CN101132791A

CN101132791A - 用于鉴定替加色罗在慢性便秘患者中的功效的生物标记

Info

Publication number: CN101132791A
Application number: CNA2006800050199A
Authority: CN
Inventors: L·麦克莱恩
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2005-01-04
Filing date: 2006-01-03
Publication date: 2008-02-27
Also published as: WO2006074127A3; WO2006074127A2; EP1835909A2; AU2006204146A1; BRPI0606369A2; CA2593695A1; IL184029A0; JP2008526775A; KR20070111475A; MX2007008159A; US20090118350A1; RU2007129672A

Abstract

用药物遗传学评估所选候选基因中多态性对慢性便秘患者对替加色罗(Zelmac/Zelnorm)的应答的影响。分析鉴定了6种基因(HTR4、HTR3B、MLN、AQP3、SLC12A2、SCNN1A)中的12种单核苷酸多态性(SNP)，所述多态性与4周的治疗后对替加色罗的至少60％的应答率和5或者更大的优势率(与安慰剂比较)有关。所鉴定的基因显示出宽范围的不同功能，包括5－羟色胺信号传递、分泌和运动性，所有都在保持胃肠道的正常功能中是重要的。从而这些数据暗示慢性便秘可能由与上面鉴定的基因中变体有关的多种病理生理机制引起，所述基因所有都对替加色罗的治疗良好应答。没有这些变体的患者对于治疗的应答不显著大于对安慰剂的应答，其可以表明他们的慢性便秘不是由于病理生理机制而是由于环境或者可能由于心理因素引起。具有这些变体的患者也较不可能应答安慰剂，再次暗示这些变体与真实的病理生理有关。

Description

用于鉴定替加色罗在慢性便秘患者中的功效的生物标记

发明领域

本发明一般涉及体外组织样品的分析测试，更具体地，涉及鉴定更可能应答替加色罗治疗的慢性便秘个体的遗传多态性的方面。

发明背景

慢性便秘的患病非常普遍，多数估计为占其他方面健康群体的10-20％Higgins & Johanson，Am.J.Gastroenterol.99：750-9(2004)；Talley et al.，Am.J.Gastroenterol.98：1107-11(2003)。仅在美国，就有250万就诊是由于便秘。Sonnenburg & Koch，Dig.Disc.Sci. 34：606-11(1989)。有许多亚类的慢性便秘，包括慢通过性便秘、骨盆底功能异常、功能性便秘和便秘型肠易激综合征(C-IBS)。Prather，Rev.Gastroenterol.Disorders，4：S11-16(2004)。尽管症状可以取决于亚型而不同，但是通常它们包括稀少的排粪(＜3次/周)，伴随着持续的下坠症状、粪便硬或者块状，和感觉不完全的排粪。Thompson等人，Gut45(suppl II)：43-7(1999)。

替加色罗(Zelnorm_/Zelmac_；HTF919)在2002年7月被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于便秘型肠易激综合征(C-IBS)的短期缓解并且在2004年8月被批准用于慢性便秘。替加色罗是氨基胍吲哚化合物，其作为5-羟色胺(5-HT₄)受体(HTR4)的激动剂并且已经在几种动物模型中阐明作为整个胃肠(GI)道的促进(promotile)药物。Pfannkuche HJ等人，Neurogastroenterol.Motil.7：280(1995)；Grider JR等人，Gastroenterology；115：370-80(1998)。已经证明替加色罗显著增加健康志愿者(Degen L等人，Aliment Pharmacol.Ther.15(11)：1745-51(2001))、IBS-C患者(Prather CM等人，Gastroenterology；118(3)：463-8(2000))和慢性便秘患者(Johanson等人，Clin.Gastroenterol. Hepatol. 2：796-805(2004))中的结肠通过时间。除了它对肠能动性的作用外，还有证据表明5-HT₄受体激动剂在动物模型中对分泌(Kellum JM等人，Am.J.Physiol. 277：G515-G520(1999))以及内脏感觉(Schikowski A等人，Neurogastroenterol.Motil.14：221-227(2002)；Coelho AM等人，Gastroenterol.118(4，suppl.2)：A835；Yu S等人，Neurogastroenterol.Motil.13：445(2001))具有作用。

然而，并不是所有患者对替加色罗的应答比对安慰剂的应答更显著。最近对北美和南美洲的慢性便秘患者的研究表明对替加色罗的应答率为43％，相比对安慰剂的应答率为25％。Johanson等人，Clin.Gastroenterol.Hepatol.2：796-805(2004)。当前还不理解为什么一些患者不应答。因此，本领域中需要对替加色罗工作机理的额外了解。此外，对慢性便秘或者其他胃肠疾病中鉴定的基因的重要性的更深入的理解可以导致开发在治疗胃肠疾病中更有效的新疗法。

发明概述

本发明符合这些需求。本发明有用地对替加色罗怎样发挥作用提供了更深的理解并且提供了用于治疗慢性便秘的更有效的疗法。一方面，本发明表明在一些患者中，慢性便秘是诊断上可鉴别的疾病。慢性便秘可以由多种病理机理引起，这些机理与一些基因(HTR4、HTR3B、AQP3、MLN、SLC12A2、SCNN1A、TPH)中的变体有关-所有这些基因都良好地应答替加色罗的治疗。有趣的是，具有本发明的生物标记基因中诊断可鉴定的变体的患者较不可能应答安慰剂，再次暗示这些变体与真实的病理生理有关。在另一方面，本发明表明没有这些生物标记变体的一些患者对治疗的应答不显著强于它们对安慰剂的应答，这可以表明他们的慢性便秘不是由于生理学机理，而是可能由于环境或者可能由于心理因素引起。

在一个实施方案中，本发明提供了替加色罗用于生产治疗所选患者群体中慢性便秘的药物的用途，其中该患者群体基于替加色罗对患者的一种或多种生物标记的功效选择。这些生物标记是6种鉴定的基因中的单核苷酸多态性(SNP)，这6种基因为：5-HT₄受体的基因(HTR4；SEQ IDNOS：1-6)；5-HT₃受体亚基B的基因(HTR3B；SEQ ID NO：7)；促胃动素的基因(MLN；SEQ ID NO：8)；水通道蛋白3水通道的基因(AQP3；SEQ IDNO：9)；溶质载体家族12成员A2、也称作钠/钾/氯离子协同转运蛋白1(NKCC1)的基因(SLC12A2；SEQ ID NOS：10-11)；和非电压门控钠通道α亚基、也称作阿米洛利敏感的上皮钠通道α亚基(ENaCα)的基因(SCNN1A；SEQ ID NO：12)。在这6种基因中共鉴定了12种与对替加色罗的更高应答率有关的SNP。鉴定了具有包括指示替加色罗功效的这12种SNP的一种或多种的图谱的患者，如在所选的“高应答者”患者群体中包括。

在不同的实施方案中，本发明提供了替加色罗用于生产治疗另一所选的患者群体中慢性便秘的药物的用途，其中该患者群体基于替加色罗对患者功效的其他生物标记进行选择。在该实施方案中，标记是上面段落中鉴定的6种基因中的多态性，加上色氨酸羟化酶1的基因(TPH1；SEQ IDNOS：13-14)中的两种多态性。在该实施方案中，鉴定了具有指示替加色罗功效的这些SNP的一种或多种的图谱的患者，如包括在所选的“高应答者”患者群体中。

在另一实施方案中，本发明提供了基于个体的生物标记基因中SNP谱，鉴定具有比对安慰剂治疗更可能应答替加色罗治疗的慢性便秘的个体的方法。在一个实施方案中，个体是脊椎动物。在具体实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。在更具体的实施方案中，哺乳动物是灵长类，如猕猴或者人。

本发明还提供了治疗受试者中慢性便秘的方法。该方法包括首先得到本发明的生物标记基因中受试者的SNP谱。当确定本发明的生物标记基因中受试者的SNP谱将预测替加色罗的治疗功效时，对该受试者施用替加色罗以治疗该受试者的慢性便秘。如本文使用的，对受试者或患者施用活性剂或者药物包括自己施用和由另一人施用。含有治疗剂和诊断剂方法的这种方法由本领域中许多技术人员称作“治疗诊断学”。

本发明还提供了基于将治疗的受试者中表达的生物标记的分析，确定用于包括在替加色罗对胃肠道病症的治疗的临床试验中的受试者。胃肠道病症可以包括慢性便秘、便秘型肠易激综合征、功能性消化不良、胃食管反流病和糖尿病性胃病。当受试者的生物标记SNP谱由于与已知的生物标记SNP谱的比较，提示该受试者对合适的替加色罗治疗方案易感时，该受试者可以包括在临床试验中。相反地，当受试者的SNP谱与指示替加色罗的治疗功效谱不相似时，可以从临床试验排除该受试者。本领域技术人员可以观察这种相似性或者不相似。

本发明还提供了用于确定替加色罗施用适应的疾病功效的临床测定法、试剂盒和试剂。在一个实施方案中，该试剂盒含有用于通过杂交确定生物标记基因的SNP谱的试剂。在另一实施方案中，试剂盒含有通过聚合酶链式反应确定生物标记基因的SNP谱的试剂。

附图简述

图1是条形图，显示了治疗4周后，作为“高应答者”基因型的存在的函数的应答率。应答＝一次或多次完全自发肠运动(CSBMs)/周相对于基线的平均增加；进行至少7天治疗的意向性治疗(ITT)白种人；12种SNP包括最初的12种“高应答者”SNP；14种SNP包括加入两种TPH1 SNP；(％)指示每类中基因分型的群体的百分比。

图2是一组误差线，显示了治疗4周后，作为“高应答者”基因型的存在的函数的优势率；12种SNP包括最初的12种“高应答者”SNP；14种SNP包括加入两种TPH1 SNP；方框代表优势率，线代表95％置信区间。

图3是跨越HTR4基因组区的基因分型的SNP的位置和确定连锁不平衡的制图。上面的小图显示最初选择12种SNP来跨越HTR4基因的基因组区的大部分。方框指出与对替加色罗具有高于平均值的应答有关的那些SNP。突出显示了两个SNP测定(SNP-3802和SNP-3803)，其不产生高质量的基因型，从而不用于评价应答。下方的小图显示了HTR4的10个好基因组测定之间的连锁不平衡(LD)。左下象限指出SNP之间连锁不平衡的程度(更高的值指示强LD)，右上象限指示SNP之间的相对距离(碱基对)。注意到显示对替加色罗的更高应答的六种SNP(SNPs 1746、3754、3753、3743、3756和3747)显示了相互之间高度的连锁不平衡(＞0.6)，尤其这些SNP的前4种(1746、3754、3753和3743)之间高度的连锁不平衡，LD＞0.8。

图4显示了5-HT4受体的结构，显示了通过连线指示的不同5-HT4受体外显子中可变剪接可能性的图示。方框代表外显子，而内含子以粗线显示。外显子4和5之间的虚线代表将在mRNA中包括外显子h的剪接，而阴影线后的剪接事件省略了外显子h。通过为每种剪接变体使用不同格式的线描绘外显子5下游具有C-末端外显子的不同组合。基于外显子g内的两个可变剪接受体位点产生C-末端变体e和f。

优选实施方案详细描述

用药物遗传学评估所选候选基因中多态性对慢性便秘患者对替加色罗(Zelmac_/Zelnorm_；HTF919)的应答的影响。为参加临床试验的患者评估与药物靶标(5-HT₄受体，HTR4)、5-羟色胺途径、溶质转运和肠运动性有关的23种基因中共55个单核苷酸多态性(SNP)。分析局限于仅意向性治疗(ITT)群体中的白种人，他们完成了高剂量替加色罗(6mg，每次两次)或安慰剂的至少7天的治疗。分析结果鉴定了6种基因[HTR4(5-HT₄受体的基因；SEQ ID NOS.1-6；见下面的序列表)、HTR3B(5-HT₃受体，亚基B的基因；SEQ ID NO.7)、MLN(促胃动素的基因；SEQ ID NO：8)、AQP3(水通道蛋白3水通道的基因；SEQ ID NO：91)、SLC12A2(溶质载体家族12成员A2；钠/钾/氯离子协同转运蛋白1；NKCC1的基因；SEQ IDNOS：10-11)、SCNN1A(非电压门控钠通道α亚基ENaCα的基因；SEQ IDNO：12)]中的12种SNP，表明4周治疗后，对替加色罗的至少60％的应答率和5或者更大的(与安慰剂相比)优势率。相比，对替加色罗和安慰剂的平均总体应答率分别为46％和25％，优势率为2.6。使用这12种“高应答者”SNP作为实施方案，我们发现12种SNP(约群体的50％)的至少一种与安慰剂相比对替加色罗具有显著更高应答(62％vs.23％，优势率＝5.4)的个体。相比，没有这12种SNP的那些患者不显示出与安慰剂相比对替加色罗的显著差异(31％vs.27％，优势率＝1.3)。

另一种14种SNP的实施方案包括TPH1(色氨酸羟化酶1；SEQ IDNOS：13-14；见下面的序列表)中额外的两种SNP，表明不具有这14种SNP的任一种的32％的群体对替加色罗与对安慰剂相比没有显著不同的应答(32％vs.30％应答，优势率＝1.1)。具有这14种SNP的任一种的68％的群体显示出与安慰剂相比对替加色罗的显著更高的应答(53％vs.22％，优势率＝4.1)，尽管程度上小于使用14种SNP实施方案所看到的。

基于这些发现，慢性便秘由与上述鉴定的基因中的变体有关的病理生理机制引起，这些基因都良好的地应答替加色罗的治疗。没有这些变体的患者对治疗的应答不比对安慰剂的应答更显著，这可以表明他们的慢性便秘不是由于病理生理机制，而是由于环境的或者可能地心理因素。有趣的是，具有这些变体的患者对于安慰剂应答的可能性也较小，再次暗示这些变体与真实病理生理有关。

本文鉴定的多态性还可以与其他胃肠道病症有关，胃肠道病症为如便秘型IBS、功能性消化不良、胃食管反流病和糖尿病性胃病。

定义.本文使用的“医学状况”包括但不限于表现为治疗所针对的一种或多种生理和/或心理症状的任一种状况或者疾病，并且包括以前和新近鉴定的疾病和其他病症。

术语“临床应答”指下面的任一种或者全部：应答、无应答和不利应答(即副作用)的定量测量。

为了推导对治疗的临床应答和基因型或者单元型之间的相关性，对接受治疗的个体群体(下文中称作“临床群体”)显示出的临床应答得到基因型或者单元型数据。通过分析已经进行的临床试验的结果和/或通过设计并进行一种或多种新的临床试验，可以得到该临床数据。

术语“临床试验”指设计用来对特定治疗的应答收集临床数据的任一种研究，并且包括但不限于I期、II期和III期临床试验。用标准方法定义患者群体和登记受试者。

优选包括在临床群体中的个体根据目的医学状况的存在分级。该潜在患者的分级可以使用标准的体检或者一种或多种实验室试验。备选地，患者的分级可以使用对这样的情况单元型分型：其中在单元型对和疾病易感性或者严重性之间存在强烈的相关性。

对试验群体中的每个个体施用目的治疗性治疗，并使用一种或多种预定的标准测量每名个体对治疗的应答。预期在许多情况下，试验群体将显示出一系列应答，并且研究人员将选择由多种应答组成的应答者组(即，低、中、高)的数目。此外，确定试验群体中每个个体的基因的基因型和/或单元型，其可以在施用治疗之前或之后进行。

如本文所用的“SNP核酸”是核酸序列，其包含在个体或者个体组之间其他方面相同的核苷酸序列内可变的核苷酸，从而，作为等位基因存在。这种SNP核酸优选长为约15到约500个核苷酸。SNP核酸可以是染色体的部分，或者它们可以是染色体部分的精确拷贝，如通过PCR或者通过克隆扩增染色体的这一部分。SNP核酸优选在下文中简写为“SNP”。根据本发明的SNP探针是与SNP核酸互补的寡核苷酸。

术语“互补的”指在寡核苷酸的整个长度上在字码的Watson和Crick意义上互补。

本文使用的术语“多态性”将指在群体中以＞1％的频率存在的任一序列变体。序列变体可以以显著大于1％，如5％或者10％或者以上的频率存在。而且，该术语可以用于指在个体中多态性位点上观察到的序列变异。多态性包括核苷酸替代、插入、缺失和微卫星，并且可以但不必须导致基因表达或者蛋白质功能中的可检测的差异。

术语“基因型”将指在个体中一对同源染色体上基因座中一个或多个多态性位点上发现的核苷酸对的未定相(unphased)的5’到3’序列。如本文所用的，基因型包括完整基因型和/或亚基因型。

术语“多核苷酸”将指任何RNA或者DNA，其可以是未修饰的或者修饰的RNA或者DNA。多核苷酸包括，但不限于，单链和双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区混合的RNA、和包含DNA和RNA的杂种分子，其可以是单链的或者更典型地，为双链的，或者单链和双链区的混合物。此外，多核苷酸指包含RNA或者DNA或者RNA和DNA的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或者RNA和具有为了稳定性或者其他原因修饰的主链的DNA或者RNA。

本文使用的术语“基因”将指DNA区段，其含有RNA产物的受调节的合成的所有信息，包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其他非翻译区。

本文使用的术语“基因座”将指染色体或者DNA分子上对应于基因或者生理或者表型特征的位置。

本文使用的术语“多肽”将指任何多肽，其包含通过肽键或者修饰的肽键相互连接的两个或多个氨基酸，即，肽等构物。多肽指短链(通常称作肽、糖肽或者寡肽)和较长链(通常称作蛋白质)。多肽可以含有20种基因编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽包括通过自然过程如翻译后加工或者通过本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰在基础教科书中详细描述，并且在专著以及多卷的研究文献中更详细描述。

术语“多态性位点”将指基因组上的一个位置，发现在群体中在该位置上存在至少两个备选序列，最频繁的一个序列具有不超过99％的频率。

术语“定相的”指当应用于基因座中两个或多个多态性位点的核苷酸对的序列时，基因座的单个拷贝上那些多态性位点上存在的核苷酸的组合是已知的。

单核苷酸多态性.在人基因组中的序列变异主要由单核苷酸多态性(SNP)组成，剩余的是短串联重复(包括微卫星)、长串联重复(小卫星)、和其他插入和缺失。SNP是在基因组中单个位置上发生核苷酸变异性，其中两种备选的碱基在人类群体中以可见的频率(即＞1％)发生。SNP可以在基因内或者基因组的基因间区域内发生。

