JP2003528288A - 高分子の三次元形状の決定方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、タンパク質の三次元立体配座を決定するための迅速で効率的な方法を提供する。本発明の方法は、１）物理的な距離制約を形成するステップ、例えば、タンパク質の残基間で既知のサイズの分子内化学架橋を形成するステップと、２）反応プール内で分子内化学架橋を有する分子の数を、例えば、分子間結合を有するタンパク質を除去するサイズ分離によって、濃縮するステップと、３）濃縮された反応プールを、特定の部位においてタンパク質を切断するタンパク質分解酵素に触れさせて、ペプチド断片を生成するステップと、４）ペプチド断片のサイズを測定して、タンパク質において特定の空間的関係を有するリンク部位を決定するステップと、５）得られたデータを解釈して、推定されたリンク部位の空間的関係に基づいて空間ジオメトリおよびタンパク質の構造を決定するステップと、を備える。情報は、アミノ酸間の距離制約を生成および／または分析するために使用可能なコンピュータシステムの支援により分析されることが好ましい。
Description
【０００１】
生物学的高分子の三次元構造を決定する能力における進歩は、結晶のＸ線回折
分析から始まり、その後、非結晶環境におけるタンパク質の高分解度の磁気共鳴
の使用に拡張された。こうした方法は非常に大きな成功を収め、現在、膨大な数
の構造体がブルックヘブンタンパク質データバンクおよび核酸データバンクに保
存されている。このような技術は、理論的な医薬品設計に使用される。しかし、
このような技術は、通常、多くの年月を要し、タンパク質の適切な分析を可能に
する十分な量の純生成物を必要とする。
分析から始まり、その後、非結晶環境におけるタンパク質の高分解度の磁気共鳴
の使用に拡張された。こうした方法は非常に大きな成功を収め、現在、膨大な数
の構造体がブルックヘブンタンパク質データバンクおよび核酸データバンクに保
存されている。このような技術は、理論的な医薬品設計に使用される。しかし、
このような技術は、通常、多くの年月を要し、タンパク質の適切な分析を可能に
する十分な量の純生成物を必要とする。
【０００２】
三次元構造の決定における結晶法およびＮＭＲ等の磁気共鳴アプローチの成功
にも関わらず、構造が知られていないタンパク質および核酸は多数存在し、例え
ば、膜タンパク質および結晶形成に関して不十分な可溶性を有するタンパク質が
存在する。また、種々のゲノムプロジェクトでは、今後数年だけでも膨大な数の
新しいタンパク質を確認することが約束されており、未決定の構造が残ることは
間違いない。科学者がこうした膨大な新しい一連の情報を利用する場合には、新
たな高スループットの戦略が要求される。
にも関わらず、構造が知られていないタンパク質および核酸は多数存在し、例え
ば、膜タンパク質および結晶形成に関して不十分な可溶性を有するタンパク質が
存在する。また、種々のゲノムプロジェクトでは、今後数年だけでも膨大な数の
新しいタンパク質を確認することが約束されており、未決定の構造が残ることは
間違いない。科学者がこうした膨大な新しい一連の情報を利用する場合には、新
たな高スループットの戦略が要求される。
【０００３】
ＮＭＲまたは結晶法の代替方法として研究されている１つのアプローチは、化
学架橋である。架橋および一価標識実験は、長年に渡って実施されており、低分
解度の構造情報を提供できる。コーヘン等の「ミオグロビンを例としたタンパク
質構造の予測における化学的に導かれた距離制約の使用について」、J Mol. Bio
l.1980 137:9-22。ミトラ等の「平衡転移アルキル化によるタンパク質の架橋用
試薬」、J. Am. Chem. Soc. 1979 101,3097。例えば、タンパク質におけるアミ
ノ酸表面の到達性は、選択的な化学修飾を使用し、その後、結果として生じた修
飾済み（および未修飾）のペプチドのタンパク質分解消化および質量スペクトロ
メトリプロファイリングを用いることによって、調査されてきた。スカウ等の「
選択的化学修飾および質量スペクトロメトリのペプチドマッピングによるタンパ
ク質表面のトポロジ調査」、Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jun 15;89(12):563
0-4。グロッカ等の「アミノアルキル化および質量スペクトロメトリペプチドマ
ッピングによるタンパク質の三次元構造における表面トポロジの分子の特徴」、
Bioconjug. Chem. 1994 Nov-Dec;5(6):583-90。シールスタッド等の「選択的な
タンパク質分解／質量スペクトル分析による人間のエストロゲン受容体配位結合
ドメインの構造的中心の分析」、Biochemistry. 1995 Oct 3;34(39):12605-15。
シールスタッド等の「大腸菌において発現する人間のエストロゲン受容体配位結
合ドメインの質量スペクトロメトリによる分子の特徴」、Mol. Endcrinol. 1995
Jun;9(6):647-58。ザッパコスタ等の「選択的化学修飾および質量スペクトロメ
トリによるミニボディの表面トポロジ」、Protein. Sci. 1997 Sep;6(9):1901-9
。スカロニ等の「質量スペクトロメトリ処理による人間の赤血球のアシルペプチ
ド分解酵素の構造調査」、J. Protein. Chem. 1999 Apr;18(3):349-60。
学架橋である。架橋および一価標識実験は、長年に渡って実施されており、低分
解度の構造情報を提供できる。コーヘン等の「ミオグロビンを例としたタンパク
質構造の予測における化学的に導かれた距離制約の使用について」、J Mol. Bio
l.1980 137:9-22。ミトラ等の「平衡転移アルキル化によるタンパク質の架橋用
試薬」、J. Am. Chem. Soc. 1979 101,3097。例えば、タンパク質におけるアミ
ノ酸表面の到達性は、選択的な化学修飾を使用し、その後、結果として生じた修
飾済み（および未修飾）のペプチドのタンパク質分解消化および質量スペクトロ
メトリプロファイリングを用いることによって、調査されてきた。スカウ等の「
選択的化学修飾および質量スペクトロメトリのペプチドマッピングによるタンパ
ク質表面のトポロジ調査」、Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jun 15;89(12):563
0-4。グロッカ等の「アミノアルキル化および質量スペクトロメトリペプチドマ
ッピングによるタンパク質の三次元構造における表面トポロジの分子の特徴」、
Bioconjug. Chem. 1994 Nov-Dec;5(6):583-90。シールスタッド等の「選択的な
タンパク質分解／質量スペクトル分析による人間のエストロゲン受容体配位結合
ドメインの構造的中心の分析」、Biochemistry. 1995 Oct 3;34(39):12605-15。
シールスタッド等の「大腸菌において発現する人間のエストロゲン受容体配位結
合ドメインの質量スペクトロメトリによる分子の特徴」、Mol. Endcrinol. 1995
Jun;9(6):647-58。ザッパコスタ等の「選択的化学修飾および質量スペクトロメ
トリによるミニボディの表面トポロジ」、Protein. Sci. 1997 Sep;6(9):1901-9
。スカロニ等の「質量スペクトロメトリ処理による人間の赤血球のアシルペプチ
ド分解酵素の構造調査」、J. Protein. Chem. 1999 Apr;18(3):349-60。
【０００４】
アミド水素交換実験と、その後のタンパク質分解および質量スペクトロメトリ
も、タンパク質構造における溶媒到達可能領域のマップに使用されてきた。スミ
ス等の「アミド水素交換および質量スペクトロメトリによるタンパク質の非共有
構造の調査」、J Mass. Spectrom. 1979 32(2):135-146. 1997。タンパク質分解
に対する敏感性は、露出または埋もれたアミノ酸領域を間接的に特定する部位の
到達性の尺度として、いくつかのグループによって利用されている。ペイパック
等の「タンパク質分解とその後のマトリクス補助レーザ着脱イオン化質量スペク
トロメトリによるガストリン放出ペプチド／抗ボンベシンモノクローナル抗体複
合体のエピトープマッピング」、Protein. Sci. 1994 Sep;3(9):1485-92。コー
ヘン等の「タンパク質分解質量スペクトロメトリの組み合わせによるＤＮＡ結合
タンパク質マックスの溶液構造の調査」、Protein. Sci. 1995 Jun;4(6):1088-9
9。ゴームス等の「人間の複製タンパク質Ａのタンパク質分解マッピング：一本
鎖ＤＮＡとの相互作用時の複合構造ドメインおよび配座変化の証拠」、Biochemi
stry 1996 Apr 30;35(17):5586-95。ザッパコスタ等の「限られたタンパク質分
解および質量スペクトロメトリによるタンパク質の立体構造の調査：ミニボディ
の場合」、Protein. Sci. 1996 May;5(5):802−13。ジェルバソニ等の「限られ
たタンパク質分解およびＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリによるＧｒｏＥＬに関
するβ−ラクタマーゼの結合表面の特定」、Biochemistry 1998 Aug 18;37(33):
11660-9。タンパク質分解およびアシル化のアプローチは両方とも、アセチルコ
リン受容体等のすべての膜タンパク質のトポロジを特徴付けるのに適用されてお
り、細胞質、細胞外、および膜スパニング要素の明確なパターンの観察を期待で
きる。ムーア等の「質量スペクトロメトリによって確認されるニコチン性アセチ
ルコリン受容体のタンパク質分解断片：受容体トポグラフィの意味」、Biochemi
stry 1989 Nov 14;28(23):9184-91。マソッテＤ等の「コリシンＡの穴形成ドメ
インの膜結合形状の構造：部分的タンパク質分解および質量スペクトロメトリの
研究」、Biochemistry 1993 Dec 21;32(50):13787-94。しかし、こうした標識戦
略の大きな制限の１つは、タンパク質修飾の迅速で曖昧性のない特定を行う方法
の欠如だった。また、こうしたタイプの標識は、全体的な構造の決定にはほとん
ど使用されない。
も、タンパク質構造における溶媒到達可能領域のマップに使用されてきた。スミ
ス等の「アミド水素交換および質量スペクトロメトリによるタンパク質の非共有
構造の調査」、J Mass. Spectrom. 1979 32(2):135-146. 1997。タンパク質分解
に対する敏感性は、露出または埋もれたアミノ酸領域を間接的に特定する部位の
到達性の尺度として、いくつかのグループによって利用されている。ペイパック
等の「タンパク質分解とその後のマトリクス補助レーザ着脱イオン化質量スペク
トロメトリによるガストリン放出ペプチド／抗ボンベシンモノクローナル抗体複
合体のエピトープマッピング」、Protein. Sci. 1994 Sep;3(9):1485-92。コー
ヘン等の「タンパク質分解質量スペクトロメトリの組み合わせによるＤＮＡ結合
タンパク質マックスの溶液構造の調査」、Protein. Sci. 1995 Jun;4(6):1088-9
9。ゴームス等の「人間の複製タンパク質Ａのタンパク質分解マッピング：一本
鎖ＤＮＡとの相互作用時の複合構造ドメインおよび配座変化の証拠」、Biochemi
stry 1996 Apr 30;35(17):5586-95。ザッパコスタ等の「限られたタンパク質分
解および質量スペクトロメトリによるタンパク質の立体構造の調査：ミニボディ
の場合」、Protein. Sci. 1996 May;5(5):802−13。ジェルバソニ等の「限られ
たタンパク質分解およびＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリによるＧｒｏＥＬに関
するβ−ラクタマーゼの結合表面の特定」、Biochemistry 1998 Aug 18;37(33):
11660-9。タンパク質分解およびアシル化のアプローチは両方とも、アセチルコ
リン受容体等のすべての膜タンパク質のトポロジを特徴付けるのに適用されてお
り、細胞質、細胞外、および膜スパニング要素の明確なパターンの観察を期待で
きる。ムーア等の「質量スペクトロメトリによって確認されるニコチン性アセチ
ルコリン受容体のタンパク質分解断片：受容体トポグラフィの意味」、Biochemi
stry 1989 Nov 14;28(23):9184-91。マソッテＤ等の「コリシンＡの穴形成ドメ
インの膜結合形状の構造：部分的タンパク質分解および質量スペクトロメトリの
研究」、Biochemistry 1993 Dec 21;32(50):13787-94。しかし、こうした標識戦
略の大きな制限の１つは、タンパク質修飾の迅速で曖昧性のない特定を行う方法
の欠如だった。また、こうしたタイプの標識は、全体的な構造の決定にはほとん
ど使用されない。
【０００５】
タンパク質の立体構造を化学的に推定する潜在的な選択肢として調査されてき
たタンパク質のフォールディングを予測する純計算的な方法も存在する。しかし
、こうした計算的な方法はすべて信頼性がない。２０年前、ある研究において、
低分解度の距離情報が距離ジオメトリを有するタンパク質構造を決定できること
が示された。ハブル等の「高分子配座の距離制約の影響ＩＩ 実験結果および理
論予測のシミュレーション」、Biopolymers 1979 18:73-81。ハブル等は、各ア
ルファ炭素が構造内の他のすべてのアルファ炭素から１０Åより近いかまたは遠
いかを指定し、制約を満たす構造を解決する距離ジオメトリを使用して、ウシの
膵臓トリプシンインヒビタ（ＰＴＩ）およびコイのカルシウム結合タンパク質−
Ｂ（コイミオゲン）のアルファ炭素バックボーンを、実験的に決定した構造の１
ÅＲＭＳ内に再構築した。この理論的実証の明らかな意味にも関わらず、必要な
距離制約を提供する可能性がある実験的アプローチはほとんど発展しておらず、
ＮＭＲおよび／またはＸ線結晶法には及ばない。
たタンパク質のフォールディングを予測する純計算的な方法も存在する。しかし
、こうした計算的な方法はすべて信頼性がない。２０年前、ある研究において、
低分解度の距離情報が距離ジオメトリを有するタンパク質構造を決定できること
が示された。ハブル等の「高分子配座の距離制約の影響ＩＩ 実験結果および理
論予測のシミュレーション」、Biopolymers 1979 18:73-81。ハブル等は、各ア
ルファ炭素が構造内の他のすべてのアルファ炭素から１０Åより近いかまたは遠
いかを指定し、制約を満たす構造を解決する距離ジオメトリを使用して、ウシの
膵臓トリプシンインヒビタ（ＰＴＩ）およびコイのカルシウム結合タンパク質−
Ｂ（コイミオゲン）のアルファ炭素バックボーンを、実験的に決定した構造の１
ÅＲＭＳ内に再構築した。この理論的実証の明らかな意味にも関わらず、必要な
距離制約を提供する可能性がある実験的アプローチはほとんど発展しておらず、
ＮＭＲおよび／またはＸ線結晶法には及ばない。
【０００６】
このため、この分野では、タンパク質の立体的構造を決定する迅速で高スルー
プットな方法が必要とされている。また、長い精製プロセスの必要がなく、少量
のタンパク質で、タンパク質の構造を少なくとも適度な分解度で決定できる方法
が必要とされている。さらに、多重結合タンパク質またはドメインに適する改善
された方法も必要とされている。
プットな方法が必要とされている。また、長い精製プロセスの必要がなく、少量
のタンパク質で、タンパク質の構造を少なくとも適度な分解度で決定できる方法
が必要とされている。さらに、多重結合タンパク質またはドメインに適する改善
された方法も必要とされている。
【０００７】
本発明は、タンパク質またはその他の高分子の三次元構造または立体配座を決
定するための迅速で効率的な方法を提供する。本発明の方法は、１）物理的な距
離制約を生成するステップ、例えば、タンパク質の残基間で既知の長さの分子内
化学架橋を形成するステップと、２）反応プール内で分子内化学架橋を有する分
子の数を、例えば、分子間結合を有するタンパク質を除去するサイズ分離によっ
て、濃縮するステップと、３）濃縮された反応プールを、特定または不特定の部
位においてタンパク質を分解する１以上のタンパク質分解酵素に触れさせて、ペ
プチド断片を生成するステップと、４）タンパク質において特定の空間的関係を
有するリンク部位を決定するために、ペプチド断片を確認するステップと、５）
得られたデータを解釈して、推定されたリンク部位の空間的関係に基づいて空間
ジオメトリおよびタンパク質構造を決定するステップと、を備える。情報は、ド
メイン間および／またはタンパク質内のフォールディング間の、距離制約および
空間ジオメトリを、生成および／または分析するために使用可能なコンピュータ
システムの支援により分析されることが好ましい。得られたデータは、既知の構
造のタンパク質と選択的に比較される。スレッディング等の技術を用いた構造モ
デリングが、タンパク質のフォールディングの決定を支援するために使用される
。これらの手法を組み合わせて用いることにより、この分野で現在用いられてい
る他の従来の方法よりも、遙かに迅速かつ効率的に、非常に正確な三次元化学構
造を提供できる。
定するための迅速で効率的な方法を提供する。本発明の方法は、１）物理的な距
離制約を生成するステップ、例えば、タンパク質の残基間で既知の長さの分子内
化学架橋を形成するステップと、２）反応プール内で分子内化学架橋を有する分
子の数を、例えば、分子間結合を有するタンパク質を除去するサイズ分離によっ
て、濃縮するステップと、３）濃縮された反応プールを、特定または不特定の部
位においてタンパク質を分解する１以上のタンパク質分解酵素に触れさせて、ペ
プチド断片を生成するステップと、４）タンパク質において特定の空間的関係を
有するリンク部位を決定するために、ペプチド断片を確認するステップと、５）
得られたデータを解釈して、推定されたリンク部位の空間的関係に基づいて空間
ジオメトリおよびタンパク質構造を決定するステップと、を備える。情報は、ド
メイン間および／またはタンパク質内のフォールディング間の、距離制約および
空間ジオメトリを、生成および／または分析するために使用可能なコンピュータ
システムの支援により分析されることが好ましい。得られたデータは、既知の構
造のタンパク質と選択的に比較される。スレッディング等の技術を用いた構造モ
デリングが、タンパク質のフォールディングの決定を支援するために使用される
。これらの手法を組み合わせて用いることにより、この分野で現在用いられてい
る他の従来の方法よりも、遙かに迅速かつ効率的に、非常に正確な三次元化学構
造を提供できる。
【０００８】
タンパク質で分子内架橋を形成するのに使用される化学試薬は、少なくとも１
つの予測されるタンパク質の残基と反応することが好ましく、例えば、化学架橋
残基の少なくとも一端が、タンパク質内のリシンにおける任意の２ｅ−アミノ基
などのタンパク質の予測される部位と結合することが好ましい。本発明の好適な
実施形態において、タンパク質の架橋に使用される化学試薬は、タンパク質の２
つの予測される官能部位と反応し、例えば、この架橋試薬はタンパク質における
任意の２つのリシン残基を架橋する。
つの予測されるタンパク質の残基と反応することが好ましく、例えば、化学架橋
残基の少なくとも一端が、タンパク質内のリシンにおける任意の２ｅ−アミノ基
などのタンパク質の予測される部位と結合することが好ましい。本発明の好適な
実施形態において、タンパク質の架橋に使用される化学試薬は、タンパク質の２
つの予測される官能部位と反応し、例えば、この架橋試薬はタンパク質における
任意の２つのリシン残基を架橋する。
【０００９】
本発明の一態様は、タンパク質の三次元（立体）構造に関する情報を得られる
ようにタンパク質等の分子を分析する方法である。いくつかのタンパク質は結晶
化できないため、Ｘ線結晶法では分析できない。膜タンパク質は、結晶化が困難
または不可能なタンパク質の例である。多くのタンパク質は、ＮＭＲを使用する
のに十分なほど溶解しない。本発明は、本質的に、すべてのタンパク質に適用で
きる。
ようにタンパク質等の分子を分析する方法である。いくつかのタンパク質は結晶
化できないため、Ｘ線結晶法では分析できない。膜タンパク質は、結晶化が困難
または不可能なタンパク質の例である。多くのタンパク質は、ＮＭＲを使用する
のに十分なほど溶解しない。本発明は、本質的に、すべてのタンパク質に適用で
きる。
【００１０】
本発明の別の態様においては、分子の構造の詳細情報を決定するシステムを提
供する。このシステムは、質量スペクトロメータと、質量スペクトロメータから
質量情報を受け取り、この情報を処理することによって分子の構造の詳細を出力
する計算システムと、を含む。このシステムは、ポリペプチド、核酸、およびそ
の他の高分子の構造の詳細を提供することができる。この分子は、定められた少
なくとも１つの距離制約を有しており、ポリペプチドの場合は、ＢＳ３（ビス［
スルフォスクシニミジル］スベリン酸塩）等の架橋薬である。ポリペプチドに課
される制約の数は、アミノ酸残基の数の約２０％未満にすることができる。この
システムは、さらに、高分子の三次元構造を出力するために、制約されたスレッ
ディングおよび類似性モデリングを実行する。本発明の別の態様においては、こ
れらの同じ処理を実施し、分子の構造の詳細を出力する計算システムのみが提供
される。この計算システムは、これを実行するために、質量スペクトロメータ等
の別のソースから情報を受け取る。
供する。このシステムは、質量スペクトロメータと、質量スペクトロメータから
質量情報を受け取り、この情報を処理することによって分子の構造の詳細を出力
する計算システムと、を含む。このシステムは、ポリペプチド、核酸、およびそ
の他の高分子の構造の詳細を提供することができる。この分子は、定められた少
なくとも１つの距離制約を有しており、ポリペプチドの場合は、ＢＳ３（ビス［
スルフォスクシニミジル］スベリン酸塩）等の架橋薬である。ポリペプチドに課
される制約の数は、アミノ酸残基の数の約２０％未満にすることができる。この
システムは、さらに、高分子の三次元構造を出力するために、制約されたスレッ
ディングおよび類似性モデリングを実行する。本発明の別の態様においては、こ
れらの同じ処理を実施し、分子の構造の詳細を出力する計算システムのみが提供
される。この計算システムは、これを実行するために、質量スペクトロメータ等
の別のソースから情報を受け取る。
【００１１】
本発明の別の態様においては、分子の候補の得点をつけるためのコンピュータ
によって実行される方法が提供される。この方法は、質量情報を受け取るステッ
プと、分子の予期される断片を生成または保存するステップと、質量情報を予期
される断片とマッチングさせるステップと、候補の得点をつけるステップと、を
含む。このシステムは、ポリペプチド、核酸、およびその他の高分子の構造の詳
細を提供できる。この分子は、定められた少なくとも１つの距離制約を有し、ポ
リペプチドの場合は、ＢＳ３（ビス［スルフォスクシニミジル］スベリン酸塩）
等の架橋薬である。ポリペプチドに課される制約の数は、アミノ酸残基の数の約
２０％未満にすることができる。本発明の別の態様において、こうした得点付け
の処理を実行するためのコンピュータプログラム製品が提供される。
によって実行される方法が提供される。この方法は、質量情報を受け取るステッ
プと、分子の予期される断片を生成または保存するステップと、質量情報を予期
される断片とマッチングさせるステップと、候補の得点をつけるステップと、を
含む。このシステムは、ポリペプチド、核酸、およびその他の高分子の構造の詳
細を提供できる。この分子は、定められた少なくとも１つの距離制約を有し、ポ
リペプチドの場合は、ＢＳ３（ビス［スルフォスクシニミジル］スベリン酸塩）
等の架橋薬である。ポリペプチドに課される制約の数は、アミノ酸残基の数の約
２０％未満にすることができる。本発明の別の態様において、こうした得点付け
の処理を実行するためのコンピュータプログラム製品が提供される。
【００１２】
本発明の一実施形態においては、タンパク質のアミノ酸は、検出可能ラベルを
有する架橋試薬を用いて架橋される。
有する架橋試薬を用いて架橋される。
【００１３】
本発明の効果は、従来の三次元分析方法に比べ、化合物をより迅速に分析でき
ることである。また、この技術は、グリコシル化タンパク質等の本質的に不均一
なタンパク質に適用できる。
ることである。また、この技術は、グリコシル化タンパク質等の本質的に不均一
なタンパク質に適用できる。
【００１４】
本発明の別の効果は、調査されるタンパク質がＮＭＲやＸ線結晶法の場合のよ
うに純性である必要がないことである。
うに純性である必要がないことである。
【００１５】
また、別の利点は、分析において、ＮＭＲまたはＸ線結晶法を用いる分析より
も、必要とされるタンパク質が少ないことである。
も、必要とされるタンパク質が少ないことである。
【００１６】
さらに、別の利点は、本発明の方法で使用されるタンパク質の濃度は、希薄で
あってもよいことである。
あってもよいことである。
【００１７】
本発明の前述およびその他の目的、態様、効果、特徴は、以下でさらに詳述さ
れる方法の詳細を読むことにより、当業者に明らかとなる。
れる方法の詳細を読むことにより、当業者に明らかとなる。
【００１８】
本発明のモデリング方法を説明するにあたり、本発明は、説明された特定のプ
ロトコルに限定されず、もちろん変形可能である。さらに、本発明の範囲は、添
付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、ここで用いられる用語は、特
定の実施形態を説明する目的のみを有し、限定を意図するものではない。
ロトコルに限定されず、もちろん変形可能である。さらに、本発明の範囲は、添
付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、ここで用いられる用語は、特
定の実施形態を説明する目的のみを有し、限定を意図するものではない。
【００１９】
異なる定義がなされていない限り、ここで使用するすべての技術用語および科
学用語は、本発明が属する分野の業者が通常理解するものと同じ意味を有する。
本発明の実施または試験において、ここで説明するものと類似または同等の任意
の方法および要素を用いることができるが、ここでは好適な方法および要素につ
いて説明する。ここで言及するすべての引例は、出典を明記することによりその
開示内容を本願明細書の一部とする。
学用語は、本発明が属する分野の業者が通常理解するものと同じ意味を有する。
本発明の実施または試験において、ここで説明するものと類似または同等の任意
の方法および要素を用いることができるが、ここでは好適な方法および要素につ
いて説明する。ここで言及するすべての引例は、出典を明記することによりその
開示内容を本願明細書の一部とする。
【００２０】
ここで述べる引例は、本発明の出願日以前に開示が準備されている。ここには
、本発明に基づいて、本発明がこうした引例に先行する権利を有しないことの承
認と解釈されるものは含まれていない。さらに、提示した発刊日は、実際の発刊
日と異なる可能性があり、この場合は別途確認が必要となる。
、本発明に基づいて、本発明がこうした引例に先行する権利を有しないことの承
認と解釈されるものは含まれていない。さらに、提示した発刊日は、実際の発刊
日と異なる可能性があり、この場合は別途確認が必要となる。
【００２１】
定義：
ここで互換性のあるものとして使用されている「架橋薬」、「架橋試薬」など
の用語は、２つまたはそれ以上の可能性のあるアミノ酸の反応部位間の反応を可
能とする十分に近接したタンパク質内のアミノ酸を化学的にリンクする任意の試
薬を指す。架橋薬は、特定の架橋薬の最大距離内にあるタンパク質の反応性官能
基と反応する能力を有する。反応基（Ｘおよび／またはＹ）は、アミノ酸側鎖に
存在する種々の官能基と特定または一般的な態様で反応するように設計される。
二官能性架橋薬は、反応基が同じ場合はホモ二官能性（Ｘ−ＸまたはＹ−Ｙ）で
あり、反応基が異なる場合はヘテロ二官能性（Ｘ−Ｙ）である。アミン特異性ホ
モ二官能性架橋薬の例は、ＢＳ３（ビス［スルフォスクシニミジル］スベリン酸
塩）およびスルフォ−ＤＳＰ（ジチオビス（スクシニミジルプロピオン酸塩））
である。官能基Ｘおよび／またはＹは、例えばγ−アミンやメチレン等、架橋薬
と化学的に反応するアミノ酸の任意の官能部位である。アミン特異性およびメチ
レン特異性ヘテロ二官能性高分子の例は、ＳＡＮＤ（スルフォスクシニンジジル
２−［オジド−ｏ−ニトロ−ベンザミド］エチル−１，３’ジチオプロピオン酸
塩）である。ＳＡＮＤは、第二および直交反応部位としてのＣ−Ｈ結合への挿入
ための特殊な光活性基である、アリールアジドを有する。
の用語は、２つまたはそれ以上の可能性のあるアミノ酸の反応部位間の反応を可
能とする十分に近接したタンパク質内のアミノ酸を化学的にリンクする任意の試
薬を指す。架橋薬は、特定の架橋薬の最大距離内にあるタンパク質の反応性官能
基と反応する能力を有する。反応基（Ｘおよび／またはＹ）は、アミノ酸側鎖に
存在する種々の官能基と特定または一般的な態様で反応するように設計される。
二官能性架橋薬は、反応基が同じ場合はホモ二官能性（Ｘ−ＸまたはＹ−Ｙ）で
あり、反応基が異なる場合はヘテロ二官能性（Ｘ−Ｙ）である。アミン特異性ホ
モ二官能性架橋薬の例は、ＢＳ３（ビス［スルフォスクシニミジル］スベリン酸
塩）およびスルフォ−ＤＳＰ（ジチオビス（スクシニミジルプロピオン酸塩））
である。官能基Ｘおよび／またはＹは、例えばγ−アミンやメチレン等、架橋薬
と化学的に反応するアミノ酸の任意の官能部位である。アミン特異性およびメチ
レン特異性ヘテロ二官能性高分子の例は、ＳＡＮＤ（スルフォスクシニンジジル
２−［オジド−ｏ−ニトロ−ベンザミド］エチル−１，３’ジチオプロピオン酸
塩）である。ＳＡＮＤは、第二および直交反応部位としてのＣ−Ｈ結合への挿入
ための特殊な光活性基である、アリールアジドを有する。
【００２２】
ここで使用される「三官能性架橋薬」という用語は、２つのアミノ酸特異性反
応基を含むとともに、リンクしたペプチドの容易な精製を可能にする親和基など
の第３の基を含む、任意の高分子を指す。三官能性架橋薬は、例えば、市販のス
