WO1999053093A1 - Verfahren zur durchführung von reaktionen zwischen mindestens zwei reaktionspartnern in wässrigen reaktionsgemischen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von Reaktionen zwischen mindestens zwei Reaktionspartnern, insbesondere Biomolekülen, wobei mindestens ein Reaktionspartner Reaktionsbereiche mit unterschiedlichen Reaktionsbedingungen durchläuft und mindestens ein Reaktionspartner, beispielsweise ein Feature eines Bio-Chips, immobilisiert ist, und wobei die Reaktionsgemische hydrodynamisch bewegt werden.

Description

"Verfahren zur Durchfuhrung von Reaktionen zwischen mindestens zwei Reaktionspartnern in wäßrigen Reaktionsgemischen"

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchfuhrung von Reaktionen zwischen mindestens zwei Reaktionspartnern, insbesondere Biomolekulen, wobei mindestens ein Reaktionspartner Reaktionsbereiche mit unterschiedlichen Reaktionsbedingungen durchlauft und mindestens ein Reaktionspartner, beispielweise ein Feature eines Bio-Chips, immobilisiert ist, und wobei die Reaktionsgemische hydrodynamisch bewegt werden

Bio-Chips sind typischerweise zweidimensionale Anordnungen (Arrays) von Gruppen (Features) von immobilisierten, einzelstrangigen Biomolekulen, im folgenden immobilisierte Sonden genannt, zum Beispiel Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Molekule mit bestimmten Basenabfolgen (Sequenzen), oder Polypeptide, wie Antikörper oder sonstige Proteine. Die Basenabfolge (Sequenzen) der DNA-

Molekule in den einzelnen Features bzw. die Abfolge der Aminosaurereste in den Polypeptiden wie Proteinen oder Antikörpern und/oder andere diese charakterisierende Eigenschaften sind bekannt, so daß z.B. einem Feature mit DNA einer bestimmten Sequenz oder mit einem Polypeptid mit einer bestimmten Amino- sauresequenz bestimmte räumliche Positionskoordinaten zugeordnet werden können

Im folgenden Beispiel enthalt ein DNA-Chip 1 0.000 Features. Jedes Feature hat einen mittleren Durchmesser von 50 μm. Bei einer Rasteranordnung betragt der mittlere Abstand zwischen den Feature-Mittelpunkten 1 00 Mikrometer Jedes

Feature enthalt im Mittel eine große Zahl einzelstrangiger DNA-Molekule (z.B in der Größenordnung 1 00.000, 1 Million oder 1 0 Millionen) als immobilisierte Sonden von jeweils derselben oder überwiegend derselben Sequenz von z.B. 20 oder 30 Basenpaaren Lange. Allgemein kann die Geometrie, die Zahl, Anordnung und Geometrie der Features, die Zahl und Basenabfolge der immobilisierten 2

Sonden in den einzelnen Features in weiten Grenzen variiert werden

Eine wesentliche Anwendung derartiger DNA-Chips besteht darin, mit ihrer Hilfe Aussagen über die Sequenz-Zusammensetzung eines unbekannten Gemisches von Nukleinsauremolekulen, insbesondere von DNA-Molekulen, zu erhalten In vielen Fallen enthalt das zu analysierende Gemisch eine große Vielfalt von unterschiedlichen Sequenzen, stellt also ein komplexes Gemisch dar. Beispielsweise enthalt das Gemisch menschliche genomische DNA aus einem Gewebe oder Tumor, die gegebenenfalls durch Polymerase-Kettenreaktionen oder ahn - ehe Methoden vor dem Einsatz amplifiziert wurde. Bei einer angenommenen

Sequenzlange von jeweils 20 - 30 Basenpaaren kann in diesem Falle aas komplexe Gemisch mehrere Millionen Arten von DNA-Molekulen mit jeweils unterschiedlichen Sequenzen enthalten. Jede oder bestimmte Sequenzen können demnach in dem komplexen Gemisch in nur sehr geringen relativen Konzen- trationen vertreten sein. In einem anderen Beispiel enthalt das komplexe Gemisch mehrere tausend unterschiedliche Sequenzen von komplementärer DNA, auch als cDNA bezeichnet, die Information über das genetische Expressionsmuster eines Gewebes enthalten.

Um eine Aussage über die Sequenz-Zusammensetzung des komplexen Gemisches zu erhalten, können Verfahren der Hybridisierung von Nukleinsauremolekulen herangezogen werden Hierzu werden in einem vielfach angewandten Verfahren zunächst mobile Sonden hergestellt, indem die zu analysierenden DNA-Molekule zunächst geeignet markiert werden, beispielsweise durch Fluo- reszenzmarkierung eines oder mehrerer Basen der Sequenz mit Fluorochromen derselben oder verschiedener spektraler Signatur. Derzeit vielfach verwendete Fluorochrome sind z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Rhodamin-Deπvate Die spektrale Signatur ist gegeben durch die optischen Eigenschaften der Substanz, wie Absorptions- und Emissionsspektrum, die Fluoreszenzlebensdauer, oder das Polaπsationsverhalten In einem typischen Hybπdisierungsverfahren wird ein Hybπdisierungsgemisch verwendet, bestehend aus einem komplexen Gemisch von einzelstrangigen, fluoreszenzmarkierten DNA-Molekulen in einer Pufferlosung und gegebenenfalls weiteren chemischen Substanzen. Um die 3 fluoreszenzmarkierten DNA-Molekule in eine einzelstrangige Konformation zu überfuhren (Denaturierung) und damit erfmdungsgemaße mobile Sonden zu erhalten, wird meist eine thermische Behandlung vorgenommen: Die für eine Denaturierung der DNA-Molekule erforderliche Temperatur (Denatuπerungs- temperatur T_D) hangt dabei stark von der chemischen Zusammensetzung des

Hybπdisierungsgemisches ab. Nach erfolgter Denaturierung wird das Hybπdisie- rungsgemisch bei einer bestimmten Temperatur (Hybπdisierungstemperatur T_H) und für eine bestimmte Zeit (Hybπdisierungszeit t_H) auf den DNA-Chip aufgebracht. Um die Voraussetzung einzelstrangiger immobilisierter Sonden zu erful- len, müssen die bereits vor Beginn der Hybπdisierungsreaktion auf den DNA-

Chips vorhandenen DNA-Molekule entweder durch das bei der Herstellung der DNA-Chips angewandte Verfahren bereits einzelstrangig sein, oder gegebenenfalls vor Beginn der eigentlichen Hybπdisierungsreaktion einer denaturierenden Behandlung unterzogen werden. Beide Denatuπerungs-Bedingungen können beispielsweise auch durch geeignete simultane thermische Behandlung des aus

Hybπdisierungsgemisch und DNA-Chip bestehenden Objektes realisiert werden.

Statt einer geeigneten Markierung der mobilen DNA-Molekule im Hybπdisierungs- gemisch kann statt dessen oder zusätzlich auch eine Markierung der auf den DNA-Chips immobilisierten DNA-Molekule erfolgen Insoweit das Verfahren lediglich für praparative Zwecke verwendet wird, z.B. der Depletion des Hybπ- disierungsgemisches von DNA-Molekulen einer bestimmten Sequenz, kann eine Markierung der Sonden gegebenenfalls auch unterbleiben. Ein weiteres Verfahren bezieht sich auf den Nachweis der Hybπdisierungsreaktion durch nicht-optische Verfahren, wie z.B. elektrische Leitfahigkeitsanderungen.

Bei geeigneten physikalich-chemischen Voraussetzungen (z.B. Temperatur, Hybπdisierungszeit, lonenzusammensetzung und pH-Wert des Puffers, Konzentration an chaotropen Substanzen wie Formamid, Dextransulfat, LiCI in hoher Konzentration etc.), kann eine stπngente Bindung von mobilen Sonden an ebenfalls einzelstrangige immobilisierte Sonden in den Features erreicht werden.

Stπngente Bindung bedeutet, daß eine Zusammenlagerung zwischen Nukleinsau- resequenzen mit komplementärer Basenabfolge zustande kommt. Nicht gebundene mobile Sonden werden gegebenenfalls durch Waschschritte entfernt Der 4 Grad der Stringenz der Hybridisierung von mobilen Sonden einer bestimmten

Sequenz mit immobilisierten Sonden der komplementären Sequenz kann zum Beispiel durch das Verhältnis der Zahl komplementärer Basenpaarungen in einem aus einer (vor der Bindung) mobilen Sonde und einer immobilisierten Sonde gebildeten Hybridmolekül zu der Gesamtzahl der Basen der Sequenz der zu hybridisierenden mobilen Sonde angegeben werden. Eine Stringenz von 1 ,0 bedeutet, daß in einem Hybridmolekül alle Basen einer (vor der Bindung) mobilen Sonde komplementäre Paarungen mit Basen einer immobilisierte Sonde eingegangen sind .

Nach vollständiger Durchführung des Hybridisierungsverfahrens enthalten die Features mit immobilisierten Sonden, die eine komplementäre Basenabfolge zu im Hybridisierungsgemisch enthaltenen mobilen Sonden besitzen, eine erhöhte Anzahl an spezifischen Markierungssignalen, z.B. von fluoreszenzmarkierten doppelsträngigen Hybridmolekülen. Je mehr zum Beispiel fluoreszenzmarkierte mobile Sonden in einem bestimmten Feature hybridisiert haben, desto höher ist die Anzahl an Fluoreszenz-Markierungssignalen in dem betreffenden Feature. Mit geeigneten Detektions-Verfahren wird dann festgestellt, welche Features eine erhöhte Anzahl von Markierungssignalen enthalten. Bei Anwendung von Fluo- reszenzmarkierungstechniken geeignete Detektionsverfahren sind z.B. Methoden der digitalen Epifluoreszenzmikroskopie mit thermischen Lichtquellen, der Lasers- canning-Mikroskopie, der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie oder der Multi- photonen-Fluoreszenzmikroskopie. Bei anderweitig markierten Sonden können zur Detektion von Hybridmolekülen andere Verfahren in Einsatz kommen. Sofern die Basenabfolge (Sequenz) der immobilisierten Sonden in einem Feature bekannt ist, ist damit aufgrund des Verfahrens auch die (komplementäre) Sequenz der dort gebundenen mobilen Sonden im Rahmen der realisierten Strin- genzanforderungen bekannt. Je höher die realisierte Stringenz, desto genauer kann die Sequenz der dort gebundenen mobilen Sonden angeben werden. Sofern aufgrund des zur Herstellung des DNA-Chips angewandten Verfahrens die

Zuordnung von Feature-Position und Sequenz der immobilisierten Sonden in dem Feature bekannt ist, erlaubt das DNA-Chip-Hybridisierungsverfahren es daher grundsätzlich, in relativ kurzer Zeit Aussagen über die Sequenz-Zusammenset- S zung komplexer Gemische von mobilen Sonden zu treffen; bei quantitativer

Analyse der Markierungssignale und geeigneter Kalibrierung sind zudem auch Angaben über die Häufigkeiten möglich, mit der mobile Sonden im Gemisch vorhanden sind. Ferner ist es bei praparativer Anwendung möglich, DNA-Molekule mit solchen Sequenzen für einen nachfolgenden Gebrauch zu isolieren. Je hoher die Anzahl der Features mit immobilisierten Sonden jeweils verschiedener Sequenz ist, desto genauer kann ein komplexes Gemisch von mobilen Sonden analysiert werden. Derzeit sind DNA-Chips mit einer Feature-Anzahl von mehreren 100.000 bis 1 000.000 realisiert bzw. in Produktion.