说SNP是“等位基因的”是因为由于存在多态性，一个物种的一些成员可以具有未突变的序列(即，最初的等位基因)，而其他成员可以具有突变的序列(即，变体或者突变等位基因)。在最简单的情况中，可以存在仅一种突变序列，并且说多态性是二等位基因的。备选突变的发生可以产生三等位基因多态性，等等。SNP在基因组中是广泛的，并且改变基因功能的SNP可以是对表型变异的直接贡献者。由于它们的普遍和广泛性质，SNP可以是定位涉及人类疾病状况的基因的重要工具。见例如，Wang等人，Science 280：1077-1082(1998)，其公开了先导研究，其中在DNA的2.3兆碱基区内对2,227个SNP作图。

单核苷酸多态性和具体表型之间的关联不一定表明或者需要该SNP是该表型的原因。相反，该关联可以仅仅是由于SNP和实际负责给定表型的那些遗传因子之间的基因组接近，使得该SNP和所述遗传因子通常一起观察到。从而，SNP可以与“真实的”功能变体连锁不平衡(LD)。当基因组的两个不同的位置以比预期的更高水平关联时，发生LD，也称作等位基因关联。

从而，SNP可以由于它与导致特定表型的突变的接近性而具有作为标记的价值。

与病症关联的SNP也可以对它们所处的基因的功能有直接影响。序列变体可以导致氨基酸改变或者可以改变外显子-内含子剪接，从而直接修饰相关蛋白质，或者它可以存在于调节区中，改变表达周期或者mRNA的稳定性。见，例如，Nowotny等人，Current Opinions in Neuobiology11：637-641(2001)。

越来越清楚的是，患许多常见疾病的危险和用于治疗这些疾病的药物的代谢受到潜在的基因组变异的实质影响，尽管任一种变体的影响可以很小。因此，SNP和临床表型之间的关联提示(1)SNP可以在功能上造成该表型；或(2)在造成该表型的基因组上SNP的位置附近可以存在其他突变。第二个可能性是基于遗传生物学，因为DNA的大片段被遗传，并且标记可以由于它们的接近性和缺少足够的分离重组事件而连锁不平衡(LD)。

SNP的鉴定和表征.许多不同的技术可以用于鉴定和表征SNP，包括单链构象多态性(SSCP)分析、通过变性高效液相层析(DHPLC)的异源双链体分析、直接DNA测序和计算机方法(见Shi等人，Clin.Chem.47：164-172(2001)。由于公共数据库中的序列信息资源，可以用计算机工具通过比对为给定基因独立提交的序列(cDNA或者基因组序列)，在计算机芯片上(insilico)鉴定SNP。Cox等人，Hum Mutal 2001，17：141-150。

最常用的SNP分型方法当前包括杂交、引物延伸和切割方法。这些方法的每一种必须连接到合适的检测系统。检测技术包括荧光极化(见Chan等人，Genome Res.9：492-499(1999))、焦磷酸释放的发光测定检测(焦磷酸测序)(见Ahmadiian等人，Anal.Biochem.280：103-10(2000))、基于荧光共振能量转移(FRET)的切割测定法、DHPLC和质谱法(见Shi，Clin.Chem.47：164-172(2001)和美国专利号6,300,076B1)。其他检测和表征SNP的方法在美国专利号6,297,018B1和6,300,063B1中公开。将上面参考文献的公开完整引入本文作为参考。

在尤其优选的实施方案中，通过INVADER^TM技术(可以从ThirdWave Technologies Inc.Madison，Wisconsin，USA得到)可以完成多态性的检测。在该测定法中，特异上游“侵入者”(invader)寡核苷酸和部分重叠的下游探针当结合到互补DNA模板时一起形成特定结构。该结构被裂解酶(Cleavase)识别并在特定位点切割，导致释放探针寡核苷酸的5’瓣。该片段然后作为合成的二级靶标和反应混合物中含有的二级荧光标记的信号探针的“侵入者”寡核苷酸。这导致裂解酶对二级信号探针的特异切割。当用能够荧光共振能量转移的染料分子标记的该二级探针被切割时，产生荧光信号。裂解酶相对于重叠的DNA序列或者瓣形成的结构具有严格要求，并且因此可以用于特异检测下游DNA链上切割位点立即下游的单个碱基对错配。见Ryan D等人,Molecular Diagnosis 4(2)：135-144(1999)和Lyamichev V等人，Nature Biotechnology 17：292-296(1999)，以及美国专利号5,846,717和6,001,567，将其公开完整引入本文作为参考。

本发明的基因分型寡核苷酸用于实施SNP分型方法，如上述的那些。本发明的一些实施方案含有两个或多个不同标记的基因分型寡核苷酸，用于同时探测两个或多个多态性位点上核苷酸的同一性。还预期引物组合物可以含有两组或多组等位基因特异性引物对以允许同时靶定和扩增含有多态性位点的两个或多个区域。

本发明的基因分型寡核苷酸可以在固体表面如微芯片、小珠或者载玻片上固定或者合成(见例如，WO 98/20020和WO 98/20019)。此类固定化的基因分型寡核苷酸可以用于多种多态性检测测定法，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸测定法中。本发明的固定化的基因分型寡核苷酸可以包含寡核苷酸的有序阵列，其设计用于同时快速筛选DNA样品中多个基因中的多态性。

本发明的等位基因特异性寡核苷酸引物具有3’末端核苷酸，或者优选3’次末端核苷酸，其与特定SNP的仅一个核苷酸互补，从而仅当存在含有该核苷酸的等位基因时作为聚合酶介导的延伸的引物。本发明预期与编码链或者非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸(ASO)引物。使用本领域技术人员已知的技术，可以开发用于检测基因多态性的ASO引物。

本发明的其他基因分型寡核苷酸与位于本文中鉴定的多态性位点之一下游的一个到几个核苷酸的靶区域杂交。此类寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法，用于检测本文描述的多态性之一并且因此此类基因分型寡核苷酸在本文中称作“引物-延伸寡核苷酸”。在优选实施方案中，引物-延伸寡核苷酸的3’末端是与该多态性位点紧邻的核苷酸互补的脱氧核苷酸。

基因分型和单元型分型(Haplotyping).本发明的寡核苷酸组合物和试剂盒可以用于个体中基因的基因分型和/或单元型分型的方法中。术语“基因型”和“单元型”分别指含有核苷酸对或核苷酸的基因型或者单元型，所述核苷酸对或核苷酸存在于-个或多个本文描述的多态性位点上，并且可以任选还包括存在于所述基因中的一个或多个额外的多态性位点上的核苷酸对或者核苷酸。额外的多态性位点可以是当前已知的多态性位点或者以后发现的位点。

本发明的基因分型方法的一个实施方案涉及从包含目的基因或者其片段的两个拷贝的个体的核酸混合物分离，并确定两个拷贝中一个或多个多态性位点上核苷酸对的身份。如技术人员将容易理解的，个体中基因的两个“拷贝”可以是相同的等位基因或者可以是不同的等位基因。在尤其优选的实施方案中，基因分型方法包括确定每个多态性位点上核苷酸对的身份。

通常，从来自个体的生物样品，如血样或组织样品分离核酸混合物。合适的组织样品包括全血、精液、唾液、泪液、尿、粪便物质、汗液、口腔粘膜涂片、皮肤和毛发。核酸混合物可以包含基因组DNA、mRNA或cDNA，并且在后两种情况中，生物样品必须从表达该基因的器官得到。此外，本领域技术人员将理解mRNA或者cDNA制备物将不用于检测位于内含子或者5’和3’非转录区中的多态性。如果分离了基因片段，那么它必须含有将基因分型的多态性位点。

本发明的单元型分型方法的一个实施方案包括从个体分离含有目的基因或者其片段的两个拷贝的仅一个拷贝的核酸分子，并确定该拷贝中一个或多个多态性位点上核苷酸的身份。使用分离基因或者片段的两个拷贝的任一种方法可以分离核酸。如本领域技术人员将容易理解的，任何单个克隆将仅提供个体中存在的两个基因拷贝之一的单元型信息。如果希望得到个体的另一个拷贝的单元型信息，将需要检查额外的克隆。通常，将检查至少5个克隆以得到个体中基因的两个拷贝的单元型分型的90％的概率。在尤其优选的实施方案中，鉴定每个多态性位点上的核苷酸。

在优选实施方案中，通过鉴定个体中存在的基因的每个拷贝中一个或多个多态性位点上核苷酸的定相序列，可以为个体确定单元型对。在尤其优选的实施方案中，单元型方法包括鉴定基因的每个拷贝中每个多态性位点上核苷酸的定相序列。当确定基因中两个拷贝的单元型时，优选用单独容器中放置的基因的每个拷贝进行鉴定步骤。然而，如果用不同的标签标记两种拷贝，或者可以分别区分或者鉴定，那么在一些情况中可能在同一容器中进行该方法。例如，如果基因的第一种拷贝和第二种拷贝分别用不同的第二种和第二种荧光染料标记，并且用第三种不同的荧光染料标记等位基因特异性寡核苷酸用于测定多态性位点，那么检测第一种和第三种染料的组合将鉴定第一种基因拷贝中的多态性，而检测第二种和第三种染料的组合将鉴定第二种基因拷贝中的多态性。

在基因分型和单元型分型方法中，鉴定多态性位点上的核苷酸(或者核苷酸对)可以如下确定：从基因的一种或两种拷贝或者其片段直接扩增含有多态性位点的靶区域，并通过常规方法对扩增的区域测序。技术人员将容易理解在多态性位点上纯合的个体中，将在该多态性位点上检测到仅一种核苷酸，而如果该个体对于该位点是杂合的，那么将检测到两种不同的核苷酸。多态性可以直接鉴定，称作肯定型鉴定，或者通过推论鉴定，称作否定型鉴定。例如，当已知参考群体中SNP为鸟嘌呤和胞嘧啶时，可以对在该位点纯合的所有个体肯定地确定该位点为鸟嘌呤或者胞嘧啶，或者如果个体在该位点为杂合的，则为鸟嘌呤和胞嘧啶。备选地，可以否定地确定该位点不是鸟嘌呤(从而为胞嘧啶/胞嘧啶)或者不是胞嘧啶(从而为鸟嘌呤/鸟嘌呤)。

此外，通过与那些目的位点连锁不平衡的其他多态性位点的基因分型，可以间接确定存在于本发明的任一多态性位点上等位基因的身份。如上文描述，如果在一个位点上特定变体的存在表明在另一位点上存在另一变体，那么说这两个位点连锁不平衡。见Stevens，JC，Mol.Diag.4：309-317(1999))。与本发明的多态性位点连锁不平衡的多态性位点可以位于相同基因的区域中或者其他基因组区域中。与本文描述的新的多态性位点连锁不平衡的多态性位点的基因分型可以通过但不限于，上述用于检测多态性位点上等位基因身份的方法的任一种进行。

可以使用任一寡核苷酸定向的扩增方法扩增靶区域，所述方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,965,188)、连接酶链式反应(LCR)(Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991)；公开的PCT专利申请WO 90/01069)、寡核苷酸连接测定法(OLA)(Landegren等人，Science 241：1077-1080(1988))。可用作此类方法中的引物或探针的寡核苷酸将与含有或者与所述多态性位点相邻的核酸区域特异杂交。通常，寡核苷酸长度为10到35个核苷酸，优选长15到30个核苷酸。最优选地，寡核苷酸长为20到25个核苷酸长。寡核苷酸的确切长度将取决于技术人员通常考虑和实践的多种因素。

其他已知的核酸扩增方法可以用于扩增靶区域，包括基于转录的扩增系统(美国专利号5,130,238；EP 329,822；美国专利号5,169,766，公布的PCT专利申请WO 89/06700)和等温法(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392-396，1992)。

可以在扩增之前或之后用本领域中已知的几种基于杂交的方法之一测定靶区域中的多态性。通常，等位基因特异性寡核苷酸用于进行此类方法。等位基因特异性寡核苷酸可以用作不同标记的探针对，该探针对的一个成员显示出与靶序列的一个变体的完全匹配，另一个成员显示出与不同变体的完全匹配。在一些实施方案中，使用一组等位基因特异性寡核苷酸或者寡核苷酸对可以一次检测一个以上的多态性位点。优选地，该对的成员当与检测的每个多态性位点杂交时相互具有5℃内、更优选2℃内的解链温度。

等位基因特异性寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交可以在溶液中用两种实体进行，或者当寡核苷酸或者靶多核苷酸共价或者非共价固定到固相支持体时，可以进行这种杂交。例如，通过抗体-抗原相互作用、聚-L-Lys、链霉抗生物素蛋白或者抗生物素蛋白-生物素、盐桥、疏水相互作用、化学键、紫外交联、baking等等介导附着。等位基因特异性寡核苷酸可以在固相支持体上直接合成或者合成后附着到固相支持体。适于用于本发明的检测方法的固相支持体包括由硅、玻璃、塑料、纸等等制造的基质，其可以例如形成孔(如96孔板中的)、载玻片、片、膜、纤维、芯片、皿和珠。固相支持体可以经处理、包被或者衍生化以促进等位基因特异性寡核苷酸靶核酸或的固定。

个体基因的基因型或者单元型还可以通过将含有该基因的一种或两种拷贝的核酸样品与如WO 95/11995中描述的核酸阵列或者子阵列杂交来确定。阵列将含有一组等位基因特异性寡核苷酸，其代表将包括在基因型或单元型中的每个多态性位点。

使用错配检测技术也可以确定多态性的身份，所述技术包括但不限于使用核糖核酸探针的RNA酶保护方法(Winter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7575(1985)；Meyers等人，Science 230：1242(1985))和识别核苷酸错配的蛋白质，如大肠杆(E.coli)mutS蛋白(Modrich P.Ann.Rev.Genet.25：229-253(1991))。备选地，通过单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等人，Genomics 5：874-879(1989)；Humphries等人，in Molecular Diagnosisof Genetic Diseases，R.Elles，ed.，pp.321-340(1996))或变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell等人，Nucl.Acids Res.18：2699-2706，(1990)；Sheffield等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：232-236(1989))可以鉴定变体等位基因。

聚合酶介导的引物延伸方法也可以用于鉴定多态性。在专利和科学文献中已经描述了一些此类方法并且其包括遗传位分析(“Genetic BitAnalysis”)方法(WO 92/15712)和连接酶/聚合酶介导的遗传位分析(美国专利号5,679,524)。相关的方法公开在WO 91/02087、WO 90/09455、WO95/17676和美国专利号5,302,509和5,945,283中。通过美国专利号5,605,798中描述的质谱法可以检测含有多态性的延伸的引物。另一种引物延伸方法是等位基因特异性PCR。见Ruafio等人，Nucl.Acids Res.17：8392(1989)；Ruafio等人，Nucl.Acids Res.19，6877-6882(1991)；WO 93/22456；Turki等人，J.Clin.Invest.95：1635-1641(1995))。此外，如WO 89/10414描述，使用等位基因特异性引物组，通过同时扩增核酸的多个区域，可以研究多个多态性位点。

另一方面，本发明提供了SNP探针，其可用于对受试者根据他们的遗传变异类型分类。根据本发明的SNP探针是寡核苷酸，其在常规的等位基因区分测定中区分SNP。

在一些优选的实施方案中，根据本发明的该方面的寡核苷酸与SNP核酸的一个等位基因互补，但是不与SNP核酸的任何其他等位基因互补。根据本发明的该实施方案的寡核苷酸可以以多种方式区分SNP。例如，在严格杂交条件下，合适长度的寡核苷酸将与一个SNP杂交，但是不与任何其他SNP杂交。可以通过放射性标记物或者荧光标记物标记寡核苷酸。备选地，合适长度的寡核苷酸可以用作PCR的引物，其中3’末端核苷酸与含有SNP的一个等位基因互补，但是不与任何其他等位基因互补。在该实施方案中，存在或不存在PCR扩增决定SNP的单元型。

本发明的基因组和cDNA片段包含本文鉴定的至少一个新的多态性位点，具有至少10个核苷酸的长度，可以长达该基因的完整长度。优选地，根据本发明的片段长为100到3000个核苷酸，更优选长为200到2000个核苷酸，最优选长为500到1000个核苷酸。

在描述本发明的多态性位点时，为了方便，参考基因的有义链。然而，如技术人员认识到的，含有该基因的核酸分子可以是互补的双链分子并且从而对有义链上特定位点的参考也参考互补反义链上对应的位点。从而，可以参考任一链上相同的多态性位点并且可以设计寡核苷酸与任一链上含有多态性位点的靶区域特异杂交。从而，本发明还包括与本文描述的基因组变体的有义链互补的单链多核苷酸。

确定群体基因型和单元型.本发明提供了确定群体中给定基因型或者单元型的频率的方法。该方法包括确定群体的每个成员中存在的基因的基因型或者单元型，其中该基因型或者单元型包含在基因中一个或多个多态性位点上检测到的核苷酸对或者核苷酸，并计算该基因型或者单元型在该群体中被发现的频率。群体可以是参考群体、家族群体、相同性别群体、群体组、或者性状群体(例如，一组显示出目的性状如医学状况或者对治疗性治疗的应答的个体的组)。

在本发明的另一方面，在参考群体中发现的基因型和/或单元型的频率数据用于鉴定性状和基因型或单元型之间的关联的方法中。该性状可以是任何可检测的表型，包括但不限于，对疾病的易感性或者对治疗的应答。该方法包括得到参考群体中目的基因型或者单元型频率的数据，并将该数据与显示该性状的群体中该基因型或者单元型频率的数据比较。通过使用上述方法之一，确定群体中每个个体的基因型或者单元型，可以得到参考群体和性状群体之一或者两者的频率数据。性状群体的单元型可以直接确定，或者通过上述预测性基因型或者单元型方法来确定。

在该方法的优选实施方案中，性状是对疾病的易感性、疾病的严重性、疾病的分期或者对药物的反应。此类方法可以应用于为所有药物遗传学应用开发诊断试验和治疗性治疗，所述应用中，在基因型和治疗结果之间可能存在关联，所述治疗结果包括功效测量、药物代谢动力学测量和副作用测量。

在该方法的另一优选实施方案中，目的性状是患者对某种治疗性治疗显示出的临床应答，例如，对药物寻靶或者对医学状况的治疗性治疗的应答。

在另一实施方案中，通过访问以前确定的频率数据可以得到参考和/或性状群体的频率数据，所述频率数据可以是书面或者电子形式。例如，频率数据可以存在于计算机可访问的数据库中。一旦得到了频率数据，就可以比较参考和性状群体中目的基因型或单元型的频率。在优选实施方案中，比较群体中观察到的所有基因型和/或单元型的频率。如果基因的特定基因型或者单元型在性状群体中的频率比在参考群体中以统计学显著量更高，那么预测该性状与该基因型或者单元型关联。

