EP1356086A2 - Verfahren zum simultanen positionsspezifischen schneiden von fadenförmigen organischen molekülketten, insbesonere dna - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum simultanen positionsspezifischen Schneiden von fadenförmigen organischen Molekülketten, insbesondere DNA. Die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren anzugeben, mit Hilfe dessen an bestimmten -frei wählbaren- Sequenzen und simultan an vielen fadenförmigen Molekülen hochspezifisch geschnitten werden kann wird dadurch gelöst, dass Nanopartikel (1) mit einer Molekülkette (11) beliebig vorgebbarer Sequenz versehen werden, die komplementär zu einer Sequenz eines zu schneidenden Moleküls (2) gewählt wird, diese Molekülkette(n) (11) mit dem Molekül (2) auf übliche Weise hybridisiert oder auf andere Weise spezifisch gebunden werden und anschliessend die Nanopartikel (1) einer energiereichen, von den Nanopartikeln (1) absorbierbaren Strahlung wenigstens einer Wellenlänge ausgesetzt werden.

Description

Verfahren zum simultanen positionsspezifischen Schneiden von fadenförmigen organischen Molekülketten, insbesondere DNA

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum simultanen positionsspezifischen Schneiden von fadenförmigen organischen Molekülketten, insbesondere zum sequenzspezifischen Schneiden von DNA. Das Schneiden von DNA an definierten Stellen ist eine Grundtechnik der Molekularbiologie. Bislang kommen im Routinelabor ausschließlich Enzyme (Restriktionsenzyme) zum Einsatz, die eine spezifische Schnittsequenz haben. So schneidet zum Beispiel das Enzym EcoRI doppelsträngige DNA an allen Positionen mit der folgenden Basensequenz: 5' G A A T T C 3'

3X T T A A G 5' Derartige Schnitte werden für die Manipulation von DNA z.B. den Einbau neuer Abschnitte oder die definierte Verkürzung, routinemäßig benutzt. Ein ganzes Gebiet der DNA-Analytik, das sogenannte "finge rinting", beruht auf der Variation der Längenverteilung von DNA nach dem Einsatz derartiger Enzyme, die sich im Restriction Fragment Length Polymorphism (Restriktions-Fragment-Längen-Polymoφhismus ) dokumentieren. Wenn es in einzelnen Individuen eine Mutation im Bereich einer Schnittsequenz gibt (also anstatt eines T beispielsweise ein A im obigen Schema), kann die DNA dort nicht geschnitten werden, und es entstehen DNA-Fragmente mit anderen Längen als in Individuen ohne Mutation an dieser Stelle. Das Muster der Längenverteilung kann daher für die Identifizierung des einzelnen Individuums benutzt werden, was beispielsweise in der Forensik oder bei Vaterschaftsfeststellungen eingesetzt wird. Die dabei benutzte extrem hohe Sensitivität diese Verfahrens (die Veränderung einer einzelnen Base kann detektiert werden) wird ebenfalls für die Bestimmimg genetischer Defekte (z.B. Erbkrankheiten) genutzt, die an Schnittsequenzen lokalisiert sind. Bei all diesen Techniken ist man auf die natürlich vorkommenden Enzyme und ihre Schnittsequenzen beschränkt, andere Stellen sind so nicht zu schneiden. Um diese Einschränkung zu umgehen, gibt es Entwicklungen von E izelmolekültechniken zum Schneiden von DNA an beliebigen Stellen mittels Laserstrahls [Schütze, K., I. Becker, et al. (1997) "Cut out or poke in the key to the world of Single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease" Genetic Analysis 14(1): 1-8)] oder des Rasterkrafrmikroskops [AFM, Henderson, E. (1992) "Imaging and nanodissection of individual supercoiled plasmids by atomic force microscopy" Nucleic Acids Research 20(3): 445-447]. Ein entscheidender Nachteil beider Methoden ist die fehlende Selektivität und die große Schnittbreite. Beim Laser-Schneiden werden einige hundert Basenpaare zerstört, und eine Orientierung kann im allgemeinen nur anhand der Topologie (Anfang Ende) oder durch einen Fluoreszenz- markierten DNA-Abschnitt (FISH: fluorescence in situ hybridization) erreicht werden, wobei die optische Auflösung (>100...200 nm) die Methode limitiert. Zudem sind beide Methoden Einzelmolekültechniken, so daß ein einzelnes Molekül, aber keine dem Labormaßstab vergleichbare Anzahl von Molekülen geschnitten werden kann. Damit muß für eine Charakterisierung (z.B. Gelelektrophorese) oder Weiterbearbeitung wiederum vervielfacht werden, um mit den Standardlabormethoden kompatibel zu sein.

