KR20070111475A - 만성 변비 환자에서 테가세로드의 효능을 확인하기 위한바이오마커 - Google Patents

만성 변비 환자에서 테가세로드의 효능을 확인하기 위한바이오마커 Download PDF

Info

Publication number
KR20070111475A
KR20070111475A KR1020077017948A KR20077017948A KR20070111475A KR 20070111475 A KR20070111475 A KR 20070111475A KR 1020077017948 A KR1020077017948 A KR 1020077017948A KR 20077017948 A KR20077017948 A KR 20077017948A KR 20070111475 A KR20070111475 A KR 20070111475A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
tegaserod
chronic constipation
treatment
snps
Prior art date
Application number
KR1020077017948A
Other languages
English (en)
Inventor
리앤 맥린
Original Assignee
노파르티스 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
Publication of KR20070111475A publication Critical patent/KR20070111475A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

약물유전학을 이용하여 테가세로드 (Zelmac(등록상표)/Zelnorm(등록상표))에 대한 만성 변비 환자의 반응에 대한 후보 유전자를 선택하는데 있어서 다형성의 영향을 평가하였다. 상기 분석으로, 4주 치료 후 테가세로드에 대한 적어도 60％ 반응률 및 5 이상의 교차비 (odds ratio) (위약에 비해)와 관련된 6개의 유전자 (HTR4, HTR3B, MLN, AQP3, SLC12A2, SCNN1A)에서 12개의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 확인하였다. 확인된 유전자는 모두 위장관의 정상 기능을 유지하는데 중요한 세로토닌 시그널링, 분비 및 운동성을 포함한 광범위한 상이한 기능을 나타낸다. 따라서, 상기 데이타는 만성 변비가 모두 테가세로드를 사용하는 치료에 잘 반응하는 상기 확인된 유전자 내의 변이체에 관련된 다양한 병리생리학적 기전으로부터 발생할 수 있음을 의미한다. 상기 변이체가 없는 환자는 치료에 대해서 위약에 대해 반응하는 것보다 더 유의하게 반응하지 않고, 이는 만성 변비가 병리생리학적 기전으로 인한 것이 아니라, 환경적 또는 가능하게는 심리학적 요인으로 인한 것임을 나타낸다. 상기 변이체를 갖는 환자는 또한 위약에 반응할 가능성이 보다 작고, 이는 다시 상기 변이체가 진정한 병리생리학에 연관됨을 암시한다.
바이오마커, 테가세로드, 만성 변비, 유전자, 변이체, 제노타이핑

Description

만성 변비 환자에서 테가세로드의 효능을 확인하기 위한 바이오마커 {BIOMARKERS FOR IDENTIFYING EFFICACY OF TEGASEROD IN PATIENTS WITH CHRONIC CONSTIPATION}
본 발명은 일반적으로 시험관내 조직 샘플의 분석적 시험, 보다 특히 테가세로드 (tegaserod)를 사용하는 치료에 반응할 가능성이 보다 큰, 만성 변비에 걸린 개체를 확인하기 위한 유전자 다형성의 측면에 관한 것이다.
만성 변비의 유병률은 매우 크고, 그 추정치는 건강한 집단의 10-20％이다 ([Higgins ＆ Johanson, Am. J. Gastroenterol. 99:750-9 (2004)]; [Talley et al., Am. J. Gastroenterol. 98: 1107-11 (2003)]). 미국에서만 2백 5십만명이 변비 때문에 내원한다 [Sonnenburg ＆ Koch, Dig. Disc. Sci. 34: 606-11 (1989)]. 서행형 변비, 골반저 기능장애, 기능성 변비, 및 변비 우세형 과민성 대장증후군 (C-IBS)을 포함하는 만성 변비의 아형이 많이 존재한다 [Prather, Rev. Gastroenterol. Disorders, 4: S11-16 (2004)]. 증상은 아형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 힘주기, 단단하거나 덩어리진 대변, 및 불완전 배변감의 지속적인 증상과 관련된 드문 배변 (<3/주)을 포함한다 [Thompson et al., Gut 45 (suppl II): 43-7 (1999)].
테가세로드 (Zelnorm(등록상표)/Zelmac(등록상표); HTF919)는 미국 식품의약국 (FDA)에서 2002년 7월에 변비 우세형 과민성 대장증후군 (C-IBS)의 단기 경감에 대해, 2004년 8월에 만성 변비의 적응증에 대해 승인되었다. 테가세로드는 세로토닌 (5-HT4) 수용체 (HTR4)의 효능제로서 작용하는 아미노구아니딘 인돌 화합물이고, 몇몇 동물 모델에서 위장관 (GI) 전체에서 운동촉진약 (promotile drug)으로서 작용하는 것으로 나타났다 ([Pfannkuche HJ et al., Neurogastroenterol. Motil. 7: 280 (1995)]; [Grider JR et al., Gastroenterology; 115:370-80 (1998)]). 테가세로드는 또한 건강한 자원자 (Degen L et al., Aliment Pharmacol. Ther. 15 (11):1745-51 (2001)), IBS-C의 환자 (Prather CM et al., Gastroenterology; 118 (3):463-8 (2000)), 및 만성 변비의 환자 (Johanson et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2: 796-805 (2004))에서 대장 통과 시간을 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 장 운동성에 대한 그의 효과 외에, 5-HT4 수용체 효능제가 동물 모델에서 분비 (Kellum JM et al., Am. J. Physiol. 277: G515-G520 (1999)) 뿐만 아니라 내장 감각 (Schikowski A et al., Neurogastroenterol. Motil 14: 221-227 (2002); Coelho AM et al., Gastroenterol 118 (4, suppl.2): A835; Yu S et al., Neurogastroenterol. Motil 13: 445 (2001))에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 있다.
그러나, 모든 환자가 위약에 반응하는 것보다 더 유의하게 테가세로드에 반응하는 것은 아니다. 북남미 전체에서 만성 변비 환자에 대한 최근 연구는 위약에 대해서의 25％에 비해 테가세로드에 대해서 43％의 반응률을 입증했다 [Johanson et al., Clin. Gastroenterol Hepatol. 2: 796-805 (2004). 현재 일부 환자가 반응하지 않는 이유에 대해서는 알려지지 않았다. 따라서, 당업계에서 테가세로드의 작용 방식에 대해 추가로 규명하는 것이 필요하다. 또한, 만성 변비, 또는 다른 위장관 질환에서 확인된 유전자의 중요성에 대해 보다 깊이 이해하면 위장관 장애를 치료하는데 있어서 훨씬 더 효과적인 신규한 치료법을 개발할 수 있게 된다.
<발명의 개요>
본 발명은 상기 필요성에 대한 해결책을 제시한다. 본 발명은 테가세로드가 작용하는 방식에 대한 보다 깊은 유용한 이해를 제공하고, 만성 변비의 치료를 위한 보다 효과적인 치료법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 일부 환자에서 만성 변비가 진단학적으로 확인가능한 질환임을 보여준다. 만성 변비는 몇몇 유전자 (HTR4, HTR3B, AQP3, MLN, SLC12A2, SCNN1A, TPH)의 변이체에 관련된 다양한 병리생리학적 기전으로부터 발생할 수 있고, 이 모두는 테가세로드를 사용하는 치료에 잘 반응한다. 흥미롭게도, 본 발명의 바이오마커 유전자에서 진단학적으로 확인가능한 변이체를 갖는 환자도 위약에 반응할 가능성이 보다 작고, 이것은 다시 상기 변이체가 실제 병리생리학에 관련됨을 시사한다. 다른 측면에서, 본 발명은 상기 바이오마커 변이체가 없는 일부 환자가 위약보다 치료에 대해 유의하게 반응하지 않음을 보여주고, 이것은 환자의 만성 변비가 생리학적 기전 때문이 아니라 환경적 또는 가능하게는 심리학적 요인 때문일 수 있음을 나타낼 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명은 환자에 의한 테가세로드의 효능에 대한 하나 이 상의 바이오마커를 기초로 하여 선택된 환자 집단에서 만성 변비의 치료를 위한 의약의 제조에서의 테가세로드의 용도를 제공한다. 상기 바이오마커는 5-HT4 수용체의 유전자 (HTR4; 서열 1-6); 5-HT3 수용체, 서브유닛 B의 유전자 (HTR3B; 서열 7); 모틸린 (motilin)의 유전자 (MLN; 서열 8); 아쿠아포린 (aquaporin) 3 수분 채널의 유전자 (AQP3; 서열 9); 나트륨/칼륨/클로라이드 동시수송체 1 (NKCC1)로도 알려진 용질 캐리어 패밀리 12, 멤버 A2의 유전자 (SLC12A2; 서열 10-11); 및 아밀로라이드-감수성 상피 나트륨 채널, 알파 서브유닛 (ENaC 알파)으로도 알려진 비-전압 게이팅된 (gated) 나트륨 채널, 알파 서브유닛의 유전자 (SCNN1A; 서열 12)의 6개의 확인된 유전자에서의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이다. 테가세로드에 대한 보다 높은 반응률과 관련되는 상기 6개의 유전자에 걸쳐서 총 12개의 SNP가 확인되었다. 테가세로드의 효능을 나타내는 상기 12개의 SNP 중의 하나 이상을 포함하는 프로필을 갖는 환자는 선택된 "고반응자" 환자 집단에 포함되는 것으로 확인된다.
상이한 실시태양에서, 본 발명은 환자에 의한 테가세로드의 효능에 대한 다른 바이오마커를 기초로 하여 선택되는 다른 환자 집단에서 만성 변비의 치료를 위한 의약의 제조시의 테가세로드의 용도를 제공한다. 상기 실시태양에서, 마커는 상기 문단에서 확인된 6개의 유전자에서 다형성이고, 추가로 트립토판 히드록실라제 1 (TPH1; 서열 13-14)의 유전자에서 2개의 다형성을 갖는다. 상기 실시태양에서, 테가세로드의 효능을 나타내는 하나 이상의 상기 SNP를 갖는 프로필을 갖는 환자는 선택된 "고반응자" 환자 집단에 포함되는 것으로 확인된다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 개체의 바이오마커 유전자의 SNP 프로필을 기초로 하여, 위약을 사용하는 치료에 대해서보다 테가세로드를 사용하는 치료에 반응할 가능성이 더 큰, 만성 변비에 걸린 개체를 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 개체는 척추동물이다. 특정 실시태양에서, 척추동물은 포유동물이다. 보다 특정 실시태양에서, 포유동물은 영장류, 예를 들어 사이노몰거스 원숭이 또는 인간이다.
본 발명은 또한 대상에서 만성 변비를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 먼저 본 발명의 바이오마커 유전자에서 대상의 SNP 프로필을 얻는 것을 수반한다. 본 발명의 바이오마커 유전자에서 대상의 SNP 프로필이 테가세로드에 의한 치료 효능을 예측하는 것으로 결정될 때, 대상의 만성 변비를 치료하기 위해 테가세로드를 대상에게 투여한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 대상 또는 환자에 대한 물질 또는 약물의 투여는 자가 투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다. 치료 및 진단 측면을 포함하는 상기 방식은 많은 당업자가 "치료진단 (theranostic)"으로 언급하고 있다.
본 발명은 또한 치료 대상에서 발현되는 바이오마커의 분석을 기초로 하여 테가세로드에 의한 위장관 장애의 치료를 위한 임상 시험에 포함하기 위한 대상의 결정 방법을 제공한다. 위장관 장애는 만성 변비, 변비 우세형 과민성 대장증후군, 기능성 소화불량, 위식도 역류 질환 및 당뇨성 위병증을 포함할 수 있다. 대상은 공지의 바이오마커 SNP 프로필과 비교하여 그의 바이오마커 SNP 프로필이 대상이 적절한 테가세로드 치료에 감수성일 수 있음을 나타낼 때 임상 시험에 포함될 수 있다. 반대로, 대상의 SNP 프로필이 테가세로드 치료 효능을 나타내는 프로필과 유사하지 않을 경우에는 대상은 임상 시험으로부터 배제될 수 있다. 상기 유사성 또는 비유사성은 당업자가 식별할 수 있다.
본 발명은 또한 테가세로드 투여가 처방되는 질환에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 임상 분석, 키트 및 시약을 제공한다. 한 실시태양에서, 키트는 혼성화에 의해 바이오마커 유전자의 SNP 프로필을 결정하기 위한 시약을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 키트는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 바이오마커 유전자의 SNP 프로필을 결정하기 위한 시약을 포함한다.
도 1은 4주 치료 후에 "고반응자" 유전자형의 존재의 함수로서의 반응률을 보여주는 막대 그래프이다. 반응 = 기저선에 대한 하나 이상의 완전 자발적 배변 (CSBM)/주의 평균 증가; 적어도 7일 치료한 치료 대상 (ITT) 백인; 12개의 SNP는 본래의 12개의 "고반응자" SNP를 포함하고; 14개의 SNP는 2개의 TPH1 SNP를 추가로 포함하고; (％)는 각 범주에서 제노타이핑된 집단의 비율을 나타낸다.
도 2는 4주 치료 후에 "고반응자" 유전자형의 존재의 함수로서의 교차비 (odds ratio)를 보여주는 오차 막대 (error bar)이다. 12개의 SNP는 본래의 12개의 "고반응자" SNP를 포함하고; 14개의 SNP는 2개의 TPH1 SNP를 추가로 포함하고; 박스는 교차비를 나타내고, 선은 95％ 신뢰 구간을 나타낸다.
도 3은 HTR4 게놈 영역에 걸쳐 제노타이핑된 SNP의 위치 및 연관 불균형 (linkage disequilibrium)의 결정을 보여준다. 상부 패널은 12개의 SNP가 HTR4 유 전자의 대부분의 게놈 영역에 걸치도록 초기에 선택됨을 보여준다. 박스는 테가세로드에 대해 평균 반응보다 높은 반응과 관련되는 SNP를 나타낸다. 양호한 품질의 유전자형을 생성하지 않아 반응 평가에 이용되지 않은 2개의 SNP 분석 (SNP-3802 및 SNP-3803)은 하일라이트로 표시하였다. 하부 패널은 HTR4에 대한 10개의 양호한 유전자형 분석 사이의 연관 불균형 (LD)을 보여준다. 하부의 좌측 4분면은 SNP 사이의 연관 불균형 정도를 나타내고 (값이 클수록 강한 LD를 나타냄), 상부 우측 4분면은 SNP 사이의 상대적인 거리 (염기쌍에서)를 나타낸다. 테가세로드에 대해 보다 높은 반응을 보이는 6개의 SNP (SNP 1746, 3754, 3753, 3743, 3756 및 3747)는 서로 간의, 특히 처음 4개의 상기 SNP (1746, 3754, 3753 및 3743) 사이의 높은 연관 불균형 (>0.6)을 보임을 유의하여야 한다 (LD > 0.8).
도 4는 연결된 선으로 표시된 상이한 5-HT4 수용체 엑손 중에서 교대 스플라이싱 가능성을 개략적으로 제시하는, 5-HT4 수용체의 구조를 보여준다. 박스는 엑손을 나타내고, 인트론은 굵은 선으로 나타낸다. 엑손 4와 5 사이의 점선은 엑손 h를 mRNA 내로 포함시키는 스플라이싱을 나타내고, 대시선 다음의 스플라이스는 엑손 h를 생략시킨다. 엑손 5의 하류에서 C-말단 엑손과의 상이한 조합은 모든 스플라이스 변이체에 대해 상이하게 표시된 선을 사용하여 도시한다. C-말단 변이체 e 및 f는 엑손 g 내의 2개의 교대 스플라이스 허용체 부위를 기초로 하여 생성된다.
약물유전학을 사용하여 테가세로드 (Zelmac(등록상표)/Zelnorm(등록상표); HTF919)에 대한 만성 변비 환자의 반응에 대한 후보 유전자를 선택하는데 있어서 다형성의 영향을 평가하였다. 약물 표적 (5-HT4 수용체, HTR4), 세로토닌 경로, 용질 수송 및 장 운동성에 관련된 23개 유전자에서 총 55개의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 임상 시험에 등록된 환자에 대해 평가하였다. 분석은 고투여량의 테가세로드 (6 mg bid (1일 2회)) 또는 위약으로 처리한 후 적어도 7일이 경과한 치료 대상 (ITT) 집단의 백인에 대해서만 수행하였다. 분석 결과는 4주 치료 후에 테가세로드에 대한 적어도 60％의 반응률 및 5 이상의 교차비 (위약에 비교)를 보인 6개의 유전자 [HTR4 (5-HT4 수용체의 유전자; 서열 1-6; 하기 서열 목록 참조), HTR3B (5-HT3 수용체, 서브유닛 B의 유전자; 서열 7), MLN (모틸린의 유전자; 서열 8), AQP3 (아쿠아포린 3 수분 채널의 유전자; 서열 91), SLC12A2 (용질 캐리어 패밀리 12, 멤버 A2의 유전자; 나트륨/칼륨/클로라이드 동시수송체 1; NKCC1의 유전자; 서열 10-11), SCNN1A (비-전압 게이팅된 나트륨 채널, 알파 서브유닛의 유전자; ENaC 알파; 서열 12)]에서 12개의 SNP를 확인하였다. 이는 각각 테가세로드 및 위약에 대한 46％ 및 25％의 평균 총 반응률 및 교차비 2.6과 비교되었다. 상기 12개의 "고반응자" SNP를 실시태양으로 사용하여, 본 발명자들은 12개의 SNP의 적어도 하나 (집단의 약 50％)를 갖는 개체가 위약에 비해 테가세로드에 대해 유의하게 보다 높은 반응을 보임을 밝혀내었다 (62％ 대 23％, 교차비=5.4). 이것은 12개의 SNP 중 어느 하나도 갖지 않는 환자가 위약에 비해 테가세로드에 대한 반응에서 유의한 차이를 보이지 않는 것과 대조적이다 (31％ 대 27％, 교차비=1.3).
TPH1 (트립토판 히드록실라제 1; 서열 13-14; 하기 서열 목록 참조)에 추가의 2개의 SNP를 포함하는 14개 SNP의 제2 실시태양은 상기 14개의 SNP를 갖지 않는 집단의 32％가 위약에 비해 테가세로드에 대한 유의하게 상이한 반응을 보이지 않음을 밝혀내었다 (32％ 대 30％ 반응, 교차비=1.1). 상기 14개의 SNP 중 적어도 하나를 갖는 집단의 68％는 위약에 비해 테가세로드에 대한 유의하게 보다 높은 반응을 보였지만 (53％ 대 22％, 교차비=4.1), 그 정도가 14개 SNP의 실시태양을 사용하여 관찰한 것보다는 작았다.
상기 발견을 기초로 할 때, 만성 변비는 그 모두가 테가세로드를 사용하는 치료에 잘 반응하는 상기 확인된 유전자의 변이체에 관련된 다양한 병리생리학적 기전으로 발생한다. 상기 변이체가 없는 환자는 위약에 대해서보다 더 유의하게 치료에 반응하지 않고, 이는 그의 만성 변비가 병리생리학적 기전에 의해서가 아니라 환경적 또는 가능하게는 심리학적 요인 때문임을 나타낼 수 있다. 흥미롭게도, 상기 변이체가 존재하는 환자도 위약에 반응할 가능성이 보다 작고, 이는 다시 상기 변이체가 진정한 병리생리학에 연관됨을 시사한다.
