JP3015886B1 - 植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法 - Google Patents
植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法Info
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Abstract
【要約】
【課題】 植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプ
ロテアーゼの酵素活性を迅速に測定することができ、し
かも特異的、かつ簡便に測定することが可能な該酵素活
性の定量法を提供すること。 【解決手段】 アミノ酸配列中にアスパラギン残基を少
なくとも１つ有すると共に、アスパラギン残基のＣ−末
端側がイソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基
のいずれでもないオリゴペプチドであって、７−メトキ
シクマリン−４−ｙｌ−アセチル基をＮ−末端側に、
２，４−ジニトロフェニル基をＣ−末端側に配した消光
性蛍光基質を用いて、アスパラギン残基特異的エンドプ
ロテアーゼにより切断された消光性蛍光基質から生ずる
蛍光を測定することを特徴とする植物由来アスパラギン
残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法。
ロテアーゼの酵素活性を迅速に測定することができ、し
かも特異的、かつ簡便に測定することが可能な該酵素活
性の定量法を提供すること。 【解決手段】 アミノ酸配列中にアスパラギン残基を少
なくとも１つ有すると共に、アスパラギン残基のＣ−末
端側がイソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基
のいずれでもないオリゴペプチドであって、７−メトキ
シクマリン−４−ｙｌ−アセチル基をＮ−末端側に、
２，４−ジニトロフェニル基をＣ−末端側に配した消光
性蛍光基質を用いて、アスパラギン残基特異的エンドプ
ロテアーゼにより切断された消光性蛍光基質から生ずる
蛍光を測定することを特徴とする植物由来アスパラギン
残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物由来アスパラ
ギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法に
関し、詳しくは特定の構造を有する消光性蛍光基質を利
用した、植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテ
アーゼの活性を迅速に定量する方法に関する。
ギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法に
関し、詳しくは特定の構造を有する消光性蛍光基質を利
用した、植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテ
アーゼの活性を迅速に定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アスパラギン残基特異的エンドプロテア
ーゼとは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のう
ち、アスパラギン残基のＣ−末端でペプチド等を切断す
る酵素をいう。この中でも、特に植物由来のアスパラギ
ン残基特異的エンドプロテアーゼをレグマチュレインと
いう。
ーゼとは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のう
ち、アスパラギン残基のＣ−末端でペプチド等を切断す
る酵素をいう。この中でも、特に植物由来のアスパラギ
ン残基特異的エンドプロテアーゼをレグマチュレインと
いう。
【０００３】レグマチュレインは、優れた蛋白源として
食品産業等における有用性の高い植物種子の貯蔵タンパ
ク質の合成に係わる酵素である。例えば、ダイズグリシ
ニンは、当初酸性サブユニットと塩基性サブユニットが
つながった状態の一本のポリペプチドから成るダイズグ
リシニン前駆体として合成される。その後、レグマチュ
レインの作用を受けて、サブユニット間が切断されては
じめて、成熟体としてのグリシニンとなる。したがっ
て、レグマチュレインの酵素活性は、グリシニン等の貯
蔵タンパク質の工業的利用性に影響するものである。
食品産業等における有用性の高い植物種子の貯蔵タンパ
ク質の合成に係わる酵素である。例えば、ダイズグリシ
ニンは、当初酸性サブユニットと塩基性サブユニットが
つながった状態の一本のポリペプチドから成るダイズグ
リシニン前駆体として合成される。その後、レグマチュ
レインの作用を受けて、サブユニット間が切断されては
じめて、成熟体としてのグリシニンとなる。したがっ
て、レグマチュレインの酵素活性は、グリシニン等の貯
蔵タンパク質の工業的利用性に影響するものである。
【０００４】上記の事情より、レグマチュレインの酵素
活性の正確な定量法が要求され、従来は以下の方法が用
いられていた（特公平８−２４５７６号公報参照）。
イミュノブロット法での定性的な測定法これは、ダイ
ズグリシニン等の前駆体等をはじめとする天然の１１Ｓ
型種子貯蔵蛋白質前駆体を大腸菌体内で発現させて精製
した後に、これらを基質としてレグマチュレインで切断
し、生じてくる酸性サブユニット及び塩基性サブユニッ
トをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。次いで、ＰＶＤＦ膜
にブロッティングした後、塩基性サブユニットに対する
抗体を用いて、該サブユニットをイミュノブロット法で
定性的に高感度で検出する方法である。
活性の正確な定量法が要求され、従来は以下の方法が用
いられていた（特公平８−２４５７６号公報参照）。
イミュノブロット法での定性的な測定法これは、ダイ
ズグリシニン等の前駆体等をはじめとする天然の１１Ｓ
型種子貯蔵蛋白質前駆体を大腸菌体内で発現させて精製
した後に、これらを基質としてレグマチュレインで切断
し、生じてくる酸性サブユニット及び塩基性サブユニッ
トをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。次いで、ＰＶＤＦ膜
にブロッティングした後、塩基性サブユニットに対する
抗体を用いて、該サブユニットをイミュノブロット法で
定性的に高感度で検出する方法である。
【０００５】 高速液体クロマトグラフィーにより切
断した合成ペプチドを分画する活性の定量法これは、レ
グマチュレインをアスパラギン残基を含む合成ペプチド
に作用させた後、高速液体クロマトグラフィーに接続し
た逆相カラムを用いて、基質と生成したペプチドを分離
し、その切断活性を定量する方法である。
断した合成ペプチドを分画する活性の定量法これは、レ
グマチュレインをアスパラギン残基を含む合成ペプチド
に作用させた後、高速液体クロマトグラフィーに接続し
た逆相カラムを用いて、基質と生成したペプチドを分離
し、その切断活性を定量する方法である。
【０００６】しかしながら、の方法は、比較的多くの
サンプルを１度に測定することができ、感度も非常に高
いという長所を有しているが、活性の検出に丸１日程度
の時間を要し、迅速な測定法とは言えない。また、の
方法も、１サンプルあたり３０分程度の時間を必要とす
る。さらに、およびの方法では、試料にレグマチュ
レイン以外のプロテアーゼ等が含まれる場合、正確な測
定が困難であった。したがって、上記従来のレグマチュ
レイン活性測定法は、その操作性及び迅速性等の点で問
題があった。
サンプルを１度に測定することができ、感度も非常に高
いという長所を有しているが、活性の検出に丸１日程度
の時間を要し、迅速な測定法とは言えない。また、の
方法も、１サンプルあたり３０分程度の時間を必要とす
る。さらに、およびの方法では、試料にレグマチュ
レイン以外のプロテアーゼ等が含まれる場合、正確な測
定が困難であった。したがって、上記従来のレグマチュ
レイン活性測定法は、その操作性及び迅速性等の点で問
題があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の問題点を克服して、レグマチュレインの酵素活性を
迅速に測定することができ、しかも特異的、かつ簡便に
測定することが可能なレグマチュレインの酵素活性定量
法を提供することを目的とするものである。
術の問題点を克服して、レグマチュレインの酵素活性を
