量存储装置中接收数据或向大容量存储装置传递数据或两者。适于体现计算机程序指令和数据的信息载体包含所有形式的非易失性存储器，包含，举例来说，半导体存储器装置(例如，EPROM、EEPROM、固态驱动器(SSD)和闪速存储器装置)；磁盘(例如，内部硬盘或可移动盘)；磁光盘；以及光盘(例如，CD和DVD盘)。处理器和存储器可以由专用逻辑电路补充或并入专用逻辑电路系统中。
为了提供与用户的交互，本文所描述的本发明主题可以在具有I/O装置，例如，CRT、LCD、LED或用于向用户显示信息的投影装置以及用户可以用来向计算机提供输入的输入或输出装置如键盘和定点装置(例如，鼠标或轨迹球)的计算机上实施。其它种类的装置也可以用于提供与用户交互。例如，提供给用户的反馈可以是任何形式的感觉反馈，(例如，视觉反馈、听觉反馈或者触觉反馈)，并且可以用任何形式，包含声学、语音或者触觉输入接收来自用户的输入。
本文所描述的本发明主题可以在包含以下的计算系统中实施：后端组件(例如，数据服务器)、中间件组件(例如，应用服务器)、或前端组件(例如，具有图形用户接口或网页浏览器的客户端计算机，用户可以通过该图形用户接口或该网页浏览器与本文所描述的本发明主题的实施方案交互)、或此后端组件、中间件组件和前端组件的任何组合。系统的组件可以通过网络通过数字数据通信，例如通信网络)的任何形式或介质进行互连。例如，参考数据集可以存储在远程位置处并且计算机通过网络进行通信以访问参考集，以将衍生自女性受试者的数据与参考集进行比较。然而，在其它实施例中，参考集本地存储在计算机内并且计算机访问CPU内的参考集以将受试者数据与参考集进行比较。通信网络的实例包含蜂窝网络(例如，3G或4G)、局域网(LAN)和广域网(WAN)，例如，互联网。
本文所描述的本发明主题可以实施为一个或多个计算机程序产品，如一个或多个有形地具体化于信息载体(例如，在非暂时性计算机可读介质中)中的计算机程序，以用于通过数据处理设备(例如，可编程处理器、计算机或多台计算机)执行操作或控制其操作。计算机程序(也被称为程序、软件、软件应用、应用程序、宏或代码)可以用任何形式的编程语言编写，包含编译型语言或解释型语言(例如，C、C++、Perl)，并且其可以用任何形式部署，包含作为独立式程序或作为模块、组件、子例程、或适合于在计算环境中使用的其它单元。本发明的系统和方法可以包含用本领域已知的任何合适的编程语言编写的指令，包含但不限于C、C++、Perl、Java、ActiveX、HTML5、Visual Basic或JavaScript。
计算机程序未必对应于文件。程序可以存储在保持其它程序或数据的文件或文件的一部分中，存储在专用于相关程序的单个文件中或存储在多个协调文件(例如，存储一个或多个模块、子程序或代码的各部分的文件)中。计算机程序可以被部署成在一个计算机上执行或者在一个站点处或跨多个站点分布且通过通信网络互联的多个计算机上执行。
文件可以是数字文件，例如，存储在硬盘驱动器、SSD、CD或其它有形的非暂时性介质上。文件可以通过网络从一个装置发送到另一个装置(例如，作为数据包从服务器发送到客户端，例如，通过网络接口卡、调制解调器、无线卡或类似装置)。
根据本发明的对文件进行写入涉及例如通过添加、移除或重新排列颗粒对有形的非暂时性计算机可读介质进行转换(例如，通过读/写头将具有净电荷或偶极矩的有形的非暂时性计算机可读介质转换为磁化模式)，然后这些模式表示用户所期望的和对用户有用的关于客观物理现象的新信息搭配。在一些实施例中，写入涉及有形的非暂时性计算机可读介质中的材料的物理转换(例如，具有某些光学特性以便光学读/写装置然后可以读取新且有用的信息配置，例如，刻录CD-ROM)。在一些实施例中，写入文件包含转换物理闪速存储器设备，如NAND闪速存储器装置，并通过转换由浮栅晶体管制成的存储器单元阵列中的物理元件来存储信息。写入文件的方法在本领域是众所周知的，并且例如，可以由程序手动地或自动地调用或由来自软件的保存命令或来自编程语言的写入命令调用。
