CN113797197B - 替加色罗或其药学上可接受的盐在药物转运中的应用 - Google Patents

替加色罗或其药学上可接受的盐在药物转运中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种替加色罗或其药学上可接受的盐在药物转运中的应用，属于医药应用领域。本发明基于SPR、HPLC及MALDI‑TOF‑MS对替加色罗在DU145细胞中的靶标蛋白进行了捕获测试及数据分析，通过测试发现，替加色罗可有效捕获结合力Score＞200的蛋白靶基因，并从中可筛选得到与药物耐药逆转功能相关的蛋白质，证明了替加色罗具有潜在的药物耐药逆转活性。进一步，通过试验可证明，替加色罗可与人乳腺癌耐阿霉素MCF7/ADR细胞株、人卵巢瘤耐顺铂COC1/DDP细胞株联用，确实可有效提高细胞增殖抑制率，发挥良好的药物逆转功效，有效运用于药物转运中。

Description

替加色罗或其药学上可接受的盐在药物转运中的应用
技术领域
本发明属于医药应用领域，涉及替加色罗或其药学上可接受的盐在药物转运中的应用。
背景技术
替加色罗是一种5-羟色胺4型受体(5-HT4R)的激动剂，商品名为Zelnorm，分子式C20H27N5O5，分子量417.5g/mol，化学名为3-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-基亚甲基)-N-戊基咔唑酰胺马来酸氢盐。最初2002年被FDA批准用于女性便秘型肠易激综合征(IBS-C)的治疗，2019年3月，经安全性审查后用于治疗65岁以下无心血管疾病史女性IBS-C。
药物逆转是指通过化学药物来抑制多药耐药蛋白，从而减弱多药耐药蛋白将药物排除细胞外的能力，这样一来就可以增加细胞中药物的浓度，达到杀死细胞的目的。转运蛋白是介导化合物通过主动转运或被动转运进入或排出细胞的内在膜蛋白，是药物在体内处置的关键环节之一，负责药物的吸收和外排，外排型转运体主要为ABC结合盒式转运体(ATPbinding cassette transporter，ABC转运体)，ABC转运体影响着药物整个吸收、分布、代谢、排泄过程以及各种药物对机体的毒性大小，其中常见的转运蛋白有p-糖蛋白(permeability glycoprotein，P-gp)(ABCB1)、多药耐药相关蛋白MRP1(ABCC1)、乳腺癌耐药蛋白BCRP(ABCG2)(BCRP/ABCG2)、五羟色胺转运体(serotonin reuptake transporter，SERT)(SLC6A4)。
最近的研究发现，由转运体介导的药物相互作用是导致药物不良反应的一个重要机制，对于药物相互作用机制的研究是减少不良反应发生的重要方法之一。老药新用是寻找已有药物或化合物的临床新用途。与传统的从头开始发现新药的途径相比，老药新用可利用已有的药理药效学、药代动力学特性、安全性、副作用、药物相互作用等方面的临床数据，从而大大加快药物研发周期并降低上市成本。
发明内容
本发明提供了替加色罗或其药学上可接受的盐在药物转运中的应用，本发明基于SPR、HPLC及MALDI-TOF-MS对替加色罗在DU145细胞中的靶标蛋白进行了捕获测试及数据分析发现，替加色罗具有潜在的药物耐药逆转活性。通过替加色罗与人乳腺癌耐阿霉素MCF7/ADR细胞株、人卵巢瘤耐顺铂COC1/DDP细胞株联用试验证明，其确实可有效提高细胞增殖抑制率，发挥良好的药物逆转功效。
为了达到上述目的，本发明提供了一种替加色罗或其药学上可接受的盐在药物转运中的应用。
作为优选，基于SPR、HPLC及MALDI-TOF-MS对替加色罗在DU145细胞中的靶标蛋白进行捕获、筛选。
作为优选，捕获、筛选具体方法为：
将替加色罗配制液通过高通量阵列打印的方法点样在3D光交联传感芯片上的指定区域，随后通过紫外光的照射引发光交联反应而固定于芯片表面；
以DU145细胞裂解液为流动相，以芯片表面的替加色罗分子为固定相，使用SPR生物芯片监测设备实时监测芯片表面固定的分子与细胞裂解液中靶标蛋白质的结合情况，直至芯片背景噪声恢复正常；
