JPH0824576B2 - 新規アスパラギニルエンドプロテアーゼとその製造法並びに利用法 - Google Patents
新規アスパラギニルエンドプロテアーゼとその製造法並びに利用法Info
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- JPH0824576B2 JPH0824576B2 JP4215739A JP21573992A JPH0824576B2 JP H0824576 B2 JPH0824576 B2 JP H0824576B2 JP 4215739 A JP4215739 A JP 4215739A JP 21573992 A JP21573992 A JP 21573992A JP H0824576 B2 JPH0824576 B2 JP H0824576B2
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/63—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from plants
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規アスパラギニルエ
ンドプロテアーゼとその製造法並びに利用法に関する。
ンドプロテアーゼとその製造法並びに利用法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】大豆をは
じめとする植物種子には貯蔵タンパク質が含まれてお
り、古くからタンパク質源としてこれらは利用されてき
ている。貯蔵タンパク質の中で、特にグリシニン型貯蔵
タンパク質は主要なタンパク質成分となっており、該タ
ンパク質源の物性やテクスチャに重要な働きをしてい
る。このグリシニン型貯蔵タンパク質は、図１に示すよ
うに、酸性および塩基性のサブユニット対より形成され
ており、発現後、両サブユニット間が特異的にプロテア
ーゼ、すなわち本発明のアスパラギニルエンドプロテア
ーゼにより切断されるプレプロタンパク質として合成さ
れる。この重要なタンパク質資源を活用するため、これ
らの遺伝子を微生物で発現させ、該タンパク質を大量に
生産する試みがこれまでになされている。しかし、微生
物により生産されるタンパク質は前駆体であり、これを
成熟化する方法は開発されていない。
じめとする植物種子には貯蔵タンパク質が含まれてお
り、古くからタンパク質源としてこれらは利用されてき
ている。貯蔵タンパク質の中で、特にグリシニン型貯蔵
タンパク質は主要なタンパク質成分となっており、該タ
ンパク質源の物性やテクスチャに重要な働きをしてい
る。このグリシニン型貯蔵タンパク質は、図１に示すよ
うに、酸性および塩基性のサブユニット対より形成され
ており、発現後、両サブユニット間が特異的にプロテア
ーゼ、すなわち本発明のアスパラギニルエンドプロテア
ーゼにより切断されるプレプロタンパク質として合成さ
れる。この重要なタンパク質資源を活用するため、これ
らの遺伝子を微生物で発現させ、該タンパク質を大量に
生産する試みがこれまでになされている。しかし、微生
物により生産されるタンパク質は前駆体であり、これを
成熟化する方法は開発されていない。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者は、微生物によ
り大量生産されるグリシニン型貯蔵タンパク質前駆体を
成熟化する方法を確立すべく鋭意研究した結果、この前
駆体を成熟化することができる新規なアスパラギニルエ
ンドプロテアーゼを見出し、その性質を解明することに
より本発明を完成するに到った。
り大量生産されるグリシニン型貯蔵タンパク質前駆体を
成熟化する方法を確立すべく鋭意研究した結果、この前
駆体を成熟化することができる新規なアスパラギニルエ
ンドプロテアーゼを見出し、その性質を解明することに
より本発明を完成するに到った。
【０００４】すなわち、本発明は第１に、被子植物また
は裸子植物の種子中より得られ、下記の理化学的性質を
有する新規アスパラギニルエンドプロテアーゼに関す
る。 (1) グリシニン型貯蔵タンパク質前駆体または該タンパ
ク質に類するタンパク質前駆体に作用し、その酸性サブ
ユニット領域のＣ末端アミノ酸残基であるAsnと塩基性
サブユニット領域のＮ末端アミノ酸であるGly またはAs
n の間を正確に加水分解して該前駆体を成熟化する (2) 作用ｐＨが4.０から7.０である (3) チオール性である (4) 分子量３３Ｋから４６ＫＤａの単純タンパク質で、
糖鎖を有しない (5) ペプチドまたは変性タンパク質に作用し、アスパラ
ギン残基のカルボキシル基側でペプチド結合を加水分解
するが、脱アミノ基作用を有しないさらに、本発明は登
熟初期から完熟期までの被子植物または裸子植物の粉砕
した種子をｐＨ4.０〜6.０の緩衝液で抽出し、その可溶
性画分を透析したのち固−液分離し、次いで疎水クロマ
トグラフィーを行うことを特徴とする新規アスパラギニ
ルエンドプロテアーゼの製造法並びにグリシニン型貯蔵
タンパク質前駆体または該タンパク質に類するタンパク
質前駆体に上記酵素を０から１Ｍの塩化ナトリウムおよ
び０から５０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む緩
衝液中で作用させて成熟化することを特徴とするグリシ
ニン型貯蔵タンパク質の製造法に関する。
は裸子植物の種子中より得られ、下記の理化学的性質を
有する新規アスパラギニルエンドプロテアーゼに関す
る。 (1) グリシニン型貯蔵タンパク質前駆体または該タンパ
ク質に類するタンパク質前駆体に作用し、その酸性サブ
ユニット領域のＣ末端アミノ酸残基であるAsnと塩基性
サブユニット領域のＮ末端アミノ酸であるGly またはAs
n の間を正確に加水分解して該前駆体を成熟化する (2) 作用ｐＨが4.０から7.０である (3) チオール性である (4) 分子量３３Ｋから４６ＫＤａの単純タンパク質で、
糖鎖を有しない (5) ペプチドまたは変性タンパク質に作用し、アスパラ
ギン残基のカルボキシル基側でペプチド結合を加水分解
するが、脱アミノ基作用を有しないさらに、本発明は登
熟初期から完熟期までの被子植物または裸子植物の粉砕
した種子をｐＨ4.０〜6.０の緩衝液で抽出し、その可溶
性画分を透析したのち固−液分離し、次いで疎水クロマ
トグラフィーを行うことを特徴とする新規アスパラギニ
ルエンドプロテアーゼの製造法並びにグリシニン型貯蔵
タンパク質前駆体または該タンパク質に類するタンパク
質前駆体に上記酵素を０から１Ｍの塩化ナトリウムおよ
び０から５０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む緩
衝液中で作用させて成熟化することを特徴とするグリシ
ニン型貯蔵タンパク質の製造法に関する。
【０００５】本発明の新規アスパラギニルエンドプロテ
アーゼは、上記の如く、被子植物または裸子植物の種子
中より得られるものであり、下記のような理化学的性質
を有している。 (1) 作用 天然の状態で存在するグリシニン型貯蔵タンパク質前駆
体またはこれに類するタンパク質前駆体（例えば大腸菌
などの微生物により生産されたグリシニン前駆体，オー
ト麦１２Ｓグロブリン前駆体など）に作用し、その酸性
サブユニット領域のＣ末端アミノ酸残基であるAsn と塩
基性サブユニット領域のＮ末端アミノ酸であるGly また
はAsn の間を正確に加水分解し、それを成熟化させる。
また、ペプチドまたは変性タンパク質に作用し、アスパ
ラギン残基のカルボキシル基側でペプチド結合を加水分
解するが、脱アミノ基作用（例えばDNP-Pro-Glu-Ala-As
n-NH2 またはこれに類するペプチドのAsn-NH2 間を加水
分解し、アンモニウムを遊離する反応）を有していな
い。
アーゼは、上記の如く、被子植物または裸子植物の種子
中より得られるものであり、下記のような理化学的性質
を有している。 (1) 作用 天然の状態で存在するグリシニン型貯蔵タンパク質前駆
体またはこれに類するタンパク質前駆体（例えば大腸菌
などの微生物により生産されたグリシニン前駆体，オー
ト麦１２Ｓグロブリン前駆体など）に作用し、その酸性
サブユニット領域のＣ末端アミノ酸残基であるAsn と塩
基性サブユニット領域のＮ末端アミノ酸であるGly また
はAsn の間を正確に加水分解し、それを成熟化させる。
また、ペプチドまたは変性タンパク質に作用し、アスパ
ラギン残基のカルボキシル基側でペプチド結合を加水分
解するが、脱アミノ基作用（例えばDNP-Pro-Glu-Ala-As
n-NH2 またはこれに類するペプチドのAsn-NH2 間を加水
分解し、アンモニウムを遊離する反応）を有していな
い。
【０００６】(2) 至適ｐＨおよび温度安定性 ｐＨ4.０〜7.０で作用し、ｐＨ4.５〜5.５で最大活性を
示す。また、１０分間の熱処理では、６０℃まで活性が
認められるが、酵素反応の温度は２０〜３０℃が好まし
い。
示す。また、１０分間の熱処理では、６０℃まで活性が
認められるが、酵素反応の温度は２０〜３０℃が好まし
い。
【０００７】(3)SDS-page による分子量測定 分子量３３〜４６ＫＤａの単純タンパク質で、糖鎖を有
しない。さらに詳しくは大豆では３３〜３3.８ＫＤａ、
ギンナンでは３７ＫＤａ、米では４６ＫＤａの分子量を
示す。
しない。さらに詳しくは大豆では３３〜３3.８ＫＤａ、
ギンナンでは３７ＫＤａ、米では４６ＫＤａの分子量を
示す。
【０００８】(4) 阻害および活性化 １ｍＭの水銀イオンおよび銅イオンにより著しく阻害さ
れ、１０ｍＭの亜鉛イオンによっても阻害される。しか
し、１０ｍＭのマグネシウムイオン，カルシウムイオン