Um der Limitierung der begrenzten räumlichen Auflösung derartiger physikalischen Verfahren zu umgehen, wurde in der Materialverarbeitung das "proximity focusing" benutzt, bei dem ein kleines Objekt (eine Abtastspitze eines Rastert melmikroskops mit einem Radius im unteren Nanometerbereich) als hochintensive Sekundär-Strahlungsquelle betrachtet werden kann, die durch eingestrahltes Laserlicht gespeist wird [Gorbunov, A. A. and W. Pompe (1994) "Thin Film Nanoprocessing by Laser/STM Combination" phys. stat. sol. (a) 145: 333-338]. Diese Sekundärstrahlung wird dabei in der Nähe des kleinen Objektes (Nahfeldeffekt) wirksam, wodurch eine Fokussierang in der Größenordnung des Objektes erreicht wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit

Hilfe dessen an bestimmten -frei wählbaren- Sequenzen und simultan an vielen fadenförmigen Molekülen, insbesondere DNA hochspezifisch geschnitten werden kann. Dies wird durch eine spezifische Markierung mittels Nanopartikeln und anschließender Anregung dieser Partikel durch Einstrahlung von Energie erreicht. Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß Energie in einem breiteren Strahl in die Probe geschickt wird, aber durch ein geeignet plaziertes Nanoobjekt nur in einem kleinen Volumenbereich zur Wirkung kommt. Das wird durch die nanolokale Konversion der durch das Nanoobjekt lokal absorbierten Strahlungsenergie in Wärme und chemische Umsetzung erreicht.

Einzelne Moleküle wie z.B. Farbstoffe können zwar gut im Nanobereich positioniert werden, ihre Effizienz für die lokale Absorption und Konversion der Energie ist jedoch gering. Außerdem verlieren sie durch die Absorption der Strahlung häufig sehr schnell ihre absorptive Wirkung durch photochemische Prozesse. Bei vorliegender Erfindung finden hingegen elektronenleitende Nanopartikel und insbesondere metallische Nanopartikel und unter diesen wiederum solche aus schweren Edelmetallen Verwendung. Diese sind außerdem, im Gegensatz zu Farbstoflmarkern, nicht nur in einem schmalen Spektralbereich sondern breitbandig anwendbar. Neben elektromagnetischer Strahlung (IR- Strahlung, sichtbares Licht, UV-Licht, Röntgenstrahlung) kann auch die Energie aus Strahlen schneller Teilchen wie etwa Elektronen oder Ionen effektiv konvertiert werden. Im optischen Bereich wird die Effizienz der Strahlungskonversion durch die schmalen intensiven Banden der Plasmonenresonanz gesteigert. Durch Anwendung von Partikeln aus gleichem Material, aber unterschiedlicher Größe lassen sich Plasmonenresonanzen bei unterschiedlicher Wellenlänge nutzen, um zusätzlich lokale Schnittstellen zu adressieren oder lokal eng begrenzte Schnitte durch die kooperative Wirkung von zwei oder mehr Wellenlängen zu erreichen.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines schematischen Ausfuhrungsbeispiels näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 a-e schematisch den Ablauf des Verfahrens anhand eines einzelnen Molekülstrangs, Fig. 2 a-c verdeutlicht gewisse Schwierigkeiten beim Schneiden langgestreckter Moleküle, die eine dreidimensionale Faltung aufweisen und

Fig. 3 a-c zeigt eine Lösungsmöglichkeit zur Vermeidung der Schwierigkeiten nach Fig. 2 a-c.