ルフォ−ＳＢＥＤ（スルフォスクシニミジル［２−ｏ−（ビオチンアミド）−２
−（ｐ−アジドベンザミド）−ヘキサミド］エチル１，３’−ジチオプロピオン
酸塩）であり、これは、ビオチン基を有し、アヴィジンを使用して親和的に選択
される。
応基を含むとともに、リンクしたペプチドの容易な精製を可能にする親和基など
の第３の基を含む、任意の高分子を指す。三官能性架橋薬は、例えば、市販のス
ルフォ−ＳＢＥＤ（スルフォスクシニミジル［２−ｏ−（ビオチンアミド）−２
−（ｐ−アジドベンザミド）−ヘキサミド］エチル１，３’−ジチオプロピオン
酸塩）であり、これは、ビオチン基を有し、アヴィジンを使用して親和的に選択
される。
【００２３】
ここで使用される「オンラインクロマトグラフィ質量スペクトロメトリ」とい
う用語は、クロマトグラフィの流出物が質量スペクトロメータへ流入する方法を
指す。この流出物は、質量スペクトロメータに直接流入してもよいし、質量スペ
クトロメータに流入する前に他の検出手段を通過するようにしてもよい。
う用語は、クロマトグラフィの流出物が質量スペクトロメータへ流入する方法を
指す。この流出物は、質量スペクトロメータに直接流入してもよいし、質量スペ
クトロメータに流入する前に他の検出手段を通過するようにしてもよい。
【００２４】
ここで使用される「オフラインクロマトグラフィ」という用語は、クロマトグ
ラフィを実行し、フラクションを分離し、その後分析する方法を指す。
ラフィを実行し、フラクションを分離し、その後分析する方法を指す。
【００２５】
ここで使用される「低分解度」という用語は、約５Åを超える構造の分解度を
指す。
指す。
【００２６】
ここで使用される「中分解度」という用語は、約２〜５Åの構造を指す。本発
明は、約２〜５Å、より一般的には、約３〜５Åの構造の分解度を提供できる。
明は、約２〜５Å、より一般的には、約３〜５Åの構造の分解度を提供できる。
【００２７】
本発明の一般的な態様：
本発明は、物理的な距離制約を決定する統合技術および制約情報の分析によっ
て、約３Å〜約５Å、より具体的には、３．５Å〜４．５Åの分解度レベルで高
分子の構造態様の決定を可能にする十分なアミノ酸近接情報を高い信頼性で入手
できる、という発見に基づいている。説明を容易にするために、ここでは、タン
パク質の空間ジオメトリを決定することに関して、この技術を説明する。この技
術は、例えば、ＲＮＡ，ＤＮＡの構造的関係、および／または、こうした分子の
タンパク質との相互作用の関係（例えば制限結合）などの、他の高分子の構造態
様を決定する場合にも使用可能であり、本発明の方法は、タンパク質の構造の決
定に限定されるものではない。したがって、以下の開示では、タンパク質の立体
構造を決定するために本発明の方法が使用されているが、同じ一般的な概念は、
広範な異なるタイプの高分子の構造の確認にも適用できる。
て、約３Å〜約５Å、より具体的には、３．５Å〜４．５Åの分解度レベルで高
分子の構造態様の決定を可能にする十分なアミノ酸近接情報を高い信頼性で入手
できる、という発見に基づいている。説明を容易にするために、ここでは、タン
パク質の空間ジオメトリを決定することに関して、この技術を説明する。この技
術は、例えば、ＲＮＡ，ＤＮＡの構造的関係、および／または、こうした分子の
タンパク質との相互作用の関係（例えば制限結合）などの、他の高分子の構造態
様を決定する場合にも使用可能であり、本発明の方法は、タンパク質の構造の決
定に限定されるものではない。したがって、以下の開示では、タンパク質の立体
構造を決定するために本発明の方法が使用されているが、同じ一般的な概念は、
広範な異なるタイプの高分子の構造の確認にも適用できる。
【００２８】
図１は、本発明の方法の一実施形態のステップを示している。本発明の方法の
第１のステップは、物理的な距離制約の決定であり、化学的または物理的手段を
用いたタンパク質の空間的制約の確認を含んでいる。本発明の一実施形態は、タ
ンパク質の残基の空間的関係の限界を決定するために化学架橋試薬を利用する。
架橋薬と融和する官能基を有し、化学反応が可能な近接性を有する残基のみが、
実際に架橋する。したがって、架橋残基の確認は、タンパク質の立体配座に関す
るジオメトリ制約を決定するために採用される。タンパク質構造の決定において
は、異なる空間的制約および／または官能基特異性を有する複数の架橋薬を、使
用できる。
第１のステップは、物理的な距離制約の決定であり、化学的または物理的手段を
用いたタンパク質の空間的制約の確認を含んでいる。本発明の一実施形態は、タ
ンパク質の残基の空間的関係の限界を決定するために化学架橋試薬を利用する。
架橋薬と融和する官能基を有し、化学反応が可能な近接性を有する残基のみが、
実際に架橋する。したがって、架橋残基の確認は、タンパク質の立体配座に関す
るジオメトリ制約を決定するために採用される。タンパク質構造の決定において
は、異なる空間的制約および／または官能基特異性を有する複数の架橋薬を、使
用できる。
【００２９】
本発明の方法の第２のステップは、分子内架橋タンパク質の架橋反応プールの
濃縮である。架橋に続いて、反応プールは、ペプチド内架橋を有するタンパク質
に関して濃縮される。そして、ペプチド間結合を有する分子は、例えば、サイズ
分離技術によって、完全に除去されることが好ましい。
濃縮である。架橋に続いて、反応プールは、ペプチド内架橋を有するタンパク質
に関して濃縮される。そして、ペプチド間結合を有する分子は、例えば、サイズ
分離技術によって、完全に除去されることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法の第３のステップは、濃縮された反応プールのタンパク質分解で
ある。架橋ペプチドは、トリプシンなどの既知の切断部位と反応するタンパク質
分解酵素によって、タンパク質分解される。架橋断片は、タンパク質分解後も結
合を維持している。架橋前のタンパク質におけるペプチド断片の数は予測できる
ため、架橋タンパク質のタンパク質分解後に生成された断片のサイズを決定する
ことにより、特定のサイズの化学架橋試薬と反応する残基の確認が可能になる。
ある。架橋ペプチドは、トリプシンなどの既知の切断部位と反応するタンパク質
分解酵素によって、タンパク質分解される。架橋断片は、タンパク質分解後も結
合を維持している。架橋前のタンパク質におけるペプチド断片の数は予測できる
ため、架橋タンパク質のタンパク質分解後に生成された断片のサイズを決定する
ことにより、特定のサイズの化学架橋試薬と反応する残基の確認が可能になる。
【００３１】
本発明の方法の第４のステップは、タンパク質分解によって生成されたペプチ
ド断片の分析である。本発明の一実施形態においては、質量スペクトロメトリ（
ＭＳ）技術を用いることによって、架橋断片が確認される。飛行時間型（ＴＯＦ
）質量スペクトロメトリおよびタンデム質量スペクトロメトリ（ＭＳ／ＭＳ）等
の容易に利用可能な高分解度の質量スペクトロメトリ技術の出現により、タンパ
ク質分解により分解された架橋タンパク質から発生したペプチド等の化合物の複
雑な混合物の分析が実現可能となった。ＭＳ技術では、多数の架橋に関して、高
い質量精度（＜１０ｐｐｍ）で、同位体レベルでの分子イオンの分解度を許容す
る。
ド断片の分析である。本発明の一実施形態においては、質量スペクトロメトリ（
ＭＳ）技術を用いることによって、架橋断片が確認される。飛行時間型（ＴＯＦ
）質量スペクトロメトリおよびタンデム質量スペクトロメトリ（ＭＳ／ＭＳ）等
の容易に利用可能な高分解度の質量スペクトロメトリ技術の出現により、タンパ
ク質分解により分解された架橋タンパク質から発生したペプチド等の化合物の複
雑な混合物の分析が実現可能となった。ＭＳ技術では、多数の架橋に関して、高
い質量精度（＜１０ｐｐｍ）で、同位体レベルでの分子イオンの分解度を許容す
る。
【００３２】
本発明の方法の最後のステップは、タンパク質のモデリング、特に空間ジオメ
トリソフトウェアを用いたモデリングを含む。最近の質量スペクトロメトリ方法
の高感度および質量範囲を、類似性モデリング等のタンパク質モデリング技術と
併用することで、ドメインマッピングおよび中分解度構造、すなわち、約３Å〜
約５Åの構造の構築が可能となる。このデータの統合および解釈により、タンパ
ク質の構造的な立体配座が決定され、タンパク質の立体構造が示される。
トリソフトウェアを用いたモデリングを含む。最近の質量スペクトロメトリ方法
の高感度および質量範囲を、類似性モデリング等のタンパク質モデリング技術と
併用することで、ドメインマッピングおよび中分解度構造、すなわち、約３Å〜
約５Åの構造の構築が可能となる。このデータの統合および解釈により、タンパ
ク質の構造的な立体配座が決定され、タンパク質の立体構造が示される。
【００３３】
分子内架橋によって取り組むことのできる構造上の問題は、フォールディング
の認識に限られない。いくつかの制約の限界において、ドメイン対当たり３つま
での制約によって、ドメイン−ドメイン配置が実施できる。ロッシ等の「人間の
補足タンパク質分解酵素Ｃ１ｓの触媒領域の構造：化学架橋および三次元類似性
モデリングによる研究」、Biochemistry 1995 Jun 6;34(22):7311-21。ラクロア
等の「人間の補足タンパク質分解酵素Ｃ１ｒの集合および触媒領域の構造：三次
元架橋および類似性モデリング化に基づく三次元モデル」、Biochemistry 1997
May 27;36(21):6270-82。したがって、ドメインレベルで溶解可能な構造を有す
る大きなタンパク質、例えばＨＩＶ−１インテグラーゼも、本発明の方法を用い
て分析できる。多くの制約の限界において、タンパク質の構造の計算は、距離ジ
オメトリを使用し、その後の分子力学の精緻化によって直接実行できる。ダイダ
等の「ＨＩＶ−１インテグラーゼの触媒ドメインの結晶構造、他のポリヌクレオ
チジル転移酵素との類似性」Science 1994 Dec 23;266(5193):1981-6。ロディ
等の「ＨＩＶ−１インテグラーゼのＤＮＡ結合ドメインの溶解構造」、Biochemi
stry 1995 Aug 8;34(31):9826-33。カイ等のNat. Struct. Biol. 1997 4,567-77
。ゴールドガ等の「ＨＩＶ−１インテグラーゼの核ドメインの新たな３構造：マ
グネシウムと結合する活性部位」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 Aug 4;95
(16):9150-4。ハブル他「溶液中のタンパク質配座の決定に関する核磁気共鳴お
よび距離ジオメトリの統合使用の評価」、J. Mol. Biol. 1985 Mar 20;182(2):2
81-94。ガンタート等の「冗長二面角制約を有するプログラムＤＩＡＮＡを使用
したＮＭＲデータからのタンパク質構造計算の改善された効率」、J. Biomol. N
MR. 1991 Nov;1(4):447-56。
の認識に限られない。いくつかの制約の限界において、ドメイン対当たり３つま
での制約によって、ドメイン−ドメイン配置が実施できる。ロッシ等の「人間の
補足タンパク質分解酵素Ｃ１ｓの触媒領域の構造：化学架橋および三次元類似性
モデリングによる研究」、Biochemistry 1995 Jun 6;34(22):7311-21。ラクロア
等の「人間の補足タンパク質分解酵素Ｃ１ｒの集合および触媒領域の構造：三次
元架橋および類似性モデリング化に基づく三次元モデル」、Biochemistry 1997
May 27;36(21):6270-82。したがって、ドメインレベルで溶解可能な構造を有す
る大きなタンパク質、例えばＨＩＶ−１インテグラーゼも、本発明の方法を用い
て分析できる。多くの制約の限界において、タンパク質の構造の計算は、距離ジ
オメトリを使用し、その後の分子力学の精緻化によって直接実行できる。ダイダ
等の「ＨＩＶ−１インテグラーゼの触媒ドメインの結晶構造、他のポリヌクレオ
チジル転移酵素との類似性」Science 1994 Dec 23;266(5193):1981-6。ロディ
等の「ＨＩＶ−１インテグラーゼのＤＮＡ結合ドメインの溶解構造」、Biochemi
stry 1995 Aug 8;34(31):9826-33。カイ等のNat. Struct. Biol. 1997 4,567-77
。ゴールドガ等の「ＨＩＶ−１インテグラーゼの核ドメインの新たな３構造：マ
グネシウムと結合する活性部位」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 Aug 4;95
(16):9150-4。ハブル他「溶液中のタンパク質配座の決定に関する核磁気共鳴お
よび距離ジオメトリの統合使用の評価」、J. Mol. Biol. 1985 Mar 20;182(2):2
81-94。ガンタート等の「冗長二面角制約を有するプログラムＤＩＡＮＡを使用
したＮＭＲデータからのタンパク質構造計算の改善された効率」、J. Biomol. N
MR. 1991 Nov;1(4):447-56。
【００３４】
本発明の方法は、特に、この技術分野で利用可能な他のタンパク質構造決定技
術の限界に関して、この方法に大きな有用性を与えるいくつかの利点を有する。
この方法は、第一の信頼できる中分解度（３〜５Å）の構造を生成するので、原
理的に、Ｘ線結晶法およびＮＭＲデータの精緻化の開始点として利用可能であり
、時間および作業をかなり節約できる。本発明の方法は、比較的迅速に利用でき
るため、多数のペプチドを素早く分析するのに特に有効である。実験プロトコル
は完全に自動化が可能であるため、高スループットのアプローチに使用しやすい
。したがって、本発明は、ゲノムおよびタンパク質の研究結果の分析に特に適し
ている。分子内架橋は、非常に低いタンパク質濃度の条件下で高められるため、
わずかな量のタンパク質しか必要としない。本発明の方法は、ＮＭＲまたはＸ線
結晶法などの他の技術に比べ、タンパク質純度はあまり重要でなく、分子の重量
および配列情報に基づいた架橋ペプチドと一致するピークのみが関係する。具体
的には、本発明では、比較的短期間（平均１日ないし最大で数週間の範囲）でタ
ンパク質の立体構造を取得できる。ここで説明する方法は、任意のタンパク質混
合物に適用可能であり、具体的な一例においては、代表的なin vitro His標識
タンパク質表現系の１または２ステップの精製によって予想される中程度の純度
（例えば、約６０％超〜約８０％超の純度）のタンパク質標本に使用できる。
術の限界に関して、この方法に大きな有用性を与えるいくつかの利点を有する。
この方法は、第一の信頼できる中分解度（３〜５Å）の構造を生成するので、原
理的に、Ｘ線結晶法およびＮＭＲデータの精緻化の開始点として利用可能であり
、時間および作業をかなり節約できる。本発明の方法は、比較的迅速に利用でき
るため、多数のペプチドを素早く分析するのに特に有効である。実験プロトコル
は完全に自動化が可能であるため、高スループットのアプローチに使用しやすい
。したがって、本発明は、ゲノムおよびタンパク質の研究結果の分析に特に適し
ている。分子内架橋は、非常に低いタンパク質濃度の条件下で高められるため、
わずかな量のタンパク質しか必要としない。本発明の方法は、ＮＭＲまたはＸ線
結晶法などの他の技術に比べ、タンパク質純度はあまり重要でなく、分子の重量
および配列情報に基づいた架橋ペプチドと一致するピークのみが関係する。具体
的には、本発明では、比較的短期間（平均１日ないし最大で数週間の範囲）でタ
ンパク質の立体構造を取得できる。ここで説明する方法は、任意のタンパク質混
合物に適用可能であり、具体的な一例においては、代表的なin vitro His標識
タンパク質表現系の１または２ステップの精製によって予想される中程度の純度
（例えば、約６０％超〜約８０％超の純度）のタンパク質標本に使用できる。
【００３５】
一態様において、本発明の方法の実施において実行される種々の動作は、計算
処理として行われる。例えば、質量スペクトロメータからの化学データを解釈し
、解釈から三次元構造情報を決定する種々の動作を計算的に実施できる。図２は
、本発明の一実施形態の計算機能２０１の高レベルの概要を示すフローチャート
である。ステップ２０３では、ペプチド断片配列を、タンパク質分解されたタン
パク質で観察された質量スペクトロメトリのピークに割り当て、架橋残基を含む
タンパク質断片を確認することによって距離制約情報を生成する。ステップ２０
５では、スレッディングアプローチによって、候補である二次構造の順位リスト
を生成する。後で詳述するように、スレッディングは、既知の三次元構造を有す
る別のタンパク質のレイアウト後に、問題のタンパク質の一次配列を三次元的に
レイアウトする。ステップ２０７では、（ｉ）残基との疎水性相互作用、または
、（ｉｉ）ステップ２０３の距離制約情報、などの物理的制約基準との適合性に
基づいて、これらの候補構造の再順位付けを行う。ステップ２０９では、類似性
モデリングを、ステップ２０７で決定された上位の１つまたは複数の候補へ割り
当てる。そして、問題のタンパク質の残基と上位の候補の残基とを位置的にマッ
チングさせることによって、構造の更なる精緻化を行う。
処理として行われる。例えば、質量スペクトロメータからの化学データを解釈し
、解釈から三次元構造情報を決定する種々の動作を計算的に実施できる。図２は
、本発明の一実施形態の計算機能２０１の高レベルの概要を示すフローチャート
である。ステップ２０３では、ペプチド断片配列を、タンパク質分解されたタン
パク質で観察された質量スペクトロメトリのピークに割り当て、架橋残基を含む
タンパク質断片を確認することによって距離制約情報を生成する。ステップ２０
５では、スレッディングアプローチによって、候補である二次構造の順位リスト
を生成する。後で詳述するように、スレッディングは、既知の三次元構造を有す
る別のタンパク質のレイアウト後に、問題のタンパク質の一次配列を三次元的に
レイアウトする。ステップ２０７では、（ｉ）残基との疎水性相互作用、または
、（ｉｉ）ステップ２０３の距離制約情報、などの物理的制約基準との適合性に
基づいて、これらの候補構造の再順位付けを行う。ステップ２０９では、類似性
モデリングを、ステップ２０７で決定された上位の１つまたは複数の候補へ割り
当てる。そして、問題のタンパク質の残基と上位の候補の残基とを位置的にマッ
チングさせることによって、構造の更なる精緻化を行う。
【００３６】
図３は、タンパク質、特に酵素、またはこのようなタンパク質と結合する高分
子の特定、設計、および／または、分析を行うために、比較的大きなゲノムまた
はタンパク質の調査として、本発明を使用する方法を示す。三次元タンパク質構
造は、種々の形態で生成される。図３の右側の二経路は、ゲノムデータから、タ
ンパク質を分析し、タンパク質の構造を生成する従来の技術を表す。研究者は、
通常、遺伝子／ポリヌクレオチド配列を確認または設計することから始める。３
０１を参照されたい。完全なin silico処理の一部として（最も右の経路）、一
次ヌクレオチド／アミノ酸配列から仮想タンパク質が生成される。３０３を参照
されたい。次に、得られたタンパク質の３Ｄ構造を予測するために、広く知られ
た種々の処理が実行される。３０５を参照されたい。こうした処理は、タンパク
質の一次配列のみにより、完全なin silico開始点から実行可能であり、実験デ
ータを補足する必要はない。この時点で、完全なin silico技術は、タンパク質
の二次構造の予測に関してうまく機能するが、二次構造を超える高分解度の特徴
の予測に関しては不適切である。いずれにしても、タンパク質の予測三次元構造
は、対象の配位子との仮想結合等の仮想実験の実行に、使用される場合がある。
３０７を参照されたい。こうした結合は、タンパク質の構造が正確な場合に有効
である。同様の結合実験は、フローチャートの他の２経路から導かれた構造を用
いて実施可能である。
子の特定、設計、および／または、分析を行うために、比較的大きなゲノムまた
はタンパク質の調査として、本発明を使用する方法を示す。三次元タンパク質構
造は、種々の形態で生成される。図３の右側の二経路は、ゲノムデータから、タ
ンパク質を分析し、タンパク質の構造を生成する従来の技術を表す。研究者は、
通常、遺伝子／ポリヌクレオチド配列を確認または設計することから始める。３
０１を参照されたい。完全なin silico処理の一部として（最も右の経路）、一
次ヌクレオチド／アミノ酸配列から仮想タンパク質が生成される。３０３を参照
されたい。次に、得られたタンパク質の３Ｄ構造を予測するために、広く知られ
た種々の処理が実行される。３０５を参照されたい。こうした処理は、タンパク
質の一次配列のみにより、完全なin silico開始点から実行可能であり、実験デ
ータを補足する必要はない。この時点で、完全なin silico技術は、タンパク質
の二次構造の予測に関してうまく機能するが、二次構造を超える高分解度の特徴
の予測に関しては不適切である。いずれにしても、タンパク質の予測三次元構造
は、対象の配位子との仮想結合等の仮想実験の実行に、使用される場合がある。
３０７を参照されたい。こうした結合は、タンパク質の構造が正確な場合に有効
である。同様の結合実験は、フローチャートの他の２経路から導かれた構造を用
いて実施可能である。
【００３７】
手元にある与えられた遺伝子またはヌクレオチド配列を用いて、当然、実際の
タンパク質を作ることができる。前述のように、Ｘ線結晶法またはＮＭＲを実際
のタンパク質（３１１）に対して実行し、その３Ｄ構造を予測することができる
。３１３を参照されたい。残念ながら、これらの方法は周知の難点と制限とを有
している。これらの方法は、極めて時間がかかる。Ｘ線結晶法は、問題のタンパ
ク質の標本の結晶化を必要とするが、多くのタンパク質は結晶化しない。結晶化
するタンパク質のうちの一部は、結晶化した時に本来の立体配座を示さない。Ｎ
ＭＲは、通常、極度に濃縮された塩溶液内にタンパク質が懸濁または溶解するこ
とを必要とする。こうした条件は、タンパク質の本来の立体配座を混乱させる場
合が多い。本発明は、架橋残基の形態での非常に限られた実験情報を使用するこ
とにより、タンパク質の実際の３Ｄ構造の非常に優れた予測（２〜５Å ＲＭＳ
以内）をすることを可能となる。本発明を達成するためには、非常に少数の架橋
、通常、アミノ酸残基の数の約１０％で十分であることが分かっている。３１５
を参照されたい。この制約情報を使用し、タンパク質の一般的な構造特性（３１
７）が決定される。これは、完全なin silicoまたはＮＭＲやＸ線結晶法の実験
によって決定された３Ｄ構造の検証または改善に使用される。
タンパク質を作ることができる。前述のように、Ｘ線結晶法またはＮＭＲを実際
のタンパク質（３１１）に対して実行し、その３Ｄ構造を予測することができる
。３１３を参照されたい。残念ながら、これらの方法は周知の難点と制限とを有
している。これらの方法は、極めて時間がかかる。Ｘ線結晶法は、問題のタンパ
ク質の標本の結晶化を必要とするが、多くのタンパク質は結晶化しない。結晶化
するタンパク質のうちの一部は、結晶化した時に本来の立体配座を示さない。Ｎ
ＭＲは、通常、極度に濃縮された塩溶液内にタンパク質が懸濁または溶解するこ
とを必要とする。こうした条件は、タンパク質の本来の立体配座を混乱させる場
合が多い。本発明は、架橋残基の形態での非常に限られた実験情報を使用するこ
とにより、タンパク質の実際の３Ｄ構造の非常に優れた予測（２〜５Å ＲＭＳ
以内）をすることを可能となる。本発明を達成するためには、非常に少数の架橋
、通常、アミノ酸残基の数の約１０％で十分であることが分かっている。３１５
を参照されたい。この制約情報を使用し、タンパク質の一般的な構造特性（３１
７）が決定される。これは、完全なin silicoまたはＮＭＲやＸ線結晶法の実験
によって決定された３Ｄ構造の検証または改善に使用される。
【００３８】
物理的な距離制約の決定：
タンパク質の残基間の物理的な距離制約の決定には、蛍光共鳴エネルギ転移や
スピン標識手法などの多くの手法を利用できる。好適な実施形態において、距離
制約は、タンパク質を架橋し、その後、リンクした断片を確認するために質量ス
ペクトロメトリを用いることで決定される。図４は、そのような架橋タンパク質
の図である。架橋領域は単純なアルキル鎖にすることができ、架橋薬の長さは、
エチレン基を変えること等によって、変化させることができる。架橋薬領域は、
短くても、長くてもよく、より正確な近接性を定めても（例えば、試薬と強固な
架橋薬領域との結合）、結合近接性の外側の境界を定めてもよい（例えば、試薬
と柔軟な架橋薬領域との結合）。この架橋薬は、他の特性を変えるために化学的
に修正可能であり、例えば、架橋薬の親和性を強めるためにヒドロキシル基を加
えたり、架橋薬を強固にするために芳香基を加えたりすることができる。本発明
の方法においては、二官能性および三官能性化学架橋薬などの多くの異なるリン
カーを使用することができる。任意の架橋薬に関して、潜在反応部位の少なくと
も１つ、好ましくは両方は、知られている。反応基は、その反応性に対して直交
または非直交であるとみなすことができる。
スピン標識手法などの多くの手法を利用できる。好適な実施形態において、距離
制約は、タンパク質を架橋し、その後、リンクした断片を確認するために質量ス
ペクトロメトリを用いることで決定される。図４は、そのような架橋タンパク質
の図である。架橋領域は単純なアルキル鎖にすることができ、架橋薬の長さは、
エチレン基を変えること等によって、変化させることができる。架橋薬領域は、
短くても、長くてもよく、より正確な近接性を定めても（例えば、試薬と強固な
架橋薬領域との結合）、結合近接性の外側の境界を定めてもよい（例えば、試薬
と柔軟な架橋薬領域との結合）。この架橋薬は、他の特性を変えるために化学的
に修正可能であり、例えば、架橋薬の親和性を強めるためにヒドロキシル基を加
えたり、架橋薬を強固にするために芳香基を加えたりすることができる。本発明
の方法においては、二官能性および三官能性化学架橋薬などの多くの異なるリン
カーを使用することができる。任意の架橋薬に関して、潜在反応部位の少なくと
も１つ、好ましくは両方は、知られている。反応基は、その反応性に対して直交
または非直交であるとみなすことができる。
【００３９】
架橋実験から抽出できる距離制約情報を最大にするために、異なる長さのスペ
ーサアームおよび柔軟性を有する架橋試薬のライブラリによって、多くの多様な
一連のアミノ酸機能をターゲットにできる。より強固または短いスペーサは、架
橋残基間の可能性のある距離の範囲を狭めるので、フォールディングの認識にお
いて多くの判別が提供される。さらに、架橋薬のライブラリを用いて実行される
実験は、制約の全体的な精度を改善するために使用される。立体配座分析に多く
の距離制約を提供することによって、実験的に導かれる制約の数および精度によ
って、回答が得られる構造の問題のタイプが定義される。使用する架橋試薬は、
タンパク質およびペプチド化学分野の当業者に知られる種々の要素を用いて、選
ぶことが可能である。これには、タンパク質で予測される構造モチーフが含まれ
、例えば、タンパク質の一次配列から予測されるモチーフ等が含まれる。特定の
ドメインおよび／またはフォールディングを確認するための多数のタンパク質の
スクリーニング等で、タンパク質の特定の構造態様を確認する場合、架橋試薬は
、特定のドメインおよび／またはフォールディングを確認するための有効性に基
づいて選択される。
ーサアームおよび柔軟性を有する架橋試薬のライブラリによって、多くの多様な
一連のアミノ酸機能をターゲットにできる。より強固または短いスペーサは、架
橋残基間の可能性のある距離の範囲を狭めるので、フォールディングの認識にお
いて多くの判別が提供される。さらに、架橋薬のライブラリを用いて実行される
実験は、制約の全体的な精度を改善するために使用される。立体配座分析に多く
の距離制約を提供することによって、実験的に導かれる制約の数および精度によ
って、回答が得られる構造の問題のタイプが定義される。使用する架橋試薬は、
タンパク質およびペプチド化学分野の当業者に知られる種々の要素を用いて、選
ぶことが可能である。これには、タンパク質で予測される構造モチーフが含まれ
、例えば、タンパク質の一次配列から予測されるモチーフ等が含まれる。特定の
ドメインおよび／またはフォールディングを確認するための多数のタンパク質の
スクリーニング等で、タンパク質の特定の構造態様を確認する場合、架橋試薬は
、特定のドメインおよび／またはフォールディングを確認するための有効性に基
づいて選択される。
【００４０】
本開示を読む当業者にとって明らかなように、長さ、強固さ、特異性等の異な
る種々の架橋薬を利用できる。例えば、異なる長さおよび／または特異性の一連
のホモ二官能性試薬が、特定のタンパク質の研究に適した適切な長さおよび／ま
たは化学的成分を有する架橋薬を提供するために、生成される。例えば、アミン
特異性を有する長さの異なる一連のホモ二官能性試薬を使用して、特定のタンパ
ク質の研究を実行できる。例えば、２または４メチレンの長さを有する架橋薬な
どの６メチレンを有する架橋薬ＢＳ３（ビス［スルフォスクシニミジル］スベリ
ン酸塩）と相同な架橋薬を生成することにより、長さの異なる一連のアミン特異
性架橋薬を提供できる。種々の架橋薬を使用して取られたデータを組み合わせる
ことによって、より詳細なタンパク質の空間制約の分析を提供できる。
る種々の架橋薬を利用できる。例えば、異なる長さおよび／または特異性の一連
のホモ二官能性試薬が、特定のタンパク質の研究に適した適切な長さおよび／ま
たは化学的成分を有する架橋薬を提供するために、生成される。例えば、アミン
特異性を有する長さの異なる一連のホモ二官能性試薬を使用して、特定のタンパ
ク質の研究を実行できる。例えば、２または４メチレンの長さを有する架橋薬な
どの６メチレンを有する架橋薬ＢＳ３（ビス［スルフォスクシニミジル］スベリ
ン酸塩）と相同な架橋薬を生成することにより、長さの異なる一連のアミン特異
性架橋薬を提供できる。種々の架橋薬を使用して取られたデータを組み合わせる
ことによって、より詳細なタンパク質の空間制約の分析を提供できる。
【００４１】
本発明の方法で使用する架橋試薬は、例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３
−ジメチルアミノプロピル］−カルビジイミドヒドロクロリド）、ロマントの試
薬として知られるＤＳＰ（ジチオビス［スクシニミジルプロピオン酸塩］）、Ｂ
Ｓ３（ビス［スルフォスクシニミジル］スベリン酸塩）、およびＤＳＳ（ジスク