および１０ｍＭのＥＤＴＡでは全く活性には影響しな
い。ＳＨプロテアーゼの阻害剤であるp-chloro-mercuri
benzensulfonic acid,N-ethylmaleimide,モノヨード酢
酸によって、それぞれ0.１ｍＭ，1.０ｍＭおよび１０ｍ
Ｍの濃度で完全に阻害される。ペプチド性のプロテアー
ゼインヒビターであるアンチパイン，キモスタチン，ロ
イペプチン，トリプシンインヒビターなどによっては全
く阻害されないし、セリンプロテアーゼのインヒビター
であるphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF) によって
も全く阻害されない。また、１ｍＭ以上の還元剤、例え
ば２−メルカプトエタノール，ジチオスレイトールなど
によって活性化される。以上のことから本酵素はチオー
ル酵素である。
れ、１０ｍＭの亜鉛イオンによっても阻害される。しか
し、１０ｍＭのマグネシウムイオン，カルシウムイオン
および１０ｍＭのＥＤＴＡでは全く活性には影響しな
い。ＳＨプロテアーゼの阻害剤であるp-chloro-mercuri
benzensulfonic acid,N-ethylmaleimide,モノヨード酢
酸によって、それぞれ0.１ｍＭ，1.０ｍＭおよび１０ｍ
Ｍの濃度で完全に阻害される。ペプチド性のプロテアー
ゼインヒビターであるアンチパイン，キモスタチン，ロ
イペプチン，トリプシンインヒビターなどによっては全
く阻害されないし、セリンプロテアーゼのインヒビター
であるphenylmethylsulfonylfluoride(PMSF) によって
も全く阻害されない。また、１ｍＭ以上の還元剤、例え
ば２−メルカプトエタノール，ジチオスレイトールなど
によって活性化される。以上のことから本酵素はチオー
ル酵素である。
【０００９】次に、本発明のアスパラギニルエンドプロ
テアーゼの活性測定法について述べる。 活性測定法１ 本酵素の活性測定には、グリシニン型貯蔵タンパク質ま
たはこれに類するタンパク質に対応し、リーダー配列を
有さないｃＤＮＡを大腸菌などの微生物で発現させて得
られるグリシニン型貯蔵タンパク質前駆体またはこれに
類するタンパク質前駆体を基質として用いることができ
る。ここで、ｃＤＮＡにはグリシニン，オート麦１２Ｓ
グロブリン，グルテリン，ギンナン８Ｓグロブリン，綿
実のゴシピンなどのｃＤＮＡがある。活性測定は、０か
ら１Ｍ塩化ナトリウム、０から５０ｍＭ２−メルカプト
エタノールを含むｐＨ4.０〜6.０の酸性緩衝液中で本酵
素を含む試料を加えて２５℃で３〜１０時間反応後、SD
S-pageを行い、精製した酸性および塩基性サブユニット
をＣＢＢ染色またはウエスタンブロットにより検出する
ことにより行う。なお、グリシニン前駆体を用いた場合
は、0.２Ｍ以上の塩化ナトリウムおよび0.１Ｍ以上の２
−メルカプトエタノールを加える必要がある。ここで用
いる酸性緩衝液としては、酢酸緩衝液，クエン酸リン酸
ナトリウム緩衝液などを挙げることができる。
テアーゼの活性測定法について述べる。 活性測定法１ 本酵素の活性測定には、グリシニン型貯蔵タンパク質ま
たはこれに類するタンパク質に対応し、リーダー配列を
有さないｃＤＮＡを大腸菌などの微生物で発現させて得
られるグリシニン型貯蔵タンパク質前駆体またはこれに
類するタンパク質前駆体を基質として用いることができ
る。ここで、ｃＤＮＡにはグリシニン，オート麦１２Ｓ
グロブリン，グルテリン，ギンナン８Ｓグロブリン，綿
実のゴシピンなどのｃＤＮＡがある。活性測定は、０か
ら１Ｍ塩化ナトリウム、０から５０ｍＭ２−メルカプト
エタノールを含むｐＨ4.０〜6.０の酸性緩衝液中で本酵
素を含む試料を加えて２５℃で３〜１０時間反応後、SD
S-pageを行い、精製した酸性および塩基性サブユニット
をＣＢＢ染色またはウエスタンブロットにより検出する
ことにより行う。なお、グリシニン前駆体を用いた場合
は、0.２Ｍ以上の塩化ナトリウムおよび0.１Ｍ以上の２
−メルカプトエタノールを加える必要がある。ここで用
いる酸性緩衝液としては、酢酸緩衝液，クエン酸リン酸
ナトリウム緩衝液などを挙げることができる。
【００１０】活性測定法２ 本酵素は、ペプチドまたは変性タンパク質に作用し、ア
スパラギン残基のカルボキシル基側でペプチド結合を加
水分解する作用があるため、アスパラギン残基を含むペ
プチド、例えばvasoactive intestinal peptide, parat
hyroid hormone, neurotensin などを基質に用い、０か
ら５０ｍＭ２−メルカプトエタノールをを含むｐＨ4.０
〜6.０の酢酸緩衝液中で本酵素を含む試料を加えて２５
〜４０℃で１０分〜１０時間反応後、１／１０量の酢酸
を加えて酵素反応を停止させ、生成したペプチドフラグ
メントを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
り定量することによって活性を測定することができる。
このときのＨＰＬＣの条件としては、ＯＤＳ，Ｃ８，
Ｃ４，フェニルなどの逆相カラムにペプチドフラグメン
トを吸着させ、それを０から0.１％のＴＦＡを含むアセ
トニトリルによって溶出させ、２１０〜２２０ｎｍまた
は２５０〜２９０ｎｍのＵＶ吸収を測定することによっ
て生成フラグメントを定量することができる。しかしな
がら、夾雑物の多い酵素試料の場合は、この方法で活性
を測ることは困難であるので、上記活性測定法１を用い
ることが望ましい。
スパラギン残基のカルボキシル基側でペプチド結合を加
水分解する作用があるため、アスパラギン残基を含むペ
プチド、例えばvasoactive intestinal peptide, parat
hyroid hormone, neurotensin などを基質に用い、０か
ら５０ｍＭ２−メルカプトエタノールをを含むｐＨ4.０
〜6.０の酢酸緩衝液中で本酵素を含む試料を加えて２５
〜４０℃で１０分〜１０時間反応後、１／１０量の酢酸
を加えて酵素反応を停止させ、生成したペプチドフラグ
メントを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
り定量することによって活性を測定することができる。
このときのＨＰＬＣの条件としては、ＯＤＳ，Ｃ８，
Ｃ４，フェニルなどの逆相カラムにペプチドフラグメン
トを吸着させ、それを０から0.１％のＴＦＡを含むアセ
トニトリルによって溶出させ、２１０〜２２０ｎｍまた
は２５０〜２９０ｎｍのＵＶ吸収を測定することによっ
て生成フラグメントを定量することができる。しかしな
がら、夾雑物の多い酵素試料の場合は、この方法で活性
を測ることは困難であるので、上記活性測定法１を用い
ることが望ましい。
【００１１】本発明のアスパラギニルエンドプロテアー
ゼは、前述したように、登熟初期から完熟期まで、特に
登熟初期から登熟後期の被子植物または裸子植物の粉砕
した種子をｐＨ4.０〜6.０の緩衝液で抽出し、その可溶
性画分を透析したのち固−液分離することにより得るこ
とができる。これらの種子には大量の貯蔵タンパク質が
含まれており、上記のようにｐＨ4.０〜6.０の緩衝液、
特にｐＨ4.０〜5.０の酸性条件で可溶化される画分を０
から５０ｍＭ（ｐＨ4.０〜5.０）の低イオン強度の緩衝
液で透析することにより、該貯蔵タンパク質を分離する
ことができる。次いで、遠心分離などにより上清液を
得、これを粗酵素液として用いることができる。必要に
応じてさらに精製することもでき、例えば粗酵素液を硫
安分画後、Butyl-Toyopearl, Phenyl-Toyopearl, Pheny
l-Sepharose, Alkyl-Sepharoseなどによる疎水クロマト
グラフィーを行った後、Sephacryl S-200, TSK-gel HW5
5 などを用いるゲル濾過を行い、さらにはDEAE-Sepharo
seに供することにより、ほぼ単一タンパク質レベルまで
精製することが可能である。とりわけ、疎水クロマトグ
ラフィーによる精製が効果的である。
ゼは、前述したように、登熟初期から完熟期まで、特に
登熟初期から登熟後期の被子植物または裸子植物の粉砕
した種子をｐＨ4.０〜6.０の緩衝液で抽出し、その可溶
性画分を透析したのち固−液分離することにより得るこ
とができる。これらの種子には大量の貯蔵タンパク質が
含まれており、上記のようにｐＨ4.０〜6.０の緩衝液、
特にｐＨ4.０〜5.０の酸性条件で可溶化される画分を０
から５０ｍＭ（ｐＨ4.０〜5.０）の低イオン強度の緩衝
液で透析することにより、該貯蔵タンパク質を分離する
ことができる。次いで、遠心分離などにより上清液を
得、これを粗酵素液として用いることができる。必要に
応じてさらに精製することもでき、例えば粗酵素液を硫
安分画後、Butyl-Toyopearl, Phenyl-Toyopearl, Pheny
l-Sepharose, Alkyl-Sepharoseなどによる疎水クロマト
グラフィーを行った後、Sephacryl S-200, TSK-gel HW5
5 などを用いるゲル濾過を行い、さらにはDEAE-Sepharo
seに供することにより、ほぼ単一タンパク質レベルまで
精製することが可能である。とりわけ、疎水クロマトグ
ラフィーによる精製が効果的である。
【００１２】次に、本発明の新規アスパラギニルエンド
プロテアーゼを用いてグリシニン型貯蔵タンパク質前駆
体または該タンパク質に類するタンパク質前駆体を成熟
化する方法について述べる。グリシニン型貯蔵タンパク
質前駆体または該タンパク質に類するタンパク質前駆体
は、該タンパク質の遺伝子をpKK233-2などの発現ベクタ
ーを用い、大腸菌などの微生物で発現させ、該形質転換
した微生物を培養することによって大量に生産すること