여기서 확인된 다형성은 또한 다른 위장관 장애, 예를 들어 변비 우세형 IBS, 기능성 소화불량, 위식도 역류 질환 및 당뇨성 위병증에도 관련이 있을 수 있다.
정의.
본원에서 사용되는 "의학적 상태"는 치료가 요구되는 하나 이상의 물리적 및/또는 심리학적 증상으로 나타나는 임의의 상태 또는 질병을 포함하고 이로 제한되지 않으며, 이전에 및 새로 확인된 질병 및 다른 질환을 포함한다.
용어 "임상 반응"은 반응, 무반응 및 유해한 반응 (즉, 부작용)의 정량적 측정 중의 어느 하나 또는 전부를 의미한다.
처치에 대한 임상 반응과 유전자형 또는 반수체형 (Haplotype) 사이의 상호관계를 추론하기 위해, 처치를 수행한 개체 집단 (이후 "임상 집단")이 보인 임상 반응에 대해 유전자형 또는 반수체형 데이타를 수집한다. 상기 임상 데이타는 이미 수행한 임상 시험의 결과의 분석 및/또는 하나 이상의 새로운 임상 시험의 설계 및 실행에 의해 얻을 수 있다.
용어 "임상 시험"은 특정 처치에 대한 반응의 임상 데이타를 수집하기 위해 고안된 임의의 연구를 의미하고, I상, II상 및 III상 임상 시험을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 표준 방법을 사용하여 환자 집단을 규정하고 대상을 등록시킨다.
임상 집단에 포함된 개체는 목적하는 의학적 상태의 존재에 대해 등급별로 나누는 것이 바람직하다. 상기 잠재적인 환자의 등급화는 표준 물리적 검사 또는 하나 이상의 실험실 시험을 사용할 수 있다. 별법으로, 환자의 등급화는 반수체형 쌍과 질병 감수성 또는 심도 사이에 강한 상호관련이 존재하는 상황에 대한 하플로타이핑 (haplotyping)을 사용할 수 있다.
목적하는 치료 처치는 시험 집단 내의 각각의 개체에 대해 실시되고, 처치에 대한 각각의 개체의 반응은 하나 이상의 소정의 기준을 사용하여 측정한다. 많은 경우에, 시험 집단은 일정 범위의 반응을 보이고, 조사자는 다양한 반응에 의해 이루어지는 반응자군 (예를 들어, 저, 중, 고)의 수를 선택할 것으로 생각된다. 또한, 시험 집단의 각각의 개체의 유전자는 제노타이핑 및/또는 하플로타이핑되고, 이것은 처치 시행 전 또는 후에 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 "SNP 핵산"은 개체 또는 개체의 그룹 사이에서 그렇지 않으면 동일한, 따라서 대립유전자로서 존재하는 뉴클레오티드 서열 내에서 가변적인 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열이다. 상기 SNP 핵산의 길이는 바람직하게는 약 15 내지 약 500개의 뉴클레오티드이다. SNP 핵산은 염색체의 일부일 수 있거나, 예를 들어 PCR 또는 클로닝을 통한 염색체의 일부의 증폭에 의한 염색체의 일부의 정확한 카피일 수 있다. SNP 핵산은 이후에 간단히 "SNP"로 언급된다. 본 발명에 따른 SNP 프로브는 SNP 핵산에 상보성인 올리고뉴클레오티드이다.
용어 "상보성"은 왓슨 (Watson)과 클릭크 (Crick)의 올리고뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 상보성임을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "다형성"은 집단에서 >1％의 빈도로 존재하는 임의의 서열 변이체를 의미한다. 서열 변이체는 유의하게 1％ 초과, 예를 들어 5％ 또는 10％ 이상의 빈도로 존재할 수 있다. 또한, 상기 용어는 다형성 부위에서 개체에서 관찰되는 서열 변이를 의미하기 위해 사용될 수 있다. 다형성은 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결손 및 마이크로새털라이트 (microsatellite)를 포함하고, 유전자 발현 또는 단백질 기능의 검출가능한 차이를 야기할 수 있지만, 그럴 필요는 없다.
용어 "유전자형"은 개체에서 상동 염색체 쌍의 로커스의 하나 이상의 다형성 부위에서 발견되는 뉴클레오티드 쌍의 비동조화된 (unphased) 5'-3' 서열을 의미한다. 본원에서 사용되는 유전자형은 전체-유전자형 및/또는 하위-유전자형을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 변형되지 않거나 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 RNA 또는 DNA를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 단일- 및 이중쇄 DNA, 단일- 및 이중쇄 구역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중쇄 구역 RNA, 단일- 및 이중쇄 구역의 혼합물인 RNA, 및 단일쇄 또는, 보다 일반적으로는 이중쇄 또는 단일- 및 이중쇄 구역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA를 모두 포함하는 3중 가닥 영역을 의미한다. 또한, 용어 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 프로모터, 엑손, 인트론, 및 발현을 조절하는 다른 비번역 영역을 포함하여 RNA 산물의 조절된 생합성에 대한 모든 정보를 포함하는 DNA의 세그먼트를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "로커스"는 유전자 또는 물리적 또는 표현형 특징에 대응하는 염색체 또는 DNA 분자 상의 위치를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2 이상의 아미노산, 즉 펩티드 동배체 (isostere)를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는 펩티드, 글리코펩티드 또는 올리고머로 통상 언급되는 짧은 사슬과 일반적으로 단백질로 언급되는 보다 긴 사슬을 모두 의미한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자 코딩 아미노산 이외의 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 자연적 프로세스, 예를 들어 번역후 프로세싱에 의해 또는 당업계에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 변형은 기본 교재 및 보다 상세한 논문 및 방대한 연구 문헌에 잘 기재되어 있다.
용어 "다형성 부위"는 적어도 2개의 교대 서열이 집단에서 발견되고 그의 가장 빈번한 빈도가 99％ 이하인 로커스 내의 위치를 의미한다.
용어 "동조화된 (phased)"은 로커스 내의 2 이상의 다형성 부위의 뉴클레오티드 쌍의 서열에 적용할 때, 로커스의 단일 카피 상의 상기 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드의 조합이 알려져 있음을 의미한다.
단일 뉴클레오티드 다형성. 인간 게놈의 서열 변이는 주로 단일 뉴클레오티드 다형성 ("SNP")으로 이루어지고, 나머지는 짧은 탠덤 반복체 (tandem repeat) (마이크로새털라이트 포함), 긴 탠덤 반복체 (미니새털라이트), 다른 삽입 및 결손이다. SNP는 게놈의 단일 위치에서 뉴클레오티드 가변성의 발생을 나타내고, 여기서 2개의 교대 염기가 인간 집단에서 인식가능한 빈도 (즉, >1％)로 발생한다. SNP는 유전자 내에서 또는 게놈의 유전자간 (intergenic) 영역 내에서 발생할 수 있다.
SNP는, 다형성의 존재 때문에 종의 일부 멤버가 비돌연변이된 서열 (즉, 본래의 대립유전자)을 가질 수 있는 반면에 다른 멤버는 돌연변이된 서열 (즉, 변이체 또는 돌연변이체 대립유전자)를 가질 수 있다는 점에서 "대립유전자성"으로 언급된다. 가장 간단한 경우에, 단지 하나의 돌연변이된 서열이 존재할 수 있고, 다형성은 이중대립유전자성이다. 교대 돌연변이의 발생은 삼중대립유전자 다형성 등을 야기할 수 있다. SNP는 게놈 전체에 걸쳐 존재하고, 유전자의 기능을 변경하는 SNP는 표현형 변이에 대한 직접적인 원인일 수 있다. 그들의 유병률 및 널리 존재하는 특성 때문에, SNP는 인간 질병 상태에 관련되는 유전자의 위치를 파악하기 위한 중요한 수단이 될 잠재력을 갖는다 (예를 들어, 2,227개의 SNP가 2.3 메가베이스 영역의 DNA에 걸쳐 맵핑된 파일럿 연구를 개시하고 있는 문헌 [Wang et al., Science 280: 1077-1082 (1998)] 참조).
단일 뉴클레오티드 다형성과 특정 표현형 사이의 상관성이 반드시 SNP가 표현형의 원인임을 나타내거나 요구하지는 않는다. 대신, 상관성은 단지 SNP와 주어진 표현형의 실제 요인이 되는 유전 인자가 종종 함께 관찰되도록 SNP와 상기 유전 인자 사이의 게놈 근접성 때문일 수 있다. 따라서, SNP는 "진정한" 기능성 변이체와의 연관 불균형 (LD)으로 존재할 수 있다. 대립유전자 연관성으로도 알려진 LD는 게놈의 2개의 특유한 위치에서 대립유전자가 예상보다 큰 수준으로 연관될 때 존재한다.
따라서, SNP는 특정 표현형을 야기하는 돌연변이에 대한 그의 근접성에 의해 의미 있는 마커로서 기능할 수 있다.
질병과 연관되는 SNP는 또한 그들이 위치하는 유전자의 기능에 대한 직접 효과를 가질 수 있다. 서열 변이체는 아미노산을 변화시키거나 엑손-인트론 스플라이싱을 변경시켜 직접 관련 단백질을 변형시키거나, 조절 구역에 존재하여 mRNA의 발현 사이클 또는 안정성을 변경시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nowotny et al., Current Opinions in Neuobiology 11:637-641 (2001)] 참조).
많은 통상적인 질환 발생 위험성 및 상기 병태 치료에 사용되는 약물 치료 대사는 근원적인 게놈 변이에 의해 실질적으로 영향받지만, 임의의 하나의 변이체의 효과는 작을 수 있음이 보다 분명해진다. 따라서, SNP와 임상 표현형 사이의 연관성은 (1) SNP가 표현형에 대한 기능적 원인일 수 있거나, (2) 표현형을 유도하는 게놈 상의 SNP 위치 근처에 다른 돌연변이가 존재할 수 있음을 시사한다. 상기 두번째 가능성은 DNA의 큰 단편이 유전되고 마커가 그의 근접성 및 충분히 분리된 재조합 사건의 결여에 의한 연관 불균형 (LD) 상태로 존재할 수 있다는 점에서 유전학을 기초로 한다.
SNP의 확인 및 특성 분석. 단일쇄 형태 구조 다형성 (SSCP) 분석, 변성 고성능 액체 크로마토그래피 (DHPLC)에 의한 이종이중체 (heteroduplex) 분석, 직접 DNA 서열결정 및 컴퓨터 이용 분석 방법을 포함하여 많은 상이한 기술을 사용하영 SNP를 확인하고 특성을 분석할 수 있다 (Shi et al., Clin. Chem. 47:164-172 (2001) 참조). 공공 데이타베이스의 서열 정보가 풍부하기 때문에, 컴퓨터 도구를 사용하여 주어진 유전자 (cDNA 또는 게놈 서열)에 대해 독립적으로 제시된 서열을 정렬함으로써 인 실리코 (in silico) 방식으로 SNP를 확인할 수 있다 (Cox et al., Hum Mutal 2001, 17:141-150).
현재 가장 통상적인 SNP 타이핑 방법은 혼성화, 프라이머 연장, 및 절단 방법을 포함한다. 각각의 상기 방법은 적합한 검출 시스템에 연결되어야 한다. 검출 기술은 형광 편광 (Chan et al., Genome Res. 9:492-499 (1999) 참조), 피로포스페이트 방출의 발광 검출 (pyrosequencing), (Ahmadiian et al., Anal. Biochem. 280:103-10 (2000) 참조), 형광 공명 에너지 전달 (FRET)-기반 절단 분석, DHPLC 및 질량 분광법 (Shi, Clin. Chem. 47:164-172 (2001) 및 미국 특허 6,300,076 B1 참조)을 포함한다. SNP를 확인하고 특성을 분석하기 위한 다른 방법은 미국 특허 6,297,018 B1 및 6,300,063 B1에 개시되어 있다. 상기 참고문헌의 개시 내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
특히 바람직한 실시태양에서, 다형성의 검출은 INVADER™ 기술 (써드 웨이브 테크놀로지스 인크. (Third Wave Technologies Inc. 미국 위스콘신 매디슨)으로부터 입수가능함))에 의해 달성할 수 있다. 상기 분석에서, 상류의 특정 "인베이더 (invader)" 올리고뉴클레오티드 및 부분적으로 중복되는 하류의 프로브가 상보성 DNA 주형에 결합할 때 함께 특정 구조를 형성한다. 상기 구조는 클리바제 (Cleavase) 효소에 의해 인식되어 특이적 부위에서 절단되어, 프로브 올리고뉴클레오티드의 5' 플랩 (flap)을 방출시킨다. 이어서, 상기 단편은 반응 혼합물에 포함된 합성 2차 표적 및 2차 형광 표지된 시그날 프로브에 대한 "인베이더" 올리고뉴클레오티드로서 기능한다. 이것은 클리바제 효소에 의한 2차 시그날 프로브의 특이적 절단을 야기한다. 형광 시그날은 형광 공명 에너지 전달이 가능한 염료 분자로 표지된 상기 2차 프로브가 절단될 때 발생한다. 클리바제는 중복되는 DNA 서열 또는 플랩에 의해 형성된 구조에 대해 엄격한 요건을 갖고, 따라서 하류 DNA 스트랜드 상의 절단 부위의 바로 상류의 단일 염기쌍 미스매치를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다 (그 전부가 본원에 참고로 포함된다 문헌 [Ryan D et al., Molecular Diagnosis 4(2): 135-144 (1999) 및 Lyamichev V et al. Nature Biotechnology 17: 292-296 (1999)], 및 미국 특허 5,846,717 및 6,001,567 참조).
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 제노타이핑 (genotyping)은 상기한 바와 같은 SNP 타이핑 방법의 실시에 사용되다. 본 발명의 일부 실시태양은 2 이상의 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 정체를 동시에 프로빙하기 위해 2 이상의 상이하게 표지된 제노타이핑 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 다형성 부위를 포함하는 2 이상의 영역의 동시 표적화 및 증폭을 허용하기 위해 프라이머 조성물이 대립유전자-특이적 프라이머쌍의 2 이상의 세트를 포함할 수 있음이 고려된다.
본 발명의 제노타이핑 올리고뉴클레오티드는 고체 표면, 예를 들어 마이크로칩, 비드 또는 유리 슬라이드 상에 고정되거나 합성될 수 있다 (예를 들어, WO 98/20020 및 WO 98/20019 참조). 상기 고정된 제노타이핑 올리고뉴클레오티드는 프로브 혼성화 및 폴리머라제 연장 분석을 포함하여 이로 제한되지 않는 다양한 다형성 검출 분석에 사용될 수 있다. 본 발명의 고정된 제노타이핑 올리고뉴클레오티드는 DNA 샘플을 여러 유전자에서 다형성에 대해 동시에 신속하게 스크리닝하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드의 순차적인 (ordered) 어레이를 포함할 수 있다.
본 발명의 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 특정 SNP의 하나의 뉴클레오티드에만 상보성이어서 뉴클레오티드를 포함하는 대립유전자가 존재할 경우에만 폴리머라제-매기 연장을 위한 프라이머로서 기능하는 3' 말단 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 3' 말단에서 두번째로 위치하는 (penultimate) 뉴클레오티드를 갖는다. 코딩 또는 비코딩 스트랜드에 혼성화하는 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 프라이머가 본 발명에 의해 고려된다. 유전자 다형성을 검출하기 위한 ASO 프라이머는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 개발할 수 있다.
본 발명의 다른 제노타이핑 올리고뉴클레오티드는 본원에서 확인된 다형성 부위 중의 하나의 1개 내지 복수개의 뉴클레오티드 하류에 위치하는 표적 구역에 혼성화한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 본원에서 설명된 다형성 중의 하나를 검출하기 위한 폴리머라제-매개 프라이머 연장 방법에 유용하고, 따라서, 상기 제노타이핑 올리고뉴클레오티드는 본원에서 "프라이머 연장 올리고뉴클레오티드"로서 언급된다. 바람직한 실시태양에서, 프라이머 연장 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 다형성 부위에 바로 인접하여 위치하는 뉴클레오티드에 상보성인 데옥시뉴클레오티드이다.
제노타이핑 및 하플로타이핑. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물 및 키트는 개체에서 유전자를 제노타이핑 및/또는 하플로타이핑하기 위한 방법에 유용하다. 용어 "유전자형" 및 "반수체형"은 본원에 기재된 다형성 부위의 하나 이상에 존재하는 뉴클레오티드 쌍 또는 뉴클레오티드를 각각 함유하는 유전자형 또는 반수체형을 의미하고, 임의로 유전자에서 하나 이상의 추가의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드 쌍 또는 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 추가의 다형성 부위는 후속적으로 발견된, 현재 공지된 다형성 부위(들)일 수 있다.
본 발명의 제노타이핑 방법의 한 실시태양은 2 카피의 목적하는 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 혼합물을을 개체로부터 단리하고, 2 카피의 다형성 부위 중의 하나 이상에서 뉴클레오티드 쌍의 정체를 결정하는 것을 수반한다. 당업자가 쉽게 이해할 바와 같이, 개체에서 유전자의 2 "카피"는 동일한 대립유전자이거나 상이한 대립유전자일 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 제노타이핑 방법은 각각의 다형성 부위에서 뉴클레오티드 쌍의 정체를 결정하는 것을 포함한다.
일반적으로, 핵산 혼합물은 개체로부터 취한 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 샘플 또는 조직 샘플로부터 단리된다. 적합한 조직 샘플은 전혈, 정액, 타액, 눈물, 뇨, 대변, 땀, 구강 표본, 피부 및 모발을 포함한다. 핵산 혼합물은 게놈 DNA, mRNA 또는 cDNA로 이루어질 수 있고, mRNA 및 cDNA의 경우에, 생물학적 샘플은 유전자가 발현되는 장기로부터 얻어야 한다. 또한, 당업자는 mRNA 또는 cDNA 제제가 인트론 또는 5' 및 3' 비전사 영역에 위치하는 다형성을 검출하기 위해 사용되지 않음을 쉽게 이해할 것이다. 유전자 단편이 단리된 경우, 이는 제노타이핑되는 다형성 부위를 포함하여야 한다.
본 발명의 하플로타이핑 방법의 한 실시태양은 2 카피의 목적하는 유전자, 또는 그의 단편 중의 하나만을 포함하는 핵산 분자를 개체로부터 단리하고, 그 카피의 하나 이상의 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 정체를 결정하는 것을 포함한다. 핵산은 2 카피의 유전자 또는 단편을 분리할 수 있는 임의의 방법을 사용하여 단리할 수 있다. 당업자가 쉽게 이해할 바와 같이, 임의의 개체 클론은 단지 개체에 존재하는 2개의 유전자 카피 중의 하나에 대한 반수체형 정보만을 제공할 것이다. 반수체형 정보가 개체의 다른 카피에 대해 요구될 경우, 추가의 클론에 대한 조사가 필요할 것이다. 일반적으로, 개체에서 유전자의 두 카피 모두를 하플로타이핑할 가능성을 90％를 초과하도록 하기 위해서는 적어도 5개의 클론을 조사하여야 한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 각각의 다형성 부위에서의 뉴클레오티드가 확인된다.