Die am Beispiel von DNA-Chips ausgeführte Darstellung des Standes der Technik laßt sich in einer dem Fachmann bekannten Weise auch auf andere Bio-Chips übertragen Beispielsweise werden Bio-Chips beschrieben, bei denen die Features statt einzelstrangiger DNA-Molekule als immobilisierte Sonden Polypeptide, z B Proteine, verwendet werden. Wahrend bei DNA-Molekulen die Stringenz im wesentlichen von der Gesamtzahl der Wasserstoffbruckenbindungen zwischen komplementären Basen in einem Hybπdmolekul abhangig ist, kann die Spezifitat der Protein-Proteinbindung beispielsweise durch die Anzahl der Wasserstoffbruckenbindungen sowie Van-der-Waals-Bindungen zwischen den Proteinen charakterisiert werden, die in diesem Falle stark von den räumlichen Konformationen der bindenden Biomolekule abhangig ist

Empirische Beobachtungen zeigen, daß bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren der sichere Nachweis einer bestimmten Nukleotidsequenz in einem komplexen Gemisch von DNA-Molekulen als mobile Sonden durch Nachweis mit

Hilfe der DNA-Chip-Hybπdisierung an die in einem Feature vorhandenen immobilisierten Sonden von DNA-Molekulen komplementärer Sequenz oftmals nicht oder nur schwer möglich ist. Bei vielen Anwendungen ist dies als ein gravierender Nachteil anzusehen Beispielsweise erfordert der sichere Nachweis einer Tumor-relevanten kleinen Deletion in amplifizierter Patienten-DNA, daß in Kontroll-DNA mit Anwesenheit von mobilen Sonden der Deletions-Sequenz im Hybπdisierungsgemisch deren sicherer Nachweis mit Hilfe des DNA-Chip-Hybπ- disierungsverfahrens möglich ist, wahrend in der Tumor-DNA auch mobile 6

Sonden mit sehr ähnlichen Sequenzen, wie diejenigen der Deletion klar diskriminiert werden können. Die dazu oftmals erforderlichen hohen Stringenzan- forderungen können zu einer die Analyse erheblich beeinträchtigenden Verminderung der Signalstärke führen. Ähnliche Probleme ergeben sich beispielsweise auch, wenn eine große Zahl von mobilen Sonden mit geringfügig abweichender

Basenabfolge durch DNA-Chip-Hybridisierung analysiert werden soll. Hier kann auch die Wahrscheinlichkeit für unerwünschte Assoziationsprozesse der mobilen Sonden erhöht sein.

Als ein konkretes Beispiel wird von einem DNA-Chip mit 1 0.000 Features wie oben beschrieben ausgegangen, mit einer DNA-Chip-Größe von 1 0 x 1 0 mm^:. In dem Hybridisierungsgemisch befinden sich 1 .000.000 verschiedene Arten von einzelstrangigen DNA-Molekülen als mobile Sonden mit jeweils einer Länge von 20 - 30 Basen bei einer Konzentration von 1 00 ng/μl. Derartig komplexe Ge- mische können beispielsweise bei Verwendung von genomischer DNA ohne weitere Vorreinigung oder Amplifikation auftreten. Auch bei Verwendung von komplementärer DNA (cDNA) von Geweben kann die Komplexität des Gemisches außerordentlich hoch sein. Das gesamte Volumen des Hybridisierungs- gemisches wird zu 1 00 μl angenommen. Die benötigte Menge an mobilen Sonden beträgt in diesem Falle 1 0 μg. Jede der 1 .000.000 angenommenen

Arten von mobilen Sonden hat in dem Gemisch somit eine Masse von 1 0 pg . Jede Art von mobilen Sonden ist in der Lösung damit bei Annahme gleicher Häufigkeiten mit etwa 0,6 Milliarden Exemplaren vertreten. Bei einer Anzahl von 1 .000.000 immobilisierten Sonden pro Feature mit jeweils komplementärer Sequenz ist das Verhältnis V(P/T){Anzahl mobiler Sonden/[Anzahl immobilisierter Sonden mit komplementärer Sequenz]} bei vollständiger Denaturierung um Größenordnungen höher als 1 , d.h. auf eine immobilisierte Sonde kommen zum Beispiel mehrere hundert mobiler Sonden der komplementären Sequenz. Zudem kann die relative Konzentration einzelner oder mehrerer Arten von mobilen Sonden in dem Hybridisierungsgemisch sehr gering sein .

Experimentelle Erfahrungen der DNA-Chip-Hybridisierung mit im Stand der Technik beschriebenden Verfahren, zum Beispiel im Fall von Oligonukleotiden als mobile Sonden, zeigen erhebliche Nachteile.

Einige Gründe für diese Ergebnisse werden im folgenden beispielhaft aufgeführt:

(i) Es kann davon ausgegangen werden, daß die Stringenzanforderungen bei

DNA-Chip-Hybridisierung zum Teil erheblich größer sind als bei in situ- Hybridisierungsreaktionen, bei denen ein komplexes Gemisch von markierten DNA-Molekülen als mobilen Sonden zur in s/ftv-Hybridisierung an chromosomale Ziel-DNA als "immobilisierte Sonden" verwendet wird . Beispielsweise kann es für die Identifizierung eines Metaphasechromo- soms A mit Hilfe einer Fluoreszenz-/>7-s/Y-y-Hybridisierung (FISH) eines komplexen Gemisches mit mobilen Sonden aus einer chromosomenspezifischen DNA-Bibliothek des betreffenden Chromosoms A völlig ausreichend sein, wenn nur die Hälfte der hybridisierten mobilen Sonden an komplementäre "immobilisierte Sonden" im Chromosom A gebunden ist.

Bei subchromosomalen in s/Yu-Markierungsorten kann der Wert noch wesentlich kleiner sein. Ist hingegen bei DNA-Chip-Hybridisierungen ein besonders hoher Grad an Stringenz erforderlich, so sind entsprechend stringente Reaktionsbedingungen und Waschungen anzuwenden. Diese können zum Teil auch solche mobile Sonden ablösen, die an vollkommen koplementäre chromosomale DNA-Abschnitte als "immobilisierte Sonden" gebunden sind.

(ii) Bei in s/Y-V-Hybridisierungsreaktionen an chromosomale Ziel-DNA wird aufgrund der Begrenzung der räumlichen Auflösung der Detektionseinheit, z.B. der lichtmikroskopischen, eine scheinbar homogene Bindung der mobilen Sonden an chromosomale Zielorte auch dann beobachtet, wenn in Wirklichkeit nicht alle komplementären DNA-Abschnitte des chromoso- alen Zielortes mit (vor der Bindung) mobilen Sonden hybridisiert haben. Beispielsweise läßt sich aus einer Auswertung der Fluoreszenzphotonenstatistik von konfokal registrierten in s/Yü-Hybridisierungssignalen einer insgesamt ca. 1 00.000 Basen langen chromosomalen Zielsequenz als "immobilisierter Sonde" grob abschätzen, daß insgesamt nur ca. 2.000 E effektive Fluoreszenzphotonen registriert wurden. Auf der Objektseite entspricht dies etwa 200.000 - 600.000 insgesamt von der "immobilisierten Sonde" emittierten Photonen bzw. etwa einigen hundert an die "immobilisierte Sonde" gebundenen Fluorochrom-Molekülen; dies würde einer Hybridisierung von nur wenigen der hier z.B. jeweils einige hundert Basen langen mobile Sonden entsprechen. Geht man davon aus, daß in ähnlicher Weise bei vergleichbaren DNA-Chip-Hybridisierungen in einem bestimmten Feature nur wenige der dort befindlichen immobilisierten Sonden mit komplementären (vor der Bindung) mobilen Sonden hybridisiert sind, so wird in vielen Fällen das erhaltene Markierungssignal, z.B. ein Fluoreszenzsignal, erheblich geringer sein als das maximal mögliche, und gegebenenfalls keine Unterscheidung des Signals vom Hintergrundsrauschen gestatten. Ein weiterer Nachteil betrifft eine gegebenenfalls gewünschte Quantifizierung des Signals, z.B. zur Ermittlung der im Hybridisierungsgemisch vertretenen relativen Konzentrationen von DNA-Molekülen bestimmter

Sequenz.

(iii) Verschiedene wichtige Anwendungen der DNA-Chip-Hybridisierung erfordern es, bei hohen Stringenzanforderungen eine Hybridisierung mobiler Sonden aus einem sehr komplexen Hybridisierungsgemisch zu realisieren, das z.B. aus 1 .000.000 verschiedener Arten von Oligonukleotiden besteht. Dies kann lange Hybridisierungszeiten zur Folge haben, in denen unter den gewählten Hybridisierungsbedingungen die Wahrscheinlichkeit einer Renaturierung/Assoziation von Oligonukleotiden komplementärer oder teilweise komplementärer Sequenz in Lösung erheblich größer ist als die Wahrscheinlichkeit der Bildung eines Hybridmoleküls aus mobiler Sonde und immobilisierter Sonde mit komplementärer Sequenz.

Als Konsequenz ergibt sich, daß das Markierungssignal, z.B. ein Fluoreszenz- Signal, im Rauschen des Detektorsystems untergeht.

Ähnliche Probleme ergeben sich auch bei anderen Bio-Chips überall dort, wo zum Beispiel verschiedene wünschenswerte Reaktionsbedingungen nicht gleichzeitig 3 optimiert werden können. Ferner kann es wünschenswert sein, das im Kontakt mit dem Bio-Chip befindliche Gemisch bzw. eine andere im Kontakt mit dem Bio- Chip befindliche Flüssigkeit, z.B. eine Waschlösung, einer kontrollierten, insbesondere periodischen, Konvektionsbewegung zu unterziehen. Bei den üblichen geringen Volumina des Gemisches bzw. der für die Aufnahme des/der Bio-

Chip(s) bestimmten Kammer können solche nach dem Stand der Technik vorgenommene Konvektionsbewegungen, beispielsweise durch Pipettieren, zu nicht optimalen Resultaten führen, z.B. unerwünschten Materialverlusten.

Um die oben genannten Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren zu überwinden, ist es im Falle von Hybridisierungsreaktionen erforderlich, bei den Messungen der Hybridisierungssignale der einzelnen Features das Signal-zuRausch-Verhältnis (SNR) nachhaltig zu steigern, ohne die Stringenzanforderun- gen vermindern zu müssen . Ähnliche Anforderungen entstehen, wenn z.B. die Assoziationsreaktionen von Proteinen oder anderen Verbindungen als mobile

Sonden zu Polyaminosäuren oder Antikörpern verbessert werden sollen.