ができる。しかし、タンパク質資源として利用するに
は、これを成熟化することが必要である。まず、微生物
を培養して得たグリシニン型貯蔵タンパク質前駆体をイ
オン交換クロマトグラフィー，疎水クロマトグラフィ
ー，ゲル濾過などにより精製し、しかる後、これに本発
明の酵素を作用させ成熟化する。成熟化反応は、０から
１Ｍ塩化ナトリウム、０から５０ｍＭ２−メルカプトエ
タノールを含むｐＨ4.０〜6.０の緩衝液中に精製したグ
リシニン型貯蔵タンパク質前駆体と、その１／１００〜
１０倍量の本酵素を加え、２５〜４０℃で３〜１０時間
反応させることにより行う。なお、グリシニン前駆体を
基質として用いる場合は、0.２Ｍ以上の塩化ナトリウム
および0.１ｍＭ以上の２−メルカプトエタノールを反応
系に加える必要がある。
プロテアーゼを用いてグリシニン型貯蔵タンパク質前駆
体または該タンパク質に類するタンパク質前駆体を成熟
化する方法について述べる。グリシニン型貯蔵タンパク
質前駆体または該タンパク質に類するタンパク質前駆体
は、該タンパク質の遺伝子をpKK233-2などの発現ベクタ
ーを用い、大腸菌などの微生物で発現させ、該形質転換
した微生物を培養することによって大量に生産すること
ができる。しかし、タンパク質資源として利用するに
は、これを成熟化することが必要である。まず、微生物
を培養して得たグリシニン型貯蔵タンパク質前駆体をイ
オン交換クロマトグラフィー，疎水クロマトグラフィ
ー，ゲル濾過などにより精製し、しかる後、これに本発
明の酵素を作用させ成熟化する。成熟化反応は、０から
１Ｍ塩化ナトリウム、０から５０ｍＭ２−メルカプトエ
タノールを含むｐＨ4.０〜6.０の緩衝液中に精製したグ
リシニン型貯蔵タンパク質前駆体と、その１／１００〜
１０倍量の本酵素を加え、２５〜４０℃で３〜１０時間
反応させることにより行う。なお、グリシニン前駆体を
基質として用いる場合は、0.２Ｍ以上の塩化ナトリウム
および0.１ｍＭ以上の２−メルカプトエタノールを反応
系に加える必要がある。
【００１３】さらに、本発明の新規アスパラギニルエン
ドプロテアーゼの利用法として、精製酵素をペプチドま
たは変性タンパク質に作用させ、アスパラギン残基の後
ろで特異的にペプチド鎖を切断する性質を利用し、これ
らペプチドのマッピングに利用することができる。な
お、タンパク質の変性方法としては、６０〜１２０℃で
加熱もしくはオートクレーブする方法がある。ペプチド
または変性タンパク質に本発明の酵素を作用させるとき
の反応条件は、０から５０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルを含むｐＨ4.０〜6.０の緩衝液中に該ペプチドまたは
変性タンパク質と、その１／１００〜１０倍量の本酵素
を加え、２５〜４０℃で３〜１０時間反応させることが
必要である。なお、用いた基質のアミノ酸配列によって
は切断され易いものや、切断され難いものがあるが、例
外なくアスパラギン残基の後ろで切断が行われる。ただ
し、ＮＮＮＶＥＥＬのような場合は、Ｎ末端から２番目
のＮのカルボキシル残基で切断される（ＮＮ↑ＮＶＥＥ
Ｌ）（図９参照）。
ドプロテアーゼの利用法として、精製酵素をペプチドま
たは変性タンパク質に作用させ、アスパラギン残基の後
ろで特異的にペプチド鎖を切断する性質を利用し、これ
らペプチドのマッピングに利用することができる。な
お、タンパク質の変性方法としては、６０〜１２０℃で
加熱もしくはオートクレーブする方法がある。ペプチド
または変性タンパク質に本発明の酵素を作用させるとき
の反応条件は、０から５０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ルを含むｐＨ4.０〜6.０の緩衝液中に該ペプチドまたは
変性タンパク質と、その１／１００〜１０倍量の本酵素
を加え、２５〜４０℃で３〜１０時間反応させることが
必要である。なお、用いた基質のアミノ酸配列によって
は切断され易いものや、切断され難いものがあるが、例
外なくアスパラギン残基の後ろで切断が行われる。ただ
し、ＮＮＮＶＥＥＬのような場合は、Ｎ末端から２番目
のＮのカルボキシル残基で切断される（ＮＮ↑ＮＶＥＥ
Ｌ）（図９参照）。
【００１４】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらにより制限されるものではない。 参考例１ アスパラギニルエンドプロテアーゼの活性測定法１ 大豆グリシニンA1aB1bに対応するリーダー配列を有さな
いｃＤＮＡを発現ベクターpKK233-2（ファルマシア製）
にin-flameで挿入し、大腸菌ＮＭ５２２を宿主に用いて
発現させた。１０ｍｌのＬＢ培地で一晩培養した上記大
腸菌を１リットルのＬＢ培地に接種し、対数増殖期（OD
600nm=0.8)に達するまで２３℃で培養した後、１３℃の
温度に下げ、さらに一晩培養した。培養終了後、遠心分
離（12,000ｇ，１５分，４℃）によって集菌し、５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍｌ
の１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）に菌体を懸濁
させた。この懸濁液に１ｍｌ（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）の
塩化リゾチーム水溶液を加え、氷上で超音波破砕器によ
り菌体を破砕し、遠心分離（11,000ｇ，１５分，４℃）
により菌体破砕物を除去した。得られた上清液に結晶硫
安を３０％飽和となるように加え、再び遠心分離（11,0
00ｇ，１５分，４℃）を行って上清液を集め、さらに７
０％飽和になるように硫安を加えた。次いで、遠心分離
（11,000ｇ，２０分，４℃）によってPro-A1aB1b（グリ
シニン前駆体) を含む硫安沈殿物を得た。
が、本発明はこれらにより制限されるものではない。 参考例１ アスパラギニルエンドプロテアーゼの活性測定法１ 大豆グリシニンA1aB1bに対応するリーダー配列を有さな
いｃＤＮＡを発現ベクターpKK233-2（ファルマシア製）
にin-flameで挿入し、大腸菌ＮＭ５２２を宿主に用いて
発現させた。１０ｍｌのＬＢ培地で一晩培養した上記大
腸菌を１リットルのＬＢ培地に接種し、対数増殖期（OD
600nm=0.8)に達するまで２３℃で培養した後、１３℃の
温度に下げ、さらに一晩培養した。培養終了後、遠心分
離（12,000ｇ，１５分，４℃）によって集菌し、５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍｌ
の１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）に菌体を懸濁
させた。この懸濁液に１ｍｌ（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）の
塩化リゾチーム水溶液を加え、氷上で超音波破砕器によ
り菌体を破砕し、遠心分離（11,000ｇ，１５分，４℃）
により菌体破砕物を除去した。得られた上清液に結晶硫
安を３０％飽和となるように加え、再び遠心分離（11,0
00ｇ，１５分，４℃）を行って上清液を集め、さらに７
０％飽和になるように硫安を加えた。次いで、遠心分離
（11,000ｇ，２０分，４℃）によってPro-A1aB1b（グリ
シニン前駆体) を含む硫安沈殿物を得た。
【００１５】この沈殿物を0.１５Ｍ塩化ナトリウムを含
む少量の３５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.６）に
静かに溶解させた後、同緩衝液に対して透析を行った。
次に、この透析内液を同緩衝液で平衡化させたＱ−セフ
ァロースカラム（ファルマシア製、φ２６ｍｍ×４００
ｍｍ）に吸着させ、約５００ｍｌの同緩衝液によって非
吸着のタンパク質を溶出させた後、0.１５Ｍ→0.５Ｍの
塩化ナトリウム濃度のリニアグラジエントを行った。
む少量の３５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.６）に
静かに溶解させた後、同緩衝液に対して透析を行った。
次に、この透析内液を同緩衝液で平衡化させたＱ−セフ
ァロースカラム（ファルマシア製、φ２６ｍｍ×４００
ｍｍ）に吸着させ、約５００ｍｌの同緩衝液によって非
吸着のタンパク質を溶出させた後、0.１５Ｍ→0.５Ｍの
塩化ナトリウム濃度のリニアグラジエントを行った。
【００１６】得られた溶出画分を大豆グリシニンに対す
る抗血清を用いたウエスタンブロットによって分析した
ところ、グリシニン前駆体は塩化ナトリウム濃度が0.３
〜0.３５Ｍ濃度の画分に溶出されることが明らかとなっ
た。このグリシニン前駆体溶出画分に終濃度１Ｍとなる
ように硫安を加えた後、１Ｍ硫安，0.４Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む３５ｍＭリン酸カリウム緩衝液対し透析し、こ
の透析内液を同緩衝液で平衡化したブチルトーヨーパー
ル６５０Ｍ（東ソー製、φ２６ｍｍ×４００ｍｍ）に吸
着させ、約５００ｍｌの同緩衝液を用いて非吸着のタン
パク質を溶出後、１Ｍ→０Ｍの硫安濃度のリニアグラジ
エントを行って０Ｍ硫安画分にSDS-page上でほぼ単一の
Pro-A1aB1bタンパク質を得た。
る抗血清を用いたウエスタンブロットによって分析した
ところ、グリシニン前駆体は塩化ナトリウム濃度が0.３
〜0.３５Ｍ濃度の画分に溶出されることが明らかとなっ
た。このグリシニン前駆体溶出画分に終濃度１Ｍとなる
ように硫安を加えた後、１Ｍ硫安，0.４Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む３５ｍＭリン酸カリウム緩衝液対し透析し、こ