シニミジルスベリン酸塩）である。ＤＳＰおよびＤＳＳは共にホモ二官能性、ア
ミン反応性試薬であり、ＤＳＰのジスルフィド結合は分割可能であるが、ＤＳＳ
のそれは非分割性であるという点のみ異なっている。ＢＳ３は、膜不浸透性であ
るＤＳＳの水溶性の類似体である。ＥＤＣは用途が多く、水溶性で、カルボキシ
ル基（ターゲットタンパク質に存在するＡｓｐまたはＧｌｕ、若しくは架橋薬の
カルボキシル基）を活性エステルに転換する能力を有しており、アミン含有分子
（タンパク質または架橋薬）の求核攻撃により安定したアミド架橋を形成するこ
とを可能にする。
−ジメチルアミノプロピル］−カルビジイミドヒドロクロリド）、ロマントの試
薬として知られるＤＳＰ（ジチオビス［スクシニミジルプロピオン酸塩］）、Ｂ
Ｓ３（ビス［スルフォスクシニミジル］スベリン酸塩）、およびＤＳＳ（ジスク
シニミジルスベリン酸塩）である。ＤＳＰおよびＤＳＳは共にホモ二官能性、ア
ミン反応性試薬であり、ＤＳＰのジスルフィド結合は分割可能であるが、ＤＳＳ
のそれは非分割性であるという点のみ異なっている。ＢＳ３は、膜不浸透性であ
るＤＳＳの水溶性の類似体である。ＥＤＣは用途が多く、水溶性で、カルボキシ
ル基（ターゲットタンパク質に存在するＡｓｐまたはＧｌｕ、若しくは架橋薬の
カルボキシル基）を活性エステルに転換する能力を有しており、アミン含有分子
（タンパク質または架橋薬）の求核攻撃により安定したアミド架橋を形成するこ
とを可能にする。
【００４２】
タンパク質内の架橋を生成するために、タンパク質溶液に選択された架橋薬を
加え、架橋を可能にするのに有効な条件下で反応させる。この条件、例えば、緩
衝液、タンパク質と架橋薬との相対的な濃度、ｐＨ、温度、時間などは、当業者
が予測できるように、ターゲットの官能アミノ酸基の共有結合を形成するのに適
すように選択される。ホモ二官能性架橋薬（またはホモ三官能性架橋薬、Ｘ−ｚ
−Ｙ）の場合、両方の基が反応可能であり、架橋薬のいくらかのパーセンテージ
が、同じタンパク質の空間的に離れた２つのアミノ酸の間で架橋を形成し（分子
内架橋）、または、２つの分離したタンパク質分子の間で架橋を形成する（分子
間架橋）。ヘテロ二官能性架橋薬の場合は、第二の一連の条件が、その後、直交
基によって利用され、ターゲット部位と反応する。これは、例えば、アリールア
ジド等の光活性化基の場合は光の変化であり、スルフヒドリル選択基の場合はｐ
Ｈの変化である。
加え、架橋を可能にするのに有効な条件下で反応させる。この条件、例えば、緩
衝液、タンパク質と架橋薬との相対的な濃度、ｐＨ、温度、時間などは、当業者
が予測できるように、ターゲットの官能アミノ酸基の共有結合を形成するのに適
すように選択される。ホモ二官能性架橋薬（またはホモ三官能性架橋薬、Ｘ−ｚ
−Ｙ）の場合、両方の基が反応可能であり、架橋薬のいくらかのパーセンテージ
が、同じタンパク質の空間的に離れた２つのアミノ酸の間で架橋を形成し（分子
内架橋）、または、２つの分離したタンパク質分子の間で架橋を形成する（分子
間架橋）。ヘテロ二官能性架橋薬の場合は、第二の一連の条件が、その後、直交
基によって利用され、ターゲット部位と反応する。これは、例えば、アリールア
ジド等の光活性化基の場合は光の変化であり、スルフヒドリル選択基の場合はｐ
Ｈの変化である。
【００４３】
例えば、ＢＳ３およびＤＳＴは、次の一般的な反応条件でＦＧＦ−２とよく反
応する。２５℃、２時間、１００ｍＭヘペス緩衝液内で架橋薬とタンパク質の分
子比率が２０：１である５μＭのタンパク質、ｐＨ７．５。ＨＩＶ−１インテグ
ラーゼとの架橋反応は、特定の温度では不適切であり、全体の反応時間を増加さ
せるとともに、反応温度を下げることで達成される（０℃、４０時間）。スルフ
ォ−ＥＭＣＳ（Ｎ−［ε−マレイミドカプロロキシ］スルフォスクシニミジルエ
ステル）や、スルフォ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［γ−マレイミドブチリロキシ］スルフ
ォ−スクシニミドエステル）等のＬｙｓ−Ｃｙｓヘテロ二官能性架橋薬は、ＮＨ
Ｓ−エステルを介してＬｙｓと反応し、マレイミド官能基を介してＣｙｓと反応
する。マレイミド基は、ｐＨが６．５〜７．５のとき、スルフヒドリルに関する
選択性が最も大きくなり、このｐＨを超えると、一次アミンとの反応がより大き
くなる。この反応は、ｐＨ７．０では、ＮＨＳ−エステルとマレイミド基とが同
時に反応するため１ステップで実行される。あるいは、２ステップに分けて実行
することもでき、ｐＨ６．５の第１のステップではマレイミド基が反応し、ｐＨ
７．５の第２のステップではＮＨＳ−エステルが反応する。
応する。２５℃、２時間、１００ｍＭヘペス緩衝液内で架橋薬とタンパク質の分
子比率が２０：１である５μＭのタンパク質、ｐＨ７．５。ＨＩＶ−１インテグ
ラーゼとの架橋反応は、特定の温度では不適切であり、全体の反応時間を増加さ
せるとともに、反応温度を下げることで達成される（０℃、４０時間）。スルフ
ォ−ＥＭＣＳ（Ｎ−［ε−マレイミドカプロロキシ］スルフォスクシニミジルエ
ステル）や、スルフォ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［γ−マレイミドブチリロキシ］スルフ
ォ−スクシニミドエステル）等のＬｙｓ−Ｃｙｓヘテロ二官能性架橋薬は、ＮＨ
Ｓ−エステルを介してＬｙｓと反応し、マレイミド官能基を介してＣｙｓと反応
する。マレイミド基は、ｐＨが６．５〜７．５のとき、スルフヒドリルに関する
選択性が最も大きくなり、このｐＨを超えると、一次アミンとの反応がより大き
くなる。この反応は、ｐＨ７．０では、ＮＨＳ−エステルとマレイミド基とが同
時に反応するため１ステップで実行される。あるいは、２ステップに分けて実行
することもでき、ｐＨ６．５の第１のステップではマレイミド基が反応し、ｐＨ
７．５の第２のステップではＮＨＳ−エステルが反応する。
【００４４】
いずれの場合においても、得られる生成物は、以下の結果を含むタンパク質の
混合物を含む。１）一方の端部のみでタンパク質と共有して付着する架橋薬（ゆ
きどまり架橋の場合、距離に関する有効な情報はほとんどない）、２）単一のタ
ンパク質に付着する空間的に離れた２つの部位を含む架橋（２つの共有するリン
ク部位を有するタンパク質単量体、望ましい結果）、および／または３）別の２
つのタンパク質分子をつなぐ架橋薬（タンパク質間架橋、タンパク質−タンパク
質の相互作用を調査する場合を除き、一般には望まれない）。図５を参照。
混合物を含む。１）一方の端部のみでタンパク質と共有して付着する架橋薬（ゆ
きどまり架橋の場合、距離に関する有効な情報はほとんどない）、２）単一のタ
ンパク質に付着する空間的に離れた２つの部位を含む架橋（２つの共有するリン
ク部位を有するタンパク質単量体、望ましい結果）、および／または３）別の２
つのタンパク質分子をつなぐ架橋薬（タンパク質間架橋、タンパク質−タンパク
質の相互作用を調査する場合を除き、一般には望まれない）。図５を参照。
【００４５】
図６は、距離制約情報を生成する１つの適切な計算処理を示す。６０１を参照
されたい。この処理は６０３で開始される。計算システムは、タンパク質に使用
された特定の（複数の）架橋薬および（複数の）タンパク質分解酵素が与えられ
た場合に、予期される多くの断片を生成する。このリストを生成するために、シ
ステムは、通常、一次配列，タンパク質分解酵素の確認，架橋試薬の確認などの
入力を少なくとも必要とする。例えば、リシンおよびアルギニンをＣ末端で分割
するトリプシンによってタンパク質が処理される場合、こうした分割生成物の一
次配列から生成されるすべてのタンパク質断片が考慮される。また、タンパク質
断片の一部は、付着する架橋試薬を有するため、こうした修飾断片もリストにさ
れる。例えば、架橋薬ＢＳ３（リシンと結合する）が使用される場合、リシン残
基を有する追加の潜在的な断片の一部および結合するＢＳ３が、加えられた架橋
薬の質量と共にリストにされる。好適な実施形態において、予期される断片のリ
ストは、１以上の架橋試薬によってリンクされる２以上のペプチドバックボーン
を含む多くまたは任意の断片を含まない。こうした化学種については、その後の
処理において説明される。この実施形態において、架橋薬を含む断片を考慮する
とき、結合した架橋薬は１つの自由な（結合していない）末端部を有する。こう
した架橋試薬を含むペプチド断片を考慮するとき、試薬の末端部の化学的状態に
応じて、種々の亜種が存在する可能性がある。例えば、同じタンパク質断片が、
次のような分子重量の変化を伴って、リストにされる場合がある。完全なリンカ
ーが付着した断片（リンカー＋脱離基）および加水分解リンカーアームが付着し
た断片（通常、加水分解される）。特定の断片が２以上のリシン基を有する場合
には、例えば、リシン残基間の断片内架橋の可能性もリストにされる。
されたい。この処理は６０３で開始される。計算システムは、タンパク質に使用
された特定の（複数の）架橋薬および（複数の）タンパク質分解酵素が与えられ
た場合に、予期される多くの断片を生成する。このリストを生成するために、シ
ステムは、通常、一次配列，タンパク質分解酵素の確認，架橋試薬の確認などの
入力を少なくとも必要とする。例えば、リシンおよびアルギニンをＣ末端で分割
するトリプシンによってタンパク質が処理される場合、こうした分割生成物の一
次配列から生成されるすべてのタンパク質断片が考慮される。また、タンパク質
断片の一部は、付着する架橋試薬を有するため、こうした修飾断片もリストにさ
れる。例えば、架橋薬ＢＳ３（リシンと結合する）が使用される場合、リシン残
基を有する追加の潜在的な断片の一部および結合するＢＳ３が、加えられた架橋
薬の質量と共にリストにされる。好適な実施形態において、予期される断片のリ
ストは、１以上の架橋試薬によってリンクされる２以上のペプチドバックボーン
を含む多くまたは任意の断片を含まない。こうした化学種については、その後の
処理において説明される。この実施形態において、架橋薬を含む断片を考慮する
とき、結合した架橋薬は１つの自由な（結合していない）末端部を有する。こう
した架橋試薬を含むペプチド断片を考慮するとき、試薬の末端部の化学的状態に
応じて、種々の亜種が存在する可能性がある。例えば、同じタンパク質断片が、
次のような分子重量の変化を伴って、リストにされる場合がある。完全なリンカ
ーが付着した断片（リンカー＋脱離基）および加水分解リンカーアームが付着し
た断片（通常、加水分解される）。特定の断片が２以上のリシン基を有する場合
には、例えば、リシン残基間の断片内架橋の可能性もリストにされる。
【００４６】
６０３では、システムは、リスト内の生成された断片のそれぞれの質量を計算
する。これにより、断片を質量スペクトロメータからの情報と相関させることが
可能になる。すべての断片が生成されると、これらは、分子重量範囲に格納され
ることによって整理される。６０４を参照されたい。図７の７０１は、いくつか
の個別のビンを含む、計算済みタンパク質断片の格納リストを表している。例に
ついては、７０２を参照されたい。ビン内の個々の質量種は、リンクしたリスト
として表現される。７０３を参照されたい。次に、実際にタンパク質分解された
タンパク質から得られる質量スペクトロメトリデータを、予期される化学種の格
納された集合と整合させる。
する。これにより、断片を質量スペクトロメータからの情報と相関させることが
可能になる。すべての断片が生成されると、これらは、分子重量範囲に格納され
ることによって整理される。６０４を参照されたい。図７の７０１は、いくつか
の個別のビンを含む、計算済みタンパク質断片の格納リストを表している。例に
ついては、７０２を参照されたい。ビン内の個々の質量種は、リンクしたリスト
として表現される。７０３を参照されたい。次に、実際にタンパク質分解された
タンパク質から得られる質量スペクトロメトリデータを、予期される化学種の格
納された集合と整合させる。
【００４７】
説明したように、断片のリストおよび関連する質量が生成および格納された後
、実際の質量スペクトロメトリデータが分析される。システムは、タンパク質分
解されたタンパク質の分析から得られた各ＭＳピークを考慮することが好ましい
。処理６０１において、これは動作６０５および６０６として表される。ここで
は、システムは、考慮されるピーク数に等しい変数Ｎを設定し（６０５）、これ
らの種々のピークで反復適用する（６０６）。反復ループ動作６０６では、まず
、指標値「ｉ」が１に設定される。その後、現在値ｉがＮの値より大きいか否か
を決定する。大きくない場合は、ピークを作り出した化学種の化学的構造を特定
する種々の動作を実行する。
、実際の質量スペクトロメトリデータが分析される。システムは、タンパク質分
解されたタンパク質の分析から得られた各ＭＳピークを考慮することが好ましい
。処理６０１において、これは動作６０５および６０６として表される。ここで
は、システムは、考慮されるピーク数に等しい変数Ｎを設定し（６０５）、これ
らの種々のピークで反復適用する（６０６）。反復ループ動作６０６では、まず
、指標値「ｉ」が１に設定される。その後、現在値ｉがＮの値より大きいか否か
を決定する。大きくない場合は、ピークを作り出した化学種の化学的構造を特定
する種々の動作を実行する。
【００４８】
好適な実施形態においては、１つまたは複数の制御スペクトルが、図６の処理
が実行される前に、ＭＳデータから減じられる。リンクした残基を有するタンパ
ク質断片のみ（リンクしているものが他の端部で全く付着していない場合を含む
）が、一般に対象となるので、このように架橋薬を有する残基に対応するＭＳデ
ータを減じるのは有効である。好適な実施形態において、質量種のリストは、既
存のペプチドのライブラリを用いて部分的に構築可能であるため、リストの作成
作業が簡略化される。
が実行される前に、ＭＳデータから減じられる。リンクした残基を有するタンパ
ク質断片のみ（リンクしているものが他の端部で全く付着していない場合を含む
）が、一般に対象となるので、このように架橋薬を有する残基に対応するＭＳデ
ータを減じるのは有効である。好適な実施形態において、質量種のリストは、既
存のペプチドのライブラリを用いて部分的に構築可能であるため、リストの作成
作業が簡略化される。
【００４９】
そして、システムが第１のＭＳピークを考慮すると仮定する場合には、観察さ
れたそのピークの質量が切り捨てられ、対応するビンと整合させる。６０７を参
照されたい。その後、システムはビン内の質量種のリストを調べ、それぞれの百
万分率（ＰＰＭ）のエラーを計算する。６０９を参照されたい。プログラムは、
次に、計算された質量種の許容ＰＰＭ範囲に入る、すべての断片を出力する。６
１１を参照されたい。なお、システムへの１つの入力データは、ユーザ調整可能
なＰＰＭエラーウィンドウであってもよい。
れたそのピークの質量が切り捨てられ、対応するビンと整合させる。６０７を参
照されたい。その後、システムはビン内の質量種のリストを調べ、それぞれの百
万分率（ＰＰＭ）のエラーを計算する。６０９を参照されたい。プログラムは、
次に、計算された質量種の許容ＰＰＭ範囲に入る、すべての断片を出力する。６
１１を参照されたい。なお、システムへの１つの入力データは、ユーザ調整可能
なＰＰＭエラーウィンドウであってもよい。
【００５０】
この処理は、断片対断片の架橋に対応する質量種をまだ明らかにしていない。
この実施形態においては、プログラムは、このようなすべての組み合わせを格納
していないが、これに代えて、個々のタンパク質断片のリストを検索し、互いに
リンクする２つの断片が観察されたＭＳピークと整合するか否かを決定する。６
１３を参照されたい。この処理は、詳しくは次のとおりである。この処理では、
ステップ６０５および６０６のような反復適用処理において、各ＭＳピークの組
み合わせを検索する。この組み合わせにはリンカーが存在すると仮定できるため
、この処理ではＭＳピークの重量を調べ、リンカーの重量を減じる。次に、占有
の度合いが最も低い分子重量ビンに進む。ビン内の各断片に関して、断片のパー
トナーが存在する場合、どちらが断片と架橋することが可能か、および、どちら
が質量を持つか、を決定するためのチェックが行われ、第１の断片の質量が加え
られるときに、補正したＭＳピークが計算される。これは、現在のビンおよびそ
の後のビン内のすべての断片について反復され、組み合わせ検索において、すべ
てのビンが明らかになるまで継続される。ＰＰＭエラーウィンドウを満たすペプ
チド間架橋種は、６１５において出力される。特定の実施形態において、このプ
ログラムは、非常に希にしか生成されない３以上の架橋断片の組み合わせを検索
しない。
この実施形態においては、プログラムは、このようなすべての組み合わせを格納
していないが、これに代えて、個々のタンパク質断片のリストを検索し、互いに
リンクする２つの断片が観察されたＭＳピークと整合するか否かを決定する。６
１３を参照されたい。この処理は、詳しくは次のとおりである。この処理では、
ステップ６０５および６０６のような反復適用処理において、各ＭＳピークの組
み合わせを検索する。この組み合わせにはリンカーが存在すると仮定できるため
、この処理ではＭＳピークの重量を調べ、リンカーの重量を減じる。次に、占有
の度合いが最も低い分子重量ビンに進む。ビン内の各断片に関して、断片のパー
トナーが存在する場合、どちらが断片と架橋することが可能か、および、どちら
が質量を持つか、を決定するためのチェックが行われ、第１の断片の質量が加え
られるときに、補正したＭＳピークが計算される。これは、現在のビンおよびそ
の後のビン内のすべての断片について反復され、組み合わせ検索において、すべ
てのビンが明らかになるまで継続される。ＰＰＭエラーウィンドウを満たすペプ
チド間架橋種は、６１５において出力される。特定の実施形態において、このプ
ログラムは、非常に希にしか生成されない３以上の架橋断片の組み合わせを検索
しない。
【００５１】
６１１および／または６１５において、手元のピークが分析され、関連する一
致が出力された後、処理制御は反復ループ動作６０６に戻り、ここでは値ｉを１
増加させる。このシステムは、再び現在値ｉが値Ｎを超えるか否かを決定する。
考慮すべきピークがより多く存在すると仮定する場合、次のピーク（ｉ）が選択
され、処理制御は動作６０７，６０９，６１１，６１３，６１５に戻り、前述の
処理が実行されるが、参照するのは新しいピーク（ｉ）である。
致が出力された後、処理制御は反復ループ動作６０６に戻り、ここでは値ｉを１
増加させる。このシステムは、再び現在値ｉが値Ｎを超えるか否かを決定する。
考慮すべきピークがより多く存在すると仮定する場合、次のピーク（ｉ）が選択
され、処理制御は動作６０７，６０９，６１１，６１３，６１５に戻り、前述の
処理が実行されるが、参照するのは新しいピーク（ｉ）である。
【００５２】
すべてのＭＳピークを考慮した後（ｉがＮよりも大きくなった時点）、動作６
０６の回答は否定となる。この時点で、処理制御は６１７に分岐し、システムは
最終結果を出力する。代表的な読み取り可能な出力形式では、リストは、図８に
示すように、ＭＳピークの質量と、それが対応するタンパク質の断片または断片
の組み合わせと、一連のＭＳスキャンにおいて観察されたピークの回数と、ＰＰ
Ｍエラーと、架橋付着の位置と、を含む。質量の冗長性、つまり質量種より多く
対応することが観察されたＭＳピークは、特に許容ＰＰＭエラーとして約５が選
択された場合、希に見られる。これらは、コンピュータプログラムが最終結果を
出力した後で解決できる。この結果は、候補構造の再ランク付けのための距離制
約情報として使用される（図２の動作２０７および図１３を参照）。このソフト
ウェアは、ＢＳ３に加え、他の架橋薬に適応するように書かれており、本発明の
ソフトウェアは、他のタンパク質分解および架橋試薬でも利用できる。１以上の
架橋薬またはタンパク質分解酵素が使用され、それぞれ異なる架橋薬およびタン
パク質分解酵素による複数の分解が実施される実施形態を扱うために拡張するこ
とができる。
０６の回答は否定となる。この時点で、処理制御は６１７に分岐し、システムは
最終結果を出力する。代表的な読み取り可能な出力形式では、リストは、図８に
示すように、ＭＳピークの質量と、それが対応するタンパク質の断片または断片
の組み合わせと、一連のＭＳスキャンにおいて観察されたピークの回数と、ＰＰ
Ｍエラーと、架橋付着の位置と、を含む。質量の冗長性、つまり質量種より多く
対応することが観察されたＭＳピークは、特に許容ＰＰＭエラーとして約５が選
択された場合、希に見られる。これらは、コンピュータプログラムが最終結果を
出力した後で解決できる。この結果は、候補構造の再ランク付けのための距離制
約情報として使用される（図２の動作２０７および図１３を参照）。このソフト
ウェアは、ＢＳ３に加え、他の架橋薬に適応するように書かれており、本発明の
ソフトウェアは、他のタンパク質分解および架橋試薬でも利用できる。１以上の
架橋薬またはタンパク質分解酵素が使用され、それぞれ異なる架橋薬およびタン
パク質分解酵素による複数の分解が実施される実施形態を扱うために拡張するこ
とができる。
【００５３】
この質量スペクトロメータおよび計算システムの装置の概要は、図９の９０１
に示している。架橋分子断片は、質量スペクトロメータ９０３への入力であり、
この実施形態ではタンパク質断片である。この質量スペクトロメータは各断片に
関するＭ／Ｚ（質量対電荷）を出力し、これは分子の一次配列と共に計算システ
ム９０５に供給される。この計算システムは、その後、分子の３Ｄ構造の詳細を
出力する。
に示している。架橋分子断片は、質量スペクトロメータ９０３への入力であり、
この実施形態ではタンパク質断片である。この質量スペクトロメータは各断片に
関するＭ／Ｚ（質量対電荷）を出力し、これは分子の一次配列と共に計算システ
ム９０５に供給される。この計算システムは、その後、分子の３Ｄ構造の詳細を
出力する。
【００５４】
二部位分子内架橋の濃縮：
タンパク質の架橋に続いて、オプションとして、分子内架橋を有するタンパク
質に関する反応生成物の濃縮が行われ、単一部位および／または分子間架橋を有
するタンパク質を最小化、および好ましくは排除する。例えば、分子間架橋は、
サイズ排除クロマトグラフィを用いて確認される。本開示を読む当業者にとって
明らかであるように、他の方法を利用することも可能である。あるいは、架橋反
応後の濃縮が不要な、十分に低い単一部位および／または分子間架橋の度合いを
有する反応生成物を提供する（複数の）架橋反応の反応条件を選択するようにし
てもよい。反応が完了し、所望の反応生成物の濃縮が実行された後、タンパク質
生成物の最初の質量スペクトル分析をオプションとして実行し、全体的な反応化
学量論を決定する。架橋修飾の予想質量は既知であるため、未修飾タンパク質（
Ｍ）から修飾タンパク質（Ｍ’）への質量の推移は、架橋修飾の平均数を与える
。架橋薬およびタンパク質の絶対および相対濃度は、実験設計の重要なパラメー
タである。理想的には、架橋薬によって、タンパク質の共有修飾の平均総数を、
タンパク質当たり１架橋よりも少なくし（つまり、架橋修飾数／タンパク質＜１
）、誤った距離制約を生成する恐れのあるタンパク質の立体構造の大きな混乱を
避ける。また、架橋反応は、望ましい二部位タンパク質内架橋よりも、多くの単
一部位ゆきどまり修飾を生成する可能性がある。しかし、単純な単一部位修飾が
全体的な構造に与える混乱は、二部位架橋よりも遙かに小さい可能性が高い。
質に関する反応生成物の濃縮が行われ、単一部位および／または分子間架橋を有
するタンパク質を最小化、および好ましくは排除する。例えば、分子間架橋は、
サイズ排除クロマトグラフィを用いて確認される。本開示を読む当業者にとって
明らかであるように、他の方法を利用することも可能である。あるいは、架橋反
応後の濃縮が不要な、十分に低い単一部位および／または分子間架橋の度合いを
有する反応生成物を提供する（複数の）架橋反応の反応条件を選択するようにし
てもよい。反応が完了し、所望の反応生成物の濃縮が実行された後、タンパク質
生成物の最初の質量スペクトル分析をオプションとして実行し、全体的な反応化
学量論を決定する。架橋修飾の予想質量は既知であるため、未修飾タンパク質（
Ｍ）から修飾タンパク質（Ｍ’）への質量の推移は、架橋修飾の平均数を与える
。架橋薬およびタンパク質の絶対および相対濃度は、実験設計の重要なパラメー
タである。理想的には、架橋薬によって、タンパク質の共有修飾の平均総数を、
タンパク質当たり１架橋よりも少なくし（つまり、架橋修飾数／タンパク質＜１
）、誤った距離制約を生成する恐れのあるタンパク質の立体構造の大きな混乱を
避ける。また、架橋反応は、望ましい二部位タンパク質内架橋よりも、多くの単
一部位ゆきどまり修飾を生成する可能性がある。しかし、単純な単一部位修飾が
全体的な構造に与える混乱は、二部位架橋よりも遙かに小さい可能性が高い。
【００５５】
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ特異性架橋薬（例えば、ＢＳ３）の場合には、質量スペクトロ
メータが、これら２つの反応の可能性における質量の違い、例えば、０．１％未
満の分解能を有していれば、２つの結果は区別可能である。タンパク質が２０，
０００の質量を有する場合、水により加水分解された第２の端部を有する単一の
標識部位（Ｌｙｓ標識）の質量は、２０，１５６となる。この質量の移行は、タ
ンパク質において二部位反応（Ｌｙｓ対Ｌｙｓ）が発生した場合の質量、Ｍ＝２
０，１３８よりも、１８Ｄａ大きい。
メータが、これら２つの反応の可能性における質量の違い、例えば、０．１％未
満の分解能を有していれば、２つの結果は区別可能である。タンパク質が２０，
０００の質量を有する場合、水により加水分解された第２の端部を有する単一の
標識部位（Ｌｙｓ標識）の質量は、２０，１５６となる。この質量の移行は、タ
ンパク質において二部位反応（Ｌｙｓ対Ｌｙｓ）が発生した場合の質量、Ｍ＝２
０，１３８よりも、１８Ｄａ大きい。
【００５６】
架橋試薬は潜在的に、二つ（以上）の異なるタンパク質のアミノ酸残基との共
有結合を形成できるため、サイズ排除クロマトグラフィまたはその他の分離手法
を（変性または非変性条件下で）利用して、タンパク質間架橋を有するタンパク
質から内架橋タンパク質を分離できる。例えば、ＢｉｏＲａｄ ＢｉｏＳｅｌｅ
ｃｔＴＭカラムを使用して、架橋二量体を除去できる。ＢｉｏＲａｄ ＢｉｏＳ
ｅｌｅｃｔ１２５−５カラム（各３００×７．８ｍｍ）を使用する非変性条件下
（１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ７．０）では、一般に２つのピークが観察
され、先の溶離ピークはタンパク質二量体を含み、後の溶離ピークは単量体を含
む（図１０）。
有結合を形成できるため、サイズ排除クロマトグラフィまたはその他の分離手法
を（変性または非変性条件下で）利用して、タンパク質間架橋を有するタンパク
質から内架橋タンパク質を分離できる。例えば、ＢｉｏＲａｄ ＢｉｏＳｅｌｅ
ｃｔＴＭカラムを使用して、架橋二量体を除去できる。ＢｉｏＲａｄ ＢｉｏＳ
ｅｌｅｃｔ１２５−５カラム（各３００×７．８ｍｍ）を使用する非変性条件下
（１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ７．０）では、一般に２つのピークが観察
され、先の溶離ピークはタンパク質二量体を含み、後の溶離ピークは単量体を含
む（図１０）。
【００５７】
タンパク質単量体を含む部分は、さらに変性条件下（８Ｍ尿素、１００ｍＭク
エン酸塩緩衝液、ｐＨ５）でＴｏｓｏＨａａｓ Ｇ２０００カラムを使用して、
更に２つの下位構成要素に分離可能であり、先の溶離ピークはゆきどまりまたは
単一標識リンカー（実際の架橋ではなく、表面のみの標識）を有するタンパク質
単量体を主に含み、後の溶離ピークは実際に分子内架橋アミノ酸を有する単量体
を主に含む。
エン酸塩緩衝液、ｐＨ５）でＴｏｓｏＨａａｓ Ｇ２０００カラムを使用して、
更に２つの下位構成要素に分離可能であり、先の溶離ピークはゆきどまりまたは
単一標識リンカー（実際の架橋ではなく、表面のみの標識）を有するタンパク質
単量体を主に含み、後の溶離ピークは実際に分子内架橋アミノ酸を有する単量体
を主に含む。
【００５８】
ゲル電気泳導、濾過、透析等の他のサイズ分離法をこの方法に取り入れること
も可能である。非常に少量のタンパク質が利用可能である場合、単量体からの二
量体の分離は、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって達成できる。その後、個々のタンパク
質ゲルバンドを切離し、タンパク質を電子溶離することができる。
も可能である。非常に少量のタンパク質が利用可能である場合、単量体からの二
量体の分離は、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって達成できる。その後、個々のタンパク
質ゲルバンドを切離し、タンパク質を電子溶離することができる。
【００５９】
断片化およびサイズ分離：
架橋に続いて、対象のタンパク質は、分解によってペプチドに断片化され、ペ
プチド生成物は、例えば逆相クロマトグラフィによって分離される（図１１参照
）。本発明の方法における断片化のためのタンパク質分解酵素は、架橋タンパク
質を小さな扱いやすい部分に分割するのに用いられる活量を有する。これは、分
解中にタンパク質を特定の切断部位で繰り返し正確に分裂させる能力を有する、
当技術分野において既知である任意の酵素または化学活量であってもよい。最適
な活量は広く知られており、最適な活量は従来の操作を使用して選択できる。
プチド生成物は、例えば逆相クロマトグラフィによって分離される（図１１参照
）。本発明の方法における断片化のためのタンパク質分解酵素は、架橋タンパク
質を小さな扱いやすい部分に分割するのに用いられる活量を有する。これは、分
解中にタンパク質を特定の切断部位で繰り返し正確に分裂させる能力を有する、
当技術分野において既知である任意の酵素または化学活量であってもよい。最適
な活量は広く知られており、最適な活量は従来の操作を使用して選択できる。
【００６０】
こうした酵素または化学活量の例は、例示的な例として、リシンのカルボキシ
ル側とアルギニンとのペプチド結合を加水分解する酵素トリプシン、芳香族残基
（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）のカルボキシル側のペ