在优选实施方案中，检查不同民族地理组的单元型频率数据以确定它们是否与哈迪-温伯格平衡一致。D.L.Hartl等人，Principles of PopulationGenomics，3rd Ed.(Sinauer Associates，Sunderland，MA，1997)。哈迪-温伯格平衡假定发现单元型对H1/H2的频率等于P_H-W(H₁/H₂)＝2p(H₁)p(H₂)(如果H₁≠H₂)和P_H-W(H₁/H₂)＝p(H₁)p(H₂)(如果H₁＝H₂)。在观测的和期望的单元型频率之间的统计学显著差异可以是由于一种或多种因素，包括群体组中的显著近交、对基因的强烈选择压力、抽样偏差，和/或基因分型过程中的误差。如果在民族地理组中观察到与哈迪-温伯格平衡的大偏离，那么可以增加该组中个体的数目以观察该偏离是否是由于抽样偏差。如果大样品量不减小观测到的和期望的单元型对频率之间的差异，那么可以希望考虑使用直接单元型分型方法，如CLASPER System^TM技术(美国专利号5,866,404)、SMD、或等位基因特异性长程PCR(Michalotos-Beloin等人，Nucl Acids Res 24：4841-4843(1996))考虑对个体进行单元型分型。

在用于预测单元型对的该方法的一个实施方案中，本发明的方法涉及进行下面的分析。首先，将每个可能的单元型对与参考群体中的单元型对比较。通常，参考群体中仅仅一个单元型对与可能的单元型对匹配并且将该对分配给该个体。偶然，参考单元型对中存在的仅一个单元型与个体的可能的单元型对一致，并且在此类情况中，对该个体分配含有该已知单元型和通过从可能的单元型对扣除该已知的单元型得到的新单元型的单元型对。在罕见的情况下，参考群体中没有单元型与可能的单元型对一致，或者备选地，多个参考单元型对与可能的单元型对一致。在此类情况中，优选使用直接分子单元型分型方法，如上文讨论的方法确定个体的单元型。

在优选实施方案中，通过使用标准方差分析(ANOVA)检验用Bonferoni校正和/或用自举法(bootstrapping method)进行统计学分析，自举法多次模拟基因型/表型校正并且计算显著性值。当将分析许多多态性时，可以进行计算以校正可以偶然发现的显著关联。对于用于本发明的方法中的统计学方法，见Statistical Methods in Biology，3^rd edition，BaileyNTJ，(Cambridge Univ.Press，1997)；Introduction to ComputationalBiology，Waterman MS(CRC Press，2000)和Bioinformatics，BaxevanisAD & Ouellette BFF编者(John Wiley & Sons，Inc.，2001)。

在本发明的另一实施方案中，与目的基因型或者单元型连锁不平衡的可检测的基因型或者单元型可以用作替代标记。通过确定给定基因的特定基因型或者单元型是否在也显示出潜在的替代标记基因型的群体中比在参考群体中的频率更高，可以发现与另一基因型连锁不平衡的基因型。如果该频率是统计学显著的，那么该标记基因型预测该基因型或者单元型，并且可以用作替代标记。

基因型或单元型和受试者对治疗的应答之间的相关性.从给定受试者得到临床和多态性数据后，产生个体应答和基因型或者单元型含量之间的相关性。可以以几种方法产生相关性：在一种方法中，个体通过他们的基因型或者单元型(或者单元型对)分组(也称作多态性组)，然后计算每个多态性组的成员显示的临床应答的平均值和标准差。

为了推导对治疗的临床应答和基因型或单元型之间的相关性，必须得到接受治疗的个体群体(下文中“临床群体”)显示的临床应答的数据。该临床数据可以通过分析已经进行的临床试验的结果得到和/或临床数据可以通过设计并进行一个或多个新的临床试验来得到。

然后分析这些结果以确定在多态性组之间临床应答中观察到的任何差异是统计学显著的。可以使用的统计学分析方法可以如L.D.Fisher & G.vanBelle，Biostatistics：A Methodology for the Health Sciences(Wiley-Interscience，New York，1993)中描述的使用。该分析还可以包括回归计算该基因中哪些多态性位点对于表型中的差异贡献最大。

发现单元型含量和临床应答之间的相关性的第二种方法使用基于误差-最小化优化算法的预测模型，该算法之一是遗传算法(R.Judson，GeneticAlgorithms and Their Uses in Chemistry in Reviews in ComputationalChemistry，Vol.10，pp.1-73，K.B.Lipkowitz and D.B.Boyd，eds.(VCHPublishers，New York，1997)。也可以使用模拟退火(Press等人，NumericalRecipes in C：The Art of Scientific Computing，Ch.10(CambridgeUniversity Press，Cambridge)1992)、神经网络(E.Rich & K.Knight，Artificial Intelligence，2nd Edition，Ch.10(McGraw-Hill，New York，1991)、标准梯度下降法(Press等人，supra Ch.10)，或者其他全局或者局部优化方法(见上文Judson中讨论)。

还可以使用方差分析(ANOVA)技术分析相关性以确定通过基因中多态性位点的不同子集可以解释临床数据的差异到什么程度。用ANOVA检验关于应答变量是否由一个或多个可以测量的性状或者变量引起或者与其相关的假设(Fisher & vanBelle，上文，Ch.10)。在本文提供的实施例中，使用Mantel-Haenzel检验进行该具体研究中主要统计学分析，以确定优势率和95％置信限、logistic回归(logistic regression)、ANCOVA和Fisher精确检验。

从上述分析，技术人员可以容易建立数学模型，其预测作为基因型或者单元型含量的函数的临床应答。

基因的临床应答和基因型或单元型(或者单元型对)之间关联的鉴定可以是设计诊断方法的基础，该诊断方法确定那些个体哪些将应答或不应答治疗，或者备选地，将以较低水平应答，从而可以需要更多治疗，即更大剂量的药物。本发明的这些诊断方法可以采取几种形式之一：例如，直接DNA测试(即，对基因中一个或多个多态性位点基因分型或单元型分型)、血清学检验，或者体检测量。唯一的需要是在诊断测试结果和潜在的基因型或者单元型之间存在良好的相关性。在优选实施方案中，该诊断方法使用上述预测性单元型分型方法。

计算机可以实现涉及实施本发明方法的任一种或所有分析和数学操作。此外，计算机可以执行程序，该程序产生在显示装置上显示的视图(或屏幕)，并且使用该程序，用户可以与视图交互并分析与该基因和它的基因组变异有关的大量信息，包括染色体位置、基因结构、和基因家族、基因表达数据、多态性数据、遗传序列数据和临床群体数据(例如，关于一个或多个群体的民族地理起源、临床反应、基因型和单元型的数据)。本文描述的多态性数据可以作为关系数据库的一部分存储(例如，Oracle数据库的实例或者一组ASCII平面文件)。这些多态性数据可以存储在计算机的硬驱上或者可以例如，存储在CD-ROM或者计算机可以访问的一个或多个其他存储装置上。例如，数据可以存储在一个或多个数据库中，通过网络与计算机通信。

在其他实施方案中，本发明提供了用于对个体中基因进行单元型分型和/或基因分型的方法、组合物和试剂盒。组合物含有寡核苷酸探针和引物，它们设计用于与含有多态性位点或者与多态性位点相邻的一个或多个靶区域特异杂交。用于建立本文描述的新的多态性位点上个体的基因型或单元型的方法和组合物可以用于研究多态性在蛋白质的表达和功能影响的疾病的病因中的作用，研究药物寻靶功效，预测个体对该蛋白质的表达和功能影响的疾病的易感性，和预测个体对靶定基因产物的药物的反应性。

本发明还提供了用于存储和显示为基因确定的多态性数据的计算机系统。计算机系统包含计算机处理单元、显示器、含有多态性数据的数据库。多态性数据包括为参考群体中给定基因鉴定的多态性、基因型和单元型。在优选实施方案中，计算机系统能够产生画面，其显示根据它们的进化关系组织的单元型。

评估表达水平.RT-PCR(实时定量PCR)是评估例如，本发明的基因(例如，含有SNP和目的多态性的那些基因)的基因表达水平的一种方法。RT-PCR测定法利用RNA逆转录酶催化从RNA链、包括mRNA链合成DNA链。可以特异检测和定量所得的DNA并且该方法可以用于确定mRNA的特定种类的水平。这样做的一种方法称作TAQMAN^TM(PEApplied Biosystems，Foster City，California，USA)，其在下文更详细描述。

测量细胞的转录状态的其他方法包括产生有限复杂性的限制性片段库用于电泳分析，如通过组合双限制性酶消化与定相引物的方法(见例如，Zabeau等人的1992年9月24日提交的EP 0 534858 A1)，或者选择具有与确定的mRNA末端最接近的位点的限制性片段的方法。见例如，Prashar& Weissman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2)659-663(1996)。其他方法包括用多种cDNA的每一种产生统计学上的样品cDNA库，如通过测序足够的碱基，例如，20-50个碱基，以标识每种cDNA，并测序短的标签，例如9-10个碱基，所述标签在相对于确定的mRNA末端途径模式的已知位置产生。见例如，Velculescu，Science 270：484-487(1995)。

通过测量不同对照组中基因表达确定基因表达产物的标准对照水平。然后将对照组基因表达水平与给定受试者中基因表达产物的测量水平比较。该基因表达产物可以是与那个特定基因型组相关的特征性mRNA或者那个特定基因型组的多肽基因表达产物。然后可以基于与给定组的对照水平相比测量的水平有多么相似，对患者分类或者分配到特定基因型组。

如本领域技术人员将理解的，进行这种决定存在一定程度的不确定性。因此，对照组水平的标准差将用于做出概率性的确定并且本发明的方法将应用于基于基因型组确定的概率的宽范围内。从而，例如并且不作为限制，在一个实施方案中，如果基因表达产物的测量的水平落入任何对照组平均值的2.5倍标准差内，那么可以将该个体分配给该基因型组。在另一实施方案中，如果基因表达产物的测量水平落入任一对照组的平均值的2.0倍标准差内，那么可以将该个体分配到该基因型组。在再一个实施方案中，如果基因表达产物的测量水平落入任一对照组的平均值的1.5倍标准差内，那么可以将该个体分配到该基因型组。在再一个实施方案中，如果基因表达产物的测量水平落入任一对照组的平均值的1.0倍或更小的标准差内，那么可以将该个体分配到该基因型组。

从而，该方法将允许以不同程度的概率确定特定患者可以置于哪个组，并且这种分配给一个基因型组将然后决定个体将置于的危险类别。

检测和测量mRNA水平和多肽基因表达产物的水平的方法是本领域中公知的并且包括使用核苷酸微阵列和多肽检测方法，包括质谱仪和/或抗体检测和定量技术。也见Tom Strachan & Andrew Read，HumanMolecular Genetics，2^nd Edition.(John Wiley and Sons，Inc.Publication，NY，1999)。

其他方面的测量.在本发明的多种实施方案中，可以测量转录状态之外的生物学状态，如翻译状态、活性状态或者混合的方面，以便得到药物和途径应答。这些实施方案的细节在下文描述。

翻译状态测量.本发明的基因编码的蛋白质的表达可以通过探针检测，探针可以可检测地标记，或者可以随后标记。通常，探针是识别表达的蛋白质的抗体。

术语“抗体”包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或者嵌合抗体和生物学功能抗体片段，其足够该抗体片段结合到蛋白质。

为了产生针对所公开的基因之一编码的蛋白质的抗体，通过用多肽或者其部分注射，可以免疫多种宿主动物。此类宿主动物包括，但不限于，兔、小鼠和大鼠。取决于宿主物种，多种佐剂可以用于增强免疫应答，这些佐剂包括但不限于，弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶，如氢氧化铝；表面活性物质，如卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚；和潜在有用的人佐剂，如卡介苗(BCG)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。

多克隆抗体是从用抗原，如靶基因产物，或者其抗原性功能衍生物免疫的动物的血清得到的抗体分子的异质群体。为了产生多克隆抗体，通过用补充如上述佐剂的编码蛋白，或者其部分注射，可以免疫宿主动物，如上述的宿主动物。

单克隆抗体(mAbs)是针对特定抗原的抗体的同质群体，可以通过提供通过传代细胞系培养产生抗体分子的任意技术得到。这些技术包括，但不限于，Kohler & Milstein，Nature，256：495-497(1975)；和美国专利号4,376,110的杂交瘤技术；Kosbor等人，Immunol. Today，4：72(1983)；Cole等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：2026-2030(1983)的人B细胞杂交瘤技术；和EBV-杂交瘤技术，Cole等人，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy pp.77-96(Alan R.Liss，Inc.，1985)。此类抗体可以是任意免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。产生本发明的mAb的杂交瘤可以在体外或者体内培养。体内高滴定度mAb的产生使得其是当前优选的生产方法。

此外，可以使用为了产生“嵌合抗体”而开发的技术(见Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature，312：604-608(1984)；和Takeda等人，Nature，314：452-454(1985))，该技术将具有合适的抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有合适生物学活性的人抗体分子的基因剪接在一起。嵌合抗体是这样的分子，其中不同的部分来自不同的动物物种，如具有来自小鼠mAb的可变或者高变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体。

备选地，关于产生单链抗体所描述的技术(美国专利号4,946,778；Bird，Science，242：423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)；和Ward等人，Nature，334：544-546(1989))可以适用于产生差别表达的基因单链抗体。通过用氨基酸桥连接Fv区的重链片段和轻链片段，得到单链多肽而形成单链抗体。

用于产生“人源化抗体”的技术可以适用于产生针对蛋白质、其片段或者衍生物的抗体。此类技术公开在美国专利号5,932,448；5,693,762；5,693,761；5,585,089；5,530,101；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,661,016；和5,770,429中。

识别特异表位的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，此类片段包括，但不限于，可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)₂片段和通过还原F(ab′)₂片段的二硫桥产生的Fab片段。备选地，可以构建Fab表达文库(见Huse等人，Science，246：1275-1281(1989))，以允许快速和容易地鉴定具有所希望的特异性的单克隆Fab片段。

然后通过免疫测定方法利用上述抗体测定给定样品中表达已知蛋白质的程度。此类免疫测定方法包括，但不限于，斑点印迹、蛋白质印迹、竞争和非竞争蛋白质结合测定法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组织化学、荧光激活细胞分选术(FACS)，和通常使用和在科学和专利文献中大量描述的其他方法，并且许多在商业上使用。

为了容易检测，尤其优选的是夹心ELISA，其存在许多变通方法，所有这些变通方法都意在用于本发明的方法和测定法中。例如，在典型的正向测定法(forward assay)中，将未标记的抗体固定在固态基质上并将待测试的样品与被结合的分子接触，温育合适的时间，以足够允许形成抗体-抗原二级复合体。此时，将用能够诱导可检测的信号的报道分子标记的二级抗体加入并温育，允许时间足够形成抗体-抗原-标记抗体的三级复合体。洗除任何未反应的物质，并且抗原的存在通过观察信号来确定，或者可以通过与含有已知量的抗原的对照样品比较来定量。正向测定法的变通方法包括同时测定法，其中样品和抗体同时加入到结合的抗体，或者反向测定法，其中标记的抗体和待测试的样品首先混合，温育并加入未标记的表面结合的抗体。这些技术是本领域技术人员公知的，并且次要改变的可能性将是显然的。本文所用的“夹心测定法”意在包括对基本的两位点技术的所有变通方案。对于本发明的免疫测定法，唯一的限制性因素是经标记的抗体必须是对目的基因表达的蛋白质特异的抗体。

该类型测定法中最常用的报道分子是酶、含有荧光团-或者放射性核素的分子。对于酶免疫测定法(EIA)，将酶缀合到二级抗体，通过戊二醛或者高碘酸缀合。然而，如将容易认识到的，存在多种不同的连接技术，它们是技术人员公知的。常使用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶，等等。通常选择与特定酶一起使用的底物用来当被对应的酶水解时产生可检测的颜色改变。例如，对硝基苯磷酸适于与碱性磷酸酶缀合物一起使用；对于过氧化物酶缀合物，通常使用1，2-苯二胺或者甲苯胺。还可以使用荧光底物，其产生荧光产物而不是上面提到的显色底物。然后将含有合适底物的溶液加入三级复合体。底物与连接二级抗体的酶反应，得到定性的可见信号，其可以进一步定量，通常通过分光光度法定量，得到对血清样品中存在的蛋白质的量的评估。

备选地，荧光化合物，如荧光素和罗丹明，可以化学偶联到抗体而不改变它们的结合能力。当通过用特定波长的光照射激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能，在分子中诱导激发态，然后发出具有特征性更长波长的光。该发射呈现为用光学显微镜可目视检测的特征性颜色。免疫荧光和EIA技术在本领域中非常成熟并且尤其优选用于本发明方法。然而，其他报道分子，如放射性同位素、化学发光或者生物发光分子也可以使用。本领域技术人员将明白怎样改变操作以适合所需的用途。

本发明基因的翻译状态的测量也可以根据一些额外方法进行。例如，通过构建微阵列可以进行蛋白质的整个基因组，即“蛋白质组”的监视，Goffeau等人，上文，所述微阵列中结合位点包含固定化的、优选单克隆的抗体，这些抗体对细胞基因组编码的许多蛋白质种类特异。优选地，存在针对大部分编码蛋白质，或者至少与测试或者证实目的生物学网络模型相关的那些蛋白质的抗体。制备单克隆抗体的方法是公知的。见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NY，1988)，将其为了所有目的完整引入本文)。在一个优选实施方案中，产生针对基于细胞的基因组序列设计的合成的肽片段的单克隆抗体。使用这种抗体阵列，将来自细胞的蛋白质与阵列接触，并且用本领域已知的测定法测定它们的结合。

通过二维凝胶电泳系统可以分离蛋白质。二维凝胶电泳是本领域公知的并且通常包括沿着第一维等电聚焦，然后沿着第二维进行SDS-PAGE电泳。见，例如，Hames等人，″Gel Electrophoresis of Proteins：A PracticalApproach″(IRL Press，NY，1990)；Shevchenko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：14440-14445(1996)；Sagliocco等人，Yeast，12：1519-1533(1996)；和Lander，Science，274：536-539(1996)。所得电泳图可以通过多种技术分析，所述技术包括质谱技术、使用多克隆和单克隆抗体进行蛋白质印迹和免疫印迹分析，和内部和N-末端微测序。使用这些技术，可以鉴定在给定生理条件下产生的所有蛋白质的大部分，所述给定生理条件包括在暴露于药物的细胞中，例如，在酵母中，或者在通过例如缺失或者过表达特定基因而修饰的细胞中。

体液或者组织中基因的多肽(蛋白质)表达产物的检测可以用于确定存在或不存在多态性，并且多肽表达产物的相对水平可以用于确定该多态性以纯合还是杂合状态存在(从而确定该个体的危险类别)。