の透析内液を同緩衝液で平衡化したブチルトーヨーパー
ル６５０Ｍ（東ソー製、φ２６ｍｍ×４００ｍｍ）に吸
着させ、約５００ｍｌの同緩衝液を用いて非吸着のタン
パク質を溶出後、１Ｍ→０Ｍの硫安濃度のリニアグラジ
エントを行って０Ｍ硫安画分にSDS-page上でほぼ単一の
Pro-A1aB1bタンパク質を得た。
【００１７】酵素活性の測定は以下のようにして行っ
た。精製したPro-A1aB1bタンパク質１４０ｎｇ，５０ｍ
Ｍメルカプトエタノールおよび１００ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）１５μｌに
酵素液を加え、３７℃で一晩酵素反応を行った。得られ
た反応液をLaemmli の系にて電気泳動を行い、グリシニ
ンの塩基性サブユニットに対する抗血清を用いてウエス
タンブロットを行った。なお、検出にはイミュンプロッ
トＨＰＲキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用した。新
しく生成した塩基性サブユニット（B1b)のブロットされ
たバンドの強さを測定することにより酵素活性を測定し
た。
た。精製したPro-A1aB1bタンパク質１４０ｎｇ，５０ｍ
Ｍメルカプトエタノールおよび１００ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）１５μｌに
酵素液を加え、３７℃で一晩酵素反応を行った。得られ
た反応液をLaemmli の系にて電気泳動を行い、グリシニ
ンの塩基性サブユニットに対する抗血清を用いてウエス
タンブロットを行った。なお、検出にはイミュンプロッ
トＨＰＲキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用した。新
しく生成した塩基性サブユニット（B1b)のブロットされ
たバンドの強さを測定することにより酵素活性を測定し
た。
【００１８】参考例２ アスパラギニルエンドプロテアーゼの活性測定法２ オート麦１２Ｓグロブリンの一つであるＡ2 Ｂに対応
し、そのリーダー配列を有さないｃＤＮＡ（図６参照）
を発現ベクターpKK233-2（ファルマシア製）にin-flame
で挿入し、大腸菌ＪＭ１０５を宿主に用いて発現させた
（図７参照）。発現方法は参考例１に準じて行い、１３
℃で一晩培養した後、同様に氷上で超音波破砕し、約１
００ｍｌの遠心上清液を得た。この上清液１５μｌに１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）を加えた後、酵素液４μｌを
加え、３７℃で一晩酵素反応を行った。次いで、この反
応液をLaemmli の系にて電気泳動を行い、オート麦１２
Ｓグロブリンに対する抗血清を用いてウエスタンブロッ
トを行った。検出にはイミュンプロットＨＰＲキット
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用した。新しく生成した塩
基性サブユニット（A2) のブロットされたバンドの強さ
を測定することにより酵素活性を測定した。
し、そのリーダー配列を有さないｃＤＮＡ（図６参照）
を発現ベクターpKK233-2（ファルマシア製）にin-flame
で挿入し、大腸菌ＪＭ１０５を宿主に用いて発現させた
（図７参照）。発現方法は参考例１に準じて行い、１３
℃で一晩培養した後、同様に氷上で超音波破砕し、約１
００ｍｌの遠心上清液を得た。この上清液１５μｌに１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）を加えた後、酵素液４μｌを
加え、３７℃で一晩酵素反応を行った。次いで、この反
応液をLaemmli の系にて電気泳動を行い、オート麦１２
Ｓグロブリンに対する抗血清を用いてウエスタンブロッ
トを行った。検出にはイミュンプロットＨＰＲキット
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用した。新しく生成した塩
基性サブユニット（A2) のブロットされたバンドの強さ
を測定することにより酵素活性を測定した。
【００１９】実施例１ 完熟した大豆種子からのアスパラギニルエンドプロテア
ーゼの取得 熱処理および脱脂工程を行っていない大豆粉５ｋｇを１
５リットルの２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）に少し
ずつ加え、溶液のｐＨを5.０に調整した後、室温で２時
間緩やかに攪拌した。次に、遠心分離（12,000ｇ，１０
分）により得た上清液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.
０）に対して４℃で透析することにより、抽出液中に含
まれているグリシニンなどの貯蔵タンパク質を沈殿させ
たのち、再び遠心分離（12,000ｇ，１０分）を行い約１
０リットルの上清液を得た。
ーゼの取得 熱処理および脱脂工程を行っていない大豆粉５ｋｇを１
５リットルの２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）に少し
ずつ加え、溶液のｐＨを5.０に調整した後、室温で２時
間緩やかに攪拌した。次に、遠心分離（12,000ｇ，１０
分）により得た上清液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.
０）に対して４℃で透析することにより、抽出液中に含
まれているグリシニンなどの貯蔵タンパク質を沈殿させ
たのち、再び遠心分離（12,000ｇ，１０分）を行い約１
０リットルの上清液を得た。
【００２０】この上清液に結晶硫酸アンモニウムを４０
％飽和となるように加え、氷上で１時間攪拌した後、遠
心分離（12,000ｇ，１０分，４℃）によりアスパラギニ
ルエンドプロテアーゼを含むタンパク質8.４ｇからなる
沈殿物を得た。この硫安沈殿物を１Ｍ硫酸アンモニウム
を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）１００ｍｌに溶
解して同緩衝液で平衡化させたブチルトーヨーパール６
５０Ｍカラム（φ５０ｍｍ×３００ｍｍ×２本）に吸着
させ、２リットルの同緩衝液でカラムを洗浄したのち、
硫酸アンモニウム濃度を（１Ｍ→０Ｍ）／４リットルの
割合で低下させるリニアグラジエントを行った。
％飽和となるように加え、氷上で１時間攪拌した後、遠
心分離（12,000ｇ，１０分，４℃）によりアスパラギニ
ルエンドプロテアーゼを含むタンパク質8.４ｇからなる
沈殿物を得た。この硫安沈殿物を１Ｍ硫酸アンモニウム
を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）１００ｍｌに溶
解して同緩衝液で平衡化させたブチルトーヨーパール６
５０Ｍカラム（φ５０ｍｍ×３００ｍｍ×２本）に吸着
させ、２リットルの同緩衝液でカラムを洗浄したのち、
硫酸アンモニウム濃度を（１Ｍ→０Ｍ）／４リットルの
割合で低下させるリニアグラジエントを行った。
【００２１】次いで、参考例１に記載の方法で各フラク
ションの活性を測定したところ、図２の斜線部分に活性
を有するフラクションを得た。このフラクションをセン
トリプレップ（ミリポア社製）で濃縮し、セファクリル
Ｓ−２００ＨＲカラムクロマトグラフィー（φ２６ｍｍ
×９００ｍｍ×２本）を行った。0.１Ｍ塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液で溶出させ、図３の斜線部分
に１3.４ｍｇのアスパラギニルエンドプロテアーゼＡ，
Ｂ，Ｃ（それぞれ等電点（ｐＩ）4.８５，分子量（Ｍ
Ｗ）33,800: ｐＩ4.８９，ＭＷ33,400: ｐＩ4.９４，Ｍ
Ｗ33,000）を得た。
ションの活性を測定したところ、図２の斜線部分に活性
を有するフラクションを得た。このフラクションをセン
トリプレップ（ミリポア社製）で濃縮し、セファクリル
Ｓ−２００ＨＲカラムクロマトグラフィー（φ２６ｍｍ
×９００ｍｍ×２本）を行った。0.１Ｍ塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液で溶出させ、図３の斜線部分
に１3.４ｍｇのアスパラギニルエンドプロテアーゼＡ，
Ｂ，Ｃ（それぞれ等電点（ｐＩ）4.８５，分子量（Ｍ
Ｗ）33,800: ｐＩ4.８９，ＭＷ33,400: ｐＩ4.９４，Ｍ
Ｗ33,000）を得た。
【００２２】実施例２ ギンナンからのアスパラギニルエンドプロテアーゼの取
得 十分に洗浄した完熟ギンナン３ｋｇを乳鉢で破砕した
後、さらに粉砕器によりペースト状になるまで粉砕し
た。次に、１０リットルの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.
０）を加え、緩やかに攪拌しながら一晩抽出を行った。
しかる後、遠心分離（12,000ｇ，２０分，４℃）により
残渣を除去し、上清液を５０リットルの２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ5.０）に対し４℃で３回透析を行った。変性
タンパク質を遠心分離（12,000ｇ，２０分，４℃）で除
去後、上清液９リットルに対し３０％飽和になるように
結晶硫安を加え、氷上で１時間攪拌し、次いで遠心分離
（12,000ｇ，２０分，４℃）によって１０リットルの上
清液を得た。
得 十分に洗浄した完熟ギンナン３ｋｇを乳鉢で破砕した
後、さらに粉砕器によりペースト状になるまで粉砕し
た。次に、１０リットルの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.