对芯片表面固定的分子所捕获的蛋白质进行原位Trypsin酶解，基于LC-MS联用对上述蛋白质进行鉴定，并通过数据加权打分及功能注释分析得到被捕获的蛋白质的种类和功能。
作为优选，替加色罗配制液为用DMSO配制成的10mM溶液；DU145细胞裂解液经配制后的终浓度为200μg/mL。
作为优选，所捕获得到的得分Score＞200的蛋白包括MDM2、ABCC2、TRPC4、SLC6A3、HTR2B、ABCB11、BRCA1、NFE2L2、POLK、ABCC3、ABHD4、HTR1D、FEN1、KCNJ2、ABCG2、CYP1A2、ERG、USP2、GMNN、FOSB、KCNH2、SMAD3、HTR2C、HTR7、HTR2A、SLCO1B1、KCNQ1、CYP2C8、SLC6A4、NPFFR2、NPFFR1、KCNQ2、ABCC4、TARDBP、KCNK9、SNCA、APAF1、SLCO1B3、PMP22、KDM4A、RBBP8、H4C1、SMPD1、GLP1R和RACGAP1。
作为优选，所筛选得到的得分Score＞200的且与药物转运相关的蛋白包括MDM2、ABCC2、SLC6A3、HTR2B、ABCB11、BRCA1、NFE2L2、ABCC3、HTR1D、KCNJ2、ABCG2、CYP1A2、FOSB、KCNH2、HTR2C、HTR2A、KCNQ1、CYP2C8、SLC6A4、KCNQ2、ABCC4、TARDBP、KCNK9、APAF1、PMP22、SMPD1和GLP1R。
作为优选，所筛选得到的得分Score＞200的且与药物转运相关的蛋白的药物转运功能主要表现为ABC转运体、铂类药物耐药、药物跨膜转运、药物代谢过程、细胞对药物的反应、药物反应、钾通道活性、药物逆转功能、药物代谢和药物逆转中的至少一种。
作为优选，替加色罗与人乳腺癌耐阿霉素MCF7/ADR细胞株联用，相比于2μM替加色罗、5μM替加色罗和1μM阿霉素单独使用的细胞增殖抑制率为12.5％、68.0％和24.83％，替加色罗2μM+阿霉素1μM联用后的细胞增殖抑制率为49.53％，替加色罗5μM+阿霉素1μM联用后的细胞增殖抑制率为86.86％。
作为优选，替加色罗与人卵巢瘤耐顺铂COC1/DDP细胞株联用，相比于浓度为1670nM的顺铂的单独处理后的细胞增殖抑制，替加色罗0.5μM+DDP-1670nM组给药24h的细胞增殖抑制率为8.18％，替加色罗1μM+DDP-1670nM组给药24h的细胞增殖抑制率为15.41％，替加色罗2μM+DDP-1670nM组给药24h的细胞增殖抑制率为20.35％，替加色罗5μM+DDP-1670nM组给药24h的细胞增殖抑制率为14.85％。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明基于SPR、HPLC及MALDI-TOF-MS对替加色罗在DU145细胞中的靶标蛋白进行了捕获测试及数据分析，通过测试发现，替加色罗可有效捕获结合力Score＞200的蛋白靶基因，并从中可筛选得到与药物耐药逆转功能相关的蛋白质，证明了替加色罗具有潜在的药物耐药逆转活性。进一步，通过试验可证明，替加色罗可与人乳腺癌耐阿霉素MCF7/ADR细胞株、人卵巢瘤耐顺铂COC1/DDP细胞株联用，确实可有效提高细胞增殖抑制率，发挥良好的药物逆转功效，可有效运用于药物转运中。
附图说明
图1为本发明实施例提供的靶标捕获的过程图；
图2为本发明实施例提供的靶标蛋白鉴定的过程图；
图3为本发明实施例提供的流通DU145细胞裂解液、芯片表面点样区与空白区的信号峰图；其中，替加色罗点样区域信号曲线(上部)表示芯片上的化合物点样区的信号变化，背景噪声信号曲线(下部)表示未点样区域信号变化；
图4为评分Score＞200的蛋白靶基因Gene Ontology(GO)富集分析图；
图5为评分Score＞200的蛋白靶基因KEGG Pathway富集分析图；
图6为本发明实施例提供的阿霉素与替加色罗联合用药对人乳腺癌阿霉素耐药细胞的活性的影响；
图7为本发明实施例提供的顺铂与替加色罗联合用药对人卵巢瘤耐顺铂细胞的活性的影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1体外实验