基于生物学状态的其他方面的实施方案.尽管监视mRNA丰度之外的细胞成分当前带来了一些技术困难，但是本领域技术人员将明白，使用本发明的方法可以测量与细胞功能的表征有关的蛋白质的活性，本发明的实施方案可以基于此类测量。可以通过适合被表征的特定活性的任何功能的、生物化学的或者物理方法进行活性测量。当活性涉及化学转化时，细胞蛋白质可以与天然底物接触，并测量转化率。当活性涉及多聚体单位的结合，例如，活化的DNA结合复合体与DNA的结合时，可以测量结合的蛋白质的量或者该结合的二级结果，如所转录的mRNA的量。而且，当唯一的功能活性已知时，例如在细胞周期控制中，可以观察功能的执行。不管怎样已知和测量，蛋白质活性的改变都形成了可以通过本发明的前述方法可以分析的应答数据。

在备选的和非限制性实施方案中，应答数据可以由细胞的生物学状态的混合方面形成。可以从例如，某些mRNA丰度的改变、某些蛋白质丰度的改变和某些蛋白质活性的改变构建应答数据。

核酸和蛋白质作为标记的检测.在具体实施方案中，可以使用本领域已知的方法，通过原位或者体外形式测定生物样品中对应于标记物的mRNA的水平。术语“生物样品”意在包括组织、细胞、生物液体和其分离物、来自受试者的分离物，以及受试者中存在的组织、细胞和液体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，对于mRNA的分离不选择的任意RNA分离技术都可以用于从细胞纯化RNA。见例如，Ausubel等人，Ed.，Curr.Prot.Mol.Biol.，John Wiley & Sons，NY(1987-1999)。此外，使用本领域技术人员已知的技术可以容易地处理大量组织样品，如美国专利号4,843,155的一步RNA分离方法。

分离的mRNA可以用于杂交或者扩增测定法，其包括但不限于，DNA印迹分析或者RNA印迹分析、PCR分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一种优选的诊断方法包括将分离的mRNA与可以与所选基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是例如，全长cDNA，或者其部分，如全长cDNA或者其部分，如长为至少7、15、30、50、100、250或者500个核苷酸并且在严格条件下足以与编码本发明的标记的mRNA或者基因组DNA特异杂交的寡核苷酸。适于在本发明的诊断测定法中使用的其他合适的探针在本文中描述。mRNA与探针的杂交表明所述的标记正被表达。

在一种形式中，将mRNA固定在固体表面上并与探针接触，例如，通过在琼脂糖凝胶上电泳分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜，如硝酸纤维素。在备选形式中，将探针固定在固体表面上并将mRNA与探针接触，例如，在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以容易地修改已知的mRNA检测方法用于检测本发明的标记编码的mRNA的水平。

用于测定对应于样品中本发明的标记的mRNA水平的备选方法包括核酸扩增方法，例如，通过RT-PCR(在Mullis，美国专利号4,683,202(1987)中提出的实验实施方案；连接酶反应，Barany(1991)，上文；自动维持序列复制，Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874-1878(1990)；转录扩增系统，Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：1173-1177(1989)；Q-Beta复制酶，Lizardi等人，Biol.Technology，6：1197(1988)；滚环复制、美国专利号5,854,033(1988)；或者任意其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。如果此类分子以非常低的数目存在，那么这些检测方案可以特别用于检测核酸分子。如本文所用的，扩增引物定义为一对核酸分子，其可以与基因的5’或3’区(分别为正链和负链，或者反之亦然)退火并且含有它们之间的短区域。通常，扩增引物长为约10-30个核苷酸并且侧翼区长为约50-200个核苷酸。在合适的条件下并且使用合适的试剂，此类引物允许扩增包含引物侧翼的核苷酸序列的核酸分子。

在原位方法中，mRNA不需要在检测前从细胞分离。在此类方法中，使用已知的组织学方法制备/处理细胞或者组织样品。将样品固定在支持体，通常在载玻片上，然后与探针接触，该探针与编码所述标记的mRNA杂交。

作为基于标记的绝对表达水平进行测定的备选方法，测定可以基于标记的归一化的表达水平。通过校正标记的绝对表达水平对表达水平归一化，通过将标记的的表达与组成性表达的非标记的基因例如管家基因的表达进行比较来进行校正。用于归一化的合适的基因包括管家基因，如肌动蛋白基因或者上皮细胞特异基因。该归一化允许将一种样品，例如，患者样品中的表达水平与另一种样品比较，或者在不同来源的样品之间比较。

备选地，表达水平可以作为相对表达水平提供。为了确定标记的相对表达水平，在测定所讨论的样品的表达水平之前，为正常的对比患病生物样品的10种或者更多样品，优选50种或更多样品确定标记的表达水平。测定大数目样品中测定的每种基因的平均表达水平并且其用作标记的基线表达水平。然后为试样测定的标记的表达水平(绝对表达水平)除以为该标记得到的平均表达值。这提供了相对表达水平。

优选地，用于基线测定的样品将来自没有多态性的受试者。细胞来源的选择依赖于相对表达水平的使用。使用正常组织中发现的表达作为平均表达得分帮助证实所测定的标记是否特异的(对比正常细胞)。此外，随着更多数据的积累，可以修正平均表达值，提供基于所积累的数据的改进的相对表达值。

多肽的检测.在本发明的另一实施方案中，检测对应于标记的多肽。用于检测本发明的多肽的优选试剂是能够结合对应于本发明的标记的多肽的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或者更优选地，是单克隆的。可以使用完整抗体，或者其片段，例如，Fab或者F(ab′)₂。术语“经标记的”关于探针或者抗体，意在包括通过将可检测的物质偶联，即物理连接到探针或者抗体来直接标记所述探针或者抗体，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性来间接标记所述探针或者抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体和具有生物素的DNA探针的末端标记检测一级抗体，用生物素标记使得该DNA探针可以用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测。

使用本领域技术人员公知的技术可以从个体分离蛋白质。所用的蛋白质分离方法可以例如，为Harlow and Lane(1988)，上文中描述的方法。

多种形式可以用于确定样品是否含有结合给定抗体的蛋白质。此类形式的实例包括，但不限于，EIA；放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹分析和ELISA。技术人员将容易修改已知的蛋白质/抗体检测方法用于确定细胞是否表达本发明的标记和血液或者其他身体组织中特定多肽表达产物的相对浓度。

在一种形式中，抗体或者抗体片段可以用于方法中，如用于蛋白质印迹或者免疫荧光技术以检测表达的蛋白质。在此类用途中，通常优选在固相支持体上固定抗体或者蛋白质。合适的固相支持体或者载体包括能够结合抗原或者抗体的任何支持体。公知的支持体或者载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然或者修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。

本领域技术人员将已知用于结合抗体或者抗原的许多其他合适的载体，并且将能够使此类支持体适合用于本发明。例如，从患者细胞分离的蛋白质可以在聚丙烯酰胺凝胶电泳上电泳并固定到固相支持体，如硝酸纤维素上。支持体可以用合适的缓冲液洗涤并用可检测性标记的抗体处理。固相支持体可以用所述缓冲液再次洗涤以除去未结合的抗体。固相支持体上结合的标记的量可以通过常规方法检测并将该测量转变为血液或者另一身体组织的中蛋白质的水平或者浓度。

试剂盒.本发明还包括试剂盒，其用于检测生物样品中对应于本发明标记的多肽或者核酸的存在，所述生物样品为例如任何体液，包括但不限于，血清、血浆、淋巴、胆囊液、尿、粪便、脑脊液、腹水(acitic fluid)或者血液并且包括身体组织的活组织检查样品。例如，试剂盒可以包含经标记的化合物或者试剂，其能够检测生物样品中对应于本发明的标记的多肽或者编码该多肽的mRNA，和用于测定样品中所述多肽或者mRNA的量的手段，例如，结合所述多肽的抗体或者结合编码该多肽的DNA或者mRNA的寡核苷酸探针。试剂盒还可以包括使用该试剂盒解释所得结果的使用说明。

在另一实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含在分开的容器中包装的至少两种基因分型寡核苷酸。试剂盒还可以含有包装在单独容器中的其他组分如杂交缓冲液(其中寡核苷酸可以用作探针)。备选地，当寡核苷酸用于扩增靶区域时，该试剂盒可以含有包装在单独的容器中的聚合酶和反应缓冲液，该缓冲液经优化用于聚合酶(如对于PCR)介导的引物延伸。

在优选实施方案中，此类试剂盒可以还包含DNA样品收集手段。

具体地，基因分型引物组合物可以包含至少两组等位基因特异性引物对。优选地，在分开的容器中包装这两种基因分型寡核苷酸。

对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可以包含例如：1)第一种抗体，例如，附着到固相支持体的第一种抗体，其结合对应于本发明的标记的多肽，和任选地2)第二种不同的抗体，其结合所述多肽或者第一种抗体并且缀合可检测的标记。

对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒可以包含例如：1)寡核苷酸，例如，可检测地标记的寡核苷酸，其与编码对应于本发明的标记的多肽的核酸序列杂交；或者2)用于扩增对应于本发明的标记的核酸分子的引物对。

试剂盒还可以包含例如，缓冲剂、防腐剂或者蛋白质稳定剂。试剂盒可以还包含检测可检测的标记必需的组分，例如，酶或者底物。试剂盒可以还含有对照样品或者一系列对照样品，其可以经测定并与试样比较。试剂盒的每种组分可以封闭在单个容器中并且所有不同的容器可以与关于使用该试剂盒解释所进行的测定的结果的说明书一起位于一个包装中。

给出下面的实施例用于更完全阐明本发明的优选实施方案。决不应将这些实施例理解为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书限定。

实施例1慢性便秘患者对替加色罗的应答的药物遗传学分析

引言.进行临床试验，通过在前4周的治疗期间测量完全自发肠运动(CSBM)的次数，评估6mg每日两次(12mg/天)或者2mg每日两次(4mg/天)对比安慰剂的功效。第二个目的包括评价整个12周治疗期间SCBM的次数、肠排便习惯、泻药使用和安全性和耐受性问题。临床试验设计由没有给药的2周的基线周期、12周的随机化、双盲、安慰剂对照的治疗期和没有研究药物的4周停药期组成。作为临床试验的部分，在筛选用于药物遗传学分析时从患者收集DNA以评价与药物靶标和疾病病因有关的遗传多态性。

已经为SLC6A4基因表征了两个主要类别的插入/缺失多态性，一个位于内含子2，另一个位于启动子区中。SLC6A4是5-羟色胺转运蛋白基因，也称作SERT或者HTT。Camilleri和同事报导SLC6A4启动子插入/缺失多态性与用5-羟色胺-HT₃受体拮抗剂阿洛司琼治疗后的结肠转运反应有关。Camilleri M等人，Gastroenterology；123(2)：425-32(2002)。我们发现对于5-羟色胺转运蛋白启动子多态性的C16(长)等位基因纯合的个体倾向于显示与安慰剂相比对替加色罗的更大的应答。对C16-C16的总体应答率对于替加色罗为48％，对于安慰剂为21％(OR＝3.51，95％CI：1.67-7.41)，相比C14-C14纯合子对替加色罗为45％，对安慰剂为27％(OR＝2.3，95％CI：0.93-5.69)，C14-C16杂合子对替加色罗为43％，对安慰剂为28％(OR＝1.95；95％CI：1.12-3.41)。在给定的治疗组内，在不同基因型之间的应答率没有统计学显著差异。

在该研究中，评估了23种新候选基因中的总共55个单核苷酸多态性(SNP)(完整列表见表1)。这些包括药物靶标(HRT4)以及5-HT₃受体亚基HTR3A和HTR3B中的许多SNP。还评估了与5-羟色胺合成(TPH，TDO2)和下游5-羟色胺信号传递(CALCA或CGRP1)有关的基因，以及与肠运动性有关的基因，如促胃动素(MLN)和肠分泌有关的基因(SLC12A2，AQP3，SCNN1A)。

表1

候选基因列表
候选基因列表			基因	描述	功能/注释
ABP1ADORA1AQP3AQP4CALCACFTRHTR3AHTR3BHTR4MLNSCNN1A	阿米洛利结合蛋白1(胺氧化酶(含有铜))；二胺氧化酶(DAO)腺苷A1受体水通道蛋白3水通道蛋白4降钙素/降钙素-相关的多肽，α(CGRP1)囊性纤维化跨膜调节子5-羟色胺(5-羟色胺)受体3A5-羟色胺(5-羟色胺)受体3B5-羟色胺(5-羟色胺)受体4促胃动素钠通道，非电压门控的1α	被替加色罗的降解产物戊基氨基胍(PAG)抑制；基于在小鼠中看到的粘膜增生的可能的安全性考虑选择选择性结合腺苷的G-蛋白偶联受体；参与肠神经系统内在膜蛋白的水通道蛋白家族的成员，其作为许多细胞的质膜中的水选择性通道转运水、甘油或者其他小分子的水通道；MIP家族蛋白质的成员降钙素和降钙素基因相关肽的前体；在神经系统和外周组织中发现的受体的配体Cl转运；ENaC钠通道的调节子被5-羟色胺激活，参与起始蠕动反射和促进管腔内分泌被5-羟色胺激活，参与起始蠕动反射和促进管腔内分泌Zelmac的靶标；被5-羟色胺激活，参与起始蠕动反射和促进管腔内分泌刺激窦和十二指肠的收缩Na转运	基因	描述	功能/注释

表1

候选基因列表
候选基因列表			基因	描述	功能/注释
SGKSLC12A2SLC12A4SLC26A3SLC4A1SLC4A2SLC9A2SLC9A3SLC9A3R1TAC1	血清和糖皮质激素调节激酶溶质载体家族12(钠/钾/氯离子转运蛋白)，成员2溶质载体家族12(钾/氯离子转运蛋白)，成员4溶质载体家族26，成员3溶质载体家族4，阴离子交换剂，成员1(红细胞膜蛋白带3，Diego血液组)溶质载体家族4，阴离子交换剂，成员2(红细胞膜蛋白带3-样1)溶质载体家族9(钠/氢交换剂)，同工型2(NHE2)溶质载体家族9(钠/氢交换剂)，同工型3(NHE3)溶质载体家族9(钠/氢交换剂)，同工型3调节因子1速激肽，前体1(物质K，物质P，神经激肽1，神	结肠中重要的调节蛋白，介导早期醛固酮作用NKCC1-溶质转运KCC1溶质转运在结肠中表达的肿瘤抑制基因，可能具有阴离子转运蛋白活性AE1-阴离子交换1AE2-阴离子交换2electroneutrol NaCl转运electroneutrol NaCl转运NHE3(SLC9A3)钠/氢反向转运蛋白的调节辅因子认为起神经递质功能的激素，其与神经受体和平滑肌细胞相互作用；	基因	描述	功能/注释

TDO2TPH

经激肽2，神经调节肽L，神经激肽α，神经肽K，神经肽γ)色氨酸2，3-加双氧酶色氨酸羟化酶(色氨酸5-单加氧酶)

起血管扩张剂和促分泌素的功能催化色氨酸向5-羟色胺的分解代谢中的限速步骤催化5-羟色胺合成中的初始和限速步骤

样品.将共1348名患者随机化为意向治疗(ITT)群体。在患者筛选时从这些患者收集血样并使用PUREGENE^TM DNA分离试剂盒(IsolationKit)(D-50K)提取DNA。其中，来自738名随机化患者的样品对于评估的55种SNP的至少半数具有良好的质量基因型数据。

临床评估.通过完全自发肠运动(CSBM)的次数测量初次功效，其中“完全”指导致完全排空感觉的肠运动，“自发”表明在24小时内没有使用泻药。评估的初次功效终点是治疗4周后在基线之上增加1或多次CSBM/周。在该基因分型研究中评估的二次终点是RESP12：治疗12周后在基线之上增加1或多次CSBM/周。如果患者满足这些标准并且已经完成了至少7天的治疗，那么将患者分类为应答者。基于每周的日记评估，如令人烦恼的便秘、令人烦恼的腹部疼痛、和在12周治疗期结束时对肠排便习惯的满意度来评价额外的二次功效评估(使用基线值作为分析的共变量)。

基因分型.在23种候选基因中选择了共61种多态性用于分析。对于多数测定使用TaqMan^_技术进行基因分型，而一些在室内使用ThirdWave Technologies Invader Assay技术进行(见表2对于所有评估的SNP的测定ID)。在基因分型的61种SNP中，55种产生好质量的多态性基因型，其用于进一步评价。

表2

评价的候选基因的测定ID

基因	PG ID	测定名称	基因	PG ID	测定名称
基因	PG ID	测定名称	基因	PG ID	测定名称	ABP1ABP1ABP1ADORA1AQP3AQP3AQP3AQP4CALCACALCACFTRCFTRCFTRHTR3AHTR3AHTR3BHTR4HTR4HTR4HTR4HTR4HTR4HTR4HTR4HTR4HTR4MLNMLN	1763176421851786183818391840184137503783374537523761174817493755174637413742374337473751375337543756376017833748	TWT_402234ABI_E_rs2071514_10ABI_E_rs1049793_10ABI_C_____262337_1_ABI_E__rs517210_10ABI_C____2736449_1_TWT_402221ABI_E_rs2339214_10ABI_C____2697070_1_ABI_E_____rs5241_10ABI_C_____656774_1_ABI_C____3021357_10ABI_C_____656763_10ABI_C____1372135_1_ABI_E_rs1176713_10ABI_C____7488596_1_ABI_E__rs723180_10ABI_C__11259587_10ABI_C__11259592_10ABI_C__11267705_10ABI_C___1992167_10ABI_C___2816608_10ABI_C___3168086_10ABI_C___3220820_10ABI_C___7505278_10ABI_C____349748_10ABI_C___1920380_1_ABI_C___2005027_10	SCNN1ASCNN1ASCNN1ASGKSLC12A2SLC12A2SLC12A2SLC12A4SLC26A3SLC26A3SLC26A3SLC4A1SLC4A1SLC4A1SLC4A2SLC4A2SLC4A2SLC9A2SLC9A2SLC9A2SLC9A3SLC9A3RSLC9A3RTAC1TDO2TPHTPH	180438053806374418421843380118291835183738041822182437821825334233441828375837593757181937491795374617563784	ABI_E_rs2228576_10ABI_E_rs3741914_10ABI_E_rs3782726_10ABI_C____1347310_10ABI_C____8942125_1_ABI_E__rs790156_10ABI_E_rs1864922_10ABI_E_rs3785098_10ABI_C____8856481_10ABI_E_rs2269778_10ABI_E_rs3735605_10ABI_C____2548337_1_ABI_E_rs2072081_10ABI_E_____rs5036_10TWT_402225ABI_C__15972956_10ABI_C___2073105_1_TWT_402224ABI_C___8906170_10ABI_C___8906179_10ABI_C___8293157_10ABI_C___2160161_1_ABI_C___2160155_10ABI_C___2560484_1_ABI_C___1601897_10ABI_C___2298450_1_ABI_E_rs1607395_10