合适的计算装置通常包含大容量存储器、至少一个图形用户接口、至少一个显示装置，并且通常包含装置之间的通信。大容量存储器展示了一种计算机可读介质，即计算机存储介质。计算机存储介质可以包含在任何方法或技术中实施用于存储如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据等信息的易失性、非易失性介质以及可移动和不可移动介质。计算机存储介质的实例包含RAM、ROM、EEPROM、闪速存储器或其它存储器技术、CD-ROM、数字通用盘(DVD)或其它光盘存储装置、磁盒、磁带、磁盘存储装置或其它磁存储装置、射频识别标签或芯片，或可以用于存储期望信息并且可以由计算装置访问的任何其它介质。
如本领域技术人员所认识到的，对于本发明的方法的执行是必要的或最适合的，本发明的计算机系统或机器包含一个或多个处理器(例如，中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)或两者)、主存储器和静态存储器，其通过总线彼此通信。
在图16所示的示例性实施例中，系统200可以包含计算机249(例如，膝上型计算机、台式计算机或平板计算机)。计算机249可以被配置成通过网络209通信。计算机249包含一个或多个处理器259和存储器263以及输入/输出机构254。在本发明的方法采用客户端/服务器架构的情况下，可以使用服务器213执行本发明的方法的步骤，该服务器包含处理器221和存储器229中的一个或多个，能够获得数据、指令等，或者通过接口模块225提供结果，或者将结果作为文件217提供。服务器213可以通过计算机249或终端267通过网络209参与，或者服务器213可以直接连接到终端267，包含一个或多个处理器275和存储器279，以及输入/输出机构271。
对于I/O 249、237或271中的任一个，根据本发明的系统200或机器可以进一步包含视频显示单元(例如，液晶显示器(LCD)或阴极射线管(CRT))。根据本发明的计算机系统或机器还可以包含字母数字输入装置(例如，键盘)、光标控制装置(例如，鼠标)、磁盘驱动单元、信号生成装置(例如，扬声器)、触摸屏、加速度计、麦克风、蜂窝射频天线和网络接口装置，该网络接口装置可以是例如网络接口卡(NIC)、Wi-Fi卡或蜂窝调制解调器。
根据本发明的存储器263、279或229可以包含机器可读介质，其上存储有使本文所描述的方法或功能中的任何一个或多个方法或功能具体化的一组或多组指令(例如，软件)。在计算机系统执行软件期间，该软件还可以完全或至少部分地驻留在主存储器内和/或处理器内，主存储器和处理器还构成机器可读介质。软件可以进一步通过网络接口装置在网络上传输或接收。
多路复用和感应充电
在某些实施例中，在本发明的系统和方法中使用样品装载和分析的多路复用，任选地使用感应充电进行分析。此类方法描述于例如美国专利申请公开第2020/0381238号中，该美国专利申请公开的内容通过引用整体并入本文。在某些实施例中，感应DC nESI电离源包含3D电控移动平台、发射器固持器和弹簧针固持器。在此类实施例中，发射器固持器预装载了96个发射器和样品。发射器固持器通过3D打印连接器附接到3D移动台。发射器固持器被设计成易于与移动台附接并从其拆卸以便于样品引入和清洁。发射器固持器的前部(面向MS入口的一侧)具有96个孔以固持96个发射器。在孔内部，存在96个长度与发射器固持器的长度相同的单独电极。当将发射器装载到固持器中时，这些电极被插入到发射器中但不到达样品溶液。电极的另一端从后部(与MS入口相对的一侧)开始并且焊接到具有96个孔的PCB。在PCB上，存在96个通过焊接与96个电极电接触的经隔离的铜层。放置在PCB后面的弹簧针电极与MS入口对齐。弹簧针电极的位置由3D移动台的固定臂上的弹簧针固持器固定。弹簧针电极接触PCB。当装置运行时，运动控制系统首先到达右上方的起点，并在竖直的y方向上移动以寻找第一行发射器，并且然后在水平的x方向上移动以依次分析第一行中的样品。当发射器与MS入口对齐时，弹簧针接触PCB上对应铜层并向电极施加2到3.5kV电压，以诱导发射器的尖端中的样品的DC nESI电离。应注意，电极不接触样品，因此电离被诱导。由于感应nESI中的流速非常低，因此尽管样品体积非常小，但仍有足够的时间记录高质量的MS数据。