本实施例中的体外实验测试是基于SPR、HPLC及MALDI-TOF-MS对替加色罗在DU145细胞中的靶标蛋白进行的捕获测试及数据分析(由智一高高通量信息技术公共实验平台提供)。
所使用的样品及关键设备信息见表1。
表1本实验的样品及所涉及仪器信息
所使用的关键参数信息详见表2。
表2实验过程涉及的参数信息表
本方法主要包括以下步骤：
将替加色罗通过高通量打印的方法固定在芯片表面，之后通过紫外光的照射引发光交联反应而固定于芯片表面(图1中1-2)；
表面等离子共振原理(Surface Plasmon Resonance,SPR)部分：细胞液裂解处理，释放蛋白，作为流动相流通过含打印有已知分子的芯片表面；光交联传感芯片制作；清洗备用；通过SPR设备监测已知分子捕获细胞裂解液中靶标蛋白的捕获过程(图1中3-4)；
在芯片表面进行蛋白质原位Trypsin酶解；高效液相色谱HPLC和质谱MALDI-TOF-MS联用(LC-MS)蛋白质鉴定；质谱分析；蛋白质鉴定；数据加权打分及功能注释，分析出被已知分子捕获到的蛋白靶标的种类和功能(图1中5-6)；
通过生物信息学算法对捕获到的蛋白进行功能、细胞亚定位和信号通路进行注释及分析(图2)。
具体方法如下：
1.第一部分实验(SPR部分)
1.1主要实验样品与仪器：
固定相样品：化合物-替加色罗(纯度>99％，MW＝417Da)；
流动相样品：DU145细胞株(取样时间2019-12-26)；
SensorChipTM3D光交联传感芯片(芯片编号PL-CS-2000162，BetterWays Inc.)；
细胞裂解液(细胞梯度成分裂解液BWLS-17，BetterWays Inc.)；
SPR生物芯片分析系统-1(bScreen LB 991,Berthold)；
SPR无标记互作分析仪-2(Reichert4SPR,Reichert Technologies)，备用；
SPR无标记互作分析仪-3(PlexArrayTMUT-v4,PLEXERA LLC)，备用；
芯片微阵列打印机(AD-1520,BioDot Corporation)；
紫外光交联仪(UV Spectroirradiator 1020,Amersham Life Science)；
Cocktail蛋白酶抑制剂(100x Halt Protease Inhibitor Cocktail,ThermoFisher)；
BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit,Thermo Fisher)；
其他常规实验室设备、耗材及试剂(CORNING、EPPENDORF、Bio-Rad、SIGMA等)。
1.2细胞液裂解处理
化合物替加色罗用量标定：使用DMSO溶解化合物配制10mM化合物溶液。为控制点样量的一致，采用BioDotTM-1520阵列打印机进行阵列打印，设置点间距280μm，点直径180μm，采用双针打印系统，芯片表面含有50×50点阵，预计点溶液量2.5nL，重复点样5次，芯片表面点样量为31.25μL(312.5nMol)。
细胞裂解用量标定：细胞裂解后，使用蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher BCAProtein Assay Kit)对其进行标定，测定浓度为：417.55μg/mL。使用裂解液1x原液对样品进行浓度调节，终浓度为200μg/mL。
将细胞样品从冰箱中取出，瞬时离心使样品集中在EP管底，加入120μLPBS和终浓度(v:v)1％的Cocktail蛋白酶抑制剂，充分震荡重悬，按照3：4的比例加入BWLS-17裂解液，按照《注射器喷射裂解法》SOP处理细胞样品，处理后的样品16000g，10min，4℃离心，分装放入-40℃冰箱暂存。测试前样品解冻样品，16000g，10min，4℃离心取上清进行浓度测定(Thermo Fisher BCA Protein Assay Kit)，使用裂解液1x原液对样品进行浓度调节，终浓度为200μg/mL，现用现配。