迅速に測定することができ、しかも特異的、かつ簡便に
測定することが可能なレグマチュレインの酵素活性定量
法を提供することを目的とするものである。
【０００８】一般に、酵素活性の迅速な定量法として
は、吸光度測定法、蛍光光度測定法等が汎用されてい
る。一般的なアスパラギン残基に特異的なエンドプロテ
アーゼの酵素活性定量法として、プロテアーゼ活性の代
わりにアミド化したアミノ酸からのアミノ基を遊離する
活性であるアミダーゼ活性を測定する方法がある。すな
わち、Ｃ−末端のアスパラギン残基のカルボキシル基を
アミド化したペプチドを用意し、そのペプチドにアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼを作用させて、そ
の活性を測る方法が既にいくつか報告されている。
は、吸光度測定法、蛍光光度測定法等が汎用されてい
る。一般的なアスパラギン残基に特異的なエンドプロテ
アーゼの酵素活性定量法として、プロテアーゼ活性の代
わりにアミド化したアミノ酸からのアミノ基を遊離する
活性であるアミダーゼ活性を測定する方法がある。すな
わち、Ｃ−末端のアスパラギン残基のカルボキシル基を
アミド化したペプチドを用意し、そのペプチドにアスパ
ラギン残基特異的エンドプロテアーゼを作用させて、そ
の活性を測る方法が既にいくつか報告されている。
【０００９】具体的には、アスパラギン残基のカルボ
キシル基にアミノ基を結合させたペプチドを合成し、そ
のアミダーゼ活性を高速液体クロマトグラフィーで測定
する方法（Abe Y. et al., Journal of Biological Che
mistry, 268, 3525-3529 (1993) ）や、アスパラギン
残基のカルボキシル基に７−アミノ−４−メチルクマリ
ン（7-amino-4-methylcoumarin) を結合させたペプチド
を合成し、そのアミダーゼ活性を蛍光法で測定する方法
（Asha A. Kembhavi et al., Archives of Biochemistr
y and Biophysics, 303, 208-213 (1993) ）等の報告が
ある。やの定量法のように、プロテアーゼ活性に代
えてアミダーゼ活性を定量する方法は、トリプシン、パ
パイン等でも使用されている簡便な方法である。
キシル基にアミノ基を結合させたペプチドを合成し、そ
のアミダーゼ活性を高速液体クロマトグラフィーで測定
する方法（Abe Y. et al., Journal of Biological Che
mistry, 268, 3525-3529 (1993) ）や、アスパラギン
残基のカルボキシル基に７−アミノ−４−メチルクマリ
ン（7-amino-4-methylcoumarin) を結合させたペプチド
を合成し、そのアミダーゼ活性を蛍光法で測定する方法
（Asha A. Kembhavi et al., Archives of Biochemistr
y and Biophysics, 303, 208-213 (1993) ）等の報告が
ある。やの定量法のように、プロテアーゼ活性に代
えてアミダーゼ活性を定量する方法は、トリプシン、パ
パイン等でも使用されている簡便な方法である。
【００１０】そこで、本発明者らは、先述の及びの
各方法によって酵素活性を確認済みのレグマチュレイン
について、上記及びの各方法でそれぞれアミダーゼ
活性の測定を行った。しかしながら、レグマチュレイン
は、これらの方法において、アミダーゼ活性を示さなか
った。
各方法によって酵素活性を確認済みのレグマチュレイン
について、上記及びの各方法でそれぞれアミダーゼ
活性の測定を行った。しかしながら、レグマチュレイン
は、これらの方法において、アミダーゼ活性を示さなか
った。
【００１１】すなわち、及びの定量法では、アスパ
ラギン残基に特異的に作用してそのＣ−末端を切断する
というレグマチュレインの活性ではなく、混在している
アミダーゼ活性、すなわちアスパラギナーゼの作用の如
く、単にアミド化したアミノ酸からのアミノ基を遊離す
る活性が定量されることになる。
ラギン残基に特異的に作用してそのＣ−末端を切断する
というレグマチュレインの活性ではなく、混在している
アミダーゼ活性、すなわちアスパラギナーゼの作用の如
く、単にアミド化したアミノ酸からのアミノ基を遊離す
る活性が定量されることになる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】したがって、レグマチュ
レインの活性を測定するにあたり、上記の及びの定
量法のように、Ｃ−末端にあるアスパラギン残基のカル
ボキシル基をアミド化したペプチドを用いる方法は採用
できないことが判明した。
レインの活性を測定するにあたり、上記の及びの定
量法のように、Ｃ−末端にあるアスパラギン残基のカル
ボキシル基をアミド化したペプチドを用いる方法は採用
できないことが判明した。
【００１３】そこで、本発明者らは、種々のペプチドを
合成してレグマチュレインの特性について検討した。す
なわち、ダイズグリシニン前駆体サブユニットのうち、
Ａ2Ｂ1aサブユニットの酸性サブユニットと塩基性サブ
ユニットの切断部位を基にして種々のペプチドを合成
し、レグマチュレインの切断特性について検討した。そ
の結果、レグマチュレインは、アスパラギン残基がＮ−
末端及びＣ−末端にあるペプチドに対して切断活性を示
さず、一定の切断ルールに基づいて活性を示すことが明
らかとなった。さらに、この切断ルールに基づいて合成
した消光性蛍光基質を用いることにより、レグマチュレ
イン活性を迅速に、しかも高感度で定量できることを見
出した。本発明は、このような知見に基づいて完成され
たものである。
合成してレグマチュレインの特性について検討した。す
なわち、ダイズグリシニン前駆体サブユニットのうち、
Ａ2Ｂ1aサブユニットの酸性サブユニットと塩基性サブ
ユニットの切断部位を基にして種々のペプチドを合成
し、レグマチュレインの切断特性について検討した。そ
の結果、レグマチュレインは、アスパラギン残基がＮ−
末端及びＣ−末端にあるペプチドに対して切断活性を示
さず、一定の切断ルールに基づいて活性を示すことが明
らかとなった。さらに、この切断ルールに基づいて合成
した消光性蛍光基質を用いることにより、レグマチュレ
イン活性を迅速に、しかも高感度で定量できることを見
出した。本発明は、このような知見に基づいて完成され
たものである。
【００１４】すなわち、請求項１記載の本発明は、アミ
ノ酸配列中にアスパラギン残基を少なくとも１つ有する
と共に、アスパラギン残基のＣ−末端側がイソロイシン
残基、ロイシン残基及びバリン残基のいずれでもない、
配列表の配列番号１〜６のいずれかに記載のオリゴペプ
チドであって、７−メトキシクマリン−４−ｙｌ−アセ
チル基をＮ−末端側に、２，４−ジニトロフェニル基を
Ｃ−末端側に配した消光性蛍光基質を用いて、アスパラ
ギン残基特異的エンドプロテアーゼにより切断された消
光性蛍光基質から生ずる蛍光を測定することを特徴とす
る植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ
活性の迅速定量法である。
ノ酸配列中にアスパラギン残基を少なくとも１つ有する
と共に、アスパラギン残基のＣ−末端側がイソロイシン
残基、ロイシン残基及びバリン残基のいずれでもない、
配列表の配列番号１〜６のいずれかに記載のオリゴペプ
チドであって、７−メトキシクマリン−４−ｙｌ−アセ
チル基をＮ−末端側に、２，４−ジニトロフェニル基を
Ｃ−末端側に配した消光性蛍光基質を用いて、アスパラ
ギン残基特異的エンドプロテアーゼにより切断された消
光性蛍光基質から生ずる蛍光を測定することを特徴とす
る植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ
活性の迅速定量法である。
【００１５】 請求項２記載の本発明は、消光性蛍光基質
が、配列表の配列番号１〜６のいずれかに記載のオリゴ
ペプチドであって、７−メトキシクマリン−４−ｙｌ−
アセチル基をＮ−末端側のグリシン残基のアミノ基に、
２，４−ジニトロフェニル基をＣ−末端側から３番目の
リジン残基のε−アミノ残基に配した消光性蛍光基質で
ある請求項１記載の迅速定量法である。
が、配列表の配列番号１〜６のいずれかに記載のオリゴ
ペプチドであって、７−メトキシクマリン−４−ｙｌ−
アセチル基をＮ−末端側のグリシン残基のアミノ基に、
２，４−ジニトロフェニル基をＣ−末端側から３番目の
リジン残基のε−アミノ残基に配した消光性蛍光基質で