Allgemein, das heißt mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren, kann dies so geschehen, daß das Rauschen gesenkt und/oder die Signalstärke erhöht wird. Zum Beispiel kann bei Verwendung von fluoreszenzmarkierten mobilen Sonden und gegebenem DNA-Chip nach Hybridisierung das SNR- Verhältnis verbessert werden durch: Optimierte Fiuoreszenzanregung durch Anregungslichtquellen erhöhter Intensität im Absorptionsmaximum der zur Markierung verwandten Fluorochrome; Verminderung der Ausbleichung der Fluorochrome durch Verwendung von Zwei- oder Multiphotonenanregung;

Sammlung des vom Feature abgestrahlten Fluoreszenzlichtes durch Optiken hoher Numerischer Apertur; Verminderung optischer Elemente im Detektions- strahlengang, welche die Fluoreszenzausbeute vermindern; Verwendung von Fluoreszenzdetektoren erhöhter Quantenausbeute; gekühlte Fluoreszenzdetekto- ren; verbesserte Abstimmung der Vergrößerungsfaktoren des optischen Detek- tionssystems zwischen der Feature-Größe in der Objektebene und der Pixelgröße in der Ebene des Detektionssystems; verbesserte Auswertungsalgorithmen der erhaltenen digitalen Fluoreszenzbilder des DNA-Chips. Andere Möglichkeiten, um die oben gennanten Nachteile zu überwinden, betreffen den DNA-Chip selbst und die Hybridisierung der mobilen Sonden an die immobilisierten Sonden in den Features. Beispielsweise können zur Markierung Fluorochrome mit erhöhter Photostabilitat eingesetzt werden; der Markierungs- grad der mobilen Sonden kann erhöht werden; die Gesamtzahl bzw. Konzentration der immobilisierte Sonden in einem Feature kann erhöht werden, usw

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue Systeme bereitzustellen, die allgemein verwendbar sind, um Reaktionen zwischen zwei Reaktionspartnern, wie z.B Biomolekulen in Features von Bio-Chips, durchzufuhren, bei denen, wie vorstehend beschrieben mehrere Schritte wie beispielsweise im Falle von DNA-Molekulen Denatuπerung/Hybπdisierung sequentiell und/oder periodisch durchlaufen werden, wobei die oben genannten Nachteile bisher bekannter Verfahren überwunden werden.

Die obige Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstande der vorliegenden Erfindung gelost.

Die Figuren zeigen:

Fig 1 A ist die schematische Darstellung eines horizontalen Querschnitts einer erfindungsgemaßen mikrohydrodynamischen Reaktionskammer zur Durchfuhrung von Reaktionen mit Features auf Bio-Chips Zu sehen sind die ringförmige Innenelektrode (E1 , hier positiv ( + ) geladen) mit dem Außendruchmesser 2r₀, die ringförmige Außenelektrode (E2, hier negativ (-) geladen) mit dem Innendurchmesser 2R sowie die Kompartimente I (I) und II (II) . Die Pfeile bezeichnen die Richtung des mikrohydrodynamischen Transports der mobilen Sonden.

Fig. 1 B ist die schematische Darstellung eines vertikalen Querschnitts durch dieselbe Reaktionskammer mit den Kompartimenten I und II wie Fig 1 A. Zusätzlich zu den Elektroden sind hier die Grundflache F_G und die obere Abschlußflache F₀, die sich in der Hohe H_z über der Grundflache befindet, zu sehen. Ein Teil der Abschlußflache des Kompartiments I ist als transparentes Fenster Fe ausgebildet. Über dem Fenster ist eine Detektionseinπchtung 0 angedeutet, die bei- spielsweise aus einer Anregungs- und Detektionsoptik oder anderen

Biosensoren bestehen kann. Auf der Grundflache sind die Bio-Chips (BC) angeordnet, unter diesen befinden sich die Mikrosensoren ( 1 ,2) , z.B. aktive Elemente beispielweise zur Kühlung und/oder Heizung oder Bestimmung der lonenkonzentration Das Niveau des Reaktionsgemisches befindet sich in der Hohe h_F über der Grundflache. Die Richtung des magnetischen Feldes B und des elektrischen Feldes E sind angegeben

Insbesondere wird ein Verfahren zur Durchfuhrung von Reaktionen zwischen mindestens zwei Reaktionspartnern in wäßrigen Reaktionsgemischen bereitgestellt, bei dem mindestens ein Reaktionspartner Reaktionsbereiche mit unterschiedlichen Reaktionsbedingungen durchlauft und mindestens ein Reaktionspartner immobilisiert ist, wobei die Reaktionsgemische hydrodynamisch bewegt werden

Der Begriff " Reaktionsbedinungen" umfaßt sämtliche physikalische Bedingungen wie beispielsweise Temperatur, Druck usw. als auch die chemischen Bedingungen wie beispielweise lonenkonzentration, -starke und -Zusammensetzung, pH- Wert usw der jwei gen Reaktionsgemische.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform sind die Reaktionsbereiche Kom- partimente, die räumlich so voneinander getrennt sind, daß sich die in ihnen herrschenden Reaktionsbedingungen gegenseitig nicht beeinflussen

Der Begriff " Kompartiment" bezeichnet allgemein einen Reaktionsbereich, der räumlich von der Umgebung abgeschlossen ist, jedoch über eine Öffnung oder einen Durchlaß o a verfugt, so daß er bei Bedarf, wie beispielsweise zur Überführung von Reaktionsgemischen, mit der Umgebung oder mit anderen Re- 12. aktionsbereichen bzw. Kompartimenten Stoffe austauschen kann. Insbesondere bedeutet der Begriff "Kompartiment" einen räumlich abgegrenzten Reaktionsbereich, der jedoch über einen Austauschbereich verfügt, mit der eine Überführung von Reaktionsgemischen zwischen verschiedenen Kompartimenten möglich ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist mindestens ein Reaktionspartner an einer Fläche eines Reaktioπs- bereichs oder eines Kompartiments immobilisiert, und die Reaktion zwischen den Reaktionspartnern ist eine Bindungsreaktion.

Der Begriff "Bindungsreaktion " umfaßt jede Art von chemischer und physikalischer Assoziationsreaktion zwischen zwei Molekülen, wie beispielweise kova- lenter Bindung, Wasserstoffbrückenbindungen, hydrohobe Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Wechselwirkungen usw.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte

(a) Halten mindestens eines Reaktionspartners in einem Reaktionsgemisch unter ersten Reaktionsbedingungen in einem Kompartiment l,

(b) Halten der mobilen und immobilisierten Reaktionspartner in einem Reaktionsgemisch unter zweiten Reaktionsbedingungen im Kompartiment I, wobei eine Bindungsreaktion zwischen den Reaktionspartnern stattfindet,

(c) Überführen des Reaktionsgemisches mit den nicht gebundenen Molekülen des mobilen Reaktionspartners in ein Kompartiment II,

(d) Halten des mobilen Reaktionspartners von Schritt (c) unter dritten Reaktionsbedingungen, die gleich denen von Schritt (a) sein können, im Kompartiment II,

(e) Überführen des mobilen Reaktionspartners von Schritt (d) in das Kom- partiment I und gegebenenfalls

(f) Wiederholen der Schritte (b) bis (e) bis eine vorgegebene Abbruchsbedingung erfüllt ist. Der Begriff "Abbruchsbedingung" kann jede mit der Bindungsreaktion in Zusammenhang stehende Bedingung wie beispielsweise die Erreichung einer bestimmten, im Zusammenhang mit der Bindungsreaktion zu erreichende Größe oder Wert oder Änderung eines Parameters sein. Solche Parameter können beispielweise die Anzahl an gebundenen Molekülen der mobilen and die immobilisierten Reaktionspartner, Änderung des oder Erreichen eines bestimmten physikalisch-chemischen Parameters wie beispielsweise pH-Wert, lonenzusammenset- zung und/oder lonenstärke, Temperatur, Druck usw. sein.

In bevorzugten Ausführungsformen des vorstehenden Verfahrens können zwischen den Schritten (c) und (d) zusätzlich Schritte der Detektion und Auswertung der Reaktion und/oder zwischen den Schritten (b) und (c) zusätzlich ein oder mehrere Waschschritte durchgeführt werden.

Desweiteren können beim vorstehend beschriebenen Verfahren weitere Kom- partimente mit denselben oder anderen Reaktionsbedingungen als in den Kompartimenten I und II von den mobilen und/oder immobilisierten Reaktionspartnern durchlaufen werden .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Kompartimente so angeordnet, daß die Überführung des Reaktionsgemisches in den Schritten (c) und (e) auf derselben Bewegungsbahn verläuft, jedoch die Bewegungsrichtung entgegengesetzt ist. In einer weiteren Ausführungsform können die Kompartimente so angeordnet ssein, daß die Überfüh- rung des Reaktionsgemisches in den Schritten (c) und (e) auf einer kreisförmigen

Bewegungsbahn in jeweils der gleichen Bewegungsrichtung verläuft.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft Reaktionen, die unter Mikrobedingungen ablaufen, wobei das Reaktionsvolumen in den Kompartimenten nicht größer als etwa 1 50 μl, mehr bevorzugt nicht kleiner als 20 μl und nicht größer als 1 00 μl, ist. Solche Mikrobedingungen sind beipielsweise bei einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform des Verfahrens anzutreffen, bei der die Reaktionspartner Biomoleküle sind. Bevorzugterweise sind die Biomolekule aus der Gruppe der Nukleinsäuren und/oder Polypeptide ausgewählt. Der Begriff "Nukleinsaure" bedeutet native, halbsynthetische oder modifizierte Nukleinsauremolekule aus Desoxyπbonukleoti- den und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden wie Aminonu- kleotiden oder [σ-S]-Trιphosphatnukleotιden. Im Falle von Nukleinsäuren ist die

Bmdugsreaktion eine Hybridisierung. In Fall der Hybridisierung von Nukleinsäuren werden die entsprechenden Reaktionsgemische "Hybπdisierungsgemische" genannt

Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet die Anlagerung zweier Nukleinsäuren aufgrund von spezifischen Wasserstoffbruckenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren sowie unspezifischen hydrophoben WechselwirKungen durch die sog. Basenstapelung innerhalb des Hybπdmolekuls. Die Anlagerung erfolgt meist dadurch, daß die entsprechenden Nukleinsauremolekule zuvor reversibel denaturiert, beispielweise durch die Erhöhung der Temperatur auf einen bestimmten Wert wie beispielweise über den sog. Schmelzpunkt der jeweiligen Nukleinsaurespezies oder durch Änderung des pH-Werts usw., und danach renaturiert werden, z.B. durch Absenken der Temperatur um einen bestimmten Wert unterhalb des Schmelzpunktes.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens sind die Polypeptide aus der Gruppe der Proteine, wie beispielweise moklonale oder polyklonale Antikoper ausgewählt

Bevorzugterweise ist bei dem erfindungsgemaßen Verfahren mindestens ein

Reaktionspartner, wie z. B. eine Nukleinsaure oder ein Antikörper, mit einer Markierung versehen.