プチド結合を加水分解する酵素キモトリプシン、メチオニン残基でタンパク質を
化学的に切断する臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｇｌｕのカルボキシル側（重炭素ア
ンモニウム、ｐＨ７．８、または酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ４．０）または
ＧｌｕおよびＡｓｐ（リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．８）の非常に特異的なペプチド
結合を加水分解するエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、およびＡｓｐのアミノ側
およびシステイン酸のペプチド結合を加水分解するエンドプロテイナーゼＡｓｐ
−Ｎを含む。扱いやすいペプチドを取得するために、特異性の低いタンパク質分
解酵素を使用することも可能で、これには、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
Ｔｒｐ、およびＶａｌのような大きい側鎖を有する疎水性アミノ酸のアミノ基を
含むペプチド結合を加水分解するサーモリシン、および芳香族アミノ酸およびそ
の他の疎水性アミノ酸（ＰｈｅおよびＬｅｕ）のカルボキシル基を含むペプチド
結合で選択的にタンパク質を切断するペプシン等が含まれる。酵素トリプシンは
、タンパク質を小さく扱いやすい部分に分割する酵素活量として最適な場合が多
く、これはトリプシンが、低コストと、タンパク質分子のアミノ酸配列において
発生するアミノ酸アルギニンおよびリシンにおける非常に再現性が高く正確な切
断部位とによって特徴付けられるためである。トリプシンを使用して標識タンパ
ク質から最終的なペプチド混合物を生成するのに使用する代表的な反応条件は、
５０ｍＭ ＮＨ４ＮＣＯ３、ｐＨ９、トリプシン対タンパク質の重量比２０：１
、および３７℃での２時間の定温放置である。
ル側とアルギニンとのペプチド結合を加水分解する酵素トリプシン、芳香族残基
（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）のカルボキシル側のペ
プチド結合を加水分解する酵素キモトリプシン、メチオニン残基でタンパク質を
化学的に切断する臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｇｌｕのカルボキシル側（重炭素ア
ンモニウム、ｐＨ７．８、または酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ４．０）または
ＧｌｕおよびＡｓｐ（リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．８）の非常に特異的なペプチド
結合を加水分解するエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、およびＡｓｐのアミノ側
およびシステイン酸のペプチド結合を加水分解するエンドプロテイナーゼＡｓｐ
−Ｎを含む。扱いやすいペプチドを取得するために、特異性の低いタンパク質分
解酵素を使用することも可能で、これには、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、
Ｔｒｐ、およびＶａｌのような大きい側鎖を有する疎水性アミノ酸のアミノ基を
含むペプチド結合を加水分解するサーモリシン、および芳香族アミノ酸およびそ
の他の疎水性アミノ酸（ＰｈｅおよびＬｅｕ）のカルボキシル基を含むペプチド
結合で選択的にタンパク質を切断するペプシン等が含まれる。酵素トリプシンは
、タンパク質を小さく扱いやすい部分に分割する酵素活量として最適な場合が多
く、これはトリプシンが、低コストと、タンパク質分子のアミノ酸配列において
発生するアミノ酸アルギニンおよびリシンにおける非常に再現性が高く正確な切
断部位とによって特徴付けられるためである。トリプシンを使用して標識タンパ
ク質から最終的なペプチド混合物を生成するのに使用する代表的な反応条件は、
５０ｍＭ ＮＨ４ＮＣＯ３、ｐＨ９、トリプシン対タンパク質の重量比２０：１
、および３７℃での２時間の定温放置である。
【００６１】
タンパク質分解酵素と化学試薬との組み合わせを、架橋タンパク質に加えて、
ペプチド混合物を生成することも可能である。以下のＳＤＳ ＰＡＧＥによるサ
イズ分離に続く場合、タンパク質分解酵素によるタンパク質のゲル内分解が使用
され、得られたペプチドは、このゲルスライスから抽出される。得られたペプチ
ド混合物は、未標識および標識ペプチドを含み、標識のある部分は、さらに、分
子間、分子内、または単一標識架橋に分けられる。
ペプチド混合物を生成することも可能である。以下のＳＤＳ ＰＡＧＥによるサ
イズ分離に続く場合、タンパク質分解酵素によるタンパク質のゲル内分解が使用
され、得られたペプチドは、このゲルスライスから抽出される。得られたペプチ
ド混合物は、未標識および標識ペプチドを含み、標識のある部分は、さらに、分
子間、分子内、または単一標識架橋に分けられる。
【００６２】
分解の後、当業者に知られる任意の方法を使用して、断片を分けることができ
る。好ましくは、ペプチドはクロマトグラフィカラムを使用して分けられる。こ
のクロマトグラフィカラムは、適切な溶媒システムと協調し、分解反応後、ペプ
チド分解産物のクロマトグラフィによる分別が可能なクロマトグラフィ媒体を含
む。このクロマトグラフィカラムは、ペプチド分解産物を受け取る入口ポートと
、クロマトグラフィにより分別されたペプチド分解産物を含む流液を送り出す出
口ポートとを含む。
る。好ましくは、ペプチドはクロマトグラフィカラムを使用して分けられる。こ
のクロマトグラフィカラムは、適切な溶媒システムと協調し、分解反応後、ペプ
チド分解産物のクロマトグラフィによる分別が可能なクロマトグラフィ媒体を含
む。このクロマトグラフィカラムは、ペプチド分解産物を受け取る入口ポートと
、クロマトグラフィにより分別されたペプチド分解産物を含む流液を送り出す出
口ポートとを含む。
【００６３】
好適な実施形態において、このクロマトグラフィカラムは、逆相ＨＰＬＣ分析
用カラムである。これは、逆相ＨＰＬＣ手法を使用して、分解産物がクロマトグ
ラフィカラムを通じて溶離した時に、ペプチド分解産物を分別することが可能な
分別媒体を備える。こうした技術を実践するために、クロマトグラフィ媒体は疎
水性であることが好ましい。これは、ペプチド分解産物自体が疎水性の性質を有
する傾向にあるためである。本発明の操作での使用に適したＨＰＬＣ分析用カラ
ムの例は、カリフォルニア州ヘスペリアのセパレーションズグループ社からＶｙ
ｄａｃ ＴＭ Ｃ−１８ ＨＰＬＣカラムとして市販されている。
用カラムである。これは、逆相ＨＰＬＣ手法を使用して、分解産物がクロマトグ
ラフィカラムを通じて溶離した時に、ペプチド分解産物を分別することが可能な
分別媒体を備える。こうした技術を実践するために、クロマトグラフィ媒体は疎
水性であることが好ましい。これは、ペプチド分解産物自体が疎水性の性質を有
する傾向にあるためである。本発明の操作での使用に適したＨＰＬＣ分析用カラ
ムの例は、カリフォルニア州ヘスペリアのセパレーションズグループ社からＶｙ
ｄａｃ ＴＭ Ｃ−１８ ＨＰＬＣカラムとして市販されている。
【００６４】
ペプチド断片の確認：
架橋タンパク質を断片化し、オプションとして精製した後、ペプチド断片を確
認して、タンパク質構造内で特定のペプチド断片に架橋を割り当てる。これは種
々の手法を使用して行うことが可能であり、エドマン配列決定、クロマトグラフ
ィ、質量スペクトロメトリ法、またはこれらの方法の組み合わせが含まれる。グ
ラント等のMethods Enzymol. 1997 289:395-419。
認して、タンパク質構造内で特定のペプチド断片に架橋を割り当てる。これは種
々の手法を使用して行うことが可能であり、エドマン配列決定、クロマトグラフ
ィ、質量スペクトロメトリ法、またはこれらの方法の組み合わせが含まれる。グ
ラント等のMethods Enzymol. 1997 289:395-419。
【００６５】
架橋ペプチドの確認の一方法は、オンラインクロマトグラフィ−質量スペクト
ロメトリ法、または、オフラインクロマトグラフィ後の質量スペクトロメトリ法
のいずれかを含む。クロマトグラフィ構成要素は、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８、または
同様の分離体系を使用する逆相分離を含む。１００％水性から開始され７０〜１
００％有機性（例えばアセトニトリルまたはメタノール）に至る勾配溶離プロフ
ィールが利用され、ペプチドはオフラインで分別して収集されるか、若しくは適
切に設計された質量スペクトロメータのソースに直接溶離する。Ｃ１８またはＣ
８カラムの代表的な勾配は、１００％溶媒Ａから開始され、７０分で１００％溶
媒Ｂに至る直線勾配である（溶媒Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＨ
２Ｏ、溶媒Ｂ＝０．８％ＴＦＡの７０％アセトニトリル／３０％Ｈ２Ｏ）。質量
スペクトロメータにとってＴＦＡが望ましくない場合は、ＴＦＡの代わりにギ酸
を使用できる。
ロメトリ法、または、オフラインクロマトグラフィ後の質量スペクトロメトリ法
のいずれかを含む。クロマトグラフィ構成要素は、Ｃ４、Ｃ８、Ｃ１８、または
同様の分離体系を使用する逆相分離を含む。１００％水性から開始され７０〜１
００％有機性（例えばアセトニトリルまたはメタノール）に至る勾配溶離プロフ
ィールが利用され、ペプチドはオフラインで分別して収集されるか、若しくは適
切に設計された質量スペクトロメータのソースに直接溶離する。Ｃ１８またはＣ
８カラムの代表的な勾配は、１００％溶媒Ａから開始され、７０分で１００％溶
媒Ｂに至る直線勾配である（溶媒Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＨ
２Ｏ、溶媒Ｂ＝０．８％ＴＦＡの７０％アセトニトリル／３０％Ｈ２Ｏ）。質量
スペクトロメータにとってＴＦＡが望ましくない場合は、ＴＦＡの代わりにギ酸
を使用できる。
【００６６】
オフラインＨＰＬＣ分離では、Ｅｌｄｅｘ ＭｉｃｒｏＰｒｏ ＨＰＬＣを用
いることができ、１μｌ／分で動作するＭｉｃｈｒｏｍ ＭＡＧＩＣ ＭＳ逆相
カラム（０．２×５０ｍｍ）を取り付けることが好ましい。あるいは、有する材
料の量および望まれるペプチド分離の度合いに応じて、高い充填容量を有するＬ
Ｃ Ｐａｃｋｉｎｇ Ｆｕｓｉｃａ ＩＩ逆相カラム（０．３×１５０ｍｍ，５
ｍＬ／ｍｉｎ）を使用してもよい。いずれの場合においても、Ａ＝０〜１％ＴＦ
Ａ／水およびＢ＝７０％アセトニトリル内の０．０８％ＴＦＡである勾配プログ
ラムは、１０％溶液Ｂ／９０％溶液Ａから６０分で９０％溶液Ｂ／１０％溶液Ａ
に至る。ペプチドは、ＬＣ ＰａｃｋｉｎｇｓキャピラリＺ−セルを取り付けた
ＡＢＩ７８５Ａ ＵＶ検出器により、２１０ｎｍで検出され、その後のＭＳ分析
のためにエッペンドルフ管または直接プレート上に収集される。
いることができ、１μｌ／分で動作するＭｉｃｈｒｏｍ ＭＡＧＩＣ ＭＳ逆相
カラム（０．２×５０ｍｍ）を取り付けることが好ましい。あるいは、有する材
料の量および望まれるペプチド分離の度合いに応じて、高い充填容量を有するＬ
Ｃ Ｐａｃｋｉｎｇ Ｆｕｓｉｃａ ＩＩ逆相カラム（０．３×１５０ｍｍ，５
ｍＬ／ｍｉｎ）を使用してもよい。いずれの場合においても、Ａ＝０〜１％ＴＦ
Ａ／水およびＢ＝７０％アセトニトリル内の０．０８％ＴＦＡである勾配プログ
ラムは、１０％溶液Ｂ／９０％溶液Ａから６０分で９０％溶液Ｂ／１０％溶液Ａ
に至る。ペプチドは、ＬＣ ＰａｃｋｉｎｇｓキャピラリＺ−セルを取り付けた
ＡＢＩ７８５Ａ ＵＶ検出器により、２１０ｎｍで検出され、その後のＭＳ分析
のためにエッペンドルフ管または直接プレート上に収集される。
【００６７】
架橋ペプチドの検出に最適なＭＳ器具がいくつか存在し、その一部としては、
１）個々のＨＰＬＣフラクションがオフラインで最初に分離されるマトリクス補
助レーザ着脱イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）器具、２）オンライ
ンＨＰＬＣによる電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）直交ＴＯＦ質量スペクトロメ
ータ、および／または３）同じくオンラインＨＰＬＣ検出によるＥＳＩイオント
ラップ器具が含まれる。さらに他の方法は、本開示を読むことで当業者に明らか
になる。
１）個々のＨＰＬＣフラクションがオフラインで最初に分離されるマトリクス補
助レーザ着脱イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）器具、２）オンライ
ンＨＰＬＣによる電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）直交ＴＯＦ質量スペクトロメ
ータ、および／または３）同じくオンラインＨＰＬＣ検出によるＥＳＩイオント
ラップ器具が含まれる。さらに他の方法は、本開示を読むことで当業者に明らか
になる。
【００６８】
この質量決定においては、いくつかの重要な考慮事項が存在し、これには全体
的な質量精度、検出の動的範囲、および質量範囲が含まれる。一般には、架橋ペ
プチドの確認に関して解釈の可能性を制限することが可能になる１００ｐｐｍよ
り優れた質量精度が望ましい。実施においては、適切に内部調整された多くのＭ
Ｓ器具によって、１０ｐｐｍまでまたはこれより優れた質量精度が達成できる。
この高いレベルの質量精度に基づいて、容易にペプチド（およびペプチド架橋）
の割り当てができるため、これは非常に望ましい。タンデムＭＳ実験を選択した
ペプチドイオンに関して実施し、追加断片情報（「配列タグ」）を得ることが可
能であり、これはその後ペプチドのアイデンティティの立証および／または架橋
に含まれる正確なアミノ酸位置の割り当てに使用される。
的な質量精度、検出の動的範囲、および質量範囲が含まれる。一般には、架橋ペ
プチドの確認に関して解釈の可能性を制限することが可能になる１００ｐｐｍよ
り優れた質量精度が望ましい。実施においては、適切に内部調整された多くのＭ
Ｓ器具によって、１０ｐｐｍまでまたはこれより優れた質量精度が達成できる。
この高いレベルの質量精度に基づいて、容易にペプチド（およびペプチド架橋）
の割り当てができるため、これは非常に望ましい。タンデムＭＳ実験を選択した
ペプチドイオンに関して実施し、追加断片情報（「配列タグ」）を得ることが可
能であり、これはその後ペプチドのアイデンティティの立証および／または架橋
に含まれる正確なアミノ酸位置の割り当てに使用される。
【００６９】
本発明の一実施形態は、好ましくは、飛行時間型（ＴＯＦ）質量スペクトロメ
トリ器具の使用により、架橋ペプチドのアイデンティティを決定する。ＴＯＦ質
量スペクトロメトリ法では、精製したイオンが検出器に移動する時間を測定する
ことで、質量対電荷（ｍ／ｚ）比率に従ってイオンを分離する。ＴＯＦ質量スペ
クトロメータは、事実上無制限の質量対電荷比率範囲を有する比較的単純で安価
な器具であるため、本発明において有利である。ＴＯＦ質量スペクトロメータは
、各イオン化イベントで生成されたすべてのイオンを記録できるため、走査型器
具より潜在的に高い感度を有する。ＴＯＦ質量スペクトロメータは、従来の磁場
質量スペクトロメータでは感度が不足する大きな有機分子の質量対電荷比率を測
定するのに有効である。本発明で使用可能なＴＯＦ質量スペクトロメータの例は
、米国特許第５，０４５，６９４号、第５，１６０，８４０号、および第５，６
２７，３６９号に示されており、これらは特に参考としてここに取り入れている
。
トリ器具の使用により、架橋ペプチドのアイデンティティを決定する。ＴＯＦ質
量スペクトロメトリ法では、精製したイオンが検出器に移動する時間を測定する
ことで、質量対電荷（ｍ／ｚ）比率に従ってイオンを分離する。ＴＯＦ質量スペ
クトロメータは、事実上無制限の質量対電荷比率範囲を有する比較的単純で安価
な器具であるため、本発明において有利である。ＴＯＦ質量スペクトロメータは
、各イオン化イベントで生成されたすべてのイオンを記録できるため、走査型器
具より潜在的に高い感度を有する。ＴＯＦ質量スペクトロメータは、従来の磁場
質量スペクトロメータでは感度が不足する大きな有機分子の質量対電荷比率を測
定するのに有効である。本発明で使用可能なＴＯＦ質量スペクトロメータの例は
、米国特許第５，０４５，６９４号、第５，１６０，８４０号、および第５，６
２７，３６９号に示されており、これらは特に参考としてここに取り入れている
。
【００７０】
質量スペクトロメータの性能は、質量分解度によって部分的にのみ定められる
。他の重要な特性は、質量精度、感度、質量体電荷比率、および動的範囲である
。全体的な性能を定める種々の要素の相対的な重要性は主に標本の種類によって
変化するが、特定の応用に関して十分な性能を得るために、いくつかのパラメー
タを指定し、同時に最適化する必要がある。こうしたパラメータは、本発明の方
法における最適な分解度に関して変化し、これは本開示を読むことで当業者にと
って明らかとなる。
。他の重要な特性は、質量精度、感度、質量体電荷比率、および動的範囲である
。全体的な性能を定める種々の要素の相対的な重要性は主に標本の種類によって
変化するが、特定の応用に関して十分な性能を得るために、いくつかのパラメー
タを指定し、同時に最適化する必要がある。こうしたパラメータは、本発明の方
法における最適な分解度に関して変化し、これは本開示を読むことで当業者にと
って明らかとなる。
【００７１】
ＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリ：
マトリクス補助レーザ着脱／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）は、１００，０００Ｄ
ａ分子質量を超える大きな生体分子について、完全な状態を維持しながら脱着お
よびイオン化を容易にするため、特に生物学的応用において有利であり、したが
って本発明の方法における使用にも有利である。そのため、好適な一実施形態に
おいて、ＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリ手法が使用される。ＭＡＬＤＩにおい
て、イオンは一般に、表面を離れた後で実質的な平均速度を有し、これはあらゆ
る質量のイオンの大部分において同じであり、平均速度の周囲には大きな幅があ
る。この平均速度は、飛行時間と質量のルートとの間の非線形関係につながる。
この幅は、低い質量分解度につながるが、個々のイオン質量の信号を測定すると
きには、質量分解度を改善する方法が存在する。飛行時間を質量に転換する関係
を、ここでは簡略化のために「質量スケール」と呼ぶ。
ａ分子質量を超える大きな生体分子について、完全な状態を維持しながら脱着お
よびイオン化を容易にするため、特に生物学的応用において有利であり、したが
って本発明の方法における使用にも有利である。そのため、好適な一実施形態に
おいて、ＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリ手法が使用される。ＭＡＬＤＩにおい
て、イオンは一般に、表面を離れた後で実質的な平均速度を有し、これはあらゆ
る質量のイオンの大部分において同じであり、平均速度の周囲には大きな幅があ
る。この平均速度は、飛行時間と質量のルートとの間の非線形関係につながる。
この幅は、低い質量分解度につながるが、個々のイオン質量の信号を測定すると
きには、質量分解度を改善する方法が存在する。飛行時間を質量に転換する関係
を、ここでは簡略化のために「質量スケール」と呼ぶ。
【００７２】
ＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリ法の他の修正事項も報告されており、オプシ
ョンとして本発明の方法において使用することができる。レノン等の第４２回質
量スペクトロメトリ法および関連事項に関するＡＳＭＳ会議議事録（Proceeding
s of the 42nd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics）、
１９９４年５月２９日−６月３日、イリノイ州シカゴ、５０１ページにおいて、
研究者は、改善された分解度、および小さなタンパク質の迅速な断片化について
報告している。さらに、ブルーカ等の第１３回国際質量スペクトロメトリ法会議
（13th International Mass Spectrometry Conference）、１９９４年８月２９
日−９月３日、ハンガリ、ブダペストにおいて、研究者は、パルスイオン抽出を
用いるコンパクトなＭＡＬＤＩ器具で小さな合成ポリマを測定する際の大幅な分
解度の向上を報告している。加えて、レイリ等のラピッドコミュニケーション（
Rapid Commun.）、質量スペクトロメトリ法、８、１９９４年、８６５−８６８
および、コルビ、ラピッドコミュニケーション（Rapid Commun.）、質量スペク
トロメトリ法、８、１９９４年、８６５−８６８において、研究者は、パルスイ
オン抽出ＭＡＬＤＩソースによる小さなタンパク質に関する質量分解度の大きな
改善を報告している。
ョンとして本発明の方法において使用することができる。レノン等の第４２回質
量スペクトロメトリ法および関連事項に関するＡＳＭＳ会議議事録（Proceeding
s of the 42nd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics）、
１９９４年５月２９日−６月３日、イリノイ州シカゴ、５０１ページにおいて、
研究者は、改善された分解度、および小さなタンパク質の迅速な断片化について
報告している。さらに、ブルーカ等の第１３回国際質量スペクトロメトリ法会議
（13th International Mass Spectrometry Conference）、１９９４年８月２９
日−９月３日、ハンガリ、ブダペストにおいて、研究者は、パルスイオン抽出を
用いるコンパクトなＭＡＬＤＩ器具で小さな合成ポリマを測定する際の大幅な分
解度の向上を報告している。加えて、レイリ等のラピッドコミュニケーション（
Rapid Commun.）、質量スペクトロメトリ法、８、１９９４年、８６５−８６８
および、コルビ、ラピッドコミュニケーション（Rapid Commun.）、質量スペク
トロメトリ法、８、１９９４年、８６５−８６８において、研究者は、パルスイ
オン抽出ＭＡＬＤＩソースによる小さなタンパク質に関する質量分解度の大きな
改善を報告している。
【００７３】
最初の運動エネルギの分散による影響を補うために、イオンリフレクタ（イオ
ン鏡またはリフレクトロンとも呼ばれる）を使用できる。イオンリフレクタは、
自由飛行領域の端部に配置される。イオンリフレクタは、一つ以上の均一な、抑
制の静電フィールドを含む。イオンは、リフレクタに入ると、この静電フィール
ドに関して、フィールドの方向の速度要素がゼロになるまで減速させられる。そ
の後、イオンは、進入したエネルギと同一のエネルギでリフレクタから出るが、
速度の方向は反対になる。大きなエネルギを有するイオンは、リフレクタの深く
まで入り、その結果、イオンリフレクタ内に長い時間とどまる。適切に設計され
たリフレクタにおいては、同様の質量および電荷のイオンが、最初のエネルギに
関係なく、同時に検出器に到着するようにイオンの飛行経路を修正する電位を選
択する。本開示を読むことで、当業者には、こうした修正および本発明の方法へ
の応用が理解されるため、こうした修正および原則も開示した技術に応用するこ
とができる。
ン鏡またはリフレクトロンとも呼ばれる）を使用できる。イオンリフレクタは、
自由飛行領域の端部に配置される。イオンリフレクタは、一つ以上の均一な、抑
制の静電フィールドを含む。イオンは、リフレクタに入ると、この静電フィール
ドに関して、フィールドの方向の速度要素がゼロになるまで減速させられる。そ
の後、イオンは、進入したエネルギと同一のエネルギでリフレクタから出るが、
速度の方向は反対になる。大きなエネルギを有するイオンは、リフレクタの深く
まで入り、その結果、イオンリフレクタ内に長い時間とどまる。適切に設計され
たリフレクタにおいては、同様の質量および電荷のイオンが、最初のエネルギに
関係なく、同時に検出器に到着するようにイオンの飛行経路を修正する電位を選
択する。本開示を読むことで、当業者には、こうした修正および本発明の方法へ
の応用が理解されるため、こうした修正および原則も開示した技術に応用するこ
とができる。
【００７４】
電子スプレーイオン化質量スペクトロメトリ：
本発明の方法において、高い質量精度（≦２０〜５０ｐｐｍ）およびオンライ
ンＨＰＬＣ／ＭＳ分析のために、いわゆる「電子スプレーイオン化」（ＥＳＩ）
質量スペクトロメトリ法が使用される。電子スプレーイオン化においては、通常
は伝導性のキャピラリニードルによって、（複数の）アナライトを含む液体に電
位が加えられる。溶液内のアナライトは、約７５〜１００μｍの内径を有する伝
導性のニードルから、例えば３０００Ｖの高電圧で、接地電位ないし質量スペク
トロメータの入口につながる約３００Ｖの間の電位の伝導性アパーチャプレート
に向けて噴霧される。若しくは、同程度で極性が反対の高電圧を、質量スペクト
ロメータの入口アパーチャに加えてもよい。高電界においてイオンが生成され、
その後これが質量スペクトロメータで分析される。
ンＨＰＬＣ／ＭＳ分析のために、いわゆる「電子スプレーイオン化」（ＥＳＩ）
質量スペクトロメトリ法が使用される。電子スプレーイオン化においては、通常
は伝導性のキャピラリニードルによって、（複数の）アナライトを含む液体に電
位が加えられる。溶液内のアナライトは、約７５〜１００μｍの内径を有する伝
導性のニードルから、例えば３０００Ｖの高電圧で、接地電位ないし質量スペク
トロメータの入口につながる約３００Ｖの間の電位の伝導性アパーチャプレート
に向けて噴霧される。若しくは、同程度で極性が反対の高電圧を、質量スペクト
ロメータの入口アパーチャに加えてもよい。高電界においてイオンが生成され、
その後これが質量スペクトロメータで分析される。
【００７５】
ＥＳＩでは、周囲と同じ温度および圧力で、過度な断片化を起こさずに、溶液
中のアナライトを気相イオンに直接転換できる。ＥＳＩ質量スペクトロメトリ法
は、極性またはイオン性の不揮発性化合物の分析に適している。ＥＳＩが、高速
原子衝突またはサーモスプレー等の他のソフトイオン化手法より有利な点は、多
重電荷種の形成であり、このためＥＳＩは高分子重量（１，０００，０００Ｄａ
）の生体分子およびポリマの分析に適している。フェン等の「電子スプレーイオ
ン化−原理および実施」、Mass Spectrom. Rev. vol.9,pp.37-70(1990)を参照さ
れたい。電子スプレーのメカニズムの全般的な背景については、Ｐ・ケバール等
のAnal. Chem.65:972A-986A(1993)を参照されたい。
中のアナライトを気相イオンに直接転換できる。ＥＳＩ質量スペクトロメトリ法
は、極性またはイオン性の不揮発性化合物の分析に適している。ＥＳＩが、高速
原子衝突またはサーモスプレー等の他のソフトイオン化手法より有利な点は、多
重電荷種の形成であり、このためＥＳＩは高分子重量（１，０００，０００Ｄａ
）の生体分子およびポリマの分析に適している。フェン等の「電子スプレーイオ
ン化−原理および実施」、Mass Spectrom. Rev. vol.9,pp.37-70(1990)を参照さ
れたい。電子スプレーのメカニズムの全般的な背景については、Ｐ・ケバール等
のAnal. Chem.65:972A-986A(1993)を参照されたい。
【００７６】
この実施形態に関して、ＥＳＩ−ＴＯＦは、好ましくはキャピラリＨＰＬＣカ
ラムに取り付けたアプライドバイオシステムズ１４０ＢシリンジポンプＨＰＬＣ
システムと結合するマリナＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメータを使用して実施
される（１０〜１５ｃｍ毎のフシカ２００〜３００μＩ．Ｄ．、Ｃ１８またはＣ
１４パッキング）。０．１％ギ酸のＨ２Ｏ（溶媒Ａ）および０．０５５％ギ酸の
５／２（ｖ／ｖ）のエタノール／プロパノール（溶液Ｂ）を含む勾配溶媒が利用
され、１０％〜６０％Ｂで７０分間行われる。
ラムに取り付けたアプライドバイオシステムズ１４０ＢシリンジポンプＨＰＬＣ
システムと結合するマリナＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトロメータを使用して実施
される（１０〜１５ｃｍ毎のフシカ２００〜３００μＩ．Ｄ．、Ｃ１８またはＣ
１４パッキング）。０．１％ギ酸のＨ２Ｏ（溶媒Ａ）および０．０５５％ギ酸の
５／２（ｖ／ｖ）のエタノール／プロパノール（溶液Ｂ）を含む勾配溶媒が利用
され、１０％〜６０％Ｂで７０分間行われる。
【００７７】
構造モデリング：
構造モデリングに使用する計算機戦略は、種々の計算機手法を用いる、折り畳
みファミリー、ドメイン・ドメイン形状、および／または三次元構造の決定のた
めの実験的ペプチド断片データからの目標アミノ酸対間の、あらゆる実験的距離
制約条件を利用する。多くの制約の限界の中で、構造は、距離架橋を用いて、直
接生成される。同じ手法は、全長構造内でドメインを配向させるために、オリゴ
マー内でモノマー間の相互作用を決定するために、または受容体・リガンド複合
体を定義するために用いることもできる。そのような解析の組み合わせは、タン
パク質の三次元構造の構造モデリングを作るであろう。図１２を参照。そのよう
な解析は、三次元ソフトウェアの助けを借りて行うのが望ましい。
みファミリー、ドメイン・ドメイン形状、および／または三次元構造の決定のた
めの実験的ペプチド断片データからの目標アミノ酸対間の、あらゆる実験的距離
制約条件を利用する。多くの制約の限界の中で、構造は、距離架橋を用いて、直
接生成される。同じ手法は、全長構造内でドメインを配向させるために、オリゴ
マー内でモノマー間の相互作用を決定するために、または受容体・リガンド複合
体を定義するために用いることもできる。そのような解析の組み合わせは、タン
パク質の三次元構造の構造モデリングを作るであろう。図１２を参照。そのよう
な解析は、三次元ソフトウェアの助けを借りて行うのが望ましい。