ある請求項１記載の迅速定量法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法の対象となる酵素は、植物由来のアスパラ
ギン残基特異的エンドペプチダーゼ、すなわちレグマチ
ュレインである。この酵素の具体例としては、例えばダ
イズグリシニン前駆体のサブユニット間を切断すること
により、グリシニンの成熟化に係わるものがある。この
酵素の理化学的性質は、特公平８−２４５７６号公報に
記載されている。
本発明の方法の対象となる酵素は、植物由来のアスパラ
ギン残基特異的エンドペプチダーゼ、すなわちレグマチ
ュレインである。この酵素の具体例としては、例えばダ
イズグリシニン前駆体のサブユニット間を切断すること
により、グリシニンの成熟化に係わるものがある。この
酵素の理化学的性質は、特公平８−２４５７６号公報に
記載されている。
【００１７】 本発明の方法の特徴は、上記アスパラギン
特異的エンドペプチダーゼの酵素活性を測定するにあた
り、消光性蛍光基質を用いることにある。消光性蛍光基
質は、アミノ酸配列中にアスパラギン残基を少なくとも
１つ有すると共にアスパラギン残基のＣ−末端側がイソ
ロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基のいずれで
もないオリゴペプチドであって、７−メトキシクマリン
−４−ｙｌ−アセチル基をＮ−末端側に、２，４−ジニ
トロフェニル基をＣ−末端側に配した構造をとるもので
ある。
特異的エンドペプチダーゼの酵素活性を測定するにあた
り、消光性蛍光基質を用いることにある。消光性蛍光基
質は、アミノ酸配列中にアスパラギン残基を少なくとも
１つ有すると共にアスパラギン残基のＣ−末端側がイソ
ロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基のいずれで
もないオリゴペプチドであって、７−メトキシクマリン
−４−ｙｌ−アセチル基をＮ−末端側に、２，４−ジニ
トロフェニル基をＣ−末端側に配した構造をとるもので
ある。
【００１８】 本発明者らは、レグマチュレインが、ダイ
ズグリシニン前駆体サブユニットのうち、Ａ2Ｂ1aサブ
ユニットの酸性サブユニットと塩基性サブユニットの間
を攻撃して切断することに注目した。そして、その切断
部位のアミノ酸配列を基にして得られるオリゴペプチド
が、レグマチュレインの定量に有用である点に着目し
た。
ズグリシニン前駆体サブユニットのうち、Ａ2Ｂ1aサブ
ユニットの酸性サブユニットと塩基性サブユニットの間
を攻撃して切断することに注目した。そして、その切断
部位のアミノ酸配列を基にして得られるオリゴペプチド
が、レグマチュレインの定量に有用である点に着目し
た。
【００１９】 この部分から設計したペプチドを蛍光基お
よびそのクエンチャーで修飾して得られる消光性蛍光基
質が、アスパラギン残基特異的エンドペプチダーゼの酵
素活性の測定に有用であることが明かとなった。現在ま
でに、このような消光性蛍光ペプチドを使用して、レグ
マチュレインが持つ酵素活性を測定したという実例は、
未だ報告がない。
よびそのクエンチャーで修飾して得られる消光性蛍光基
質が、アスパラギン残基特異的エンドペプチダーゼの酵
素活性の測定に有用であることが明かとなった。現在ま
でに、このような消光性蛍光ペプチドを使用して、レグ
マチュレインが持つ酵素活性を測定したという実例は、
未だ報告がない。
【００２０】 消光性蛍光基質のオリゴペプチドのアミノ
酸配列は、レグマチュレインの酵素作用の対象となる必
要がある。レグマチュレインは、前述の通り、アスパラ
ギン残基のＣ−末端側でペプチド鎖を切断する酵素であ
る。したがって、オリゴペプチドのアミノ酸配列中に
は、少なくとも１つのアスパラギン残基を有する必要が
ある。ただし、レグマチュレインの酵素特異性により、
アスパラギン残基はＮ−末端やＣ−末端ではないことが
必要である。また、アスパラギン残基はＮ−末端から３
残基目以降に位置すると、レグマチュレインの活性をよ
り受けやすくなるので、好ましい。また、アスパラギン
残基のＣ−末端側の隣の残基の種類がイソロイシン残
基、ロイシン残基およびバリン残基のいずれでもないこ
とが必要である。その理由は、これらのアミノ酸残基の
存在はレグマチュレインの酵素活性に影響を与えるため
である。このようなオリゴペプチド部分としては、請求
項１記載の本発明のように、配列表の配列番号１〜６に
記載のアミノ酸配列とすることが必要である。
酸配列は、レグマチュレインの酵素作用の対象となる必
要がある。レグマチュレインは、前述の通り、アスパラ
ギン残基のＣ−末端側でペプチド鎖を切断する酵素であ
る。したがって、オリゴペプチドのアミノ酸配列中に
は、少なくとも１つのアスパラギン残基を有する必要が
ある。ただし、レグマチュレインの酵素特異性により、
アスパラギン残基はＮ−末端やＣ−末端ではないことが
必要である。また、アスパラギン残基はＮ−末端から３
残基目以降に位置すると、レグマチュレインの活性をよ
り受けやすくなるので、好ましい。また、アスパラギン
残基のＣ−末端側の隣の残基の種類がイソロイシン残
基、ロイシン残基およびバリン残基のいずれでもないこ
とが必要である。その理由は、これらのアミノ酸残基の
存在はレグマチュレインの酵素活性に影響を与えるため
である。このようなオリゴペプチド部分としては、請求
項１記載の本発明のように、配列表の配列番号１〜６に
記載のアミノ酸配列とすることが必要である。
【００２１】 さらに、これら６つの配列中、配列番号１
〜３記載のアミノ酸配列を有する消光性蛍光基質のよう
に、アスパラギン残基のＣ−末端側の第２番目の隣がイ
ソロイシン残基かロイシン残基又はバリン残基である
と、酵素活性が非常に顕著となり、高い蛍光強度が観察
されることとなるので、より好ましい。このようなペプ
チドの残基数は、作業上の扱いの観点から、７〜１２残
基とすることが好ましい。
〜３記載のアミノ酸配列を有する消光性蛍光基質のよう
に、アスパラギン残基のＣ−末端側の第２番目の隣がイ
ソロイシン残基かロイシン残基又はバリン残基である
と、酵素活性が非常に顕著となり、高い蛍光強度が観察
されることとなるので、より好ましい。このようなペプ
チドの残基数は、作業上の扱いの観点から、７〜１２残
基とすることが好ましい。
【００２２】 消光性蛍光ペプチドは、上記オリゴペプチ
ド部分のＮ−末端側に、蛍光基である（７−メトキシク
マリン−４−イル）アセチル [(7-methoxycoumarin-4-y
l) acetyl]基（以下、ＭＯＣＡｃ基という。）を有する
ものである。このＭＯＣＡｃ基は強力な蛍光基であり、
消光性蛍光基質のオリゴペプチドがレグマチュレインに
より切断されると、強力な蛍光を発することができる。
ド部分のＮ−末端側に、蛍光基である（７−メトキシク
マリン−４−イル）アセチル [(7-methoxycoumarin-4-y
l) acetyl]基（以下、ＭＯＣＡｃ基という。）を有する
ものである。このＭＯＣＡｃ基は強力な蛍光基であり、
消光性蛍光基質のオリゴペプチドがレグマチュレインに
より切断されると、強力な蛍光を発することができる。
【００２３】 この蛍光基は、Ｎ−末端側のアミノ酸残基
に配する。Ｎ−末端側とは、レグマチュレインにより切
断されるアスパラギン残基よりもＮ−末端側であること
を意味するが、請求項３記載の本発明のように、Ｎ−末
端のアミノ酸のアミノ基に結合させることが好ましい。
また、Ｎ−末端側のアミノ酸残基の種類は特に限定され
ないが、グリシン、チロシン又はアスパラギン酸である
ことが好ましい。
に配する。Ｎ−末端側とは、レグマチュレインにより切
断されるアスパラギン残基よりもＮ−末端側であること
を意味するが、請求項３記載の本発明のように、Ｎ−末
端のアミノ酸のアミノ基に結合させることが好ましい。
また、Ｎ−末端側のアミノ酸残基の種類は特に限定され
ないが、グリシン、チロシン又はアスパラギン酸である
ことが好ましい。
【００２４】 一方、消光性蛍光基質のオリゴペプチド部
分のＣ−末端のアミノ酸に、ＭＯＣＡｃ基の効果的なク
エンチャー（蛍光吸収基）である２，４−ジニトロフェ
ニル[2,4-dinitrophenyl]基（以下、Ｄｎｐ基とい
う。）を配する。Ｄｎｐ基をＣ−末端側に配する消光性
蛍光基質は、レグマチュレインによる切断前にＭＯＣＡ
ｃ基による蛍光を発しない。酵素による作用を受ける
と、該基質はＭＯＣＡｃ基を有するＮ−末端側とＤｎｐ
基を有するＣ−末端側とに切断される。すると、ＭＯＣ
Ａｃ基を有するＮ−末端側の断片は、Ｄｎｐ基の影響は