1.3光交联传感芯片制作
芯片性能标定：本实验所采用的NanoSensor生物芯片是由美国Lumera公司代工芯片基片，芯片表面Au层厚度为47.5nm±0.5nm。本公司进行光交联高分子层修饰处理，芯片结合量批间差＜0.5％；芯片用于测定时最佳共振角由Berthold b ScreenLB991生物芯片分析仪自动调校至最佳共振角。
取出1张光交联传感芯片，回温30min至室温。将替加色罗用DMSO配制成为10mM溶液。通过高通量阵列打印机将化合物溶液点样在3D光交联传感芯片上的指定区域。为控制点样量，采用BioDotTM-1520阵列打印机进行阵列打印，设置点间距280μm，点直径180μm，采用双针打印系统，芯片表面含有50×50点阵，预计点溶液量2.5nL，重复点样5次，芯片表面点样量为31.25μL(312.5nMol)。期间严格避光，N2环境，压力1.05ATMs。打印完毕芯片在芯片打印机内低温抽湿自然干燥。干燥完成后，将芯片转移到紫外光交联仪内进行光交联反应，波长365nm，N2环境压力1.20ATMs，辐照流程及参数：能量9000μW/cm，2min；暂停2min；能量9000μW/cm，2min；暂停2min；能量2500μW/cm，15min。
1.4清洗备用
光交联反应后，依次用DMF、无水乙醇和超纯水在摇床上摇洗15min。在洁净车间使用氮气吹干，将芯片贴上Cover，标记芯片备用，至此传感芯片制作完成，保存条件为-20℃。
1.5 SPR在线捕获
SPR测试过程中，流动相为DU145细胞裂解液，芯片表面固定相为替加色罗分子。使用SPR生物芯片分析仪实时监测芯片表面固定的分子与裂解液中靶标蛋白的结合情况(见图3)。
其中，时间轴区段操作为：
0s～260s：体系预洗涤，使芯片表面在缓冲液中浸润。此时共振强度约为0RU。
260s～520s：样品结合，芯片表面固定的分子捕获裂解液中的蛋白靶标。图2中该区域表明：裂解液中的蛋白开始结合到芯片表面；同时非点样区也会受范德华力、疏水作用力影响结合一定的蛋白，但非点样区的蛋白结合信号相对点样区信号有明显差别。
520s～820s：芯片洗涤，去除芯片表面的非特异性粘附的蛋白。图1中该区域表明：芯片表面经过洗涤后，可与芯片表面分子特异性结合蛋白靶标保留在了芯片表面，不可结合的分子及非特异性分子逐渐离开芯片表面，共振强度下降并达到平台期(～975.33RU)；非点样区的非特异性结合也逐渐被清洗，背景值的共振强度逐渐回落到基线水平(～45.17RU)，芯片背景噪声恢复正常。
将1.2步样品作为样品流通液，对1.4步制作的芯片进行测试。详细步骤如下：
1)在SPR生物芯片分析系统上安装好芯片后，调整测试基线，对芯片表面进行3次重生，流通重生液为Gly·HCl(pH2.0)，流速(Rate):3μL/s，时长(Duration)：300s，载体缓冲液(Buffer):1×PBST(0.05％Tween-20)；
2)用100μg/mL BSA对芯片表面进行封闭处理，流速(Rate):3μL/s，时长(Duration):300s,载体缓冲液(Buffer):1×PBS(pH7.4)；
3)对芯片表面进行重生Regen*1次重生液为Gly·HCl(pH 2.0)，流速(Rate):3μL/s，时长(Duration):300s；完成本步骤后归零时间线、归零信号基线。(收集共振强度数据从下一步开始)
4)系统平衡：流通1×PBS(pH7.4)缓冲液平衡系统，流速(Rate):2μL/s，时长(Duration):260s,载体缓冲液(Buffer):1×PBS(pH7.4)；
5)捕获开始：将3.2中的样品通入芯片，流速(Rate):2μL/s，时长(Duration):260s,载体缓冲液(Buffer):1×PBS(pH7.4)；
6)芯片清洗：芯片进样完毕，进行清洗步骤，借助芯片表面仿生纤毛，去除非特异性吸附；流速(Rate):2μL/s，时长(Duration):260s,载体缓冲液(Buffer):1×PBS(pH7.4)。
