CN115047092B - 一种血管紧张素转移酶ii抑制剂的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提出了一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，涉及生物分析领域。一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其包括以下步骤：体外反应体系的构建：将血管紧张素转移酶II与待测药物以及血管紧张素转移酶II所对应的特异性底物混合反应，构建体外血管紧张素转移酶II的反应体系；液相色谱分析测定：通过液相色谱分析测定体外反应体系中反应产物的含量；抑制剂效果评估：对液相色谱分析测定结果进行抑制率计算，根据抑制率的结果来对血管紧张素转移酶II抑制剂的抑制效果进行评估。该筛选方法灵敏度高，准确度好，稳定性强，且大大节约酶和底物的用量，具备高通量筛选条件，易于推向市场。

Description

一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法
技术领域
本申请涉及生物分析领域，具体而言，涉及一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法。
背景技术
血管紧张素转移酶II(ACE II)被认为是SARS-CoV-2的主要受体，宿主细胞膜上的受体ACE II促进SARS-CoV-2的刺突S蛋白与细胞膜融合，这是感染的关键初始阶段，SARS-CoV-2进入宿主细胞后释放病毒遗传物质到支气管上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞中，引发人呼吸道感染和间质性肺炎，因此，ACE II被认为是控制COVID-19爆发的重要治疗靶点，也是抗病毒药物的最有希望的治疗靶点。因此，建立针对ACE II抑制剂筛选的方法是新的有效的治疗策略，开发ACE II抑制剂对于开发治疗COVID-19药物提供了新思路。
现有的ACE II抑制剂筛选模型，包括虚拟筛选、荧光光谱筛选、色谱筛选等。虚拟筛选法虽然可有效降低高通量筛选的实验成本，但假阳性化合物的有效排除仍是虚拟筛选需要关注的核心问题。虚拟筛选必须与实验筛选技术有机结合，才能进一步确定候选苗头化合物的潜在抑制活性。荧光分析方法具有操作简单、检测灵敏、分析快速等优点，但需要分离纯化高活性的ACE II及具备配套的仪器，需要克服快速水解、高浓度荧光干扰物基质效应及高筛选成本的缺点，基质效应的存在促使学者将研究目标瞄准色谱分离系统。现有的色谱法，利用细胞膜层析(CMC)技术完成抑制剂筛选分离，都是利用特殊填料和稳定的ACE II混合制成色谱柱，先将与ACE II相互作用的化合物筛选出来，再结合细胞毒性试验、冠状病毒刺突假型病毒进入试验、表面等离子共振技术等确定抑制剂活性。此类方法制备ACE II/CMC色谱柱程序相对复杂，且重复性和是否可进行高通量筛选还有待考证。另外，使用二维色谱与质谱联用对筛选出抑制剂进行结构表征，仪器成本较高，推广普及性将受到影响。因此，建立灵敏度高、简单便捷、可高通量筛选、稳定性好及易推广的ACE II抑制剂筛选方法是现在ACE II抑制剂开发的新目标。
发明内容
本申请的目的在于提供一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，该筛选方法具有反应体系微小、灵敏度高、特异性强，且能避免复杂生物样品中的物质对测定结果的干扰等优点。
本申请解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本申请实施例提供一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
体外反应体系的构建：将血管紧张素转移酶II、待测化合物以及上述血管紧张素转移酶II所对应的特异性底物混合反应，得到反应产物，构建出血管紧张素转移酶II的体外反应体系；
上述特异性底物为硝基修饰的血管紧张素II Ang II(-NO2)，上述反应产物为4-硝基苯丙氨酸；
液相色谱分析测定：通过液相色谱分析测定上述体外反应体系中上述反应产物的含量；
待测化合物的抑制效果评估：对上述液相色谱分析测定结果进行抑制率计算，根据抑制率的结果评估待测化合物对血管紧张素转移酶II的抑制效果；上述抑制率计算公式如方程式(1)所示；
其中R1和R2分别是具有待测化合物和无待测化合物时上述体外反应体系中产物的峰面积。
相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：
