JP2010508024A - 複数のオリゴヌクレオチド用のフィンガープリント分析 - Google Patents

Abstract

本発明は、オリゴヌクレオチド試料、特に、サイズ及びシーケンスを変える可能性のある様々なオリゴヌクレオチドを収容する試料の精度を評価するための方法を提供する。方法は、マルチ−オリゴヌクレオチド試料が同じ又はほぼ同じ分子重量を有する異なるオリゴヌクレオチドを収容するかどうかにかかわらず、この試料の精度を評価するのに用いることのできるフィンガープリントを提供する。
【選択図】図４

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドのポスト合成的解析及び検証に関し、特に、複数のオリゴヌクレオチドのポスト合成的解析及び検証に関する。

（関連出願の相互参照）
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下で、２００６年１０月２６日に出願された特許文献１に基づく優先権を主張するものである。上記出願の全体の教示が引用により本明細書に組み入れられる。

オリゴヌクレオチドは、多数の研究及び臨床用途において用いられる。オリゴヌクレオチドの完全性を保証することは、オリゴヌクレオチドを用いる用途において失敗又は誤った結果を防ぐために不可欠である。幾つかの方法は、結果として生じるオリゴヌクレオチドが、技術者がその用途で用いるように意図したものであることを保証するために開発されてきた。

オリゴヌクレオチド合成の間、品質を保証する１つの方法は、トリチル監視を通して行われる。オリゴヌクレオチド合成においてモノマーの５^'−ヒドロキシル基の限度を定めるために用いられるジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基は、酸で除去された後に、そのプロトン化した形態で蛍光を発する。蛍光発光の吸光度は、４９８ｎｍ又はおよそ４９８ｎｍで測定可能である。吸光度レベルの減少は、結合が効率的でなかったという表示である可能性がある。

オリゴヌクレオチド・ターゲットの同一性は、母集団の優勢な分子重量を測定することによってポスト合成的に査定可能である。ターゲット・シーケンスは、公知であるので、ベース自体の算出された分子重量は、所望の化合物が生成されたかどうかを見るために、測定された分子重量を比較する基準となる。この原理を利用する１つの方法は、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を通して行われる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、電荷を問題になっているサンプルに分け与え試料皿からそれをはじくために、化学的マトリクスと併せてレーザ光を用いる。結果として生じるイオンは、飛行管を通って検出器へ移動し、時間の関数として粒子総数を測定する。飛行時間（ＴＯＦ）は、分子の質量に正比例する。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、分子重量を査定するための堅牢で非常に高い処理能力の工程である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの１つの欠点は、その処置のイオン化効率（及びそれ故溶解）が、〜４５ベースより上又は＞１３，０００Ｄａで急速に低下することである。クローニング及び／又は遺伝子合成のための７０ｍｅｒアレイ及び長オリゴヌクレオチドの普及により、より長い生成物を査定するために別の方法が必要とされる。

エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析は、オリゴヌクレオチドのようなターゲット分子を多重電荷状態にイオン化する。この電荷状態の読み出しは、親ピークにデコンボリュートされることのできる波形である。方法は、５００乃至１，５００の堅いｍ／ｚウィンドウを用い、それに高い質量精度を与える。電荷状態のみがイオンに対して変化するので、高分子重量を有するオリゴヌクレオチドは、この方法を用いて分析可能である。それ故、ＥＳＩは、より長いオリゴヌクレオチドに対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでの好ましい品質管理（ＱＣ）方法であることが多い（非特許文献１を参照されたい）。

現在のところ、品質管理におけるＥＳＩ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの使用は、ＥＳＩの結果を所与の分子重量のオリゴヌクレオチド・シーケンスに起因する予想されるピークと比較することに限定される。いくつかの分析は、所与の分析のために４８、９６又はそれより大きいオリゴヌクレオチド・シーケンスを用いることができ、分子重量だけに基づく分析において、所与のシーケンスは、他のシーケンスから区別不能であることがある。分析の品質管理は、故に、分析の結果が、予想される結果と同じであることを保証するために、所与のプラットフォームを通して分析を実行することに依存する。

単一ヌクレオチドの多型の有無を検出するために、マルチ−オリゴヌクレオチド試料を観察した他の方法は、当技術分野で公知である（Ｋｏｓｔｅｒ他による特許文献２を参照されたい）が、この分析は、オリゴヌクレオチド混合物及びその相対濃度における、いかなる成分オリゴヌクレオチドの有無も検出することはできない。