０）を加え、緩やかに攪拌しながら一晩抽出を行った。
しかる後、遠心分離（12,000ｇ，２０分，４℃）により
残渣を除去し、上清液を５０リットルの２０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ5.０）に対し４℃で３回透析を行った。変性
タンパク質を遠心分離（12,000ｇ，２０分，４℃）で除
去後、上清液９リットルに対し３０％飽和になるように
結晶硫安を加え、氷上で１時間攪拌し、次いで遠心分離
（12,000ｇ，２０分，４℃）によって１０リットルの上
清液を得た。
【００２３】この上清液にさらに５０％飽和になるよう
に結晶硫安を加え、氷上で２時間攪拌し、次いで遠心分
離（12,000ｇ，２０分，４℃）によってアスパラギニル
エンドプロテアーゼを含む沈殿物0.４ｇを得た。このう
ち７０ｍｇのタンパク質を２００ｍｌの１Ｍ硫酸アンモ
ニウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）に溶解さ
せ、同緩衝液で平衡化させたブチルトーヨーパール６５
０Ｍカラム（φ５０ｍｍ×３００ｍｍ）に吸着させ、２
リットルの同緩衝液でカラムを洗浄したのち、硫酸アン
モニウム濃度を（１Ｍ→０Ｍ）／２リットルの割合で低
下させるリニアグラジエントを行った。
に結晶硫安を加え、氷上で２時間攪拌し、次いで遠心分
離（12,000ｇ，２０分，４℃）によってアスパラギニル
エンドプロテアーゼを含む沈殿物0.４ｇを得た。このう
ち７０ｍｇのタンパク質を２００ｍｌの１Ｍ硫酸アンモ
ニウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）に溶解さ
せ、同緩衝液で平衡化させたブチルトーヨーパール６５
０Ｍカラム（φ５０ｍｍ×３００ｍｍ）に吸着させ、２
リットルの同緩衝液でカラムを洗浄したのち、硫酸アン
モニウム濃度を（１Ｍ→０Ｍ）／２リットルの割合で低
下させるリニアグラジエントを行った。
【００２４】次いで、参考例１に記載の方法で各フラク
ションの活性を測定し、活性フラクションに８０％飽和
になるように硫安を加えて酵素を沈殿させ、それを３ｍ
ｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）に溶解させ、同緩
衝液で平衡化させたセファクリルＳ−２００ＨＲカラム
（ファルマシア製、φ１３ｍｍ×９００ｍｍ×２本）で
ゲル濾過を行った。活性フラクションをさらにSuperose
で精製し、分子量37,000の単純タンパク質であるギンナ
ンのアスパラギニルエンドプロテアーゼを取得した。
ションの活性を測定し、活性フラクションに８０％飽和
になるように硫安を加えて酵素を沈殿させ、それを３ｍ
ｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）に溶解させ、同緩
衝液で平衡化させたセファクリルＳ−２００ＨＲカラム
（ファルマシア製、φ１３ｍｍ×９００ｍｍ×２本）で
ゲル濾過を行った。活性フラクションをさらにSuperose
で精製し、分子量37,000の単純タンパク質であるギンナ
ンのアスパラギニルエンドプロテアーゼを取得した。
【００２５】実施例３ コメからのアスパラギニルエンドプロテアーゼの取得 コメ粉（使用する穀粒は新しい程良く、粉末後４〜５ヶ
月室温保存した場合は酵素の抽出効率は著しく悪くな
る。これは、油脂成分とタンパク質の結合によるためで
ある。この現象は、他の試料を用いた場合も同じであっ
た。したがって、コメ粉は新しいコメを微粉末化し、熱
ドライしないものを用いた。）２０ｋｇに５倍量の１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）を少しづつ攪拌しながら加
え、そのまま２時間室温で抽出した。次いで、遠心分離
（12,000ｇ，１０分）して残渣を除き、上清液を得た。
この上清液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）に対して
４℃で十分に透析した。生じた沈澱物を遠心除去して上
清液を得た。
月室温保存した場合は酵素の抽出効率は著しく悪くな
る。これは、油脂成分とタンパク質の結合によるためで
ある。この現象は、他の試料を用いた場合も同じであっ
た。したがって、コメ粉は新しいコメを微粉末化し、熱
ドライしないものを用いた。）２０ｋｇに５倍量の１０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）を少しづつ攪拌しながら加
え、そのまま２時間室温で抽出した。次いで、遠心分離
（12,000ｇ，１０分）して残渣を除き、上清液を得た。
この上清液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）に対して
４℃で十分に透析した。生じた沈澱物を遠心除去して上
清液を得た。
【００２６】この上清液に結晶硫酸アンモニウムを５０
％飽和となるように加え、生じた沈澱物（アスパラギニ
ルエンドプロテアーゼを含むタンパク質１２ｇ）を遠心
分離した。この沈澱物を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）１００ｍｌに溶解した
後、同緩衝液で平衡化したブチルトーヨーパール６５０
Ｍカラム（φ５０ｍｍ×３００ｍｍ×２本連結）に吸着
させた。２リットルの同緩衝液でカラムを洗浄した後、
硫酸アンモニウム濃度を（１Ｍ→０Ｍ）／４リットルの
割合で低下させるリニアグラジエント法により吸着タン
パク質の分画を行った。
％飽和となるように加え、生じた沈澱物（アスパラギニ
ルエンドプロテアーゼを含むタンパク質１２ｇ）を遠心
分離した。この沈澱物を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）１００ｍｌに溶解した
後、同緩衝液で平衡化したブチルトーヨーパール６５０
Ｍカラム（φ５０ｍｍ×３００ｍｍ×２本連結）に吸着
させた。２リットルの同緩衝液でカラムを洗浄した後、
硫酸アンモニウム濃度を（１Ｍ→０Ｍ）／４リットルの
割合で低下させるリニアグラジエント法により吸着タン
パク質の分画を行った。
【００２７】次いで、参考例１に記載の方法で各フラク
ションの活性を測定することにより、アスパラギニルエ
ンドプロテアーゼの溶出フラクションを同定した。これ
らのフラクションのタンパク質を８０％硫酸アンモニウ
ム飽和で沈澱させた後、セファクリルＳ−２００ＨＲカ
ラム（φ２６ｍｍ×９００ｍｍ×２本連結）を用いてゲ
ル濾過を行った。次に、参考例１に記載の方法を用い、
分画各画分の酵素活性を測定した。高活性を示す画分を
集め、必要に応じてさらにＤＥＡＥ−トーヨーパールま
たはこれに類するイオン交換樹脂を用いたカラムクロマ
トグラフィーにより少量の夾雑するタンパク質を除去
し、図８に示したように、ＳＤＳ−ゲル電気泳動で単一
バンドを示すまでに精製した。収量は約１ｍｇであっ
た。
ションの活性を測定することにより、アスパラギニルエ
ンドプロテアーゼの溶出フラクションを同定した。これ
らのフラクションのタンパク質を８０％硫酸アンモニウ
ム飽和で沈澱させた後、セファクリルＳ−２００ＨＲカ
ラム（φ２６ｍｍ×９００ｍｍ×２本連結）を用いてゲ
ル濾過を行った。次に、参考例１に記載の方法を用い、
分画各画分の酵素活性を測定した。高活性を示す画分を
集め、必要に応じてさらにＤＥＡＥ−トーヨーパールま
たはこれに類するイオン交換樹脂を用いたカラムクロマ
トグラフィーにより少量の夾雑するタンパク質を除去
し、図８に示したように、ＳＤＳ−ゲル電気泳動で単一
バンドを示すまでに精製した。収量は約１ｍｇであっ
た。
【００２８】実施例４ アスパラギニルエンドプロテアーゼを用いた合成ペプチ
ドの特異的分解 0.１μｇのvasoactive intestinal peptide (VIP) およ
び５０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むｐＨ5.０の
酢酸緩衝液に実施例１に記載の精製酵素を加えて２５℃
で３時間反応後、１０分の１量の酢酸を加えて酵素反応
を停止させ、生成したペチドフラグメントをHPLCによっ
て分析した。このとき用いたHPLCの条件は以下の通りで
ある。カラム：ODS120T(東ソー製）、溶媒Ａ：0.１％の
ＴＦＡ、溶媒Ｂ：0.１％のＴＦＡを含むアセトニトリ
ル、グラジエント：０→６０％Ｂ／６０分、検出：２２
０ｎｍ図４に結果を示す。図から明らかなように、アス
パラギン残基の後ろでＶＩＰが切断されていることが判
る。しかし、カルボキシル基に付いたアミノ基を加水分
解するデアミナーゼ活性は認められなかった。この方法
を酵素活性の測定法として応用することが可能である。
ドの特異的分解 0.１μｇのvasoactive intestinal peptide (VIP) およ
び５０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むｐＨ5.０の
酢酸緩衝液に実施例１に記載の精製酵素を加えて２５℃
で３時間反応後、１０分の１量の酢酸を加えて酵素反応
を停止させ、生成したペチドフラグメントをHPLCによっ
て分析した。このとき用いたHPLCの条件は以下の通りで
ある。カラム：ODS120T(東ソー製）、溶媒Ａ：0.１％の
ＴＦＡ、溶媒Ｂ：0.１％のＴＦＡを含むアセトニトリ
ル、グラジエント：０→６０％Ｂ／６０分、検出：２２
０ｎｍ図４に結果を示す。図から明らかなように、アス
パラギン残基の後ろでＶＩＰが切断されていることが判
る。しかし、カルボキシル基に付いたアミノ基を加水分
解するデアミナーゼ活性は認められなかった。この方法
を酵素活性の測定法として応用することが可能である。
【００２９】実施例５ 大腸菌で生産したグリシニン前駆体の成熟化 前記参考例１で得たグリシニン前駆体５０μｇに実施例
１で得られた精製酵素４μｇを加え、５０ｍＭメルカプ