受けなくなるので、蛍光を発生する。
分のＣ−末端のアミノ酸に、ＭＯＣＡｃ基の効果的なク
エンチャー（蛍光吸収基）である２，４−ジニトロフェ
ニル[2,4-dinitrophenyl]基（以下、Ｄｎｐ基とい
う。）を配する。Ｄｎｐ基をＣ−末端側に配する消光性
蛍光基質は、レグマチュレインによる切断前にＭＯＣＡ
ｃ基による蛍光を発しない。酵素による作用を受ける
と、該基質はＭＯＣＡｃ基を有するＮ−末端側とＤｎｐ
基を有するＣ−末端側とに切断される。すると、ＭＯＣ
Ａｃ基を有するＮ−末端側の断片は、Ｄｎｐ基の影響は
受けなくなるので、蛍光を発生する。
【００２５】 ここで、Ｃ−末端側とは、通常Ｃ−末端か
ら２残基目までのアミノ酸残基を意味する。Ｄｎｐ基を
配するアミノ酸は特に限定されないが、導入の容易性か
ら、請求項３記載の本発明の如く、リジン残基とし、そ
のε−アミノ基に結合させることが好ましい。
ら２残基目までのアミノ酸残基を意味する。Ｄｎｐ基を
配するアミノ酸は特に限定されないが、導入の容易性か
ら、請求項３記載の本発明の如く、リジン残基とし、そ
のε−アミノ基に結合させることが好ましい。
【００２６】 このようなＭＯＣＡｃをＮ−末端側に、Ｄ
ｎｐをＣ−末端側に有する消光性蛍光ペプチド、すなわ
ちＭＯＣＡｃ−Ｄｎｐ系のペプチドは、蛍光の励起波長
（Ｅｘ）３２８ｎｍ、蛍光の波長（Ｅｍ）３９３ｎｍと
十分に離れており、蛍光のバックグランドが低いという
特徴がある。
ｎｐをＣ−末端側に有する消光性蛍光ペプチド、すなわ
ちＭＯＣＡｃ−Ｄｎｐ系のペプチドは、蛍光の励起波長
（Ｅｘ）３２８ｎｍ、蛍光の波長（Ｅｍ）３９３ｎｍと
十分に離れており、蛍光のバックグランドが低いという
特徴がある。
【００２７】 本発明の定量法は、上述の消光性蛍光基質
に、測定対象であるレグマチュレインを酵素反応させ、
生じた蛍光を蛍光強度で測定する方法である。
に、測定対象であるレグマチュレインを酵素反応させ、
生じた蛍光を蛍光強度で測定する方法である。
【００２８】 通常、酵素反応は基質及び酵素試料を溶媒
に溶解した反応液を用いて行う。例えば、以下のように
して行うことができる。反応液は、ｐＨ６〜７のクエン
酸緩衝液等の緩衝液に、レグマチュレインを含む試料、
消光性蛍光基質及びジチオスレイトール等の還元剤、ブ
リジ系界面活性剤のような界面活性剤、その他の成分で
構成することができる。
に溶解した反応液を用いて行う。例えば、以下のように
して行うことができる。反応液は、ｐＨ６〜７のクエン
酸緩衝液等の緩衝液に、レグマチュレインを含む試料、
消光性蛍光基質及びジチオスレイトール等の還元剤、ブ
リジ系界面活性剤のような界面活性剤、その他の成分で
構成することができる。
【００２９】 消光性蛍光基質は疎水性が高いので、反応
液に対する溶解性に劣るため、通常は先にジメチルスル
フォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後に反応液に添加す
る。ここで、ＤＭＳＯの使用量は、反応液中の濃度が通
常４％（ｖ／ｖ）以下となるような量とする。この範囲
を超えると、ＤＭＳＯがレグマチュレインの活性に対し
て阻害を示す可能性があるからである。
液に対する溶解性に劣るため、通常は先にジメチルスル
フォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後に反応液に添加す
る。ここで、ＤＭＳＯの使用量は、反応液中の濃度が通
常４％（ｖ／ｖ）以下となるような量とする。この範囲
を超えると、ＤＭＳＯがレグマチュレインの活性に対し
て阻害を示す可能性があるからである。
【００３０】 反応液への消光性蛍光基質の添加量は、該
基質をＤＭＳＯに０．２ｍＭとなるように溶解した場
合、反応液１ｍｌあたり５〜４０μＬとすることが好ま
しい。この範囲を超えると、蛍光が過剰となる。一方、
この範囲に満たないと、蛍光が観察されず、酵素活性の
定量に支障をきたす。
基質をＤＭＳＯに０．２ｍＭとなるように溶解した場
合、反応液１ｍｌあたり５〜４０μＬとすることが好ま
しい。この範囲を超えると、蛍光が過剰となる。一方、
この範囲に満たないと、蛍光が観察されず、酵素活性の
定量に支障をきたす。
【００３１】 酵素反応は、上記反応液を通常２０〜３７
℃、好ましくは３５℃で５〜６０分間、好ましくは１５
分間静置することにより行う。酵素反応中に、試料中の
レグマチュレインにより消光性蛍光基質が分解され、蛍
光が発生する。例えば、消光性蛍光基質として、配列番
号１記載のアミノ酸配列のＮ−末端のグリシン残基のア
ミノ基にＭＯＣＡｃを、Ｃ−末端のリジン残基のε−ア
ミノ基にＤｎｐを配したＭＯＣＡｃ−Ｄｎｐ系のペプチ
ドを用いた場合、酵素反応により、消光性蛍光基質のア
スパラギン（Ｎ−末端から６番目）とグリシン（Ｎ−末
端から７番目）との間が切断される。
℃、好ましくは３５℃で５〜６０分間、好ましくは１５
分間静置することにより行う。酵素反応中に、試料中の
レグマチュレインにより消光性蛍光基質が分解され、蛍
光が発生する。例えば、消光性蛍光基質として、配列番
号１記載のアミノ酸配列のＮ−末端のグリシン残基のア
ミノ基にＭＯＣＡｃを、Ｃ−末端のリジン残基のε−ア
ミノ基にＤｎｐを配したＭＯＣＡｃ−Ｄｎｐ系のペプチ
ドを用いた場合、酵素反応により、消光性蛍光基質のア
スパラギン（Ｎ−末端から６番目）とグリシン（Ｎ−末
端から７番目）との間が切断される。
【００３２】 酢酸等の反応停止剤を添加することにより
酵素反応を停止した後、酵素反応により生じた消光性蛍
光基質の蛍光強度を測定する。測定装置としては、通常
使用されるものを用いることができ、例えば日立社製、
蛍光光度計Ｆ２０００で測定することができる。測定し
た蛍光強度は、他の試料の測定値と比較することによ
り、相対的な酵素活性を知ることができる。また、この
蛍光強度を、予め高速液体クロマトグラフィー等の手段
により測定しておいた同試料の酵素活性と照合すること
により、対応する酵素の定量が可能である。
酵素反応を停止した後、酵素反応により生じた消光性蛍
光基質の蛍光強度を測定する。測定装置としては、通常
使用されるものを用いることができ、例えば日立社製、
蛍光光度計Ｆ２０００で測定することができる。測定し
た蛍光強度は、他の試料の測定値と比較することによ
り、相対的な酵素活性を知ることができる。また、この
蛍光強度を、予め高速液体クロマトグラフィー等の手段
により測定しておいた同試料の酵素活性と照合すること
により、対応する酵素の定量が可能である。
【００３３】 したがって、本発明の方法では、レグマチ
ュレインのみを有する試料のみならず、他のプロテアー
ゼや蛍光を阻害する物質が多量に含まれるサンプル、例
えば粗抽出物での測定も可能である。すなわち、本発明
の方法によりサンプルの蛍光測定を行った結果、サンプ
ル中に蛍光を阻害する物質が存在する可能性が認められ
る場合にも、消光性蛍光基質の代わりに、実施例１で用
いるＮＮＮＥＬＥＬ（Asp Asp Asp Glu Leu Glu Leu)の
配列からなるペプチド等の指標ペプチドを用いた場合の
酵素活性を、ＨＰＬＣで定量し、該定量値と先の蛍光強
度測定値とを照らし合わせた上で、活性の見積もりを行
うことができる。
ュレインのみを有する試料のみならず、他のプロテアー
ゼや蛍光を阻害する物質が多量に含まれるサンプル、例
えば粗抽出物での測定も可能である。すなわち、本発明
の方法によりサンプルの蛍光測定を行った結果、サンプ
ル中に蛍光を阻害する物質が存在する可能性が認められ
る場合にも、消光性蛍光基質の代わりに、実施例１で用
いるＮＮＮＥＬＥＬ（Asp Asp Asp Glu Leu Glu Leu)の
配列からなるペプチド等の指標ペプチドを用いた場合の
酵素活性を、ＨＰＬＣで定量し、該定量値と先の蛍光強
度測定値とを照らし合わせた上で、活性の見積もりを行
うことができる。
【００３４】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に
説明するが、本発明はこれらにより何ら制限を受けるも
のではない。
説明するが、本発明はこれらにより何ら制限を受けるも
のではない。
【００３５】 実施例１〔レグマチュレインのアスパラギ
ン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の検出〕 （１）ＭＯＣＡｃ−Ｄｎｐ系消光性基質の蛍光強度測定 ダイズグリシニン前駆体サブユニットのうち、Ａ2Ｂ1a
サブユニットの酸性サブユニットと塩基性サブユニット
の切断部位を基にして設計したオリゴペプチド（配列表