提案する方法は、マルチ−オリゴヌクレオチド試料の理論的ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ又はＥＳＩトレース（フィンガープリント）を生成し、次にその混合の実際のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ又はＥＳＩデータをＱＣチェックのようなフィンガープリントと比較することを含む。

米国仮特許出願第６０／８６３，０６３号 米国特許第７，０７４，５６３号

Ｅｌｌｉｏｔｔ、Ｂ．及びＨａｉｌ著Ｍ．Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、２００４年１月

提案する方法は、理論的ＥＳＩトレース（フィンガープリント）を生成し、次にその合成の精度を検証するために、その混合の実際のＥＳＩトレース・データをフィンガープリントと比較することを含む。方法は、分析における１より多くのオリゴヌクレオチド・シーケンスが同じデータ点を共有する場合でさえ、ＥＳＩデータからの多数のデータ点が図表を用いて表わされることを可能にする。理論的トレースは、信号値１を個々の質量に割り当て、すなわち、別の範囲と重複しない分子重量範囲に値１が割り当てられることになる。１より多い質量が、それぞれの分子重量に出現する場合には、強度は、その数だけ増加する（例えば、分析における３つの異なるオリゴヌクレオチドが同じ分子重量を有する場合には、その範囲には強度値３が割り当てられることになる）。ピークの数は、ピーク高さの５０％又はそれより高いピーク高さで交差するいかなるものも加算されると仮定することによって、さらに削減されることになる。ピークの幅は、試料オリゴヌクレオチドの長さに依存する。新しいピークの質量は、次の式を用いて算出される：
ＭＷ_new＝（ＭＷ₁＊強度₁＋ＭＷ₂＊強度₂＋．．．ＭＷ_n＊強度_n）／（強度₁＋強度₂＋．．．強度_n）
新しいピーク強度は、個々の強度の単なる加算である。

本発明の方法は、いかなる特定の分析フォーマットにも限定されるものではなく、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果をフィンガープリント採取するためにも用いることができる。

Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）を用いて、実施例１の表１におけるデータから作成された理論的トレースである。 実施例１における４８試料の実際のＥＳＩトレースである。 Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＤａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ^TMソフトウェアを用いて、実施例１の表１におけるデータから生成された理論的トレースである。 図３における理論的トレース及び図２からの実際のＥＳＩデータのオーバーレイである。 強度が、同じ分子重量を有するオリゴヌクレオチド試料の量に等しい場合の表１におけるデータのグラフである。 図５において枠で囲まれたデータの拡大版である。 図１の理論的トレースにおける１つのピークを形成するために、ピーク４がピーク２及び３と合体する理由を説明するために、ピーク（２＋３）及び４の間の重複量を示す。 理論的トレースの２つのピークを分離することを要求するピーク（５＋６）と（７＋８）との間の間隙（５０％より大きいピーク高さの重複は無い）を示す。

提案する方法は、理論的ＥＳＩトレース（フィンガープリント）を生成し、次にその混合の実際のＥＳＩデータをＱＣチェックのようなフィンガープリントと比較することを含む。方法は、分析における１より多くのオリゴヌクレオチド・シーケンスが同じデータ点を共有する場合でさえ、ＥＳＩデータからの多数のデータ点が図示されることを可能にする。理論的トレースは、信号値１を個々の質量に割り当て、すなわち、別の範囲と重複しない分子重量範囲に値１が割り当てられることになる。１より多い質量が、それぞれの分子重量に出現する場合には、強度は、その数によって増加する（例えば、分析における３つの異なるオリゴヌクレオチドが同じ分子重量を有する場合には、その範囲には、強度値３が割り当てられることになる）。ピークの数は、ピーク高さの５０％又はそれより高いピーク高さで交差するいかなるものも加算されると仮定することによって、さらに削減されることになる。ピークの幅は、試料オリゴヌクレオチドの長さに依存する。新しいピークの質量は、次の式１を用いて算出される：
ＭＷ_new＝（ＭＷ₁＊強度₁＋ＭＷ₂＊強度₂＋．．．ＭＷ_n＊強度_n）／（強度₁＋強度₂＋．．．強度_n）
新しいピーク強度は、個々の強度の単なる加算である。