7)通过以上方法进行所有芯片的测试。测试后的芯片直接进行原位酶解或放于-4℃非凝结环境储存，并在24小时内完成酶解。
2.第二部分实验(LC-MS部分)
2.1主要实验样品与仪器
两维纳升级液相色谱质谱(NanoAcquity UPLC,Waters Corporation)
肽段捕集柱(100μm×2.0cm Acclaim PepMap C18,Thermo Fisher)
肽段分析柱(15cm×75μm Acclaim PepMap C18,Thermo Fisher)
液相色谱流动相A：5％ACN，0.1％甲酸水溶液，pH＝2.5(色谱纯甲酸调节)；
液相色谱流动相B：90％ACN，0.1％甲酸水溶液，pH＝2.5(色谱纯甲酸调节)。
质谱系统(ABSCIEXTOF/TOF质谱系统,ABSciexPte.Ltd)
冻干机(Vacuum concentrator plus,Eppendorf Corporation)
胰蛋白酶Trypsin(测序级，Promega)
其他常规实验室设备、耗材及试剂(Corning、Eppendorf、Bio-Rad、SIGMA等)
实验过程中在十万级正压洁净室条件下进行防止污染。
2.2芯片蛋白质原位Trypsin酶解
蛋白芯片进行FASP酶切：
1)向芯片加入终浓度为10mMDTT溶液，56℃反应1h；
2)还原后，加入终浓度为55mMIAM(碘乙酰胺)溶液，室温避光45min；
3)吸取芯片中的磷酸缓冲液；
4)加入30μL 0.25MTEAB(四乙基溴化铵)置换清洗重洗2～3次；
5)加入30μL 0.5MTEAB(四乙基溴化铵)，加入胰酶(胰酶储存于50mM乙酸中，储存浓度为1μg/μL)，按胰酶：底物蛋白＝1:20的量，加入胰酶，混匀，37℃孵育过夜后，胰酶：底物蛋白＝1:20补加酶液，37℃孵育4h；
6)取出消化好的肽段液至1.5mL收集管，再加入30μL0.5M TEAB碘乙酰胺，并和之前的滤液合并，真空抽干。
2.3LC-MS蛋白质鉴定
1)肽段使用10μl流动相A溶解，溶解后上样8μl。
2)上样流速为10μl/min，上样3分钟，肽段直接被捕集柱捕集，同时经过捕集柱的盐溶液直接排入废液。
3)经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段。
4)60分钟内从2％B升至45％B，反相过程共60分钟，流速为300nL/min，色谱柱温度为40℃。
2.4质谱分析
离子源喷雾电压为2.0kV，质谱仪加热毛细管设定为250℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集。全扫描MS使用Orbitrap进行扫描，扫描时间为90min，扫描范围为m/z350-1600，分辨率设定为70,000(m/z200处)。使用四级杆筛选母离子，随后使用高能碰撞解离(High erenergy C-trap dissociation,HCD)对符合串级(MS/MS)碎裂条件的母离子进行碎裂并用orbitrap扫描，扫描分辨率设定为17500，扫描范围根据母离子质荷比自动控制。对强度排名前15的离子进行MS/MS扫描。母离子选择窗口设定为2Da。对于单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子1次MS/MS后排除30秒。MS/MS使用高纯氮气，27％的碰撞能量。MS数据通过Xcalibur Software(ThermoScientific，version2.4.5)采集。
2.5蛋白质鉴定：
MS数据使用Proteome Discoverer(Thermo Fisher Scientific,version 1.7)分析软件进行Mascot算法检索，检索数据库为UniProtKB/Swiss-Prot蛋白数据库，为了减少假阳性结果，在该数据库中增加一个含有所有蛋白反转序列的诱饵数据库(decoydatabase)。
检索物种为：Homo Sapiens(Human)
数据库版本：2020_03_01
数据库容量(蛋白记录数)：20,366reviewed protein records.