【００７８】
構造モデリングは、架橋のない、修飾された、または架橋した核酸配列、ペプ
チドまたは異常アミノ酸を有する偽ペプチド配列、オリゴ糖、または定義された
配列の他のポリマーの研究に拡張可能である。望ましくは、ソフトウェアは、一
価の（親和性ラベル）試薬、ホモ二価架橋剤、ヘテロ二価架橋剤、および３以上
の結合価を有する架橋剤を含む、種々の異なる化学的または光化学的な架橋剤を
、既知の化学的最終生産物に含ませることができる。
チドまたは異常アミノ酸を有する偽ペプチド配列、オリゴ糖、または定義された
配列の他のポリマーの研究に拡張可能である。望ましくは、ソフトウェアは、一
価の（親和性ラベル）試薬、ホモ二価架橋剤、ヘテロ二価架橋剤、および３以上
の結合価を有する架橋剤を含む、種々の異なる化学的または光化学的な架橋剤を
、既知の化学的最終生産物に含ませることができる。
【００７９】
一組の構造モデルが一旦対象の配列として作られると、それらは、実験由来距
離制約条件とのそれらの整合性に基づいて、および／または、それらの計算され
た物理的性質に基づいて計算可能である。モデルの制約条件との整合性は、その
モデルに伴う制約条件誤差および、そのモデルにより定義される制約条件の数の
関数である。例えば、これらの制約条件は、位置合わせ、Ｘ線結晶解析、または
ＮＭＲによって定義される領域における結合性残基である。その物理的性質に基
づくモデリングの評価には、疎水的／親水的アミノ酸分布の計算、その水素結合
ネットワーク地図の作製、ジスルフィド結合の位置決定、突然変異データの機能
地図作製、そのモデルの二次構造の相補性および配列から予想される二次構造の
評価、重要な静電気的相互作用が維持されていることの確認、ファンデルワール
ス衝突部位の同定、配列・構造・配列類似性の評価、またはそれらの組み合わせ
が含まれる。
離制約条件とのそれらの整合性に基づいて、および／または、それらの計算され
た物理的性質に基づいて計算可能である。モデルの制約条件との整合性は、その
モデルに伴う制約条件誤差および、そのモデルにより定義される制約条件の数の
関数である。例えば、これらの制約条件は、位置合わせ、Ｘ線結晶解析、または
ＮＭＲによって定義される領域における結合性残基である。その物理的性質に基
づくモデリングの評価には、疎水的／親水的アミノ酸分布の計算、その水素結合
ネットワーク地図の作製、ジスルフィド結合の位置決定、突然変異データの機能
地図作製、そのモデルの二次構造の相補性および配列から予想される二次構造の
評価、重要な静電気的相互作用が維持されていることの確認、ファンデルワール
ス衝突部位の同定、配列・構造・配列類似性の評価、またはそれらの組み合わせ
が含まれる。
【００８０】
少なく生成された架橋（アミノ酸残基数の約１０％）でさえ、未知の構造の配
列に関する折り畳みファミリーを決定することができる。折り畳みの認識のため
の重要な理論的跳躍には、すべての可能なタンパク質構造の空間の集中的解析が
含まれる。構造計算は、対象とする配列に関して、ありそうな候補である空間に
おける、それらの構造に限定される。
列に関する折り畳みファミリーを決定することができる。折り畳みの認識のため
の重要な理論的跳躍には、すべての可能なタンパク質構造の空間の集中的解析が
含まれる。構造計算は、対象とする配列に関して、ありそうな候補である空間に
おける、それらの構造に限定される。
【００８１】
従って、折り畳みファミリーの決定には、代表的タンパク質構造ライブラリで
、対象とする配列のスレッディングをすることによって仮想構造モデルを作り、
架橋データ組から得られる距離制約条件の適用によるモデルの評価が含まれる場
合もある。もし、あるモデルが、低い制約条件違反を有することがわかった場合
、このモデルは、さらなる類似性モデリング研究のための良い候補であると考え
られる。その解析のための第一ステップは、問題の配列についての一組の構造モ
デルの作成である。構造モデルは、一組の既知のタンパク質構造のスレッディン
グをし、制約されたエネルギ最小化または分子動力学のような、距離幾何学また
はab initio法を用いて新たに構造を計算することによって作ることができる。
構造モデルは、二次構造予測法、配列におけるモチーフ、類似性モデリング、ま
たは、これらの組み合わせおよび本明細書を読めば本技術を熟知する者には明白
な他の方法によっても作ることができる。
、対象とする配列のスレッディングをすることによって仮想構造モデルを作り、
架橋データ組から得られる距離制約条件の適用によるモデルの評価が含まれる場
合もある。もし、あるモデルが、低い制約条件違反を有することがわかった場合
、このモデルは、さらなる類似性モデリング研究のための良い候補であると考え
られる。その解析のための第一ステップは、問題の配列についての一組の構造モ
デルの作成である。構造モデルは、一組の既知のタンパク質構造のスレッディン
グをし、制約されたエネルギ最小化または分子動力学のような、距離幾何学また
はab initio法を用いて新たに構造を計算することによって作ることができる。
構造モデルは、二次構造予測法、配列におけるモチーフ、類似性モデリング、ま
たは、これらの組み合わせおよび本明細書を読めば本技術を熟知する者には明白
な他の方法によっても作ることができる。
【００８２】
距離幾何学プログラムは、本発明の方法では特に有用である。距離幾何学は、
一組の（ＮｘＮ）・Ｎ距離限界を、これらの限界と整合する一組の３ｘＮデカル
ト座標に変換する一般的な方法である。そのような距離幾何学プログラムの一つ
ＤＧＥＯＭは、カリフォルニア州エメリービルのカイロン社から入手できる分子
モデル構築および立体配座解析用距離幾何学プログラムである（Havel et al.,
J. Theor. Biol. 104:359-81(1983); Havel et al., J. Theor. Biol. 104:383-
400(1983)）。分子構造は、物理的制約条件および断片同定を用いて作られる原
子間距離の全ての組によって記述可能である。ＤＧＥＯＭのような距離幾何学プ
ログラムを用いて、以前予測されたより、はるかに少ない物理的制約条件を用い
て中程度の解像度の構造を作ることができる。
一組の（ＮｘＮ）・Ｎ距離限界を、これらの限界と整合する一組の３ｘＮデカル
ト座標に変換する一般的な方法である。そのような距離幾何学プログラムの一つ
ＤＧＥＯＭは、カリフォルニア州エメリービルのカイロン社から入手できる分子
モデル構築および立体配座解析用距離幾何学プログラムである（Havel et al.,
J. Theor. Biol. 104:359-81(1983); Havel et al., J. Theor. Biol. 104:383-
400(1983)）。分子構造は、物理的制約条件および断片同定を用いて作られる原
子間距離の全ての組によって記述可能である。ＤＧＥＯＭのような距離幾何学プ
ログラムを用いて、以前予測されたより、はるかに少ない物理的制約条件を用い
て中程度の解像度の構造を作ることができる。
【００８３】
モデル作成の多くの方法のどれも、全体の方法のこのステップで適用可能であ
る。ここで述べる位置合わせ法は単なる例にすぎず、距離制約条件と整合する構
造を推定するために、他の方法を用いてもよい。本発明の方法で特に有用な２つ
の戦略は、制約されたスレッディングおよび制約された配列／構造位置合わせで
ある。他の可能な方法には、動的プログラミングおよびクリーク検出が含まれる
。
る。ここで述べる位置合わせ法は単なる例にすぎず、距離制約条件と整合する構
造を推定するために、他の方法を用いてもよい。本発明の方法で特に有用な２つ
の戦略は、制約されたスレッディングおよび制約された配列／構造位置合わせで
ある。他の可能な方法には、動的プログラミングおよびクリーク検出が含まれる
。
【００８４】
制約されたスレッディング手順の第一ステップは、配列ユニークタンパク質の
データベースによって配列のスレッディングをすることによって、一組の構造モ
デルを作ることである。そのような構造モデルを作るために、本方法では、種々
のソフトウェアプログラムが利用できる。例えば、ＦＧＦ−２について、これら
のモデルを作るために我々が用いた特殊なプログラム（ＦＧＦ２・ＢＯＶＩＮ）
は、公共領域ソフトウェア１２３Ｄである（Alexandrov et al., "Fast Protein
Fold Recognition via Sequence to Structure Alignment and Contact Capaci
ty Potentials." Protein Science Bulletin (1996)）。このプログラムには、
タンパク質の配列を入力すること、位置合わせモードを決定すること、およびソ
フトウェアアルゴリズムにモデルを作らせることが含まれる。大域的位置合わせ
では、全ての位置が考慮される。自由シフト位置合わせでは、初めおよび終わり
の隙間は得点されない。局所的位置合わせは、最大共通部分列位置合わせである
。これらの位置合わせモードのどれについても、プログラムは、最大得点位置合
わせの、ある数を与える。このプログラムのあるバージョンは、httpサイトcart
an.gmd.deでオンライン接続可能である。そのタンパク質配列、例えばＦＧＦ−
２配列、に最も相補的であると１２３Ｄが考える構造モデルを次に、我々の方法
における次のステップ、モデル評価ステップに進める。上位２０のスレッディン
グモデルを、次式を用いて、実験に由来する制約条件との整合性に関してさらに
調べることができる。
データベースによって配列のスレッディングをすることによって、一組の構造モ
デルを作ることである。そのような構造モデルを作るために、本方法では、種々
のソフトウェアプログラムが利用できる。例えば、ＦＧＦ−２について、これら
のモデルを作るために我々が用いた特殊なプログラム（ＦＧＦ２・ＢＯＶＩＮ）
は、公共領域ソフトウェア１２３Ｄである（Alexandrov et al., "Fast Protein
Fold Recognition via Sequence to Structure Alignment and Contact Capaci
ty Potentials." Protein Science Bulletin (1996)）。このプログラムには、
タンパク質の配列を入力すること、位置合わせモードを決定すること、およびソ
フトウェアアルゴリズムにモデルを作らせることが含まれる。大域的位置合わせ
では、全ての位置が考慮される。自由シフト位置合わせでは、初めおよび終わり
の隙間は得点されない。局所的位置合わせは、最大共通部分列位置合わせである
。これらの位置合わせモードのどれについても、プログラムは、最大得点位置合
わせの、ある数を与える。このプログラムのあるバージョンは、httpサイトcart
an.gmd.deでオンライン接続可能である。そのタンパク質配列、例えばＦＧＦ−
２配列、に最も相補的であると１２３Ｄが考える構造モデルを次に、我々の方法
における次のステップ、モデル評価ステップに進める。上位２０のスレッディン
グモデルを、次式を用いて、実験に由来する制約条件との整合性に関してさらに
調べることができる。
【００８５】
【数２】
【００８６】
式中、Ｅｔは全制約条件誤差、ｉは距離制約条件の数、ｄ０は組距離分離、ｄ
ｊは制約条件ｊでの２つの残基について構造によって定義される組距離。このよ
うに、ｄｊは候補のスレッディングモデルで観察される距離である。もしｄｊが
リンカーアームの長さで定義される距離ｄ０より小さいか等しければ、制約条件
ｊが寄与する制約条件誤差は存在しない。もしｄｊがｄ０より大きければ、制約
条件誤差は、これらの距離間の差によって定義される。制約条件誤差の計算に関
するこれらの関数の形は例示のためのものであり、本技術に習熟する者が、本明
細書を読めば明らかなように、他の集計関数もまた使用可能であろう。
ｊは制約条件ｊでの２つの残基について構造によって定義される組距離。このよ
うに、ｄｊは候補のスレッディングモデルで観察される距離である。もしｄｊが
リンカーアームの長さで定義される距離ｄ０より小さいか等しければ、制約条件
ｊが寄与する制約条件誤差は存在しない。もしｄｊがｄ０より大きければ、制約
条件誤差は、これらの距離間の差によって定義される。制約条件誤差の計算に関
するこれらの関数の形は例示のためのものであり、本技術に習熟する者が、本明
細書を読めば明らかなように、他の集計関数もまた使用可能であろう。
【００８７】
不自然に低い制約条件誤差を有するモデルを考慮することを避けるために、組
制約条件の５０％を有する配列構造モデルだけを一般に評価する。次に上位２０
のスレッディングモデルを制約条件誤差が増える順にランク付けする。制約され
たスレッディング方法について、モデル作成ステップの部分として、物理的性質
の評価を実施する。例えば、１２３Ｄスレッディングポテンシャルには、配列構
造類似性に関する項が含まれる。この方法におけるモデル評価ステップは、実験
に由来する制約条件に対する、各モデルの相補性を測定することに集中する。
制約条件の５０％を有する配列構造モデルだけを一般に評価する。次に上位２０
のスレッディングモデルを制約条件誤差が増える順にランク付けする。制約され
たスレッディング方法について、モデル作成ステップの部分として、物理的性質
の評価を実施する。例えば、１２３Ｄスレッディングポテンシャルには、配列構
造類似性に関する項が含まれる。この方法におけるモデル評価ステップは、実験
に由来する制約条件に対する、各モデルの相補性を測定することに集中する。
【００８８】
制約されたスレッディング過程の一例が、図１３の流れ図１３０１に、より詳
しく説明されている。既知の立体配座および折り畳みまたは領域情報を有する一
組のタンパク質構造を、ブルックヘブン・タンパク質データベースのようなデー
タベースから選ぶ。それぞれの選ばれたタンパク質に属する情報には、一次配列
、二次構造および各残基の立体位置が含まれる。次に、解析中のタンパク質の一
次構造を、それぞれの選ばれたタンパク質構造にスレッディングする。言い換え
れば、考慮中のタンパク質の骨格を、現在選んでいるタンパク質の骨格の上に置
く。考慮中のタンパク質を、ある選ばれたタンパク質で位置合わせした後、その
選ばれたタンパク質の得点を集計する（１３０５を参照）。もし例えば、公共領
域ソフトウェア１２３Ｄを用いれば、そのソフトウェアは、（１）２つのタンパ
ク質間の配列の同一性、（２）２つのタンパク質間の二次構造の位置合わせ、お
よび（３）そのスレッディングされた形でのタンパク質の接触容積ポテンシャル
に基づく得点集計を行う。第二の得点集計基準には、一次配列に基づいてタンパ
ク質の二次構造を推定することが含まれる。第三の得点集計基準には、あるアミ
ノ酸残基の局所的環境（隣接するアミノ酸）が、その実験的に求められた好まし
い環境と、どの程度密接に一致するかに基づく。他のソフトウェアプログラムお
よび他の得点集計基準（例えば、疎水性、潜在的平均力）を使用することができ
る。典型的な具体例では、次に、上位２０の候補となる構造を計算プロセスの次
のステップで使用する。
しく説明されている。既知の立体配座および折り畳みまたは領域情報を有する一
組のタンパク質構造を、ブルックヘブン・タンパク質データベースのようなデー
タベースから選ぶ。それぞれの選ばれたタンパク質に属する情報には、一次配列
、二次構造および各残基の立体位置が含まれる。次に、解析中のタンパク質の一
次構造を、それぞれの選ばれたタンパク質構造にスレッディングする。言い換え
れば、考慮中のタンパク質の骨格を、現在選んでいるタンパク質の骨格の上に置
く。考慮中のタンパク質を、ある選ばれたタンパク質で位置合わせした後、その
選ばれたタンパク質の得点を集計する（１３０５を参照）。もし例えば、公共領
域ソフトウェア１２３Ｄを用いれば、そのソフトウェアは、（１）２つのタンパ
ク質間の配列の同一性、（２）２つのタンパク質間の二次構造の位置合わせ、お
よび（３）そのスレッディングされた形でのタンパク質の接触容積ポテンシャル
に基づく得点集計を行う。第二の得点集計基準には、一次配列に基づいてタンパ
ク質の二次構造を推定することが含まれる。第三の得点集計基準には、あるアミ
ノ酸残基の局所的環境（隣接するアミノ酸）が、その実験的に求められた好まし
い環境と、どの程度密接に一致するかに基づく。他のソフトウェアプログラムお
よび他の得点集計基準（例えば、疎水性、潜在的平均力）を使用することができ
る。典型的な具体例では、次に、上位２０の候補となる構造を計算プロセスの次
のステップで使用する。
【００８９】
１３０７で、上位の候補は、カリフォルニア州エメリービルのカイロン社から
入手可能なＤＧＥＯＭのようなコンピュータプログラムによって三次元座標に変
換された残基を有する。距離制約条件情報を、上述の式に従って各候補構造に適
用する（１３０９を参照）。次に候補構造は、その式への適合に従って再びラン
ク付けされる（１３１１を参照）。
入手可能なＤＧＥＯＭのようなコンピュータプログラムによって三次元座標に変
換された残基を有する。距離制約条件情報を、上述の式に従って各候補構造に適
用する（１３０９を参照）。次に候補構造は、その式への適合に従って再びラン
ク付けされる（１３１１を参照）。
【００９０】
制約された配列／構造アライメント
制約条件リストの情報内容を調査するために使用可能な、もう１つの方法は、
制約された配列／構造アライメントである。この「制約された配列／構造アライ
メント」法は一組の構造モデルを構築するために制約条件を使用し、モデル評価
ステップは、各モデルに組疎水性接触ポテンシャルを適用することと、このポテ
ンシャル関数に基づいてモデルをランク付けすることから成る（Bryant et al.,
"An Empirical Energy Function for Threading Protein Sequence Through th
e Folding Motif," Proteins, 1993, 16:92-112）。この方法では、その折り畳
みへの位置合わせは、アルファ炭素の原子間距離が延ばされた架橋と側鎖原子の
合計（ＢＳ３結合剤の場合２３．８５Å未満）より小さい折り畳みの残基への制
約条件によって結合される標的タンパク質の残基を対称的に一致させることによ
って定義される。
制約された配列／構造アライメントである。この「制約された配列／構造アライ
メント」法は一組の構造モデルを構築するために制約条件を使用し、モデル評価
ステップは、各モデルに組疎水性接触ポテンシャルを適用することと、このポテ
ンシャル関数に基づいてモデルをランク付けすることから成る（Bryant et al.,
"An Empirical Energy Function for Threading Protein Sequence Through th
e Folding Motif," Proteins, 1993, 16:92-112）。この方法では、その折り畳
みへの位置合わせは、アルファ炭素の原子間距離が延ばされた架橋と側鎖原子の
合計（ＢＳ３結合剤の場合２３．８５Å未満）より小さい折り畳みの残基への制
約条件によって結合される標的タンパク質の残基を対称的に一致させることによ
って定義される。
【００９１】
次に、タンパク質配列を、配列の最初に一致する残基から戻って最初の残基へ
、または、その折り畳みの最初へ、最初に一致した残基から前へ、そして対称的
に第二から戻り、そして二番目に一致した残基から前へ折り畳み作業上にマッピ
ングすることができる。例えば、マッピングした残基に関する制約条件の全リス
トにわたり、１つの挿入／欠失と２Åの平均誤差で、ＦＧＦ−２の１４６残基内
の１１５残基以上が決定された。Bryantら(1993)によって定義された組疎水接触
ポテンシャルを用いて位置合わせの得点集計が可能であり、それぞれの折り畳み
について得られた最良の得点は、その折り畳みをランク付けするために保存され
た。
、または、その折り畳みの最初へ、最初に一致した残基から前へ、そして対称的
に第二から戻り、そして二番目に一致した残基から前へ折り畳み作業上にマッピ
ングすることができる。例えば、マッピングした残基に関する制約条件の全リス
トにわたり、１つの挿入／欠失と２Åの平均誤差で、ＦＧＦ−２の１４６残基内
の１１５残基以上が決定された。Bryantら(1993)によって定義された組疎水接触
ポテンシャルを用いて位置合わせの得点集計が可能であり、それぞれの折り畳み
について得られた最良の得点は、その折り畳みをランク付けするために保存され
た。
【００９２】
次に、制約された配列／構造位置合わせの、もう１つの具体例を流れ図でより
詳細に説明する。この具体例のステップは、図１３で説明したステップとは少し
異なるが、この具体例は、図２の一般的方法の概要と一致する。この具体例では
、距離制約条件は、ＭＳデータを用いる上記の具体例と同様に作られる（図２の
２０３，図５のすべてを参照）。これらの距離制約条件は、ブルックヘブン・タ
ンパク質折り畳みによってスレッディングされながら、そのタンパク質の一次配
列に適用され、候補となる構造を作る（２０５を参照）。次に、適当な得点集計
関数を用いて、候補となる構造の得点集計がなされ、再びランク付けされる。特
殊な具体例では、Bryantら(1993)の接触容積ポテンシャルを含む得点集計関数が
用いられる。この具体例で使用する得点集計関数は、その論文に記述されている
。次に、下に述べる類似性モデリングを実施する（図１４Ａ、１４Ｂ、および２
０７を参照）。
詳細に説明する。この具体例のステップは、図１３で説明したステップとは少し
異なるが、この具体例は、図２の一般的方法の概要と一致する。この具体例では
、距離制約条件は、ＭＳデータを用いる上記の具体例と同様に作られる（図２の
２０３，図５のすべてを参照）。これらの距離制約条件は、ブルックヘブン・タ
ンパク質折り畳みによってスレッディングされながら、そのタンパク質の一次配
列に適用され、候補となる構造を作る（２０５を参照）。次に、適当な得点集計
関数を用いて、候補となる構造の得点集計がなされ、再びランク付けされる。特
殊な具体例では、Bryantら(1993)の接触容積ポテンシャルを含む得点集計関数が
用いられる。この具体例で使用する得点集計関数は、その論文に記述されている
。次に、下に述べる類似性モデリングを実施する（図１４Ａ、１４Ｂ、および２
０７を参照）。
【００９３】
再ランク付けの後、次に、上位にランクされた構造の類似性モデリングを行う
。初めに、（その一次構造に由来する）タンパク質の二次構造を、モデル化して
いる構造の基礎となるブルックヘブン・タンパク質の二次構造と矛盾しないよう
にしなければならない。この一例を図１４Ａに示す。図１４Ａは、ブルックヘブ
ン折り畳み１４０５と比べて、配列１４０３に「隙間」がある、解析中のタンパ
ク質１４０１を示す。類似性モデリング・ソフトウェアは、そのタンパク質の最
小エネルギ立体配置を維持するように、この隙間の周りに残基を集める。逆に、
図１４Ｂに示すように、もしタンパク質１４０７が、ブルックヘブン・タンパク
質１４１１と比べて余分な残基１４０９を有するならば、そのソフトウェアは、
その最小エネルギ立体配置も維持するループを作ることができる。また、類似性
モデリング・ソフトウェアは、その構造のエネルギ立体配座を最小にするように
残基および部分基の方向を変えることができる。本発明で使用する類似性モデリ
ング・ソフトウェアの例には、ミズーリ州セントルイスのトリポス社のＳｙｂｙ
ｌおよびカリフォルニア州サンフランシスコのカリフォルニア大学のコンピュー
タ・グラフィックス研究所のＭｉｄａｓがある。
。初めに、（その一次構造に由来する）タンパク質の二次構造を、モデル化して
いる構造の基礎となるブルックヘブン・タンパク質の二次構造と矛盾しないよう
にしなければならない。この一例を図１４Ａに示す。図１４Ａは、ブルックヘブ
ン折り畳み１４０５と比べて、配列１４０３に「隙間」がある、解析中のタンパ
ク質１４０１を示す。類似性モデリング・ソフトウェアは、そのタンパク質の最
小エネルギ立体配置を維持するように、この隙間の周りに残基を集める。逆に、
図１４Ｂに示すように、もしタンパク質１４０７が、ブルックヘブン・タンパク
質１４１１と比べて余分な残基１４０９を有するならば、そのソフトウェアは、
その最小エネルギ立体配置も維持するループを作ることができる。また、類似性
モデリング・ソフトウェアは、その構造のエネルギ立体配座を最小にするように
残基および部分基の方向を変えることができる。本発明で使用する類似性モデリ
ング・ソフトウェアの例には、ミズーリ州セントルイスのトリポス社のＳｙｂｙ
ｌおよびカリフォルニア州サンフランシスコのカリフォルニア大学のコンピュー
タ・グラフィックス研究所のＭｉｄａｓがある。
【００９４】
類似性モデリング
両方のモデル作成方法において、実験的制約条件に最も相補的なモデルを、類
似性モデルの構築のための出発点として選ぶ。スレッディング位置合わせを、そ
の配列におけるアミノ酸を、その構造における位置に合わせるために使うことが
できる。他の位置合わせ手順もまた使用できる。次に、標準的な類似性モデリン
グ技術を用いてモデルを構築することができる。さらに、そのモデル内の距離制
約条件違反の助けにより、そのモデルをさらに洗練させる。モデルの洗練は、距
離幾何学、エネルギ最小化、および／または分子動力学を用いて実行できよう。
似性モデルの構築のための出発点として選ぶ。スレッディング位置合わせを、そ
の配列におけるアミノ酸を、その構造における位置に合わせるために使うことが
できる。他の位置合わせ手順もまた使用できる。次に、標準的な類似性モデリン
グ技術を用いてモデルを構築することができる。さらに、そのモデル内の距離制
約条件違反の助けにより、そのモデルをさらに洗練させる。モデルの洗練は、距
離幾何学、エネルギ最小化、および／または分子動力学を用いて実行できよう。
【００９５】
実施例：
以下の実施例は、本技術に通常の技能を有する者に、本発明を作り使用する方
法の完全な開示および記述を提供するためのものであり、発明者が自分達の発明
であるとみなすものの範囲を制限するためのもではなく、以下の実験が実施した
全ての実験であると示すためのものでもない。用いた数字（例えば、量、温度、
等）に関して正確さを確認する努力はしたが、いくつかの実験誤差および偏差を
考慮すべきである。特に断らない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、
温度は摂氏、そして圧力は大気圧または大気圧に近い。
法の完全な開示および記述を提供するためのものであり、発明者が自分達の発明
であるとみなすものの範囲を制限するためのもではなく、以下の実験が実施した
全ての実験であると示すためのものでもない。用いた数字（例えば、量、温度、
等）に関して正確さを確認する努力はしたが、いくつかの実験誤差および偏差を
考慮すべきである。特に断らない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、
温度は摂氏、そして圧力は大気圧または大気圧に近い。
【００９６】
以下に記述する本発明の方法は、本技術で予測されていたより、ずっと少ない
物理的制約距離、一般に、タンパク質のアミノ酸残基数の約１０％を用いて中程
度の解像度の構造（２〜５Å）を与えることがわかった。この予想外で驚くべき
結果により、本発明の方法によって、この方法を用いないで予想した場合より良
い解像度の構造を作ることが可能になった。さらに、予想より短い時間で、合理
的な構造が作られるであろう。
物理的制約距離、一般に、タンパク質のアミノ酸残基数の約１０％を用いて中程
度の解像度の構造（２〜５Å）を与えることがわかった。この予想外で驚くべき
結果により、本発明の方法によって、この方法を用いないで予想した場合より良
い解像度の構造を作ることが可能になった。さらに、予想より短い時間で、合理
的な構造が作られるであろう。
【００９７】
実施例１：確認実験
対象とするタンパク質の三次元構造を構築するために要求される組距離制約条
件の数および型を、分子間架橋技術を実施する前に予測した。七つの異なる制約
条件の型を、距離幾何学を用いて、ＢＰＴＩ、α・ブンガロトキシン、パルアル
ブミンα、サイクロフィリンＡ、ＦＧＦ−２の五つのタンパク質の構造の計算に
適用した。各タンパク質について、それらの制約条件に矛盾しない１０の構造の
組み合わせを作った。
件の数および型を、分子間架橋技術を実施する前に予測した。七つの異なる制約
条件の型を、距離幾何学を用いて、ＢＰＴＩ、α・ブンガロトキシン、パルアル
ブミンα、サイクロフィリンＡ、ＦＧＦ−２の五つのタンパク質の構造の計算に
適用した。各タンパク質について、それらの制約条件に矛盾しない１０の構造の
組み合わせを作った。
【００９８】
正確な残基間結晶学的距離を用いて作られた構造は、不正確な距離から計算さ
れた構造より高い品質を有していた。結晶構造からＲＭＳＤにより測定した最良
品質の構造は、極性極性アミノ酸結晶学的距離、二次構造由来制約条件、および
ジスルフィド結合情報を用いて計算されたものである。特にＢＰＴＩの構造は、
３つのジスルフィド結合により課される厳しい制約条件のために、２．７２Åの
ＲＭＳＤで容易に計算できた。逆に、サイクロフィリンＡ混合物は、ジスルフィ
ド結合がなく、その組で最大のタンパク質（１６５残基）であるので、最も挑戦
的な試みであることが判明した。
れた構造より高い品質を有していた。結晶構造からＲＭＳＤにより測定した最良
品質の構造は、極性極性アミノ酸結晶学的距離、二次構造由来制約条件、および
ジスルフィド結合情報を用いて計算されたものである。特にＢＰＴＩの構造は、
３つのジスルフィド結合により課される厳しい制約条件のために、２．７２Åの
ＲＭＳＤで容易に計算できた。逆に、サイクロフィリンＡ混合物は、ジスルフィ
ド結合がなく、その組で最大のタンパク質（１６５残基）であるので、最も挑戦
的な試みであることが判明した。
【００９９】
二次構造情報に基づく制約条件の追加は、それぞれ１００％および２８％のα
ヘリックスであるパルアルビミンおよびＢＰＴＩについて最も劇的であったが、
一般にＲＭＳＤを下げる。サイクロフィリンＡ、ＦＧＦ−２、およびαブンガロ
トキシンの組の他のタンパク質を、すべてβ構造であると仮定してＳＣＯＰによ
って分類した（Murzin et al. "SCOP: a Structural Classification of Protei
ns Database for the Investigation of Sequences and Structures." J. Mol.