関心のあるオリゴヌクレオチドの各々を収容する試料が準備され（「マルチ−オリゴヌクレオチド試料」）、結果として得られる試料は、ＥＳＩ器具を通される。試料におけるオリゴヌクレオチドを表すピークが存在し、多数のオリゴヌクレオチドが同じか又はほぼ同じ分子重量を有する地点においてより高いピークとなるであろう。一実施形態においては、基準フィンガープリントは、オリゴヌクレオチドの組が常に同じである基準分析キットを表すことができる。

別の実施形態においては、本発明は、オリゴヌクレオチド混合物の自動検証を与えるようにプロセッサに組み込むことができる。式１におけるアルゴリズムは、オリゴヌクレオチド混合物を、算出されたピーク又はピークの組の中に含むと予想される個々のオリゴヌクレオチド成分の、所与の分子重量を処理するソフトウェアの構成要素とすることができる。別の実施形態においては、プロセッサは、測定された質量スペクトルが算出されたスペクトルと一致するかどうかを判断するために、測定された質量スペクトルが自動システムを提供するようにする機器により動作できる。

用語「多重オリゴヌクレオチド」は、１つより多くのオリゴヌクレオチド試料のことを言い、その試料は、同じ分子重量を有することも有しないこともでき、またその試料は同じシーケンスを有することも有しないこともできる。例えば、実施例１は４８オリゴヌクレオチド試料、すなわち４８のオリゴヌクレオチドを有する多重オリゴヌクレオチド試料を収容する。

用語「質量分析法」、「質量スペクトル」及び「質量査定」は、イオン化方法及び質量分析のための多数の技術を包含する。質量分析法形式の例は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型）、ＥＳＩ−ＴＯＦ（エレクトロスプレーイオン化飛行時間型）、ＥＳＩ（一般に単一又は三連四重極を有するエレクトロスプレーイオン化）、ＥＳＩ−ＱＩＴ（エレクトロスプレーイオン化四重極イオントラップ型（直線状又は３−Ｄ））、ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化四重極イオントラップ型（直線状又は３−Ｄ））、ＭＡＬＤＩ−ＱＴＯＦ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化四重極飛行時間型）：及びＥＳＩ−ＱＴＯＦ（エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型）を含む。

オリゴヌクレオチドをイオン化するのには、通常２つの方法がある（ＭＡＬＤＩ及びＥＳＩ）。ＭＡＬＤＩは、典型的にはＴＯＦ（飛行時間）質量分析器に連結するが、それらは四重極イオントラップ（ＱＩＴ）質量分析器に連結してもよい。ＥＳＩシステムは、ＴＯＦ質量分析器、並びに四重極（単一Ｑ及び三連Ｑ）又は四重極イオントラップ（直線状及び３−Ｄ）を有する質量分析器に連結することができる。ＱＴＯＦのような混成システムもあり、最初に四重極によって次にＴＯＦによって、ＭＡＬＤＩ又はＥＳＩ源のいずれかからイオンを分析する。いかなるＴＯＦに対しても、ｒＴＯＦ（反射飛行時間）を加えることができ、或いは、多数の上述した検出器にＦＴ（フーリエ変換）を加えることができる。

以下の例は本発明をさらに説明するが、もちろんいかなる方法においてもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。

この例は、４８−オリゴヌクレオチド試料を用いる理論的フィンガープリント採取方法の精度を明示する。各オリゴヌクレオチドの予想される分子重量は、算出され表１に記入された。表１に示すように、１９のオリゴヌクレオチドが同じ分子重量を有する。ピークは、試料オリゴヌクレオチドの一般的な幅と一致するように２０Ｄａ幅であるように算出され、重複するピークは結合された。

表１：オリゴヌクレオチドの組の実際の分子重量

式１を用いて、オリゴヌクレオチドは、分子重量に基づいてグラフに描かれた。図１は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ（登録商標）を用いた式１を用いる表１からのデータのチャートを示す。
理論的トレースを設計する第１ステップは、同じ分子重量を有する試料の数に等しい強度を割り当てることによって、同じ分子重量を有するオリゴヌクレオチド試料を最初に結合させることであった。次に、式１は、重複が全ピークの間で５０％より少なくなるまで、全ピークの組に適用された。結果として図１のトレースになるように、ピークがさらにどのように結合されるかを説明するために、データの部分集合（図５において枠で囲まれた）が、次のステップを説明するために選択された。