の配列番号１参照）のＮ−末端のグリシン残基のアミノ
基にＭＯＣＡｃ基を、Ｃ−末端から３番目のリジン残基
のε−アミノ基にＤｎｐ基を、配したＭＯＣＡｃ−Ｄｎ
ｐ系ペプチドを作成し、これを消光性蛍光基質（以下、
基質１とする。）とした。この基質１をＤＭＳＯに０．
２ｍＭの濃度となるように溶解し、これを用いて第１表
に示す組成を有する反応液を作成した。
ン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の検出〕 （１）ＭＯＣＡｃ−Ｄｎｐ系消光性基質の蛍光強度測定 ダイズグリシニン前駆体サブユニットのうち、Ａ2Ｂ1a
サブユニットの酸性サブユニットと塩基性サブユニット
の切断部位を基にして設計したオリゴペプチド（配列表
の配列番号１参照）のＮ−末端のグリシン残基のアミノ
基にＭＯＣＡｃ基を、Ｃ−末端から３番目のリジン残基
のε−アミノ基にＤｎｐ基を、配したＭＯＣＡｃ−Ｄｎ
ｐ系ペプチドを作成し、これを消光性蛍光基質（以下、
基質１とする。）とした。この基質１をＤＭＳＯに０．
２ｍＭの濃度となるように溶解し、これを用いて第１表
に示す組成を有する反応液を作成した。
【００３６】
【表１】第１表〔反応液組成〕
【００３７】上記反応液を３５℃、１５分の条件で酵素
反応を行い、５Ｎ酢酸を１００μＬ加えて反応を停止さ
せた。反応液の蛍光を日立社製、蛍光光度計Ｆ２０００
で測定した。その結果、励起波長（Ｅｘ）３２８ｎｍで
蛍光波長（Ｅｍ）３９３ｎｍの蛍光が観察された。この
ことから、反応液中に含まれるレグマチュレインが酵素
反応を起こし、消光性蛍光基質（基質１）のアスパラギ
ン残基とグリシン残基との間を切断したことが判明し
た。
反応を行い、５Ｎ酢酸を１００μＬ加えて反応を停止さ
せた。反応液の蛍光を日立社製、蛍光光度計Ｆ２０００
で測定した。その結果、励起波長（Ｅｘ）３２８ｎｍで
蛍光波長（Ｅｍ）３９３ｎｍの蛍光が観察された。この
ことから、反応液中に含まれるレグマチュレインが酵素
反応を起こし、消光性蛍光基質（基質１）のアスパラギ
ン残基とグリシン残基との間を切断したことが判明し
た。
【００３８】 （２）ＭＯＣＡｃ−Ｄｎｐ系消光性基質の
蛍光強度とペプチド切断量との関係 次に、（１）において、蛍光強度１００のときの具体的
な酵素活性（ペプチド切断量）を高速液体クロマトグラ
フィー法で測定し、蛍光強度の測定値と切断されるペプ
チドの量との関係を調べた。
蛍光強度とペプチド切断量との関係 次に、（１）において、蛍光強度１００のときの具体的
な酵素活性（ペプチド切断量）を高速液体クロマトグラ
フィー法で測定し、蛍光強度の測定値と切断されるペプ
チドの量との関係を調べた。
【００３９】 上記基質１の代わりにＮＮＮＥＬＥＬ（As
p Asp Asp Glu Leu Glu Leu)の配列から成る合成ペプチ
ド（以下、ＮＮＮＥＬＥＬペプチドという。）を、１．
５ｎｍｏｌの濃度で用いた他は、第１表に示したものと
同じ組成の反応液を用いた。酵素反応条件も３５℃で１
５分間とし、先の蛍光試験で蛍光強度が１００を示す際
の条件と一致させた。なお、このＮＮＮＥＬＥＬペプチ
ドがレグマチュレインの作用を受けると、ＮＮＮとＥＬ
ＥＬとの断片に切断されることになる。
p Asp Asp Glu Leu Glu Leu)の配列から成る合成ペプチ
ド（以下、ＮＮＮＥＬＥＬペプチドという。）を、１．
５ｎｍｏｌの濃度で用いた他は、第１表に示したものと
同じ組成の反応液を用いた。酵素反応条件も３５℃で１
５分間とし、先の蛍光試験で蛍光強度が１００を示す際
の条件と一致させた。なお、このＮＮＮＥＬＥＬペプチ
ドがレグマチュレインの作用を受けると、ＮＮＮとＥＬ
ＥＬとの断片に切断されることになる。
【００４０】 反応液の適当量を逆相カラム（東ソー社
製、Ｓｉｌｉｃａ ＯＤＳ １２０Ｔφ４．６ｍｍ×１
５０ｍｍ）を接続した高速液体クロマトグラフィー（島
津社製、ＬＣ−６ＡＤ）を用い、０．１％ＴＦＡ−０．
１％ＴＦＡ／３０％アセトニトリルの直線濃度勾配を、
該カラムのマニュアルに従い、１ｍＬ／ｍｉｎの流速下
３０分間行った。ピークの検出は、２２０ｎｍの波長で
島津社製、ＳＰＤ−６ＡＶを用いて行った。
製、Ｓｉｌｉｃａ ＯＤＳ １２０Ｔφ４．６ｍｍ×１
５０ｍｍ）を接続した高速液体クロマトグラフィー（島
津社製、ＬＣ−６ＡＤ）を用い、０．１％ＴＦＡ−０．
１％ＴＦＡ／３０％アセトニトリルの直線濃度勾配を、
該カラムのマニュアルに従い、１ｍＬ／ｍｉｎの流速下
３０分間行った。ピークの検出は、２２０ｎｍの波長で
島津社製、ＳＰＤ−６ＡＶを用いて行った。
【００４１】 その結果得られたレグマチュレインによる
合成ペプチドの分解ルールを示すＨＰＬＣパターンを図
１に示す。また、レグマチュレインのＮＮＮＥＬＥＬペ
プチドに対する切断活性の結果を第２表に示す。
合成ペプチドの分解ルールを示すＨＰＬＣパターンを図
１に示す。また、レグマチュレインのＮＮＮＥＬＥＬペ
プチドに対する切断活性の結果を第２表に示す。
【００４２】
【表２】第２表〔ＨＰＬＣを用いたレグマチュレインの
ＮＮＮＥＬＥＬペプチドに対する切断活性〕
ＮＮＮＥＬＥＬペプチドに対する切断活性〕
【００４３】図１及び第２表より、（１）において蛍光
強度１００の場合に得られる蛍光強度は、レグマチュレ
インをＮＮＮＥＬＥＬペプチド１．５ｎｍｏｌのうちＥ
ＬＥＬペプチド０．５ｎｍｏｌが遊離した場合に相当す
るものであることがわかる。以上の測定結果より、酵素
反応開始１５分間で１．５ｎｍｏｌのペプチドの３分の
１が切断されたときの蛍光強度が１００であるので、１
５分間でその１００分の１、つまり蛍光強度が１の場合
のペプチド遊離量は０．００５ｎｍｏｌとなり、これは
１分間当たりに換算すると、ペプチドの切断量は僅か
０．３ｐｍｏｌとなる。本発明の方法によれば、蛍光強
度が１以上、すなわち僅か０．３ｐｍｏｌのペプチドが
切断されただけでも検出が可能であり、この方法は簡便
で、かつ感度の高い測定方法であることが示された。
強度１００の場合に得られる蛍光強度は、レグマチュレ
インをＮＮＮＥＬＥＬペプチド１．５ｎｍｏｌのうちＥ
ＬＥＬペプチド０．５ｎｍｏｌが遊離した場合に相当す
るものであることがわかる。以上の測定結果より、酵素
反応開始１５分間で１．５ｎｍｏｌのペプチドの３分の
１が切断されたときの蛍光強度が１００であるので、１
５分間でその１００分の１、つまり蛍光強度が１の場合
のペプチド遊離量は０．００５ｎｍｏｌとなり、これは
１分間当たりに換算すると、ペプチドの切断量は僅か
０．３ｐｍｏｌとなる。本発明の方法によれば、蛍光強
度が１以上、すなわち僅か０．３ｐｍｏｌのペプチドが
切断されただけでも検出が可能であり、この方法は簡便
で、かつ感度の高い測定方法であることが示された。
【００４４】 比較例１〔Abe Y.らの合成ペプチドを用い
たレグマチュレイン活性の測定〕 Abe Y. et al., Journal of Biological Chemistry, 26
8, 3525-3529 (1993)に記載の方法で用いている合成ペ
プチドを使用してレグマチュレインの活性測定を試み
た。
たレグマチュレイン活性の測定〕 Abe Y. et al., Journal of Biological Chemistry, 26
8, 3525-3529 (1993)に記載の方法で用いている合成ペ
プチドを使用してレグマチュレインの活性測定を試み
た。
【００４５】 まず、Pro-Glu-Ala-Asn からなるペプチド
において、Ｎ−末端のプロリン残基のアミノ基にＤｎｐ
基を配し、Ｃ−末端のアスパラギン残基のカルボキシル
基をアミド化した基質Ａを作成した。基質１を用いた測
定の結果、３５℃、１５分で蛍光強度４０を示すことが
わかっているレグマチュレインについて、基質１の代わ
りに基質Ａを用いて活性を測定した。すなわち、実施例
１で用いた第１表と同様の組成の反応液５０μＬ（基質
２０μＭ）を作成し、第３表に示した所定の時間（０、
１５、３０、６０、１２０分後）酵素反応を行った後、
それぞれギ酸５μＬを加えて反応を停止させた。
において、Ｎ−末端のプロリン残基のアミノ基にＤｎｐ
基を配し、Ｃ−末端のアスパラギン残基のカルボキシル
基をアミド化した基質Ａを作成した。基質１を用いた測
定の結果、３５℃、１５分で蛍光強度４０を示すことが
わかっているレグマチュレインについて、基質１の代わ
りに基質Ａを用いて活性を測定した。すなわち、実施例
１で用いた第１表と同様の組成の反応液５０μＬ（基質
２０μＭ）を作成し、第３表に示した所定の時間（０、
１５、３０、６０、１２０分後）酵素反応を行った後、