바람직한 실시태양에서, 반수체형 쌍은 개체에 존재하는 유전자의 각각의 카피에서 하나 이상의 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 동조화된 서열을 확인함으로써 개체에 대해 결정된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 하플로타이핑 방법은 유전자의 각각의 카피에서 각각의 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 동조화된 서열을 확인하는 것을 포함한다. 유전자의 두 카피 모두를 하플로타이핑할 때, 확인 단계는 바람직하게는 유전자의 각각의 카피를 별개의 용기에 둔 상태에서 수행된다. 그러나, 2 카피가 상이한 태그로 표지되거나, 다른 방식으로 별개로 구별가능하거나 확인가능하다면, 일부 경우에 동일한 용기에서 상기 방법을 수행할 수 있다. 예를 들어, 유전자의 제1 및 제2 카피가 각각 상이한 제1 및 제2 형광 염료로 표지되고, 제3의 상이한 형광 염료로 표지된 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드가 다형성 부위의 분석에 사용될 경우, 제1 및 제3 염료의 조합물의 검출은 제1 유전자 카피의 다형성을 검출하고, 제2 및 제3 염료의 조합물의 검출은 제2 유전자 카피의 다형성을 검출할 것이다.
제노타이핑 및 하플로타이핑 방법 모두에서, 다형성 부위에서 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 쌍)의 정체는 다형성 부위를 포함하는 표적 구역을 유전자, 또는 그의 단편의 하나 또는 두 카피 모두로부터 직접 증폭하고 통상적인 방법에 의해 증폭된 영역의 서열을 결정함으로써 결정할 수 있다. 당업자는 그 부위에서 동형접합성인 개체에서 단지 하나의 뉴클레오티드만 다형성 부위에서 검출되고, 개체가 그 부위에 대해 이형접합성이면 2개의 상이한 뉴클레오티드가 검출될 것임을 쉽게 이해할 것이다. 다형성은 양성 타입 확인으로 알려진 바와 같이 직접 확인되거나, 음성 타입 확인으로서 언급되는 추론에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, SNP가 참조 집단에서 구아닌 및 시토신인 것으로 알려진 경우, 부위는 그 부위에서 동형접합성인 모든 개체에 대해 구아닌 또는 시토신인 것으로 양성 결정될 수 있거나, 개체가 그 부위에서 이형접합성이면 구아닌 및 시토신인 것으로 양성 결정될 수 있다. 별법으로, 부위는 구아닌이 아니거나 (따라서, 시토신/시토신) 또는 시토신이 아닌 것(따라서 구아닌/구아닌)으로 음성으로 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 임의의 다형성 부위에 존재하는 대립유전자의 정체는 목적하는 부위와 연관 불균형 상태인 다른 다형성 부위를 제노타이핑함으로써 간접적으로 결정할 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 2개의 부위는 한 부위에 특정 변이체의 존재가 제2 부위에 다른 변이체의 존재를 나타낼 경우에 연관 불균형 상태인 것으로 말해진다 (문헌 [Stevens, JC, Mol. Diag. 4:309-317 (1999)] 참조). 본 발명의 다형성 부위와 연관 불균형 상태의 다형성 부위는 동일한 유전자의 영역에 또는 다른 게놈 영역에 위치할 수 있다. 본원에서 설명된 신규한 다형성 부위와 연관 불균형 상태인 다형성 부위의 제노타이핑은 다형성 부위에서 대립유전자의 정체를 검출하기 위한, 상기 언급된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
표적 구역은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (미국 특허 4,965,188), 리가제 연쇄 반응 (LCR) (Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991); PCT 출원 공개 WO 90/01069), 및 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석 (OLA) (Landegren et al., Science 241:1077-1080 (1988))을 포함하여 이로 제한되지 않는 임의의 올리고뉴클레오티드-지정 증폭 방법을 사용하여 증폭될 수 있다. 상기 방법에서 프라이머 또는 프로브로서 유용한 올리고뉴클레오티드는 다형성 부위를 포함하거나 이 부위에 인접한 핵산의 영역에 특이적으로 혼성화하여야 한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 길이는 10 내지 35개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 가장 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 길이는 20 내지 25개의 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 길이는 당업자가 통상적으로 고려하고 실시하는 많은 요인에 따라 결정될 것이다.
전사-기반 증폭 시스템 (미국 특허 5,130,238; EP 329,822; 미국 특허 5,169,766, PCT 특허 출원 공개 WO 89/06700) 및 등온 방법 (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992)을 포함한 다른 공지의 핵산 증폭 절차를 사용하여 표적 구역을 증폭할 수 있다.
표적 구역에서 다형성은 당업계에 공지된 복수의 혼성화-기반 방법 중의 하나를 사용하여 증폭 전 또는 후에 분석될 수 있다. 일반적으로, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드가 상기 방법의 수행시에 이용된다. 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드는 상이하게 표지된 프로브 쌍으로서 사용될 수 있고, 상기 쌍의 한 멤버는 표적 서열의 한 변이체에 완전히 매치되고 다른 멤버는 상이한 변이체에 완전히 매치된다. 일부 실시태양에서, 하나 초과의 다형성 부위는 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드의 세트 또는 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 동시에 검출할 수 있다. 세트의 멤버의 융점은 각각의 다형성 부위에 대한 혼성화가 검출될 때 바람직하게는 5℃ 이내, 보다 바람직하게는 2℃ 이내이다.
대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드의 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 혼성화는 용액 내에서 둘 모두를 사용하여 수행할 수 있거나, 상기 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 공유방식으로 또는 비공유방식으로 고체 지지체에 부착된 상태에서 수행할 수 있다. 부착은 예를 들어 항체-항원 상호작용, 폴리-L-Lys, 스트렙타비딘 또는 아비딘-비오틴, 염 브리지 (bridge), 소수성 상호작용, 화학 연결기, UV 가교결합, 베이킹 (baking) 등에 의해 매개될 수 있다. 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체 상에 직접 합성되거나 합성 후에 고체 지지체 상에 부착될 수 있다. 본 발명의 검출 방법에 사용하기 적합한 고체 지지체는 예를 들어 웰 (96웰 플레이트와 같이), 슬라이드, 시트, 막, 섬유, 칩, 접시 및 비드로 형성될 수 있는 실리콘, 유리, 플라스틱, 종이 등의 기재를 포함한다. 고체 지지체는 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 또는 표적 핵산의 이동을 용이하게 하기 위해 처리, 코팅 또는 유도체화될 수 있다.
또한, WO 95/11995에 기재된 바와 같은 핵산 어레이 및 서브어레이에 대한 유전자의 하나 또는 두 카피를 포함하는 핵산 샘플의 혼성화에 의해 개체의 유전자에 대한 유전자형 또는 반수체형도 결정될 수 있다. 어레이는 유전자형 또는 반수체형에 포함되는 각각의 다형성 부위를 나타내는 일련의 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이다.
또한, 리보프로브 (Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7575 (1985); Meyers et al., Science 230:1242 (1985)) 및 뉴클레오티드 미스매치를 인식하는 단백질, 예를 들어 이. 콜리 (E. coli) mutS 단백질 (Modrich T. Ann, Rev. Genet. 25:229-253 (1991))을 사용하는 RNase 보호 방법을 포함하여 이로 제한되지 않는 미스매치 검출 기술을 사용하여 다형성의 정체를 결정할 수 있다. 별법으로, 변이체 대립유전자는 단일쇄 형태 구조 다형성 (SSCP) 분석 (Orita et al., Genomics 5:874-879 (1989); Humphries et al., in Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, R. Elles, ed., pp. 321-340 (1996)) 또는 변성 구배 겔 전기영동 (DGGE) (Wartell et al., Nucl. Acids Res. 18:2699-2706, (1990); Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232-236 (1989))에 의해 확인될 수 있다.
또한, 폴리머라제-매개 프라이머 연장 방법을 사용하여 다형성을 확인할 수 있다. 복수의 상기 방법이 특허 및 과학 문헌에 기재되어 있고, "유전자 비트 (Genetic Bit) 분석" 방법 (WO 92/15712) 및 리가제/폴리머라제 매개 유전자 비트 분석 (미국 특허 5,679,524)을 포함한다. 관련 방법은 WO 91/02087, WO 90/09455, WO 95/17676, 및 미국 특허 5,302,509 및 5,945,283에 개시되어 있다. 다형성을 포함하는 연장된 프라이머는 미국 특허 5,605,798에 기재된 바와 같은 질량 분광법에 의해 검출될 수 있다. 다른 프라이머 연장 방법은 대립유전자-특이적 PCR이다 (Ruafio et al., Nucl. Acids Res. 17:8392 (1989); Ruafio et al., Nucl. Acids Res. 19, 6877-6882 (1991); WO 93/22456; Turki et al., J. Clin. Invest. 95:1635-1641 (1995)) 참조). 또한, 여러 다형성 부위는 WO 89/10414에 기재된 바와 같은 대립유전자-특이적 프라이머 세트를 사용하여 핵산의 여러 영역을 동시에 증폭함으로써 조사할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 유전자 변이의 종류에 따라 대상을 분류할 때 유용한 SNP 프로브를 제공한다. 본 발명에 따른 SNP 프로브는 통상적인 대립유전자 식별 분석에서 SNP를 식별하는 올리고뉴클레오티드이다.
특정 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 상기 측면에 따른 올리고뉴클레오티드는 SNP 핵산의 한 대립유전자에는 상보성이지만, SNP 핵산의 임의의 다른 대립유전자에는 상보성이 아니다. 본 발명의 상기 실시태양에 따른 올리고뉴클레오티드는 상이한 방식으로 SNP를 식별할 수 있다. 예를 들어, 엄격한 혼성화 조건 하에, 적절한 길이의 올리고뉴클레오티드는 하나의 SNP에 혼성화하지만 임의의 다른 SNP에는 혼성화하지 않을 것이다. 올리고뉴클레오티드는 방사성 표지 또는 형광 표지로 표지될 수 있다. 별법으로, 적절한 길이의 올리고뉴클레오티드는 PCR에 대한 프라이머로서 사용될 수 있고, 여기서 3' 말단 뉴클레오티드는 SNP를 포함하는 하나의 대립유전자에는 상보성이지만, 임의의 다른 대립유전자에는 상보성이 아니다. 상기 실시태양에서, PCR에 의한 증폭의 존재 또는 부재가 SNP의 반수체형을 결정한다.
본 발명의 게놈 및 cDNA 단편은 본원에서 확인된 적어도 하나의 신규한 다형성 부위를 포함하고, 적어도 10개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 유전자의 전체 길이까지 걸칠 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 단편은 100 내지 3000개의 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 200 내지 2000개의 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 500 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명의 다형성 부위를 설명할 때, 편의상 유전자의 센스 스트랜드를 언급한다. 그러나, 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 유전자를 포함하는 핵산 분자는 상보성 이중 가닥 분자일 수 있고, 따라서 센스 스트랜드 상의 특정 부위에 대한 언급은 상보성 안티센스 스트랜드 상의 대응하는 부위도 언급한다. 따라서, 어느 한 스트랜드 상의 동일한 다형성 부위를 언급할 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 다형성 부위를 포함하는 표적 구역에서 어느 한 스트랜드에 특이적으로 혼성화하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 게놈 변이체의 센스 스트랜드에 상보성인 단일쇄 폴리뉴클레오티드도 포함한다.
집단 유전자형 및 반수체형의 식별. 본 발명은 집단에서 주어진 유전자형 또는 반수체형의 빈도를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 집단의 각각의 멤버에 존재하는 유전자에 대해 유전자형 또는 반수체형을 결정하고 (상기 유전자형 또는 반수체형은 유전자 내에서 하나 이상의 다형성 부위에서 검출된 뉴클레오티드 쌍 또는 뉴클레오티드를 포함함), 유전자형 또는 반수체형이 집단에서 발견되는 빈도를 계산하는 것을 포함한다. 집단은 참조 집단, 가족 집단, 동성 집단, 집단 군, 또는 특질 (trait) 집단 (예를 들어, 목적하는 특질, 예를 들어 의학적 상태 또는 치료 처치에 대한 반응을 보이는 개체의 그룹)일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 참조 집단에서 발견되는 유전자형 및/또는 반수체형에 대한 빈도 데이타는 특질과 유전자형 또는 반수체형 사이의 연관성을 확인하는 방법에서 사용된다. 특질은 질병에 대한 감수성 또는 치료에 대한 반응을 포함하여 이로 제한되지 않는 임의의 검출가능한 표현형일 수 있다. 상기 방법은 참조 집단에서 목적하는 유전자형 또는 반수체형의 빈도에 대한 데이타를 얻고, 상기 데이타를 특질을 나타내는 집단에서의 유전자형 또는 반수체형의 빈도와 비교하는 것을 포함한다. 참조 및 특질 집단의 어느 하나 또는 둘 모두에 대한 빈도 데이타는 상기한 방법 중의 하나를 사용하여 집단의 각각의 개체를 제노타이핑 또는 하플로타이핑함으로써 얻을 수 있다. 특질 집단에 대한 반수체형은 직접 또는 별법으로 상기한 예측 유전자형 대 반수체형 방법에 의해 결정될 수 있다.
상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 특질은 질병에 대한 감수성, 질병의 심도, 질병의 단계 또는 약물에 대한 반응이다. 상기 방법은 유전자형과 치료 성과, 예를 들어 효능 측정치, 약동학적 측정치 및 부작용 측정치 사이의 연관성에 대한 가능성이 존재하는, 모든 약물유전학적 응용을 위한 진단 시험 및 치료 처치제 개발에 응용성을 갖는다.
방법의 다른 바람직한 실시태양에서, 목적하는 특질은 환자가 일부 치료 처치에 보이는 임상 반응, 예를 들어 의학적 상태에 대한 약물 표적화 또는 치료 처치에 대한 반응이다.
또다른 실시태양에서, 참조 및/또는 특질 집단의 빈도 데이타는 서면 또는 전자 형태일 수 있는 기결정된 빈도 데이타를 이용함으로써 얻는다. 예를 들어, 빈도 데이타는 컴퓨터로 접근가능한 데이타베이스로 존재할 수 있다. 일단 빈도 데이타를 얻으면, 참조 및 특질 집단 내의 목적하는 유전자형 또는 반수체형의 빈도를 비교한다. 바람직한 실시태양에서, 집단에서 관찰된 모든 유전자형 및/또는 반수체형의 빈도를 비교한다. 유전자에 대한 특정 유전자형 또는 반수체형이 통계학상 유의한 정도로 참조 집단에서보다 특질 집단에서 더 빈번한 경우, 그 특질은 유전자형 또는 반수체형과 연관된 것으로 예상된다.
바람직한 실시태양에서, 상이한 민족지리학적 군에 대한 반수체형 빈도 데이타는 하아디-바인베르크 (Hardy-Weinberg) 평형에 일치하는지를 결정하기 위해 조사한다 (D.L. Hartl et al., Principles of Population Genomics, 3rd Ed. (Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1997)]. 하아디-바인베르크 평형은 반수체형 쌍 H1/H2을 발견하는 빈도가 H1≠H2일 경우 PH-W(H1/H2) = 2p(H1)p(H2)와 같고, H1=H2일 경우 PH-W(H1/H2) = p(H1)p(H2)와 같다고 가정한다. 관찰된 반수체형 빈도와 예상된 반수체형 빈도 사이의 통계학상 유의한 차이는 집단 그룹 내의 유의한 동종번식, 유전자에 대한 강한 선택 압력, 샘플링 바이어스 (sampling bias), 및/또는 제노타이핑 과정 중의 오류를 포함하는 하나 이상의 인자 때문일 수 있다. 하아디-바인베르크 평형으로부터의 큰 편차가 민족지리학적 군에서 관찰될 경우, 편차가 샘플링 바이어스에 의한 것인지를 확인하기 위해 그 군 내의 개체의 수를 증가시킬 수 있다. 샘플 크기가 더 큰 경우에도 관찰된 반수체형 쌍 빈도와 예상된 반수체형 쌍 빈도 사이의 차이가 감소하지 않을 경우에는, 직접적 하플로타이핑 방법, 예를 들어 CLASPER System™ 기술 (미국 특허 5,866,404), SMD, 또는 대립유전자-특이적 대구간 (long-range) PCR (Michalotos-Beloin et al., Nucl Acids Res 24:4841-4843 (1996))을 사용하여 개체를 하플로타이핑하는 것을 고려할 수 있다.
반수체형 쌍을 예측하기 위한 상기 방법의 한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 다음 분석을 수행하는 것을 포함한다. 먼저, 각각의 가능한 반수체형 쌍은 참조 집단 내의 반수체형 쌍과 비교하였다. 일반적으로, 참조 집단의 단지 하나의 반수체형 쌍만이 가능한 반수체형 쌍에 매치되고, 이 쌍이 개체에 배정된다. 때때로, 참조 반수체형 쌍에서 제시되는 하나의 반수체형만이 개체의 가능한 반수체형 쌍에 일치하고, 이 경우에 상기 공지의 반수체형 및 가능한 반수체형 쌍으로부터 공지의 반수체형을 뺌으로써 유도된 새로운 반수체형을 포함하는 반수체형 쌍이 개체에게 배정된다. 드문 경우에, 참조 집단의 어느 반수체형도 가능한 반수체형 쌍과 일치하지 않거나, 또는 별법으로, 여러 참조 반수체형 쌍이 가능한 반수체형 쌍과 일치한다. 상기한 경우에, 개체는 바람직하게는 예를 들어 상기 논의된 바와 같은 직접적 분자 하플로타이핑 방법을 사용하여 하플로타이핑된다.
바람직한 실시태양에서, 통계적 분석은 Bonferoni 보정 및/또는 유전자형/표현형 상호관계를 다수회 시뮬레이션하고 유의성 값을 계산하는 부트스트래핑 (bootstrapping) 방법을 사용하는 변량의 표준 분석 (ANOVA) 시험에 의해 수행된다. 많은 다형성을 분석할 때, 우연히 발견될 수 있는 유의한 연관을 보정하기 위해 계산이 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 통계 방법에 대하여 문헌 [Statistical Method in Biology, 3rd edition, Bailey NTJ, (Cambridge Univ. Press, 1997); Introduction to Computational Biology, Waterman MS (CRC Press, 2000) 및 Bioinformatics, Baxevanis AD ＆ Ouellette BFF editors (John Wiley ＆ Sons, Inc., 2001)]을 참조한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 목적하는 유전자형 또는 반수체형과 연관 불균형 상태인 검출가능한 유전자형 또는 반수체형을 대용 마커로서 사용할 수 있다. 다른 유전자형과 연관 불균형 상태인 유전자형은, 주어진 유전자에 대한 특정 유전자형 또는 반수체형이 참조 집단보다 잠재적인 대용 마커 유전자형을 또한 보이는 집단에서 보다 높은 빈도로 존재하는지를 결정함으로써 발견할 수 있다. 빈도가 통계학상 유의하면, 마커 유전자형은 유전자형 또는 반수체형을 예측하는 것이고, 대용 마커로서 사용될 수 있다.