トエタノール、0.５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０μｌの
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）中で２５℃で１２時
間酵素反応を行った。図５に示すように、A1aB1b前駆体
が本酵素により酸性および塩基性サブユニットに切断さ
れることがSDS-page上で判る。次に、切断部位が正しい
かどうかを明らかにするため、切断された塩基性サブユ
ニット(B1b) のＮ末端アミノ酸のシークエンスを行っ
た。すなわち、酵素処理したA1aB1b前駆体４５μｇを電
気泳動後、PVDF膜（ミリポア社製）にミニトランスブロ
ットセル（Bio-Rad 社製）にエレクトロブロティング
し、PVDF膜にブロティングされた塩基性サブユニットの
Ｎ末端アミノ酸シークエンスをペプチドシークエンサー
（ＡＢＩ社製）によって分析した。その結果、得られた
塩基性サブユニットＮ末端アミノ酸シークエンスは大豆
種子のB1b サブユニットと同一であった。
１で得られた精製酵素４μｇを加え、５０ｍＭメルカプ
トエタノール、0.５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０μｌの
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）中で２５℃で１２時
間酵素反応を行った。図５に示すように、A1aB1b前駆体
が本酵素により酸性および塩基性サブユニットに切断さ
れることがSDS-page上で判る。次に、切断部位が正しい
かどうかを明らかにするため、切断された塩基性サブユ
ニット(B1b) のＮ末端アミノ酸のシークエンスを行っ
た。すなわち、酵素処理したA1aB1b前駆体４５μｇを電
気泳動後、PVDF膜（ミリポア社製）にミニトランスブロ
ットセル（Bio-Rad 社製）にエレクトロブロティング
し、PVDF膜にブロティングされた塩基性サブユニットの
Ｎ末端アミノ酸シークエンスをペプチドシークエンサー
（ＡＢＩ社製）によって分析した。その結果、得られた
塩基性サブユニットＮ末端アミノ酸シークエンスは大豆
種子のB1b サブユニットと同一であった。
【００３０】一方、生成した酸性サブユニットを６Ｍ尿
素存在中でDEAE−トーヨーパールカラムによって単離
し、トリプシンによって加水分解した後、anhydrotryps
in-HPLC カラムを通し、その非吸着画分をPico-Tagによ
り分析したところ、酸性サブユニットのＣ末端アミノ酸
もまた大豆種子と同じアスパラギンであった。このこと
からグリシニン前駆体が本酵素により２９１番目のアス
パラギンと２９２番目のグリシンの間で正確に切断され
ていることが明らかになった。
素存在中でDEAE−トーヨーパールカラムによって単離
し、トリプシンによって加水分解した後、anhydrotryps
in-HPLC カラムを通し、その非吸着画分をPico-Tagによ
り分析したところ、酸性サブユニットのＣ末端アミノ酸
もまた大豆種子と同じアスパラギンであった。このこと
からグリシニン前駆体が本酵素により２９１番目のアス
パラギンと２９２番目のグリシンの間で正確に切断され
ていることが明らかになった。
【００３１】実施例６ 種々の植物種子中に存在するアスパラギニルエンドプロ
テアーゼを用いたグリシニン型タンパク質前駆体の成熟
化 登熟初期から完熟期までの植物種子（ツルマメ，ギンナ
ン，大麦，トウモロコシ，小麦，玄米，タバコ，ツバ
キ，アオギリ，サザンカ，エンジュ，エニシダ，フジ，
大豆，オート麦）各５ｇを液体窒素中で十分に破砕した
後、５０ｍｌの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）を加
え、氷で冷しながらヒスコトロンを用いてホモジナイズ
した。次に、遠心分離（3,000g, ３０分，４℃）によっ
て残渣を除いて得た上清液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
5.０）に対して４℃で透析を行い、生じた沈殿をさらに
遠心分離（10,000ｇ，３０分，４℃）によって除去し、
得られた上清液を粗酵素液とした。
テアーゼを用いたグリシニン型タンパク質前駆体の成熟
化 登熟初期から完熟期までの植物種子（ツルマメ，ギンナ
ン，大麦，トウモロコシ，小麦，玄米，タバコ，ツバ
キ，アオギリ，サザンカ，エンジュ，エニシダ，フジ，
大豆，オート麦）各５ｇを液体窒素中で十分に破砕した
後、５０ｍｌの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）を加
え、氷で冷しながらヒスコトロンを用いてホモジナイズ
した。次に、遠心分離（3,000g, ３０分，４℃）によっ
て残渣を除いて得た上清液を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
5.０）に対して４℃で透析を行い、生じた沈殿をさらに
遠心分離（10,000ｇ，３０分，４℃）によって除去し、
得られた上清液を粗酵素液とした。
【００３２】グリシニン型タンパク質の前駆体としては
オート麦１２Ｓグロブリン前駆体（Pro-A2B)を用いた。
参考例１で述べたと同様の方法により大腸菌で発現さ
せ、精製した反応基質(A2B前駆体）１５μｌに２μｌの
２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）と２μｌの１Ｍジチオスレ
イトールを加えた後、上記各粗酵素液１１μｌを加え、
３７℃で１３時間酵素反応を行い、ウエスタンブロット
法により、切断された酸性サブユニットを検出した。そ
の結果、図６に示すように、種々の植物種子中にアスパ
ラギニルエンドプロテアーゼが存在していることが判明
すると共に、それによってグリシニン型タンパク質の前
駆体を成熟化させることが可能であった。
オート麦１２Ｓグロブリン前駆体（Pro-A2B)を用いた。
参考例１で述べたと同様の方法により大腸菌で発現さ
せ、精製した反応基質(A2B前駆体）１５μｌに２μｌの
２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）と２μｌの１Ｍジチオスレ
イトールを加えた後、上記各粗酵素液１１μｌを加え、
３７℃で１３時間酵素反応を行い、ウエスタンブロット
法により、切断された酸性サブユニットを検出した。そ
の結果、図６に示すように、種々の植物種子中にアスパ
ラギニルエンドプロテアーゼが存在していることが判明
すると共に、それによってグリシニン型タンパク質の前
駆体を成熟化させることが可能であった。
【００３３】さらに、異種の酵素が正しくアスパラギン
残基の後で基質を切り、酸性および塩基性サブユニット
を生じさせているか否かを明らかにするため、以下の実
験を実施した。実施例４で述べた方法により、オート麦
１２Ｓ Pro-A2Bタンパク質（５０μｇ）にダイズアスパ
ラギニルエンドプロテアーゼ（５μｇ）を作用させて生
じせしめたペプチド断面のうち、分子量の小さいものの
Ｎ−末端配列を解析したところ、Gly-Leu-Glu-Glu-Asn-
Phe の配列を得た。これは、オート麦１２Ｓグロブリン
Pro-A2Bの塩基性サブユニットのＮ−末端領域の配列と
完全に一致した。したがって、ダイズ由来の当該酵素は
由来の異なるタンパク質前駆体をも、生体内で切断され
る部位と同一の部位で正しく切断することが示された。
残基の後で基質を切り、酸性および塩基性サブユニット
を生じさせているか否かを明らかにするため、以下の実
験を実施した。実施例４で述べた方法により、オート麦
１２Ｓ Pro-A2Bタンパク質（５０μｇ）にダイズアスパ
ラギニルエンドプロテアーゼ（５μｇ）を作用させて生
じせしめたペプチド断面のうち、分子量の小さいものの
Ｎ−末端配列を解析したところ、Gly-Leu-Glu-Glu-Asn-
Phe の配列を得た。これは、オート麦１２Ｓグロブリン
Pro-A2Bの塩基性サブユニットのＮ−末端領域の配列と
完全に一致した。したがって、ダイズ由来の当該酵素は
由来の異なるタンパク質前駆体をも、生体内で切断され
る部位と同一の部位で正しく切断することが示された。
【００３４】実施例７ アスパラギニルエンドプロテアーゼを用いた合成ペプチ
ドの分解 下記の各種合成ペプチド（0.３μｇを水またはＤＭＳＯ
に溶解したもの）を用い、５０ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）中で
３７℃で６時間，１２時間および２４時間保温後、反応
混液の１／１０量のギ酸を加えて反応を停止した。反応
液の適当量をHPLCで分析した。結果を図７に示す。な
お、用いたカラムはペプチドの長さにより変えたが、Ｃ
4 〜Ｃ18の逆相カラムを使用した。
ドの分解 下記の各種合成ペプチド（0.３μｇを水またはＤＭＳＯ
に溶解したもの）を用い、５０ｍＭの２−メルカプトエ
タノールを含む２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）中で
３７℃で６時間，１２時間および２４時間保温後、反応
混液の１／１０量のギ酸を加えて反応を停止した。反応
液の適当量をHPLCで分析した。結果を図７に示す。な
お、用いたカラムはペプチドの長さにより変えたが、Ｃ
4 〜Ｃ18の逆相カラムを使用した。
【００３５】各種合成ペプチド（↑は切断部位を示
す。） NH3-ＮＮＶＥＥＬ （切れない） NH3-ＮＮ↑ＮＶＥＥＬ （切れ難いが
切れる） NH3-ＮＮ↑Ｎ↑ＮＶＥＥＬ （２ヶ所で切
れ、１ヶ所は切れ易い） NH3-ＮＮＮ↑ＳＥＥＬ （切れ難いが切れ
る） NH3-ＮＮＮ↑ＥＶＥＬ （切れ易い） NH3-ＳＥＳＥＮ↑ＧＬＥＥＴ （切れ易い） NH3-ＦＮＮＶＥＥＬ （切れ難い）
す。） NH3-ＮＮＶＥＥＬ （切れない） NH3-ＮＮ↑ＮＶＥＥＬ （切れ難いが