搜索参数设置如下：胰蛋白酶(Trypsin)，全酶切方式，最大漏切为2。可变修饰为肽段的甲硫氨酸(M)氧化和脱酰胺化(NQ)。单一同位素模式，肽段质量误差10ppm，碎片离子质量误差0.05Da。肽段结果使用Percolator算法控制肽段假阳性率(FDR)低于1％。本步骤可鉴定出与目标蛋白相互作用的蛋白。
2.6数据加权打分及功能注释：
基于质谱分析、蛋白鉴定以及结合力强弱、丰度等因素的Capture Score打分等步骤，共筛选得到得分(Score)＞200的蛋白包括：MDM2、ABCC2、TRPC4、SLC6A3、HTR2B、ABCB11、BRCA1、NFE2L2、POLK、ABCC3、ABHD4、HTR1D、FEN1、KCNJ2、ABCG2、CYP1A2、ERG、USP2、GMNN、FOSB、KCNH2、SMAD3、HTR2C、HTR7、HTR2A、SLCO1B1、KCNQ1、CYP2C8、SLC6A4、NPFFR2、NPFFR1、KCNQ2、ABCC4、TARDBP、KCNK9、SNCA、APAF1、SLCO1B3、PMP22、KDM4A、RBBP8、H4C1、SMPD1、GLP1R和RACGAP1。
通过自编算法(version 5.1)结合GO、KEGG公共数据库对捕获到的靶标进行生物学功能、信号通路和细胞亚结构定位的注释。Gene Ontology(GO)数据库旨在开发一个计算方法来描述基因在分子、细胞和组织水平的功能体现，GO分为分子功能(MolecularFunction,MF)、生物过程(Biological Process,BP)和细胞组分(Cellular Component,CC)三大功能类。GO三大功能类汇总后评分Score＞200的蛋白靶基因Gene Ontology(GO)富集分析功能有(如图4所示)：
血清素结合(serotonin binding)；药物跨膜转运(drug transmembranetransport)；DNA双链断裂修复(DNA double-strand break processing)；药物代谢过程(drug metabolic process)；细胞对药物的反应(cellular response to drug)；受损的DNA结合(damaged DNA binding)；G蛋白偶联受体活性(Gprotein-coupled peptidereceptor activity)；cAMP介导的信号转导(cAMP-mediated signaling)；血管直径维持(blood vessel diameter maintenance)；对药物的反应(response to drug)；钾通道活性(potassium channel activity)；循环系统中的血管生成(vascular process incirculatory system)；细胞通路中定位的维持(maintenance of location in cell)；缺氧反应(response to hypoxia)；分泌调节(regulation of secretion)；内源性凋亡信号通路(intrinsic apoptotic signaling pathway)；钙离子转运(calcium iontransport)；细胞周期的正调控(positive regulation of cell cycle)；脂质生物合成过程(lipid biosynthetic process)；炎症反应(inflammatory response)。
将捕获到的靶标蛋白注释到KEGG信号通路数据库，经过聚类分析，得到靶标蛋白在不同信号通路间的聚类分布列表，如图5所示，评分Score＞200的蛋白靶基因KEGGPathway富集功能分析有ABC转运体(ABC transporters)；亚油酸代谢(Linoleic acidmetabolism)；胆汁分泌(Bile secretion)；5-羟色胺能突触(Serotonergic synapse)；p53信号通路(p53 signaling pathway)；铂耐药(Platinum drug resistance)；癌症的中枢碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)；钙信号通路(Calcium signalingpathway)；cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)；癌症中的转录失调(Transcriptional misregulation in cancer)；Th17细胞分化(Th17 celldifferentiation)；胆碱能突触(Cholinergic synapse)；癌症相关的信号通路(Pathwaysin cancer)。