유전자형 또는 반수체형과 치료에 대한 대상의 반응 사이의 상관관계. 임상 및 다형성 데이타를 주어진 대상으로부터 얻은 후에, 개체 반응과 유전자형 또는 반수체형 수준 사이의 상호관계를 확립한다. 상호관계는 복수의 방식으로 얻을 수 있다. 한 방법에서, 개체는 그들의 유전자형 또는 반수체형 (또는 반수체형 쌍)에 의해 군으로 분류되고 (다형성 군으로도 칭함), 이어서 각각의 다형성 군의 멤버에 의해 보이는 임상 반응의 평균 및 표준 편차를 계산한다.
치료에 대한 임상 반응과 유전자형 또는 반수체형 사이의 상호관계를 추론하기 위해, 처치를 받는 개체의 집단 (이하 "임상 집단")에 의해 나타난 임상 반응에 대한 데이타를 얻을 필요가 있다. 상기 임상 데이타는 이미 실시된 임상 시험의 결과를 분석함으로써 얻을 수 있고/있거나 임상 데이타는 하나 이상의 새로운 임상 시험을 설계하고 실시함으로써 얻을 수 있다.
이어서, 다형성 군 사이에서 임상 시험에서 관찰된 임의의 변이가 통계학상 유의한지를 결정하기 위해 상기 결과를 분석한다. 사용될 수 있는 통계학적 분석 방법은 문헌 [L.D. Fisher ＆ G. vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Wiley-lnterscience, New York, 1993)]에 기재되어 있다. 상기 분석은 또한 유전자의 어떠한 다형성 부위가 표현형 차이에 가장 유의하게 작용하는지에 대한 회귀 계산을 포함할 수 있다.
반수체형 수준과 임상 반응 사이의 상호관계를 발견하기 위한 다른 방법은 오차 최소화 최적 알고리즘에 기초한 예측 모델을 사용하고, 그 중 하나는 유전자 알고리즘이다 (R. Judson, Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry in Reviews in Computational Chemistry, Vol. 10, pp. 1-73, K.B. Lipkowitz and D.B. Boyd, eds. (VCH Publishers, New York, 1997)). 시뮬레이션된 어닐링 (Press et al., Numerical Recipes in C: The Art of Scientific Computing, Ch. 10 (Cambridge University Press, Cambridge) 1992), 신경망 (E. Rich ＆ K. Knight, Artificial Intelligence, 2nd Edition, Ch. 10 (McGraw- Hill, New York, 1991), 표준 구배 강하 (descent) 방법 (Press et al., 상기 문헌, Ch. 10), 또는 다른 전체적인 또는 국소적인 최적화 방법 (Judson, 상기 문헌 참조)도 사용될 수 있다.
또한, 상호관계는 임상 데이타에서 얼마나 많은 변이가 유전자의 다형성 부위의 상이한 서브세트에 의해 설명되는지를 결정하기 위해 변량의 분석 (ANOVA) 기술을 사용하여 분석할 수 있다. ANOVA는 반응 변수가 하나 이상의 특질 또는 측정될 수 있는 변수에 의해 야기되거나 또는 이와 상호관련되는지에 대한 가설을 시험하기 위해 사용된다 (Fisher ＆ vanBelle, 상기 문헌, Ch. 10). 본원에 제공된 실시예에서, 상기 특정 연구에서 일차적인 통계 분석은 교차비 및 95％ 신뢰 한계를 결정하기 위해 Mantel-Haenzel 시험, 로지스틱 회귀 (logistic regression), ANCOVA 및 피셔의 정확 검정 (Fisher's Exact test)을 이용하여 이루어졌다.
상기 설명된 분석으로부터, 임상 반응을 유전자형 또는 반수체형 함량의 함수로서 예측하는 수학적 모델은 당업자가 쉽게 작성할 수 있다.
유전자에 대한 임상 반응과 유전자형 또는 반수체형 (또는 반수체형 쌍) 사이의 연관성의 확인은 치료에 반응하거나 하지 않는, 또는 별법으로 보다 낮은 수준으로 반응하여 보다 집중적인 치료, 즉 보다 대용량의 약물을 필요로 할 수 있는 개체를 결정하기 위한 진단 방법을 설계하기 위한 기본적인 사항일 수 있다. 본 발명의 상기 진단 방법은 복수의 형태 중의 하나, 예를 들어 직접적인 DNA 시험 (즉, 유전자에서 하나 이상의 다형성 부위의 제노타이핑 또는 하플로타이핑), 혈청학적 시험, 또는 물리적 시험 측정을 실시할 수 있다. 유일한 요건은 진단 시험 결과와 근원적인 유전자형 또는 반수체형 사이의 우수한 상호관계가 존재하여야 한다는 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 진단 방법은 상기한 바와 같은 예측 차원의 하플로타이핑 방법을 사용한다.
컴퓨터는 본 발명의 방법의 실시에 관련되는 임의의 또는 모든 분석적 및 수학적 작동을 실행할 수 있다. 또한, 컴퓨터는 디스플레이 장치 상에 화면 (또는 스크린)을 생성시키는 프로그램을 실행하고, 사용자를 이를 통해 염색체 위치, 유전자 구조 및 유전자 패밀리, 유전자 발현 데이타, 다형성 데이타, 유전자 서열 데이타, 및 임상 집단 데이타 (예를 들어, 하나 이상의 집단에 대한 민족지리학적 기원, 임상 반 응, 유전자형 및 반수체형에 대한 데이타)를 포함하여 유전자 및 그의 게놈 변이에 관한 다량의 정보를 보고 분석할 수 있다. 본원에 설명된 다형성 데이타는 관련 데이타베이스 (예를 들어, Oracle 데이타베이스 또는 ASCII 플랫 파일 (flat file))의 일부로서 저장될 수 있다. 상기 다형성 데이타는 컴퓨터의 하드 드라이버에 저장될 수 있거나 또는 예를 들어 CD-ROM 또는 컴퓨터로 실행시킬 수 있는 하나 이상의 다른 저장 장치에 저장될 수 있다. 예를 들어, 데이타는 네트워크를 통해 컴퓨터와 연결되는 하나 이상의 데이타베이스에 저장될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 개체에서 유전자를 하플로타이핑 및/또는 제노타이핑하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 조성물은 다형성 부위를 포함하거나 이에 인접하는 하나 이상의 표적 구역에 특이적으로 혼성화하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머를 포함한다. 본원에 기재된 신규한 다형성 부위에서 개체의 유전자형 또는 반수체형을 확립하기 위한 방법 및 조성물은 단백질의 발현 및 기능에 의해 영향받는 질병의 병인에서 다형성의 영향에 대한 연구, 약물 표적화의 효능 연구, 단백질의 발현 및 기능에 의해 영향받는 질병에 대한 개체의 감수성 예측 및 유전자 산물을 표적화하는 약물에 대한 개체의 반응성 예측에 유용하다.
본 발명은 또한 유전자에 대해 결정된 다형성 데이타를 저장 및 디스플레이하기 위한 컴퓨터 시스템을 제공한다. 컴퓨터 시스템은 컴퓨터 처리 장치, 디스플레이 및 다형성 데이타를 포함하는 데이타베이스를 포함한다. 다형성 데이타는 참조 집단에서 주어진 유전자에 대해 확인된 다형성, 유전자형 및 반수체형을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 컴퓨터 시스템은 진화 관계에 따라 체계화된 반수체형을 보여주는 디스플레이를 생성시킬 수 있다.
발현 수준 평가. RT-PCR (실시간 정량적 PCR)은 예를 들어 본 발명의 유전자 (예를 들어 목적하는 SNP 및 다형성을 포함하는 유전자)의 유전자 발현 수준을 평가하는 한 방법이다. RT-PCR 분석은 mRNA 스트랜드를 포함하여 RNA 스트랜드로부터 DNA 스트랜드의 합성을 촉매화하기 위해 RNA 역전사효소를 이용한다. 생성되는 DNA는 특이적으로 검출 및 정량화될 수 있고, 상기 방법을 사용하여 특이적인 종의 mRNA의 수준을 결정할 수 있다. 이를 수행하는 하나의 방법은 아래에서 보다 상세하게 설명되는 TAQMAN™ (피이 어플라이드 바이오시스템즈 (PE Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티))로서 알려져 있다.
세포의 전사 상태를 측정하는 다른 방법은 예를 들어 이중 제한 효소 소화를 페이싱 (phasing) 프라이머와 조합하는 방법에 의해 전기영동 분석을 위해 복잡성이 제한된 제한 단편의 풀을 생성시키는 것 (예를 들어, EP 0 534858 A1 (1992년 9월 22일자로 Zabeau 등에 의해 출원) 참조), 또는 규정된 mRNA 말단에 가장 가까운 부위를 갖는 제한 단편을 선택하는 방법을 포함한다 (예를 들어, Prashar ＆ Weissman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2) 659-663 (1996) 참조). 또다른 방법은 예를 들어 각각의 cDNA를 확인하기 위해 각각의 여러 cDNA에서 충분한 염기, 예를 들어 20-50개의 염기의 서열을 결정하고 규정된 mRNA 말단 경로 패턴에 대해 공지의 위치에서 생성된 짧은 태그, 예를 들어 9-10개의 염기의 서열을 결정함으로써 통계학적 샘플 cDNA의 풀을 생성시키는 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Velculescu, Science 270: 484-487 (1995)] 참조).
유전자 발현 산물의 표준 대조 수준은 상이한 대조군에서 유전자 발현을 측정함으로써 결정된다. 대조군 유전자 발현 수준은 이어서 주어진 대상에서 유전자 발현 산물의 측정된 수준과 비교된다. 상기 유전자 발현 산물은 특정 유전자형 군 또는 유전자형 군의 폴리펩티드 유전자 발현 산물과 연관된 특징적인 mRNA일 수 있다. 이어서, 환자는 측정된 수준이 주어진 군에 대한 대조 수준과 유사한 정도를 기초로 하여 특정 유전자형 군으로 분류 또는 배정될 수 있다.
당업자가 이해할 바와 같이, 상기 결정과 관련되는 특정 수준의 불확실성이 존재할 것이다. 따라서, 대조군 수준의 표준 편차를 사용하여 가능성에 근거한 결정을 내리고, 본 발명의 방법은 넓은 범위의 가능성에 기초한 유전자형 군 결정에 대해 적용될 것이다. 따라서, 예를 들어 한 실시태양에서 (이로 제한되지 않음), 유전자 발현 산물의 측정된 수준이 임의의 대조군의 평균의 2.5 표준 편차 내에 해당할 경우, 개체는 그 유전자형 군에 배정될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 유전자 발현 산물의 측정된 수준이 임의의 대조군의 평균의 2.0 표준 편차 내에 해당할 경우, 개체는 그 유전자형 군에 배정될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 유전자 발현 산물의 측정된 수준이 임의의 대조군의 평균의 1.5 표준 편차 내에 해당할 경우, 개체는 그 유전자형 군에 배정될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 유전자 발현 산물의 측정된 수준이 임의의 대조군의 평균의 1.0 이하의 표준 편차 내에 해당할 경우, 개체는 그 유전자형 군에 배정될 수 있다.
따라서, 상기 방법을 사용하여 다양한 수준의 가능성으로 특정 환자를 어느 군에 배정되어야 하는지 결정할 수 있고, 이러한 유전자형 군으로의 배정은 어느 개체를 위험 카테고리에 배정하여야 하는지 결정할 것이다.
mRNA 수준 및 폴리펩티드 유전자 발현 산물의 수준의 검출 및 측정 방법은 당업계에 공지되어 있고, 뉴클레오티드 마이크로어레이 및 질량 분광 및/또는 항체 검출 및 정량화 기술을 수반하는 폴리펩티드 검출 방법의 사용을 포함한다 (또한 문헌 [Tom Strachan ＆ Andrew Read, Human Molecular Genetics, 2nd Edition. (John Wiley and Sons, Inc. Publication, NY, 1999)] 참조).
다른 측면의 측정. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 약물 및 경로 반응을 얻기 위해 전사 상태 이외의 다른 생물학적 상태, 예를 들어 번역 상태, 활성 상태의 측면, 또는 혼합 측면을 평가할 수 있다. 상기 실시태양의 상세한 내용을 아래에서 설명한다.
번역 상태 측정. 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현은 검출가능하게 표지되었거나, 후속적으로 표지될 수 있는 프로브에 의해 검출할 수 있다. 일반적으로, 프로브는 발현된 단백질을 인식하는 항체이다.
용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 또는 키메릭 항체, 및 단백질에 대한 결합을 위해 충분히 생물학적으로 기능성인 항체 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
개시된 유전자의 하나에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체의 생산을 위해 상이한 숙주 동물을 폴리펩티드, 또는 그의 일부의 주사에 의해 면역화시킬 수 있다. 상기 숙주 동물은 토끼, 마우스 및 래트를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 숙주 종에 따라 면역학적 반응을 증가시키기 위해 프로인트 (Freund) (완전 및 불완전), 무기겔, 예를 들어 수산화알루미늄; 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀; 및 잠재적으로 유용한 인간 항원보강제, 예를 들어 칼메트-구에린 간균 (BCG) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 항원보강제를 사용할 수 있다.
폴리클로날 항체는 항원, 예를 들어 표적 유전자 산물, 또는 그의 항원 기능성 유도체로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유도된 항체 분자의 불균질 집단이다. 폴리클로날 항체의 생산을 위해, 상기 설명한 바와 같은 숙주 동물은 상기한 항원보강제로 보충된 코딩되는 단백질, 또는 그의 일부의 주사에 의해 면역화될 수 있다.
특정 항원에 대한 항체의 균질 집단인 모노클로날 항체 (mAb)는 배양 중인 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술에 의해 얻을 수 있다. 이 기술은 하이브리도마 기술 [Kohler ＆ Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); 및 미국 특허 4,376,110]; 인간 B-세포 하이브리도마 기술 [Kosbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030 (1983)]; 및 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., Monoclonal Antibody and Cancer Therapy pp. 77-96 (Alan R. Liss, Inc., 1985)]을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 그의 임의의 서브클래스를 포함하여 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체 내에서 배양될 수 있다. 고 역가의 mAb의 생체 내 생산이 현재 바람직한 생산 방법이다.
또한, 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 "키메릭 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); 및 Takeda et al., Nature 314: 452-454 (1985) 참조)이 사용될 수 있다. 키메릭 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종에서 유래한 분자, 예를 들어 무린 mAb로부터 유래한 가변 또는 초가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 분자이다.
별법으로, 단쇄 항체 생산에 대해 설명된 기술 (미국 특허 4,946,778; Bird, Science 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); 및 Ward et al., Nature 334: 544-546 (1989))을 차별적으로 발현되는 유전자 단쇄 항체 생산에 적용할 수 있다. 단쇄 항체는 아미노산 브릿지를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시켜 단쇄 폴리펩티드를 생성시킴으로써 형성된다.
"인간화 항체"의 생산에 유용한 기술은 단백질에 대한 항체, 그의 단편 또는 유도체의 생산에 채용될 수 있다. 상기 기술은 미국 특허 5,932,448; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,661,016; 및 5,770,429에 개시되어 있다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 디술피드 다리를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 별법으로, 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인할 수 있도록 Fab 발현 라이브러리를 제조할 수 있다 (Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989) 참조).
이어서, 공지의 단백질이 주어진 샘플 내에서 발현되는 정도를 상기 설명된 항체를 사용하는 면역분석 방법에 의해 결정한다. 상기 면역분석 방법은 도트 블로팅 (dot blotting), 웨스턴 블로팅, 경쟁적 및 비-경쟁적 단백질 결합 분석, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 면역 조직 화학, 형광 활성 세포 분리 (FACS), 및 통상 사용되고 과학 및 특허 문헌에 널리 기재된, 상업적으로 사용되는 다른 분석을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
검출 용이성을 위해 샌드위치 ELISA가 특히 바람직하고, 그의 많은 변형이 존재하고, 그 모두를 본 발명의 방법 및 분석에 사용하는 것이 의도된다. 예를 들어, 전형적인 전향 (forward) 분석에서, 비표지된 항체는 고체 기재 상에 고정되고, 시험되는 샘플은 적합한 시간 동인 인큐베이션한 후에 항체-항원 2원 복합체 형성에 충분한 시간 동안 결합된 분자와 접촉시킨다. 이 때, 검출가능한 시그날을 유도할 수 있는 리포터 분자로 표지된 제2 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 3원 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 인큐베이팅한다. 임의의 미반응 물질을 세척하여 제거하고, 항원의 존재는 시그날 관찰에 의해 결정하거나, 또는 기지량의 항원을 포함하는 대조 샘플과 비교하여 정량화할 수 있다. 전향 분석의 변형은 샘플과 항체가 결합된 항체에 동시에 첨가되는 동시 분석, 또는 표지된 항체 및 시험되는 샘플을 먼저 합하여 인큐베이팅한 후, 비표지된 표면 결합 항체에 첨가하는 역분석을 포함한다. 상기 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 경미하게 변경될 가능성을 쉽게 알 수 있을 것이다. 본원에서 사용되는 "샌드위치 분석"은 기본적인 2 부위 (two-site) 기술에 대한 모든 변형을 포함하고자 한 것이다. 본 발명의 면역분석에 대해, 유일한 제한 요인은 표지된 항체가 목적하는 유전자에 의해 발현된 단백질에 특이적인 항체이어야 한다는 점이다.
상기 종류의 분석에서 가장 흔하게 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단- 또는 방사성 핵종-함유 분자이다. 효소 면역분석 (EIA)의 경우에, 효소는 대체로 글루타르알데히드 또는 페리오데이트에 의해 제2 항체에 컨쥬게이팅된다. 그러나, 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 매우 다양한 상이한 라이게이션 기술이 존재하고, 이는 당업자에게 공지되어 있다. 널리 사용되는 효소는 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제 및 알칼린 포스파타제를 포함한다. 특정 효소와 함께 사용되는 기질은 일반적으로 대응하는 효소에 의한 가수분해시에 검출가능한 색상 변화를 생성시키기 위해 선택된다. 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트는 알칼린 포스파타제 컨쥬게이트와 함께 사용하기에 적합하고, 퍼옥시다제 컨쥬게이트에 대해서는 1,2-페닐렌디아민 또는 톨루이딘이 통상 사용된다. 또한, 상기한 발색 기질보다는 형광을 생성시키는 형광 기질을 사용할 수도 있다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 3원 복합체에 첨가한다. 기질은 제2 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 시그날을 생성시키고, 이는 혈청 샘플 내에 존재하는 단백질의 양을 평가하기 위해 대체로 분광광도 분석에 의해 추가로 정량화될 수 있다.