ABI＝Applied Biosystems Inc.；TWT＝Third Wave Technologies

统计学分析.使用SAS版本8.2(The SAS Institute，Cary，NC，USA)进行统计学分析。分析方法包括Fisher精确检验、协方差分析(ANCOVA)、logistic回归、和Mantel-Haenzel检验来确定优势率和95％置信区间，在p＜0.05建立显著性。使用Abecasis & Cookson，Bioinformatics 16：182-3(2000)描述的GOLD(连锁不平衡的图解概述)进行连锁不平衡的计算。

人口统计比较.表3给出了总体临床研究中的患者和该基因型分析中包括的患者的人工统计学分类。在基因型群体和总患者群体中分布是类似的。通过种族对基因型的比较表明55种SNP中的39种在按种族的基因型分布中具有显著差异(p＜0.05 Fishers精确检验)。基于这些发现，决定将分析局限于白种人群体，其占所有患者的近90％，以防止种族对随后的基因型分析的混杂效果。此外，还将分析限于那些用替加色罗或者安慰剂治疗至少7天的那些意向治疗患者(共635名患者)。

表3

基因分型的患者的人口统计

所有ITT患者				ITT白种人，＞＝7天治疗
所有ITT患者				ITT白种人，＞＝7天治疗				所有患者		基因分型的		所有患者		基因分型的
N	(％)	N	(％)	N	(％)	N	(％)	所有患者		基因分型的		所有患者		基因分型的
N	(％)	N	(％)	N	(％)	N	(％)	性别男(SEX1C＝1)女(SEX1C＝2)种族白种人(RCE1C＝1)黑人(RCE1C＝2)东方人(RCE1C＝3)其它(RCE1C＝4)年龄类别＜65(AGECAT＝1)＞＝65(AGECAT＝2)治疗替加色罗6mg每日两次(TRTC＝B2)替加色罗2mg每日两次(TRTC＝C2)安慰剂(TRTC＝P)总的	1351213114296610411881604514504471348	(10.0)(90.0)(84.7)(7.1)(0.5)(7.7)(88.1)(11.9)(33.5)(33.4)(33.2)	866526464754064890240260238738	(11.7)(88.4)(87.5)(6.4)(0.7)(5.4)(87.8)(12.2)(32.5)(35.2)(32.3)	11310061119---9711483753753691119	(10.1)(89.9)(100.0)---(86.8)(13.2)(33.5)(33.5)(33.0)	70565635---54887204227204635	(11.0)(89.0)(100.0)---(86.3)(13.7)(32.1)(35.8)(32.1)

ITT＝意向治疗；N＝患者数；Trt＝治疗

总体应答率的比较.表4给出了对于总体患者群体和我们得到基因型数据的患者亚组(所有种族和仅白种人)，与安慰剂相比，每天两次每次6-mg替加色罗的初次功效终点的总体应答(4周后在基线上平均增加1或多次CSBM/周)。在所有情况中，用替加色罗治疗的个体与用安慰剂治疗的个体相比报导更高的应答率，尽管在雄性或老年群体中没有看到统计学显著差异。用较低剂量(2mg，每天两次)的替加色罗也看到该效果，尽管应答比用6mg每天两次剂量看到的应答低。此外，分析限于仅6mg每天两次替加色罗治疗的和安慰剂治疗的患者之间的比较。

表4

治疗4周后替加色罗6mg每天两次对比安慰剂的应答率；所有患者和基因分型的患者之间的比较

年龄	性别	患者数	％应答者	优势率	(95％CI)	p-值
		患者数	％应答者				Teg-6	Plac	总的	Teg-6	Plac
		所有患者(ITT，至少7天治疗)							总的	Teg-6	Plac
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有患者(ITT，至少7天治疗)							4393974239940	4383984037959	8777958277899	44％45％36％45％35％	25％26％23％25％27％	2.32.41.92.51.4	(1.8，3.1)(1.8，3.2)(0.7，5.1)(1.8，3.3)(0.6，3.4)	＜0.0001＜0.00010.1914＜0.00010.4048
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有白种人(ITT，至少7天治疗)							4393974239940	4383984037959	8777958277899	44％45％36％45％35％	25％26％23％25％27％	2.32.41.92.51.4	(1.8，3.1)(1.8，3.2)(0.7，5.1)(1.8，3.3)(0.6，3.4)	＜0.0001＜0.00010.1914＜0.00010.4048
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有白种人(ITT，至少7天治疗)							3753373833639	3693323731554	7446697565193	45％46％37％46％33％	25％25％24％24％30％	2.52.61.82.71.2	(1.8，3.4)(1.8，3.5)(0.7，4.9)(1.9，3.8)(0.5，2.9)	＜0.0001＜0.00010.2430＜0.00010.7051
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有基因分型的(ITT，至少7天治疗)							3753373833639	3693323731554	7446697565193	45％46％37％46％33％	25％25％24％24％30％	2.52.61.82.71.2	(1.8，3.4)(1.8，3.5)(0.7，4.9)(1.9，3.8)(0.5，2.9)	＜0.0001＜0.00010.2430＜0.00010.7051
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有基因分型的(ITT，至少7天治疗)							2342092521618	2342082620331	4684175141949	46％45％48％45％50％	24％24％27％23％29％	2.72.72.52.82.4	(1.8，4.0)(1.8，4.1)(0.8，8.1)(1.8，4.2)(0.7，8.2)	＜0.0001＜0.00010.1233＜0.00010.1463
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	基因分型的白种人(ITT，至少7天治疗)							2342092521618	2342082620331	4684175141949	46％45％48％45％50％	24％24％27％23％29％	2.72.72.52.82.4	(1.8，4.0)(1.8，4.1)(0.8，8.1)(1.8，4.2)(0.7，8.2)	＜0.0001＜0.00010.1233＜0.00010.1463
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	基因分型的白种人(ITT，至少7天治疗)							2041832118717	2041812317430	4083644436147	46％45％52％46％47％	25％24％30％24％30％	2.62.72.52.82.1	(1.7，4.0)(1.7，4.2)(0.7，8.6)(1.8，4.3)(0.6，7.1)	＜0.0001＜0.00010.1437＜0.00010.2473

Teg-6＝替加色罗6mg每天两次；Plac＝安慰剂；CI＝置信区间；ITT＝意向治疗；M+F＝男性和女性

对于我们基因分型的群体(治疗至少7天的白种人)，对替加色罗6mg每天两次的总体应答率为46％，相比安慰剂中为25％。计算的优势率等于2.6(95％CI：1.7-4.0)，优势率指出与安慰剂相比实现阳性应答给定治疗的可能性。这些值是高度统计学显著的并且与临床试验作为整体计算的值相当(见表4)。应答率在患者群体之间是相似的，只是在男性和老年人中例外，他们中的应答率在基因分型的亚群中较高。12周治疗后看到类似的结果，如表5中给出。

表5

治疗12周后替加色罗6mg每天两次对比安慰剂的应答率；所有患者和基因分型的患者之间的比较

年龄	性别	患者数	％应答者	优势率	(95％CI)	p-值
		患者数	％应答者				Teg-6	Plac	总的	Teg-6	Plac
		所有患者(ITT，至少7天治疗)							总的	Teg-6	Plac
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有患者(ITT，至少7天治疗)							4393974239940	4383984037959	8777958277899	46％46％43％46％40％	27％28％23％27％29％	2.32.22.62.31.6	(1.7，3.0)(1.7，3.0)(1.0，6.8)(1.7，3.2)(0.7，3.8)	＜0.0001＜0.00010.0513＜0.00010.2490
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有白种人(ITT，至少7天治疗)							4393974239940	4383984037959	8777958277899	46％46％43％46％40％	27％28％23％27％29％	2.32.22.62.31.6	(1.7，3.0)(1.7，3.0)(1.0，6.8)(1.7，3.2)(0.7，3.8)	＜0.0001＜0.00010.0513＜0.00010.2490
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有白种人(ITT，至少7天治疗)							3753373833639	3693323731554	7446697565193	47％47％45％48％38％	26％26％24％25％31％	2.52.52.52.81.4	(1.9，3.4)(1.8，3.5)(0.9，6.8)(2.0，3.9)(0.6，3.2)	＜0.0001＜0.00010.0651＜0.00010.4868
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有基因分型的(ITT，至少7天治疗)							3753373833639	3693323731554	7446697565193	47％47％45％48％38％	26％26％24％25％31％	2.52.52.52.81.4	(1.9，3.4)(1.8，3.5)(0.9，6.8)(2.0，3.9)(0.6，3.2)	＜0.0001＜0.00010.0651＜0.00010.4868
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	所有基因分型的(ITT，至少7天治疗)							2342092521618	2342082620331	4684175141949	47％47％52％47％56％	26％26％27％25％32％	2.62.52.92.62.6	(1.7，3.8)(1.7，3.8)(0.9，9.5)(1.7，4.0)(0.8，8.7)	＜0.0001＜0.00010.0694＜0.00010.1134
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	基因分型的白种人(ITT，至少7天治疗)							2342092521618	2342082620331	4684175141949	47％47％52％47％56％	26％26％27％25％32％	2.62.52.92.62.6	(1.7，3.8)(1.7，3.8)(0.9，9.5)(1.7，4.0)(0.8，8.7)	＜0.0001＜0.00010.0694＜0.00010.1134
所有的所有的所有的＜65＞＝65	M+F女男M+FM+F	基因分型的白种人(ITT，至少7天治疗)							2041832118717	2041812317430	4083644436147	49％48％57％49％53％	25％25％30％24％33％	2.82.83.03.02.3	(1.9，4.3)(1.8，4.4)(0.9，10.5)(1.9，4.7)(0.7，7.6)	＜0.0001＜0.00010.0774＜0.00010.1929

初次功效终点：4周治疗后的应答.作为第一遍分析，进行Fishers精确检验来评价作为表型函数的应答。对6mg每日两次替加色罗和安慰剂治疗组进行该检验。仅使用该标准，就为替加色罗治疗组在药物靶标(HTR4)中的4种SNP、钠通道SCNN1A中的一种SNP、Na-K-2Cl协同转运蛋白SLC12A2中的2种SNP中看到显著关联(p＜0.05，无多次检验校正)(见表6)。色氨酸2，3二加氧酶(TDO2)基因中额外的SNP(SNP 3746)也表明替加色罗组中显著的p值(p＜0.01)。在安慰剂治疗组中没有看到统计学显著关联。

表6

作为12种SNP的基因型函数的应答，表明4周治疗后与安慰剂相比对替加色罗6mg每日两次的不同应答

基因(PG ID)	基因型	患者数		％应答者		优势率(95％CI)	p-值T6v P	p-值：R x Geno
		患者数		％应答者				p-值：R x Geno		T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P
		所有基因型	20410873149485181047720945618997820104782096782492842475972734907213511391245129	20410976119283259391197664209285219189208789248094265812021371085719681142060108	408(100％)217(55％)149(38％)25(6％)186(47％)168(42％)43(11％)197(49％)168(42％)39(10％)170(52％)120(37％)38(12％)191(48％)163(41％)41(10％)195(49％)167(42％)40(10％)183(46％)167(42％)48(12％)172(43％)178(45％)50(13％)133(33％)217(55％)48(12％)71(18％)198(50％)129(32％)32(8％)119(29％)253(63％)32(9％)105(28％)237(63％)			46％43％47％71％46％44％67％42％44％75％43％46％78％43％45％70％43％44％75％46％42％67％39％46％71％47％40％63％62％47％36％69％27％51％75％27％52％	25％24％25％18％24％28％20％22％26％26％20％23％20％21％27％29％22％27％30％21％28％29％19％30％23％26％25％19％24％26％23％16％25％26％15％30％22％	T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P	2.6(1.7，4.0)2.4(1.3，4.2)2.6(1.3，5.2)11.3(1.6，76.8)2.7(1.4，5.0)2.0(1.1，3.8)8.0(2.0，32.0)2.7(1.4，5.0)2.2(1.2，4.2)8.4(2.0，35.4)3.0(1.5，6.0)2.8(1.3，6.2)14.0(2.9，66.7)3.0(1.6，5.6)2.2(1.1，4.2)5.8(1.5，22.4)2.7(1.4，5.1)2.1(1.1，4.0)7.0(1.7，28.2)3.2(1.7，6.3)1.9(1.0，3.6)4.9(1.4，16.5)2.8(1.4，5.6)2.0(1.1，3.8)8.1(2.3，28.8)2.5(1.2，5.3)2.0(1.1，3.6)7.2(1.9，27.6)5.0(1.8，14.0)2.5(1.4，4.5)1.9(0.9，4.2)12.0(2.2，66.0)1.1(0.5，2.6)2.9(1.7，5.0)17.0(2.8，102)0.8(0.4，2.0)3.8(2.1，6.7)	＜0.00010.00340.00610.00950.00180.03290.00230.00190.01600.00270.00160.00830.00040.00080.01800.00880.00170.02480.00490.00030.05490.01010.00360.02250.00080.01440.01700.00260.00150.00240.10360.00250.7640＜0.00010.00080.7096＜0.0001	0.12170.20370.02600.02410.09220.02860.10650.02150.11310.04620.00300.0017	0.96270.72170.71820.89380.53870.64310.44870.25580.88420.92830.69140.3370
AQP3(1838)HTR3B(3755)HTR4(1746)HTR4(3743)HTR4(3747)HTR4(3753)HTR4(3754)HTR4(3756)MLN(1783)SCNN1A(3806)SLC12A2(1842)SLC12A2(3801)	CCCGGGAAACCCCCCTTTAAACCCAAATTTCCCTTTAAATTTAAACCCCCCTTTGGGTTTAAAGGGCCCTTT	所有基因型

应答＝在基线上平均增加1或多次CSBMs/周；具有至少7天治疗的ITT白种人；PG ID＝唯一的内部SNP标识符；T6＝替加色罗6mg每日两次；P＝安慰剂；CI＝置信区间；群体％＝具有该基因型群体的百分数；p-值：Rx geno＝每个治疗组内按基因型的应答率之间显著差异性检验的P-值(注意到对于多次检验没有调整p值)；表明最佳应答的基因型以粗体显示。

我们还想知道我们是否可以鉴定表现出高于对替加色罗的平均应答和在替加色罗和安慰剂治疗患者之间的应答中差异最大(如通过优势率确定)的SNP。为替加色罗使用至少60％应答率的截断值和5或者更大的优势率，我们在4周治疗后鉴定了55种SNP中的12种SNP满足这些标准。这些“高应答者”SNP包括药物靶标HTR4中的6种，HTR3B中1种，Na-K-2Cl协同转运蛋白(SLC12A2)中的两种，水通道蛋白AQP3中的1种，促胃动素(MLN)中的1种，和非电压门控Na通道SCNN1A中的1种(见表6)。有趣的是注意到四种基因(AQP3、HTR3B、MLN和SLC12A2)的“高应答者”基因型除了显示出对替加色罗的较高应答率外，还显示出在安慰剂治疗的个体中趋向于较低应答率。

在所有情况中，少数纯合基因型显示出高于对替加色罗的平均应答，并且对于个体SNP，这占群体的仅6-18％。为了增加潜在的“高应答者”数目，通过将个体分成两组进行进一步评价：具有这些“高应答者”SNP的一种或两种的那些个体，和不具有“高应答者”SNP的个体。根据该模型，约半数患者由于存在12种鉴定的SNP的至少一种而被标记为潜在的“高应答者”，而另外一半没有SNP并且将预期也不应答。使用该12种SNP模型的分析结果与性别和年龄的分类在表7中给出。

表7

治疗4周后按基因型的应答，具有12种“高应答者”SNP的一种或多种的个体与不具有SNP的那些个体按照年龄和性别进行的比较

性别(年龄)	12种SNP数目	患者数			％应答者		优势率(95％CI)	p-值T6v P	p-值：R x Geno
		患者数			％应答者				p-值：R x Geno		T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P
		M+F(所有的)女(所有的)男(所有的)M+F(＜65)M+F(＞＝65)	0-1201-120-1201-120-1201-120-1201-120-1201-12	204105991839588211011187988917710	20490114181791022311121747698301416	408(100％)195(48％)213(52％)364(100％)174(48％)190(52％)44(100％)21(48％)23(52％)361(100％)174(48％)187(52％)47(100％)21(45％)26(55％)			46％31％62％45％33％59％52％20％82％46％33％61％47％14％70％	25％27％23％24％24％24％30％45％17％24％25％22％30％36％25％	T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P	2.6(1.7，4.0)1.3(0.7，2.3)5.4(3.0，9.9)2.7(1.7，4.2)1.5(0.8，3.0)4.7(2.5，8.8)2.5(0.7，8.6)0.3(0.0，2.1)22.5(2.6，195)2.8(1.8，4.3)1.5(0.7，2.8)5.3(2.8，10.1)2.1(0.6，7.1)0.3(0.0，3.2)7.0(1.2，40.8)	＜0.00010.4672＜0.0001＜0.00010.2143＜0.00010.14370.22780.0022＜0.00010.2727＜0.00010.24730.31730.0267	＜0.00010.00040.00890.00010.0498	0.62321.00000.19300.72150.6944

应答＝在基线上平均增加1或多次CSBMs/周；具有至少7天治疗的ITT白种人；PG ID＝唯一的内部SNP标识符；T6＝替加色罗6mg每日两次；P＝安慰剂；CI＝置信区间；群体％＝具有该基因型群体的百分数；p-值：Rx geno＝每个治疗组内按基因型的应答率之间显著差异性检验的P-值(注意到对于多次检验没有调整p值)；表明最佳应答的基因型以粗体显示。注意p值有可能有偏，因为它们使用用于得到该模型的相同数据计算。

使用该模型，我们发现具有12种SNP的一种或多种的基因分型群体的52％对替加色罗的总体应答率为62％，相比对安慰剂的总体应答率为23％，优势率为5.4(95％CI：3.0-9.9)。这与没有12种SNP的任一种的患者相反，这些患者显示出对替加色罗的应答率与对安慰剂相比无显著差异(分别为31％和27％)，优势率为1.3(95％CI：0.7-2.3)。尤其有趣的是注意到我们还可以证明对于具有12种SNP的至少一种的个体，男性群体以及老年群体显示出对替加色罗的显著应答，对于作为整体的研究不能证明该显著应答。