Im Rahmen der Erfindung kommen Nanopartikel in einem Größenbereich zwischen 1 nm bis 150 nm zum Einsatz. Im Beispiel werden Gold- Nanopartikel 1 mit einem typischen Durchmesser von 15 nm durch spezifische Bindung an die gewünschte Sequenz entlang eines DNA- Strangs 2 plaziert und dann durch Einstrahlung von geeigneter Energie (Licht) angeregt. Dazu werden die Nanopartikel 1 zunächst mit einem kurzen DNA-Molekül 11 mit mehr als zehn Basen, wobei in Fig. lb und c aus Gründen der besseren Übersicht lediglich vier dargestellt sind, versehen, dessen Sequenz komplementär zu der zu schneidenden DNA 2 (Ziel-DNA vgl. Fig. la, bei der beispielhaft eine Teilsequenz eines Einzelstrangs vergrößert dargestellt ist) an der Schnittstelle ist. Damit wird eine spezifische Bindung des Nanopartikel 1 an einem definierten Ort entlang der DNA 2 erreicht (vgl. Fig. lc, wobei die spezifische Bindung wiederum vergrößert dargestellt ist). Anschließend werden ein, bevorzugt mehrere derart sequenzspezifisch markierte DNA-Moleküle einer energiereichen Strahlung, bspw. mit Licht eines Argonlasers bei einer oder mehreren Wellenlängen, um unterschiedliche Nanopartikel, die an verschiedenen Sequenzabschnitten gebunden sind, zu adressieren, ausgesetzt. Durch Absorption der Energie am Nanopartikel kommt es zu einer lokalen Erhitzung des Partikels und der Umgebung, wie es in Fig. ld schematisch angedeutet ist, die eine Durchtrennung des DNA- Strangs zur Folge hat (vgl. Fig. le). Dabei kann die Schnittgenauigkeit (=Breite des Schnittes) durch eine Abstimmung der eingestrahlten Energie fein reguliert werden. Eine Zielgenauigkeit (=Ort des Schnittes) im unteren Nanometerbereich wird durch das selbstorganisierende System von Partikeln mit behebig vorgebbarer DNA-Bindesequenz garantiert, welche an die Schnittstelle^) auf der Ziel-DNA durch Hybridisierung (Paarung komplementärer DNA-Bereiche) binden. Diese Hybridisierung kann beispielsweise nach lokalem Öflhen ("Aufschmelzen") des DNA-Doppelstrangs in Form eines Doppelstranges oder durch Anlagerung der Bindesequenz an den Doppelstrang unter Bildung einer Triplexstruktur (ist unter bestimmten Bedingungen, die vor allem von Salzgehalt und Basensequenz abhängen, energetisch begünstigt) erfolgen. Ein wesentlicher Vorteil vorliegender Erfindung ist, daß die Einstrahlung der Energie großflächiger und damit technologisch unproblematischer erfolgen kann, als die bekannten Verfahren.

Ein Problem bei den typischerweise langgestreckten DNA-Molekülen stellt die dreidimensionale Faltung dar. Wie in den Figuren 2 a-c gezeigt, können dabei trotz genauer Positionierung des Nanopartikels mehrere zusätzliche unbeabsichtigte Schnitte entstehen, da durch Rückfaltung des Strangs andere Abschnitte des Moleküls 2 in die Nähe des angeregten Nanopartikels 1 kommen. Eine gewisse Regulierung der Rückfaltung ist über die Salzkonzentration der Lösung möglich, die die Steifigkeit der DNA beeinflußt. Eine globuläre Struktur kann durch eine Streckung des Moleküls 1 verhindert werden, die aber Einzelmolekültechniken (optische Pinzette) oder aber andere aufwendige Methoden wie Flüssigkeitsstrom und/oder elektrisches Feld vorzugsweise in Kombination mit einseitiger Bindung verlangt.

Eine einfache und vor allem hoch parallelisierbare Lösungsvariante stellt die Bindung der Nanopartikel 1 auf geeigneten Oberflächen 4 dar. Dabei muß das benutzte Substratmaterial so beschaffen sein, daß keine nennenswerte Absorption der eingesetzten Strahlung erfolgt, z.B. Glas im Fall des Einsatzes von Licht zur Anregung der Nanopartikel. Es liegt ebenfalls im Rahmen der Erfindung, daß die Nanopartikel 1 durch auf der Oberfläche 4 strukturierte Spots gebildet werden. Nach der Immobilisierung der Nanopartikel 1 mit kurzer DNA 11 auf der Oberfläche 4, wozu diese bspw. im Falle der Verwendung von Glas silanisiert oder mit einer anderen die Haftung der Partikel ermöglichenden Schicht versehen sein kann, erfolgt die Anlagerung der DNA 2 nach dem in Fig. 1 beschriebenen Schema der spezifischen Bindung durch DNA- Basenpaarung (Hybridisierung). Nun kann das DNA-Molekül 2 das Nanopartikel 1 nicht mehr im Raum umgeben, da die Möglichkeiten der Rückfaltung stark eingeschränkt sind, womit die Wahrscheinlichkeit von Mehrfachschnitten, wie in Fig. 2 dargestellt, minimiert wird. Vorteilhafte Anwendungen des vorgeschlagenen Verfahrens sind zu sehen in:

- der Restriktionsanalyse von DNA (z. B. Restriktions-Fragment-Längen- Polymorphismus). Mit dem vorgeschlagenen Verfahren können diese Analysen maßgeschneidert für bestimmte Gene durchgeführt werden.

Dadurch werden viele Gene erst erreichbar, die außerhalb der bekannten Enzymschnittstellen liegen.

- dem gezielten Ausschneiden von Genabschnitten aus größeren DNA- Molekülen. Hierfür können Schneidesequenzen so ausgesucht werden, daß der gesuchte Abschnitt einfach isoliert werden kann (z.B. durch einzigartige Länge), und nicht aus einer Vielzahl gleich- und ähnlich langer DNA-Fragmente abgetrennt werden muß.