별법으로, 형광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민은 그의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 빛의 조사에 의해 활성화될 때, 형광색소 (fluorochrome)-표지된 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자의 여기 상태를 유도한 후, 특징적인 보다 긴 파장의 빛을 방출시킨다. 방출은 광학 현미경에 의해 가시적으로 검출가능한 특징적인 색상으로 나타난다. 면역형광 및 EIA 기술은 모두 당업계에 잘 확립되어 있고, 본 발명의 방법에 특히 바람직하다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 화학발광 또는 생체발광 분자도 사용할 수 있다. 요구되는 용도에 적합하도록 절차를 변경시키는 방법은 당업자가 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 발명의 유전자의 번역 상태의 측정은 또한 복수의 추가의 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 전체 게놈 모니터링 (즉 "프로테옴 (proteome))" (Goffeau et al., 상기 문헌)은 결합 부위가 세포 게놈에 의해 코딩되는 다수의 단백질 종에 특이적이며, 고정된, 바람직하게는 모노클로날 항체를 포함하는 마이크로어레이를 제조함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는, 코딩되는 단백질의 실질적인 분획, 또는 적어도 목적하는 생물학적 네트워크 모델의 시험 또는 확인에 관련된 단백질에 대한 항체가 존재한다. 모노클로날 항체의 제조 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 그 전부가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 문헌 [Harlow ＆ Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY, 1988)] 참조). 바람직한 실시태양에서, 모노클로날 항체는 세포의 게놈 서열을 기초로 하여 설계된 합성 펩티드 단편에 대해 생성된다. 상기 항체 어레이를 사용하여, 세포로부터의 단백질을 어레이에 접촉시키고, 그의 결합은 당업계에 공지된 분석으로 분석한다.
단백질은 2차원 겔 전기영동 시스템에 의해 분리될 수 있다. 2차원 겔 전기영동은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 제1 차원을 따른 등전 집속 (focusing) 및 제2 차원을 따른 SDS-PAGE 전기영동을 수반한다 (예를 들어, Hames et al., Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach (IRL Press, NY, 1990); Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14440-14445 (1996); Sagliocco et al., Yeast 12: 1519-1533 (1996); 및 Lander, Science 274: 536-539 (1996) 참조). 생성되는 전기영동도는 질량 분광 기술, 웨스턴 블롯 및 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 사용한 면역블롯 분석, 및 내부 및 N-말단 마이크로서열결정을 포함하는 많은 기술에 의해 분석할 수 있다. 상기 기술을 이용하여, 약물에 노출된 세포, 예를 들어 효모 내 또는 예를 들어 특정 유전자의 결손 또는 과발현에 의해 변형된 세포 내를 포함하여 주어진 생리학적 조건 하에서 생산된 모든 단백질의 실질적인 분획을 확인할 수 있다.
체액 또는 조직에서 유전자의 폴리펩티드 (단백질) 발현 산물의 검출은 다형성의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용될 수 있고, 폴리펩티드 발현 산물의 상대적인 수준은 다형성이 동형접합성 또는 이형접합성 상태에 존재하는지(및 따라서 개체의 위험 카테고리)를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
생물학적 상태의 다른 측면에 기초한 실시태양. mRNA 풍부도 이외의 다른 세포 성분을 모니터링하는 것이 현재 특정한 기술적 어려움을 나타내지만, 본 발명의 방법을 사용하는 당업자는 세포 기능의 특성 분석에 관련된 단백질의 활성을 측정할 수 있고 본 발명의 실시태양은 상기 측정에 기초로 할 수 있음을 분명하게 알 수 있을 것이다. 활성 측정은 특성이 분석되는 특정 활성에 적합한 임의의 기능적, 생화학적 또는 물리적 수단에 의해 수행될 수 있다. 활성이 화학적 변형을 수반하는 경우, 세포 단백질은 천연 기질과 접촉할 수 있고, 변형 비율을 측정할 수 있다. 활성이 다량체 단위의 회합, 예를 들어 활성화된 DNA 결합 복합체와 DNA의 회합을 수반하는 경우, 회합된 단백질의 양 또는 회합의 2차적인 결과, 예를 들어 전사되는 mRNA의 양을 측정할 수 있다. 또한, 예를 들어 세포 주기 조절에서와 같이 단지 기능성 활성만이 알려진 경우에는, 기능의 수행이 관찰될 수 있다. 그러나, 알려지고 측정된, 단백질 활성의 변화는 본 발명의 방법에 의해 분석된 반응 데이타를 형성한다.
별도의 비제한적 실시태양에서, 반응 데이타는 세포의 생물학적 상태의 혼합 측면으로 형성될 수 있다. 반응 데이타는 예를 들어 특정 mRNA 풍부도의 변화, 특정 단백질 풍부도의 변화 및 특정 단백질 활성의 변화로부터 얻을 수 있다.
마커로서 핵산 및 단백질의 검출. 특정 실시태양에서, 마커에 대응하는 mRNA의 수준은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 계내 (in situ) 및 시험관내 포맷으로 결정할 수 있다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상으로부터 단리된 조직, 세포, 생물학적 유체 및 그의 단리물, 및 대상 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하는 의미이다. 많은 발현 검출 방법은 단리된 RNA를 이용한다. 시험관내 방법에 있어서, 세포로부터 RNA를 정제하기 위해 mRNA의 단리에 대해 선택하지 않는 임의의 RNA 단리 기술을 이용할 수 있다 [예를 들어, Ausubel et al., Ed., Curr. Prot. Mol. Biol. (John Wiley ＆ Sons, NY, 1987-1999) 참조]. 추가로, 매우 많은 조직 샘플은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어 미국 특허 4,843,155의 1단계 RNA 단리 공정을 사용하여 용이하게 처리될 수 있다.
단리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, PCR 분석 및 프로브 어레이를 포함하고 이로 제한되지 않는 혼성화 또는 증폭 분석에 사용될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위한 하나의 바람직한 진단 방법은 단리된 mRNA를 검출되는 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것을 수반한다. 핵산 프로브는 예를 들어 전장 cDNA 또는 그의 일부, 예를 들어 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 엄격한 조건 하에서 본 발명의 마커를 코딩하는 mRNA 또는 게놈 DNA와 특이적으로 혼성화하기에 충분하다. 본 발명의 진단적 분석에 사용하기 적합한 다른 프로브가 본원에 기재된다. mRNA와 프로브의 혼성화는 목적하는 마커가 발현되고 있음을 나타낸다.
한 포맷에서, mRNA는 예를 들어 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에서 이동시키고 mRNA를 겔로부터 막, 예를 들어 니트로셀룰로스로 이송시킴으로써 고체 표면 상에 고정되고 프로브와 접촉하게 된다. 다른 포맷에서, 프로브가 예를 들어 Affymetrix 유전자 칩 어레이에서 고체 표면 상에 고정되고, mRNA는 프로브와 접촉된다. 당업자는 본 발명의 마커에 의해 코딩되는 mRNA의 수준을 검출할 때 사용하기 위해 공지의 mRNA 검출 방법을 쉽게 적용할 수 있다.
본 발명의 마커에 대응하는 mRNA의 샘플내 수준을 결정하는 다른 방법은 예를 들어 RT-PCR (Mullis의 미국 특허 4,683,202 (1987)에 제시된 실험 실시태양); 리가제 연쇄 반응 [Barany (1991), 상기 문헌]; 자기부양 서열 복제 [Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878 (1990)]; 전사 증폭 시스템 [Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177 (1989)]; Q-베타 레플리카제 [Lizardi et al., Biol. Technology 6: 1197 (1988)]; 롤링 서클 (rolling circle) 복제 [미국 특허 5,854,033 (1988)]; 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭 과정 및 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 증폭된 분자의 검출을 수반한다. 상기 검출 과정은 핵산 분자가 극히 소량으로 존재할 경우 핵산 분자의 검출을 위해 특히 유용하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 증폭 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 영역 (각각 플러스 및 마이너스 스트랜드, 또는 그 반대)에 어닐링하고 짧은 영역을 포함할 수 있는 핵산 분자의 쌍으로서 규정된다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 약 10-30개의 뉴클레오티드 길이이고 약 50-200개의 뉴클레오티드 길이의 영역에 플랭킹(flanking)된다. 적절한 조건 하에 적절한 시약을 사용하여, 상기 프라이머는 프라이머에 의해 플랭킹된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 허용한다.
계내 방법을 위해, mRNA는 검출 전에 세포로부터 단리될 필요가 없다. 상기 방법에서, 세포 또는 조직 샘플은 공지의 조직학적 방법을 사용하여 제조/처리된다. 이어서, 샘플을 지지체, 일반적으로 유리 슬라이드 상에 고정시킨 후, 마커를 코딩하는 mRNA에 혼성화할 수 있는 프로브와 접촉시킨다.
마커의 절대 발현 수준을 기초로 한 결정에 대한 대안으로서, 마커의 정규화된 발현 수준을 기초로 하여 결정을 내릴 수 있다. 발현 수준은 마커의 절대 발현 수준을 보정하거나 그의 발현을 마커가 아닌 유전자, 예를 들어 구성적으로 발현되는 하우스키핑 (housekeeping) 유전자의 발현과 비교함으로써 정규화된다. 정규화에 적합한 유전자는 하우스키핑 유전자, 예를 들어 액틴 유전자 또는 상피 세포-특이적 유전자를 포함한다. 상기 정규화를 통해 하나의 샘플, 예를 들어 환자 샘플 내의 발현 수준을 다른 샘플 또는 상이한 공급원으로부터의 샘플과 비교할 수 있다.
별법으로, 발현 수준은 상대적인 발현 수준으로서 제공될 수 있다. 마커의 상대적인 발현 수준을 결정하기 위해, 마커의 발현 수준은 시험 대상 샘플에 대한 발현 수준의 결정 전에 질병에 대한 10개 이상의 정상 생물학적 샘플, 바람직하게는 50개 이상의 샘플에 대해 결정된다. 보다 많은 수의 샘플에서 분석된 각각의 유전자의 평균 발현 수준을 결정하고, 마커에 대한 기저선 발현 수준으로 사용한다. 이어서, 시험 샘플에 대해 결정된 마커의 발현 수준 (절대 발현 수준)을 상기 마커에 대해 얻은 평균 발현값으로 나눈다. 이와 같이 하여 상대적인 발현 수준을 얻는다.
바람직하게는, 기저선 결정에 사용되는 샘플은 다형성을 갖지 않는 대상으로부터 유래한 것일 것이다. 세포 공급원의 선택은 상대적인 발현 수준의 사용에 따라 결정된다. 정상 조직에서 발견된 발현을 평균 발현 스코어로서 사용하면 분석된 마커가 (정상 세포에 대비하여) 특이적인지 확인일 수 있다. 또한, 보다 많은 데이타가 축적되면, 평균 발현값을 정정할 수 있고, 이를 통해 축적된 데이타를 기초로 하여 개선된 상대 발현값을 제공할 수 있다.
폴리펩티드의 검출. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 마커에 대응하는 폴리펩티드가 검출된다. 본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위해 바람직한 물질은 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 검출가능한 표지를 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날, 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 무손상 항체, 또는 그의 단편, 예를 들어, Fab 또는 F(ab')2가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체에 관하여 사용되는 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링, 즉 물리적으로 연결시킴으로써 수행되는 프로브 또는 항체의 직접 표지 및 직접 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접 표지를 포함하는 의미이다. 간접 표지의 예는 형광 표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출될 수 있도록 비오틴을 사용한 DNA 프로브의 말단 표지를 포함한다.
개체로부터의 단백질은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 단리할 수 있다. 사용된 단백질 단리 방법은 예를 들어 문헌 [Harlow ＆ Lane (1988), 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 방법일 수 있다.
샘플이 주어진 항체에 결합하는 단백질을 포함하는지를 결정하기 위해 다양한 포맷이 사용될 수 있다. 상기 포맷의 예는 EIA, 방사성 면역분석 (RIA), 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 당업자는 공지의 단백질/항체 검출 방법을, 세포가 본 발명의 마커를 발현하는지의 여부 및 혈액 또는 다른 신체 조직에서 특이적 폴리펩티드 발현 산물의 상대적인 농도를 결정할 때 사용하기 위해 용이하게 적용할 수 있다.
한 포맷에서, 항체 또는 항체 단편은 발현된 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 또는 면역형광 기술과 같은 방법에 사용될 수 있다. 상기 용도에서, 일반적으로 항체 또는 단백질을 고체 지지체 상에 고정시키는 것이 바람직하다. 적합한 고상 지지체 또는 캐리어는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 공지의 지지체 또는 캐리어는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변성 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자철광을 포함한다.
당업자는 항체 또는 항원 결합을 위한 많은 다른 적합한 캐리어를 알 것이고, 상기 지지체를 본 발명에 사용하기 위해 적용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 환자 세포로부터 단리된 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 이동하여 고상 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스에 고정될 수 있다. 이어서, 지지체는 적합한 버퍼로 세척된 후, 검출가능하게 표지된 항체로 처리된다. 이어서, 미결합된 항체를 제거하기 위해 고상 지지체를 버퍼로 다시 세척할 수 있다. 이어서, 고체 지지체 상의 결합된 표지의 양은 통상적인 수단에 의해 검출한 후, 상기 측정치를 혈액 또는 다른 신체 조직 내의 단백질의 수준 또는 농도로 전환할 수 있다.
키트. 본 발명은 또한 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청, 혈장, 림프, 낭성액, 소변, 대변, 뇌척수액, 복수액 또는 혈액을 포함하여 이로 제한되지 않는 임의의 체액 및 신체 조직의 생검 샘플에서 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플에서 표지된 화합물 또는 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 검출할 수 있는 물질 및 샘플 내의 폴리펩티드 또는 mRNA의 양을 결정하기 위한 수단, 예를 들어 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 키트를 사용하여 얻은 결과를 해석하기 위한 지시서를 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 별개의 용기에 포장된 적어도 2개의 제노타이핑 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 또한 별개의 용기에 포장된 다른 성분, 예를 들어 혼성화 버퍼 (올리고뉴클레오티드가 프로브로서 사용되는 경우)를 포함할 수 있다. 별법으로, 올리고뉴클레오티드가 표적 구역 증폭을 위해 사용되는 경우, 키트는 별개의 용기에 포장된 폴리머라제 및 예를 들어 PCR의 경우에 폴리머라제에 의해 매개되는 프라이머 연장을 위해 최적화된 반응 버퍼를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 키트는 DNA 샘플 수거 수단을 추가로 포함할 수 있다.
특히, 제노타이핑 프라이머 조성물은 적어도 두 세트의 대립유전자 특이적 프라이머쌍을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 2개의 제노타이핑 올리고뉴클레오티드는 별개의 용기에 포장된다.
항체 기반 키트의 경우, 키트는 예를 들어 1) 예를 들어 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드에 결합하는, 고체 지지체에 부착된 제1 항체, 및 임의로; 2) 폴리펩티드 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능한 표지에 컨쥬게이팅된 제2의 상이한 항체를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 기반 키트의 경우, 키트는 예를 들어 1) 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 혼성화하는 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드; 또는 2) 본 발명의 마커에 대응하는 핵산 분자의 증폭에 유용한 프라이머의 쌍을 포함할 수 있다.
키트는 또한 예를 들어 완충제, 보존제 또는 단백질-안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출가능한 표지, 예를 들어 효소 또는 기질을 검출하기 위해 필요한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 키트는 분석되어 시험 샘플과 비교될 수 있는 대조 샘플 또는 일련의 대조 샘플을 포함할 수도 있다. 키트의 각각의 성분은 개별 용기에 봉입될 수 있고, 상이한 모든 용기가 키트를 사용하여 수행된 분석 결과를 해석하기 위한 지시서와 함께 단일 패키지 내에 포함될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 더욱 충분히 예시하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 어떠한 식으로도 청구의 범위에 의해 규정되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 I
만성 변비의 환자의 테가세로드에 대한 반응의 약물유전학적 분석
도입. 처음 4주 치료 동안 완전 자발적 배변 (CSBM)의 횟수를 측정함으로써 위약에 대비하여 6 mg bid (12 mg/day) 또는 2 mg bid (4 mg/day)에서 테가세로드 (Zelmac(등록상표)/Zelnorm™)의 효능을 평가하기 위해 임상 시험을 수행하였다. 2차 목표는 전체 12주 치료 기간 동안 CSBM의 횟수, 배변 습관, 완하제 사용, 및 안전성 및 내약성 문제를 평가하는 것을 포함하였다. 임상 시험 디자인은 약물치료가 없는 2주 기저선 기간, 12주의 무작위 이중 맹검의 위약-대조 치료 기간, 및 연구 약물치료가 없는 4주 금단기로 이루어졌다. 임상 시험의 일부로서, DNA를 약물 표적 및 질병 병인에 관련한 유전자 다형성을 평가하기 위해 약물유전학적 분석을 위한 스크리닝에서 환자로부터 수집하였다.
SLC6A4 유전자에 대해 2가지 주요 종류의 삽입/결손 다형성을, 하나는 인트론 2에, 다른 하나는 프로머터 구역에서 특성화되었다. SLC6A4는 SERT 또는 HTT로서도 알려진 세로토닌 전달체 유전자이다. 카밀레리 (Camilleri) 및 동료 연구자들은 SLC6A4 프로모터 삽입/결손 다형성이 세로토닌 5-HT3 수용체 길항제인 알로세트론으로 치료한 후 대장 통과 반응과 연관되었음을 보고하였다 (Camilleri M et al., Gastroenterology; 123 (2):425-32 (2002)). 본 발명자들은 세로토닌 전달체 프로모터 다형성의 C16 (긴) 대립유전자에 대해 동형접합성인 개체가 위약에 비해 테가세로드에 대한 보다 큰 반응을 나타내는 경향이 있음을 발견하였다. C16-C16에 대한 총 반응률은 테가세로드에 대해 48％ 및 위약에 대해 21％ (OR=3.51, 95％ CI: 1.67-7.41)로서, 이를 테가세로드에 대해 45％ 및 위약에 대해 27％ (OR=2.3, 95％ CI: 0.93-5.69)인 C14-C14 동형접합체, 및 테가세로드에 대해 43％ 및 위약에 대해 28％ (OR=1.95; 95％ CI: 1.12-3.41)인 C14-C16 이형접합체에 비교하였다. 주어진 처리군 내에서, 상이한 유전자형 사이의 반응률 사이에 통계학상 유의한 차이는 없었다.
본 연구에서, 23개의 새로운 후보 유전자 내의 총 55개 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 평가하였다 (완전한 목록은 표 1을 참조한다). 이들은 약물 표적 (HTR4), 및 5-HT3 수용체 서브유닛 HTR3A 및 HTR3B 내의 많은 SNP를 포함하였다. 세로토닌 합성 (TPH, TDO2) 및 하류 세로토닌 시그널링 (CALCA 또는 CGRP1)과 관련된 유전자, 및 장 운동성, 예를 들어 모틸린 (MLN) 및 장 분비 (SLC12A2, AQP3, SCNN1A)와 관련된 유전자를 또한 평가하였다.