それぞれギ酸５μＬを加えて反応を停止させた。
【００４６】 反応停止後、ＨＰＬＣにアプライし、実施
例１と同様の条件で酵素活性を測定した。検出は、３５
０ｎｍ、分離溶媒は４７ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
／２０％アセトニトリルで行った。反応開始後１２０分
までインキュベート（３５℃）した結果を第３表に示
す。
例１と同様の条件で酵素活性を測定した。検出は、３５
０ｎｍ、分離溶媒は４７ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
／２０％アセトニトリルで行った。反応開始後１２０分
までインキュベート（３５℃）した結果を第３表に示
す。
【００４７】
【表３】第３表〔Abe Y.らのペプチドの切断活性〕
【００４８】第３表より、レグマチュレインは、上記基
質を分解しないことがわかる。このことから、Abe Y.ら
の方法に記載のペプチドを用いても、レグマチュレイン
の酵素活性を測定できないことが明らかである。
質を分解しないことがわかる。このことから、Abe Y.ら
の方法に記載のペプチドを用いても、レグマチュレイン
の酵素活性を測定できないことが明らかである。
【００４９】 比較例２〔Asha A. Kembhaviらの合成ペプ
チドを用いたレグマチュレインの酵素活性測定〕 Asha A. Kembhavi et al., Archives of Biochemistry
and Biophysics, 303,208-213 (1993) に記載の方法で
用いている合成ペプチドを使用してレグマチュレインの
活性測定を試みた。
チドを用いたレグマチュレインの酵素活性測定〕 Asha A. Kembhavi et al., Archives of Biochemistry
and Biophysics, 303,208-213 (1993) に記載の方法で
用いている合成ペプチドを使用してレグマチュレインの
活性測定を試みた。
【００５０】 Phe-Ala-Ala-Asn からなるペプチドにおい
て、Ｎ−末端のフェニルアラニン残基のアミノ基にbenz
yloxycarbonyl 基を配し、一方Ｃ−末端側のアスパラギ
ン残基のカルボキシル基を7-(4-methyl) coumarylamide
化した基質Ｂを作成した。基質１を用いた測定の結果、
３５℃、１５分で蛍光強度４０を示すことがわかってい
るレグマチュレインについて、基質１の代わりに基質Ｂ
を用いて活性を測定した。すなわち、実施例１で用いた
第１表と同様の組成の反応液１ｍＭ（ただし、基質１０
μＭ）を作成し、比較例１と同様に酵素反応させた。反
応液の蛍光測定（λＥｘ＝３６０ｎｍ、λＥｍ＝４６０
ｎｍ）を行った。結果を第４表に示す。
て、Ｎ−末端のフェニルアラニン残基のアミノ基にbenz
yloxycarbonyl 基を配し、一方Ｃ−末端側のアスパラギ
ン残基のカルボキシル基を7-(4-methyl) coumarylamide
化した基質Ｂを作成した。基質１を用いた測定の結果、
３５℃、１５分で蛍光強度４０を示すことがわかってい
るレグマチュレインについて、基質１の代わりに基質Ｂ
を用いて活性を測定した。すなわち、実施例１で用いた
第１表と同様の組成の反応液１ｍＭ（ただし、基質１０
μＭ）を作成し、比較例１と同様に酵素反応させた。反
応液の蛍光測定（λＥｘ＝３６０ｎｍ、λＥｍ＝４６０
ｎｍ）を行った。結果を第４表に示す。
【００５１】
【表４】第４表〔Asha A. Kembhaviらのペプチドの切断
活性〕
活性〕
【００５２】第４表から明らかなように、基質Ｂの反応
液からは蛍光は観察されなかった。このことから、レグ
マチュレインは、上記基質Ｂの分解能を有さず、Asha
A.Kembhavi et al. (1993)に記載のペプチドを用いて
も、レグマチュレインの酵素活性を測定できないことが
示された。
液からは蛍光は観察されなかった。このことから、レグ
マチュレインは、上記基質Ｂの分解能を有さず、Asha
A.Kembhavi et al. (1993)に記載のペプチドを用いて
も、レグマチュレインの酵素活性を測定できないことが
示された。
【００５３】 実施例２〔消光性蛍光基質のアミノ酸配列
の検討〕 実施例１で用いたダイズグリシニン前駆体サブユニット
の配列をもとに作成した基質１のアミノ酸の一部を他の
残基に置き換えることにより、９種類の消光性蛍光基質
（以下、それぞれ基質２〜１０とする。）を合成した。
基質２〜１０のペプチド部分の配列は、配列表の配列番
号２〜１０に示す通りである。
の検討〕 実施例１で用いたダイズグリシニン前駆体サブユニット
の配列をもとに作成した基質１のアミノ酸の一部を他の
残基に置き換えることにより、９種類の消光性蛍光基質
（以下、それぞれ基質２〜１０とする。）を合成した。
基質２〜１０のペプチド部分の配列は、配列表の配列番
号２〜１０に示す通りである。
【００５４】 基質２〜１０の配列は、基質１などの配列
の一部をを置き換えたものである。すなわち、基質２〜
４（配列表の配列番号２〜４参照）は、基質１（配列表
の配列番号１参照）においてＮ−末端から８番目（Ｎの
２つＣ−末端側）のイソロイシン残基をそれぞれロイシ
ン残基、バリン残基、グリシン残基に置き換えたもので
ある。基質５、６（配列表の配列番号５、６参照）は、
基質１においてＮ−末端から７番目（Ｎの１つＣ−末端
側）のグリシン残基をそれぞれアルギニン残基、アラニ
ン残基に置き換えたものである。基質７〜９（配列表の
配列番号７〜９参照）は、それぞれ基質１〜３において
Ｎ−末端から７番目のアミノ酸と８番目のアミノ酸とを
相互に入れ換えたものである。基質１０（配列表の配列
番号１０参照）は、基質１のＮ−末端から６番目のアス
パラギン残基をアスパラギン酸残基に置き換えたもので
ある。これら各基質の酵素活性を、実施例１と同様の方
法により測定した。結果を第５表に示す。
の一部をを置き換えたものである。すなわち、基質２〜
４（配列表の配列番号２〜４参照）は、基質１（配列表
の配列番号１参照）においてＮ−末端から８番目（Ｎの
２つＣ−末端側）のイソロイシン残基をそれぞれロイシ
ン残基、バリン残基、グリシン残基に置き換えたもので
ある。基質５、６（配列表の配列番号５、６参照）は、
基質１においてＮ−末端から７番目（Ｎの１つＣ−末端
側）のグリシン残基をそれぞれアルギニン残基、アラニ
ン残基に置き換えたものである。基質７〜９（配列表の
配列番号７〜９参照）は、それぞれ基質１〜３において
Ｎ−末端から７番目のアミノ酸と８番目のアミノ酸とを
相互に入れ換えたものである。基質１０（配列表の配列
番号１０参照）は、基質１のＮ−末端から６番目のアス
パラギン残基をアスパラギン酸残基に置き換えたもので
ある。これら各基質の酵素活性を、実施例１と同様の方
法により測定した。結果を第５表に示す。
【００５５】
【表５】第５表〔合成した１０種類の消光性基質に対す
るレグマチュレインの活性〕
るレグマチュレインの活性〕
【００５６】第５表より、以下のことが分かる。まず、
基質１０は蛍光の発生が全く観察されないことから、ア
スパラギン残基を含まないペプチドは切断されず、酵素
反応が生起しない。このことから、レグマチュレインの
アスパラギン残基に対する特異性の観点より、酵素活性
を示す消光性蛍光基質は、必ずアスパラギン残基を含む
必要があることがわかる。
基質１０は蛍光の発生が全く観察されないことから、ア
スパラギン残基を含まないペプチドは切断されず、酵素
反応が生起しない。このことから、レグマチュレインの
アスパラギン残基に対する特異性の観点より、酵素活性
を示す消光性蛍光基質は、必ずアスパラギン残基を含む
必要があることがわかる。
【００５７】 次に、基質１〜９については、いずれもア
スパラギン残基を有するものであるが、基質２〜６は、
高い蛍光強度を示すのに対し、基質７〜９はほとんど蛍
光を示さない。酵素活性を示した基質２〜６の中でも、
基質２及び３は、基質１と同等又はそれ以上の高い活性
を示している。このことから、基質１のアスパラギン残
基のＣ−末端側の２番目のイソロイシン残基をロイシン
残基又はバリン残基に代えることにより、同等又はそれ
以上の酵素活性が得られることがわかる。
スパラギン残基を有するものであるが、基質２〜６は、
高い蛍光強度を示すのに対し、基質７〜９はほとんど蛍
光を示さない。酵素活性を示した基質２〜６の中でも、
基質２及び３は、基質１と同等又はそれ以上の高い活性
を示している。このことから、基質１のアスパラギン残
基のＣ−末端側の２番目のイソロイシン残基をロイシン