Biol. 1995 Apr 7, 247(4):536-40）。αヘリックスの構造を正確に定義するた
めには、延びた構造より多くの制約条件が必要であるので、らせんシステムでは
二次構造は、最終ＲＭＳＤを下げる。
ヘリックスであるパルアルビミンおよびＢＰＴＩについて最も劇的であったが、
一般にＲＭＳＤを下げる。サイクロフィリンＡ、ＦＧＦ−２、およびαブンガロ
トキシンの組の他のタンパク質を、すべてβ構造であると仮定してＳＣＯＰによ
って分類した（Murzin et al. "SCOP: a Structural Classification of Protei
ns Database for the Investigation of Sequences and Structures." J. Mol.
Biol. 1995 Apr 7, 247(4):536-40）。αヘリックスの構造を正確に定義するた
めには、延びた構造より多くの制約条件が必要であるので、らせんシステムでは
二次構造は、最終ＲＭＳＤを下げる。
【０１００】
不正確な制約条件から計算された構造もまた、制約条件の数に応じて品質に影
響を与えた。もし各アミノ酸について、他の全てのアミノ酸が、接触している（
＜１０Å）または接触していない（＞１０Å）と分類できれば、得られるＤＧ生
成構造は、結晶学的構造から平均で２ÅＲＭＳＤ未満である。この結果は、Have
lら(1979)の結果と一致する。
響を与えた。もし各アミノ酸について、他の全てのアミノ酸が、接触している（
＜１０Å）または接触していない（＞１０Å）と分類できれば、得られるＤＧ生
成構造は、結晶学的構造から平均で２ÅＲＭＳＤ未満である。この結果は、Have
lら(1979)の結果と一致する。
【０１０１】
もしこの近接情報を、極性残基間の相互作用についてだけ定義すれば、制約条
件の総数が、ほぼ１／１６に落ちる時、計算された構造の品質は、かなり低下す
る。極性・極性相互作用に関する非接触情報をさらに取り除いても、その組の小
さいタンパク質についてのＲＭＳＤを劇的には増やさなかった（即ち、５９残基
を有するＢＰＴＩおよび７４残基を有するαブンガロトキシン）。しかし、２つ
の最も大きいタンパク質ＦＧＦ−２（１４６残基）およびサイクロフィリンＡ（
１６５残基）については増加が最大であった。
件の総数が、ほぼ１／１６に落ちる時、計算された構造の品質は、かなり低下す
る。極性・極性相互作用に関する非接触情報をさらに取り除いても、その組の小
さいタンパク質についてのＲＭＳＤを劇的には増やさなかった（即ち、５９残基
を有するＢＰＴＩおよび７４残基を有するαブンガロトキシン）。しかし、２つ
の最も大きいタンパク質ＦＧＦ−２（１４６残基）およびサイクロフィリンＡ（
１６５残基）については増加が最大であった。
【０１０２】
実施例２．ＦＧＦモデル研究
ＦＧＦ−２の三次元タンパク質構造を、ＦＧＦ−２にＢＳ３架橋剤を用い、そ
の後ＲＰＬＣ分離およびＭＳ分析（共にＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ）を行って決定
した。ＦＧＦ−２はヘパリンが存在しなければ弱く自己会合するだけであり、高
い塩基性（正味の電荷＝＋１１）で、約１０％のリジンを含む一次配列を有する
ので、ＢＳ３分子間架橋のためには、最適に近いシステムである（Venkataraman
et al. "Preferential self-association of basic fibroblast growth factor
is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation."
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Jan 23, 93(2):845-50）。ホモ二官能性架
橋剤ＢＳ３は、スペーサアーム（長さ１１．４Å）として六炭素アルキル鎖を有
するリシン・リジン架橋剤であり、生理的ｐＨで一級アミンと反応し安定な生成
物を作る２つのＮＨＳエステル基を有する。ＢＳ３の加水分解の半減期は、ｐＨ
７．０で４〜５時間である。ＮＨＳエステルの加水分解は、一級アミンとの反応
と競争し、従って、反応生成物には、ａ）一方の端は加水分解され（片末端が未
結合の架橋剤）、１５６．０８Ｄａの質量が増え、タンパク質に共有結合したＢ
Ｓ３の一端、およびｂ）１３８．０８Ｄａの質量が増え、ＢＳ３と架橋した２つ
のリジンの混合物が含まれる。架橋したペプチド：修飾されたペプチドの比にお
ける、ここの結果で説明した反応の記述は、約１：１であった。
の後ＲＰＬＣ分離およびＭＳ分析（共にＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ）を行って決定
した。ＦＧＦ−２はヘパリンが存在しなければ弱く自己会合するだけであり、高
い塩基性（正味の電荷＝＋１１）で、約１０％のリジンを含む一次配列を有する
ので、ＢＳ３分子間架橋のためには、最適に近いシステムである（Venkataraman
et al. "Preferential self-association of basic fibroblast growth factor
is stabilized by heparin during receptor dimerization and activation."
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Jan 23, 93(2):845-50）。ホモ二官能性架
橋剤ＢＳ３は、スペーサアーム（長さ１１．４Å）として六炭素アルキル鎖を有
するリシン・リジン架橋剤であり、生理的ｐＨで一級アミンと反応し安定な生成
物を作る２つのＮＨＳエステル基を有する。ＢＳ３の加水分解の半減期は、ｐＨ
７．０で４〜５時間である。ＮＨＳエステルの加水分解は、一級アミンとの反応
と競争し、従って、反応生成物には、ａ）一方の端は加水分解され（片末端が未
結合の架橋剤）、１５６．０８Ｄａの質量が増え、タンパク質に共有結合したＢ
Ｓ３の一端、およびｂ）１３８．０８Ｄａの質量が増え、ＢＳ３と架橋した２つ
のリジンの混合物が含まれる。架橋したペプチド：修飾されたペプチドの比にお
ける、ここの結果で説明した反応の記述は、約１：１であった。
【０１０３】
化学架橋：
化学架橋を非常に低いタンパク質濃度（５μＭ）で行い、タンパク質に対する
架橋剤の比を２０：１とし、タンパク質当たり平均１つのリジン−リジン架橋を
行わせた。その主な理由は、天然のタンパク質では不可能な架橋を作るタンパク
質三次元構造の重大な歪み（偽りの距離制約条件）を避けることである。タンパ
ク質当たり１つの架橋は、三次および四次構造を歪ませないことが、結晶構造で
示された（Haniu et al. "Recombinant human erythropoietin (rHuEPO): cross
-linking with disuccinimidyl esters and identification of the interfacin
g domains in EPO." Protein Sci. 1993 Sep, 2(9):1441-51）。単純な単一部位
の修飾は、望む二部位架橋より、構造全体に、かなり小さな歪みしか与えないよ
うである。もし修飾の５０％が架橋による場合には、タンパク質当たり形成させ
る平均の架橋は約１である。
架橋剤の比を２０：１とし、タンパク質当たり平均１つのリジン−リジン架橋を
行わせた。その主な理由は、天然のタンパク質では不可能な架橋を作るタンパク
質三次元構造の重大な歪み（偽りの距離制約条件）を避けることである。タンパ
ク質当たり１つの架橋は、三次および四次構造を歪ませないことが、結晶構造で
示された（Haniu et al. "Recombinant human erythropoietin (rHuEPO): cross
-linking with disuccinimidyl esters and identification of the interfacin
g domains in EPO." Protein Sci. 1993 Sep, 2(9):1441-51）。単純な単一部位
の修飾は、望む二部位架橋より、構造全体に、かなり小さな歪みしか与えないよ
うである。もし修飾の５０％が架橋による場合には、タンパク質当たり形成させ
る平均の架橋は約１である。
【０１０４】
発現系から１ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ−２タンパク質を得、１００ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ ｐＨ ７．５、１Ｍ ＮａＣｌおよび１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む反応緩衝液
中で４℃で一夜透析した。新たに調製した架橋剤にＤＴＴ（最終濃度１０ ｍＭ
）を加え、この溶液を、複数のタンパク質含有反応緩衝液に加えた。用いた架橋
剤は、ホモ二官能性架橋剤スベリン酸ビス［スルフォスクシニミジル］（ＢＳ３
）および酒石酸ジスルフォスクシニミジル（スルフォ・ＤＳＴ）（イリノイ州ロ
ックフォード、ピアス社）で、ＦＧＦ−２タンパク質（５μＭ）に対して２０倍
モル過剰の架橋剤（１００μＭ）を用いた。この反応は、室温で１〜２４時間行
い、１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０を１０ｍＭまで加えることにより反応を止めた。
いくつかの場合には、架橋したＦＧＦ−２を、８Ｍ尿素で変性させ、５０ｍＭ
ＩＡＭを加えることによってシステイン残基を保護した。ゲル濾過精製およびタ
ンパク質分解の前に、変性したＦＧＦ−２を、４℃で、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ
１０で濾過することにより濃縮した。
Ｓ ｐＨ ７．５、１Ｍ ＮａＣｌおよび１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む反応緩衝液
中で４℃で一夜透析した。新たに調製した架橋剤にＤＴＴ（最終濃度１０ ｍＭ
）を加え、この溶液を、複数のタンパク質含有反応緩衝液に加えた。用いた架橋
剤は、ホモ二官能性架橋剤スベリン酸ビス［スルフォスクシニミジル］（ＢＳ３
）および酒石酸ジスルフォスクシニミジル（スルフォ・ＤＳＴ）（イリノイ州ロ
ックフォード、ピアス社）で、ＦＧＦ−２タンパク質（５μＭ）に対して２０倍
モル過剰の架橋剤（１００μＭ）を用いた。この反応は、室温で１〜２４時間行
い、１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０を１０ｍＭまで加えることにより反応を止めた。
いくつかの場合には、架橋したＦＧＦ−２を、８Ｍ尿素で変性させ、５０ｍＭ
ＩＡＭを加えることによってシステイン残基を保護した。ゲル濾過精製およびタ
ンパク質分解の前に、変性したＦＧＦ−２を、４℃で、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ
１０で濾過することにより濃縮した。
【０１０５】
ゲル濾過クロマトグラフィ：
架橋の後、ＦＧＦ−２の単量体および二量体を分離するために、ゲル濾過クロ
マトグラフィ（ＳＥＣ）を行った。化学架橋は、理論的には、分子内架橋（１つ
のタンパク質上の２つの架橋したアミノ酸）と分子間架橋（相互に架橋した２つ
のタンパク質）の両方を起こし得る。架橋したＦＧＦ−２の単量体と二量体を分
離するために、ＴｏｓｏＨａａｓ Ｇ２０００（２．０×６０ ｃｍ）を付けた
ギルソンＨＰＬＣシステムを用いて変性条件下でゲル濾過クロマトグラフィを行
った。カラムは、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、８Ｍ尿素、および
１ｍＭ ＤＴＴ、流速１ｍｌ／ｍｉｎで平衡化した。単量体および二量体タンパ
ク質の画分を集め、４℃でＣｅｎｔｅｒｃｏｎ １０濾過で濃縮した。非変性Ｓ
ＥＣは、二本のＢｉｏ・Ｓｉｌｅｃｔ ＳＥＣ １２５・５カラム（３００×７
．８ｍｍ）を用いて行った。カラムは、１００ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ７．
０で平衡化した。溶出は、１ｍｌ／ｍｉｎでＫｒａｔｏｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌ
ｏｗ ７８３吸光度検出器で分光学的にモニターした。
マトグラフィ（ＳＥＣ）を行った。化学架橋は、理論的には、分子内架橋（１つ
のタンパク質上の２つの架橋したアミノ酸）と分子間架橋（相互に架橋した２つ
のタンパク質）の両方を起こし得る。架橋したＦＧＦ−２の単量体と二量体を分
離するために、ＴｏｓｏＨａａｓ Ｇ２０００（２．０×６０ ｃｍ）を付けた
ギルソンＨＰＬＣシステムを用いて変性条件下でゲル濾過クロマトグラフィを行
った。カラムは、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、８Ｍ尿素、および
１ｍＭ ＤＴＴ、流速１ｍｌ／ｍｉｎで平衡化した。単量体および二量体タンパ
ク質の画分を集め、４℃でＣｅｎｔｅｒｃｏｎ １０濾過で濃縮した。非変性Ｓ
ＥＣは、二本のＢｉｏ・Ｓｉｌｅｃｔ ＳＥＣ １２５・５カラム（３００×７
．８ｍｍ）を用いて行った。カラムは、１００ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ７．
０で平衡化した。溶出は、１ｍｌ／ｍｉｎでＫｒａｔｏｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌ
ｏｗ ７８３吸光度検出器で分光学的にモニターした。
【０１０６】
タンパク質試料から二量体のＳＥＣ分離を行った後、積み重ね手順に従って、
試料を、１５％ゲルを用いるＳＤＳ・ＰＡＧＥにかけた（Laemmli "Cleavage of
structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4
." Nature 1940 Aug 15, 227(259):680-5））。ミオシン（２０９ｋＤａ）、β
ガラクトシダーゼ（１２５ｋＤａ）、ＢＳＡ （７０ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（
４２．８ｋＤａ）、大豆トリプシン阻害剤（３２．６ｋＤａ）、リゾチーム（１
７．６ｋＤａ）およびアプロチニン（７．５ｋＤａ）の各分子量のタンパク質を
含む予め染色した標準タンパク質混合物は、Ｂｉｏｒａｄから購入した。
試料を、１５％ゲルを用いるＳＤＳ・ＰＡＧＥにかけた（Laemmli "Cleavage of
structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4
." Nature 1940 Aug 15, 227(259):680-5））。ミオシン（２０９ｋＤａ）、β
ガラクトシダーゼ（１２５ｋＤａ）、ＢＳＡ （７０ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（
４２．８ｋＤａ）、大豆トリプシン阻害剤（３２．６ｋＤａ）、リゾチーム（１
７．６ｋＤａ）およびアプロチニン（７．５ｋＤａ）の各分子量のタンパク質を
含む予め染色した標準タンパク質混合物は、Ｂｉｏｒａｄから購入した。
【０１０７】
キャピラリーＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ，ＰＳＤ質量スペクトロメトリ
： 架橋したＦＧＦ−２を分析するために、単量体画分をトリプシンで消化した。
トリプシン消化は３７℃で行い、トリプシン／タンパク質の比を１：２０とした
。１６時間後、その消化液に再度トリプシンを加え（トリプシン：タンパク質の
比は再度１：２０）、３７℃で２時間インキュベーションを続けた。ＰＭＳＦを
５ｍＭまで加えることにより酵素反応を止めた。得られるペプチド混合物は、未
修飾および修飾ペプチドを含んでいた。修飾されたＦＧＦ−２トリプシン消化物
のクロマトグラム（図１６）は、非修飾ＦＧＦ−２のクロマトグラムとはかなり
異なり、修飾されたペプチドの存在が示唆された。陰をつけたピークは、Ｔｈｒ
１２１・Ｌｙｓ１２９に結合したＴｙｒ７３・Ｌｙｓ８６等の、いくつかの架橋
したペプチドを含む、ある選ばれた画分であり、正確な質量ｍ／ｚ＝２７３９．
４を有する。そのＭＡＬＤＩおよびＰＳＤスペクトルを図１７および図１８にそ
れぞれ示す。ラベルされたピークは、質量スペクトロメトリによって、架橋した
ペプチドであることが後で同定された。ＢＳ３架橋剤アームは疎水性であるから
、架橋したペプチドは、すべて、勾配の後の部分に出てきた。
： 架橋したＦＧＦ−２を分析するために、単量体画分をトリプシンで消化した。
トリプシン消化は３７℃で行い、トリプシン／タンパク質の比を１：２０とした
。１６時間後、その消化液に再度トリプシンを加え（トリプシン：タンパク質の
比は再度１：２０）、３７℃で２時間インキュベーションを続けた。ＰＭＳＦを
５ｍＭまで加えることにより酵素反応を止めた。得られるペプチド混合物は、未
修飾および修飾ペプチドを含んでいた。修飾されたＦＧＦ−２トリプシン消化物
のクロマトグラム（図１６）は、非修飾ＦＧＦ−２のクロマトグラムとはかなり
異なり、修飾されたペプチドの存在が示唆された。陰をつけたピークは、Ｔｈｒ
１２１・Ｌｙｓ１２９に結合したＴｙｒ７３・Ｌｙｓ８６等の、いくつかの架橋
したペプチドを含む、ある選ばれた画分であり、正確な質量ｍ／ｚ＝２７３９．
４を有する。そのＭＡＬＤＩおよびＰＳＤスペクトルを図１７および図１８にそ
れぞれ示す。ラベルされたピークは、質量スペクトロメトリによって、架橋した
ペプチドであることが後で同定された。ＢＳ３架橋剤アームは疎水性であるから
、架橋したペプチドは、すべて、勾配の後の部分に出てきた。
【０１０８】
架橋したペプチドの同定は、オンラインＬＣ／ＭＳまたはオフライン逆相キャ
ピラリＨＰＬＣで行い、後の場合には、画分を集めた。架橋したＦＧＦ−２混合
物の質量は、カリフォルニア州フォスター市のパースペクティーブ・バイオシス
テムズ社から購入したＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ・ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦで測
定した。この装置は、窒素レーザー（３３７ｎｍ）、遅延抽出光学および２０ｋ
Ｖの加速電圧を使用した。すべての場合、ペプチド画分はアセトニトリル／メタ
ノール（１：１； ｖ／ｖ）中３３ｍＭのα・シアノ・４・ヒドロキシ桂皮酸と
混合し、金メッキしたＭＡＬＤＩ標的上で風乾させた。限られた配列情報を得る
ために、選ばれた架橋ペプチドのプロトン化イオン（ＭＨ＋）から、後源崩壊（
ＰＳＤ）スペクトルを得た。ＰＳＤの説明に関しては、Kaufmann et al. "Mass
spectrometric sequencing of linear peptides by product-ion analysis in a
reflection time-of-flight mass spectrometer using matrix-assisted laser
desorption ionization." Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993 Oct, 7(19):90
2-10を参照。ＰＳＤ実験は、電圧が９〜１１ステップ変えられる一組の反射レン
ズを通して、各ステップで電圧を前のステップの７５％まで下げながら焦点を合
わせた後、前駆体ペプチドイオンを選択的に飛び出させ、その準安定断片を解析
することにより行った。完全なＰＳＤスペクトルは、個別に焦点を合わせた断片
を一緒にステッチすることによって作った。ＰＳＤモードでの質量校正は、標準
ペプチドＡＣＴＨ １８・３９由来の断片イオンを用いて行った。（非修飾ＦＧ
Ｆ−２と比べて）約２５０Ｄａの平均質量シフトを有する広いピークが観察され
た。
ピラリＨＰＬＣで行い、後の場合には、画分を集めた。架橋したＦＧＦ−２混合
物の質量は、カリフォルニア州フォスター市のパースペクティーブ・バイオシス
テムズ社から購入したＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ・ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦで測
定した。この装置は、窒素レーザー（３３７ｎｍ）、遅延抽出光学および２０ｋ
Ｖの加速電圧を使用した。すべての場合、ペプチド画分はアセトニトリル／メタ
ノール（１：１； ｖ／ｖ）中３３ｍＭのα・シアノ・４・ヒドロキシ桂皮酸と
混合し、金メッキしたＭＡＬＤＩ標的上で風乾させた。限られた配列情報を得る
ために、選ばれた架橋ペプチドのプロトン化イオン（ＭＨ＋）から、後源崩壊（
ＰＳＤ）スペクトルを得た。ＰＳＤの説明に関しては、Kaufmann et al. "Mass
spectrometric sequencing of linear peptides by product-ion analysis in a
reflection time-of-flight mass spectrometer using matrix-assisted laser
desorption ionization." Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993 Oct, 7(19):90
2-10を参照。ＰＳＤ実験は、電圧が９〜１１ステップ変えられる一組の反射レン
ズを通して、各ステップで電圧を前のステップの７５％まで下げながら焦点を合
わせた後、前駆体ペプチドイオンを選択的に飛び出させ、その準安定断片を解析
することにより行った。完全なＰＳＤスペクトルは、個別に焦点を合わせた断片
を一緒にステッチすることによって作った。ＰＳＤモードでの質量校正は、標準
ペプチドＡＣＴＨ １８・３９由来の断片イオンを用いて行った。（非修飾ＦＧ
Ｆ−２と比べて）約２５０Ｄａの平均質量シフトを有する広いピークが観察され
た。
【０１０９】
ペプチド内（Ｋ４６・Ｋ５２）およびペプチド間（Ｋ２６・Ｋ４６）架橋の割
当ては、１８の架橋のそれぞれが、どのように割り当てられたかの典型的な例で
ある。図１７は、トリプシン消化物からの画分の１つのＭＡＬＤＩ・ＴＯＦスペ
クトルを示す。各スペクトルは、近似的外部標準を用いて校正された。各スペク
トルについて、質量リストが作られ、本発明の計算機上の特徴で上述したように
、手作りのソフトウェアＡＳＡＰを用いて質量の割り当てを行った。簡単に言え
ば、このプログラムは、特定の酵素での、あるタンパク質の予測された断片化に
基づいて架橋したタンパク質断片を同定することができる。
当ては、１８の架橋のそれぞれが、どのように割り当てられたかの典型的な例で
ある。図１７は、トリプシン消化物からの画分の１つのＭＡＬＤＩ・ＴＯＦスペ
クトルを示す。各スペクトルは、近似的外部標準を用いて校正された。各スペク
トルについて、質量リストが作られ、本発明の計算機上の特徴で上述したように
、手作りのソフトウェアＡＳＡＰを用いて質量の割り当てを行った。簡単に言え
ば、このプログラムは、特定の酵素での、あるタンパク質の予測された断片化に
基づいて架橋したタンパク質断片を同定することができる。
【０１１０】
３つのトリプシンペプチドが割り当てられた。１つのペプチド内架橋および１
つのペプチド間架橋は、この特定の画分での誤差が１００ｐｐｍ以内。その３つ
のトリプシンペプチドは同定が容易である。質量は、ペプチド２７Ｎ・３３Ｒ
（Ｍ＋Ｈ＋＝８１０．４９）、１１１Ｙ・１１９Ｋ （Ｍ＋Ｈ＋＝１１１６．６
３３）および１１０Ｋ・１１９Ｋ （Ｍ＋Ｈ＋＝１２２４．７３）に一致する。
イオンｍ／ｚ ２０５９．０５がペプチド内架橋であると同定された。このイオ
ンの全質量は、ペプチド４５Ｅ・６０Ｒの質量（Ｍ＋Ｈ＋＝１９２１．００Ｄａ
）と架橋剤アームの質量（１３８．０８Ｄａ）の和である。このペプチド（ＥＫ
ＳＤＰＨＩＫＬＱＬＱＡＥＥＲ）には２つの内部リジンしかないので、リジン４
６は恐らくリジン５２と架橋しているであろう。この割り当ては、ＭＡＬＤＩ・
ＳＰＤ（後源崩壊）実験（図１９ａ）によって確認された。低分子領域では、Ｐ
／Ｒ、Ｇ／Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｉ／Ｌのアミノ酸アンモニウムイオンが観察され、この
ペプチドのアミノ酸組成を与えた。３つのＮ末端断片（ｍ／ｚ １０７４、ｍ／
ｚ １１８７、ｍ／ｚ １３１５）および３つのＣ末端断片（ｍ／ｚ ９８８、
ｍ／ｚ ８７４、ｍ／ｚ ７４６）は、ペプチドの割り当ておよび架橋の位置と
一致した。ＰＳＤデータは、このように、リジン５２と架橋したリジン４６を有
するペプチド４５Ｅ・６０Ｒとしてイオンｍ／ｚ ２０５９．０５という我々の
割り当てを確認した。
つのペプチド間架橋は、この特定の画分での誤差が１００ｐｐｍ以内。その３つ
のトリプシンペプチドは同定が容易である。質量は、ペプチド２７Ｎ・３３Ｒ
（Ｍ＋Ｈ＋＝８１０．４９）、１１１Ｙ・１１９Ｋ （Ｍ＋Ｈ＋＝１１１６．６
３３）および１１０Ｋ・１１９Ｋ （Ｍ＋Ｈ＋＝１２２４．７３）に一致する。
イオンｍ／ｚ ２０５９．０５がペプチド内架橋であると同定された。このイオ
ンの全質量は、ペプチド４５Ｅ・６０Ｒの質量（Ｍ＋Ｈ＋＝１９２１．００Ｄａ
）と架橋剤アームの質量（１３８．０８Ｄａ）の和である。このペプチド（ＥＫ
ＳＤＰＨＩＫＬＱＬＱＡＥＥＲ）には２つの内部リジンしかないので、リジン４
６は恐らくリジン５２と架橋しているであろう。この割り当ては、ＭＡＬＤＩ・
ＳＰＤ（後源崩壊）実験（図１９ａ）によって確認された。低分子領域では、Ｐ
／Ｒ、Ｇ／Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｉ／Ｌのアミノ酸アンモニウムイオンが観察され、この
ペプチドのアミノ酸組成を与えた。３つのＮ末端断片（ｍ／ｚ １０７４、ｍ／
ｚ １１８７、ｍ／ｚ １３１５）および３つのＣ末端断片（ｍ／ｚ ９８８、
ｍ／ｚ ８７４、ｍ／ｚ ７４６）は、ペプチドの割り当ておよび架橋の位置と
一致した。ＰＳＤデータは、このように、リジン５２と架橋したリジン４６を有
するペプチド４５Ｅ・６０Ｒとしてイオンｍ／ｚ ２０５９．０５という我々の
割り当てを確認した。
【０１１１】
イオンｍ／ｚ ２４６５．３１は、ペプチド間架橋として割り当てられた。全
質量は、２つのトリプシン消化ペプチド２３Ｌ・３３Ｒ（Ｍ＝１３１６．６６
Ｄａ）、４５Ｅ・５２Ｋ（Ｍ＝９５２．４８７ Ｄａ）、架橋剤アーム（Ｍ＝１
３８．０８３ Ｄａ）、および１つのプロトンの合計である。表面ラベル化実験
（データは示さず）から、ＮＨＳエステルによって修飾されるリジンは、トリプ
シンによって認識されず、切断されなかった。これは、Ｃ末端リジン５２が、修
飾部位にはなり得ないことを示す。従って、唯一の可能性は、リジン２６とリジ
ン４６間の架橋である。選ばれた親イオンｍ／ｚ ２４６５．３１（図１９ｂ）
は、低分子量領域において、Ｐ／Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、およびＹに対するアンモ