除了上述6种基因外，还有一种额外的似乎有趣的候选基因(TPH1；色氨酸羟化酶)。如表8中所示，来自该基因的两种测定之一的一种基因型(SNP-1756为GG，SNP-3784为TT)的优势率＞5。这主要是由于与对替加色罗的高于平均值的应答相对，15-16％的低安慰剂应答率。然而，有趣的是注意到对相反等位基因纯合的个体对替加色罗的应答率与安慰剂相比没有显著差异。而且，不像上述12种“高应答者”SNP，对于TPH1，主要是纯合的等位基因显示出较好的总体应答，占群体的35-36％。通过存在或不存在最初的12种“高应答者”SNP或者包括额外的2种2 TPH1 SNP分类的应答率和优势率的比较分别在图1和图2中显示。

表8

4周治疗后TPH1基因的基因型应答

基因(PG ID)	基因型	患者数		％应答者		优势率(95％CI)	p-值T6v P	p-值：R x Geno
		患者数		％应答者				p-值：R x Geno		T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P
		所有基因型	204768633348676	2046110233349665	408(100％)137(35％)188(48％)66(17％)68(17％)182(47％)141(36％)			46％51％48％36％32％49％50％	25％16％27％27％24％28％15％	T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P	2.6(1.7，4.0)5.4(2.4，12.1)2.4(1.3，4.4)1.5(0.5，4.3)1.6(0.5，4.5)2.4(1.3，4.5)5.5(2.4，12.4)	＜0.0001＜0.00010.00430.43140.42090.0041＜0.0001	0.35120.1935	0.24760.1686
TPH1(1756)TPH1(3784)	GGGTTTCCCTTT	所有基因型
TPH1(1756)TPH1(3784)	GGGTTTCCCTTT	14种SNP的0种＞＝14种SNP的1种				69135	63141			132(32％)276(68％)	32％53％	30％22％	1.1(0.5，2.3)4.1(2.4，6.8)	0.8312＜0.0001	0.0047	0.2214

应答＝在基线上平均增加1或多次CSBMs/周；具有至少7天治疗的ITT白种人；PG ID＝唯一的内部SNP标识符；T6＝替加色罗6mg每日两次；P＝安慰剂；CI＝置信区间；群体％＝具有该基因型群体的百分数；p-值：Rxgeno＝每个治疗组内按基因型的应答率之间显著差异性检验的P-值(注意到对于多次检验没有调整p值)；包括最初的12种SNP加上2种TPH1 SNP；表明最佳应答的基因型以粗体显示。注意p值有可能有偏，因为它们使用用于得到该模型的相同数据计算。

对于具有14种SNP的至少一种的那些个体，尽管包括2种额外的TPHSNP减小了对替加色罗的总体应答，但是与最初的12种“高应答者”SNP相比，它将该类别中患者的百分比增加到68％。此外，对于32％的不具有这些SNP的任一种的个体，它还减小了治疗和安慰剂之间应答率的差异，从而更好地定义明显的“非应答者”群体。

二次功效终点：12周治疗后应答。使用12周治疗后在基线上平均增加1或多次CSBM/周的二次功效终点，进行与上面相同的比较。12种个体“高应答者”SNP的结果在表9中给出，使用具有或没有这12种SNP的至少一种的个体比较的结果在表10中给出。

表9

作为12种SNP的基因型函数的应答，显示出12周治疗后与安慰剂相比替加色罗6mg每天两次的不同应答

基因(PG ID)	基因型	患者数		％应答者		优势率(95％CI)	p-值T6v P	p-值：R x Geno
		患者数		％应答者				p-值：R x Geno		T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P
		所有基因型	20410873149485181047720945618997820104782096782492842475972734907213511391245129	20410976119283259391197664209285219189208789248094265812021371085719681142060108	408(100％)217(55％)149(38％)25(6％)186(47％)168(42％)43(11％)197(49％)168(42％)39(10％)170(52％)120(37％)38(12％)191(48％)163(41％)41(10％)195(49％)167(42％)40(10％)183(46％)167(42％)48(12％)172(43％)178(45％)50(13％)133(33％)217(55％)48(12％)71(18％)198(50％)129(32％)32(8％)119(29％)253(63％)32(9％)105(28％)237(63％)			49％47％49％64％49％47％67％44％49％70％48％52％78％41％54％65％45％50％70％50％45％63％39％54％71％49％44％67％62％49％44％54％47％50％58％49％50％	25％25％28％18％24％28％28％20％27％42％20％19％30％21％27％38％21％27％40％20％29％38％20％28％35％28％27％14％22％27％26％16％25％28％15％28％26％	T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P	2.8(1.9，4.3)2.7(1.5，4.8)2.5(1.3，5.0)8.1(1.2，53.2)3.0(1.6，5.7)2.3(1.2，4.4)5.1(1.4，19.1)3.1(1.6，5.8)2.6(1.4，4.9)3.2(0.9，12.0)3.7(1.9，7.5)4.7(2.1，10.5)8.2(1.9，35.4)2.7(1.4，5.2)3.1(1.6，6.0)3.0(0.8，10.8)3.1(1.7，5.9)2.7(1.4，5.2)3.5(0.9，13.0)4.1(2.1，8.0)2.0(1.0，3.7)2.8(0.9，8.9)2.6(1.3，5.1)3.0(1.6，5.6)4.6(1.4，15.2)2.6(1.2，5.3)2.2(1.2，3.9)12.0(2.8，51.7)5.9(2.1，16.6)2.6(1.4，4.7)2.2(1.1，4.7)6.2(1.2，32.3)2.7(1.2，5.8)2.5(1.5，4.3)7.9(1.5，43)2.4(1.1，5.4)2.9(1.7，5.0)	＜0.00010.00060.00670.02390.00040.00980.01280.00040.00360.08300.00010.00020.00370.00210.00050.08880.00040.00230.0597＜0.00010.03660.08650.00660.00040.01120.01140.00660.00030.00060.00140.03430.02480.01260.00050.01170.03180.0001	0.51980.32100.10780.06330.08410.12200.32860.01200.12530.25290.91650.9079	0.82700.83180.12370.56010.23910.17720.13400.26480.49670.86400.58070.5354
AQP3(1838)HTR3B(3755)HTR4(1746)HTR4(3743)HTR4(3747)HTR4(3753)HTR4(3754)HTR4(3756)MLN(1783)SCNN1A(3806)SLC12A2(1842)SLC12A2(3801)	CCCGGGAAACCCCCCTTTAAACCCAAATTTCCCTTTAAATTTAAACCCCCCTTTGGGTTTAAAGGGCCCTTT	所有基因型

应答＝在基线上平均增加1或多次CSBMs/周；具有至少7天治疗的ITT白种人；PG ID＝唯一的内部SNP标识符；T6＝替加色罗6mg每日两次；P＝安慰剂；CI＝置信区间；群体％＝具有该基因型群体的百分数；p-值：R xgeno＝每个治疗组内按基因型的应答率之间显著差异性检验的P-值(注意到对于多次检验没有调整p值)；表明最佳应答的基因型以粗体显示。

表10

12周治疗后按基因型的应答，具有12种“高应答者”SNP的1种或多种的个体对比不具有SNP的那些个体按年龄和性别的比较

性别(年龄)	12种SNP数目	患者数			％应答者		优势率(95％CI)	p-值T6v P	p-值：R x Geno
		患者数			％应答者				p-值：R x Geno		T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P
		M+F(所有的)女(所有的)男(所有的)M+F(＜65)M+F(＞＝65)	0-1201-120-1201-120-1201-120-1201-120-1201-12	204105991839588211011187988917710	20490114181791022311121747698301416	408(100％)195(48％)213(52％)364(100％)174(48％)190(52％)44(100％)21(48％)23(52％)361(100％)174(48％)187(52％)47(100％)21(45％)26(55％)			49％36％63％48％36％61％57％40％73％49％37％62％53％29％70％	25％30％22％25％28％23％30％45％17％24％26％22％33％50％19％	T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P	2.8(1.9，4.3)1.3(0.7，2.4)6.0(3.3，10.9)2.8(1.8，4.4)1.4(0.8，2.8)5.5(2.9，10.3)3.0(0.9，10.5)0.8(0.1，4.5)13.3(1.8，100)3.0(1.9，4.7)1.6(0.8，3.1)5.6(3.0，10.6)2.3(0.7，7.6)0.4(0.1，2.8)10.1(1.6，64.0)	＜0.00010.3619＜0.0001＜0.00010.2656＜0.00010.07740.80550.0081＜0.00010.1457＜0.00010.19290.36130.0104	0.00030.00070.19840.00070.1534	0.19960.48860.19300.59480.1216

应答＝在基线上平均增加1或多次CSBMs/周；具有至少7天治疗的ITT白种人；PG ID＝唯一的内部SNP标识符；T6＝替加色罗6mg每日两次；P＝安慰剂；CI＝置信区间；群体％＝具有该基因型群体的群体百分数；p-值：R x geno＝每个治疗组内按基因型的应答率之间显著差异性检验的P-值(注意到对于多次检验没有调整p值)；表明最佳应答的基因型以粗体显示。注意p值有可能有偏，因为它们使用用于得到该模型的相同数据计算。

通常，在12周时的发现与治疗4周后的发现相似，尽管这些发现不是统计学上显著的(由于不明的原因)。有趣的是注意到尽管药物靶标HTR4的“高应答者”基因型对于替加色罗治疗的患者保持高于平均值(＞60％)，但是对于安慰剂治疗的个体，这现在也伴随着高于平均值的应答率(30-40％)。对于4周应答，AQP、MLN和SLC12A2“高应答者”基因型除了对替加色罗的高于平均值应答，继续表现出低于平均值的安慰剂应答。对于2种TPH1 SNP再次看到该对安慰剂的较低应答，如表11中说明。

表11

12周治疗后对于TPH基因按照基因型的应答

基因(PG ID)	基因型	患者数		％应答者		优势率(95％CI)	p-值T6 v P	p-值：R x Geno
		患者数		％应答者				p-值：R x Geno		T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P
		所有基因型	204768633348676	2046110233349665	408(100％)137(35％)188(48％)66(17％)68(17％)182(47％)141(36％)			49％51％51％45％41％52％51％	25％15％30％27％26％30％15％	T6	P	总的(％)	T6	P	T6	P	2.8(1.9，4.3)6.1(2.6，14.1)2.4(1.3，4.4)2.2(0.8，6.2)1.9(0.7，5.4)2.5(1.4，4.7)5.8(2.6，13.0)	＜0.0001＜0.00010.00390.12760.20330.0025＜0.0001	0.84390.5798	0.07000.0864
TPH1(1756)TPH1(3784)	GGGTTTCCCTTT	所有基因型
TPH1(1756)TPH1(3784)	GGGTTTCCCTTT	14种SNP的0种＞＝14种SNP的1种				69135	63141			132(32％)276(68％)	39％54％	35％21％	1.2(0.6，2.4)4.4(2.6，7.4)	0.6184＜0.0001	0.0543	0.0550

应答＝在基线上平均增加1或多次CSBMs/周；具有至少7天治疗的ITT白种人；PG ID＝唯一的内部SNP标识符；T6＝替加色罗6mg每日两次；P＝安慰剂；CI＝置信区间；群体％＝具有该基因型群体的群体百分数；p-值：R x geno＝每个治疗组内按基因型的应答率之间显著差异性检验的P-值(注意到对于多次检验没有调整p值)；14种SNP包括最初的12种SNP加上两种TPH1 SNP；表明最佳应答的基因型以粗体显示。注意p值有可能有偏，因为它们使用用于得到该模型的相同数据计算。

通过logistic回归分析。使用logistic模型进行进一步分析以考虑性别和年龄以及治疗和“高应答者”基因型状态。使用12SNP或14SNP模型，4周或12周治疗后，这些分析的结果在表12中给出。尽管在这些模型的每一个中包括年龄和性别似乎对于应答没有显著影响，但是治疗与基因型状态的组合对于结果具有高度显著的影响，比仅治疗更是显著。与使用所有14种SNP的模型相比，使用含有最初12种“高应答者”SNP的模型的该影响稍微更显著。

表12

使用“高应答者”基因型分类、性别、年龄和治疗对应答的 Logistic回归分析

RESP4：4周治疗后在基线上增加/或多次CSBM/周
RESP4：4周治疗后在基线上增加/或多次CSBM/周								模型包括6种基因中的12种SNP				模型包括7种基因中的14种SNP
作用	DF	Wald卡方	Pr＞ChiSq	作用	DF	Wald卡方	Pr＞ChiSq	模型包括6种基因中的12种SNP				模型包括7种基因中的14种SNP
作用	DF	Wald卡方	Pr＞ChiSq	作用	DF	Wald卡方	Pr＞ChiSq	TRTCAGECATSEX1CHR_12SNPSTRTC^＊AGECATTRTC^＊SEX1CTRTC^＊HR_12SNPS	1111111	3.970.030.615.750.380.0010.88	0.04630.87300.43490.01650.53730.98520.0010	TRTCAGECATSEX1CHR_14SNPsTRTC^＊AGECATTRTC^＊SEX1CTRTC^＊HR_14SNPs	1111111	2.620.120.531.080.110.007.81	0.10540.72520.46490.29870.74320.96740.0052
RESP12：12周治疗后在基线上增加/或多次CSBM/周									1111111	3.970.030.615.750.380.0010.88	0.04630.87300.43490.01650.53730.98520.0010		1111111	2.620.120.531.080.110.007.81	0.10540.72520.46490.29870.74320.96740.0052
RESP12：12周治疗后在基线上增加/或多次CSBM/周								模型包括6种基因中的12种SNP				模型包括7种基因中的14种SNP
作用	DF	Wald卡方	Pr＞ChiSq	作用	DF	Wald卡方	Pr＞ChiSq	模型包括6种基因中的12种SNP				模型包括7种基因中的14种SNP
作用	DF	Wald卡方	Pr＞ChiSq	作用	DF	Wald卡方	Pr＞ChiSq	TRTCAGECATSEX1CHR_12SNPSTRTC^＊AGECATTRTC^＊SEX1CTRTC^＊HR_12SNPS	1111111	5.650.330.532.340.380.0711.79	0.01750.56630.46770.12600.53820.79690.0006	TRTCAGECATSEX1CHR_14SNPsTRTC^＊AGECATTRTC^＊SEX1CTRTC^＊HR14_SNPs	1111111	4.110.480.480.020.120.047.79	0.04260.48810.48670.89130.73100.83250.0053

TRTC＝治疗类别(替加色罗6-mg每日两次或安慰剂)；SEX1C＝性别；AGECAT＝年龄类别(<or>＝65)，HR_12SNPS＝通过存在或不存在12种“高应答者”SNP的一种或多种分类；HR_14SNPS＝通过7种基因中存在所有14种SNP分类；^＊＝2个参数之间的相互作用；Pr＞ChiSq＝与卡方检验相关的p-值(如果p＜0.05则显著影响)

额外的二次终点.除了上面的评估外，还从每周日记评估评价5个额外的二次功效终点。这些包括每周对肠排便习惯满意度的改变、令人烦恼的便秘、令人烦恼的腹部气胀、令人烦恼的腹部疼痛和总体便秘缓解。表13给出了分析的结果，其比较了12周治疗(替加色罗6-mg每日两次对比安慰剂)结束时这些参数的总体改变和它们是否具有12种“高应答者”SNP的一种或多种。使用这些评估的基线值作为定量共变量，应用ANCOVA模型。

对于组合的所有患者，与安慰剂相比，用替加色罗治疗导致更好的结果(较低的值表明更好的应答)。当通过“高应答者”基因型评价时，对于没有12种SNP的任一种的个体，没有治疗差异(“T6 vs.P：0 SNPs”)。然而，具有12种SNP的一种或多种的个体对于所有5种评估显示出对于替加色罗比对安慰剂的明显更大的应答(“T6 vs.P：＞＝1 SNPs”)。而且，在替加色罗治疗的群体中，在具有或没有12种SNP的至少一种的个体之间，对于令人烦恼的便秘、总体便秘缓解和对肠排便习惯的总体满意度的结果有显著差异。在有或者没有1种或多种“高应答者”SNP的个体之间，基线得分无显著差异。从而，这些数据与为基于CSBM的次数的初次功效终点看到的差别应答相一致。

表13

12周治疗后每周日记评估的ANCOVA分析；通过治疗和存在12种 “高应答者”SNP的一种或多种的比较

功效变量	治疗	N	LS平均值			p-值(ANCOVA)
			LS平均值			p-值(ANCOVA)				所有基因型	12种SNP的0种	＞＝12种SNP的1种	0vs＞＝1SNPs	T6vsP：All	T6vsP：0SNPs	T6vsP：＞＝1SNPs
			令人烦恼的腹部气胀	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	2.772.302.09	2.782.282.18	2.752.322.00	0.74550.77220.1148	所有基因型	12种SNP的0种	＞＝12种SNP的1种	0vs＞＝1SNPs	T6vsP：All	T6vsP：0SNPs	T6vsP：＞＝1SNPs	0.0092	0.3769	0.0047
令人烦恼的腹部疼痛	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	令人烦恼的腹部气胀	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	2.772.302.09	2.782.282.18	2.752.322.00	0.74550.77220.1148	2.342.041.84	2.342.001.90	2.342.061.77	0.98530.59160.2435	0.0132	0.3859	0.0084	0.0092	0.3769	0.0047
令人烦恼的腹部疼痛	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	令人烦恼的便秘	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	2.802.412.07	2.812.432.25	2.792.401.87	0.81940.78230.0006	2.342.041.84	2.342.001.90	2.342.061.77	0.98530.59160.2435	0.0132	0.3859	0.0084	＜0.0001	0.1255	＜0.0001
总体便秘缓解	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	令人烦恼的便秘	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	2.802.412.07	2.812.432.25	2.792.401.87	0.81940.78230.0006	2.752.352.08	2.762.342.20	2.742.351.95	0.77090.90020.0139	0.0003	0.1934	＜0.0001	＜0.0001	0.1255	＜0.0001
总体便秘缓解	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	对排便习惯的满意度	基线12-wk安慰剂12-wk Teg-6mg	398198200	3.092.642.33	3.112.652.48	3.062.632.17	0.60180.86850.0068	2.752.352.08	2.762.342.20	2.742.351.95	0.77090.90020.0139	0.0003	0.1934	＜0.0001	0.0003	0.1719	＜0.0001

LS＝最小平方均值；N＝观察次数；Teg-6＝替加色罗6-mg每日两次。

等位基因频率.表14显示了基因分型的白种人群体的12种“高应答者”SNP的次要等位基因频率，用于与通过ABI为白种人的参考小组给予的次要等位基因频率比较。在我们的慢性便秘群体和参考样品之间的等位基因频率中似乎没有任何大的差异。