図６は、図５において枠で囲まれたデータの拡大版である。ピーク１及び１１は、他のどのピークとも重複せず、それ故、独立するピークのままであった。５０％より大きいピーク高で重複のあったピークは、式１を用いて結合された。例えば、全てが、５０％より大きいピーク高で重複するので、ピーク２、３、及び４は結合される。特に、ピーク２及び３は、式１を用いて加えられ（（１２９１４．４＊１＋１２９２４．４＊１）／（１＋１）＝１２９２１．９、強度＝２）、（２＋３）の合計から得られたピークがピーク４のピーク高さの５０％より大きいところでピーク４に重複するので、結果として得られた合計はピーク４に加えられた（（１２９２１．９＊２＋１２９３３．４＊１）／（２＋１）＝１２９２５．７、強度３）。ピーク４に対する（２＋３）ピークの図示については図７を参照されたい。
ピーク５及び６は、１つのピークを形成するために結合され、ピーク７及び８は別のピークを形成するために結合された。ピーク６及び７は５０％のピーク高さより大きいところで重複し、ピーク（５＋６）及び（７＋８）のそれぞれの組は、６及び７が互いに対するより大きい重複があった。より大きい重複ピークが算出されると（（５＋６）及び（７＋８））、（５＋６）と（７＋８）との間で５０％より大きい重複はなくなり、それ故、結合されなかった。図８を参照されたい。

別の理論的チャートが、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍからのＤａｔａＥｘｐｌｏｒｅｒ^TMソフトウェアで、表１からのデータにより式１を用いて作成された（図３）。すべての４８のオリゴヌクレオチドを収容する試料は、実際のトレースを作成するために、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＬＣＱ^TMＥＳＩ器具の中に配置された。図２は、実際のＥＳＩトレース・データを収容する。図２及び図３は、予想されるピーク値と実際のピーク値との間の相互関係を明示するために、オーバーレイされた（図４）。結果は、実際のトレースにおける各ピークが理論的トレースにおける対応するピークを有し、実際のトレースが理論的フィンガープリントに存在した各ピークを収容することを明示する。

ここに列挙された刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての引用文献は、各引用文献が、引用によって組み入れられ個々に及び特定的に表示され、その全体が本明細書に説明されるように、引用によって同じ程度に本明細書に組み入れられる。

本発明を説明するに当たって（特に特許請求の範囲において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、それ以外の意味が本明細書に表示されない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「収容する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、それ以外の意味が言及されない限り、制約が無い用語（すなわち、「含むがしかし限定はされない」という意味）として解釈されるべきである。本明細書での値の範囲の列挙は、それ以外の値が本明細書に示されない限り、単にその範囲内に収まる各別個の値を個々に指す間に合わせの方法として働くように意図されており、各別個の値は、個々に本明細書の中に列挙されるかのように明細書に組み入れられる。本明細書に説明される全ての方法は、別の方法により本明細書に示されない限り、或いは内容と明らかに矛盾しない限りは、いかなるふさわしい順番においても実行可能である。本明細書に提供されるあらゆる例、又は例示的言語（例えば「のような」）の使用は、単に、本発明の理解をし易くすることが意図されており、別の方法により記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。明細書におけるどの言語も、特許請求されてないいかなる要素も本発明の実施に欠かすことができないと示すように解釈されるべきではない。

本発明を実行するために本発明者には公知の最善の様式を含む本発明の好ましい実施形態が、本明細書に説明される。それら好ましい実施形態の変形態様は、前述の説明を読むことにより、当業者には明白になるであろう。本発明者らは、当業者がそのような変形態様を適当なものとして採用すれることを期待し、本発明者らは、本発明が、特に本明細書で説明される以外で実践されることを意図する。従って、本発明は、準拠法によって許諾されるようなここに添付される特許請求の範囲に列挙される内容の全ての修正及び等価な物を含む。さらに、全ての可能な変形態様において上述された要素のいかなる組み合わせも、別のものが本明細書に示されない又は別のものが内容に明白に矛盾しない限り、本発明により包含される。

Claims (11)