1、本申请提供的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，使用实验室常规的液相色谱仪作为分析检测仪器，利用商品化的酶和商品化的底物建立的反应体系，避免采用价格昂贵且操作繁琐的细胞水平的筛选，使该方法更利于重复和推广，且反应体系微小，成本低。
2、本申请利用高效液相色谱分析法对反应产物进行测定，操作简便，能有效降低干扰，使得测定的灵敏度高和重现性强，且可以连续分析大批量的待测化合物，节约时间，能够有效的提高筛选效率。
3、该筛选方法，不仅可以用于药物开发初期ACE II抑制剂的开发，为药物发现提供药物基础；还可以用于临床中ACE II抑制剂类药物的用药剂量以及体内ACE II活性水平的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例中一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法的原理图；
图2为本申请实施例1中产物4-硝基苯丙氨酸峰面积对4-硝基苯丙氨酸浓度的标准曲线；
图3为本申请实施例1中产物4-硝基苯丙氨酸与内标的峰面积比值(I/I0)对4-硝基苯丙氨酸浓度的标准曲线；
图4为本申请实施例1中外标法空白血浆、空白底物、产物标准品及ACE II反应体系的色谱图；
其中，4A为外标法空白血浆的色谱图，4B为外标法空白底物的色谱图，4C为外标法产物标准品的色谱图，4D为外标法ACE II反应体系的色谱图；
图5为本申请实施例1中内标法产物标准品及ACE II反应体系的色谱图；
其中，5A为内标法产物标准品的色谱图，5B为内标法ACE II反应体系的色谱图；
图6为本申请实施例14中待筛选化合物的抑制率结果。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本申请。
本实施方式提供一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
体外反应体系的构建：将血管紧张素转移酶II、待测化合物以及上述血管紧张素转移酶II所对应的特异性底物混合反应，得到反应产物，构建出血管紧张素转移酶II的体外反应体系；
上述特异性底物为硝基修饰的血管紧张素II Ang II(-NO2)，上述反应产物为4-硝基苯丙氨酸；
液相色谱分析测定：通过液相色谱分析测定上述体外反应体系中上述反应产物的含量；
待测化合物的抑制效果评估：对上述液相色谱分析测定结果进行抑制率计算，根据抑制率的结果评估待测化合物对血管紧张素转移酶II的抑制效果；上述抑制率计算公式如方程式(1)所示；
其中R1和R2分别是具有待测化合物和无待测化合物时上述体外反应体系中产物的峰面积。
上述特异性底物为硝基修饰的血管紧张素II(Ang II(-NO2))，具体为血管紧张素II末尾处苯丙氨酸的对位被硝基取代；对应生成的特异性反应产物为4-硝基苯丙氨酸(pNP)。pNP作为定量标准，可直接用外标法测定反应产物的含量；也可通过内标法测定反应产物的含量。
在本申请的一些实施例中，上述体外反应体系的构建步骤中，先将上述待测化合物与上述血管紧张素转移酶II混合，再加入上述特异性底物进行混合反应。该筛选方法筛选的对血管紧张素转移酶II具有抑制作用的化合物的类型，大都为竞争性抑制剂，和血管紧张素转移酶II上的活性位点结合，使得特异性的底物减少甚至不能和血管紧张素转移酶II发生反应，生成的产物就会减少，甚至不生成。先将上述待测化合物与上述血管紧张素转移酶II混合，保证能与血管紧张素转移酶II活性位点发生作用的待测化合物充分接触，先与活性位点结合，再加入特异性底物与未被结合的位点发生特异性反应，产生我们方法中定量测定的特异性产物，以此来确定待测化合物是否对血管紧张素转移酶II具有抑制作用。反之，如果将血管紧张素转移酶II和底物先混合，或是血管紧张素转移酶II、待测化合物和底物一同混合，由于底物和酶特异性反应能力可能优于待测化合物与酶的结合能力，抢先占下活性位点，本身具有结合能力的待测化合物将减少或不能结合，筛选将出现假阴性的情况。
在本申请的一些实施例中，上述体外反应体系的构建的步骤中，混合反应后还需要加入淬灭剂。反应加入淬灭剂的作用是使血管紧张素转移酶II瞬间失活，不能发生反应。酶反应是一个过程，到达反应平台期的时间跟酶和底物量都有关系，酶和产物完全反应需要的时间不定，在优化完酶的用量和底物浓度后，可以测定出反应体系的产物达到可准确定量的时间。加入淬灭剂一方面是为了控制实验变量，使得建立的筛选体系的反应时间是统一的，再加上统一底物浓度，待测化合物浓度，酶用量等条件，保证反应条件的统一性，减少反应中不定变量对实验准确性的影响；另一方面，淬灭剂使得酶失活后，会产生沉淀析出，离心取上清后，待测的特异性产物会保留在上清液中进行分析，清澈的上清液进入液相色谱仪分析，会减少对色谱柱和仪器的伤害。