切れる） NH3-ＮＮ↑Ｎ↑ＮＶＥＥＬ （２ヶ所で切
れ、１ヶ所は切れ易い） NH3-ＮＮＮ↑ＳＥＥＬ （切れ難いが切れ
る） NH3-ＮＮＮ↑ＥＶＥＬ （切れ易い） NH3-ＳＥＳＥＮ↑ＧＬＥＥＴ （切れ易い） NH3-ＦＮＮＶＥＥＬ （切れ難い）
【００３６】以上のことから、Ｎの後にＶ，Ｌなどの疎
水性アミノ酸がくる場合は、本酵素により切断されない
か、切断され難い。したがって、の場合はＮ↑ＮＶＥ
ＥＬが切断する可能性があるが、本酵素はアミノペプチ
ダーゼ活性がないので、は切断されない。また、は
矢印の部位で切断されるが、はより切断され易い。Ｖ
をＳ，Ｇなどの疎水性でなく分子の大きさも比較的小さ
いアミノ酸に置き換えると、切断するようになるが、効
率的に切断するにはＮの後に疎水性でないアミノ酸残基
が来て、その直後に疎水性アミノ酸残基が来るような、
例えば、…ＮＧＶ…のような切断環境の場合、Ｎの後で
容易に切断される。また、切断部位となるＮの上流に他
のアミノ酸が１個以上存在しなければならない（ＸＮＹ
φ…，Ｘはφ以外のアミノ酸残基、Ｙはφ以外でＡ，
Ｓ，Ｔ，Ｐ，Ｇなどの比較的分子の小さなアミノ酸残基
があるとよい、φは疎水性アミノ酸残基である）が、３
〜４個以上のアミノ酸残基があると、切断され易くな
る。図８にペプチドＮＨ2 −ＮＮＮＶＥＥＬ−ＣＯＯＨ
に本酵素を作用させた場合の切断ペプチドの分離例を示
した。分取したペプチドのアミノ酸配列解析から、切断
がＮＮ↑ＮＶＥＥＬのように矢印の部位で起っているこ
とが明らかとなった。
水性アミノ酸がくる場合は、本酵素により切断されない
か、切断され難い。したがって、の場合はＮ↑ＮＶＥ
ＥＬが切断する可能性があるが、本酵素はアミノペプチ
ダーゼ活性がないので、は切断されない。また、は
矢印の部位で切断されるが、はより切断され易い。Ｖ
をＳ，Ｇなどの疎水性でなく分子の大きさも比較的小さ
いアミノ酸に置き換えると、切断するようになるが、効
率的に切断するにはＮの後に疎水性でないアミノ酸残基
が来て、その直後に疎水性アミノ酸残基が来るような、
例えば、…ＮＧＶ…のような切断環境の場合、Ｎの後で
容易に切断される。また、切断部位となるＮの上流に他
のアミノ酸が１個以上存在しなければならない（ＸＮＹ
φ…，Ｘはφ以外のアミノ酸残基、Ｙはφ以外でＡ，
Ｓ，Ｔ，Ｐ，Ｇなどの比較的分子の小さなアミノ酸残基
があるとよい、φは疎水性アミノ酸残基である）が、３
〜４個以上のアミノ酸残基があると、切断され易くな
る。図８にペプチドＮＨ2 −ＮＮＮＶＥＥＬ−ＣＯＯＨ
に本酵素を作用させた場合の切断ペプチドの分離例を示
した。分取したペプチドのアミノ酸配列解析から、切断
がＮＮ↑ＮＶＥＥＬのように矢印の部位で起っているこ
とが明らかとなった。
【００３７】
【発明の効果】本発明によれば、被子植物または裸子植
物の種子に由来する新規アスパラギニルエンドプロテア
ーゼとその製造法が提供される。ところで、植物種子に
含まれるグリシニン型貯蔵タンパク質の利用を図るた
め、遺伝子組換え技術を利用して微生物に該タンパク質
を大量生産させる試みがなされているが、この方法で得
られるタンパク質は前駆体である。これをタンパク質資
源として活用するためには、成熟化することが必要であ
る。本発明の酵素は該グリシニン型貯蔵タンパク質前駆
体に作用して、これを成熟化させることができるため、
本酵素は植物種子由来の貯蔵タンパク質の利用を図る上
に極めて有用である。さらに、本酵素を用いてタンパク
質をアスパラギン残基のカルボキシル基末端で切断する
ことにより、切断個所の構造解析が可能である。よっ
て、本酵素を用いることにより、ペプチドの一次構造解
析に必要な量のペプチドを容易に生成することができ
る。
物の種子に由来する新規アスパラギニルエンドプロテア
ーゼとその製造法が提供される。ところで、植物種子に
含まれるグリシニン型貯蔵タンパク質の利用を図るた
め、遺伝子組換え技術を利用して微生物に該タンパク質
を大量生産させる試みがなされているが、この方法で得
られるタンパク質は前駆体である。これをタンパク質資
源として活用するためには、成熟化することが必要であ
る。本発明の酵素は該グリシニン型貯蔵タンパク質前駆
体に作用して、これを成熟化させることができるため、
本酵素は植物種子由来の貯蔵タンパク質の利用を図る上
に極めて有用である。さらに、本酵素を用いてタンパク
質をアスパラギン残基のカルボキシル基末端で切断する
ことにより、切断個所の構造解析が可能である。よっ
て、本酵素を用いることにより、ペプチドの一次構造解
析に必要な量のペプチドを容易に生成することができ
る。
【図１】 グリシニン型貯蔵タンパク質のタンパク分解
酵素によるプロセッシングの模式図である。
酵素によるプロセッシングの模式図である。
【図２】 実施例１の粗酵素液の疎水クロマトグラムで
ある。斜線部分は酵素活性の強い領域を示す。
ある。斜線部分は酵素活性の強い領域を示す。
【図３】 実施例１の疎水クロマトグラフィーで分画し
た酵素液のゲル濾過によるクロマトグラムである。斜線
部分を集めて精製酵素とした。
た酵素液のゲル濾過によるクロマトグラムである。斜線
部分を集めて精製酵素とした。
【図４】 実施例３のアスパラギニルエンドプロテアー
ゼにより切断したペプチドフラグメントのＨＰＬＣ分離
図であり、矢印は各生成ペプチドフラグメントの一次構
造をアミノ酸の一文字表示法で示している。
ゼにより切断したペプチドフラグメントのＨＰＬＣ分離
図であり、矢印は各生成ペプチドフラグメントの一次構
造をアミノ酸の一文字表示法で示している。
【図５】 実施例４の大腸菌で生産し、精製したグリシ
ニン前駆体に酵素を作用させ、その切断状況をSDS-page
で分析した電気泳動写真である。レーン１は本発明の酵
素、レーン２は基質として用いたグリシニン前駆体、レ
ーン３はグリシニン前駆体に酵素を作用させたもの、レ
ーン４は大豆種子より得たcold insolublefraction (CI
F) で、本画分にはグリシニンが濃縮されているので、
分子量マーカーとして用いた。
ニン前駆体に酵素を作用させ、その切断状況をSDS-page
で分析した電気泳動写真である。レーン１は本発明の酵
素、レーン２は基質として用いたグリシニン前駆体、レ
ーン３はグリシニン前駆体に酵素を作用させたもの、レ
ーン４は大豆種子より得たcold insolublefraction (CI
F) で、本画分にはグリシニンが濃縮されているので、
分子量マーカーとして用いた。
【図６】 参考例２で用いたオート麦１２Ｓグロブリン
A2B ｃＤＮＡの塩基配列を示す。クローン名 pOTG664が
A2B をコードしているｃＤＮＡである。＊の部分から下
流部分を図７の方法により発現ベクターに導入して大腸
菌で生産した。
A2B ｃＤＮＡの塩基配列を示す。クローン名 pOTG664が
A2B をコードしているｃＤＮＡである。＊の部分から下
流部分を図７の方法により発現ベクターに導入して大腸
菌で生産した。
【図７】 オート麦１２Ｓグロブリン pro-A2Bの大腸菌
における発現プラスミドの構築方法を示した模式図であ
る。
における発現プラスミドの構築方法を示した模式図であ
る。
【図８】 Ａは、実施例５のオート麦１２Ｓグロブリン
前駆体に酵素を作用させた後のウエスタンブロット分析
図である。５８Ｋはオート麦１２Ｓグロブリン前駆体で
あるPro-A2B 、３３Ｋはオート麦１２ＳグロブリンのA2
酸性サブユニットである。図中、ａはオート麦１２Ｓグ
ロブリン画分（オート麦種子から抽出したタンパク質で
ある。図６のcDNAの塩基配列から明らかなように、酸性
サブユニットのＣ−末端を種々の程度に欠損したｍＲＮ
Ａ群により大きさの異なるオート麦１２Ｓタンパク質が
合成されている。A2酸性サブユニットはその中でも最も
分子量の大きなタンパク質である。）を示し、ｂは pro
-A2Bを示す。ｃは pro-A2Bオート麦からのアスパラギニ
ルエンドプロテアーゼの粗酵素液を加えて反応させない
もの（コントロール実験）を示し、ｄは pro-A2Bに上記
ｃと同じ酵素液を加えて反応させたものを示す。ｅはダ
イズ精製酵素と pro-A2Bで反応させたものを示し、ｆは
フジ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示す。ｇはエ
ニシダ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示し、ｈは
エンジュ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示す。ｉ
はサザンカ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示し、
ｊはアオギリ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
す。ｋはツバキ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
し、ｌはタバコ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
す。ｍはコメ精製酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
し、ｎはコムギ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
す。ｏはトウモロコシ粗酵素と pro-A2Bで反応させたも
のを示し、ｐは大麦粗酵素と pro-A2Bで反応させたもの
を示す。ｑはギンナン精製酵素と pro-A2Bで反応させた
ものを示し、ｒはツルマメ粗酵素と pro-A2Bで反応させ
たものを示す。ｓはA2B のみで酵素を入れずに反応させ
たもの（対照）を示す。Ｂは、異種酵素によるオート麦
１２ＳグロブリンA2B タンパク質の切断部位の同定のた
めのＣＢＢ染色像である。Ａで、由来を異にする酵素が