其中，得分(Score)＞200且与药物逆转相关的蛋白有：MDM2、ABCC2、SLC6A3、HTR2B、ABCB11、BRCA1、NFE2L2、ABCC3、HTR1D、KCNJ2、ABCG2、CYP1A2、FOSB、KCNH2、HTR2C、HTR2A、KCNQ1、CYP2C8、SLC6A4、KCNQ2、ABCC4、TARDBP、KCNK9、APAF1、PMP22、SMPD1和GLP1R。
并且，上述蛋白的药物转运功能主要表现为ABC转运体(ABC transporters)、铂类药物耐药(Platinum drug resistance)；药物跨膜转运(Drug transmembranetransport)、药物代谢过程(Drug metabolic process)、细胞对药物的反应(Cellularresponse to drug)、药物反应(Response to drug)、钾通道活性(Potassium channelactivity)、药物逆转功能(Drug transport function)、药物代谢(Drug metabolism)药物逆转(Drug transport)(详细见表3的结果)。
表3替加色罗结合力Score＞200且与药物逆转相关的蛋白靶基因的功能分析
结合上述内容可知，本实施例基于SPR、HPLC及MALDI-TOF-MS对替加色罗在DU145细胞中的靶标蛋白进行了捕获测试，并结合质谱分析、蛋白鉴定以及结合力强弱、丰度等因素的Capture Score打分等步骤，共筛选得到得分(Score)＞200的蛋白45个，其中27个蛋白表现出了较强的药物转运功能，基于此可知，替加色罗在药物转运方面具有潜在的优势。
实施例2使用人乳腺癌阿霉素耐药细胞株检测替加色罗在逆转耐药或药物联合中的作用
1)耐药细胞株的培养(采用浓度梯度递增法处理细胞)：
将MCF7/ADR细胞用含100ng/mL阿霉素的RPMI-1640培养液培养，待细胞长满后进行细胞传代，并再用含250ng/mL阿霉素的RPMI-1640培养液培养，待细胞长满后再次进行细胞传代培养。
2)接种细胞：
取对数生长期的MCF7/ADR细胞，吸弃旧培养液，加入适量PBS清洗一次，吸弃PBS，加入1mL胰酶，晃匀后吸弃胰酶，于培养箱中消化5min后，加入4mLDMEM高糖培养液吹打混匀，用1.5mL离心管取80μLPBS和20μL细胞悬液，混匀后用计数板在显微镜下进行计数，计算细胞浓度。根据细胞浓度计算所需细胞悬液和培养液的体积，向2块96孔板中加入90μL稀释后的细胞悬液，使每孔中细胞数为8000个，于培养箱中培养。
3)加药：
铺板24h后，每孔各加10μL用2μM和5μM的替加色罗(替加色罗)、1μM的阿霉素和2μM的替加色罗(替加色罗)+1μM的阿霉素以及5μM的替加色罗(替加色罗)+1μM的阿霉素DMEM高糖培养液稀释的不同浓度的药物溶液处理细胞，以加等量DMSO作为对照。
4)刃天青检测：
加药一定时间后向96孔板每孔中各加入10μL刃天青溶液，培养箱中孵育4h，测荧光值(两个波长分别为549nm、595nm)，根据荧光值计算细胞增殖抑制率。数值以means±SEM形式给出。使用GraphPad Prism 7Demo software软件分析和计算，采用t-tests的方法进行差异比较。P<0.05或更低水平的数据定为具有显著性差异。
为了比较替加色罗的耐药逆转活性与本身的细胞毒性的大小，我们设置替加色罗单药组，选用阿霉素的浓度为1μM，联用2μM及5μM的替加色罗处理细胞，于24h刃天青染色法检测细胞增殖抑制率，结果如图6所示，相比于加DMSO组的细胞存活，与替加色罗(2μM(抑制率12.5％)和5μM(抑制率68.0％))和阿霉素(1μM(抑制率24.83％))单独使用相比，替加色罗和阿霉素联合使用后，可以显著提高细胞增殖抑制率(替加色罗(2μM)+阿霉素(1μM)联用后抑制率在49.53％；替加色罗(5μM)+阿霉素(1μM)联用后抑制率在86.86％)，确定了替加色罗的耐药逆转活性。
实施例3使用人卵巢瘤耐顺铂细胞株检测替加色罗在逆转耐药或药物联合中的作用
1)耐药细胞株的培养(采用浓度梯度递增法处理细胞)：
将COC1/DDP细胞用含150ng/mL顺铂的RPMI-1640培养液培养，待细胞长满后进行细胞传代，并用含300ng/mL顺铂的RPMI-1640培养液培养，待细胞长满后再次进行细胞传代，并用含500ng/mL顺铂的RPMI-1640培养液培养。
2)接种细胞：
取对数生长期的COC1/DDP细胞，将细胞转移至15mL离心管中，1000rpm，5min进行离心，倒掉旧培养液，加入4mLRPMI-1640培养液吹打混匀，用1.5mL离心管取80μLPBS和20μL细胞悬液，混匀后用计数板显微镜下进行计数，计算细胞浓度。根据细胞浓度计算所需细胞悬液和培养液的体积，向3块96孔板中加入90μL稀释后的细胞悬液，使每孔中细胞数为8000个。于培养箱中培养24h。
3)加药：