加入淬灭剂后制得供试品，供试品的制备包括：将加入淬灭剂后的反应液离心，取上清液，或者利用固相萃取系统处理即为外标法供试品。此外，将上清液与等体积的内标混合，得到待测的内标法供试品。
这里需要说明的是，淬灭剂为有机溶剂，例如甲醇、乙腈等。这些溶剂能达到淬灭反应体系，使得酶失活后沉淀出来的效果；另外，甲醇、乙腈对于液相色谱仪是非常友好的试剂，虽然强酸强碱高温等条件也能使反应失活，但强酸强碱溶液对于仪器损害较大，不建议使用。而高温条件对于实验操作是不方便的，容易对实验人员造成伤害。
在本申请的一些实施例中，上述混合反应的时间为3-30min。酶反应是一个过程，反应前期产物生成量是一个直线上升的过程，测定前30min大约是线性增长期，但3h才到达反应平台期，以反应完全结束的时间作为反应时间过于耗时，在优化完酶的用量和底物浓度后，可以测定出反应3min后，反应体系的产物就可以达到可准确定量的程度。因此选择这个时间段，即节省时间，又能准确测定产物生成量，使得建立的筛选体系具备快速、准确的特点。
在本申请的一些实施例中，上述液相色谱分析测定步骤中，还包括反应产物前处理，上述前处理方法为萃取。反应体系由酶，特异性底物、产物及缓冲液构成。酶可以由人的血清或血浆离心取上清获得，也可以通过构建人ACE II过表达慢病毒侵染人HEK 293细胞，培养后离心取上清获得。因此整个反应体系相对来说是复杂的，如果直接取样进行液相色谱分析，即损害色谱柱，也会堵塞液相色谱系统。通过加入淬灭剂，可以达到沉淀反应体系中蛋白等大分子物质的效果，而反应产物作为小分子，会依然溶解在上层上清液中。在方法学验证中，曾考察过基质效应的影响，反应产物在上清液中的回收率可达85％以上，符合方法学开发的要求。因此采取加入淬灭剂离心取上清的方式对反应体系进行离线的样品前处理。
在本申请的一些实施例中，上述萃取为离心取上清，或是固相萃取。离心取上清的方法，一方面方法简单易操作，通过基质效应考察，回收率也能达到要求。另外，该方式只需简单的有机溶剂和离心机即可完成实验，实验成本低，可推行程度高。固相萃取技术也可以达到对反应产物分离富集的效果，但是固相萃取技术相对来说，实验成本提高，且要经过活化-上样-淋洗-洗脱等一系列步骤，实验时间会大大增加，而且要配置固相萃取装置和氮吹仪。其他一些在线样品前处理除蛋白的方法，皆需配备在线样品前处理系统，仪器更加繁复且昂贵，普及更加困难，因此选择简单萃取和固相萃取两种方式。
在本申请的一些实施例中，上述液相色谱分析测定步骤中，测定上述反应产物的方法为，利用自动进样器进样，进样量为1-20μL；然后采用有机溶剂-水体系洗脱分析色谱柱，流速为0.3-1.2mL/min；然后洗脱液进入紫外检测器进行分析，冲洗时间为3-10min。进样量过大，可能会堵塞色谱柱筛板，影响色谱柱使用寿命。采用有机溶剂-水体系洗脱分析色谱柱是通过有机溶剂-水体系的洗脱色谱柱，能将反应体系中底物，产物及少量残留蛋白分离开，达到准确定量的效果。流速为0.3-1.2mL/min，在这一范围下，底物，产物及少量残留蛋白均能实现基线分离。冲洗时间为3-10min，在这个时间内产物及少量残留蛋白会被冲洗下来。
在本申请的一些实施例中，上述有机溶剂-水体系为50％乙腈-50％水。此条件下，底物、产物及少量残留蛋白均能实现基线分离，且色谱峰响应最灵敏。
在本申请的一些实施例中，上述分析色谱柱为反相分析色谱柱。本方法的定量物质为产物4-硝基苯丙氨酸，为小分子极性适中化合物，反相分析色谱柱非常适合分析小分子极性适中化合物，反相分析色谱柱能达到将其与反应体系其他成分分离，且具有较高灵敏度的效果，因此选用反相分析色谱柱。
在本申请的一些实施例中，上述紫外检测器的检测波长范围是265-285nm。本方法的定量物质为产物4-硝基苯丙氨酸，其在265-285nm具有较灵敏的吸收，因此在此波长范围内对4-硝基苯丙氨酸定量测定，会更灵敏准确。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种ACE II抑制剂的筛选方法，其包括以下步骤：
一、建立体外ACE II抑制剂的筛选反应体系：
体外ACE II抑制剂的筛选体系的原理为：反应底物与ACE II混合后，会生产成相应特异性具有紫外吸收的产物，当待测化合物，例如1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌，与ACE II混合后形成复合物的ACE II不具有酶活性也无法催化特异性底物转化成产物的反应，即抑制了ACE II的反应活性。因此，通过测定产物的含量，便可反映出待测药物的抑制作用大小，其检测原理如图1所示。