为了解决传统nESI工作流程呈现的样品引入问题，开发了一种使用多路复用系统的“浸渍即走(dip and go)”策略。在这种方法中，将96个尖端大小为20微米的发射器预装载到发射器固持器中。固持器的大小被设计成与标准96孔板的大小相对应，并且每个发射器的位置与96孔板中每个孔的位置相对应。为了装载样品，一个人固持发射器固持器并使带有发射器的一侧面向96孔板，降低固持器并允许每个发射器被浸没到样品溶液中10秒钟并且然后抬起固持器。此程序可以手动地完成，或者可以用机器人完成。引入到发射器中的样品溶液量为大约100nL。样品装载量可以通过使用不同的装载时间而变化。
在样品分析之前可以对发射器上的样品应用诱导电泳清洁(“脱盐”)以实现具有复杂基质的样品的更好的分析性能。通过同时向电极施加电压(例如，大于5kV，其中极性与nESI分析所用极性相同或相反)，在发射器尖端中的样品中诱导的高电场将导致电泳。离子迁移率大的离子，如溶液中的来自简单盐的阴离子和阳离子将朝向溶液的两端迁移，从而使离子迁移率小的物质，如肽将基本上保持在其原始位置并将经历选择性电离。
为了进行离线电泳清洁，一个人固持发射器固持器并允许PCB的铜层接触连接到电源的高压输出的铜板。在距离发射器尖端0.5cm至1cm的距离处，放置另一个接地的铜板以便在样品溶液中建立较大的电位变化以启动电泳。电泳维持10秒并且然后将发射器固持器重新安装到3D移动台平台的背面上。按照A部分中描述的相同步骤，一个人记录清洁的样品的光谱。此方法更方便但稍慢(因为清洁会稍微减慢用于电离的运动率)。
离线清洁的替代方案是使用一个用于清洁的HV电源以及第二个用于电离的HV电源进行在线清洁。为了进行在线电泳清洁，将发射器固持器附接到移动台。在进行清洁时，移动台允许发射器固持器从左向右移动。弹簧针固持器上的左弹簧针供应-6kV电压以诱导对指向接地的对电极的样品的电泳清洁。随后，在清洁之后，发射器移动并与MS入口对齐，在该点处，施加到弹簧针固持器上的具有2kV至3.5kV电压的右弹簧针电极通过A中描述的相同过程对发射器中的样品启动感应nESI分析。此方法更快并且样品筛选率可以被最大化。
如上所述，感应充电在多路复用分析设置中可以是有用的。感应充电进一步描述于例如美国专利第9,184,036号中，该美国专利的内容通过引用整体并入本文。在感应充电中，探针包含喷雾发射器和电压源并且探针被配置成使得电压源不与喷雾发射器或由喷雾发射器发射的喷雾接触。以此方式，离子通过感应充电产生，即，感应方法用于对初级微液滴充电。这使得液滴产生与样品引入系统的打开同步(并且也与雾化气体的脉冲同步)。由于缺乏物理接触，感应nESI可以实施以用于各种nESI阵列。
实例包含圆形和线性模式。在示例性旋转阵列中，距每个喷雾器约2mm放置的电极进而供应有2-4kV正脉冲(10-3000Hz)，从而给出一系列离子信号。使用在相邻nESI发射器中诱导产生的电压可以在线性阵列中产生同时或顺序的离子信号。可以在正检测模式和负检测模式两者下观察纳米电喷雾羽流并在质谱中检测分析物。在电泳清洁工作模式下，直流电压源(1.5-6kV)用于诱导纳米电喷雾。与由交流电流电压感应的先前实例不同，感应电场在此模式下保持相同的方向，这确保了高效的电泳清洁性能。
离子阱和质谱仪
本领域已知的任何离子阱均可以用于本发明的系统中。示例性离子阱包含双曲线离子阱(例如，美国专利第5,644,131号，该美国专利的内容通过引用整体并入本文)、圆柱形离子阱(例如，Bonner等人,《国际质谱法与离子物理学杂志(International Journal ofMass Spectrometry and Ion Physics)》,24(3):255-269,1977，该文献的内容通过引用整体并入本文)、线性离子阱(Hagar,《质谱法快讯(Rapid Communications in MassSpectrometry)》,16(6):512-526,2002，该文献的内容通过引用整体并入本文)以及直线形离子阱(美国专利第6,838,666号，该美国专利的内容通过引用整体并入本文)。
