JP2010513890A - 治療タンパク質の凝集体の直接質量分光分析 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体凝集体または抗体の他の分子間生成物の同定および特徴付けは極めて重要である。何故ならば、多数の抗体が医薬品として使用されているからである。老化、熱ストレス、pHストレスまたはホスト細胞発現の結果としての抗体凝集体または他の治療タンパク質により形成された凝集体の分析は、これらの治療分子の安定性を評価するのに極めて重要である。
本発明の目的は、治療タンパク質、例えば抗体、薬物または薬物候補の凝集の量を決定する方法であって、凝集体を架橋して、精製された多成分サンプルまたは不均質生物学的マトリックス(heterogeneous biological matrices)において、共有結合で安定化された凝集体を形成し、次いでサンプルの消化またはフラグメント化なしに高質量検出器を備えたMALDI ToF質量分析法により、モノマー治療タンパク質および凝集した治療タンパク質の得られた混合物を分析することによる方法を提供することである。
(a)モノマー治療タンパク質および非共有結合で凝集した治療タンパク質の混合物を架橋試薬と接触させて共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体を形成する工程;
(b)形成されたインタクトなイオンを、高質量検出器を備えた高質量MALDI ToF質量分析法により分析する工程;
(c)質量ピークを予め確立された較正曲線と比較することにより治療タンパク質サンプルにおける凝集の量を直接決定する工程
を含む、質量分析法を使用して、消化されていない、フラグメント化されていないモノマー治療タンパク質のインタクトなイオンと共に消化されていない、フラグメント化されていない治療タンパク質凝集体のインタクトなイオンを測定することにより凝集の量を決定する方法を提供する。
本発明は、骨の折れるルーチンな分析のための高質量MALDI ToF質量分析法および架橋化学の組み合わせを使用して高い感度および精度で、精製された多成分混合物または不均質生物学的マトリックスにおいて、治療タンパク質、例えば抗体、薬物または薬物候補の凝集の量を分析する方法に関する。
(a)モノマー治療タンパク質および非共有結合で凝集した治療タンパク質の混合物を架橋試薬(架橋試薬混合物を含む)と接触させて共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体を形成する工程;
(b)工程(a)のタンパク質モノマーおよび凝集体から形成されたインタクトなイオンを、高質量検出器を備えた高質量MALDI ToF質量分析法により分析する工程;
(c)質量ピークを予め確立された較正曲線と比較することにより凝集の量を直接決定する工程;
を含む。
(a)治療タンパク質モノマーおよび非共有結合で結合した治療タンパク質凝集体(1種または複数)を含む第1サンプルを得る工程;
(b)該第1サンプルを架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させて、治療タンパク質モノマーおよび共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体(1種または複数)を含む第2サンプルを得る工程;
(c)該第2サンプルをマトリックス溶液と混合してサンプル/マトリックス混合物を得る工程;
(d)基材上に該サンプル/マトリックス溶液をデポジションさせ、それにより均質な薄層を形成する工程;
(e)基材をレーザーからの放射により照明し、それにより該治療タンパク質モノマーおよび共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体(1種または複数)を脱離させそしてインタクトなイオンを発生させる工程;
(f)消化されていない、フラグメント化されていない治療タンパク質モノマーおよび共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体(1種または複数)の該インタクトなイオンを質量分離および高質量検出システムを使用して質量分離および検出する工程;
(g)治療タンパク質のモノマー形態および凝集した形態(1種または複数)について検出されたピークの表面積を決定する工程;
(h)予め確立された較正曲線上にこれらの表面積の値をプロットする工程;
(i)サンプルの凝集の量を較正曲線から決定する工程;
を含む。
質量分析法:すべての質量測定は、高質量レトロフィット検出器システム(HM1,CovalX,Zurich,Switzerland)を備えたMALDI ToF質量分析計Reflex IV(Bruker,Bremen)で行った。CovalX HM1高質量レトロフィットシステムは、5〜1500kDa範囲における高分子量分子イオンの検出を最適化するように設計される。CovalX HM1高質量レトロフィットシステムは、すべての標準MALDI ToF質量分析計にインストールされうる。