1.溶液配制：
反应底物配置：在分析天平上准确称取反应底物Ang II(-NO2)10mg，用pH 7.5缓冲溶液(0.001mM Zn(OAc)2，0.1mM TCEP，50mM HEPES，0.3mM CHAPS和300mM NaCl)稀释定容至10ml棕色容量瓶中，-20℃冰箱中保存。
待测化合物的配置：精密称取待测化合物适量，使用少量DMSO溶解后，用缓冲溶液稀释至100nmol，-20℃冰箱中保存。
阳性对照溶液：精密称取1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌适量，使用少量DMSO溶解后，用缓冲溶液稀释至100nmol，-20℃冰箱中保存。
2.ACE II抑制剂的筛选体系构建：
ACE II的获取：以健康人类空白血浆作为ACE II的来源。血清：室温血液自然凝固15min，在2500rpm/min条件下，离心20min左右。血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合15min后，在2500rpm/min条件下，离心20min。仔细收集上清。两者均保存在-20℃冰箱中，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
也可通过构建人重组ACE II的过表达慢病毒载体，并将包装好的慢病毒侵染人HEK 293细胞，37℃、5％ CO2条件下培养；在6孔板中以0.5×106cell/mL的密度传代，培养时细胞密度不可超过1.2×106cell/mL。使用时，在4000rpm/min条件下，离心20min，取上清。
取50μL ACE II，分别加入50μL 100nmol·L-1待测化合物溶液，混匀后加入相同体积的特异性底物Ang II(-NO2)，混合后，反应5min，加入100μL含有0.2％乙酸的乙腈溶液淬灭。12000rpm离心10min后取100μL的上清液可直接作为外标法进行分析，亦可和100μL的内标混合进行高效液相色谱分析。
二、建立基于HPLC法ACE II筛选体系中的反应产物：
1.HPLC方法的建立
本实验采用液相色谱仪为大连依利特ECLASSICAL 3200；采用反向色谱柱型号为大连依利特Supersil ODS2 5μm(4.6mm*250mm)，流动相的组成为50％乙腈(含0.1％甲酸)水溶液，流速为1.0mL/min；进样量为5μL；冲洗时间为5min。紫外检测波长为274nm。
2.建立ACE II反应体系中反应产物的定量方法：
准确称取4-硝基苯丙氨酸(pNP)粉末适量，用50％乙腈水(v/v)溶液定容于250mL容量瓶中，保存于4℃冰箱中。使用时，用50％乙腈水(v/v)溶液分别配置成1μg/L到2000mg/L系列浓度的产物标准溶液，进行液相色谱分析。产物4-硝基苯丙氨酸的标准曲线如图2所示，线性回归方程为Y＝47.98X+182.1(R2＝0.999)，定量范围为5μg/L到300mg/L；
采用内标法定量，内标为萘，进行高效液相色谱分析。以产物与内标质谱响应面积比I/I0为Y轴和产物浓度为X轴，建立标准曲线：产物4-硝基苯丙氨酸的标准曲线如图3所示，线性回归方程为Y＝0.09277X+0.3232(R2＝0.999)，定量范围为5μg/L到300mg/L；
从图2和图3可以看出，上述标准曲线线性良好，因此，采用液相色谱定量分析的结果是准确可靠的。
外标法色谱图分析如图4所示，空白血浆和空白底物中未出现产物4-硝基苯丙氨酸的色谱峰(如图4A和图4B所示)，说明ACE II反应体系中的产物4-硝基苯丙氨酸皆为ACEII催化特异性反应底物Ang II(-NO2)所产生，ACE II反应体系中产物4-硝基苯丙氨酸的出峰时间和产物标准品出峰时间一致(如图4C和图4D所示)，均为2.20min左右。如图4B所示，空白底物出峰时间为1.70min左右，与产物4-硝基苯丙氨酸可实现基线分离。
内标法色谱图分析如图5所示，本法选用萘作为内标物，一方面萘在275nm处具有最大吸收，与产物4-硝基苯丙氨酸相近；另外，如图5A所示，萘在此实验条件下，出峰时间为3.00min左右，既与产物峰出峰时间相差不远，且实现了基线分离。内标法定量ACE II反应体系色谱图如图5B所示，底物、产物及内标分别在1.70min左右、2.20min左右及3.00min左右出峰。
3.方法学验证：
针对建立的产物定量方法进行方法验证，考察定量限、检测限、精密度、准确度和基质效应，应符合2020版中国药典四部《分析方法验证指导原则》要求。
(1)定量限和检测限