- in einer kontrollierten Freisetzung von DNA-Fragmenten. Hierzu ist nach dem Stand der Technik ein Verfahren bekannt, bei dem Oberflächenbereiche mit immobilisierter doppelsträngiger DNA mittels

Laser soweit erhitzt werden, daß es zur Öffnung des Doppelstrangs ("Aufschmelzen") kommt. Dabei müssen Temperaturen oberhalb der Schmelztemperatur (50-95°C) lokal erzeugt werden, ohne daß es zu Temperaturspitzen und damit einer Schädigung der Moleküle kommt. Basierend auf der hier vorgeschlagenen Erfindung kann dieses komplizierte Temperaturregime durch die Benutzung von immobilisierten Kolloiden ersetzt werden, die Moleküle mit Schneidesequenz binden (vergl. Fig. 3a). Durch eine entsprechende Belichtung werden diese Moleküle geschnitten (Fig. 3b) und die Fragmente dabei freigesetzt (Fig. 3c). Dieser Vorgang läßt sich noch parallelisieren, indem verschiedene Schnittsequenzen in verschiedenen Oberflächenbereichen gebunden werden, und diese Bereiche dann unabhängig voneinander beuchtet werden. Dabei kommt es zur definierten Freisetzung der jeweiligen Fragmente.

Die Erfindung ist nicht auf das in den Ausfuhrungsbeispielen beschriebene sequenzspezifische Schneiden von DNA beschränkt, sondern grundsätzlich auch auf andere Biopolymere anwendbar, bei denen eine positionsspezifische Anbindung der mit geeigneten Bindungspartnern versehenen Nanopartikel möghch ist. Auch kann die Art der zum Einsatz gelangenden Strahlung eine andere als die beschriebene sein, sofern die eingesetzten Nanopartikel die dort abgegebene Energie absorbieren.

Die Nanopartikel können sowohl aus Metall- als auch Halbleiteφartikeln wie auch aus Kompositen aus diesen Materialien gebildet sein und organische Komponenten umfassen. Der Durchmessers der Partikel kann durch eine Abscheidung von z.B. Metall-, Halbleiter- oder organischen Materiahen eingestellt werden.

Die Verwendung verschiedener Größenklassen von Partikeln in Zusammenhang mit jeweils abgestimmten Strahlungsquellen erlaubt die voneinander unabhängige Prozessienmg verschiedener Teilmengen, wie in Fig. 4b anhand von DNA erläutert. Durch die Verwendung verschiedener, in diesem Beispiel zwei Partikelklassen, die sich in ihrer Energieabsoφtion unterscheiden (z.B. aufgrund verschiedener Durchmesser), kann durch selektive Einstrahlung gezielt nur eine Klasse aktiviert werden.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum simultanen positionsspezifischen Schneiden von fadenförmigen organischen Molekülketten, insbesondere DNA dadurch gekennzeichnet, daß Nanopartikel (1) mit einer Molekülkette (11) beüebig vorgebbarer Sequenz versehen werden, die komplementär zu einer Sequenz eines zu schneidenden Moleküls (2) gewählt wird, diese Molekülkette(n) (11) mit dem Molekül (2) auf übliche Weise hybridisiert oder auf andere Weise spezifisch gebunden werden und anschließend die Nanopartikel (1) einer energiereichen, von den Nanopartikeln (1) absorbierbaren Strahlung wenigstens einer Wellenlänge ausgesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bezüghch ihres Strahlungsabsoφtionsvermögens wenigstens zwei voneinander unterschiedliche Chargen von Nanopartikeln (1), die jeweils unterschiedliche Molekülketten (11) tragen, eingesetzt werden, wobei die zu einer Nanopartikelcharge gehörigen Molekülketten (11) jedoch eine identische Sequenz aufweisen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei Wahl von unterschiedlichen Nanopartikeln (1) gleicher Materialzusammensetzung diesen eine voneinander abweichende Größe gegeben wird.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (1) metallische Partikel, vorzugsweise aus schweren Edelmetallen gewählt werden.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als energiereiche, von den Nanopartikeln (1) absorbierbaren Strahlung diffus eingestrahltes Licht verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Nanopartikel (1) unterschiedlicher Materialzusammensetzung gewählt werden, wobei Nanopartikelchargen gleicher Materialzusammensetzung jeweils identische Sequenzen von Molekülketten (11) zugeordnet werden.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Molekülketten (11) versehenen Nanopartikel (1) einseitig auf geeigneten Oberflächen (4) immobilisiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für genannte Oberflächen (4) ein Material eingesetzt wird, das im Gegensatz zu den Nanopartikeln (1) wenig oder keine Strahlung absorbiert.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nanopartikel (1) durch auf der Oberfläche (4) strukturierte Spots gebildet werden.