Hab−32は、腫瘍細胞を化学療法および放射に対して脆弱性にし、そして腫瘍細胞成長を遅くする薬物抗体候補である。Hab−32モノマーおよびダイマーの精製されたサンプルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して調製される。サイズ排除クロマトグラフィーの異なる画分を、1:1:1オクタン二酸ビス(3−スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド)エステル、3,3’−ジチオプロピオン酸ジスクシンイミジルおよびグルタル酸ジスクシンイミジルの混合物(200μg/mL)を使用して架橋に供する。25℃で45分間インキュベーション後に、既知濃度でHab−32の異なる量のモノマーおよびダイマーを含有する混合サンプルを調製する。高質量MALDI ToF質量分析法(HM1, CovalX, Zurich, Switzerland)を使用してこのサンプルを分析する(図1A、B、C、D、E、F)。各スペクトルにおいて、Hab−32モノマーおよびHab−32ダイマーに対応する2つのピークを検出する。これらのスペクトルから、検出されたピークの表面積(RiD/(Rim+RiD)を凝集の%の関数としてプロットする。RiDはピークダイマーの表面積であり、Rimはピークモノマーの表面積である。得られた較正曲線は、サンプル中に存在する凝集した抗体の百分率と高質量MALDI ToF MSにより検出されたピークの表面積間との相関を示す。各サンプルのタンパク質濃度は10μLの容積で1μMである。1mg/mL架橋混合物1μLを使用して、高質量MALDI ToF 分析の前に凝集体を安定化する。凝集体溶液1μLをシナピン酸(70%アセトニトリル:30%水:0.1%トリフルオロ酢酸中の10mg/mL)1μLと混合し、そして乾燥小滴技術を使用して1μLをスポットすることによりサンプルを調製する。
TK−190906は、チロシンキナーゼが関与する種々の生理学的経路に対するその効果のために開発された薬物候補である。この実施例は、治療タンパク質TK−190906の精製されていないサンプルから直接凝集の量を決定することを証明する。タンパク質TK−190906を含有するサンプルを、前もってサイズ排除クロマトグラフィーに供することなく、酒石酸ジスクシンイミジル、ヨード酢酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび3,3’ジチオプロピオン酸ジスクシンイミジルの3:1:1混合物(200μg/mL、25℃、45分)を使用して直接架橋反応に供する。高質量MALDI質量分析法による分析後に、治療タンパク質TK−190906のダイマーがm/z86.2kDaで明らかに検出される(図2A)。実施例1におけるとおりに得られた較正曲線から、サンプル中の凝集の量を直接決定することができる。反応には、500nMのTK−190906サンプル10μLが関与する。MS分析のために、シナピン酸(70%アセトニトリル:30%水:0.1%トリフルオロ酢酸中の10mg/mL)1μLと混合された溶液1μlを使用し、そして乾燥小滴技術を使用して1μLをスポットしてサンプルを調製する。
LK−200906は、MAPk経路に対する効果について評価された薬物候補である。この実施例は、モノマー状態(図3A)および凝集した状態(図3B)のタンパク質LK−200906を実証する。凝集体のスペクトルにおいて、タンパク質LK−200206のダイマーおよびトリマーは、m/z=34.5kDaおよびm/z=51.8kDaで検出される。反応には、酒石酸ジスクシンイミジル、ヨード酢酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、3,3’ジチオプロピオン酸ジスクシンイミジルおよびエチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシニマート)の3:1:1:1混合物を使用して架橋反応に供された(200μg/mL、25℃、45分)500nMのLK−200206、10μLが関与する。サンプルの凝集の量は、モノマー、ダイマーおよびトリマーのピークの表面積を100%と考えて決定される。分析は、LK−200906の凝集されたサンプルが、モノマー形態49%,ダイマー形態16%およびトリマー形態35%を含有していることを示す。
TN300707は、心肺バイパスの処置について評価された治療抗体候補である。この実施例は、低い量の凝集体を含有するサンプルの高質量MALDI分析を証明する。架橋試薬による処理の前には、タンパク質TN300707のダイマーは検出されない(図4A)。架橋後に、TN300707のダイマーが、m/z=304.92で検出される(図4B)。分析には、酒石酸ジスクシンイミジル、ヨード酢酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび3,3’ジチオプロピオン酸ジスクシンイミジルおよびエチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシニマート)の3:1:1:1混合物を使用して架橋反応に供された(200μg/mL、25℃、45分)500nMのTN300707、10μLが関与する。サンプルの凝集の量は、架橋実験についてのモノマーのピークおよびダイマーピークの表面積を考慮して決定され、そして予め確立された較正曲線と比較される(図4C)。分析は、TN300707のサンプルがダイマー4.47%を含有することを示す。同じ実験を10回繰り返すと、ダイマー値は4.47%±0.08との分析の高い精度を示した。