4-硝基苯丙胺酸的检测限：1μg/L(SNR＝3.50±1.53；n＝6)；定量下限：5μg/L(SNR＝11.05±1.26；n＝6)。由该结果可以看出该方法检测灵敏度高。
(2)精密度和准确度考察
配置低浓度(30μg/L)，中间浓度(10mg/L)，高浓度(300mg/L)三个浓度水平的产物溶液作为质控样品，进行准确度和精密度的考察。准确度都在85％-115％之间，精密度的相对偏差都在±15％之内，说明该方法精密度和准确度良好。
(3)基质效应的考察
分别用缓冲液和酶溶液配置低浓度(30μg/L)，中间浓度(10mg/L)，高浓度(300mg/L)三个浓度水平的产物溶液，分析基质(酶溶液)中产物检测的回收率和精密度。回收率都在85％-115％之间，说明该方法不受基质干扰。
4.建立基于HPLC筛选ACE II抑制剂的方法
使用已知抑制作用的1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌做标准阳性对照空白水溶液为阴性对照进行抑制剂筛选测定，按照本方法测定出的阳性对照1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌的IC50值为186nmol，与已知文献报道的200nmol相当。
由此说明本实施例建立的基于HPLC筛选ACE II抑制剂的方法准确，灵敏，可以作为ACE II抑制剂开发的方法。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，区别在于以下几点：
1、在ACE II抑制剂的筛选体系构建步骤中，待测化合物溶液与血管紧张素转移酶II混合，加入相同体积的特异性底物Ang II(-NO2)，混合后，反应3min。
2、在HPLC方法的建立步骤中，流速为0.3mL/min；进样量为10μL；冲洗时间为8min，紫外检测波长为265nm。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，区别在于以下几点：
1、在ACE II抑制剂的筛选体系构建步骤中，待测化合物溶液与血管紧张素转移酶II混合，加入相同体积的特异性底物Ang II(-NO2)，混合后，反应15min。
2、在HPLC方法的建立步骤中，流速为1.2mL/min；进样量为15μL；冲洗时间为3min，紫外检测波长为285nm。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，区别在于以下几点：
1、在ACE II抑制剂的筛选体系构建步骤中，待测化合物溶液与血管紧张素转移酶II混合，加入相同体积的特异性底物Ang II(-NO2)，混合后，反应20min。
2、在HPLC方法的建立步骤中，流速为0.5mL/min；进样量为8μL；冲洗时间为7min。
实施例5
本实施例与实施例1基本相同，区别在于以下几点：
1、在ACE II抑制剂的筛选体系构建步骤中，待测化合物溶液与血管紧张素转移酶II混合，加入相同体积的特异性底物Ang II(-NO2)，混合后，反应30min。
2、在HPLC方法的建立步骤中，流速为0.9mL/min；进样量为20μL。
实施例6-13
分别使用如表1所示的阳性药物1N-08795、1N-26923、1N-28616、1S-91206、4S-14713、4S-16659、DX600和MLN 4760代替实施例1中的1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌，再根据表2所示的底物，依次建立ACE II抑制剂筛选体系以及建立对应产物的液相色谱分析方法，最后测定阳性药物IC50值，其结果与文献报道结果一致。
表1.血管紧张素酶转换酶抑制剂类药物
表2.ACE II筛选体系中可用的酶和底物
实施例14
本实施例为血管紧张素转移酶II抑制剂筛选方法的验证实验，本实施例的筛选方法与实施例1中的筛选方法相同。
以已知具有抑制ACE II作用的化合物(药物)为阳性对照，水为空白对照，使用实施例1中所提供的筛选方法筛选出具有抑制作用的化合物，即化合物1-9，并计算出相应浓度下的抑制率。
化合物1-9，分别为异百里香酚、柠檬烯、麻黄碱、常春藤苷D、伪麻黄碱、对异丙基甲苯、桔梗皂苷D、松果菊苷、异绿原酸C。
抑制率计算公式如方程式(1)所示，通过将具有抑制剂的产物的响应值除以空白对照中的响应值来计算每个抑制剂浓度的抑制率。
其中R1和R2分别是具有抑制剂和无抑制剂的产物的峰面积。
待筛选化合物1-9的抑制率结果如图6所示，从图6中可以看出，化合物1-9均对血管紧张素转移酶II有抑制作用，与报道中一致。该实验表明，本申请提供的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法具有高准确性。