任何质谱仪(例如，微型质谱仪的台式质谱仪)均可以用于本发明的系统中并且在某些实施例中，该质谱仪是微型质谱仪。示例性微型质谱仪描述于例如Gao等人,(《分析化学(Anal.Chem.)》2008,80,7198-7205.)，该文献的内容通过引用整体并入本文。与具有数千瓦功率的用于实验室规模仪器的泵送系统相比，微型质谱仪的泵送系统通常较小，如用于Gao等人所描述的系统的仅具有5升/分钟(0.3立方米/小时)隔膜泵和11升/秒涡轮泵的18W泵送系统。其它示例性微型质谱仪描述于例如Gao等人,(《分析化学》,2008,80,7198-7205.)，Hou等人,(《分析化学》,2011,83,1857-1861.)，以及Sokol等人,(《国际质谱法杂志(Int.J.Mass Spectrom.)》,2011,306,187-195)，这些文献中的每个文献的内容通过引用整体并入本文。
迷你12的控制系统(Linfan Li,Tsung-Chi Chen,Yue Ren,Paul I.Hendricks,R.Graham Cooks和Zheng Ouyang,“微型环境质量分析系统(Miniature Ambient MassAnalysis System)”《分析化学(Anal.Chem.)》2014,86 2909-2916,DOI:10.1021/ac403766c；和860.Paul I.Hendricks,Jon K.Dalgleish,Jacob T.Shelley,MatthewA.Kirleis,Matthew T.McNicholas,Linfan Li,Tsung-Chi Chen,Chien-Hsun Chen,JasonS.Duncan,Frank Boudreau,Robert J.Noll,John P.Denton,Timothy A.Roach,ZhengOuyang和R.Graham Cooks,“使用背负式微型质谱仪进行自主原位分析和实时化学检测：概念、仪器开发和性能(Autonomous in-situ analysis and real-time chemicaldetection using a backpack miniature mass spectrometer:concept,instrumentation development,and performance)”《分析化学》,2014,86 2900-2908DOI:10.1021/ac403765x，该文献中的每个文献的内容通过引用整体并入本文)，以及迷你10的真空系统(Liang Gao,Qingyu Song,Garth E.Patterson,R.Graham Cooks和ZhengOuyang,“手持直线形离子阱质谱仪(Handheld Rectilinear Ion Trap MassSpectrometer)”,《分析化学》,78(2006)5994-6002DOI:10.1021/ac061144k，该文献的内容通过引用整体并入本文)可以组合以产生图9所示的微型质谱仪。其大小可以类似于鞋盒的大小(H20 cm x W25 cm x D35 cm)。在某些实施例中，微型质谱仪使用双LIT配置，例如描述于Owen等人(美国专利申请序列号14/345,672)以及Ouyang等人(美国专利申请序列号61/865,377)，这些文献中的每个文献的内容通过引用整体并入本文。
实例
实例1
通过高通量方法并使用乙酰胆碱(0.25mM，m/z 146)作为内标物获得胆碱(m/z104)的校准曲线(图12)。所有样品均在生物测定基质(0.1M磷酸盐缓冲液，pH 8，0.1％BSA)中制备并且在无任何预处理的情况下进行分析。使用流体处理机器人在每个浓度(和空白)下制备了九个单独的样品，并且然后在相同的PTFE涂覆的板上的不同位置中钉扎四次作为50nL的斑点，从而得到总共216个斑点。DESI-MS用于正离子模式下的板分析(喷雾溶剂：MeOH，所施加的电压：4kV、仪器：离子阱)。
数据采集和处理由CHRIS软件控制。所有斑点的有效分析时间均在四分钟以下。校准曲线中的每个数据点表示36个斑点的平均值(9种单独溶液，每种溶液重复4次)。为拟合数据而调整的线性模型的确定系数(R2)为0.998。在不同的天数钉扎不同的载玻片之后，结果是可重复的。
实例2