铺板24h后，每孔各加10μL分别用0.5μM、1μM、2μM和5μM的替加色罗(替加色罗)+1670nM的顺铂分别处理细胞，以及1670nM的顺铂单独用RPMI-1640培养液稀释的不同浓度的药物溶液处理细胞，以加等量DMSO作为对照。
4)刃天青检测：
加药一定时间后向96孔板每孔中各加入10μL刃天青溶液，培养箱中孵育4h，测荧光值(两个波长分别为549nm、595nm)，根据荧光值计算细胞增殖抑制率。数值以means±SEM形式给出。使用GraphPadPrism7Demosoftware软件分析和计算，采用t-tests的方法进行差异比较。P<0.05或更低水平的数据定为具有显著性差异。
为了进一步确定替加色罗对耐药细胞株的耐药逆转活性，我们选择顺铂耐药的COC1/DDP细胞进行实验，COC1/DDP耐药顺铂的浓度剂量为1670nM，用1670nM的顺铂联合不同浓度的替加色罗处理COC1/DDP细胞，于24h刃天青染色法检测细胞增殖抑制率，结果如图7所示。与单独加DDP-1670nM组相比，联合不同浓度的替加色罗均可显著提高细胞增殖抑制率，其中替加色罗0.5μM+DDP-1670nM组给药24h的抑制率为8.18％，1μM+DDP-1670nM组给药24h的抑制率为15.41％，2μM+DDP-1670nM组给药24h的抑制率为20.35％，5μM+DDP-1670nM组给药24h的抑制率为14.85％，这表明替加色罗可以逆转COC1/DDP细胞对顺铂的耐药活性。

Claims (7)

1.替加色罗或其药学上可接受的盐在制备药物转运的药物中的应用，其特征在于，替加色罗或其药学上可接受的盐通过影响得分Score＞200的且与药物转运相关的蛋白的药物转运功能逆转癌症对化疗药物的耐药性；
所述化疗药物为顺铂或阿霉素，所述癌症为人卵巢瘤或人乳腺癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，基于SPR、HPLC及MALDI-TOF-MS对替加色罗在DU145细胞中的靶标蛋白进行捕获、筛选。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，捕获、筛选具体方法为：
将替加色罗配制液通过高通量阵列打印的方法点样在3D 光交联传感芯片上的指定区域，随后通过紫外光的照射引发光交联反应而固定于芯片表面；
以DU145细胞裂解液为流动相，以芯片表面的替加色罗分子为固定相，
使用 SPR生物芯片监测设备实时监测芯片表面固定的分子与细胞裂解液中靶标蛋白质的结合情况，直至芯片背景噪声恢复正常；
对芯片表面固定的分子所捕获的蛋白质进行原位Trypsin酶解，基于LC-MS联用对上述蛋白质进行鉴定，并通过数据加权打分及功能注释分析得到被捕获的蛋白质的种类和功能。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，替加色罗配制液为用DMSO 配制成的10mM溶液；DU145细胞裂解液经配制后的终浓度为200μg/mL。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所筛选得到的得分Score＞200的且与药物转运相关的蛋白包括MDM2、ABCC2、SLC6A3、HTR2B、ABCB11、BRCA1、NFE2L2、ABCC3、HTR1D、KCNJ2、ABCG2、CYP1A2、FOSB、KCNH2、HTR2C、HTR2A、KCNQ1、CYP2C8、SLC6A4、KCNQ2、ABCC4、TARDBP、KCNK9、APAF1、PMP22、SMPD1和GLP1R。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，替加色罗与人乳腺癌耐阿霉素MCF7/ADR细胞株联用，相比于2 μM替加色罗、5 μM替加色罗和1 μM阿霉素单独使用的细胞增殖抑制率为12.5%、68.0%和24.83%，替加色罗2 µM+阿霉素1 µM联用后的细胞增殖抑制率为49.53%，替加色罗5 µM+阿霉素1 µM联用后的细胞增殖抑制率为86.86%。
7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，替加色罗与人卵巢瘤耐顺铂COC1/DDP细胞株联用，相比于浓度为1670 nM的顺铂的单独处理后的细胞增殖抑制，替加色罗0.5 μM+DDP-1670 nM组给药24 h的细胞增殖抑制率为8.18%，替加色罗1 μM+DDP-1670nM组给药24 h的细胞增殖抑制率为15.41%，替加色罗2 μM+DDP-1670 nM组给药24 h的细胞增殖抑制率为20.35%，替加色罗5 μM+DDP-1670 nM组给药24 h的细胞增殖抑制率为14.85%。
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