ニウムイオンを示した。”α”はペプチド鎖２３Ｌ・３３Ｒを表し、”β”はペ
プチド鎖４５Ｅ・５２Ｋを表すために用いられる。最も多い断片イオンは、ｍ／
ｚ ６９６．４であり、ｙ６αおよびｙ６βの両方に一致する。イオンｍ／ｚ
１９７４．７は、ｂ４βに一致する。ＰＳＤスペクトルの断片の９０％が、その
割り当てに一致し、ペプチド２３・３３と４５・５２はＫ２６・Ｋ４６で架橋し
ていることが確認された。
質量は、２つのトリプシン消化ペプチド２３Ｌ・３３Ｒ（Ｍ＝１３１６．６６
Ｄａ）、４５Ｅ・５２Ｋ（Ｍ＝９５２．４８７ Ｄａ）、架橋剤アーム（Ｍ＝１
３８．０８３ Ｄａ）、および１つのプロトンの合計である。表面ラベル化実験
（データは示さず）から、ＮＨＳエステルによって修飾されるリジンは、トリプ
シンによって認識されず、切断されなかった。これは、Ｃ末端リジン５２が、修
飾部位にはなり得ないことを示す。従って、唯一の可能性は、リジン２６とリジ
ン４６間の架橋である。選ばれた親イオンｍ／ｚ ２４６５．３１（図１９ｂ）
は、低分子量領域において、Ｐ／Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｒ、Ｆ、およびＹに対するアンモ
ニウムイオンを示した。”α”はペプチド鎖２３Ｌ・３３Ｒを表し、”β”はペ
プチド鎖４５Ｅ・５２Ｋを表すために用いられる。最も多い断片イオンは、ｍ／
ｚ ６９６．４であり、ｙ６αおよびｙ６βの両方に一致する。イオンｍ／ｚ
１９７４．７は、ｂ４βに一致する。ＰＳＤスペクトルの断片の９０％が、その
割り当てに一致し、ペプチド２３・３３と４５・５２はＫ２６・Ｋ４６で架橋し
ていることが確認された。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
オンラインＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ：
いくつかのトリプシン消化物もまたオンラインＨＰＬＣおよび電子スプレーイ
オン化飛行時間（ＥＳＩ・ＴＯＦ）質量スペクトロメトリを用いて分析した。ペ
プチドをＲＰ・ＨＰＬＣで分離し、質量スペクトロメータのイオン源に直接溶出
させた。ＥＳＩ・ＴＯＦ質量スペクトルは、アプライド・バイオシステムズ７５
９Ａ吸光度検出器付アプライド・バイオシステムズ１４０Ｂ溶媒送達システムと
つなげたマリナー電子スプレーイオン化飛行時間質量スペクトロメータを用いて
得た。溶媒Ａは、水中０．１％ギ酸。溶媒Ｂは、エタノール／プロパノール（５
／２）中０．０５％ギ酸。濃度勾配は、７０分で１０％Ｂから６０％Ｂ。
オン化飛行時間（ＥＳＩ・ＴＯＦ）質量スペクトロメトリを用いて分析した。ペ
プチドをＲＰ・ＨＰＬＣで分離し、質量スペクトロメータのイオン源に直接溶出
させた。ＥＳＩ・ＴＯＦ質量スペクトルは、アプライド・バイオシステムズ７５
９Ａ吸光度検出器付アプライド・バイオシステムズ１４０Ｂ溶媒送達システムと
つなげたマリナー電子スプレーイオン化飛行時間質量スペクトロメータを用いて
得た。溶媒Ａは、水中０．１％ギ酸。溶媒Ｂは、エタノール／プロパノール（５
／２）中０．０５％ギ酸。濃度勾配は、７０分で１０％Ｂから６０％Ｂ。
【０１１４】
概して、ＭＡＬＤＩ・ＴＯＦまたはＥＳＩ・ＴＯＦ質量スペクトロメータで１
００ｐｐｍの質量精度が達成された。内部標準を用いて、２０ｐｐｍに達する、
より高い精度が達成された。全部で１８の質量が、架橋ペプチドにユニークに割
り当てられた。
００ｐｐｍの質量精度が達成された。内部標準を用いて、２０ｐｐｍに達する、
より高い精度が達成された。全部で１８の質量が、架橋ペプチドにユニークに割
り当てられた。
【０１１５】
制約されたスレッディング：
「制約されたスレッディング」手法が、折り畳み認識に用いられた。第一ステ
ップとして、ウシＦＧＦ−２配列（ＦＧＦ２＿ＢＯＶＩＮ）を、折り畳み予測用
スレッディングプログラム１２３Ｄで処理した（Alexandrov等、1996）。１２３
Ｄプログラムは、６３５の配列ユニーク・タンパク質のデータベースをスレッデ
ィングする際に発見された得点上位２０の配列構造位置合わせを出力した（Hobo
hrn等、1997）。ＦＧＦ−２配列に関する１２３Ｄスレッディングアルゴリズム
によって発見された上位２０の配列構造組を表２に示す。
ップとして、ウシＦＧＦ−２配列（ＦＧＦ２＿ＢＯＶＩＮ）を、折り畳み予測用
スレッディングプログラム１２３Ｄで処理した（Alexandrov等、1996）。１２３
Ｄプログラムは、６３５の配列ユニーク・タンパク質のデータベースをスレッデ
ィングする際に発見された得点上位２０の配列構造位置合わせを出力した（Hobo
hrn等、1997）。ＦＧＦ−２配列に関する１２３Ｄスレッディングアルゴリズム
によって発見された上位２０の配列構造組を表２に示す。
【０１１６】
【表２】
【０１１７】
各組が、ＦＧＦ−２配列に対する構造モデルを定義する。上位２０の配列構造
組の内、３つのβ三つ葉タンパク質は、位置１（ＦＧＦ−２： ４ＦＧＦ）、５
（ＩＬ・１β）、および１２（ヒスアクトフィリン：１ＨＣＥ）である。ＦＧＦ
−２構造４ＦＧＦは、組換え配列と９８％以上の同一性を有し、それがスレッデ
ィングアルゴリズムによって第一位になった理由を部分的に説明している。しか
し、もし繊維芽細胞増殖因子の構造がスレッディングデータベースの中になけれ
ば、スレッディングアルゴリズムは、ＦＧＦ−２の折り畳みファミリーを、Ｄ・
ＵＴＰアーゼ、βクリップタンパク質の折り畳みファミリーであると誤って予測
するであろう。
組の内、３つのβ三つ葉タンパク質は、位置１（ＦＧＦ−２： ４ＦＧＦ）、５
（ＩＬ・１β）、および１２（ヒスアクトフィリン：１ＨＣＥ）である。ＦＧＦ
−２構造４ＦＧＦは、組換え配列と９８％以上の同一性を有し、それがスレッデ
ィングアルゴリズムによって第一位になった理由を部分的に説明している。しか
し、もし繊維芽細胞増殖因子の構造がスレッディングデータベースの中になけれ
ば、スレッディングアルゴリズムは、ＦＧＦ−２の折り畳みファミリーを、Ｄ・
ＵＴＰアーゼ、βクリップタンパク質の折り畳みファミリーであると誤って予測
するであろう。
【０１１８】
距離制約条件に対する補正：
次に、これらの２０のスレッディングモデルを次式を用いて全制約条件誤差Ｅ
ｔを計算することによって、我々の実験由来距離制約条件への適合を計算した：
ｔを計算することによって、我々の実験由来距離制約条件への適合を計算した：
【０１１９】
【数３】
【０１２０】
Ｅｔは全制約条件誤差、ｉは距離制約条件の数、ｄ０は組距離分離、ｄｊは制
約条件ｊでの２つの残基について構造によって定義される組距離。このように、
ｄｊは候補のスレッディングモデルで観察される距離である。もしｄｊがリンカ
ーアームの長さで定義される距離ｄ０より小さいか等しければ、制約条件ｊが寄
与する制約条件誤差は存在しない。もしｄｊがｄ０より大きければ、制約条件誤
差は、これらの距離間の差と定義される。２３．８５Åという距離は、ＢＳ３に
よって架橋された２つのリジンによって確保することができる理論的最大空間距
離である。いくつかの場合の制約条件は、結晶構造における非解像領域または配
列位置合わせにおける隙間のために定義できなかった。不自然に低い制約条件誤
差を有するモデルを考慮することを避けるために、組制約条件の５０％を越える
配列構造モデルだけを評価した。上位２０のスレッディングモデルを制約条件誤
差が増える順にランク付けした（表３）。
約条件ｊでの２つの残基について構造によって定義される組距離。このように、
ｄｊは候補のスレッディングモデルで観察される距離である。もしｄｊがリンカ
ーアームの長さで定義される距離ｄ０より小さいか等しければ、制約条件ｊが寄
与する制約条件誤差は存在しない。もしｄｊがｄ０より大きければ、制約条件誤
差は、これらの距離間の差と定義される。２３．８５Åという距離は、ＢＳ３に
よって架橋された２つのリジンによって確保することができる理論的最大空間距
離である。いくつかの場合の制約条件は、結晶構造における非解像領域または配
列位置合わせにおける隙間のために定義できなかった。不自然に低い制約条件誤
差を有するモデルを考慮することを避けるために、組制約条件の５０％を越える
配列構造モデルだけを評価した。上位２０のスレッディングモデルを制約条件誤
差が増える順にランク付けした（表３）。
【０１２１】
【表３】
【０１２２】
結晶構造テンプレートにおける位置合わせまたは非解像領域における隙間によ
って定義される制約条件が５０％未満の２つの構造モデル２ＰＨＹおよび２ＰＬ
ＤＡを捨てた。制約条件誤差の計算の後、スレッディングアルゴリズムによって
１、５、および１２位にランク付けされたβ三つ葉折り畳みファミリーに属する
ものを、表３の１、２、および４に再びランク付けした。それらは、それぞれ、
ＦＧＦ−２、ＩＬ・１β、およびヒスアクトフィリンである。この場合、もしＦ
ＧＦ−２の構造が未知であったならば、ＦＧＦ−２とＩＬ・１βの位置合わせの
配列の同一性が１３％未満であるとしても、ＦＧＦ−２はＩＬ・１βと同じ折り
畳みを有すると正しく予測されるであろう。
って定義される制約条件が５０％未満の２つの構造モデル２ＰＨＹおよび２ＰＬ
ＤＡを捨てた。制約条件誤差の計算の後、スレッディングアルゴリズムによって
１、５、および１２位にランク付けされたβ三つ葉折り畳みファミリーに属する
ものを、表３の１、２、および４に再びランク付けした。それらは、それぞれ、
ＦＧＦ−２、ＩＬ・１β、およびヒスアクトフィリンである。この場合、もしＦ
ＧＦ−２の構造が未知であったならば、ＦＧＦ−２とＩＬ・１βの位置合わせの
配列の同一性が１３％未満であるとしても、ＦＧＦ−２はＩＬ・１βと同じ折り
畳みを有すると正しく予測されるであろう。
【０１２３】
三位にランクされた構造、脂肪酸結合タンパク質（１ＥＡＬ）は、リポカイン
折り畳みファミリーの一員であり、β三つ葉ファミリーと多くの特徴を共有して
いる。リポカインファミリーは、曲折モチーフを有する閉じたまたは開いた樽に
よって特徴付けられる（Ｍｕｒｚｉｎ等、１９９５）。β三つ葉折り畳みファミ
リーは、同様に、曲折モチーフおよびヘアピントリプレットを有する閉じた樽を
含む。脂肪酸結合タンパク質の構造は、βヘアピン挿入を有する開いた１０鎖の
β樽で、４７残基にわたり、３．６ÅのＲＭＳＤを有するＦＧＦ−２と位置合わ
せ可能である（Holm et al. "Protein Structure Comparison by Alignment of
Distance Matrices." J Mol Bio. 1993 233:123-38）。リポカイン折り畳みファ
ミリーの別の一員、レチノール結合タンパク質（１ＨＢＱ）は、８位にランクさ
れ、８鎖の閉じたβ樽を含む。
折り畳みファミリーの一員であり、β三つ葉ファミリーと多くの特徴を共有して
いる。リポカインファミリーは、曲折モチーフを有する閉じたまたは開いた樽に
よって特徴付けられる（Ｍｕｒｚｉｎ等、１９９５）。β三つ葉折り畳みファミ
リーは、同様に、曲折モチーフおよびヘアピントリプレットを有する閉じた樽を
含む。脂肪酸結合タンパク質の構造は、βヘアピン挿入を有する開いた１０鎖の
β樽で、４７残基にわたり、３．６ÅのＲＭＳＤを有するＦＧＦ−２と位置合わ
せ可能である（Holm et al. "Protein Structure Comparison by Alignment of
Distance Matrices." J Mol Bio. 1993 233:123-38）。リポカイン折り畳みファ
ミリーの別の一員、レチノール結合タンパク質（１ＨＢＱ）は、８位にランクさ
れ、８鎖の閉じたβ樽を含む。
【０１２４】
制約条件誤差に基づいて、上位得点の配列構造組を再び順位付けすることは、
β三つ葉折り畳みファミリーに対して強い予測を可能にする。このファミリーの
メンバーは、リストの上位４つの地位の内３つを占める。さらに、それは、実験
データと完全に一致する構造の代表（ＩＬ・１β）を含む唯一のファミリーであ
る。ＦＧＦ−２の構造が未知であったと仮定すれば、ＩＬ・１βの構造は、ＦＧ
Ｆ−２配列の類似性モデルを構築する合理的な出発点であろう。
β三つ葉折り畳みファミリーに対して強い予測を可能にする。このファミリーの
メンバーは、リストの上位４つの地位の内３つを占める。さらに、それは、実験
データと完全に一致する構造の代表（ＩＬ・１β）を含む唯一のファミリーであ
る。ＦＧＦ−２の構造が未知であったと仮定すれば、ＩＬ・１βの構造は、ＦＧ
Ｆ−２配列の類似性モデルを構築する合理的な出発点であろう。
【０１２５】
スペクトル割り当て：
我々の実験データの解釈での助けとなるように、質量スペクトロメトリ解析プ
ログラムが開発された。このプログラムは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ配列、質量／電
荷リスト、架橋剤の質量、最大許容質量誤差、タンパク質分解酵素、質量の型、
最大電荷状態、および最小ピーク量の入力を要求する。既知のタンパク質配列お
よびタンパク質分解の特異性に基づいて、ペプチドの仮想加水分解ライブラリを
構築する。このライブラリの各ペプチドを、単一同位体または平均質量によって
指標化する。アミノ酸修飾、ペプチド内ラベリング、および／またはペプチド間
架橋を、この仮想ライブラリに表示する。それぞれの非割り当て質量に対して、
このプログラムは、ユーザが定義した誤差閾値内の質量を有する代表例を求めて
、その仮想ライブラリを検索する。もし一致するものが見つからなければ、その
プログラムは、実験の質量の誤差閾値内の付加的質量を有する架橋可能なペプチ
ド対を求めて、そのライブラリをコンビナトリアル的に検索する。それぞれの質
量について、ＡＳＡＰは、可能な割り当ておよび理論的質量と比べた各割り当て
の質量誤差を列挙する。
ログラムが開発された。このプログラムは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ配列、質量／電
荷リスト、架橋剤の質量、最大許容質量誤差、タンパク質分解酵素、質量の型、
最大電荷状態、および最小ピーク量の入力を要求する。既知のタンパク質配列お
よびタンパク質分解の特異性に基づいて、ペプチドの仮想加水分解ライブラリを
構築する。このライブラリの各ペプチドを、単一同位体または平均質量によって
指標化する。アミノ酸修飾、ペプチド内ラベリング、および／またはペプチド間
架橋を、この仮想ライブラリに表示する。それぞれの非割り当て質量に対して、
このプログラムは、ユーザが定義した誤差閾値内の質量を有する代表例を求めて
、その仮想ライブラリを検索する。もし一致するものが見つからなければ、その
プログラムは、実験の質量の誤差閾値内の付加的質量を有する架橋可能なペプチ
ド対を求めて、そのライブラリをコンビナトリアル的に検索する。それぞれの質
量について、ＡＳＡＰは、可能な割り当ておよび理論的質量と比べた各割り当て
の質量誤差を列挙する。
【０１２６】
類似性モデリング：
リジン・リジン架橋に由来する距離制約条件情報は、一組の上位得点スレッデ
ィングモデルに存在するＦＧＦ−２の構造に似た構造に対して選択的であった。
特に、ＩＬ・１βの構造は、実験由来距離制約条件（ＦＧＦ−２の次にランク）
と最も整合性があり、ＦＧＦ−２（β三つ葉）と同じ折り畳みを有する。次に、
ＩＬ・１β構造に対する、ＦＧＦ−２のスレッディング位置合わせを、ＦＧＦ−
２の４．８Å類似性モデルの構築における出発点として用いた。
ィングモデルに存在するＦＧＦ−２の構造に似た構造に対して選択的であった。
特に、ＩＬ・１βの構造は、実験由来距離制約条件（ＦＧＦ−２の次にランク）
と最も整合性があり、ＦＧＦ−２（β三つ葉）と同じ折り畳みを有する。次に、
ＩＬ・１β構造に対する、ＦＧＦ−２のスレッディング位置合わせを、ＦＧＦ−
２の４．８Å類似性モデルの構築における出発点として用いた。
【０１２７】
このモデルは、ＩＬ・１β構造に対する、ＦＧＦ−２配列のスレッディング位
置合わせに基づいた。図２０に、類似性モデリングに使用したＩＬ・１βおよび
ＦＧＦ−２のスレッディング位置合わせを示す。このスレッディング位置合わせ
は、その類似性モデルの１１９のアミノ酸を定義した。この位置合わせに基づい
て構築されたモデルの全骨格ＲＭＳＤは８．６３Åである。もし、あまり位置合
わせされていないＮ末端領域を、この位置合わせから除けば、ＲＭＳＤは、９８
のアミノ酸にわたり、４．７６Åに改善される。図２１に、類似性モデリング後
の構造と、実際のタンパク質の構造間の一致を示す。このＲＭＳＤは、配列位置
合わせにおいて、平均して、１アミノ酸のフレームシフトで期待される値に等し
い。
置合わせに基づいた。図２０に、類似性モデリングに使用したＩＬ・１βおよび
ＦＧＦ−２のスレッディング位置合わせを示す。このスレッディング位置合わせ
は、その類似性モデルの１１９のアミノ酸を定義した。この位置合わせに基づい
て構築されたモデルの全骨格ＲＭＳＤは８．６３Åである。もし、あまり位置合
わせされていないＮ末端領域を、この位置合わせから除けば、ＲＭＳＤは、９８
のアミノ酸にわたり、４．７６Åに改善される。図２１に、類似性モデリング後
の構造と、実際のタンパク質の構造間の一致を示す。このＲＭＳＤは、配列位置
合わせにおいて、平均して、１アミノ酸のフレームシフトで期待される値に等し
い。
【０１２８】
ＦＧＦ−２とＩＬ・１βが２０％未満の配列同一性しか持たないとしても、こ
のモデルはＦＧＦ−２構造の突出した姿を捕まえる。ＦＧＦ−２構造の核にある
β鎖を、正確に位置付けする。当然ながら、配列の位置合わせおよびモデリング
の誤差は主にループ領域に生じる。限られた類似性しか持たない配列では一般に
正確にモデル化することが困難な領域である（Hilbert et al. "Structural rel
ationships of homologous proteins as a functional principle in homology
modeling." Proteins. 1993, 17(2):138-51）。Ｎ末端の２０のアミノ酸もまた
、スレッディングアルゴリズムによっては、うまく位置合わせされない。ＩＬ・
１βおよび４ＦＧＦ構造（１０１残基にわたり２．７Å ＲＭＳＤ）のＤＡＬＩ
構造位置合わせによって定義される「正しい」位置合わせは、Ｎ末端領域では、
相当異なる（Ｈｏｌｍ等、１９９３）。ＦＧＦ−２と比べてＩＬ・１βの挿入に
より、その構造に残された隙間は、Ｔｒｉｐｏｓ Ｓｙｂｙｌ ６．４を用いる
１００ステップのエネルギ最小化によって閉じられた。結晶構造骨格へのモデル
の最小二乗偏差（ＲＭＳＤ）を、モデル中の等価な残基を結晶構造における残基
へ、位置合わせすることによって計算した。我々の類似性モデルに対して我々が
期待できた最低のＲＭＳＤは、この構造位置合わせに対応する。
のモデルはＦＧＦ−２構造の突出した姿を捕まえる。ＦＧＦ−２構造の核にある
β鎖を、正確に位置付けする。当然ながら、配列の位置合わせおよびモデリング
の誤差は主にループ領域に生じる。限られた類似性しか持たない配列では一般に
正確にモデル化することが困難な領域である（Hilbert et al. "Structural rel
ationships of homologous proteins as a functional principle in homology
modeling." Proteins. 1993, 17(2):138-51）。Ｎ末端の２０のアミノ酸もまた
、スレッディングアルゴリズムによっては、うまく位置合わせされない。ＩＬ・
１βおよび４ＦＧＦ構造（１０１残基にわたり２．７Å ＲＭＳＤ）のＤＡＬＩ
構造位置合わせによって定義される「正しい」位置合わせは、Ｎ末端領域では、
相当異なる（Ｈｏｌｍ等、１９９３）。ＦＧＦ−２と比べてＩＬ・１βの挿入に
より、その構造に残された隙間は、Ｔｒｉｐｏｓ Ｓｙｂｙｌ ６．４を用いる
１００ステップのエネルギ最小化によって閉じられた。結晶構造骨格へのモデル
の最小二乗偏差（ＲＭＳＤ）を、モデル中の等価な残基を結晶構造における残基
へ、位置合わせすることによって計算した。我々の類似性モデルに対して我々が
期待できた最低のＲＭＳＤは、この構造位置合わせに対応する。
【０１２９】
大抵の場合、我々は、ペプチド架橋割り当てを、個々のペプチドのPSD分析を
行うことによって、ほぼ確認したが、それは、しばしば正確な結合位置に関する
情報を提供した。次に、これらのデータを、これらのリジン残基間の一組の距離
制約条件を表にするために使用した。
行うことによって、ほぼ確認したが、それは、しばしば正確な結合位置に関する
情報を提供した。次に、これらのデータを、これらのリジン残基間の一組の距離
制約条件を表にするために使用した。
【０１３０】
この実験データは、小さな球形のタンパク質であるＦＧＦ−２の１８のリジン
・リジン架橋を、単一の実験によって、残基レベルまで分解することができるこ
とを示した。非常に保守的な残基・残基距離に変換した時、そのリジン・リジン
近接データは、ＦＧＦ−２の折り畳みファミリーを正確に同定するのに充分であ
る。初めから低解像度のこのタンパク質の三次元構造を決定するには、さらに架
橋が必要であるが、ＦＧＦ−２類縁体のリジン架橋の結果および既知の構造を、
ＦＧＦ−２の４．８Å構造を作るために使うことができる。この技術は、大きさ
および複雑さを変えた複数のタンパク質および１ｍｇ以下のタンパク質を用いて
使用可能である。
・リジン架橋を、単一の実験によって、残基レベルまで分解することができるこ
とを示した。非常に保守的な残基・残基距離に変換した時、そのリジン・リジン
近接データは、ＦＧＦ−２の折り畳みファミリーを正確に同定するのに充分であ
る。初めから低解像度のこのタンパク質の三次元構造を決定するには、さらに架
橋が必要であるが、ＦＧＦ−２類縁体のリジン架橋の結果および既知の構造を、
ＦＧＦ−２の４．８Å構造を作るために使うことができる。この技術は、大きさ
および複雑さを変えた複数のタンパク質および１ｍｇ以下のタンパク質を用いて
使用可能である。
【０１３１】
実施例３．ＨＩＶ−１インテグラーゼ：
ＨＩＶ・１インテグラーゼは、亜鉛・指Ｎ末端領域、触媒核、および非特異的
ＤＮＡ結合Ｃ末端領域の３つの構造領域を含む２８８アミノ酸のタンパク質であ
る。ＮおよびＣ末端は個別にＮＭＲによって解析され、核領域はＸ線結晶解析に
よって解析されたが（Dyda等、1994；Lodi等、1995；Cai等、1997；Goldgur等、
1998）、ＨＩＶインテグラーゼの全長構造は決定されていなかった。
ＤＮＡ結合Ｃ末端領域の３つの構造領域を含む２８８アミノ酸のタンパク質であ
る。ＮおよびＣ末端は個別にＮＭＲによって解析され、核領域はＸ線結晶解析に
よって解析されたが（Dyda等、1994；Lodi等、1995；Cai等、1997；Goldgur等、
1998）、ＨＩＶインテグラーゼの全長構造は決定されていなかった。
【０１３２】
ＢＳ３での分子内架橋が、全長ＨＩＶ・Ｉインテグラーゼタンパク質に適用さ
れた。その手順は、ＦＧＦ−２に用いられたものと同じ、例えば、架橋の後、ゲ
ル濾過クロマトグラフィ、タンパク質分解、およびＬＣ・ＭＳである。この実験
の目的はインテグラーゼの折り畳みファミリーを決定することではなく、全長構
造内の領域・領域相互作用の地図を作ることであった。そのインテグラーゼ単量
体内の３つの領域の配置を決定するためには、理論的には、９未満の領域間架橋
が必要である（領域対当たり約３）。
れた。その手順は、ＦＧＦ−２に用いられたものと同じ、例えば、架橋の後、ゲ
ル濾過クロマトグラフィ、タンパク質分解、およびＬＣ・ＭＳである。この実験
の目的はインテグラーゼの折り畳みファミリーを決定することではなく、全長構
造内の領域・領域相互作用の地図を作ることであった。そのインテグラーゼ単量
体内の３つの領域の配置を決定するためには、理論的には、９未満の領域間架橋
が必要である（領域対当たり約３）。
【０１３３】
１つの架橋反応は、五つの領域間架橋を作った。架橋したリジンは、Ｋ３４・
Ｋ２６４、Ｋ４２・Ｋ１５９、Ｋ４２・Ｋ１８６、Ｋ４２・Ｋ２３６、およびＫ
１８６・Ｋ２３６である。２つの架橋は、Ｎ末端領域／核領域架橋、二つはＮ末
端領域／Ｃ末端領域架橋、そして一つは核領域／Ｃ末端領域架橋である。各架橋
は、結合に関わる２つのリジン間の距離に上限を定義した。五つの架橋に由来す
る距離情報、３つの領域の構造、および領域間の隙間を橋渡しする制約条件を用
い、距離幾何学を用いて、我々は、３つのインテグラーゼ領域についてのユニー
クな配置を計算することができた。
Ｋ２６４、Ｋ４２・Ｋ１５９、Ｋ４２・Ｋ１８６、Ｋ４２・Ｋ２３６、およびＫ
１８６・Ｋ２３６である。２つの架橋は、Ｎ末端領域／核領域架橋、二つはＮ末
端領域／Ｃ末端領域架橋、そして一つは核領域／Ｃ末端領域架橋である。各架橋
は、結合に関わる２つのリジン間の距離に上限を定義した。五つの架橋に由来す
る距離情報、３つの領域の構造、および領域間の隙間を橋渡しする制約条件を用
い、距離幾何学を用いて、我々は、３つのインテグラーゼ領域についてのユニー
クな配置を計算することができた。
【０１３４】
実施例４．ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素：
未知の三次元構造を有するＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓタンパク質であるＣＭＰ・
ＮｅｕＡｃ合成酵素（ＣＮアーゼ）の立体配座を決定するために、一組の架橋実
験もまた行った。このタンパク質は、以前に単離され、発現され、酵素機構が決
定された（Tullius et al., "Covalent modification of Lys19 in the CTP bin
ding site of cytidine 5'-monophosphate N-acetylneuraminic acid synthase.
" Protein Sci. 1999, Mar, 8(3):666-75; Samules et al., "Investigation of
the Kinetic Mechanism of Cytidine 5'-Monophosphate N-Acetylneuraminic A
cid Synthetase from Haemophilus ducreyi With New Insights On Rate-limiti
ng Steps from Product Inhibition Analysis." Biochemistry. 1999 38(19):61
95-203）。ＣＮアーゼは、ＣＴＰとシアル酸（またはＮｅｕＡｃ）の反応を触媒
し、ヌクレオチド・糖供与体基質ＣＭＰ・ＮｅｕＡｃを作り、これが今度は、感
染性細菌のリポオリゴ糖における末端ガラクトース残基にシアル酸を付加する。
シアル酸の付加は、細菌における重要な病原力機構であり、ＣＮアーゼ酵素は薬
の開発のための潜在的に魅力的な標的である。
ＮｅｕＡｃ合成酵素（ＣＮアーゼ）の立体配座を決定するために、一組の架橋実
験もまた行った。このタンパク質は、以前に単離され、発現され、酵素機構が決
定された（Tullius et al., "Covalent modification of Lys19 in the CTP bin
ding site of cytidine 5'-monophosphate N-acetylneuraminic acid synthase.