图13的图A示出了用于评估方法的性能的模拟抑制图。探索了八种不同的胆碱/乙酰胆碱比率(m/z 104/146)，从而保持底物加产物的总浓度不变([胆碱]+[乙酰胆碱]＝500μM)。这些溶液模拟了来自抑制实验的结果(其中乙酰胆碱向胆碱的转化将随着抑制剂浓度的增加而降低乙酰胆碱比率)。预期的行为(在曲线的至少一个区域内)是对数的。如图13的图B所观察到的，对数转换数据示出了预期的线性行为(R2＝0.996)。这说明了该方法如何用于在不需要内标物、标记或样品预处理的情况下计算IC50值。使用流体处理机器人在生物测定基质(0.1M磷酸盐缓冲液，pH 8，0.1％ BSA)中制备所有溶液，并且然后在相同的PTFE涂覆的板上快速钉扎四次。DESI-MS用于正离子模式下的板分析(喷雾溶剂：MeOH，所施加的电压：4kV，仪器：Thermo线性离子阱)。数据采集和处理由CHRIS软件控制。在两个图中，每个数据点表示12个斑点的平均值(3种单独溶液，每种溶液重复4次)。所有斑点的有效分析时间(包含空白)均在3分钟以下。
实例3
图14的图A-B示出了仅在添加酶之后的生物测定混合物(图A)和在室温下温育30分钟之后的生物测定混合物(图B)(在0.1M磷酸盐缓冲液中，pH 8，0.1％ BSA)的代表性质谱。如可以观察到的，乙酰胆碱(m/z 146)在实验条件下温育之后完全转化为胆碱(m/z104)。使用DESI-MS在正离子模式下获取数据(喷雾溶剂：MeOH，所施加的电压：4kV，仪器：离子阱)而无需任何样品预处理，仅在生物测定混合物点样之后。
实例4
图15的图A示出了用于使用不同的质谱仪(Waters QToF)评估方法的性能的模拟对数抑制图。以与图14的图A-B类似的方式获得数据。通过使用三种不同的酶与底物的比率，获得了三个图(具有统计学上相同的斜率)。使用胆碱的强度(m/z 104)除以乙酰胆碱的分子离子(m/z 146)、其片段(m/z 87)或两者之和(m/z 146+87)计算这些比率。结果表现如预期。图15的图B示出了使用QToF仪器通过方法获得的典型光谱。
通过引用并入
贯穿本公开已经参考和引用了其它文献，如专利、专利申请、专利公开、杂志、书籍、论文、网络内容。出于所有目的将所有此类文献特此通过引用整体并入本文。
等效物
本发明可以在不偏离其精神或实质特征的情况下以其它具体形式实施。因此前述实施例应当在所有方面被视为是说明性的而不是限制本文所描述的本发明。
Claims (22)
1.一种用于分析一种或多种酶促反应的方法，所述方法包括：
在底物上制备多个离散斑点，其中所述离散斑点中的每一个包括一种或多种酶促反应的底物和产物；
将来自电离源的排出物依次引导到所述多个离散斑点中的每一个上，以从所述离散斑点中的每一个中依次解吸所述底物和/或所述产物并由所述离散斑点中的每一个依次产生所述底物和/或所述产物的进入质谱仪的离子；以及
依次分析所述质谱仪中来自所述离散斑点中的每一个的所述底物和/或所述产物的所述离子，由此分析所述一种或多种酶促反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述电离源为解吸电喷雾电离探针(DESI)并且所述排出物为DESI喷雾。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括相同的测试化合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括基于对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物是否抑制所述酶促反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括基于所述对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物抑制所述酶促反应的完全程度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶促反应与生理病状相关，并且确定所述测试化合物抑制所述酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将所述测试化合物开发成治疗所述病状的药物