Der Begriff "Markierung " bedeutet geeignete, direkt oder indirekt nachweisbare Atome oder Moleküle, die in die Moleküle der Reaktionspartner eingebaut oder damit verbunden sind. Geeignete Markierungen sind beispielsweise solche, die an Nukleotide gekoppelte Fluoreszenzfarbstoffe und/oder beispielsweise Biotin und/oder Digoxigenin und/oder mit radioaktiven Isotopen markierte Nukleotide « 5^" umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Markierungsverbindung ein Fluoreszenzfarbstoff mit einer zur Selektion kleiner Substanzmengen ausreichendem Unterschied im Fluoreszenzverhalten der Emissionsspektren, wie z.B. Cumarine und Rodamine und/oder der Fluoreszenzlebensdauer wie z.B. Fluo- reszenzisothiocyanate (FITC) und Europium-Chelat-markierte und/oder Porphirin- markierte Avidine.

Bevorzugte immobilisierte Biomoleküle sind solche die in wie oben beschriebenen sog . Features von Bio-Chips, wie beispielweise DNA-Chips vorliegen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die Biomoleküle in Form ganzer

Zellen oder Teilen davon, wie beispielsweise chromosomale DNA, insbesondere Metaphasechromosomen, vor. Im Falle von ganzen Zellen handelt es sich bei der Hybridisierung zwischen den Nukleinsäuren in den Zellen um eine "in s/Yι/-Hybri- disierung " .

Die Optimierung der Reaktionsdurchführung zwischen den Reaktionspartnern betrifft im Falle von Bio-Chips die Assoziationsreaktionen auf dem Bio-Chip selbst, insbesondere von Hybridisierungsreaktionen auf DNA-Chips selbst. Sie geht von Bedingungen, insbesondere von Hybridisierungsbedingungen aus, bei denen die gewünschte Verbindung einer mobilen Sonde bestimmter Sequenz bzw. Zusammensetzung mit einer immobilisierten Sonde bestimmter komplementärer Sequenz bzw. Aminosäuresequenz im wesentlichen nur zwischen einer einzelstrangigen mobilen Sonde und einer einzelstrangigen immobilisierten Sonde erfolgt. Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden demnach mehrere Ziele erreicht:

( 1 ) Die Konzentration von mobilen Sonden und immobilisierten Sonden vor der Hybridisierungs-Bindung wird soweit als möglich aufrecht erhalten, d.h. die Verminderung der Konzentration von mobilen Sonden sowie gegebenenfalls von immobilisierten Sonden, zum Beispiel durch Renaturierung von DNA-Molekülen komplementärer Sequenz im Hybridisierungsgemisch, wird verhindert bzw. vermindert, ohne die erwünschten (strin- genten) Assoziationsreaktionen zwischen mobilen Sonden und immobili- ΛG sierten Sonden zu beeinträchtigen.

(2) Eine erfolgte Zusammenlagerung von (vor der Bindung) mobilen Sonden mit immobilisierten Sonden, zum Beispiel von einzelstrangigen DNA-Mole- külen als mobilen Sonden mit DNA-Molekülen komplementärer Sequenz als immobilisierte Sonden zu doppelsträngigen Hybridmolekülen wird aufrecht erhalten.

Im folgenden soll die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe an einer bevor- zugten Anwendung dargestellt werden, der Verbesserung von Hybridisierungs- reaktionen auf DNA-Chips.

Die derzeit verwendeten Hybridisierungsverfahren beruhen darauf, daß das Hybridisierungsgemisch mit den als mobile Sonden dienenden denaturierten DNA-Molekülen auf den DNA-Chip mit den dort befindlichen denaturierten oder bereits einzelstrangigen immobilisierten DNA-Molekülen als immobilisierten Sonden aufgebracht wird. In einer Variante dieses Verfahrens wird das Hybridisierungsgemisch bereits vor der Denaturierung mit den auf dem DNA-Chip fixierten immobilisierten Sonden zusammengebracht. Anschließend wird das aus Hybridisierungsgemisch und DNA-Chip bestehende System einerdenaturierenden thermischen Behandlung unterzogen, und dann auf eine die Hybridisierung erlaubende Temperatur abgekühlt. Dieses Verfahren erfüllt die vorstehend genannte Bedingung (ii) . Aufgrund der Renaturierung/Assoziation von DNA- Molekülen komplementärer oder teilweise komplementärer Sequenz im Hybridi- sierungsgemisch selbst nimmt jedoch die Anzahl der für eine Hybridisierung zur

Verfügung stehenden mobilen Sonden ständig ab. Wie die oben angegebene Beispielrechnung zeigt, kann das Verhältnis von mobilen Sonden im Hybridisierungsgemisch zu immobilisierten Sonden komplementärer Sequenz in den Features hohe Werte annehmen, d .h. die Wahrscheinlichkeit einer Renaturierung bereits im Hybridisierungsgemisch zwischen mobilen Sonden mit komplementärer

Sequenz kann sehr viel größer sein als die Wahrscheinlichkeit einer Hybridisierung zwischen mobilen Sonden und immobilisierten Sonden. Im Hybridisierungsgemisch renaturierte DNA-Moleküle stehen jedoch nicht mehr als mobile Sonden für den Prozeß der Hybridisierung an immobilisierte Sonden zur Verfugung, mit der möglichen (hier nicht relevanten) Ausnahme der Bildung von Dreifach-DNA- Strangen.

Als Konsequenz dieser physikalisch-chemisch bedingten Reaktionen können die beiden vorstehend genannten Aufgaben ( 1 ) und (2) bei den Hybπdisierungs- verfahren nach dem Stand der Technik nicht gleichzeitig optimiert werden: So erfordert eine Aufrechterhaltung der Konzentration an mobilen Sonden, d.h. an (typischerweise markierten) einzelstrangigen DNA-Molekulen im Hybπdisierungs- gemisch bzw. der Konzentration an immobilisierten Sonden, d.h. (wo relevant) der immobilisierten einzelstrangigen DNA-Molekule auf den Features, eine erhöhte Temperatur bzw eine entsprechende chemische Zusammensetzung des Hybπdisierungsgemisches. Die Aufrechterhaltung der doppelstrangigen Hybπd- molekule hingegen erfordert geringere Temperaturen bzw. eine andere che- mische Zusammensetzung des Hybπdisierungsgemisches.

Die erfindungsgemaße Losung dieses Problems besteht darin, unter den für DNA- Chip-Hybπdisierungen typischen Mikrobedingungen (Reaktionsvolumina in der Großenordung von z. B. 50 bis 1 00 μl), das erfindungsgemaße Verfahren in Form der folgenden Schritte durchzufuhren:

(A) Das Hybridisierungsgemisch und gegebenenfalls die in einem Kompartiment I befindlichen DNA-Chip-Features zunächst einer stark ernohten Denatuπerungstemperatur T_D auszusetzen [gemäß obigem Schritt (a)j, so daß eine Denaturierung der im Hybridisierungsgemisch befindlichen DNA-

Molekule und damit die Bildung der mobilen Sonden bewirkt wird; dasselbe Verfahren fuhrt, soweit noch erforderlich, zur Denaturierung der auf den Features befindlichen DNA-Molekule, d.h. zu der Bildung der immobilisierten Sonden

(B) Nach Abschluß der ersten Denatuπerungsphase das Hybridisierungsgemisch und die DNA-Chip Features in dem Kompartiment I bei einer niedrigeren Hybπdisierungstemperatur T_H gemäß obigem Sehnt (b) mitein- ander reagieren zu lassen, so daß Hybridmoleküle von immobilisierten Sonden mit (vor der Bindung) mobilen Sonden komplementärer Sequenz mit der gewünschten Stringenz gebildet werden.

(C) Das Hybridisierungsgemisch mit den nicht gebundenen DNA-Molekülen vom Hybridisierungsort gemäß obigem Schritt (c) zu entfernen und in einem räumlich getrennten Kompartiment II wiederum einer denaturierenden thermischen Einwirkung auszusetzen [gemäß obigem Schritt (d)], z.B. bei der oben genannten Temperatur T_D. Statt thermischen Veränderungen oder zusätzlich zu diesen können auch lokale chemische oder physikalische Einwirkungen, z.B. durch lokale Änderungen von pH, Ionen-Milieu, Ladungsverhältnissen etc., erfolgen.

(D) Das neu denaturierte Hybridisierungsgemisch von Schritt (C) aus dem Kompartiment II wiederum an den Ort der DNA-Chip Features in Kompartiment I gemäß obigem Schritt (e) zu verbringen und dort unter Hybridi- sierungsbedingungen wiederum reagieren zu lassen, z.B. unter den Bedingungen von Schritt (B) bei der Hybridisierungstemperatur T_H. Zulässig sind alle Bedingungen, die eine Hybridisierungsreaktion mit der gewünschten Stringenz ermöglichen. Die beiden Kompartimente können sich demnach anstatt oder zusätzlich zu thermischen Unterschieden auch in anderen lokalen physikalisch-chemischen Parametern unterscheiden.

(E) Das Verfahren gemäß obigem Schritt (f) solange zu wiederholen, bis eine optimale oder vorgesehene Abbruchsbedingung erfüllt ist. Eine solche

Abbruchbedingung kann z.B. durch eine bestimmte Signalstärke von einzelnen oder mehreren Features, z.B. mit einer oder mehreren Kontroll- sequenz(en), realisiert werden, durch eine bestimmte Zeitvorgabe für den Gesamtprozeß, durch bestimmte Mikrosensorwerte, etc.

Nach Beendigung des periodischen Verfahrens und gegebenenfalls einem oder mehreren Waschschritten zur Entfernung nichtgebundener mobiler Sonden und/oder zur Erhöhung der Stringenz werden die erhaltenen Hybridisierungs- signale detektiert, wobei das Verfahren mit beliebigen Detektionsverfahren kombiniert werden kann.

Wie die vorstehend im Stand der Technik bekannten Beispiele zeigen, ist es insbesondere aus ökonomischen Gründen (Menge der benötigten markierten

DNA) sowie diagnostischen Gründen (wie zum Beispiel die begrenzte Verfügbarkeit von DNA/RNA bei geringen Zellmengen) wichtig, mit geringen Substanzmengen bzw. Volumina des Hybridisierungsgemisches auszukommen. Die im Stand der Technik erwähnten Beispiele zeigen, daß bei der erfindungsgemäßen Lösung des Problems besondere Mikrobedingungen zu erfüllen sind, wie zum Beispiel ein

Gesamtreaktionsvolumen von nur 100 μl. Die Distanz zwischen den Kompartimenten I und I I D(l-Il) wird so gewählt, daß eine für die Zwecke des Hybridisie- rungsverfahrens ausreichende thermische oder sonstige physikalisch-chemische Isolierung der Kompartimente I und II erreicht werden kann, d.h. daß die in Kompartiment II herrschende Denaturierungstemperatur T_D nicht zu einer unerwünschten Erhöhung der Temperatur T_H in Kompartiment I führt. Entsprechendes gilt für die ausreichende Isolierung der Kompartimente bei Verwendung anderer physikalisch-chemischer Parameter. Um dies und die gewünschten Temperaturen in Kompartiment I und Kompartiment II zu erreichen, werden in den Kompartimenten bzw. in geeigneter räumlicher Beziehung zu ihnen aktiv kühlende (z.B. Peltier-Elemente) bzw. heizende Elemente (z.B. Ohmsche Leiter) angebracht. Die Heizung kann gegebenenfalls auch durch einen fokussierten Laserstrahl erfolgen. Die Temperatur und andere für die Hybridisierungsreaktion wichtige Parameter, wie z.B. lonenkonzentration, pH, elektrische Ladung der Features, können durch Mikrosensorsysteme gemessen und zur Kontrolle verwendet werden. Eine bevorzugte Vorrichtung sieht vor, die Mikrosensorsysteme entweder dicht oberhalb oder dicht unterhalb der DNA-Chip Ebene anzubringen, um die jeweils andere Seite für die Detektion der Hybridisierungsorte auf den Features zu verwenden. Entsprechende lokale Festsetzungen sind auch für andere physikalisch-chemische Parameter möglich, z.B. durch Ionen freisetzende oder entziehende lokal gebundene Speichermoleküle in den Kompartimenten. Eine wiederholte (periodische) Durchführung der Verfahrensschritte (a) bis (f) [bzw. (C) bis (E)] mit Hilfe mikrohydrodynamischer Transporttechniken ist grund- 10 sätzlich auf zwei Weisen möglich:

1 . Wird die Bewegungsrichtung des Hybridisierungsgemisches von Kompartiment I nach Kompartiment II mit "I nach II " bezeichnet, so erfolgt die Bewegung des Hybridisierungsgemisches von "II nach I" grundsätzlich auf derselben Bahn, die Bewegungsrichtung ist jedoch entgegengesetzt.