残基又はバリン残基に代えることにより、同等又はそれ
以上の酵素活性が得られることがわかる。
【００５８】 また、基質２、３ほどではないが、基質４
〜６も酵素活性を示した。基質４の蛍光強度から、アス
パラギン残基のＣ−末端側の２番目の残基をグリシン残
基に代えた消光性蛍光基質も、レグマチュレインの攻撃
を受けることがわかる。さらに、基質５、６の結果よ
り、アスパラギン残基のＣ−末端側の１番目の残基をア
ルギニン残基又はアラニン残基に代えても酵素活性を有
することが明らかである。
〜６も酵素活性を示した。基質４の蛍光強度から、アス
パラギン残基のＣ−末端側の２番目の残基をグリシン残
基に代えた消光性蛍光基質も、レグマチュレインの攻撃
を受けることがわかる。さらに、基質５、６の結果よ
り、アスパラギン残基のＣ−末端側の１番目の残基をア
ルギニン残基又はアラニン残基に代えても酵素活性を有
することが明らかである。
【００５９】 一方、基質７〜９の場合は、酵素活性が全
く認められなかった。これらの基質では、Ｎ−末端から
２番目の残基がグリシン残基であるが、同様の基質４の
場合には、良好な結果を得られている。この点を考慮す
ると、基質７〜９において酵素活性を示さない理由は、
アスパラギン残基のＣ−末端側の１番目の残基がロイシ
ン残基、イソロイシン残基またはバリン残基に置換され
ているからであることがわかる。
く認められなかった。これらの基質では、Ｎ−末端から
２番目の残基がグリシン残基であるが、同様の基質４の
場合には、良好な結果を得られている。この点を考慮す
ると、基質７〜９において酵素活性を示さない理由は、
アスパラギン残基のＣ−末端側の１番目の残基がロイシ
ン残基、イソロイシン残基またはバリン残基に置換され
ているからであることがわかる。
【００６０】 上記結果より、植物種子貯蔵タンパク質か
ら設計した消光性蛍光基質であ基質１において、そのア
ミノ酸配列を一定の条件下で置換しても、同等の酵素活
性を観測できることが証明された。
ら設計した消光性蛍光基質であ基質１において、そのア
ミノ酸配列を一定の条件下で置換しても、同等の酵素活
性を観測できることが証明された。
【００６１】 実施例３〔消光性蛍光基質を利用したレグ
マチュレインの特性解析〕 酵素反応条件を少し変えたこと以外は、基質１を利用し
た実施例１と同じ手順で試験を行い、レグマチュレイン
の有するｐＨ安定性、至適ｐＨ、温度安定性及び至適温
度の検討を行った。
マチュレインの特性解析〕 酵素反応条件を少し変えたこと以外は、基質１を利用し
た実施例１と同じ手順で試験を行い、レグマチュレイン
の有するｐＨ安定性、至適ｐＨ、温度安定性及び至適温
度の検討を行った。
【００６２】 （１）至適ｐＨの検討 種々の緩衝液を用いて酵素反応時のｐＨを１．９〜１
１．４として酵素活性を測定した。ｐＨ４〜９における
測定結果を図２に示す。図２より、ｐＨ６．８で最も高
い蛍光強度を示していることから、レグマチュレインの
至適ｐＨは６．８であることがわかる。
１．４として酵素活性を測定した。ｐＨ４〜９における
測定結果を図２に示す。図２より、ｐＨ６．８で最も高
い蛍光強度を示していることから、レグマチュレインの
至適ｐＨは６．８であることがわかる。
【００６３】 （２）ｐＨ安定性の検討 上記（１）と同様にして反応液をそれぞれｐＨ１．９〜
１１．４の範囲とし、２０℃にて３０分で保存した後
に、緩衝液でｐＨを６．８に戻し、その後に酵素活性を
測定した。結果を図３に示す。図３より、ｐＨ２から９
の間で本酵素は安定であることが明らかである。
１１．４の範囲とし、２０℃にて３０分で保存した後
に、緩衝液でｐＨを６．８に戻し、その後に酵素活性を
測定した。結果を図３に示す。図３より、ｐＨ２から９
の間で本酵素は安定であることが明らかである。
【００６４】 （３）至適温度の検討 酵素反応温度を０〜６０℃とした他は、実施例１と同様
に行い、至適温度に対する検討を行った。結果を図４に
示す。図４より、３５℃が本酵素の至適温度であること
がわかる。
に行い、至適温度に対する検討を行った。結果を図４に
示す。図４より、３５℃が本酵素の至適温度であること
がわかる。
【００６５】 （４）温度安定性の検討 反応液を０〜６０℃の範囲で３０分間静置後、最適条件
（３５℃）に戻して酵素活性を測定した。結果を図５に
示す。図５より、本酵素の安定温度領域は０〜２０℃と
極めて低いことが判明した。
（３５℃）に戻して酵素活性を測定した。結果を図５に
示す。図５より、本酵素の安定温度領域は０〜２０℃と
極めて低いことが判明した。
【００６６】
【発明の効果】本発明の方法は、特定の消光性蛍光基質
に酵素を作用させることにより生ずる蛍光強度を測定す
るだけで、植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプ
ロテアーゼを定量することが可能であることから、従来
法に比べ、簡便である上に、短期間に測定することがで
きる。
に酵素を作用させることにより生ずる蛍光強度を測定す
るだけで、植物由来のアスパラギン残基特異的エンドプ
ロテアーゼを定量することが可能であることから、従来
法に比べ、簡便である上に、短期間に測定することがで
きる。
【００６７】 さらに、本発明の方法は、他のプロテアー
ゼや蛍光を阻害する物質が多量に含まれるサンプル、例
えば粗抽出物であっても、同様に迅速、かつ短期間に酵
素の特異的な定量が可能である。また、本発明の定量法
を用いれば、非常に高い感度で酵素活性を測定できる。
例えば、ペプチド１．５ｎｍｏｌから１分間に０．３ｐ
ｍｏｌ程度の切断ペプチドを生じさせる程度の弱い酵素
活性でも測定が可能である。
ゼや蛍光を阻害する物質が多量に含まれるサンプル、例
えば粗抽出物であっても、同様に迅速、かつ短期間に酵
素の特異的な定量が可能である。また、本発明の定量法
を用いれば、非常に高い感度で酵素活性を測定できる。
例えば、ペプチド１．５ｎｍｏｌから１分間に０．３ｐ
ｍｏｌ程度の切断ペプチドを生じさせる程度の弱い酵素
活性でも測定が可能である。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director of National Food Research Institute, Ministry of Agricult ure, Forestry and Fisheries <120> アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の定量法 <130> P100995K <160> 10 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 1 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Gly Ile Lys Arg Arg 11 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 2 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Gly Leu Lys Arg Arg 11 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 3 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Gly Val Lys Arg Arg 11 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 4 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Gly Gly Lys Arg Arg 11 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 5 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Arg Ile Lys Arg Arg 11 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 6 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Ala Ile Lys Arg Arg 11 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 7 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Ile Gly Lys Arg Arg 11 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 8 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Leu Gly Lys Arg Arg 11 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 9 Gly Lys Ser Arg Arg Asn Val Gly Lys Arg Arg 11 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Glycine max <220> <221> PEPTIDE <400> 10 Gly Lys Ser Arg Arg Asp Gly Ile Lys Arg Arg 11