表14

12种“高应答者”SNP的等位基因频率

PG基因座ID	基因符号	次要等位基因频率
		次要等位基因频率			等位基因	E2302(Cauc)	ABI ref(Cauc)
		183837551746374337473753375437561783380618423801	AQP3HTR3BHTR4HTR4HTR4HTR4HTR4HTR4MLNSCNN1ASLC12A2SLC12A2	GCTCTTTCTGAC	等位基因	E2302(Cauc)	ABI ref(Cauc)	0.250.320.300.300.310.310.330.350.390.430.220.23	0.280.260.320.300.300.330.360.31N/A0.480.220.22

ABI ref＝来自Applied Biosystems Inc.参考样品的次要等位基因频率；Cauc＝白种人；E2302＝当前的基因分型研究(CHTF919E2302)；N/A＝对于白种人群体得不到

连锁不平衡的评价.在12种“高应答者”SNP中，6种位于药物靶标HTR4内。这些SNP的所有都位于内含子区域内，跨越近100kb的基因组DNA(见图3)。进一步分析表明这6种SNP都非常接近连锁不平衡，对于四种SNP(1746、3754、3753和3743)，D’值＞0.8，对于SNPs 3756和3747，D’＞0.6(见图3)。Na-K-2Cl协同转运蛋白SLC12A2的2种“高应答者”SNP也与2种TPH1 SNP一样，相互非常接近LD。

与安慰剂相比对替加色罗的差别应答有关的基因的细节.最初的SNP“高应答者”基因型模型是基于存在于共6种不同的基因中的12种SNP：6种在HTR4中，2种在SLC12A2中，HTR3B、MLN、AQP3和SCNN1A中各1种。第二种14SNP模型包括TPH1基因中额外的两种SNP。关于这些基因的每一种以及它们在便秘和对替加色罗的应答中的作用的进一步细节在下文讨论。

HTR4：5-HT₄受体(药物靶标).HTR4是与腺苷酸环化酶偶联的7次跨膜G-蛋白偶联的受体，其存在于整个GI肠道中以及许多其他组织如脑中。已经鉴定了主要位于该基因的5’末端的许多不同外显子的可变剪接导致的所表达的5-HT₄受体的几种变体。除了编码跨膜结构域4和5之间的14个氨基酸插入的外显子h外，可变剪接的外显子a-g导致仅在C-末端结构域不同的蛋白质。Bender E等人，Neurochem.74(2)：478-89(2000)。不同的HTR4剪接变体表现不同的组织特异性以及生理活性中的不同。Bender E等人，Neurochem.74(2)：478-89(2000)；Blondel O等人，JNeurochem.70(6)：2252-61(1998)；Claeysen S等人，Mol Pharmacol；55：910-920(1999)。

使用图4作为参考，6种“高应答者”HTR4 SNPs位于下面的位置：SNPs3753、3743、3756和3747位于外显子2的下游的内含子1中；SNP 3754位于外显子3和4之间，SNP 1746位于外显子4和5之间，外显子h的上游。尽管这些SNP没有一个位于编码区中或者之间在剪接位点中，但是可能它们与另一个待鉴定的具有功能重要性的SNP密切LD。由于这些SNP之间大区域的连锁不平衡(见图3)，不可能预测该推定的功能SNP将位于何处。取决于该位置，许多功能结果是可能的，如：该基因的启动子区中将影响总体表达的改变；剪接位点中将影响哪种剪接变体被表达的改变，或者可能地该蛋白质的氨基酸序列中可以影响所表达的蛋白质的活性的改变。将需要额外的研究来确定这些情况中的哪一种(如果存在)是真实的。

HTR3B：5-HT₃受体B.HTR3B编码5-HT₃受体的B亚基，5-HT₃受体是配体控制的离子通道的Cys环家族的成员，该家族包括烟碱性乙酰胆碱(nAch)、GABA_A和甘氨酸受体。Reeves DC & Lummis SC，Mol.Membr.Biol.19：11-26(2002)。至少三种不同的5-HT3受体亚基是已知的(A、B和C)，并且功能受体是含有放在一起的5个这些亚基的寡聚体，通常是A和B的组合。然而，已经描述了由仅5个HT_3A亚基组成的功能性均五聚体受体。每个亚基由4个跨膜结构域组成，证明通道的孔由M2结构域形成。该受体作为相对非选择性阳离子通道并且在激活后导致神经元中快速的去极化应答。

确定了HTR3B中一个SNP的基因型(SNP 3755)并且其与对替加色罗的差别应答有关。该SNP编码外显子5中的错义突变，其导致氨基酸位置129处的氨基酸从酪氨酸改变为丝氨酸，其位于细胞外N-末端结构域内。研究已经表明5-HT_3A受体亚基的细胞外结构域中的几个酪氨酸残基在通道的配体结合或者控制中，以及在受体装配和结构中起重要作用。Price KL& Lummis SC，J Biol Chem.279(22)：23294-301(2004)。该SNP还显示出与编码跨膜结构域的该基因的3’区高度连锁不平衡(SNP Browser Version1.0，Applied Biosystems Inc.)。

MLN：促胃动素.促胃动素是主要由小肠的内分泌细胞分泌的作为胃肠收缩调节剂的肽激素。人促胃动素基因(MLN)由5个外显子组成并且编码115个氨基酸前激素原，其包括22个氨基酸的促胃动素激素肽、25个氨基酸的信号肽，和C-末端促胃动素结合的肽(MAP)。外显子2和3编码信号肽和22个氨基酸的促胃动素肽，而C-末端MAP主要由外显子3和4编码。Daikh DI等人，DNA.8(8)：615-21(1989)。与当前分析中较高应答有关的促胃动素SNP(SNP 1783)是错义突变，其用丙氨酸代替前激素原的氨基酸位置15的缬氨酸。这将该突变置于该基因的信号肽区域中相对于活性促胃动素肽的位置-11中。有趣的是，该多态性在物种间保守。DepoortereI等人，Peptides.18(10)：1497-503(1997)。信号肽序列中的改变可以影响该蛋白质的亚细胞定位，其将影响活性促胃动素肽的分泌，或者可能完全阻止该活性肽从前体的正确分泌。在具有自发性便秘[Sjolund K等人，ScandJ Gastroenterol.21(8)：914-8(1986)]和慢通过性便秘[Peracchi M等人，Scand J Gastroenterol.34(1)：25-8(1999)]的患者中，也观察到血浆中分泌的促胃动素的水平改变。已经报导了炎性肠病患者中促胃动素信号肽多态性之间的关联。Annese V等人，Dig.Dis.Sci.43(4)：715-9(1998)。然而，没有报导相关水平的血浆促胃动素。

AQP3：水通道蛋白3.水通道蛋白3(AQP3)是水通道的水通道蛋白家族的成员。流体分泌和吸收是胃肠道和水通道蛋白的主要功能，它们跨上皮转运水的能力在该过程中起关键作用。AQP3在许多组织，包括胃肠道、肾、肝、胰腺、肺、外周淋巴细胞、脾脏和前列腺中表达。Ishibashi K等人，Genomics 27：352-354(1995)。除了它的水通道功能，已经发现水通道蛋白3促进非离子小溶质如尿素和甘油的转运，但是转运的程度较小。在直肠中，AQP3在调节粪便脱水量中起关键作用，从而影响粪便的硬度或软度，其是与慢性便秘相关的症状之一。Kierbel A等人，Pflugers Arch.440(4)：609-18(2000)。

AQP3基因由跨约6kb的6个外显子组成，编码区分布在6个外显子的每一个中。Inase N等人，J.Biol.Chem.270(30)：17913-6(1995)。与较高的替加色罗应答有关的AQP3 SNP(SNP 1838)位于内含子1中。没有功能显著性与该SNP有关，尽管它可以与接近外显子1的区域的还没有定义的功能SNP连锁。沿着该基因的长度几乎没有显示连锁不平衡，因此，它不可能与位于外显子5和内含子5的剪接接头的已知的功能突变关联。Roudier N等人，J Biol Chem.277(48)：45854-9(2002)。该突变导致翻译的基因中早熟的终止密码子，其然后编码非功能蛋白质。有趣的是，尽管对于该等位基因纯合的个体(AQP3_null)在它们的血红细胞中不显示出降低的甘油转运，但是没有其他报导的临床综合征与该AQP3缺陷相关，至少在正常条件下是如此。

SLC12A2：Na-K-2Cl协同转运蛋白1(NKCC1).SLC12A2是溶质载体家族的成员，其功能是将钠、钾和氯离子一起以电中性形式转运穿过细胞膜。该Na-K-2Cl协同转运蛋白也称作NKCC1，在多种细胞类型(上皮的和非上皮的)中表达。Russell JM，Physiol Rev 80：211-276(2000)。在上皮细胞，如在大肠中，NKCC1位于基底外侧膜并且主要用于为细胞提供将从顶面分泌的氯离子。上皮Cl分泌造成粘膜表面水合作用，其对于肠道的流体组成具有很大影响。在非上皮细胞中，NKCC1蛋白质作为调节细胞体积中的关键因素。Lytle C，.J.Biol.Chem 272：15069-15077(1997)。

NKCC1最初从鲨鱼直肠腺克隆[Xu J-C等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2201-2205(1994)]，并且之后很快从直肠来源的细胞系克隆了人基因。Payne JA等人，J Biol Chem.270(30)：17977-85(1995)。表达的蛋白质由1212个氨基酸组成，具有12个跨膜结构域，其侧翼为细胞内N-和C-末端结构域。Hebert SC等人，Pflugers Arch.447(5)：580-93(2004)。尽管没有人类疾病直接与NKCC1基因缺陷连锁，但是该基因中的突变已经与小鼠中耳聋[Dixon MJ等人，Hum.Mol.Genet.8(8)：1579-84(1999)]和精子发生失败[Pace AJ等人，J.Clin.Invest.105(4)：441-50(2000)]有关。这里，我们鉴定了该基因中与对替加色罗的更高的应答有关的两种SNP：SNP3801，位于内含子中，和SNP 1842，位于该基因的相反末端的3’UTR中。

SCNN1A：非电压门控的钠通道，α.SCNN1A基因编码α亚基非电压门控的阿米洛利敏感的钠通道，通常称作上皮钠通道或者ENaC。该通道是末端结肠中钠吸收的主要途径之一，从而在保持肠的流体组成中起关键作用。尽管仅α亚基就能够形成传导钠的功能通道，但是体内功能通道由α、β和γ亚基的组合组成。

SCNN1A基因由跨染色体12p13上17kb的13个外显子组成，编码区在外显子2中开始并且在外显子13中结束。Ludwig M等人，Hum Genet.102(5)：576-81(1998)。“高应答者”SNP 3806位于内含子5中SCNN1A基因中间附近。再次，在整个基因间存在高度的连锁不平衡，所以作为原因的SNP可以在任何地方。有趣的是，也基因分型的两种其他SCNN1ASNP(一个在5’末端附近，一个在3’末端附近)也显示出对替加色罗的一定的较高应答(优势率＞3.5)，并且与SNP 3806连锁不平衡。SCNN1A基因中的许多突变已经与人类疾病关联，主要是由于肾中的作用。一些等位基因变体已经与几个不同家族中1型常染色体隐性假性醛固酮减少症关联(见OMIM #600228：sodium channel，nonvoltage-gated 1，alpha subunit；SCNN1A http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi？id＝600228中的条目)。在高血压和SCNN1A中的SNP之间已经进行了关联，可能是由于肾中较低水平的钠再吸收。Iwai N等人，J.Am.Soc.Nephrol.13：80-85(2002)。也处于醛固酮控制下的末端结肠中突变对该钠通道的影响当然可以导致对肠中液体和电解质平衡的有害影响。

TPH1：色氨酸羟化酶1.色氨酸羟化酶是5-羟色胺生物合成中的限速酶，催化色氨酸向5-羟基色氨酸(5-HT)的单加氧，5-羟基色氨酸然后被脱羧形成5-羟色胺。TPH1主要在外周，包括肠的肠嗜铬细胞中表达，而最近鉴定的TPH2基因优先在脑中表达。Walther DJ等人，Science299(5603)：76(2003)。5-羟色胺在原因上涉及情绪控制的多个重要的神经方面，并且涉及调节睡眠、焦虑、酒精中毒、药物滥用、食物摄入，和性行为，而在外周组织中，5-羟色胺涉及调节血管紧张度、肠运动性、初步止血和细胞介导的免疫应答。Veenstra-VanderWeele J，Anderson GM &Cook EH Jr.，Eur J Pharmacol.410(2-3)：165-181(2000)。

两种TPH1 SNP与＞5.0的优势率有关，其主要是由于与替加色罗组中较高的应答率相反，在安慰剂组中较低的应答率。这两种SNP位于内含子1(SNP 1756)和内含子5(SNP 3784)中，并且认为不导致它们自身的功能突变。该完整基因强烈连锁不平衡，因此所鉴定的SNP也可能与功能SNP连锁，其可以位于该基因中的任何地方。许多研究已经评估了TPH1多态性和自杀危险或者其他心境障碍，得到了混合型结果。综述见Arango V等人，J.Psychiatr.Res.37(5)：375-86(2003)。这些研究中评估的SNP不位于编码区中。Arango等人报导还没有鉴定功能性SNP。尽管关于TPH1基因型和肠病症的关系报导较少，Coates和同事最近的报导指出在具有溃疡性结肠炎、便秘型肠易激综合征(IBS-C)和腹泻型肠易激综合征(IBS-D)的患者中，TPH1信使RNA显著减少。Coates MD等人，Gastroenterology.126(7)：1657-64(2004)。

结论.该药物遗传学分析的目的是评估与5-HT4和5-HT3受体、5-羟色胺、肠分泌和运动性有关的候选基因中的多态性是否与慢性便秘患者中对替加色罗治疗的差别应答有关。按基因型的应答的比较鉴定了6种基因中的12种SNP与治疗差别应答，4周治疗后对替加色罗6-mg每日两次的应答率为＞60％，优势率为5或更大(与安慰剂相比)(见表6)。相比，对替加色罗和安慰剂的平均总体应答率为46％和25％，优势率为2.6。使用这12种“高应答者”SNP作为一个实施方案，我们发现具有12种SNP的至少一种(群体的约50％)的个体具有对替加色罗与对安慰剂相比更好的应答(62％对23％，优势率＝5.4)。这与剩下的没有12种SNP的任一种的约50％的患者不显示出对替加色罗与对安慰剂相比的显著差异相反(31％对27％，优势率＝1.3)。使用12种SNP模型的结果在12周治疗后相似，尽管在个体基因型水平上存在一定差异。

使用来自14种SNP的基因型分类患者的第二个实施方案也发现可以用于进一步定义非应答者群体。在该实施方案中除了最初的12种“高应答者”SNP外还包括来自TPH1基因的两种SNP，我们发现没有14种SNP的任一种的32％的患者对替加色罗和安慰剂的应答率分别为32％和30％，优势率为1.1。然而，使用该模型将具有这14种SNP的至少一种的68％的患者对替加色罗的总体应答率降低到仅53％，其低于使用12种SNP模型看到的62％应答率。

鉴定的基因显示出宽范围的不同功能，尽管所有的在胃肠道的正常功能的保持中都是重要的。5-羟色胺受体HTR4和HTR3B是5-羟色胺的主要靶标，从而介导该重要的神经递质的下游结果，包括运动性的调节、肠分泌，以及内脏敏感性。TPH1是5-羟色胺合成中的限速酶，在这些5-羟色胺介导的调节功能中也具有明显的重要作用。溶质转运在保持胃肠道中水和电解质的平衡中是必要的，并且从而可以对肠分泌和吸收具有重要影响。鉴定的三种基因在溶质转运中具有重要作用：SLC12A2(NKCC1)是氯离子分泌的主要转运途径；SCNN1A(ENaCα)在钠的吸收中是重要的；AQP3在水和甘油的转运中起重要作用。最后，促胃动素(MLN)是发现调节胃肠道运动性的关键内脏激素之一。

基于这些发现，慢性便秘可以由与上面鉴定的基因中的变体相关的多种病理生理机制引起，所有这些基因都对于替加色罗的治疗良好应答。没有这些变体的患者对治疗的应答不比对安慰剂的应答更明显，这可以表明他们的慢性便秘不是由于病理生理机理，而是由于环境或者可能由于心理因素。有趣的是，具有这些变体的患者也较不可能应答安慰剂，再次暗示这些变体与真实的病理生理有关。

本文引用的所有参考文献都完整并且为了所有目的以同样的程度引入作为参考，就好像每个单独的出版物、专利或者专利申请都为了所有目的特别并单独指出完整引入作为参考一样。

本发明不限于按照本申请中描述的特定实施方案，其意在作为对本发明的个别方面的单个描述。如本领域技术人员将明白的，可以做出本发明的许多修饰和变通方案而不背离其精神和范围。除了本文列举的方法和装置之外，本发明范围内的功能上等同的方法和装置根据前面的描述将对于本领域技术人员是显而易见的。此类修饰和变通方案意在落入所附权利要求的范围内。本发明仅仅受到所附权利要求，以及此类权利要求的等同物的完整范围的限制。