후보 유전자 목록
유전자 설명 기능/해설
ABP1 아밀로라이드 결합 단백질 1 (아민 옥시다제 (구리-함유)); 디아민 옥시다제 (DAO) 테가세로드의 분해 생성물인 펜틸아미노구아니딘 (PAG)에 의한 억제; 마우스에서 나타난 점막 증식의 가능한 안정성 문제에 기초하여 선택됨
ADORA1 아데노신 A1 수용체 아데노신에 선택적으로 결합하는 G 단백질-커플링된 수용체; 장관 신경계에 관여됨
AQP3 아쿠아포린 3 많은 세포의 형질막에서 수분 선택성 채널로서 기능하는 내재성 막 단백질의 아쿠아포린 패밀리의 멤버
AQP4 아쿠아포린 4 물, 글리세롤, 또는 다른 소분자를 수송하는 수분 채널; 단백질의 MIP 패밀리의 멤버
CALCA 칼시토닌/칼시토닌-관련 폴리펩티드, 알파 (CGRP1) 칼시토닌 및 칼시토닌 유전자-관련 펩티드의 전구체; 신경계 및 말초 조직에서 발견되는 수용체에 대한 리간드
CFTR 낭성 섬유증 트랜스멤브레인 조절자 Cl 수송; ENaC 나트륨 채널의 조절자
HTR3A 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 3A 연동 반사를 개시하고 관강내 분비를 촉진시키는데 관여하는 세로토닌에 의한 활성화
HTR3B 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 3B 연동 반사를 개시하고 관강내 (intraluminal) 분비를 촉진시키는데 관여하는 세로토닌에 의한 활성화
HTR4 5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 4 Zelmac의 표적; 연동 반사를 개시하고 관강내 분비를 촉진시키는데 관여하는 세로토닌에 의한 활성화
MLN 모틸린 유문동 (antrum) 및 십이지장의 수축을 자극함
SCNN1A 나트륨 채널, 비-전압 게이팅된 1 알파 Na 수송
유전자 설명 기능/해설
SGK 혈청 ＆ 글루코코르티코이드 조절 키나제 초기 알도스테론 작용을 매개하는 결장에서 중요한 조절 단백질
SLC12A2 용질 캐리어 패밀리 12 (나트륨/칼륨/염소 전달체), 멤버 2 NKCC1 - 용질 수송
SLC12A4 용질 캐리어 패밀리 12 (칼륨/염소 전달체), 멤버 4 KCC1 용질 수송
SLC26A3 용질 캐리어 패밀리 26, 멤버 3 결장에서 발현되는 종양 서프레서; 가능한 음이온 전달체 활성을 가짐
SLC4A1 용질 캐리어 패밀리 4, 음이온 교환기, 멤버 1 (적혈구 막 단백질 밴드 3, Diego 혈액형) AE1 - 음이온 교환 1
SLC4A2 용질 캐리어 패밀리 4, 음이온 교환기, 멤버 2 (적혈구 막 단백질 밴드 3-유사 1) AE2 - 음이온 교환 2
SLC9A2 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 이소형 2 (NHE2) 일렉트로뉴트롤 (electroneutrol) NaCl 수송
SLC9A3 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 이소형 3 (NHE3) 일렉트로뉴트롤 NaCl 수송
SLC9A3R1 용질 캐리어 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 이소형 3 조절 인자 1 NHE3 (SLC9A3)의 조절 보조인자 나트륨/수소 역운반체
TAC1 태키키닌, 전구체 1 (물질 K, 물질 P, 뉴로키닌 1, 뉴로키닌 2, 뉴로메딘 L, 뉴로키닌 알파, 신경펩티드 K, 신경펩티드 감마) 신경 수용체 및 평활근 세포와 상호작용하는 신경전달물질로서 기능하는 것으로 생각되는 호르몬; 혈관확장제 및 분비촉진제로서 기능함
TDO2 트립토판 2,3-디옥시게나제 트립토판의 세로토닌으로의 이화에서 속도 제한 단계를 촉매함
TPH 트립토판 히드록실라제 (트립토판 5-모노옥시게나제) 세로토닌의 합성에서 초기 및 속도 제한 단계를 촉매함
샘플. 총 1348명의 환자를 치료 대상 (ITT) 집단으로서 랜덤화하였다. 상기 환자로부터의 혈액 샘플을 환자 스크리닝의 시점에 수집하고, DNA를 PUREGENE™ DNA 단리 키트 (D-50K)를 사용하여 추출하였다. 이들 중에, 738명의 랜덤화된 환자로부터의 샘플이 평가된 55개 SNP의 적어도 절반에 대하여 우수한 품질 유전자형 데이타를 가졌다.
임상 평가. 1차 효능을 완전 자발적 배변 (CSBM)의 횟수에 의해 측정하였고, 여기서 "완전"은 완전 배변감을 일으키는 배변을 나타내고, "자발적"은 24시간 이내에 완하제를 사용하지 않은 것을 나타낸다. 평가된 1차 효능 종점은 4주 치료 후 기저선을 초과한 CSBM/주의 1회 이상 증가였다. 상기 제노타이핑 연구에서 평가된 2차 종점은 RESP12 (12주 치료 후 증가 기저선을 초과한 CSBM/주의 1회 이상 증가)였다. 환자가 상기 기준을 만족하면 반응자로서 분류하고, 적어도 7일의 치료를 완료하였다. 추가의 2차 효능 평가, 예를 들어 견디기 힘든 변비, 견디기 힘든 복통, 및 12주 치료 기간의 끝에 배변 습관에서 만족은 주단위 일지 평가를 기초로 하여 평가하였다 (기저선 값을 분석을 위한 공변 (co-variant)으로서 이용하여).
제노타이핑. 23개 후보 유전자에서 총 61개의 다형성을 분석을 위해 선택하였다된. 제노타이핑은 대부분의 분석에 대해 TaqMan(등록상표) 기술을 이용하여 수행하였지만, 몇몇은 사내에서 써드 웨이브 테크놀로지스 Invader 분석 기술을 이용하여 수행하였다 (모든 평가된 SNP에 대한 분석 ID에 대해서는 표 2를 참조한다). 제노타이핑된 61개의 SNP 중에서 55개가 추가의 평가에 사용하기 위한 우수한 품질의 다형성 유전자형을 수득하였다.
Figure 112007056648437-PCT00001
통계적 분석. 통계적 분석은 SAS 버전 8.2 (더 에스에이에스 인스티튜트 (The SAS Institute, 미국 노스캐롤라이나주 캐리))를 이용하여 수행하였다. 분석 방법은 피셔의 정확 검정, 공변량 분석 (ANCOVA), 로지스틱 회귀, 및 교차비 및 95％ 신뢰 구간을 결정하기 위해 Mantel-Haenzel 시험을 포함하였고, 유의성은 p<0.05에서 확립하였다. 연관 불균형의 계산은 문헌 [Abecasis ＆ Cookson, Bioinformatics 16: 182-3 (2000)]에 설명된 GOLD (연관 불균형의 도표 오버뷰 (graphical overview)) 방법을 이용하여 수행하였다.
인구통계 비교. 표 3은 총 임상 연구에서 환자 및 본 유전자형 분석에 포함된 환자의 인구통계적 분류를 제시한다. 분포는 유전자형 집단과 전체 환자 집단 사이에 유사하였다. 인종에 의한 유전자형의 비교는 55개의 SNP 중 39개가 인종에 의해 유전자형 분포에서 유의한 차이를 가짐을 증명하였다 (p<0.05 피셔의 정확 검정). 상기 발견에 기초하여, 후속적인 유전자형 분석에 대한 인종의 교락 (confounding) 효과를 방지하기 위해 분석을 모든 환자의 거의 90％를 차지하는 백인 집단으로 제한하는 것으로 결정하였다. 또한, 분석은 또한 적어도 7일 동안 테가세로드 또는 위약으로 치료한 치료 대상 환자 (총 635명의 환자)로 제한하였다.
제노타이핑된 환자의 인구통계
모든 ITT 환자 ITT 백인, >=7일의 Trt
모든 환자 제노타이핑된 모든 환자 제노타이핑된
N (％) N (％) N (％) N (％)
성별
남성 (SEX1C=1) 135 (10.0) 86 (11.7) 113 (10.1) 70 (11.0)
여성 (SEX1C=2) 1213 (90.0) 652 (88.4) 1006 (89.9) 565 (89.0)
인종
백인 (RCE1C=1) 1142 (84.7) 646 (87.5) 1119 (100.0) 635 (100.0)
흑인 (RCE1C=2) 96 (7.1) 47 (6.4) - - - -
동양인 (RCE1C=3) 6 (0.5) 5 (0.7) - - - -
기타 (RCE1C=4) 104 (7.7) 40 (5.4) - - - -
연령 카테고리
<65 (AGECAT=1) 1188 (88.1) 648 (87.8) 971 (86.8) 548 (86.3)
>=65 (AGECAT=2) 160 (11.9) 90 (12.2) 148 (13.2) 87 (13.7)
치료
테가세로드 6-mg bid (TRTC=B2) 451 (33.5) 240 (32.5) 375 (33.5) 204 (32.1)
테가세로드 2-mg bid (TRTC=C2) 450 (33.4) 260 (35.2) 375 (33.5) 227 (35.8)
위약 (TRTC=P) 447 (33.2) 238 (32.3) 369 (33.0) 204 (32.1)
총 1348 738 1119 635
ITT = 치료 대상; N = 환자의 수; Trt = 치료
총 반응률의 비교. 표 4는 총 환자 집단 및 본 발명자들이 유전자형 데이타를 갖는 환자의 하위군 (모든 인종 및 백인만) 모두에 대해 위약에 비교한 테가세로드 6-mg bid에 대한 1차 효능 종점 (4주 후 기저선을 초과한 CSBM/주의 1회 이상의 평균 증가)에 대한 총 반응을 나타낸다. 모든 경우에, 테가세로드로 치료한 개체는 위약으로 치료한 개체에 비해 더 높은 반응률을 보고하였지만, 남성 또는 고령 집단에서통계학상 유의한 차이는 보이지 않았다. 이는 또한 보다 저 용량 (2-mg bid)의 테가세로드에서도 보이지만, 반응은 6-mg bid 용량에 대해 보인 것보다 적었다. 추가의 분석은 6-mg bid 테가세로드-처리 및 위약-처리 환자 사이의 비교로 제한하였다.
4주 치료 후 테가세로드 6-mg bid 대 위약에 대한 반응률; 모든 환자와 제노타이핑된 환자 사이의 비교
연령 성별 환자의 수 ％ 반응자 교차비 (95％ CI) p-값
Teg-6 Plac 총 Teg-6 Plac
모든 환자 (ITT, 적어도 7일의 치료)
모든 M+F 439 438 877 44％ 25％ 2.3 (1.8, 3.1) <0.0001
모든 여성 397 398 795 45％ 26％ 2.4 (1.8, 3.2) <0.0001
모든 남성 42 40 82 36％ 23％ 1.9 (0.7, 5.1) 0.1914
<65 M+F 399 379 778 45％ 25％ 2.5 (1.8, 3.3) <0.0001
>=65 M+F 40 59 99 35％ 27％ 1.4 (0.6, 3.4) 0.4048
모든 백인 (ITT, 적어도 7일의 치료)
모든 M+F 375 369 744 45％ 25％ 2.5 (1.8, 3.4) <0.0001
모든 여성 337 332 669 46％ 25％ 2.6 (1.8, 3.5) <0.0001
모든 남성 38 37 75 37％ 24％ 1.8 (0.7, 4.9) 0.2430
<65 M+F 336 315 651 46％ 24％ 2.7 (1.9, 3.8) <0.0001
>=65 M+F 39 54 93 33％ 30％ 1.2 (0.5, 2.9) 0.7051
모든 제노타이핑된 (ITT, 적어도 7일의 치료)
모든 M+F 234 234 468 46％ 24％ 2.7 (1.8, 4.0) <0.0001
모든 여성 209 208 417 45％ 24％ 2.7 (1.8, 4.1) <0.0001
모든 남성 25 26 51 48％ 27％ 2.5 (0.8, 8.1) 0.1233
<65 M+F 216 203 419 45％ 23％ 2.8 (1.8, 4.2) <0.0001
>=65 M+F 18 31 49 50％ 29％ 2.4 (0.7, 8.2) 0.1463
백인 제노타이핑된 (ITT, 적어도 7일의 치료)
모든 M+F 204 204 408 46％ 25％ 2.6 (1.7, 4.0) <0.0001
모든 여성 183 181 364 45％ 24％ 2.7 (1.7, 4.2) <0.0001
모든 남성 21 23 44 52％ 30％ 2.5 (0.7, 8.6) 0.1437
<65 M+F 187 174 361 46％ 24％ 2.8 (1.8, 4.3) <0.0001
>=65 M+F 17 30 47 47％ 30％ 2.1 (0.6, 7.1) 0.2473
Teg-6 = 테가세로드 6-mg bid; Plac = 위약; CI = 신뢰 구간; ITT = 치료 대상; M+F = 남성 및 여성
본 발명의 제노타이핑된 집단 (백인, 적어도 7일의 치료)에 대해 위약에서 25％에 비해 테가세로드 6-mg bid에 대한 총 반응률은 46％이었다. 위약에 비교할 때 주어진 치료의 양성 반응을 얻는 가능성을 나타내는 계산된 교차비는 2.6 (95％ CI: 1.7 - 4.0)이었다. 상기 값은 통계학상 매우 유의하고, 전체로서 임상 시험에 대해 계산된 값에 필적하였다 (표 4 참조). 제노타이핑된 하위집단에서 다소 더 높은 것으로 나타난 남성 및 고령자에서 반응을 제외하고는 환자 집단 사이에서 반응률은 유사하였다. 표 5에 제시된 바와 같이, 12주 치료 후 유사한 결과가 보였다.
12주 치료 후 테가세로드 6-mg bid 대 위약에 대한 반응률; 모든 환자와 제노타이핑된 환자 사이의 비교
연령 성별 환자의 수 ％ 반응자 교차비 (95％ CI) p-값
Teg-6 Plac 총 Teg-6 Plac
모든 환자 (ITT, 적어도 7일의 치료)
모든 M+F 439 438 877 46％ 27％ 2.3 (1.7, 3.0) <0.0001
모든 여성 397 398 795 46％ 28％ 2.2 (1.7, 3.0) <0.0001
모든 남성 42 40 82 43％ 23％ 2.6 (1.0, 6.8) 0.0513
<65 M+F 399 379 778 46％ 27％ 2.3 (1.7, 3.2) <0.0001
>=65 M+F 40 59 99 40％ 29％ 1.6 (0.7, 3.8) 0.2490
모든 백인 (ITT, 적어도 7일의 치료)
모든 M+F 375 369 744 47％ 26％ 2.5 (1.9, 3.4) <0.0001
모든 여성 337 332 669 47％ 26％ 2.5 (1.8, 3.5) <0.0001
모든 남성 38 37 75 45％ 24％ 2.5 (0.9, 6.8) 0.0651
<65 M+F 336 315 651 48％ 25％ 2.8 (2.0, 3.9) <0.0001
>=65 M+F 39 54 93 38％ 31％ 1.4 (0.6, 3.2) 0.4868
모든 제노타이핑된 (ITT, 적어도 7일의 치료)
모든 M+F 234 234 468 47％ 26％ 2.6 (1.7, 3.8) <0.0001
모든 여성 209 208 417 47％ 26％ 2.5 (1.7, 3.8) <0.0001
모든 남성 25 26 51 52％ 27％ 2.9 (0.9, 9.5) 0.0694
<65 M+F 216 203 419 47％ 25％ 2.6 (1.7, 4.0) <0.0001
>=65 M+F 18 31 49 56％ 32％ 2.6 (0.8, 8.7) 0.1134
백인 제노타이핑된 (ITT, 적어도 7일의 치료)
모든 M+F 204 204 408 49％ 25％ 2.8 (1.9, 4.3) <0.0001
모든 여성 183 181 364 48％ 25％ 2.8 (1.8, 4.4) <0.0001
모든 남성 21 23 44 57％ 30％ 3.0 (0.9, 10.5) 0.0774
<65 M+F 187 174 361 49％ 24％ 3.0 (1.9, 4.7) <0.0001
>=65 M+F 17 30 47 53％ 33％ 2.3 (0.7, 7.6) 0.1929
Teg-6 = 테가세로드 6-mg bid; Plac = 위약; CI = 신뢰 구간; ITT = 치료 대상; M+F = 남성 및 여성
1차 효능 종점: 4주 치료 후 반응. 1차 통과 분석으로서, 반응을 유전자형의 기능으로서 평가하기 위해 피셔의 정확 검정을 수행하였다. 상기 분석은 6-mg bid 테가세로드 및 위약 처리군 모두에 대해 따로 이루어졌다. 상기 기준만을 사용하면, 테가세로드 처리군에 대해 약물 표적 (HTR4)에서 4개의 SNP, 나트륨 채널 SCNN1A에서 1개의 SNP, 및 Na-K-2Cl 동시수송체 SLC12A2에서 2개의 SNP에 대해 유의한 연관 (p<0.05, 다중 시험 보정 없음)이 보였다 (표 6 참조). 트립토판 2,3-디옥시게나제 (TDO2) 유전자에서 추가의 SNP (SNP 3746)이 또한 테가세로드 군에서 유의한 p-값을 나타냈다 (p<0.01). 위약 처리군 사이에는 통계학상 유의한 연관이 보이지 않았다.
Figure 112007056648437-PCT00002
본 발명자들은 또한 테가세로드에 대한 평균보다 높은 반응을 나타내고 교차비에 의해 결정될 때 테가세로드 및 위약 처리된 환자 사이의 반응에서의 차이를 최대화시키는 SNP를 확인할 수 있는지 알고자 하였다. 테가세로드에 대한 적어도 60％ 반응률 및 5 이상의 교차비의 컷오프 (cut-off)를 이용하여, 55개의 SNP 중에서 4주 치료 후 상기 기준에 맞는 12개의 SNP를 확인하였다. 상기 "고반응자" SNP는 약물 표적 HTR4에서 6개, HTR3B에서 1개, Na-K-2Cl 동시수송체 (SLC12A2)에서 2개, 아쿠아포린 채널 AQP3에서 1개, 모틸린 (MLN)에서 1개, 및 비-전압 게이팅된 Na 채널 SCNN1A에서 1개를 포함하였다 (표 6 참조). 4가지 유전자 (AQP3, HTR3B, MLN 및 SLC12A2)에 대한 "고반응자" 유전자형은 테가세로드에 대해 보다 높은 반응률을 보이는 것에 추가로, 위약 처리된 개체에서 보다 낮은 반응률를 향한 경향을 또한 보였음은 흥미있었다.
모든 경우에, 테가세로드에 대한 평균보다 높은 반응을 나타낸 것은 소수 동형접합성 유전자형이었고, 이는 각각의 개체 SNP에 대해 집단의 단지 6-18％를 차지하였다. 잠재적인 "고반응자"의 수를 증가시키기 위해, 개체를 2개의 군으로 그룹핑함으로써 추가의 평가를 수행하였다: 상기 "고반응자" SNP를 하나 이상 갖는 군, 및 전혀 갖지 않는 군. 상기 모델에 따라, 약 1/2의 환자를 12개의 확인된 SNP 중 적어도 하나의 존재로 인해 잠재적인 "고반응자"로서 표지한 반면, 다른 절반은 SNP를 갖지 않았고 따라서 마찬가지로 잘 반응하지 않는 것으로 예상될 것이다. 상기 12개의 SNP 모델을 사용하는 분석의 결과를 성별 및 연령에 의한 분류와 함께 표 7에 제시한다.