【図面の簡単な説明】
【図１】 レグマチュレインによる合成ペプチドの分解
ルールを示すＨＰＬＣパターンである。
ルールを示すＨＰＬＣパターンである。
【図２】 本発明の消光性蛍光基質を用いて測定したレ
グマチュレインの至適ｐＨを示すグラフである。
グマチュレインの至適ｐＨを示すグラフである。
【図３】 本発明の消光性蛍光基質を用いて測定したレ
グマチュレインのｐＨ安定性を示すグラフである。
グマチュレインのｐＨ安定性を示すグラフである。
【図４】 本発明の消光性蛍光基質を用いて測定したレ
グマチュレインの至適温度を示すグラフである。
グマチュレインの至適温度を示すグラフである。
【図５】 本発明の消光性蛍光基質を用いて測定したレ
グマチュレインの温度安定性を示すグラフである。
グマチュレインの温度安定性を示すグラフである。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/37 G01N 21/64 - 21/78 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ／ＰＩＲ／Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ
Claims (2)
- 【請求項１】 アミノ酸配列中にアスパラギン残基を少
なくとも１つ有すると共に、アスパラギン残基のＣ−末
端側がイソロイシン残基、ロイシン残基及びバリン残基
のいずれでもない、配列表の配列番号１〜６のいずれか
に記載のオリゴペプチドであって、７−メトキシクマリ
ン−４−ｙｌ−アセチル基をＮ−末端側に、２，４−ジ
ニトロフェニル基をＣ−末端側に配した消光性蛍光基質
を用いて、アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ
により切断された消光性蛍光基質から生ずる蛍光を測定
することを特徴とする植物由来アスパラギン残基特異的
エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法。 - 【請求項２】 消光性蛍光基質が、配列表の配列番号１
〜６のいずれかに記載のオリゴペプチドであって、７−
メトキシクマリン−４−ｙｌ−アセチル基をＮ−末端側
のグリシン残基のアミノ基に、２，４−ジニトロフェニ
ル基をＣ−末端側から３番目のリジン残基のε−アミノ
残基に配した消光性蛍光基質である請求項１記載の迅速
定量法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10327536A JP3015886B1 (ja) | 1998-11-04 | 1998-11-04 | 植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法 |
| US09/410,025 US6251623B1 (en) | 1998-11-04 | 1999-10-01 | Quick assay method for the activity of a plant-derived, asparagine residue-specific endoprotease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10327536A JP3015886B1 (ja) | 1998-11-04 | 1998-11-04 | 植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3015886B1 true JP3015886B1 (ja) | 2000-03-06 |
| JP2000139498A JP2000139498A (ja) | 2000-05-23 |
Family
ID=18200203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10327536A Expired - Lifetime JP3015886B1 (ja) | 1998-11-04 | 1998-11-04 | 植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼ活性の迅速定量法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6251623B1 (ja) |
| JP (1) | JP3015886B1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001009165A3 (en) * | 1999-07-29 | 2002-03-07 | Univ Johns Hopkins | ACTIVATION OF PEPTIDE PRODRUGS BY hK2 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LT3150988T (lt) * | 2015-10-01 | 2021-06-25 | Nanotemper Technologies Gmbh | Dalelių stabilumo ir agregacijos optinio matavimo sistema bei būdas |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2051702T3 (es) * | 1986-04-01 | 1994-07-01 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Derivados peptidicos y metodo para medir la actividad de sustancias fisiologicamente activas usandolos como sustratos. |
| JPH0773508B2 (ja) * | 1989-11-17 | 1995-08-09 | 寳酒造株式会社 | Ｌ―アスパラギンのアミド結合の水解方法及び試薬 |
| JPH0824576B2 (ja) * | 1992-07-22 | 1996-03-13 | 農林水産省食品総合研究所長 | 新規アスパラギニルエンドプロテアーゼとその製造法並びに利用法 |
| JP3012928B1 (ja) * | 1998-11-04 | 2000-02-28 | 農林水産省食品総合研究所長 | 植物由来アスパラギン残基特異的エンドプロテアーゼｃＤＮＡおよび遺伝子 |
-
1998
- 1998-11-04 JP JP10327536A patent/JP3015886B1/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-10-01 US US09/410,025 patent/US6251623B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001009165A3 (en) * | 1999-07-29 | 2002-03-07 | Univ Johns Hopkins | ACTIVATION OF PEPTIDE PRODRUGS BY hK2 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000139498A (ja) | 2000-05-23 |
| US6251623B1 (en) | 2001-06-26 |
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