Claims (12)
- (a)モノマー治療タンパク質および非共有結合で凝集した治療タンパク質の混合物を架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させて、共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体を形成する工程;
(b)工程(a)のタンパク質モノマーおよびタンパク質凝集体から形成されたインタクトなイオンを、高質量検出器を備えた高質量MALDI ToF質量分析法により分析する工程;
(c)質量ピークを予め確立された較正曲線と比較することにより凝集の量を直接決定する工程;
を含む、治療タンパク質の凝集の量を決定するための方法。 - (a)治療タンパク質モノマーおよび非共有結合で結合した治療タンパク質凝集体を含む第1サンプルを得る工程;
(b)該第1サンプルを架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させて、治療タンパク質モノマーおよび共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体を含む第2サンプルを得る工程;
(c)該第2サンプルをマトリックス溶液と混合してサンプル/マトリックス混合物を得る工程;
(d)基材上に該サンプル/マトリックス溶液をデポジションさせ、それにより均質な薄層を形成する工程;
(e)基材をレーザーからの放射により照明し、それにより該治療タンパク質モノマーおよび共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体を脱離させ、そしてインタクトなイオンを発生させる工程;
(f)消化されていない、フラグメント化されていない治療タンパク質モノマーおよび共有結合で安定化された治療タンパク質凝集体の該インタクトなイオンを質量分離および高質量検出システムを使用して質量分離および検出する工程;
(g)治療タンパク質のモノマー形態および凝集した形態について検出されたピークの表面積を決定する工程;
(h)予め確立された較正曲線上にこれらの表面積の値をプロットする工程;
(i)サンプルの凝集の量を較正曲線から決定する工程;
を含む、請求項1に記載の方法。 - 既知の量の凝集を有する凝集した治療タンパク質サンプルを分析することにより較正曲線を確立する、請求項1または2に記載の方法。
- 同じ質量分析法スペクトルに存在するモノマー治療タンパク質および凝集した治療タンパク質に対応するピーク全表面積に基づいて凝集の量を確立する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 治療タンパク質を含む混合物中のインタクトなイオンを、該混合物を架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させる前に高質量検出器を備えた高質量MALDI ToF質量分析法により更に分析して、共有結合凝集の量を決定する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 精製された多成分サンプルまたは不均質生物学的マトリックスにおいて治療タンパク質凝集体を分析する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 治療タンパク質が抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 治療タンパク質が薬物または薬物候補である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 架橋試薬が、酒石酸ジスクシンイミジル、オクタン二酸ビス(3−スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド)エステル、ヨード酢酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、3,3’−ジチオプロピオン酸ジスクシンイミジル、オクタン二酸ジ−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタル酸ジスクシンイミジルおよびエチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシナート)から選ばれる1つの試薬または架橋試薬の混合物である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 高質量検出器がイオン変換ダイノード(ICD)検出器である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 薬物開発、製造プロセスにおける治療タンパク質の特徴付けおよび治療タンパク質品質コントロールのための請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 自動化された高スループット用途における請求項11に記載の使用。
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