2. Eine weitere erfindungsgemäße Anordnung sieht vor, daß der Materialtransport zwischen den Kompartimenten I und II auch nur in einer Rich- tung stattfinden kann. Dies wird z.B. durch eine Anordnung der Kompartimente erreicht, die eine kreisförmige Bewegung des Hybridisierungsgemisches erlaubt. Zum Beispiel besteht die Hybridisierungsvorrichtung aus einem Zylinder mit einem Durchmesser 2R und einer Höhe h; ein Innenbereich mit dem Durchmesser 2r ist für das Hybridisierungsgemisch nicht zugänglich. Das Kompartiment I mit dem DNA-Chip sowie den zugehörigen Kühl-/Heizelementen/Mikrosensoren befindet sich mit dem Schwerpunkt z.B. in Uhrzeigerposition " 1 2". Das Kompartiment II mit den zugehörigen Kühl/Heizelementen befindet sich z.B. in Uhrzeigerposition "6". Die Bewegung des Hybridisierungsgemisches erfolgt z.B. im Uhr- zeigersinn, also von Kompartiment I nach Kompartiment II und in gleicher

Richtung von Kompartiment II nach Kompartiment I .

Allgemein ist jede Anordnung zulässig, die eine periodische mikrohydrodynamische Bewegung des Hybridisierungsgemisches von Kompartiment I in Kom- partiment II und wieder zurück von Kompartiment II nach Kompartiment I zuläßt, sei sie nun wie in Punkt 1 . sowohl in der einen wie in der anderen Richtung möglich, oder einsinnig gerichtet (Bewegung z.B. nur in Richtung des Uhrzeigersinnes wie in Punkt 2.) .

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es ferner, wie oben in einer bevorzugten

Ausführungsform beschrieben, möglich, eine geeignete Vermehrung der Anzahl der Kompartimente vorzunehmen. Beispielsweise kann ein Kompartiment I.A so ausgestattet sein, daß es DNA-Chips mit Features enthält, deren immobilisierte Sonden in ihrer Sequenz komplementär sind zu Sequenzen solcher mobilen Sonden, die für die betreffende Analyseart nicht erwünscht sind. Beispielsweise enthält ein Kompartiment I .A einen oder mehrere DNA-Chips für repetitive Sequenzen einer zu analysierenden komplexen Probe. Kompartiment I .B enthält einen oder mehrere DNA-Chips mit immobilisierten Sonden, deren Sequenzen komplementär sind zu Sequenzen solcher mobiler Sonden, die für die betreffende Analyse erwünscht sind, z.B. von interessierenden singulären DNA-Sequenzen. Durch wiederholten Durchgang des Hybridisierungsgemisches durch das Kompartiment I .A wird eine Depletion des Hybridisierungsgemisches von mobilen Sonden "unerwünschter" Sequenz (z.B. repetitiven Sequenzen) erreicht; gegenüber einer Depletion des Gemisches von mobilen Sonden vor Beginn der DNA- Chip-Hybridisierung besteht der erfindungsgemäße Vorteil in der Einsparung der hierzu erforderlichen getrennten Arbeitsschritte. Dies ist z.B. von Bedeutung bei vielfach durchgeführten diagnostischen Anwendungen in klinischen Laboratori- umsuntersuchungen, in der klinischen oder biomedizinischen Forschung, oder in der pharmazeutischen Entwicklung. Dieser Ansatz kann bei entsprechender Modifikation in erfindungsgemäßer Weise auch zu einer positiven Selektion bestimmter mobiler Sonden aus dem Hybridisierungsgemisch verwendet werden.

In einem weiteren Beispiel können weitere Kompartimente I.A1 , I.A2, I.A3 etc. eingeführt werden, die jeweils "unerwünschte" mobile Sonden binden, gegebenenfalls bei individuell festgelegten Temperaturbedingungen T_{H 1} , T_H2, T_H3, etc. (oder sonstigen physikalisch-chemischen Parametern) bzw. die solche Moleküle binden, deren Immobilisierung für eine weitere Verarbeitung erwünscht ist. Auch die Anzahl der Kompartimente I.B läßt sich in ähnlicher Weise erweitern. Der erfindungsgemäße Vorteil besteht z.B. in einer verbesserten Anpassung der Temperatur an die jeweiligen Hybridisierungsbedingungen . Beispielsweise werden in einem Kompartiment I .B1 Features von immobilisierten Sonden mit allen denjenigen Sequenzen untergebracht, die optimal bei einer Temperatur T_{H 1} hybridisieren . In einem Kompartiment I .B2 werden Features von immobilisierten

Sonden mit allen denjenigen Sequenzen untergebracht, die optimal bei einer Temperatur T_H2 hybridisieren, usw. Ein zusätzliches Kompartiment III kann als Speicherkompartiment für mobile Sonden dienen. Eine erfindungsgemäße Reali- 12. sierung eines solchen Speicherkompartiments kann z.B. aus Elementen einer stark vergrößerten Oberfläche bestehen, die eine reversible Affinität für die mobilen Sonden besitzen, wie z.B. ein positives/negatives elektrisches Oberflächenpotential, oder eine temperaturabhängige chemische Affinität.

Die für eine gegebene DNA-Chip-Hybridisierung optimale Anzahl, Größe und Verteilung der Kompartimente hängt in besonderer Weise auch ab von der zur Verfügung stehenden Menge an Hybridisierungsgemisch (Reaktionsgemisch) . Beispielsweise hat eine zylinderförmige Hybridisierungsvorrichtung mit einem Außendurchmesser von 2R = 30 mm und einem inneren (dem Hybridisierungsgemisch nicht zugänglichen) Durchmesser von 2r₀ = 10 mm eine für Hybridisie- rungsreaktionen freie Grundfläche von 630 mm². Bei einer angenommenen Größe eines Einzelkompartiments von 1 00 mm² können demnach etwa maximal 6 Kompartimente mit dieser Grundfläche in einer so dimensionierten Hybridisie- rungsvorrichtung untergebracht werden. Bei einer angenommenen Flüssigkeitshöhe h_F = 0, 1 mm des Hybridisierungsgemisches in der Hybridisierungsvorrichtung wird bei diesem Beispiel somit ein Volumen des Hybridisierungsgemisches von 63 mm³ = 63 μl benötigt. Zum Beispiel ergibt sich demnach bei einer Konzentration an mobilen Sonden von 20 ng/μl ein Bedarf an mobilen Sonden von 1 ,3 μg. Bei höheren/niedrigeren Konzentrationen ergeben sich entsprechend höhere/niedrigere Werte. In gleicher Weise können die für andere gewünschte Anzahlen, Geometrien und Größen von Kompartimenten benötigten Volumina der Hybridisierungsgemische abgeschätzt werden. Für rasche diagnostische Entscheidungen unter Verwendung von Patienten-DNA aus geringen Ausgangs- mengen ist beispielsweise eine Anordnung wünschenswert, welche die benötigten Mengen an mobilen Sonden minimiert. Dies ist z.B. möglich durch Reduktion der Zahl der Kompartimente, der Feature-Anzahl, der Feature-Größen usw.

Für die erfindungsgemäße Bewegung der üblicherweise kleinen Volumina an Hybridisierungsgemisch sind mikrohydrodynamische Verfahren vorgesehen.

Erfindungsgemäß sind insbesondere Verfahren geeignet, die auf der gemeinsamen Wirkung einer elektrischen und einer magnetischen Feldkonfiguration beruhen. Im allgemeinen erlauben es derartige magnetomotorische Verfahren, bei ZI inkompressiblen, leitenden Flüssigkeiten im Prinzip jede vom Anwender gewünschte Stromungsstruktur zu realisieren. Das wäßrige Hybridisierungsgemisch ist in sehr guter Näherung als inkompressible Flüssigkeit anzusehen. Die Ionen- starke von Hybπdisierungsgemischen (typische Ionen-Konzentrationen im Bereich von 1 50 bis 800 mM) ist ebenfalls für die Bewegung des Hybridisierungsgemisches mittels elektromagnetischer Felder ausreichend. Die Anwendung der allgemeinen Prinzipien des Flussigkeitstransportes auf die mikrohydrodynamische Bewegung beispielweise eines Hybridisierungsgemisches wie bei der DNA-Chip- Hybπdisierung, erfordert jedoch die Losung spezieller erfindungsgemaßer Auf- gaben

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine Re- aktionsdurchfuhrungsvorπchtung zur Durchfuhrung von Reaktionen zwischen mindestens zwei Reaktionspartnern in wäßrigen Reaktionsgemischen mit - mindestens zwei Kompartimenten, die zur Aufnahme der wäßrigen Reaktionsgemische ausgelegt sind, einer eine Flussigkeitsverbindung zwischen den Kompartimenten bereitstellenden Flussig keitsverbindungseinπchtung, mindestens einer Immobilisierungseinπchtung, die in mindestens einem der Kompartimente angeordnet ist und zum Immobilisieren mindestens eines

Teils mindestens eines der Reaktionspartner ausgelegt ist, und einer Flussigkeitsbewegungseinπchtung, die zum hydrodynamischen Bewegen der wäßrigen Reaktionsgemische zwischen den Kompartimenten über die Flussigkeitsbewegungseinπchtung ausgelegt ist.