同一の基質を同一の部位で切断している可能性が高いこ
とをイムノブロット法で示した。なお、使用した抗体は
オート麦１２Ｓグロブリンに対して作成されたが、オー
ト麦１２Ｓグロブリンの酸性サブユニットに対してのみ
反応し、塩基性サブユニットとは反応しなかった。Ｂで
は、オート麦種子以外の植物種子から調製した酵素が、
オート麦前駆体を、予想される酸性サブユニットと塩基
性サブユニットの結合部位に存在するアスパラギン残基
の後で正確に切断するか否かを明らかにするために行っ
た実験結果を示している。精製したオート麦１２Ｓグロ
ブリンPro-A2B のタンパク質（６０μｇ）を、ダイズ由
来の精製アスパラギニルエンドプロテアーゼ（２μｇ）
で切断した。その後、SDS-pageで分離した塩基性サブユ
ニットに相当すると思われるフラグメントを、実施例４
に示した方法でＮ−末端アミノ酸配列分析をガス相アミ
ノ酸配列解析機（米国ＡＢＩ社製）を用いて分析した。
なお、＊はPro-A2B 、＊＊は酵素により切断した酸性サ
ブユニットA2である。
前駆体に酵素を作用させた後のウエスタンブロット分析
図である。５８Ｋはオート麦１２Ｓグロブリン前駆体で
あるPro-A2B 、３３Ｋはオート麦１２ＳグロブリンのA2
酸性サブユニットである。図中、ａはオート麦１２Ｓグ
ロブリン画分（オート麦種子から抽出したタンパク質で
ある。図６のcDNAの塩基配列から明らかなように、酸性
サブユニットのＣ−末端を種々の程度に欠損したｍＲＮ
Ａ群により大きさの異なるオート麦１２Ｓタンパク質が
合成されている。A2酸性サブユニットはその中でも最も
分子量の大きなタンパク質である。）を示し、ｂは pro
-A2Bを示す。ｃは pro-A2Bオート麦からのアスパラギニ
ルエンドプロテアーゼの粗酵素液を加えて反応させない
もの（コントロール実験）を示し、ｄは pro-A2Bに上記
ｃと同じ酵素液を加えて反応させたものを示す。ｅはダ
イズ精製酵素と pro-A2Bで反応させたものを示し、ｆは
フジ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示す。ｇはエ
ニシダ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示し、ｈは
エンジュ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示す。ｉ
はサザンカ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示し、
ｊはアオギリ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
す。ｋはツバキ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
し、ｌはタバコ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
す。ｍはコメ精製酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
し、ｎはコムギ粗酵素と pro-A2Bで反応させたものを示
す。ｏはトウモロコシ粗酵素と pro-A2Bで反応させたも
のを示し、ｐは大麦粗酵素と pro-A2Bで反応させたもの
を示す。ｑはギンナン精製酵素と pro-A2Bで反応させた
ものを示し、ｒはツルマメ粗酵素と pro-A2Bで反応させ
たものを示す。ｓはA2B のみで酵素を入れずに反応させ
たもの（対照）を示す。Ｂは、異種酵素によるオート麦
１２ＳグロブリンA2B タンパク質の切断部位の同定のた
めのＣＢＢ染色像である。Ａで、由来を異にする酵素が
同一の基質を同一の部位で切断している可能性が高いこ
とをイムノブロット法で示した。なお、使用した抗体は
オート麦１２Ｓグロブリンに対して作成されたが、オー
ト麦１２Ｓグロブリンの酸性サブユニットに対してのみ
反応し、塩基性サブユニットとは反応しなかった。Ｂで
は、オート麦種子以外の植物種子から調製した酵素が、
オート麦前駆体を、予想される酸性サブユニットと塩基
性サブユニットの結合部位に存在するアスパラギン残基
の後で正確に切断するか否かを明らかにするために行っ
た実験結果を示している。精製したオート麦１２Ｓグロ
ブリンPro-A2B のタンパク質（６０μｇ）を、ダイズ由
来の精製アスパラギニルエンドプロテアーゼ（２μｇ）
で切断した。その後、SDS-pageで分離した塩基性サブユ
ニットに相当すると思われるフラグメントを、実施例４
に示した方法でＮ−末端アミノ酸配列分析をガス相アミ
ノ酸配列解析機（米国ＡＢＩ社製）を用いて分析した。
なお、＊はPro-A2B 、＊＊は酵素により切断した酸性サ
ブユニットA2である。
【図９】 実施例６の酵素による合成ペプチドの分解ル
ールを示すＨＰＬＣパターンである。上図は、ペプチド
ＮＮＮＶＥＥＬの分解パターンを、下図は、ペプチドＮ
ＮＮＥＶＥＬの分解パターンを示す。ＳはＮＮＮＥＶＥ
Ｌ，ＰはＥＶＥＬを示す。
ールを示すＨＰＬＣパターンである。上図は、ペプチド
ＮＮＮＶＥＥＬの分解パターンを、下図は、ペプチドＮ
ＮＮＥＶＥＬの分解パターンを示す。ＳはＮＮＮＥＶＥ
Ｌ，ＰはＥＶＥＬを示す。
【図１０】 実施例６の酵素のＳＤＳ−ゲル電気泳動像
であり、Ｍは分子量マーカー、レーン１は米の精製酵素
（分子量約４５Ｋダルトン）、レーン２はイチョウの精
製酵素（分子量３７Ｋダルトン）、レーン３は大豆由来
の精製酵素（分子量３３〜３４Ｋダルトン）を示す。
であり、Ｍは分子量マーカー、レーン１は米の精製酵素
（分子量約４５Ｋダルトン）、レーン２はイチョウの精
製酵素（分子量３７Ｋダルトン）、レーン３は大豆由来
の精製酵素（分子量３３〜３４Ｋダルトン）を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 被子植物または裸子植物の種子中より得
られ、下記の理化学的性質を有する新規アスパラギニル
エンドプロテアーゼ。 (1) グリシニン型貯蔵タンパク質前駆体または該タンパ
ク質に類するタンパク質前駆体に作用し、その酸性サブ
ユニット領域のＣ末端アミノ酸残基であるAsnと塩基性
サブユニット領域のＮ末端アミノ酸であるGly またはAs
n の間を正確に加水分解して該前駆体を成熟化する (2) 作用ｐＨが4.０から7.０である (3) チオール性である (4) 分子量３３Ｋから４６ＫＤａの単純タンパク質で、
糖鎖を有しない (5) ペプチドまたは変性タンパク質に作用し、アスパラ
ギン残基のカルボキシル基側でペプチド結合を加水分解
するが、脱アミノ基作用を有しない - 【請求項２】 登熟初期から完熟期までの被子植物また
は裸子植物の粉砕した種子をｐＨ4.０〜6.０の緩衝液で
抽出し、その可溶性画分を透析したのち固−液分離し、
次いで疎水クロマトグラフィーを行うことを特徴とする
請求項１記載の新規アスパラギニルエンドプロテアーゼ
の製造法。 - 【請求項３】 登熟初期から完熟期までの被子植物また
は裸子植物の粉砕した種子をｐＨ4.０〜6.０の緩衝液で
抽出し、その可溶性画分を透析したのち固−液分離し、
得られた液体を硫安分画，疎水クロマトグラフィーおよ
びゲル濾過を行うことを特徴とする請求項１記載の新規
アスパラギニルエンドプロテアーゼの製造法。 - 【請求項４】 グリシニン型貯蔵タンパク質前駆体また
は該タンパク質に類するタンパク質前駆体に請求項１記
載の酵素を０から１Ｍの塩化ナトリウムおよび０から５
０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む緩衝液中で作
用させて成熟化することを特徴とするグリシニン型貯蔵
タンパク質の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4215739A JPH0824576B2 (ja) | 1992-07-22 | 1992-07-22 | 新規アスパラギニルエンドプロテアーゼとその製造法並びに利用法 |
| DE4324276A DE4324276C2 (de) | 1992-07-22 | 1993-07-20 | Asparaginyl-Endoprotease, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| GB9315233A GB2269177B (en) | 1992-07-22 | 1993-07-22 | Asparaginyl endoprotease |
| US08/486,721 US5739025A (en) | 1992-07-22 | 1995-06-07 | Method for producing an asparaginyl endoprotease |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4215739A JPH0824576B2 (ja) | 1992-07-22 | 1992-07-22 | 新規アスパラギニルエンドプロテアーゼとその製造法並びに利用法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07184A JPH07184A (ja) | 1995-01-06 |
| JPH0824576B2 true JPH0824576B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
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Family Cites Families (1)
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Non-Patent Citations (1)
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