综上所述，本申请实施例的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其包括以下步骤：体外反应体系的构建：将血管紧张素转移酶II与待测药物以及血管紧张素转移酶II所对应的特异性底物混合反应，构建体外血管紧张素转移酶II的反应体系；液相色谱分析测定：通过液相色谱分析测定体外反应体系中反应产物的含量；抑制剂效果评估：对液相色谱分析测定结果进行抑制率计算，根据抑制率的结果来对血管紧张素转移酶II抑制剂的抑制效果进行评估。
本申请提供的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，利用高效液相色谱分析法对反应产物进行测定，操作简便，能有效降低干扰，使得测定的灵敏度高和重现性强，且反应体系微小，成本低，且可以连续分析大批量的待测样品，节约时间，能够有效的提高筛选效率。
本申请提供的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，不仅可以用于药物开发初期，ACE II抑制剂的开发，为药物发现提供药物基础，还可以用于临床中ACE II抑制剂类药物的用药剂量以及体内ACE II活性水平的检测。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims (10)

1.一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，其包括以下步骤：
体外反应体系的构建：将血管紧张素转移酶II、待测化合物以及所述血管紧张素转移酶II所对应的特异性底物混合反应，得到反应产物，构建出血管紧张素转移酶II的体外反应体系；
所述特异性底物为硝基修饰的血管紧张素II Ang II(-NO2)，所述反应产物为4-硝基苯丙氨酸；
液相色谱分析测定：通过液相色谱分析测定所述体外反应体系中所述反应产物的含量；
待测化合物的抑制效果评估：对所述液相色谱分析测定结果进行抑制率计算，根据抑制率的结果评估待测化合物对血管紧张素转移酶II的抑制效果；
所述抑制率计算公式如方程式(1)所示；
其中R1和R2分别是具有待测化合物和无待测化合物时所述体外反应体系中产物的峰面积。
2.根据权利要求1所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，在所述体外反应体系的构建步骤中，先将所述待测化合物与所述血管紧张素转移酶II混合，再加入所述特异性底物进行混合反应。
3.根据权利要求2所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，在所述体外反应体系的构建的步骤中，混合反应后还需要加入淬灭剂。
4.根据权利要求2所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述混合反应的时间为3-30min。
5.根据权利要求1所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，在所述液相色谱分析测定步骤之前，还包括反应产物前处理，所述前处理方法为萃取。
6.根据权利要求5所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述萃取为离心取上清，或是固相萃取。
7.根据权利要求1所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，在所述液相色谱分析测定步骤中，测定所述反应产物的方法为，利用自动进样器进样，进样量为1-20μL；然后采用有机溶剂-水体系洗脱分析色谱柱，流速为0.3-1.2mL/min；然后洗脱液进入紫外检测器进行分析，冲洗时间为3-10min。
8.根据权利要求7所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述有机溶剂-水体系为50％乙腈-50％水。
9.根据权利要求7所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述分析色谱柱为反相分析色谱柱。
10.根据权利要求7所述的一种血管紧张素转移酶II抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述紫外检测器的检测波长范围是265-285nm。
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