1. オリゴヌクレオチド混合物における成分オリゴヌクレオチドの有無を検出する方法であって、
   ａ）前記オリゴヌクレオチド混合物の質量スペクトルの測定値を取得し、
   ｂ）前記質量スペクトルの測定値を、算出された質量スペクトルと比較する
   ステップを含み、ＭＷ₁が前記オリゴヌクレオチド混合物における１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの第１の部分集合であり、ＭＷ₂が前記オリゴヌクレオチド混合物における１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの第２の部分集合であり、ＭＷ_nが前記オリゴヌクレオチド混合物における付加的な部分集合を表し、強度₁が前記オリゴヌクレオチド混合物における１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの前記第１部分集合の強度であり、強度₂が前記オリゴヌクレオチド混合物における１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの前記第２部分集合の強度であり、強度_nが、前記オリゴヌクレオチド混合物における付加的な部分集合の強度を表す場合に、前記算出された質量スペクトルは、ＭＷ_new＝（ＭＷ₁＊強度₁＋ＭＷ₂＊強度₂＋．．．ＭＷ_n＊強度_n）／（強度₁＋強度₂＋．．．強度_n）である式１から導出されることを特徴とする方法。
2. 前記質量スペクトルは質量分析法トレースであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記質量スペクトルはエレクトロスプレーイオン化質量分析トレースであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記質量スペクトルはマトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記質量スペクトルはエレクトロスプレーイオン化四重極イオントラップ型であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記質量スペクトルはマトリクス支援レーザ脱離イオン化四重極イオントラップ型であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記質量スペクトルはマトリクス支援レーザ脱離イオン化四重極飛行時間型であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 前記質量スペクトルはエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記算出された質量スペクトルはプロセッサによって与えられ、前記のプロセッサは、算出された質量スペクトルを提供するために、前記オリゴヌクレオチド混合物の一組の所与の分子重量を受容することを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. オリゴヌクレオチドの基準セットを使用する分析のためのキットであって、前記のキットはオリゴヌクレオチドの前記基準セットと、請求項１におけるように算出された質量スペクトルを含むことを特徴とするキット。
11. エレクトロスプレーイオン化質量分析トレースにおいてピーク強度及びピーク質量を分析するための方法であって、
    ａ）試料の各オリゴヌクレオチド構成材料に初期強度値１を割り当て、
    ｂ）一組のオリゴヌクレオチド構成材料から、等しい分子重量を有するオリゴヌクレオチド構成材料の第１のサブセットを判断し、
    ｃ）Ｉ_newが結合されたピーク強度であり、Ｉ₁及びＩ₂が第１のサブセットの前記オリゴヌクレオチド構成材料であり、Ｉ_nがＩ₁及びＩ₂と等しい分子重量を有する前記第１のサブセットに存在することもしないこともできる付加的なオリゴヌクレオチド構成材料を表す、式Ｉ_new＝Ｉ₁＋Ｉ₂＋．．．Ｉ_nを用いて、前記結合されたピーク強度を形成するために、前記第１のサブセットの構成材料を結合し、
    ｄ）ピーク分子重量を、前記第１のサブセットの各構成材料の前記分子重量に等しい前記結合されたピークに割り当て、
    ｅ）前記一組のオリゴヌクレオチド構成材料から、オリゴヌクレオチド構成材料の第２のサブセットを判断し、
    オリゴヌクレオチド構成材料の前記の第２サブセットは、前記第２サブセットの各構成材料がエレクトロスプレーイオン化質量分析トレースにおけるピークとして描かれる場合に、前記第２サブセットの構成材料の前記ピークが５０％より大きいピーク高さで重複する前記第２サブセットの他の構成材料の範囲内の分子重量を有し、
    ｆ）Ｉ２_newが結合されたピーク強度であり、Ｉ２₁及びＩ２₂が第２サブセットの前記オリゴヌクレオチド構成材料の強度であり、Ｉ２_nが前記第２サブセットに存在することもしないこともできる付加的なオリゴヌクレオチド構成材料を表す、数式Ｉ２_new＝Ｉ２₁＋Ｉ２₂＋．．．Ｉ２_nを用いて、前記第２の結合されたピーク強度を形成するために、前記第２サブセットの構成材料を結合し、
    ｇ）ＭＷ_newが第２の結合されたピーク質量を表し、ＭＷ₁及びＭＷ₂が第２サブセットの構成材料の前記分子重量であり、ＭＷ_nが前記第２サブセットに存在することができる付加的な構成材料を表す、数式ＭＷ_new＝（ＭＷ₁＊Ｉ２₁＋ＭＷ₂＊Ｉ２₂＋．．．ＭＷ_n＊Ｉ２_n）／（Ｉ２₁＋Ｉ２₂＋．．．Ｉ２_n）を用いて、第２の結合したピーク質量に対する前記第２サブセットの前記構成材料を結合する、
    ステップを含むことを特徴とする方法。

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