序列

SEQ.ID NO.	PG ID	基因	[SNP]周围的序列
SEQ.ID NO.	PG ID	基因	[SNP]周围的序列	1	1746	HTR4	TCTAGATAAGGCGGGAACTGTCATAAGCATGACTATCAAAGCTAAATAAAACATACTGAATTAAATACAAAATATGAAGATTAAGTAAAATATTCTTTGAAAGATTGGAAAGTAACCAAGACAAATAAGACTTAGTAGCTACACTCTCAAAAAGAAAAAGAAGACCTCTACTATTTC[C，T]TTTGGGGCCTTTACTGAGTCATATAAGGTCTGTGTAAAAGTAATTGTGGTTTTTGCCATT
2	3743	HTR4	AATCTGCTGTCAATACCCTAGGAGAGGGCTTCCTTTCATCTTCTCCTAGACTATCACAACCACTTTTATCCCACTAACTACTTTGTCTTTGTCTTCAAATTCTTAGTATATGAGACAGCTTAAATTTAACATGTTCAAAATTGAACTCCTGATTTCCCTAACCTCAAACCTGCTTCCCATATGAATACATAGCAAATCTATTTCTCCAGTTGCTCAGGTTAAAAATTTGGAAGCCACTTTTACCAGGTCTCTACCTCTTCTACCTCCAGTACATCAGCAAATCCTGATAGCTCTAACTTC[A，C]TAACGTTTCCTGATCCCAACCCTTTACCAGCCATTCAATGTCATACCATTCTAGTTCCTACTACATCATGCTTCACTTGGTGACTGCAAAGTCCTCTCAACTGGCATCCCTGCTTCCATCATTTCTCACATACAATCCACTCTTCACCCACTAGACAGAATGAGCTTTGAAAAATATTGAGATTGGAACATATCACTTCCATACTCACTGCCCTTAAGATGGCTTGTCATCTCACTAGGAGTAAACCCAGAACCCTCACCATGACCTATGTAAATTTACAAAGCTGGCCACTGGCTGCTT	1	1746	HTR4
2	3743	HTR4		3	3747	HTR4	GGGTTACAGGTTGGCAGCAGCTGTGTTCCTGATCTCTTTGTGGGATCTGATAATAACTCTCTCCCCTCGGCCCTTCAGGCACAAGGATGATAACAGCTCACTGCTGTGCTAAGCTCCAAGGTATTCCACCATCCTTTGTTGATTTTAACCTTGCACACACCTTTAACTCATTTGTGCCTGCTTTCCCTTTCCTATGGGACCTCCTATCAGGCTGCTCAACCTATCACTGTTCCTTCATGTCAACCACAAATTTGGTTAGCCGTTAAAGTCTTCATTCAAGAAATGGATGTGAATATTTAA[A，T]GTTCAAAGCTAAGGGCCACTGTCAATTTAATCCAAATTGCCTGTTATTATGACCTAGGCTTTGGTGACCACAGAAGTATACTGAGGATTGTGACACATACAGCCGATTCCAATCGCTTTCATTTTGGGTTGATTTAGTAGGGTATATCTGGAATATATTCTGTGAAGGTTATATTTTAGTGGAGATGATCTTGATTCTCTAGTAGGATTGAAAAGAAAGTGAATGAAGAAAGGAAAGAAGAAAGTAAGAAAAGAATTGAGGGAGGAAAGAAGGAAGAGAGAGAAAAAAGAAAAAGGACCT
4	3753	HTR4	CCTGTGCCCCGACAGGCCATGGGTTAGACAAGTTTGTCCTAGACCCAAACCCCACATTTGAATATGGGAAAACCAGGGCCCAGAAAAGAAGAGCTGACTTGTCAGAGCGTGCTAGTGGCTGGTCTGGGAGAGGCTGCTTGTCCTGTGAGCCCACCACTGAGAACACACAGTTCCAAAAATCAAGAATTCTCTGTCTTTCCTGAGCTCTTTTGACTGAAAATTAAGGTGCATGCCCTCTCCAGATGGAAGCAGCCTGCAAAGTCATGGCTTTGGCCTTGTCCAGAACTTCTGTTAAGCTGG[C，T]ACAGAAGACAAGGGGCCAAAGGGAATGAGGAACCAGTCTGGCAGCAGTTGGAGAATGAGAAAGTCCCTCCATTCAGCTGAGAAGTATTTTTATAGGCAGATTGATAGATTGTTTATGACTGAAGTTCAGATGAAAAGAAATTCCAGATATGCTTATTTAAATCACCCTTCTACACTTAAGTTCTAACTATCAACAGTACAAATATCAGATAGGGAAGATTTAATTCAATGAGGAAAACTGTACACTTAGAAAAAAGACCTTAATAGGCTGATGTGGCCACCAAAAATTCATTTGATCTTA	3	3747	HTR4

SEQ.ID NO.	PG ID	基因	[SNP]周围的序列
SEQ.ID NO.	PG ID	基因	[SNP]周围的序列	5	3754	HTR4	AAATATTATGTACAAAGCCTGAACCTGCCCTAAAAGAGTATGTGAGAAGGAGAAACTTTTAATATACTTTCCTTGTGAAATGCATTTCAATCCTATTGGGAAAACAAATGTAATTGTGTGACACAGTTCACAATGACAGACACTTTTCATTTATACATTACAAAATCGAATTATACTCCAGGGAGATCATTAAGAAAATGCAGATACATTTATCTCCAGCACAAGATTAAACATGCAACCTTGAAGTAAGAATTGTATGTTTTACAAGTAAACCTGTTTAAAAGAGGATCGGAGACTAAG[A，T]AACTGTTGGAGAATTTTGCCGATAAAACACATCAAATTTTTGAGCTGTGCAGAGGAAGGGTGACAATTCAGCTGGGTGTATCCAAAAAAGAATCTTGCAGTACTATAGAGAATACTATCTTCAAGGAAGTGAAATTGACTTTTTTTTTAAAAAGGGAATTACATTTAATGCTAAGTAAAGGACAAAGTACAGCATGTTCAGAGAAAGGGGATAAAAATGGTTAAAAGTCTGAAAAGTATGGCTTATGAGGCCAGCAGAAGGATCTAGAAATATTTGGCCTAATATAGGGAAGACTTGGGG
6	3756	HTR4	TGTGTCTGTATCTTTTCTGTCACTTTATATAACTAATTACTGTTTACTCTTTCCAAGCAGGGTGTGTGGGGATCCAAACTGTGGGAGAGAATGGTGTTACTTTGGGGAAGCCTTTGCAGAAACAAGACAGTCTGGAAGAAAGGGAAACTCCAGCTGCAGAATTTTCTTCTCTTTTCTTGCTGTGGCCCCATCCTCCCACCTGGCTCTAGGGGAAAGTCCTATTTAAAAGTGAGAGTTAGTAACTTAGCATCTTTCAGCAGATATCACAGTTGCCTCTGGCACAGCCTCTTGCACCCTCGT[A，C]CTTCCTCTCCTGGCTGTGCCTGCCTCAGCATGGGGATAACTGACTGCCCTCAGTTTTCCTCACCCTGCTACTAGATTTGTAGCTGGATTTGGGGACCTCTGAAGGAATTTTAACCACATAGGGAAGCGGTATGATCAAGTGGAAGAAATGAAAACACCAAGGCTCGTAAGATTGAGATCTAATCCTGCTCTGCCACCAACCAGCTGAGTCTCCCCTGCTGAACCATCAGTCAGCTCTGTGGTTGCAAGACCGATAGACTTTTCTCAGCACTGGTCTCATTTAATCTCTGCAACACTTGCA	5	3754	HTR4
6	3756	HTR4		7	3755	HTR3B	AGAAGTGCCATGTGTTGACATTATTTAAGATACAGATCTGGTTACTAATGTTGAGGTTACTCATTATGTCTGTGTTGTTATAGCAGCAAATGAGTTAACTTACGAGGCTGTCACTGAAAAGCTCATCTTTGCCAGGGTGAATCATCTCATGGAAAATGCGATTCTGTTTTGCAGGGCTAGGCTGGTCCTGGACCTCATGGTCACTACCATCTCCTAATCAGCCTATGTTTTGAAATGACCAACATCCTCTCTGTGACAACAAGTTCTCTTGTGTTTCATATAGTGTGGACATTGAAAGAT[A，C]CCCTGACCTTCCCTATGTTTATGTGAACTCATCTGGGACCATTGAGAACTATAAGCCCATCCAGGTGGTCTCTGCGTGCAGTTTAGAGACATATGCTTTTCCATTTGATGTCCAGAATTGCAGCCTGACCTTCAAGAGCATTCTGCATACAGGTAAACCATGAGAGATACCCATTAATGCTAGGTTGGTGCACATAGGTGAAATGATATTATACTATCCTTCAGGTCTATTTTATTCTTGCAGATAATTGGCTATTTAAAAATTGGAATCTCTTCTTGCGGTTTTTTGGCTCCTGCTGTA
8	1783	MLN	CATTGTCCAGCTCCAAGATGGTATCCCGTAAGGCTGTGGCTGCTCTGCTGGTGGTGCATG[C，T]AGCTGCCATGCTGGCCTCCCAGACGGAAGCCTTCGTCCCCATCTTCACCTATGGCGAACT	7	3755	HTR3B

SEQ.ID NO.	PG ID	基因	[SNP]周围的序列
SEQ.ID NO.	PG ID	基因	[SNP]周围的序列	9	1838	AQP3	TGTCCCGCTGCGGGGAGATGCTCCACATCCGCTACCGGCTGCTCCGACAGGCGCTGGCCGAGTGCCTGGGGACCCTCATCCTCGTGGTGAGTGGAGGGAGCCGGGGAAGCCCTTCTCTCTCCAGCCCTTGCACTCCCCAAACTCTCACTTCCCCGAAGGGGCTGTGTTTTCCAAGGTAGCCTGGACCCACCTCCCCAGCT[C，G]TGACCCCCACGCTTAACCGCGGAGGATCAAGCTGACTTCCAAAGTCCTCTTCCCCACGGTTCTAACCCCCTCTCTGACAGCTCCGACTCTTGCCAGAATGACAGCTGTTACTCCCCAGTGATAGTGCCGATCGTTTACCCTCCCACAAGTGACTCAGCCAACAGGCTGGGGGCAGCGGTCACGCTTGCAGTCTGGGACAG
10	1842	SLC12A2	TGCTATTCAAGTAGCAAAGGAAAACTACTCTCACAAACTTCAGTTCAACA[A，G]AGAAGAATCACCATTAAGATTGAGATATGGAATTGACTAAAACCGAAGTC	9	1838	AQP3
10	1842	SLC12A2		11	3801	SLC12A2	GTCAAGGGTGGAATTGCCGAGGAATGTTAACTTAATCTCTCAAAAGTTTGTAGCGGGTTTGGCTAGTTACGTGATACCGGAGGGCTGCCTCTAACAACCTTCCCCATCCAGTTAGGTATCTCGTGTGCACTTTCTTTCCCACCCACGCTCAACAGTCACCA[C，T]CCCTCTGAATGACAGTAGTGTTTGTGGGCCCTTTAGAGGAGAATGTGCAGTGAGGATCTCTCGAGAGAGGTTGGAGAGCACCTACCATCTGTGTCGTTTTGAAAGATTGTGTTGTGTGGCTTATGTACGCCTATTAGGGATCGCAAGAGTGGGAATGTTGCTGTTTGAAGGAAAACCTTAACAGGGTGTGTTTATGGTCTATGAGTTATTAAAGCTCAATTCTTGCAATCTTGAATATACAAAGGATCATAGAGATCTTGTCTTGGGACACGCTGTTCCTAATAATGGCATAACTCTTTTTTTTTGCGATGAAAACGTT
12	3806	SCNN1A	GCATAGGGAAAGCACAGGTGTCCAGGTGACAGTTAGAGGAACTTGGTGACAGGTGTGGGC[G，T]GACTCAGGCTTAGGTGTTGCTACCATCTTACTTCCCAGCTGGTAGTTTCTGTCCTCAAAC	11	3801	SLC12A2
12	3806	SCNN1A		13	1756	TPH1	TCCCTTTGCTGAGCACCTGCATCCGAACACTCTTTACTTTATTTTCTTAATCTTCCATGTGTTCACCAACTAGATTCTAAATTCCTTTATGTCTTCCCTTTATATTCTTCGCAGCCCTTACCTAGTTACACAGGTGTTCATTAAGTTATTTTAGGATGCACTGGTTAGTATTGGAGATTATCTGCTCTAACCTTCTCATT[T，G]TTTTAGATGAAAAAACTATAGGGTGATTAGTGCTCATGTTTCATTATCATGTCCCCAGCACTCTTCCTCAGCTACCCAAATTGGTAAGAGAACATACCCTCCTCCCACACTTATACACAGAGCACCCCCATCTTAGGCTGACTTGGGAGAGGTCAGAAGAGGAGATCTGGTTCAGCTGTTACTAAGATTGTAGCTTAAGA

SEQ.ID NO.	PG ID	基因	[SNP]周围的序列
SEQ.ID NO.	PG ID	基因	[SNP]周围的序列	14	3784	TPH1	TTTAGTTTTTATAGAAACCACTTACATAATTTCTTCCCTTGTAGAAACTGTATTGCTCTTTCCTGTTTATTTCTTCTAGTTTTGTGTATAGTTGTTGAATACTGTTAAGGAGTTAAATAGATATGTAGATTTTTTTAAGTCTATGAGAGAAACTCAAAGACAGCAATTTCAGACCACGATGGAAATAAACTAAACTCTCTTGAGTCACAGCATAACTGCTTTGTTTTCTCCACTATGGTAATCTGCTGAGATTATCTACTGAGATAAAAGGGAAAATTTATACTTCTTAAATATTGTAAACCCTTGAAGATAGATCACTGATCATTTTACTTCCTATACTAGCTAGAAAAAAGTAAAGAGGCCTGGA[C，T]CAAACAAATATAAAGAACTAAAAGGAACAAAATTGTCCTTACCCTTTGTTTATGCCTCTACTAGCACCATCTTTTTTCTTGCTAAAATTATAAAATCTTAATGTGGAAAATGTCTTCAACCTTCTCCAAGATGTTTGAATCTCCTCTACCAAATAATGGGTGTGGAGCTTTTGCATGAACACCCCCACGGATGAGGAACTAACCATCTCATCAGCCTATTCTATTTTCAAATCACTCTTTAACAAGATATTCTCTATTCTAGGCCAAAAGCTTGAAGTTTCTATCCAACAGTCCTTTACTT

Claims

1.替加色罗用于生产治疗所选患者群体中慢性便秘的药物的用途，其中该患者群体基于患者中存在的生物标记基因中的遗传多态性选择，其中遗传多态性表明替加色罗在治疗慢性便秘中的功效。

2.确定具有胃肠病症的个体对用替加色罗治疗的应答性的方法，其包括：

(a)对于个体中存在的基因的两个拷贝，确定多态性遗传基因座上核苷酸对的身份，和

(b)如果该基因的区域中遗传多态性位点上的核苷酸对表明该个体对用替加色罗治疗慢性便秘应答，那么将该个体分配到“高”应答者组中。

3.权利要求2的方法，其中胃肠病症选自便秘型肠易激综合征(C-IBS)、功能性消化不良、胃食管反流病和糖尿病性胃病。

4.治疗受试者中慢性便秘的方法，其包括步骤：

(a)得到受试者的来自一种或多种基因的遗传基因座上的基因型，所述基因型表明替加色罗在治疗慢性便秘中功效的指示，其中所述基因选自5-HT₄受体(HTR4)的基因、5-HT₃受体亚基B(HTR3B)的基因、促胃动素(MLN)的基因、水通道蛋白3水通道(AQP3)的基因、溶质载体家族12成员A2(SLC12A2)、也称作钠/钾/氯离子协同转运蛋白1(NKCC1)的基因、和非电压门控钠通道α亚基(SCNN1A)、也称作阿米洛利敏感的上皮钠通道α亚基(ENaCα)的基因，和

(b)(i)如果受试者中的基因型表明替加色罗在治疗慢性便秘中的功效的指示，那么对该受试者施用替加色罗，或者(ii)如果受试者的基因型不表明指示替加色罗在治疗慢性便秘中的功效，那么对该受试者施用备选疗法。

5.权利要求4的方法，其中慢性便秘是便秘型肠易激综合征(C-IBS)。

6.权利要求4的方法，其中HTR4的基因具有选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6的核苷酸序列组成的组的序列。

7.权利要求4的方法，其中HTR3B的基因具有选自由SEQ ID NO：7的核苷酸序列组成的组的序列。

8.权利要求4的方法，其中MLN的基因具有选自由SEQ ID NO：8的核苷酸序列组成的组的序列。

9.权利要求4的方法，其中AQP3的基因具有选自由SEQ ID NO：9的核苷酸序列组成的组的序列。

10.权利要求4的方法，其中SLC12A2的基因具有选自由SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11的核苷酸序列组成的组的序列。

11.权利要求4的方法，其中SCNN1A的基因具有选自由SEQ IDNO：12的核苷酸序列组成的组的序列。

12.治疗受试者中慢性便秘的方法，其包括步骤：

(a)得到受试者的来自一种或多种基因的遗传基因座上的基因型，所述基因型表明替加色罗在治疗慢性便秘中功效的指示，其中所述基因选自5-HT₄受体(HTR4)的基因、5-HT₃受体亚基B(HTR3B)的基因、促胃动素(MLN)的基因、水通道蛋白3水通道(AQP3)的基因、溶质载体家族12成员A2(SLC12A2)、也称作钠/钾/氯离子协同转运蛋白1(NKCC1)的基因、和非电压门控钠通道α亚基(SCNN1A)、也称作阿米洛利敏感的上皮钠通道α亚基(ENaCα)的基因；和色氨酸羟化酶1(TPH1)的基因，和

(b)(i)如果受试者的基因型表明替加色罗在治疗慢性便秘中功效的指示，那么对该受试者施用替加色罗，或者(ii)如果受试者的基因型不表明指示替加色罗在治疗慢性便秘中功效，那么对该受试者施用备选疗法。

13.权利要求12的方法，其中慢性便秘是便秘型肠易激综合征(C-IBS)。

14.权利要求12的方法，其中TPH1的基因具有选自由SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的核苷酸序列组成的组的序列。

15.鉴定基因的单元型和胃肠道病症性状之间的关联的方法，其包括比较显示出胃肠道病症的群体中单元型的频率与参考群体中单元型的频率，其中胃肠道病症性状群体中该单元型比参考群体中的更高频率表明该单元型与胃肠道病症性状关联，并且其中该基因选自5-HT₄受体(HTR4)的基因、5-HT₃受体亚基B(HTR3B)的基因、促胃动素(MLN)的基因、水通道蛋白3水通道(AQP3)的基因、溶质载体家族12成员A2(SLC12A2)、也称作钠/钾/氯离子协同转运蛋白1(NKCC1)的基因、和非电压门控钠通道α亚基(SCNN1A)、也称作阿米洛利敏感的上皮钠通道α亚基(ENaCα)的基因；和色氨酸羟化酶1(TPH1)的基因。

16.选自5-HT₄受体(HTR4)的基因、5-HT₃受体亚基B(HTR3B)的基因、促胃动素(MLN)的基因、水通道蛋白3水通道(AQP3)的基因、溶质载体家族12成员A2(SLC12A2)、也称作钠/钾/氯离子协同转运蛋白1(NKCC1)的基因、非电压门控钠通道α亚基(SCNN1A)、也称作阿米洛利敏感的上皮钠通道α亚基(ENaCα)的基因；和色氨酸羟化酶1(TPH1)的基因的基因产物用作药物活性靶标的用途，其中该用途包括步骤：

(a)将药物与具有在所选的基因区域中多态性位点上核苷酸对的多核苷酸编码的第一种基因产物接触，所述核苷酸对表明对用替加色罗治疗慢性便秘具有高应答性；

(b)鉴定所述药物对所述第一种基因产物的活性；

(c)将药物与具有在所选的基因区域中多态性位点上的核苷酸对的多核苷酸编码的第二种基因产物接触，所述核苷酸对表明对用替加色罗治疗慢性便秘具有低应答性；

(d)鉴定所述药物对所述第二种基因产物的活性；

(e)鉴定步骤(b)中鉴定的活性和步骤(d)中鉴定的活性之间的相似性和不同。