Figure 112007056648437-PCT00003
상기 모델을 사용하여, 본 발명자들은 12개의 SNP를 하나 이상 갖는 제노타이핑된 집단의 52％가 위약에 대해 23％에 비해 테가세로드에 대해 총 반응률이 62％이었고, 교차비는 5.4 (95％ CI: 3.0-9.9)이었음을 발견하였다. 이는 위약에 비해 테가세로드에 대해 유의하게 상이한 반응률을 보이지 않고 (각각 27％ 및 31％) 교차비가 1.3 (95％ CI: 0.7-2.3)인, 임의의 12개의 SNP를 갖지 않는 환자에 대조적이다. 본 발명자들이 또한 12개의 SNP를 적어도 하나 갖는 개체에 대해 남성 집단 및 고령자 집단 모두에 있어서 테가세로드에 대한 유의한 반응을 증명할 수 있음이 특히 흥미있었고, 이는 전체적인 연구에 있어서 증명될 수 없었다.
상기 설명된 6개의 유전자에 추가로, 하나의 추가의 후보 유전자 (TPH1; 트립토판 히드록실라제)가 흥미롭게 보였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 상기 유전자에 대한 각각의 2개의 분석으로부터 하나의 유전자형 (SNP-1756에 대해 GG 및 SNP-3784에 대해 TT)이 >5의 교차비를 가졌다. 이는 주로 테가세로드에 대한 평균보다 훨씬 더 큰 반응에 반대로 15-16％의 낮은 위약 반응률로 인한 것이었다. 그러나, 반대 대립유전자에 동형접합성인 개체가 위약에 비해 테가세로드에 대한 반응률에서 유의한 차이를 갖지 않음이 또한 흥미있었다. 또한, 상기 설명된 12개의 "고반응자" SNP와 달리, TPH1에 있어서 보다 우수한 총 반응을 보인 것은, 집단의 35-36％를 차지하는 다수 동형접합성 대립유전자였다. 본래의 12개의 "고반응자" SNP의 존재 또는 부재에 의해, 또는 추가의 2 TPH1 SNP의 포함에 의해 분류된 반응률 및 교차비의 비교를 각각 도 1 및 도 2에 나타낸다.
Figure 112007056648437-PCT00004
2개의 추가의 TPH SNP를 포함시키면 본래의 12개의 "고반응자" SNP에 비해 14개의 SNP를 적어도 하나 갖는 개체에 있어서 테가세로드에 대한 총 반응을 감소시키지만, 그 카테고리 내의 환자의 비율을 68％로 증가시킨다. 또한, 이는 임의의 상기 SNP를 갖지 않는 개체의 32％에 있어서 치료 및 위약 사이의 반응률에서의 차이를 추가로 감소시켜, 명백한 "비-반응자" 집단을 보다 잘 규정한다.
2차 효능 종점: 12주 치료 후 반응. 12주 치료 후 기저선을 초과한 CSBM/주의 1회 이상의 평균 증가의 2차 효능 종점을 이용하여, 상기한 바와 동일한 비교를 수행하였다. 12개의 개체 "고반응자" SNP에 대한 결과를 표 9에 제시하고, 12개의 SNP를 적어도 하나 갖는 또는 갖지 않는 개체의 비교를 이용한 결과를 표 10에 제시한다.
Figure 112007056648437-PCT00005
Figure 112007056648437-PCT00006
일반적으로, 12주에서의 발견은 4주 치료 후에 보인 것과 유사하였지만, 그만큼 통계학상 유의하지 않았다 (이유는 불분명하다). 약물 표적, HTR4에 대한 "고반응자" 유전자형은 테가세로드-처리 환자 (>60％)에 대해 평균보다 더 높게 유지한 반면, 마찬가지로 위약-처리 개체에 대해 평균보다 더 높은 반응률 (30-40％)이 또한 동반되었음은 흥미있었다. 4주 반응에서와 같이, AQP, MLN, 및 SLC12A2 "고반응자" 유전자형은 테가세로드에 대한 평균보다 높은 반응에 추가로, 계속하여 평균보다 더 낮은 위약 반응률을 나타냈다. 상기 위약에 대한 보다 낮은 반응은 표 11에 나타내는 바와 같이 다시 2 TPH1 SNP에 대해서도 마찬가지로 보였다.
Figure 112007056648437-PCT00007
로지스틱 회귀에 의한 분석. 치료 및 "고반응자" 유전자형 상태에 추가로 성별 및 연령을 고려하기 위해 로지스틱 리모델링 (remodel)을 이용하여 추가의 분석을 수행하였다. 12개의 SNP 또는 14개의 SNP 모델을 이용하는 상기 분석의 결과를 4 또는 12주 치료 후 표 12에 제시한다. 각각의 상기 모델에 연령 및 성별을 포함시키면 반응에 대해 유의한 효과를 갖는 것으로 보이지 않지만, 치료와 유전자형 상태의 조합은 치료 단독에서보다 더 성과에 대해 매우 유의한 효과를 갖는다. 상기 효과는 모든 14개의 SNP를 사용하는 모델에 비해 본래의 12개의 "고반응자" SNP를 포함하는 모델을 이용하면 약간 더 유의하다.
Figure 112007056648437-PCT00008
추가의 2차 종점. 상기 평가에 추가로, 5가지 추가의 2차 효능 종점을 주단위 일지 평가로부터 평가하였다. 이들은 배변 습관에서 만족, 견디기 힘든 변비, 견디기 힘든 복부 팽만, 견디기 힘든 복통, 및 전체적인 변비 경감에서 주단위 변화를 포함하였다. 표 13은 이들 변수에서 12주의 치료의 끝에서 치료 (테가세로드 6-mg bid 대 위약)에 의한 총 변화를 비교하는 분석의 결과, 및 12개의 "고반응자" SNP를 하나 이상 가졌는지를 제시한다. 상기 평가의 기저선 값을 정량적 공변으로서 사용하여 ANCOVA 모델을 적용하였다.
테가세로드를 사용하는 치료는 합해진 모든 환자에 대해 위약에 비해 더 우수한 성과를 얻었다 (보다 낮은 값은 보다 우수한 반응을 나타낸다). "고반응자" 유전자형에 의해 평가될 때, 12개의 SNP를 어느 것도 갖지 않는 개체에 대해서 치료 차이는 없었다 ("T6 대 P: 0 SNP"). 그러나, 12개의 SNP를 하나 이상 갖는 개체는 5가지 모든 평가에 대해 위약보다 테가세로드에 대한 유의하게 더 큰 반응을 나타냈다 ("T6 대 P: >=1 SNP"). 또한, 테가세로드 치료 집단 내에서, 견디기 힘든 변비, 전체적인 변비 경감, 및 배변 습관에서 총 만족에 대해 12개의 SNP를 적어도 하나 갖는 또는 갖지 않는 개체들 사이의 성과에서 유의한 차이가 있었다. "고반응자" SNP를 하나 이상 갖거나 갖지 않는 개체들 사이의 기저선 스코어에서는 유의한 차이가 없었다. 따라서, 상기 데이타는 CSBM의 수에 기초한 1차 효능 종점에 대해 보이는 차별적인 반응과 일치한다.
12주의 치료 후 주단위 일지 평가의 ANCOVA 분석; 치료 및 12개의 "고반응자" SNP의 하나 이상의 존재에 의한 비교
효능 변수 치료 N LS 평균값 p-값 (ANCOVA)
모든 표현형 12개의 SNP 중 0 12개의 SNP 중 >=1 0 대 >=1 SNP T6 대 P: 모든 T6 대 P: 0 SNP T6 대 P: >=1 SNP
견디기 힘든 복부 팽만 기저선 398 2.77 2.78 2.75 0.7455
12-wk 위약 198 2.30 2.28 2.32 0.7722
12-wk Teg-6 mg 200 2.09 2.18 2.00 0.1148 0.0092 0.3769 0.0047
견디기 힘든 복통 기저선 398 2.34 2.34 2.34 0.9853
12-wk 위약 198 2.04 2.00 2.06 0.5916
12-wk Teg-6 mg 200 1.84 1.90 1.77 0.2435 0.0132 0.3859 0.0084
견디기 힘든 변비 기저선 398 2.80 2.81 2.79 0.8194
12-wk 위약 198 2.41 2.43 2.40 0.7823
12-wk Teg-6 mg 200 2.07 2.25 1.87 0.0006 <0.0001 0.1255 <0.0001
전체적인 변비 경감 기저선 398 2.75 2.76 2.74 0.7709
12-wk 위약 198 2.35 2.34 2.35 0.9002
12-wk Teg-6 mg 200 2.08 2.20 1.95 0.0139 0.0003 0.1934 <0.0001
배변 습관에서 만족 기저선 398 3.09 3.11 3.06 0.6018
12-wk 위약 198 2.64 2.65 2.63 0.8685
12-wk Teg-6 mg 200 2.33 2.48 2.17 0.0068 0.0003 0.1719 <0.0001
LS = 최소 제곱 평균; N = 관찰의 수; Teg-6 = 테가세로드 6-mg bid.
대립유전자 빈도. 표 14는 백인 참조 패널에 대해 ABI에 의해 주어진 소수 대립유전자 빈도와 비교하기 위한 제노타이핑된 백인 집단에 대해 12개의 "고반응자" SNP에 대한 소수 대립유전자 빈도를 나타낸다. 본 발명의 만성 변비 집단과 참조 샘플 사이의 대립유전자 빈도에서 임의의 큰 차이가 있는 것으로 나타나지 않는다.
12개의 "고반응자" SNP에 대한 대립유전자 빈도
PG 로커스 ID 유전자 기호 소수 대립유전자 빈도
대립유전자 E2302 (Cauc) ABI ref (Cauc)
1838 AQP3 G 0.25 0.28
3755 HTR3B C 0.32 0.26
1746 HTR4 T 0.30 0.32
3743 HTR4 C 0.30 0.30
3747 HTR4 T 0.31 0.30
3753 HTR4 T 0.31 0.33
3754 HTR4 T 0.33 0.36
3756 HTR4 C 0.35 0.31
1783 MLN T 0.39 N/A
3806 SCNN1A G 0.43 0.48
1842 SLC12A2 A 0.22 0.22
3801 SLC12A2 C 0.23 0.22
ABI ref = 어플라이드 바이오시스템즈 인크. 참조 샘플로부터의 소수 대립유전자 빈도; Cauc = 백인; E2302 = 현재 제노타이핑 연구 (CHTF919E2302); N/A = 백인 집단에 대해 이용가능하지 않음.
연관 불균형의 평가. 12개의 "고반응자" SNP 중에서 6개가 약물 표적 HTR4 내에 위치하였다. 모든 상기 SNP는 거의 100 kb의 게놈 DNA에 걸쳐 인트론 영역에 위치하였다 (도 3 참조). 추가의 분석은 상기 6개의 SNP가 모두 매우 밀접한 연관 불균형으로 존재하였고, 4개의 SNP (1746, 3754, 3753 및 3743)에 대해 D'값은 >0.8이고 SNP 3756 및 3747에 대해 D'>0.6이었음을 증명하였다 (도 3 참조). Na-K-2Cl 동시수송체 SLC12A2에 대한 2개의 "고반응자" SNP가 또한 서로 매우 밀접한 LD로 존재하였고, 2개의 TPH1 SNP도 마찬가지였다.
위약에 비해 테가세로드에 대한 차별적인 반응과 연관된 유전자에 대한 상세한 설명. 초기 SNP "고반응자" 유전자형 모델은 총 6개의 상이한 유전자 내에 존재하는 12개의 SNP에 기반하였다: HTR4에 6개, SLC12A2에 2개, 및 HTR3B, MLN, AQP3 및 SCNN1A에 각각 1개. 제2의 14개의 SNP 모델은 TPH1 유전자 내의 추가의 2개의 SNP를 포함하였다. 상기 각각의 유전자에 대한 추가의 상세한 내용을 변비에서 이들의 가능한 역할 또는 테가세로드에 대한 반응과 함께 아래 논의한다.
HTR4 : 5- HT 4 수용체 (약물 표적). HTR4는 GI관 및 다른 많은 조직, 예를 들어 뇌 전체에 널리 퍼져있는 아데닐레이트 시클라제에 커플링된 7-트랜스멤브레인 도메인 G-단백질 커플링된 수용체이다. 주로 유전자의 5' 단부에 위치하는 많은 상이한 엑손의 교대 스플라이싱으로 인해, 발현된 5-HT4 수용체의 복수의 변이체가 확인되었다 (도 4 참조). 트랜스멤브레인 도메인 4와 5 사이의 14개의 아미노산 삽입을 코딩하는 엑손 h를 제외하고, 교대 스플라이싱된 엑손 a-g는 C-말단 도메인에서만 상이한 단백질을 생성시킨다 (Bender E et al., Neurochem. 74(2): 478-89 (2000)). 상이한 HTR4 스플라이스 변이체는 상이한 조직 특이성, 및 생리학적 활성의 차이를 나타낸다 (Bender E et al., Neurochem. 74(2): 478-89 (2000); Blondel O et al., J Neurochem. 70(6):2252-61 (1998); Claeysen S et al., Mol Pharmacol; 55: 910-920 (1999)).
도 4를 참조하면, 6개의 "고반응자" HTR4 SNP는 다음 위치에 위치한다: SNP 3753, 3743, 3756 및 3747은 인트론 1 내의 엑손 2의 하류에 위치하고; SNP 3754는 엑손 3과 4 사이에 위치하고; SNP 1746은 엑손 4와 5 사이에 엑손 h의 상류에 위치한다. 상기 SNP 중 어느 것도 코딩 영역 내에 또는 스플라이스 부위에 직접 위치하지 않는 반면, 기능적 유의성을 갖는 아직 미확인된 SNP와 같이 이들은 다른 것과 밀접한 LD로 존재하는 것 같다. 이들 SNP 사이의 큰 영역의 연관 불균형으로 인해 (도 3 참조), 상기 제안된 기능성 SNP가 어디에 위치할 것인지 예측하는 것은 가능하지 않다. 위치에 따라, 많은 기능적 결과, 예를 들어: 전체 발현에 영향을 끼칠 수 있는 유전자의 프로모터 영역에서 변경; 어떤 스플라이스 변이체가 발현되는지 영향을 끼칠 수 있는 스플라이스 부위에서 변경; 또는 가능하게는 발현된 단백질의 활성에 영향을 끼칠 수 있는 단백질의 아미노산 서열에서 변화가 가능하다. 존재한다면, 상기 시나리오 중 어느 것이 진정한 것인지 결정하기 위해 추가의 연구가 필요할 것이다.
HTR3B : 5- HT 3 수용체 B. HTR3B는 니코틴성 아세틸콜린 (nAch), GABAA 및 글라이신 수용체를 포함하는 리간드-게이팅된 이온 채널의 Cys-루프 패밀리의 멤버인 5-HT3 수용체의 B 서브유닛을 코딩한다 (Reeves DC ＆ Lummis SC, Mol. Membr. Biol. 19: 11-26 (2002)). 적어도 3개의 특유한 5-HT3 수용체 서브유닛이 알려져 있고 (A, B 및 C), 기능성 수용체는 함께 놓인 이들 서브유닛 중 5개를 함유하는 올리고머, 보통 A 및 B의 조합체이다. 그러나, 5-HT3A 서브유닛만으로 이루어진 기능성 호모펜타머 수용체가 또한 설명되었다. 각각의 서브유닛은 4개의 트랜스멤브레인 도메인으로 이루어지고, 채널의 세공은 M2 도메인에 의해 형성된다는 증거가 있다. 상기 수용체는 비교적 비-선택적 양이온 채널로서 작용하고, 활성화 후 뉴런에서 신속한 탈분극 반응을 유발한다.
HTR3B에서 하나의 SNP가 제노타이핑되었고 (SNP 3755), 테가세로드에 대한 차별적인 반응과 연관되었다. SNP는 세포외 N-말단 도메인에 위치하는, 아미노산 위치 129에서 티로신에서 세린으로의 아미노산 변화를 일으키는 엑손 5에서의 미스센스 돌연변이를 코딩한다. 연구에서 5-HT3A 수용체 서브유닛의 세포외 도메인 내의 복수의 티로신 잔기가 리간드 결합 또는 채널의 게이팅 뿐만 아니라 수용체 조립 및 구조에서 중요한 역할을 하는 것이 증명되었다 (Price KL ＆ Lummis SC, J Biol Chem. 279 (22):23294-301 (2004)). 상기 SNP는 또한 트랜스멤브레인 도메인을 코딩하는 유전자의 3' 영역과 높은 연관 불균형을 나타낸다 (SNP Browser 버전 1.0, 어플라이드 바이오시스템즈 인크).
MLN : 모틸린. 모틸린은 위장관 수축의 조절자로서 작용하는, 주로 소장의 내분비 세포에 의해 분비되는 펩티드 호르몬이다. 인간 모틸린 유전자 (MLN)는 5개의 엑손으로 이루어지고, 22-아미노산 모틸린 호르몬 펩티드, 25-아미노산 시그날 펩티드, 및 C-말단 모틸린-연관 펩티드 (MAP)를 포함하는 115-아미노산 프리프로호르몬을 코딩한다. 엑손 2 및 3은 시그날 펩티드 및 22-아미노산 모틸린 펩티드를 코딩하는 한편, C-말단 MAP는 주로 엑손 3 및 4에 의해 코딩된다 (Daikh DI et al., DNA. 8(8): 615-21 (1989)). 본 발명의 분석에서 보다 높은 반응과 연관된 모틸린 SNP (SNP 1783)은 프리프로호르몬의 아미노산 위치 15에서 발린을 알라닌으로 치환한 미스센스 돌연변이이다. 이는 활성 모틸린 펩티드에 비해 위치-11에서 유전자의 시그날 펩티드 영역에 돌연변이를 배치한다. 흥미롭게도, 상기 다형성은 종을 가로질러 보존된다 (Depoortere I et al., Peptides. 18(10): 1497-503 (1997)). 시그날 펩티드 서열에서 변경은 단백질의 세포미만 정위에 영향을 끼칠 수 있고, 이는 활성 모틸린 펩티드의 분비에 영향을 끼칠 수 있거나, 아마도 전체로서 전구체로부터 활성 펩티드의 적절한 분리를 방지한다. 혈장 내의 분비된 모틸린의 변경된 수준은 또한 특발성 변비 환자에서 (Sjolund K et al., Scand J Gastroenterol. 21(8):914-8 (1986)) 및 서행형 변비에서 (Peracchi M et al., Scand J Gastroenterol. 34(1):25-8 (1999)) 관찰되었다. 모틸린 시그날 펩티드 다형성 사이의 연관성이 염증성 장 질병 환자에서 보고되었다 (Annese V et al., Dig. Dis. Sci. 43(4): 715-9 (1998)). 그러나, 연관된 수준의 혈장 모틸린은 보고되지 않았다.