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括所述酶促反应的酶的抑制剂和测试化合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述测试化合物是否能够抵消所述抑制剂以及重新开始所述酶促反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括基于所述对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物抵消所述抑制剂的完全程度以及重新开始所述酶促反应的完全程度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中确定所述测试化合物抵消所述抑制剂的完全程度以及重新开始所述酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将所述测试化合物开发成抵消所述抑制剂的药物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个来自酶促反应中的不同时间点。
12.一种用于分析一种或多种酶促反应的方法，所述方法包括：
在底物上制备多个离散斑点，其中所述离散斑点中的每一个包括一种或多种酶促反应的底物和产物；
将来自电离源的排出物依次引导到所述多个离散斑点中的每一个上，以从所述离散斑点中的每一个中依次解吸所述底物和/或所述产物并由所述离散斑点中的每一个依次产生所述底物和/或所述产物的进入质谱仪的离子；
依次获得所述质谱仪中来自所述离散斑点中的每一个的所述底物和/或所述产物的所述离子的离子强度；以及
通过应用校准曲线将来自所述离散斑点中的每一个的所述底物和/或所述产物的所述离子的离子强度转换为所述底物与所述产物的浓度比，由此分析所述一种或多种酶促反应。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述电离源为解吸电喷雾电离探针(DESI)并且所述排出物为DESI喷雾。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括相同的测试化合物。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括基于对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物是否抑制所述酶促反应。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括基于所述对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物抑制所述酶促反应的完全程度。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述酶促反应与病状相关，并且确定所述测试化合物抑制所述酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将所述测试化合物开发成治疗所述病状的药物。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个的子集进一步包括所述酶促反应的酶的抑制剂和测试化合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述测试化合物是否能够抵消所述抑制剂以及重新开始所述酶促反应。
20.根据权利要求19所述的方法，其进一步包括基于所述对所述酶促反应的进展的监测来确定所述测试化合物抵消所述抑制剂的完全程度以及重新开始所述酶促反应的完全程度。
21.根据权利要求20所述的方法，其中确定所述测试化合物抵消所述抑制剂的完全程度以及重新开始所述酶促反应的完全程度确定了是否应考虑将所述测试化合物开发成抵消所述抑制剂的药物。
22.根据权利要求12所述的方法，其中所述多个离散斑点中的每一个来自酶促反应中的不同时间点。
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