Der Begriff " Flussigkeitsverbindungseinπchtung " gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt jegliche reversibel regelbare Verbindung, wie beispielsweise eine reversibel verschließbare Öffnung oder einen regelbaren Durchlaß oder sonstige Verbindung, zwischen den Kompartimenten

Der Begriff "Immobilisierungseinπchtung" umfaßt beispielweise solche, die zur Aufnahme Biomolekulen, insbesondere von Bio-Chips und/oder ganzer Zellen oder teilen davon, geeignet sind Unter einer "hydrodynamischen Bewegung" ist gemäß der vorliegenden Erfindung beispielsweise eine Bewegung der wäßrigen Reaktionsgemische zu verstehen, die von einer lonenreibung in den Reaktionsgemischen hervorgerufen wird Eine solche Bewegung kann beispielweise durch Einwirkung einer Kraft auf die in den wäßrigen Reaktionsgemischen gelost vorliegenden Ionen mittels einer

Kombination elektrischer und magnetischer Felder erreicht werden Eine derart hervorgerufene Bewegung von Reaktionsgemischen wird im folgenden als "magnetohydrodynamischer Mateπaltransport" bezeichnet

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Reaktionsdurch- fuhrungsvorπchtung umfaßt die Flussigkeitsbewegungsemπchtung mindestens eine erste Felderzeugungseinrichtung zur Erzeugung eines elektrischen Feldes und eine zweite Felderzeugungseinrichtung zur Erzeugung eines magnetischen Feldes, wobei mindestes eine Feldsteuereinπchtung zum Steuern der ersten und der zweiten Felderzeugungsvorrichtung vorgesehen ist, und wobei das elektrische und das magnetische Feld die Kompartimente durchsetzen. Bevorzugterweise verlaufen dabei die Feldlinien des elektrischen Feldes in jedem Raumpunkt der Kompartimente und der Flussigkeitsverbindungseinπchtung senkrecht zu Feldlinien des magnetischen Feldes.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Re- aktionsdurchfuhrungsvorπchtung umfaßt die erste Felderzeugungseinrichtung einen kreisförmigen Hohlzy πder mit Innendurchmesser 2R und einen konzentrisch darin angeordneten kreisförmigen Innenzylinder mit Außendurchmesser 2r₀, der Innenzylinder umfaßt desweiteren eine erste Elektrode E1 und der

Außenzylinder eine zweite Elektrode E2, die derart angeordnet sind, daß mindestens in einem Bereich zwischen dem Hohlzylmder und dem Innenzylinder ein radialsymmetπsches elektrisches Feld durch Anlegen einer elektrischen Potential- differenz zwischen den Elektroden mittels der Feldsteuereinrichtung erzeugbar ist Weiterhin ist es bevorzugt, daß die Kompartimente zwischen dem Hohlzylmder und dem Innenzylinder angeordnet sind

Bei einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Re- 25 aktionsdurchführungsvorrichtung ist die zweite Felderzeugungseinrichtung an einer Stirnseite der Zylinder derart angeordnet, daß die magnetischen Feldlinien, welche die Kompartimente durchsetzen, im wesentlichen parallel zu der Zylinderachse verlaufen. Einer solchen Anordnung entspricht beispielsweise ein Perma- nentmagnet oder Elektromagnet, der in geeigneter Orientierung zu und geeignetem Abstand von den Kompartimenten, z.B. unterhalb einer die Zylinder an deren Unterseite bündig abschließende Bodenplatte, auf der die Kompartimente angeordnet sind, angebracht ist.

Die Beschreibung der erfindungsrelevanten Änderungen der allgemeinen Verfahren des magnetohydrodynamischen Materialtransports soll im folgenden Beispiel der Klarheit halber anhand einer wie vorstehend definierten zylindergeometrischen Anordnung am Beispiel einer Hybridisierungsvorrichtung dargestellt werden. Modifikationen einer zylindergeometrischen Anordnung werden eben- falls als erfindungsmäßig angesehen, sofern durch diese Änderungen nicht ein im

Prinzip anderes Verfahren beschrieben wird.

In einer derartigen zylindergeometrischen Anordnung besteht die Geometrie der Hybridisierungsvorrichtung aus einem Zylinder des Durchmessers 2R und der Höhe H_z > h_F, wobei h_F die Höhe des Hybridisierungsgemisches in der gefüllten

Hybridisierungsvorrichtung darstellt. Das Hybridisierungsgemisch, die Kompartimente I, II usw., die Kühl- und Heizelemente sowie die für Mikrosensorik- messungen verwendeten Elemente sind in geeigneter Weise auf der Grundfläche F_G ("unten") in einem Außenbereich des Zylinders mit dem Radius r > r₀ und r < R angeordnet. Die Rotationsachse des Zylinders steht senkrecht auf der

Grundfläche. DNA-Chips, Kühl- und Heizelemente, sowie Mikrosensorikelemente in den Kompartimenten sind so angeordnet, daß die DNA-Chips von dem Hybridisierungsgemisch voll benetzt werden können. Eine hierzu dienliche Anordnung ist z.B. eine Anordnung der genannten Elemente direkt auf der Grundfläche F_G, wobei die elektrischen Zuführungen seitwärts oder nach unten erfolgen. Darüber werden in geringem Abstand die DNA-Chips angebracht. Die Hybridisierungsvorrichtung wird von der Oberfläche F₀ in einer Höhe H_z ("oben ") abgeschlossen. An oder über der Oberfläche F₀ befinden sich die zur Detektion des Hybridisie- u rungssignals erforderlichen Einrichtungen, z.B. elektrische Biosensoren, oder optische Elemente, wie die Frontlinse eines Epifluoreszenzmikroskopsystems, Laserscanningmikroskopsystems etc.. Zu diesem Zwecke ist die Oberfläche F₀ mit den geeigneten Eigenschaften versehen, für optische Messungen z.B. an passenden Stellen transparent ausgeführt.

Zur erfindungsgemäßen mikrohydrodynamischen Bewegung des Gemisches mit den mobilen Sonden, zum Beispiel eines Hybridisierungsgemisches, gehören die folgenden Besonderheiten:

(a) Die dem Gemisch mit den mobilen Sonden, z.B. dem Hybridisierungsgemisch, zugewandte Oberfläche (Größe z.B. gleich 2π r₀ h, h h_c) des dem Gemisch nicht zugänglichen Innenraumes von 2r₀ Durchmesser ist als eine Elektrode El ausgebildet, während die dem Gemisch zugewandte Oberfläche des Außenraumes (Größe z.B. gleich 2/7 R h_F) der Reaktionsvorrichtung, zum Beispiel der Hybridisierungsvorrichtung, von 2R Durchmesser als Elektrode E2 mit entgegengesetzter Polung ausgestaltet ist. Bei einer Potentialdifferenz von beispielsweise 2 V zwischen E1 und E2 und einem Elektrodenabstand von 10 mm wird hierdurch in dem Gemisch ein elektrisches Feld E von 200 V/m angelegt, dessen Richtung jeweils radial und horizontal zu der Oberfläche des Gemisches verläuft.

(b) Senkrecht zu dem elektrischen Feld wird ein das Gemisch durchsetzendes Magnetfeld angelegt. Grundsätzlich ist es z.B. denkbar, dies mit Hilfe von Helmholtzspulen zu realisieren, deren Achse mit der Rotationsachse der

Außen- und Innenzylinder der Reaktionsvorrichtung zusammenfällt. Derartige Anordnungen haben sich bei der magnetomotorischen Bewegung größerer Flüssigkeitsmengen, z.B. 100 ml und mehr bewährt. Unter den mikrohydrodynamischen Bedingungen der Bio-Chip-Reaktionen, z.B. DNA- Chip Hybridisierung, können jedoch z.B. wegen der hier bedeutsamen

Kapillarkräfte für eine erfindungsgemäße mikrohydrodynamische Bewegung des Gemisches, z.B. des Hybridisierungsgemisches, erheblich größere Produkte von Feldstärke E zwischen den Elektroden E1 und E2 und 1 ?- magnetischer Flußdichte B erforderlich sein. Eine wesentliche Erhöhung von E kann jedoch zu einem wesentlichen Anstieg der elektrischen Stromstärke mit einer unerwünschten Ohmschen Wärmeentwicklung führen. Große magnetische Flußdichten mit Hilfe von Helmholtzspulen in nicht- magnetischen Medien zu erreichen, ist zwar möglich, kann jedoch mit erheblichem technischem Aufwand verbunden sein. Daher wird in einer bevorzugten Anordnung eine auch bei geringer elektrischer Potentialdifferenz (z.B. einige Volt) ausreichende magnetische Flußdichte mit Hilfe eines Elektromagneten/Permanentmagneten realisiert, der sich in dem Raum unterhalb der Grundfläche F_G befindet und dessen wirksame Polfläche zum Beispiel parallel zur Ebene der Grundfläche F_G und damit parallel zur Ebene der gewünschten mikrohydrodynamischen Bewegung des Gemisches und in möglichst geringem Abstand von dieser angeordnet ist. In einer erfindungsgemäßen Ausführung wird durch eine geeignete Geo- metrie der wirksamen Polfläche erreicht, daß die magnetische Flußdichte

B das Gemisch senkrecht oder fast senkrecht zur Richtung des elektrischen Feldes E durchsetzt. Bei einer derartigen erfindungsgemäßen Ausführung kann der Abstand der wirksamen Polfläche zum Beispiel einige 1 00 μm bis 1 mm betragen . Der Elektromagnet besteht zum Bei- spiel aus einer Spule mit einem ferromagnetischen Kern. Sofern die Verringerung des Abstandes zum Gemisch es erfordert, kann die wirksame Polfläche mit einer geeigneten Geometrie des ferromagnetischen Materials ausgestattet werden, die z.B. Vertiefungen für die Aufnahme von Heiz- und Kühlelementen sowie Mikrosensoren und deren elektrischen Zu- und Ableitungen enthält. Eine hierbei auftretende Inhomogenität der magnetischen Flußdichte und/oder Richtungsänderung ist ebenfalls erfindungsgemäß möglich, sofern sie so konfiguriert wird, daß die gewünschte mikrohydrodynamische Bewegung des Gemisches zwischen den Kompartimenten ermöglicht wird .

Unter Verwendung von Materialien mit einer hohen magnetischen Permeabilitätszahl lassen sich auf diese Weise mit vertretbarem technischem Aufwand im Hybridisierungsgemisch magnetische Kraftflußdichten von 0, 1 bis 1 Tesla realisieren. Da sich die Elemente zur Erzeugung des magnetischen Feldes unterhalb der Grundfläche F_G befinden, werden der Reaktionsraum und die Detektion des Markierungssignals, z.B. des Hybridisierungssignals, hierdurch nicht beeinträchtigt.

(c) Die Stärke von elektrischem Feld und Magnetfeld können durch geeignete Schaltungsvorrichtungen nach dem Stand der Technik geregelt werden. Dies ermöglicht es, eine Bewegung des Gemisches, z.B. des Hybridisierungsgemisches, je nach Erfordernis in Gang zu setzen, zu beschleunigen, zu verlangsamen, anzuhalten, sowie in ihrer Richtung zu verändern.

Insoweit zuverlässige Messungen in der Reaktionsvorrichtung, z.B. der Hybridisierungsvorrichtung, z.B. mit Hilfe der Mikrosensorelemente, nur bei abgeschalteten elektrischen/magnetischen Feldern möglich sind, können derartige Messungen bei Pausen in der mikrohydrodynamischen

Bewegung des Hybridisierungsgemisches durchgeführt werden.