" Protein Sci. 1999, Mar, 8(3):666-75; Samules et al., "Investigation of
the Kinetic Mechanism of Cytidine 5'-Monophosphate N-Acetylneuraminic A
cid Synthetase from Haemophilus ducreyi With New Insights On Rate-limiti
ng Steps from Product Inhibition Analysis." Biochemistry. 1999 38(19):61
95-203）。ＣＮアーゼは、ＣＴＰとシアル酸（またはＮｅｕＡｃ）の反応を触媒
し、ヌクレオチド・糖供与体基質ＣＭＰ・ＮｅｕＡｃを作り、これが今度は、感
染性細菌のリポオリゴ糖における末端ガラクトース残基にシアル酸を付加する。
シアル酸の付加は、細菌における重要な病原力機構であり、ＣＮアーゼ酵素は薬
の開発のための潜在的に魅力的な標的である。
【０１３５】
ＣＮアーゼ分子もまた、架橋剤としてＢＳ３を用いて調べらた。架橋タンパク
質およびさらなる解析は、単一のＢＳ３実験で六つの架橋ペプチドを同定した（
表４）。β樽タンパク質は一貫して高い得点を与えたが、スレッディング法と組
み合わせた、これらの制限されたＬｙｓ・Ｌｙｓ距離制約条件を用いては、我々
はデータベース中のユニークな折り畳みファミリーを同定することはできなかっ
た。次に、他のホモおよびヘテロ二官能性試薬を用いるさらなる距離制約条件を
、ＣＮアーゼの折り畳みファミリーだけでなく、３〜５Åの誤差範囲での完全三
次元構造を同定するために用いた。
質およびさらなる解析は、単一のＢＳ３実験で六つの架橋ペプチドを同定した（
表４）。β樽タンパク質は一貫して高い得点を与えたが、スレッディング法と組
み合わせた、これらの制限されたＬｙｓ・Ｌｙｓ距離制約条件を用いては、我々
はデータベース中のユニークな折り畳みファミリーを同定することはできなかっ
た。次に、他のホモおよびヘテロ二官能性試薬を用いるさらなる距離制約条件を
、ＣＮアーゼの折り畳みファミリーだけでなく、３〜５Åの誤差範囲での完全三
次元構造を同定するために用いた。
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
図２２Ａおよび図２２Ｂに、本発明の具体例を実現するのに適したコンピュー
タシステム２２００を示す。図２２Ａは、そのコンピュータシステムの１つの可
能な物理的形態を示す。勿論、そのコンピュータシステムは、集積回路、プリン
ト回路板および小さなハンドヘルド装置から大きなスーパーコンピュータに及ぶ
多くの物理的形態を有するであろう。コンピュータシステム２２００には、モニ
ター２２０２、ディスプレイ２２０４、容器２２０６、ディスクドライブ２２０
８、キーボード２２１０およびマウス２２１２が含まれる。ディスク２２１４は
、コンピュータシステム２２００へまたはからデータを移動するのに用いるコン
ピュータ読み取り可能な媒体である。
タシステム２２００を示す。図２２Ａは、そのコンピュータシステムの１つの可
能な物理的形態を示す。勿論、そのコンピュータシステムは、集積回路、プリン
ト回路板および小さなハンドヘルド装置から大きなスーパーコンピュータに及ぶ
多くの物理的形態を有するであろう。コンピュータシステム２２００には、モニ
ター２２０２、ディスプレイ２２０４、容器２２０６、ディスクドライブ２２０
８、キーボード２２１０およびマウス２２１２が含まれる。ディスク２２１４は
、コンピュータシステム２２００へまたはからデータを移動するのに用いるコン
ピュータ読み取り可能な媒体である。
【０１３８】
図２２Ｂは、コンピュータシステム２２００の構成図の一例である。多種類の
サブシステムが、システムバス２２２０に付けられている。プロセッサ２２２２
（中央処理装置またはＣＰＵとも呼ばれる）は、メモリ２２２４を含む保存装置
に結合される。メモリ２２２４には、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）および
読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）が含まれる。この技術では良く知られているよう
に、ＲＯＭはＣＰＵへ一方通行で、データや指令を送るために働き、ＲＡＭは通
常、両方向にデータや指令を送るために用いる。メモリのこれらの両タイプには
、下で説明するコンピュータ読み取り可能な媒体の適当なものが含まれてよい。
固定ディスク２２２６もまたＣＰＵ２２２２２へ両方向に結合し、追加的データ
保存能力を提供し、下で説明するコンピュータ読み取り可能な媒体のどれかを含
んでよい。固定ディスク２２２６はプログラム、データ等を保存するために使わ
れてよく、通常、一次保存より遅い（ハードディスクのような）二次保存媒体で
ある。固定ディスク２２２６内に保存された情報は、適当な場合には、メモリ２
２２４中の仮想メモリとして通常、組み込まれているようである。取り外し可能
ディスク２２１４は、下で説明するコンピュータ読み取り可能な媒体のいずれか
の形態を取ってよい。
サブシステムが、システムバス２２２０に付けられている。プロセッサ２２２２
（中央処理装置またはＣＰＵとも呼ばれる）は、メモリ２２２４を含む保存装置
に結合される。メモリ２２２４には、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）および
読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）が含まれる。この技術では良く知られているよう
に、ＲＯＭはＣＰＵへ一方通行で、データや指令を送るために働き、ＲＡＭは通
常、両方向にデータや指令を送るために用いる。メモリのこれらの両タイプには
、下で説明するコンピュータ読み取り可能な媒体の適当なものが含まれてよい。
固定ディスク２２２６もまたＣＰＵ２２２２２へ両方向に結合し、追加的データ
保存能力を提供し、下で説明するコンピュータ読み取り可能な媒体のどれかを含
んでよい。固定ディスク２２２６はプログラム、データ等を保存するために使わ
れてよく、通常、一次保存より遅い（ハードディスクのような）二次保存媒体で
ある。固定ディスク２２２６内に保存された情報は、適当な場合には、メモリ２
２２４中の仮想メモリとして通常、組み込まれているようである。取り外し可能
ディスク２２１４は、下で説明するコンピュータ読み取り可能な媒体のいずれか
の形態を取ってよい。
【０１３９】
また、ＣＰＵ２２２２は、ディスプレイ２２０４、キーボード２２１０、マウ
ス２２１２およびスピーカ２２３０のような種々の入／出力装置に結合している
。一般に、入／出力装置は、ビデオディスプレイ、トラックボール、マウス、キ
ーボード、マイク、タッチセンスディスプレイ、トランスデューサーカードリー
ダー、磁気または紙テープリーダー、タブレット、スタイラス、声または手書き
認識装置、バイオメトリックス・リーダー、または他のコンピュータのいずれか
でよい。ＣＰＵ２２２２は、ネットワーク・インタフェース２２４０を用いて、
他のコンピュータまたはテレコミュニケーション・ネットワークと接続されてよ
い。そのようなネットワーク・インタフェースを用いれば、ＣＰＵは、上述した
方法のステップの過程で、ネットワークから情報を得、またネットワークへ情報
を提供すると考えられる。さらに、本発明の方法の具体例は、ＣＰＵ２２２２上
でだけ実行してもよく、処理の一部を共有する遠距離ＣＰＵと接続されたインタ
ーネットのようなネットワーク上で実行してもよい。
ス２２１２およびスピーカ２２３０のような種々の入／出力装置に結合している
。一般に、入／出力装置は、ビデオディスプレイ、トラックボール、マウス、キ
ーボード、マイク、タッチセンスディスプレイ、トランスデューサーカードリー
ダー、磁気または紙テープリーダー、タブレット、スタイラス、声または手書き
認識装置、バイオメトリックス・リーダー、または他のコンピュータのいずれか
でよい。ＣＰＵ２２２２は、ネットワーク・インタフェース２２４０を用いて、
他のコンピュータまたはテレコミュニケーション・ネットワークと接続されてよ
い。そのようなネットワーク・インタフェースを用いれば、ＣＰＵは、上述した
方法のステップの過程で、ネットワークから情報を得、またネットワークへ情報
を提供すると考えられる。さらに、本発明の方法の具体例は、ＣＰＵ２２２２上
でだけ実行してもよく、処理の一部を共有する遠距離ＣＰＵと接続されたインタ
ーネットのようなネットワーク上で実行してもよい。
【０１４０】
さらに、本発明の具体例は、分析データの入力、そのデータを図形ユーザイン
タフェースでカラーグレードの表示に変え、そのデータの表示パラメータを変え
るようにユーザ入力に働きかけることのような種々のコンピュータ実行操作を行
うためのコンピュータコードを有するコンピュータ読み取り可能な媒体を有する
コンピュータ保存製品に関する。それらの媒体またはコンピュータコードは、本
発明の目的のために特別に設計され構築されたものでもよく、コンピュータソフ
トウェア技術を熟知する者にとって良く知られたまたは利用可能な種類のもので
もよい。コンピュータ読み取り可能な媒体の例には、ハードディスク、フロッピ
ー（登録商標）ディスク、磁気テープのような磁気媒体；ＣＤ−ＲＯＭ、ホログ
ラフィ装置のような光学的媒体；フロプティカルディスクのような磁気光学的媒
体；用途特異的ＩＣ（ＡＳＩＣ）、プログラム可能な論理装置（ＰＬＤ）、ＲＯ
ＭおよびＲＡＭ装置のような、プログラムコードを保存し実行するように特別に
構成されたハードウエア装置；および局所地域ネットワーク、高域ネットワーク
、インターネットのようなコンピュータ読み取り可能な指令を送るための信号伝
達媒体が含まれるが、これらには限定されない。コンピュータコードの例には、
コンパイラーによって作られる機械コードやインタプリタを用いてコンピュータ
によって実行される、より高いレベルのコードを含むファイルが含まれる。また
、本発明は、波を運んだり、その上で本発明のデータや指令が送られる媒体を輸
送することにも関係する。
タフェースでカラーグレードの表示に変え、そのデータの表示パラメータを変え
るようにユーザ入力に働きかけることのような種々のコンピュータ実行操作を行
うためのコンピュータコードを有するコンピュータ読み取り可能な媒体を有する
コンピュータ保存製品に関する。それらの媒体またはコンピュータコードは、本
発明の目的のために特別に設計され構築されたものでもよく、コンピュータソフ
トウェア技術を熟知する者にとって良く知られたまたは利用可能な種類のもので
もよい。コンピュータ読み取り可能な媒体の例には、ハードディスク、フロッピ
ー（登録商標）ディスク、磁気テープのような磁気媒体；ＣＤ−ＲＯＭ、ホログ
ラフィ装置のような光学的媒体；フロプティカルディスクのような磁気光学的媒
体；用途特異的ＩＣ（ＡＳＩＣ）、プログラム可能な論理装置（ＰＬＤ）、ＲＯ
ＭおよびＲＡＭ装置のような、プログラムコードを保存し実行するように特別に
構成されたハードウエア装置；および局所地域ネットワーク、高域ネットワーク
、インターネットのようなコンピュータ読み取り可能な指令を送るための信号伝
達媒体が含まれるが、これらには限定されない。コンピュータコードの例には、
コンパイラーによって作られる機械コードやインタプリタを用いてコンピュータ
によって実行される、より高いレベルのコードを含むファイルが含まれる。また
、本発明は、波を運んだり、その上で本発明のデータや指令が送られる媒体を輸
送することにも関係する。
【０１４１】
以上、本発明を特定の具体例を参照しながら説明してきたが、本発明の真の精
神および範囲から離れることなく種々の変形を行い、等価物で置き換え可能であ
ることを、当業者は理解し得よう。さらに、特定の状況、材料、物質組成、プロ
セス、プロセスステップを、本発明の目的、精神および範囲に適合させるために
多くの変形が可能である。そのようなすべての変形は、本明細書の前記特許請求
の範囲内にある。簡潔にするために種々の詳細が省かれているが、明白な構成の
代替手段を実現し得よう。従って、本実施例は、説明のためのものであり、限定
するためのものではないと考えるべきであり、本発明は、ここで与えられた詳細
に限定されるものではなく、前記特許請求範囲内で変形可能である。
神および範囲から離れることなく種々の変形を行い、等価物で置き換え可能であ
ることを、当業者は理解し得よう。さらに、特定の状況、材料、物質組成、プロ
セス、プロセスステップを、本発明の目的、精神および範囲に適合させるために
多くの変形が可能である。そのようなすべての変形は、本明細書の前記特許請求
の範囲内にある。簡潔にするために種々の詳細が省かれているが、明白な構成の
代替手段を実現し得よう。従って、本実施例は、説明のためのものであり、限定
するためのものではないと考えるべきであり、本発明は、ここで与えられた詳細
に限定されるものではなく、前記特許請求範囲内で変形可能である。
【図１】
本発明の方法の全体のステップを示すフローチャートである。
【図２】
本発明で使用される計算プロセスの高レベルのフローチャートである。
【図３】
比較的大規模なゲノムまたはタンパク質の調査として、本発明を用いる方法を
示すフローチャートである。
示すフローチャートである。
【図４】
化学架橋を使用したタンパク質における物理的距離制約の形成を示す図である
。
。
【図５】
架橋反応の生じ得る結果を示す図である。
【図６】
距離制約情報を生成するための計算処理を示すフローチャートである。
【図７】
図６のフローチャートで使用された、計算済みタンパク質断片の格納リストを
示す図である。
示す図である。
【図８】
図６の計算処理で得られる結果のユーザ報告を示す図である。
【図９】
本発明の質量スペクトロメータおよび計算システム装置を示す図である。
【図１０】
サイズ選択クロマトグラフィ処理の溶離における、単量体架橋分子および二量
体架橋分子間の相違を示す線グラフである。
体架橋分子間の相違を示す線グラフである。
【図１１】
架橋タンパク質の加水分解を示す図である。
【図１２】
架橋タンパク質の加水分解後に存在するペプチド断片の質量スペクトル分析を
示す図である。
示す図である。
【図１３】
構造の生成およびランク付けを行う計算スレッディング処理を示すフローチャ
ートである。
ートである。
【図１４Ａ】
類似性モデリングによって説明されるギャップを有するタンパク質構造を示す
図である。
図である。
【図１４Ｂ】
類似性モデリングによって説明される余分なアミノ酸残基を有するタンパク質
構造を示す図である。
構造を示す図である。
【図１５】
三次元タンパク質構造をモデル化するために情報を統合するステップを示す図
である。
である。
【図１６】
ＢＳ３架橋ＦＧＦのトリプシン分解産物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７】
ＢＳ３架橋ＦＧＦのトリプシン分解産物を形成するＨＰＬＣフラクションのＭ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
ＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図１８】
Ｔｈｒ１２１−Ｌｙｓ１２９とリンクするペプチドＴｙｒ−Ｌｙｓ８６から発
生する架橋ペプチドＭＨ＋＝ｍ／ｚ２７３９．４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＰＳＤ
スペクトルを示す図である。
生する架橋ペプチドＭＨ＋＝ｍ／ｚ２７３９．４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＰＳＤ
スペクトルを示す図である。
【図１９Ａ】
ＭＨ＋＝ｍ／ｚ２０５９（Ａ）の分子内架橋ペプチドおよびＭＨ＋＝ｍ／ｚ２
５６５（Ｂ）の分子間架橋ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図で
ある。
５６５（Ｂ）の分子間架橋ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図で
ある。
【図１９Ｂ】
ＭＨ＋＝ｍ／ｚ２０５９（Ａ）の分子内架橋ペプチドおよびＭＨ＋＝ｍ／ｚ２
５６５（Ｂ）の分子間架橋ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図で
ある。
５６５（Ｂ）の分子間架橋ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図で
ある。
【図２０】
（部分ａ）類似性モデリングに用いられるインターロイキン−１β（ＩＬ−１
β）およびＦＧＦ−２（ＦＧＦ２）のスレッディングアライメントを示す図であ
る。アライメントの上下のバーは、ＰＤＢ構造ファイルで定義されるインターロ
イキン−１β（上）およびＦＧＦ−２（下）のベータストランド位置を示す。シ
ーケンスアライメントの一致は１２．７％である。図１８（部分ｂ）も、ＩＬ−
１βおよびＦＧＦ−２のＤＡＬＩ構造アライメントを示す図である。ＤＡＬＩア
ライメントの構造的な２乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）は、１０１個の残基に対
して２．７Åである。
β）およびＦＧＦ−２（ＦＧＦ２）のスレッディングアライメントを示す図であ
る。アライメントの上下のバーは、ＰＤＢ構造ファイルで定義されるインターロ
イキン−１β（上）およびＦＧＦ−２（下）のベータストランド位置を示す。シ
ーケンスアライメントの一致は１２．７％である。図１８（部分ｂ）も、ＩＬ−
１βおよびＦＧＦ−２のＤＡＬＩ構造アライメントを示す図である。ＤＡＬＩア
ライメントの構造的な２乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）は、１０１個の残基に対
して２．７Åである。
【図２１】
ＦＧＦ−２類似性モデルのＦＧＦ−２（４ＦＧＦ）に対する構造アライメント
を示す図である。
を示す図である。
【図２２Ａ】
本発明の実施形態の実施に適したコンピュータシステムを示す図である。
【図２２Ｂ】
本発明の実施形態の実施に適したコンピュータシステムを示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 30/06 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｋ
30/48 30/84 Ｚ
30/84 30/88 Ｊ
30/88 33/68 ＺＮＡ
33/68 ＺＮＡ 30/26 Ａ
// Ｇ０１Ｎ 30/26 30/72 Ｃ
30/72 33/48 Ｚ
33/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ
，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，
ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ
Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ
，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，
ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ
Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ
，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 クンズ・アーウィン・ディ．
アメリカ合衆国 カリフォルニア州94904
グリーンブレー，アルメナー・ドライ
ブ，55
(72)発明者 タン・ニン
アメリカ合衆国 カリフォルニア州94131
サン・フランシスコ，ダイヤモンド・ハ
イツ・ブルバード，5150
(72)発明者 ドリンガー・ガビン
アメリカ合衆国 カリフォルニア州94122
サン・フランシスコ，５番・アベニュ
ー，1465
(72)発明者 オーシロ・コニー・エム．
アメリカ合衆国 カリフォルニア州94043
マウンテン・ビュー，ベンジャミン・ド
ライブ，2446
(72)発明者 ヘンペル・ジュディス・シー．
アメリカ合衆国 カリフォルニア州94118
サン・フランシスコ，２番・アベニュ
ー，145
(72)発明者 テイラー・エリック
アメリカ合衆国 カリフォルニア州94609
オークランド，62番・ストリート，561
Ｆターム(参考） 2G045 BB29 DA13 DA14 DA36 FB05
FB06 GC10 JA01
4B024 AA11 AA19 AA20 CA01 CA11
HA01 HA11 HA19 HA20
Claims (74)
- 【請求項１】 高分子の三次元構造を決定する方法であって、 高分子の残基間に物理的な距離制約を課すステップと、 前記高分子を、より小さな分子断片に断片化するステップと、 前記断片を同定処理にかけるステップと、 前記同定処理で得られる同定情報を分析して、前記高分子の三次元構造情報を
提供するステップと、 を備える、方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法であって、 前記同定処理は、質量スペクトル分析を用いた前記断片の質量測定を含む、方
法。 - 【請求項３】 請求項２記載の方法であって、 前記同定処理は、配列の同定を含む、方法。
- 【請求項４】 請求項１記載の方法であって、 前記情報を分析するステップは、 前記断片の同定に基づいて、前記断片に得点を割り当てるステップと、 前記高分子を既知の構造の関連化合物と比較することによって、複数の仮想構
造を生成するステップと、 前記距離制約を考慮することによって、前記複数の仮想構造を評価するステッ
プと、 を含む、方法。 - 【請求項５】 請求項４記載の方法であって、さらに、 前記距離制約に最も適合する仮想構造の類似性モデリング分析を実行するステ
ップを含む、方法。 - 【請求項６】 請求項１記載の方法であって、 前記高分子は、少なくとも１つのアミノ酸を含む、方法。
- 【請求項７】 請求項１記載の方法であって、 高分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、方法。
- 【請求項８】 タンパク質の三次元構造を決定する方法であって、 分析対象のタンパク質を、少なくとも２つの反応性基を含む少なくとも１つの
架橋試薬と反応させるステップと、 反応生成物を分子内架橋を有する分子に濃縮するステップと、 濃縮された反応生成物についてタンパク質分解を行い、複数のタンパク質断片
を得るステップと、 前記複数のタンパク質断片をペプチド同定分析にかけるステップと、 前記ペプチド同定分析から得られる情報を分析して、前記高分子の三次元構造
に関する情報を得るステップと、 を備える、方法。 - 【請求項９】 請求項８記載の方法であって、 前記架橋試薬は、二官能性架橋試薬である、方法。
- 【請求項１０】 請求項９記載の方法であって、 前記架橋試薬は、アミン特異的ホモ二官能性架橋試薬である、方法。
- 【請求項１１】 請求項８記載の方法であって、 前記タンパク質を、前記タンパク質上の複数の反応性部位に対して異なる特異
性を有する複数の架橋試薬と反応させる、方法。 - 【請求項１２】 請求項８記載の方法であって、 前記タンパク質を、反応性基間の長さが異なる複数の架橋試薬と反応させる、
方法。 - 【請求項１３】 請求項１記載の方法であって、 前記架橋試薬との反応は、高分子当たり平均１つの架橋試薬で修飾されるよう
に最適化されている、方法。 - 【請求項１４】 請求項８記載の方法であって、 前記反応生成物は、分子間架橋を有するタンパク質の物理的除去によって、分
子内架橋を有する分子に濃縮される、方法。 - 【請求項１５】 請求項１４記載の方法であって、 分子間架橋を有する分子は、ゲル濾過クロマトグラフィによって取り除かれる
、方法。 - 【請求項１６】 請求項８記載の方法であって、 前記タンパク質同定分析は、クロマトグラフィと質量スペクトル分析から成る
、方法。 - 【請求項１７】 請求項１６記載の方法であって、 前記クロマトグラフィは、Ｃ４、Ｃ８およびＣ１８の分離スキームを用いる逆
相分離である、方法。 - 【請求項１８】 請求項１６記載の方法であって、 前記質量スペクトル分析は、マトリクス補助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤ
Ｉ）飛行時間（ＴＯＦ）装置または電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）飛行時間（
ＴＯＦ）装置を用いて実行される、方法。 - 【請求項１９】 請求項８記載の方法であって、 前記ペプチド同定分析は、ペプチド配列決定から成る、方法。
- 【請求項２０】 請求項８記載の方法であって、 前記情報分析ステップは、 質量スペクトルデータに基づいて、複数のタンパク質分解生成物に値を割り当
るステップと、 前記高分子を既知の構造の関連化合物と比較することによって、複数の仮想構
造を生成するステップと、 架橋データから得られる距離制約を考慮することによって、前記複数の仮想構
造を評価するステップと、 を含む、方法。 - 【請求項２１】 請求項２０記載の方法であって、さらに、 前記距離制約に適合する仮想構造の類似性モデリング分析を実行するステップ
を含む、方法。 - 【請求項２２】 請求項２０記載の方法であって、 値の割り当ては、タンパク質分解生成物の仮想ライブラリを構築することによ
って行われ、前記ライブラリは、単一同位体データと平均質量データとで構成さ
れるグループから選択された基準によって指示される、方法。 - 【請求項２３】 請求項２０記載の方法であって、 仮想構造は、折り畳み予測に関するスレッディングプログラムを用いて生成さ
れる、方法。 - 【請求項２４】 請求項２０記載の方法であって、 前記仮想構造は、次式を用いて生成される、方法。 【数１】 ここで、Ｅｔは全制約誤差、ｄ０は組距離分離、ｄｉは制約ｊによる構造によ
って定義される組距離、ｉは距離制約の全数である。 - 【請求項２５】 請求項２１記載の方法であって、 類似性モデリング分析は、前記高分子の複数の成分を、前記高分子の構造にお
けるこれらの成分の空間的位置とマッチングさせる、スレッディングアライメン
トを用いて実行される、方法。 - 【請求項２６】 アミノ酸配列の三次元構造に関する情報を決定する方法で
あって、 アミノ酸配列を、約５Åないし約２０Åの距離だけ離れた２つの反応性基およ
び検出可能ラベルを含む架橋試薬と、反応させて反応生成物を得るステップと、 前記反応生成物をクロマトグラフィを用いてサイズ分離するステップと、 前記反応生成物のサイズ分離された部分のタンパク質分解を行い、前記架橋試
薬の検出可能ラベルと結合したままになっている反応生成物の一部を、単離する
ステップと、 検出可能ラベルを含む反応生成物の単離された部分について、質量スペクトル
分析を行うステップと、 可能性のある反応生成物の質量を計算し、実際の実験的質量と比較し、前記ア
ミノ酸配列の三次元構造に関する情報を提供するステップと、 を備える、方法。 - 【請求項２７】 分子の構造の詳細を決定するシステムであって、 質量スペクトロメータと、 前記質量スペクトロメータから、少なくとも１つの距離制約が課された前記分
子の実際の断片からの質量情報を含む入力データを受け取る計算システムと、 を備え、 前記計算システムは、入力データを、前記計算システムによって生成され、ま
たは、保存された前記分子の予期される断片とマッチングさせた後、前記分子の
構造の詳細を出力する、システム。 - 【請求項２８】 請求項２７記載のシステムであって、 前記分子は、ポリペプチドである、システム。
- 【請求項２９】 請求項２７記載のシステムであって、 前記分子は、核酸である、システム。
- 【請求項３０】 請求項２７記載のシステムであって、 前記距離制約は、ポリペプチド架橋試薬によって課される、システム。
- 【請求項３１】 請求項２７記載のシステムであって、 前記距離制約は、ＢＳ３によって課される、システム。
- 【請求項３２】 請求項２７記載のシステムであって、 前記距離制約の数は、約２０未満である、システム。
- 【請求項３３】 請求項２７記載のシステムであって、 前記分子は、ポリペプチドであり、 前記距離制約の数は、前記ポリペプチド内のアミノ酸残基の数の約２０％未満
である、システム。 - 【請求項３４】 請求項２７記載のシステムであって、 前記入力データは、質量スペクトロメータから与えられる、システム。
- 【請求項３５】 請求項２７記載のシステムであって、 前記質量スペクトロメータは、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ質量スペクトロメータ
である、システム。 - 【請求項３６】 請求項２７記載のシステムであって、 前記分子の候補構造は、既知のタンパクの質折り畳みによる一次配列の制約さ
れたスレッディングによって生成される、システム。 - 【請求項３７】 請求項２７記載のシステムであって、 前記分子の構造の詳細は、三次元構造情報を含む、システム。
- 【請求項３８】 請求項２７記載のシステムであって、 前記分子の構造の詳細は、三次元座標地図を含む、システム。
- 【請求項３９】 請求項３８記載のシステムであって、 前記三次元座標地図は、前記分子内の各原子の実際の位置の約２Åないし約５
ÅＲＭＳ以内で決定される、システム。 - 【請求項４０】 請求項２７記載のシステムであって、 前記分子の構造の詳細は、類似性モデリングを用いて生成される、システム。
- 【請求項４１】 分子の構造の詳細を決定するためのコンピュータシステム
であって、 １以上のプロセッサと、 １以上のユーザ入力装置と、 を備え、 前記コンピュータシステムは、 少なくとも１つの距離制約が課された前記分子の実際の断片からの質量情報を
含む入力データを受け取り、 前記コンピュータシステムは、 前記入力データを、前記分子の予期される断片とを比較した後、前記分子の構
造の詳細を出力する、コンピュータシステム。 - 【請求項４２】 請求項４１記載のシステムであって、 前記距離制約の数は、約２０未満である、システム。
- 【請求項４３】 請求項４１記載のシステムであって、 前記分子は、ポリペプチドであり、 前記距離制約の数は、前記ポリペプチド内のアミノ酸残基の数の約２０％未満
である、システム。 - 【請求項４４】 請求項４１記載のシステムであって、 前記分子の候補構造は、既知のタンパクの質折り畳みによる一次配列の制約さ
れたスレッディングによって生成される、システム。 - 【請求項４５】 請求項４１記載のシステムであって、 前記分子の構造の詳細は、三次元構造情報を含む、システム。
- 【請求項４６】 請求項４１記載のシステムであって、 前記分子の構造の詳細は、三次元座標地図を含む、システム。
- 【請求項４７】 請求項４６記載のシステムであって、 前記三次元座標地図は、前記分子内の各原子の実際の位置の約２Åないし約５
ÅＲＭＳ以内で決定される、システム。 - 【請求項４８】 請求項４１記載のシステムであって、 前記分子の構造の詳細は、類似性モデリングを用いて生成される、システム。
- 【請求項４９】 分子の候補構造の得点をつけるためのコンピュータシステ
ムで実行される方法であって、 少なくとも１つの距離制約が課された前記分子の実際の断片からの質量情報を
含む入力データを受け取るステップと、 前記分子の予期される断片を生成し、または、保存するステップと、 前記質量情報を、前記分子の予期される断片とマッチングさせて、距離制約情
報を生成するステップと、 それらが前記距離制約情報と一致する程度に基づいて、候補構造の得点をつけ
るステップと、 を備える、方法。 - 【請求項５０】 請求項４９記載の方法であって、 前記分子は、ポリペプチドである、方法。
- 【請求項５１】 請求項４９記載の方法であって、 前記分子は、核酸である、方法。
- 【請求項５２】 請求項４９記載の方法であって、 前記距離制約は、ポリペプチド架橋試薬によって課される、方法。
- 【請求項５３】 請求項４９記載の方法であって、 前記距離制約は、ＢＳ３によって課される、方法。
- 【請求項５４】 請求項４９記載の方法であって、 前記距離制約の数は、約２０未満である、方法。
- 【請求項５５】 請求項４９記載の方法であって、 前記分子は、ポリペプチドであり、 前記距離制約の数は、前記ポリペプチド内のアミノ酸残基の数の約２０％未満
である、方法。 - 【請求項５６】 請求項４９記載の方法であって、 前記入力データは、質量スペクトロメータから与えられる、方法。
- 【請求項５７】 請求項４９記載の方法であって、 前記質量スペクトロメータは、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ質量スペクトロメータ
である、方法。 - 【請求項５８】 請求項４９記載の方法であって、 前記分子の候補構造は、既知のタンパクの質折り畳みによる一次配列の制約さ
れたスレッディングによって生成される、方法。 - 【請求項５９】 請求項４９記載の方法であって、 前記候補構造は、二次構造レベルに決定される、方法。
- 【請求項６０】 請求項４９記載の方法であって、さらに、 前記分子の構造の詳細を生成して出力する、方法。
- 【請求項６１】 請求項４９記載の方法であって、 前記分子の構造の詳細は、三次元構造情報を含む、方法。
- 【請求項６２】 請求項４９記載の方法であって、 前記分子の構造の詳細は、三次元座標地図を含む、方法。
- 【請求項６３】 請求項６３記載の方法であって、 前記三次元座標地図は、前記分子内の各原子の実際の位置の約２Åないし約５
ÅＲＭＳ以内で決定される、方法。 - 【請求項６４】 請求項４９記載の方法であって、 前記分子の構造の詳細は、類似性モデリングを用いて生成される、方法。
- 【請求項６５】 コンピュータ読み取り可能な媒体と、前記コンピュータ読
み取り可能な媒体から供給されるプログラム指令であって、分子の候補構造の得
点をつけるための指令を含む前記プログラム指令と、を備えるコンピュータプロ
グラム製品であって、 前記指令は、 少なくとも１つの距離制約が課された分子の実際の断片からの質量情報を含む
入力データを受け取り、 前記分子の予期される断片を生成し、または、保存し、 前記質量情報を、前記分子の予期される断片とマッチングさせて、距離制約情
報を生成し、 それらが前記距離制約情報と一致する程度に基づいて、候補構造の得点をつけ
る、 ように指令する、コンピュータプログラム製品。 - 【請求項６６】 請求項６５記載のコンピュータプログラム製品であって、 前記距離制約の数は、約２０未満である、コンピュータプログラム製品。
- 【請求項６７】 請求項６５記載のコンピュータプログラム製品であって、 前記分子は、ポリペプチドであり、 前記距離制約の数は、前記ポリペプチド内のアミノ酸残基の数の約２０％未満
である、コンピュータプログラム製品。 - 【請求項６８】 請求項６５記載のコンピュータプログラム製品であって、 前記候補構造は、既知のタンパクの質折り畳みによる一次配列の制約されたス
レッディングによって生成される、コンピュータプログラム製品。 - 【請求項６９】 請求項６５記載のコンピュータプログラム製品であって、
さらに、 前記分子の構造の詳細を生成して出力する、コンピュータプログラム製品。 - 【請求項７０】 請求項６５記載のコンピュータプログラム製品であって、 前記分子の構造の詳細は、三次元座標地図を含む、コンピュータプログラム製
品。 - 【請求項７１】 請求項７０記載のコンピュータプログラム製品であって、 前記三次元座標地図は、前記分子内の各原子の実際の位置の約２Åないし約５
ÅＲＭＳ以内で決定される、コンピュータプログラム製品。 - 【請求項７２】 請求項６５記載のコンピュータプログラム製品であって、 前記分子の構造の詳細は、類似性モデリングを用いて生成される、コンピュー
タプログラム製品。 - 【請求項７３】 請求項１９記載の方法であって、 前記ペプチドの配列決定がエドマン配列決定から成る、方法。
- 【請求項７４】 請求項２１記載の方法であって、さらに、 前記距離制約に最も適合する仮想構造を選択するステップを含む、方法。
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