(d) Durch geeignete Wahl von Feldstärke E und magnetischer Flußdichte B kann das Gemisch, z.B. das Hybridisierungsgemisch, in dem genannten Beispiel z.B. kreisförmig um die innere Elektrode E 1 herum bewegt werden. Eine Verminderung z.B. der Feldstärke E und/oder der magnetischen Kraftflußdichte B vermindert die Bewegungsgeschwindigkeit, eine Erhöhung erhöht sie. Richtungsänderungen der Bewegung des Gemisches können entweder durch eine Umpolung des elektrischen Feldes oder des magnetischen Feldes bewirkt werden. Damit kann das Gemisch je nach

Bedarf von einem Kompartiment ins andere bewegt und seine Verweildauer in den Kompartimenten gesteuert werden.

(e) Aufgrund einer geringen Flüssigkeithöhe des Gemisches (typische Volumi- na liegen im Bereich um 50 bis 1 00 μl, gegebenenfalls auch weniger) in der Hybridisierungsvorrichtung besteht weitgehend eine laminare Strömung . Dies vereinfacht die Steuerung der mikrohydrodynamischen Bewegung. Die oben erwähnten Beispiele dienen der Veranschau chung des Verfahrens. Als erfindungsgemaße Losungen des Problems der mikrohydrodynamischen Bewegung werden alle Geometrien kombinierter elektrischer und magnetischer Felder angesehen, die den mikrohydrodynamischen Transport des Gemisches zwischen den mindestens zwei Kompartimenten in einer Reaktionsdurchfuhrungsvor- πchtung wie z.B. einer Hybridisierungsvorrichtung bewirken.

Zur Unterstützung des Transportes ist es zur Verminderung von kapillaren Bremswiderstanden ferner erfindungsgemaß, gegebenenfalls die auf der Detek- tionsseite parallel zu der Ebene des Bio-Chips, z.B. des DNA-Chips, gelegene

Oberflache F₀ der Reaktionsvorrichtung in gleichem Sinne zu rotieren wie das Gemisch aufgrund der magnetomotorischen Wirkung. Erfolgt die Detektion des Markierungssignais mit einem optischen Detektionssystem, z.B. durch Detektion der Fluoreszenzemission, so wird die Oberflache F₀ an mehreren geeigneten Stellen für das Fluoreszenzlicht transparent gestaltet, z.B durch geeignete

Fenster, so daß eine optische Detektion bei verschiedenen Rotationswinkeln möglich ist. Da bei optischer Detektion des Markierungssignals eine Anregung der Fluorochrome bevorzugt im Epifluoreszenzmodus erfolgt, ist zusätzlich eine Transmission des Anregungslichtes zu berücksichtigen. Ist eine anderweitige Detektion des Markierungssignais, z.B. des Hybridisierungssignals, zusätzlich oder an Stelle der optischen Registrierung vorgesehen, so kann die Detektions- seite so konfiguriert werden, daß trotz Rotation zumindest in bestimmten Positionen eine Detektion des Markierungssignals (bei einem Meßkompartiment) bzw der Markierungssignale (bei mehreren Meßkompartimenten) möglich ist.

Elementare Rechnungen zeigen, daß bei einer Feldstarke von einigen 1 00 V/m, einer Salzkonzentration von einigen 1 00 mM (entsprechend derjenigen in einem typischen Hybridisierungsgemisch oder Gemisch von Proteinen) , einer lonenbe- weglichkeit von einigen 1 0 ⁸ m² V^"1 s^"1 (entsprechend derjenigen monovalenter Ionen in einer wäßrigen Losung) , einer Viskosität des Gemisches von ca 0.001

N s rrf ² (entsprechend derjenigen einer wäßrigen Losung), sowie einer magnetischen Kraftflußdichte von 1 Tesla (entsprechend der in der unmittelbaren Nahe des Polschuhs eines Elektromagneten realisierbaren Normalkomponente von B 30 das aufgrund der lonenreibung bewegte Gemisch mit einer Geschwindigkeit in der Größenordnung von ca. 500 μm/s oder mehr bewegt werden kann. Dies ist ausreichend, um in wenigen Minuten einen vollen Umlauf bei einem Durchmesser der Reaktionsvorrichtung, z.B. der Hybridisierungsvorrichtung, von 30 mm zu bewirken. Bei entsprechender und technisch möglicher Verkleinerung der Dimensionierung bzw. bei Erhöhung z.B. von B werden noch erheblich kürzere Zeiten erreicht. Bei geringerem B und/oder geringerem E ist die Bewegung entsprechend langsamer, kann also je nach den Erfordernissen der Assoziationsreaktion, z.B. der Hybridisierungsreaktion, modifiziert werden.

In einem elementaren experimentellen Aufbau (s. Fig . 1 ) wurde die technische Realisierung der oben angegebenen Abschätzungen bestätigt. In eine aus einem nichtleitenden, optisch transparenten Material bestehende Reaktionskammer wurde eine zylinderförmige Innenelektrode E1 (Durchmesser 2r₀ = 2 mm) und eine ringförmige Außenelektrode E2 (Hohlzylinder, freier Innendurchmesser 2R

= 25 mm) eingesetzt. Zur Erzeugung des Magnetfeldes (Kraftflußdichte B) diente ein Permanentmagnet aus einem Standard-Radio-Lautsprecher, dessen Stirnseite dicht unterhalb der Grundfläche F_G und parallel zu dieser angeordnet wurde. Zur Realisierung eines Reaktionsgemisches mit einer bei DNA-Hybridisie- rungsreaktionen üblichen lonenkonzentration wurde eine wäßrige Lösung mit

600 mM NaCI, 60 mM Natriumeitrat, pH 7,0 (eingestellt mit NaOH) verwendet.

Die Flüssigkeitshöhe betrug 0,8 mm. Die durch magnetomotorische Kräfte erzeugte mikrohydrodynamische Bewegung der Flüssigkeit wurde auf zwei verschiedene Weisen nachgewiesen: a) Ein 2 μl-Tropfen von Bromphenolblau wurde in die zunächst farblose Flüssigkeit eingebracht, b) Die Flüssigkeit wurde insgesamt mit Bromphenolblau gefärbt und die Bewegung mithilfe eines zugesetzten Tropfens Fett detektiert.

Bei Anlegen einer elektrischen Potentialdifferenz U (Gleichspannung) von 1 ,5 V

(handelsübliche Batterie) zwischen den Elektroden E1 und E2 wurde eine Bewegungsgeschwindigkeit der Flüssigkeit von ca. 300 μm/s beobachtet. Soll die Bewegung des Gemisches nicht einsinnig erfolgen, so läßt sich dies durch Umkehrung der elektrischen Polung zwischen den Elektroden E1 und E2 oder der Richtung der magnetischen Flußdichte erreichen, z.B. durch Umkehrung der Stromrichtung in dem das B-Feld erzeugenden Elektromagneten.

Es wird ebenfalls als erfindungsgemäß angesehen, wenn bei besonderen Anforderungsprofilen an die Konvektion, wie zum Beispiel einer vielfach sich wiederholenden kreisförmigen Bewegung des Gemisches oder allgemein des die mobilen Sonden enthaltenden Gemisches die mikrohydrodynamische Bewegung ganz oder überwiegend mit Hilfe einer mechanischen Rotationsbewegung der

Oberfläche F₀ erfolgt. Dafür ist es erfindungsgemäß, daß die Oberfläche F₀ einen benetzenden Kontakt mit dem Gemisch oder einer sonstigen Flüssigkeit hat, die sich in der Hybridisierungsvorrichtung bzw. der den Bio-Chip enthaltenden Kammer befindet.

Wird (werden) in der beschriebenen Reaktionsvorrichtung DNA-Chip(s) durch ein Präparat mit chromosomaien "immobilisierten Sonden" ersetzt, wie z.B. Zellkernen oder Metaphasechromosomen, so kann die ansonsten identische oder fast identische Hybridisierungsvorrichtung auch für eine Verbesserung von in s/Yt;-Hybridisierungsreaktionen an chromosomaien "immobilisierten Sonden" eingesetzt werden, bei denen sich die "immobilisierten Sonden" noch in situ in den Zellen befinden . Da das für die DNA-Chip-Hybridisierung beschriebene Verfahrensprinzip bei dieser Anwendung wesentlich identisch ist, werden auch derartige Anwendungen als erfindungsgemäß angesehen.

Die wirtschaftlichen Erfolgsaussichten von Verfahren zur Verbesserung der mikrohydrodynamischen Optimierung von Assoziationsreaktionen auf Bio-Chips sind angesichts der enormen Bedeutung von Bio-Chips außerordentlich gut. Als Beispiel sei hier insbesondere die Anwendung auf Hybridisierungsreaktionen angeführt.

Die DNA-Chip-Hybridisierung mit Hilfe einer mikrohydrodynamischen Bewegung des Hybridisierungsgemisches zwischen mindestens zwei Kompartimenten mit 2 unterschiedlichen physikalisch-chemischen Bedingungen vermeidet die Nachteile des Standes der Technik durch eine verbesserte Nutzung der in der komplexen Probe enthaltenen DNA-Moleküle für die Hybridisierung an die immobilisierte Sonden in den Features der DNA-Chips. Für die wirtschaftliche Nutzung ist davon auszugehen, daß eine Verbesserung der Hybridisierungsbedingungen überall dort von Bedeutung ist, wo DNA-Chips in klinischer Diagnostik, in biomedizinischer Forschung, sowie bei pharmazeutischen Entwicklungen eingesetzt werden. Über die bereits genannten Vorteile hinaus kann unter ansonsten gleichen Bedingungen der Einsatz an Menge von Analysematerial reduziert werden.

Dies gilt auch für eine Anwendung des Verfahrens zur Verbesserung der in situ- Hybridisierung insbesondere komplexer mobiler Sonden an chromosomale "immobilisierte Sonden". Derartige Verbesserungen sind überall dort von Interesse, wo in klinischer Diagnostik, in biomedizinischer/pharmazeutischer Forschung und

Entwicklung das Vorkommen und der Ort von bestimmten DNA-Sequenzen in situ in einzelnen Zellen/Chromosomen festgestellt werden sollen.

Die erfindungsgemäße Hybridisierungsvorrichtung kann beispielweise als Zu- satzgerät zu bestehenden Vorrichtungen der DNA-Chip-Anaiyse bereitgestellt werden.

Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden nicht-einschränkenden Beispiele erläutert werden:

BEISPIELE

Beispiel 1

Die diesem Beispiel zugrundeliegende Aufgabe besteht in der Verbesserung der

Hybridisierung an einen DNA-Chip für die Kartierung der Genexpression. Diese soll mithilfe eines DNA-Chips der Abmessung 5 mm x 5 mm durchgeführt werden, der im Abstand von jeweils 1 00 μm in einer Matrix-Anordnung ins- 33 gesamt 2500 Features mit DNA-Sequenzen enthält, die zu den zu analysierenden Sequenzen von cDNA (komplementäre DNA) im Reaktionsgemisch komplementär sind. Eine derartige Zahl von Features ist für eine große Zahl klinisch relevanter diagnostischer Untersuchungen ausreichend. Um die Hybridisierungs- reaktion zu optimieren, soll eine wiederholte Denaturierung des Reaktionsgemisches mit den cDNA-Molekülen als mobilen Sonden durchgeführt werden, ohne die bereits imrnobiiiserten Sonden, d.h. die durch Hybridisierung an die komplementären Sequenzen in den Features gebundenen cDNA-Moleküle wieder abzulösen.

Die für die Untersuchung benötigte Menge an Reaktionsgemisch beträgt 1 50 μl, mit einer cDNA-Konzentration von 20 ng/μl, einer lonenkonzentration von 600 mM NaCI, 60 mM Natriumeitrat, und einem pH von 7,0 (eingestellt mit NaOH) . Die mobilen Sonden werden direkt mit einem im handel erhältlichen DNA-Fluo- reszenzfarbstoff gekoppelt, z.B. mit FITC (Fluorescein-Isothiocyanat, optimale

Anregung mit Argon-Ionen-Laser bei 488 nm), TexasRed (Markenname; optimale Anregung mit He-Ne-Iaser bei 594 nm; CY5.5 (Markenname; optimale Anregung mit Diodenlaser bei 675 nm), oder IRD 800 (Markenname; optimale Anregung mit Diodenlaser bei 775 nm) .

Zur Ausführung der Aufgabe wird eine Mikrohydrodynamische Reaktionskammer (Fig. 1 ) mit folgenden speziellen Bedingungen realisiert: In eine Reaktionskammer aus nichtleitendem, bis etwa 1 00°C hitzebeständigem Material wird eine zylin- derförmige Innenelektrode E1 mit einem Außendurchmesser von 2r₀ = 2 mm eingesetzt. Die Außenelektrode E2 wird als Hohlzylinder mit gleicher Symmetrieachse wie E 1 und einem Innendurchmesser 2R = 1 5 mm ausgebildet. Um Korrosion zu vermeiden, werden die Elektroden vergoldet, platiniert oder mit einer sonstigen korrosionsmindernden Schutzschicht versehen. Dicht unterhalb der Reaktionskammer wird ein Permanentmagnet mit einer magnetischen Kraft- flußdichte B angebracht, die z.B. 0, 5 Tesla beträgt. Die Stirnseite des Permanentmagneten wird parallel zur Grundfläche F_G der Reaktionskammer ausgerichtet, so daß die Richtung von B senkrecht zur Grundfläche und parallel zur Symmetrieachse der Elektroden E1 , E2 ist. In den Boden der Kammer werden miniaturisierte im Stand der Technik bekannte Heizelemente (Ohmsche Widerstände) und Kühlelemente (Peltier-Elemente) so eingelassen und verteilt, daß das Reaktionsgemisch in seiner Temperatur beeinflußt werden kann. Beispielsweise befinden sich solche Elemente (gemäß den Uhrzeiger-Positionen) in den Stellungen " 1 2, 1 ,2,3, ...1 1 " . Zur Reaktionskontrolle werden in den Positionen " 1 2, 7" (oder auch noch anderen) zusätzlich Detektoren für die Temperaturmessung eingebracht. Die Heiz-, Kühl- und Detektorelemente werden mit Hilfe von Leitungen durch den Boden der Reaktionskammer mit der Kontroll- und Detektorelektronik verbunden.

Der DNA-Chip (hier mit den Abmessungen 5 mm x 5 mm) wird im Positionsbereich " 1 1 - 1 " (Kompartiment I) eingesetzt. Gegebenenfalls werden die Heiz-, Kühl, und Detektorelemente unmittelbar in den Boden des DNA-Chips selbst integriert.

Die Höhe H_z der Reaktionskammer wird so gewählt, daß die Oberfläche F₀ das Reaktionsgemisch benetzen kann. Bei einer Menge von 1 50 μl beispielsweise ist H_z = h_F = h = 0.9 mm.

Nach dem Einfüllen des Reaktionsgemisches in die Reaktionskammer (z.B. bei

Umgebungstemperatur wie 20°C) wird diese geschlossen. Mit Hilfe der benetzenden Oberfläche F₀ wird eine gleichmäßige Verteilung des Reaktioπsgemi- sches in der Kammer herbeigeführt, z.B. unterstützt durch mechanische Rotationsbewegungen.

Zur Einleitung der Hybridisierungsreaktion werden die Nenngrößen der Heiz- und Kühlelemente in der Reaktionskammer so eingestellt, daß die mobilen Sonden (z.B. doppelsträngige cDNA Moleküle), gegebenenfalls auch die immobiliserten Sonden in den Features, denaturiert, d .h. einzelsträngig gemacht, werden. Eine typische Denaturierungstemperatur in Abwesenheit denaturierender chemischer

Agenzien beträgt T_D = 90 bis 95 °C. Nach z.B. 2 min bei dieser Temperatur wird auf die Hybridisierungstemperatur T_H abgekühlt. In Abwesenheit denaturierender chemischer Agenzien beträgt T_H typischerweise 70 bis 75 °C. Bei einer zusätzlichen Verwendung denaturierender chemischer Agentien ergeben sich jeweils niedrigere T_D- bzw. T_H-Werte, die typischerweise um ca. 20°C bzw. 25 °C niedriger sind.

Nach einer Zeitspanne von z.B. 30 min bei der Temperatur T_H wird an die Elektroden eine Potentialdifferenz U = 3 V angelegt. Die hierdurch in Kombination mit dem Permanent-Magnetfeld induzierte magnetomotorische Kraft führt zu einer mikrohydrodynamischen Bewegung des Reaktionsgemisches. Nach 1 bis 2 min ist der vor Beginn der Bewegung über dem DNA-Chip befindliche Teil (Kom- partiment I; Position " 1 1 - 1 ") des Reaktionsgemisches in den Denaturierungsbereich (Kompartiment II; Position "6 - 8") überführt worden . Durch Abschalten der Spannung zwischen den Elektroden E l und E2 wird die mikrohydrodynamische Bewegung unterbrochen. In dem Denaturierungsbereich (Kompartiment II) wird die Heiz-Leistung so eingestellt, daß dort die Denaturierungstemperatur T_D realisiert wird, im hier genannten Fall 90°C bis 95 °C. Die in den anderen

Positionen (Position " 2,3,4; 9, 1 0, 1 1 ") befindlichen Heiz- und Kühlelemente werden so eingestellt, daß eine möglichst gute Aufrechterhaltung der Temperatur T_H auf dem DNA-Chip sowie der Temperatur T_D in dem Denaturierungsbereich erreicht wird. Nach z.B. 30 min wird wiederum die Potentialdifferenz von 3 V für 1 bis 2 min angelegt. Hierdurch wird der in dem Denaturierungsbereich befindliche Teil des Reaktionsgemisches in den Hybridisierungsbereich über dem DNA- Chip (Kompartiment I) transportiert. Umgekehrt wird der über dem Hybridisierungsbereich befindliche Teil des Reaktionsgemisches zum Denaturierungsbereich weiter transportiert.

Statt einer diskontinuierlichen Bewegung des Reaktionsgemisches kann auch eine kontinuierliche Bewegung von Vorteil sein. Zum Beispiel wird an die Elektroden E1 und E2 eine kontinuierliche Potentialdifferenz von 0,03 V angelegt. Hierdurch wird eine ständige langsam kreisende Bewegung der Flüssigkeit von einigen μm/s erzeugt, durch welche die mobilen Sonden jeweils durch den

Hybridisierungsbereich (Kompartiment I) und durch den Denaturierungsbereich (Kompartiment II) hindurchbewegt werden. 36

Bei einer Reaktionskammer in den gewählten kleinen Dimensionen können bereits in Abwesenheit von elektrischen und magnetischen Feldern Diffusionsprozesse und Konvektionsströme zu einem Austausch zwischen Hybridisierungsbereich (Kompartiment I) und Denaturierungsbereich (Kompartiment II) führen. Eine einfache Rechnung zeigt jedoch, daß der Transport der mobilen Sonden zwischen den beiden Kompartimenten durch magnetomotorische Kräfte effektiver durchgeführt und geregelt werden kann. Die hierfür benötigten zusätzlichen apparativen Aufwendungen sind von der ökonomischen Seite her relativ gering .

Die Effektivität des Hybridisierungsprozesses wird z.B. durch optische Anregung und Detektion an dem Ort der Hybridisierung kontrolliert. Zu diesem Zweck ist über dem Hybridisierungsbereich (Kompartiment I) ein optisches Fenster vorgesehen, z.B. aus einem Deckglas von 1 70 μm, über dem sich ein gegebenenfalls mit Immersionsöl mit dem Fenster verbundenes Mikroskopobjektiv eines im Stand der Technik bekannten Epifluoreszenzmikroskops oder eines konfokalen

Auflicht-Laser-Rastermikroskops befindet. Eine Abbruchbedingung für den Prozess ist z.B. dann gegeben, wenn die in den einzelnen Features detektierte Fluoreszenzintensität der immobilisierten Sonden sich zeitlich nicht mehr ändert. Anschließend kann auf gleiche optische Weise das Ergebnis (Fluoreszenzver- teilung der immobilisierten Sonden im DNA-Chip) analysiert werden, gegebenenfalls nach Entfernung des Hybridisierungsgemisches und geeigneten Waschvorgängen.

Beispiel 2:

Die dem Beispiel 2 zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, als mobile Sonden fluoreszenzmarkierte genomische DNA (z.B. von einem Patienten) auf einen DNA-Chip zu hybridisieren. Hier wird nach Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter DNA-Sequenzen in der zu analysierenden Probe gesucht. Gegebenen- falls wird dabei das dem Fachmann bekannte Verfahren der komparativen

Genomhybridisierung (CGH) eingesetzt. Für die hier zu lösende erfindungsgemäße Aufgabe ist wichtig, zusätzlich zu einem Wechsel zwischen einem Hybridisierungsbereich (Kompartiment I) und einem Denaturierungsbereich (Kompartiment II) noch ein drittes Kompartiment einzuführen, in welchem eine Depletion des Hybridisierungsgemisches von die Analyse störenden "unerwünschten" Sequenzen (z.B. repetitiven Sequenzen) erfolgen kann, Zu diesem Zweck wird in dem Kompartiment III ein DNA-Chip mit Features eingebracht, deren Sequenzen bei einer Temperatur T_DEPL diese "unerwünschten" Sequenzen binden und damit ihre unerwünschte Immobilisierung in dem Analysebereich in Kompartiment I vermindern.

In dem hier behandelten Beispiel 2 besteht der DNA-Chip mit den zu testenden Sequenzen in Kompartiment I (Hybridisierungsbereich bei Temperatur T_H ) wiederum aus 2500 Features, während der "Depletions-Chip" in Kompartiment III ebenfalls z.B. 2500 Features mit für die Depletion geeigneten Sequenzen enthält. Die geometrischen Abmessungen der Chips sind jeweils 5 mm x 5 mm. Der Kammeraufbau ist der gleiche wie in Beispiel 1 . Zusätzlich wird jedoch der Depletions-Chip im Bereich Position "3-5" oder in einer anderen Position zwischen Kompartiment I und Kompartiment II untergebracht.

Die Temperatur im Kompartiment III wird mithilfe der Heiz- und Kühlelemente so eingestellt, daß dort die Temperatur T_DEPL herrscht, während in Kompartiment I die Temperatur T_H und in Kompartiment II die Temperatur T_D herrscht. Die mikrohydrodynamische Bewegung der Flüssigkeit sowie die Kontrolle und Analyse erfolgt ansonsten wie in Beispiel 1 .