AQP3 : 아쿠아포린 3. 아쿠아포린 3 (AQP3)은 수분 채널의 아쿠아포린 패밀리의 멤버이다. 유체 분비 및 흡수는 위장관의 1차 기능이고, 아쿠아포린은 상피를 가로질러 물을 수송하는 능력을 가져서 상기 공정에서 핵심 역할을 수행한다. AQP3은 위장관, 신장, 간, 췌장, 폐, 말초 백혈구, 비장 및 전립선을 포함한 많은 조직에서 발현된다 (Ishibashi K et al., Genomics 27:352-354 (1995)). 그의 수분 채널 기능에 추가로, 아쿠아포린 3은 우레아 및 글리세롤과 같은 비이온성의 작은 용질의 수송을 보다 작은 정도지만 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 직장에서, AQP3은 대변 탈수의 양을 조절하는데 있어서 핵심 역할을 수행할 수 있고, 따라서, 만성 변비와 연관된 증상 중 하나인 대변의 경도 또는 연성도에 영향을 끼친다 (Kierbel A et al., Pflugers Arch. 440(4):609-18 (2000)).
AQP3 유전자는 약 6 kb에 걸치는 6개의 엑손으로 이루어지고, 코딩 영역은 각각의 6개의 엑손 사이에 분포된다 (Inase N et al., J. Biol Chem. 270(30): 17913-6 (1995)). 보다 큰 테가세로드 반응과 연관된 AQP3 SNP (SNP 1838)는 인트론 1에 위치한다. 기능적 유의성은 상기 SNP와 연관되지 않았지만, 엑손 1의 구역 근처에 아직 규정되지 않은 기능성 SNP와 연관 관계로 존재할 수 있다. 유전자의 길이를 따라 연관 불균형은 거의 나타나지 않고, 따라서 엑손 5 및 인트론 5의 스플라이스 접합부에 위치하는 공지의 기능성 돌연변이와 연관되는 것 같지 않다 (Roudier N et al., J Biol Chem. 277(48):45854-9 (2002)). 상기 돌연변이는 번역된 유전자에서 미숙 중지 코돈을 생성시키고, 따라서 비-기능성 단백질을 코딩한다. 흥미롭게도, 상기 대립유전자 (AQP3null)에 대해 동형접합성인 개체는 그들의 적혈구에서 감소된 글리세롤 수송을 나타냈지만, 적어도 정상 조건 하에 상기 AQP3 결핍에 관련된 다른 보고된 임상 증후군은 없었다.
SLC12A2 : Na-K-2Cl 동시수송체 1 ( NKCC1 ). SLC12A2는 나트륨, 칼륨 및 클로라이드를 함께 세포 막을 가로질러 전자중성 양식으로 수송하는 기능을 하는 용질 캐리어 패밀리의 멤버이다. NKCC1으로도 알려진 상기 Na-K-2Cl 동시수송체는 다양한 세포 종류 (상피 및 비-상피 모두)에서 발현된다 (Russell JM, Physiol Rev 80:211-276 (2000)). 상피 세포, 예를 들어 대장에서, NKCC1은 기저측막 상에 위치하고, 주로 세포에 첨단 측면으로부터 분비될 클로라이드를 제공하는 역할을 한다. 상피 Cl 분비는 장관의 유체 조성에 큰 영향을 끼치는 점막 표면 수화를 책임진다. 비-상피 세포에서, NKCC1 단백질은 세포 부피를 조절하는데 있어서 핵심 역할을 한다 (Lytle C, J. Biol. Chem 272: 15069-15077 (1997)).
NKCC1은 본래 상어 직장샘으로부터 클로닝되었고 (Xu J-C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2201-2205 (1994)), 그 직후에 인간 유전자가 결장-유래 세포주로부터 클로닝되었다 (Payne JA et al., J Biol Chem. 270(30): 17977-85 (1995)). 발현된 단백질은 세포내 N- 및 C-말단 도메인에 의해 플랭킹된 12 트랜스멤브레인 도메인을 갖는 1212개의 아미노산으로 이루어진다 (Hebert SC et al., Pflugers Arch. 447(5):580-93 (2004)). 인간 질병은 NKCC1 유전자에서 결함에 직접 연결되지 않았지만, 상기 유전자에서 돌연변이는 마우스에서 난청 (Dixon MJ et al., Hum. Mol. Genet. 8(8):1579-84 (1999)) 및 정자발생의 실패 (Pace AJ et al., J. Clin. Invest. 105(4):441-50 (2000))과 연관되었다. 여기서, 본 발명자들은 상기 유전자에서 테가세로드에 대한 보다 높은 반응에 연관된 2개의 SNP, 즉 인트론 2에 위치한 SNP 3801, 및 3' UTR의 유전자의 대향 말단에 위치하는 SNP 1842를 확인하였다.
SCNN1A : 비-전압 게이팅된 나트륨 채널, 알파. SCNN1A 유전자는 상피 나트륨 채널 또는 ENaC로도 일반적으로 알려진 비-전압 게이팅된 아밀로라이드-감수성 나트륨 채널의 알파 서브유닛을 코딩한다. 상기 채널은 원위 결장에서 나트륨 흡수를 위한 1차 경로 중 하나이고, 따라서 장의 유체 조성을 유지하는데 있어서 핵심 역할을 한다. 알파 서브유닛은 단독으로 나트륨을 전달하는 기능성 채널을 형성할 수 있지만, 생체 내에서 기능성 채널은 알파, 베타 및 감마 서브유닛의 조합으로 이루어진다.
SCNN1A 유전자는 엑손 2에서 시작하여 엑손 13에서 끝나는 코딩 영역을 갖는, 염색체 12p13 상의 17 kb에 걸친 13개 엑손으로 이루어진다 (Ludwig M et al., Hum Genet. 102(5):576-81 (1998)). "고반응자" SNP 3806은 인트론 5에서 SCNN1A 유전자의 중간 부근에 위치한다. 다시, 전체 유전자에 걸쳐 높은 정도의 연관 불균형이 존재하고, 그 원인이 되는 SNP는 어느 곳에나 존재할 수 있다. 흥미롭게도, 또한 제노타이핑된 2개의 다른 SCNN1A SNP (5' 단부 부근에 하나 및 3' 단부 부근에 하나)가 또한 테가세로드에 대해 다소 더 높은 반응 (교차비 >3.5)을 보였고, SNP 3806과 LD 관계로 존재하였다. SCNN1A 유전자에서 많은 돌연변이는 주로 신장에서의 효과로 인해 인간 질병과 연관되었다. 몇몇 대립유전자 변이체가 복수의 상이한 패밀리에서 타입 1 상염색체 열성 가성저알도스테론혈증과 연관되었다 (OMIM #600228에서 도입: 나트륨 채널, 비-전압 게이팅된 1, 알파 서브유닛; SCNN1A http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=600228 참조). 아마도 신장에서 보다 낮은 수준의 나트륨 재흡수로 인해, 고혈압과 SCNN1A 내의 SNP 사이에 연관성이 또한 만들어졌다 (Iwai N et al., J. Am. Soc. Nephrol. 13:80-85 (2002)). 또한 알도스테론 제어하에 있는 원위 결장에서 상기 나트륨 채널에 대한 돌연변이의 효과는 확실히 장 내의 유체 및 전해질 균형에 대해 해로운 효과를 일으킬 수 있다.
TPH1 : 트립토판 히드록실라제 1. 트립토판 히드록실라제는 세로토닌의 생합성에서 속도 제한 효소로서, 트립토판의 5-히드록시트립토판 (5-HT)으로의 일산소화를 촉매하고, 상기 5-HT는 후속적으로 탈카르복실화되어 세로토닌을 형성한다. TPH1은 장관내 장크롬친화성 세포를 포함한 말초에서 주로 발현되는 반면, 최근 확인된 TPH2 유전자는 뇌에서 우선적으로 발현된다 (Walther DJ et al., Science 299(5603): 76(2003)). 세로토닌은 기분 조절의 다중 중추 신경 측면에, 및 수면, 긴장, 알콜 중독, 약물 남용, 음식 섭취, 및 성적 행동을 조절하는데 원인적으로 관여하는 한편, 말초 조직에서 세로토닌은 혈관 긴장도, 장 운동성, 1차 지혈, 및 세포 매개 면역 반응을 조절하는데 관여한다 (Veenstra-VanderWeele J, Anderson GM ＆ Cook EH Jr., Eur J Pharmacol. 410(2-3):165-181 (2000)).
2개의 TPH1 SNP는 >5.0의 교차비로 연관되었고, 이는 주로 테가세로드 군에서 훨씬 더 높은 반응률과 반대되는 위약 군에서 더 낮은 반응으로 인한 것이다. 상기 2개의 SNP는 인트론 1 (SNP 1756) 및 인트론 5 (SNP 3784)에 위치하고, 기능적 돌연변이 자체를 유발하는 것으로 생각되지 않는다. 상기 전체 유전자는 강한 연관 불균형 상태로 존재하여, 확인된 SNP는 유전자 내의 어느 곳에나 위치할 수 있는 기능성 SNP와 연관 상태로 존재하는 것 같다. 많은 연구에서 TPH1 다형성 및 자살 또는 다른 기분 장애의 위험을 평가하였고, 혼합된 결과를 얻었다 (Arango V et al., J. Psychiatr. Res. 37(5): 375-86 (2003)). 상기 연구에서 평가된 SNP는 코딩 구역에 위치하지 않았다. 아랑고 (Arango) 등은 기능성 SNP가 아직 확인되지 않았음을 보고하였다. TPH1 유전자형 및 장 질환의 연관성에 관하여 거의 보고된 바 없지만, 코테스 (Coates)와 동료 연구자들에 의한 최근의 보고는 궤양성 대장염, 과민성 대장증후군 - 변비 우세형 (IBS-C) 및 과민성 대장증후군 - 설사 우세형 (IBS-D)의 환자에서 TPH1 메신저 RNA의 유의한 감소가 있었음을 알려주었다 (Coates MD et al., Gastroenterology. 126(7): 1657-64 (2004)).
결론. 상기 약물유전학 분석의 목적은 5-HT4 및 5-HT3 수용체에 관련된 후보 유전자에서의 다형성, 세로토닌, 장 분비 또는 운동성이 만성 변비의 환자에서 테가세로드 치료에 대한 차별적인 반응과 연관되는지 여부를 평가하기 위한 것이다. 유전자형에 의한 반응의 비교에 의해 4주 치료 후 >60％의 테가세로드 6-mg bid에 대한 반응률 및 5 이상의 교차비 (위약에 비해)를 갖는 (표 6 참조), 치료에 대한 차별적인 반응과 연관된 6개 유전자 내의 12개 SNP를 확인하였다. 이를 테가세로드 및 위약에 대해 각각 46％ 및 25％의 평균 총 반응률 (교차비 2.6)에 비교하였다. 한 실시태양으로서 상기 12개의 "고반응자" SNP를 사용하여, 본 발명자들은 12개의 SNP 중 적어도 하나를 갖는 개체 (집단의 약 50％)가 위약에 비해 테가세로드에 대해 유의하게 더 높은 반응을 나타낸 것을 (62％ 대 23％, 교차비 = 5.4) 밝혔다. 이는 위약에 비해 테가세로드에 대한 반응에서 유의한 차이를 보이지 않은 (31％ 대 27％, 교차비 = 1.3), 12개의 SNP를 어느 것도 갖지 않는 환자의 나머지 약 50％와 대조적이다. 12개의 SNP 모델을 사용한 결과는 12주의 치료 후 유사하였지만, 개별 유전자형 수준에서 일부 차이를 보였다.
환자를 분류하기 위해 14개의 SNP로부터의 유전자형을 사용하는 제2 실시태양은 비-반응자 집단을 추가로 규정하기 위해 유용한 것으로 또한 밝혀졌다. 원래의 12개의 "고반응자" SNP에 추가로 TPH1 유전자로부터 2개의 SNP를 포함하는 상기 실시태양에서, 14개의 SNP를 전혀 갖지 않는 환자의 32％가 테가세로드 및 위약에 대해 각각 32％ 및 30％의 반응률을 갖고, 교차비는 1.1인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기 모델을 사용하면, 테가세로드에 대한 총 반응률이 14개의 SNP 중 적어도 하나를 갖는 환자의 68％에서 단지 53％로 감소되고, 이는 12개의 SNP 모델을 사용하여 보이는 62％ 반응률보다 더 낮다.
확인된 유전자는 모두 위장관의 정상 기능을 유지하는데 중요하지만 광범위한 상이한 기능을 나타낸다. 세로토닌 수용체 HTR4 및 HTR3B는 세로토닌의 일차 표적이고, 따라서 상기 중요한 신경전달물질의 하류 효과, 예를 들어 운동성, 장 분비, 및 내장 감각성의 조절을 매개한다. 세로토닌의 합성에서 속도 제한 효소인 TPH1은 상기 세로토닌-매개 조절 기능에서 또한 명백한 핵심 역할을 한다. 용질 수송은 위장관 내의 물 및 전해질의 균형을 유지하기 위해 필요하고, 따라서 장 분비 및 흡수에 유의한 영향을 끼칠 수 있다. 확인된 유전자 중 3가지가 용질 수송에서 중요한 역할을 한다: SLC12A2 (NKCC1)은 클로라이드의 분비에 대한 주요 수송 경로 중 하나이고; SCNN1A (ENaC 알파)는 나트륨의 흡수에서 중요하고; AQP3은 물 및 글리세롤의 수송에서 중요한 역할을 한다. 마지막으로, 모틸린 (MLN)은 위장관의 운동성을 조절하는 것으로 밝혀진 핵심 장 호르몬 중 하나이다.
상기 발견에 기초하여, 만성 변비는 모두 테가세로드를 사용한 치료에 잘 반응하는 상기 확인된 유전자들 내의 변이체에 관련된 다양한 병리생리학적 기전으로부터 발생할 수 있다. 상기 변이체가 없는 환자는 치료에 대해서 위약에 대해 반응하는 것보다 더 유의하게 반응하지 않고, 이는 만성 변비가 병리생리학적 기전으로 인한 것이 아니라, 환경적인 또는 가능하게는 심리학적 요인으로 인한 것임을 나타낸다. 흥미롭게도, 상기 변이체를 갖는 환자는 또한 위약에 반응할 가능성이 더 적고, 이는 다시 상기 변이체가 진정한 병리생리학에 연관됨을 암시한다.
본원에서 언급된 모든 참고 문헌은, 각각의 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전부가 구체적으로 및 개별적으로 모든 목적을 위해 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로, 모든 목적을 위해 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 본원에서 설명된, 본 발명의 개별 측면의 단일 예시에 불과한 특정 실시태양의 측면으로 제한되지 않는다. 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않는 본 발명의 많은 변형 및 변동이 가능하고, 이는 당업자가 분명히 알 것이다. 본원에서 열거된 것 이외에, 본 발명의 범위 내에 포함되는 기능적으로 동등한 방법 및 장치는 상기 상세한 설명을 통해 당업자가 분명히 알 것이다. 상기 변형 및 변동은 첨부하는 청구의 범위 내에 포함되는 것이다. 본 발명은 첨부하는 청구의 범위의 균등물의 전체 범위와 함께 상기 청구의 범위의 용어에 의해서만 제한된다.
<서열>
Figure 112007056648437-PCT00009
Figure 112007056648437-PCT00010
Figure 112007056648437-PCT00011
Figure 112007056648437-PCT00012

Claims (16)

  1. 선택된 환자 집단에서 만성 변비 치료용 의약의 제조에 있어서 테가세로드 (tegaserod)의 용도로서, 환자 집단이 환자에 존재하는 바이오마커 유전자의 유전자 다형성에 기초하여 선택되고, 상기 유전자 다형성은 만성 변비를 치료하는데 있어서 테가세로드의 효능을 나타내는 것인 용도.
  2. (a) 개체에 존재하는 유전자의 2 카피에 대해, 다형성 유전자 로커스에서 뉴클레오티드 쌍의 정체를 결정하고,
    (b) 유전자의 구역 내의 다형성 부위의 뉴클레오티드 쌍이, 개체가 만성 변비에 대해 테가세로드를 사용하는 치료에 대해 반응성인 것을 나타내면 개체를 "고" 반응자군에 배정하는 것
    을 포함하는, 테가세로드를 사용하는 치료에 대한 위장관 장애가 있는 개체의 반응성을 결정하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 위장관 장애가 변비 우세형 과민성 대장증후군 (C-IBS), 기능성 소화불량, 위식도 역류 질환, 및 당뇨성 위병증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  4. (a) 만성 변비를 치료하는데 있어서 테가세로드의 효능을 나타내는 하나 이 상의 유전자로부터의 유전자 로커스에서 대상의 유전자형을 얻는 단계로서, 여기서 상기 유전자가 5-HT4 수용체 (HTR4)에 대한 유전자; 5-HT3 수용체, 서브유닛 B (HTR3B)에 대한 유전자; 모틸린 (MLN, motilin)에 대한 유전자; 아쿠아포린 (aquaporin) 3 수분 채널 (AQP3)에 대한 유전자; 나트륨/칼륨/클로라이드 동시수송체 1 (NKCC1)로도 알려진 용질 캐리어 패밀리 12, 멤버 A2 (SLC12A2)에 대한 유전자; 및 아밀로라이드-감수성 상피 나트륨 채널 알파 서브유닛 (ENaC 알파)로도 알려진 비-전압 게이팅된 나트륨 채널, 알파 서브유닛 (SCNN1A)에 대한 유전자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 단계,
    (b) (i) 대상의 유전자형이 만성 변비를 치료하는데 있어서 테가세로드의 효능을 나타내는 경우 테가세로드를 대상에게 투여하거나, (ii) 대상의 유전자형이 만성 변비를 치료하는데 있어서 테가세로드의 효능을 나타내지 않는 경우 대체 치료제를 대상에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상에서 만성 변비를 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 만성 변비가 변비 우세형 과민성 대장증후군 (C-IBS)인 방법.
  6. 제4항에 있어서, HTR4에 대한 유전자가 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, HTR3B에 대한 유전자가 서열 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  8. 제4항에 있어서, MLN에 대한 유전자가 서열 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  9. 제4항에 있어서, AQP3에 대한 유전자가 서열 9의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  10. 제4항에 있어서, SLC12A2에 대한 유전자가 서열 10 및 서열 11의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  11. 제4항에 있어서, SCNN1A에 대한 유전자가 서열 12의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  12. (a) 만성 변비를 치료하는데 있어서 테가세로드의 효능을 나타내는 하나 이상의 유전자로부터의 유전자 로커스에서 대상의 유전자형을 얻는 단계로서, 여기서 상기 유전자가 5-HT4 수용체 (HTR4)에 대한 유전자; 5-HT3 수용체, 서브유닛 B (HTR3B)에 대한 유전자; 모틸린 (MLN)에 대한 유전자; 아쿠아포린 3 수분 채널 (AQP3)에 대한 유전자; 나트륨/칼륨/클로라이드 동시수송체 1 (NKCC1)로서도 알려진, 용질 캐리어 패밀리 12, 멤버 A2 (SLC12A2)에 대한 유전자; 아밀로라이드-감수성 상피 나트륨 채널 알파 서브유닛 (ENaC 알파)로서도 알려진, 비-전압 게이팅된 나트륨 채널, 알파 서브유닛 (SCNN1A)에 대한 유전자; 및 트립토판 히드록실라제 1 (TPH1)에 대한 유전자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 단계;
    (b) (i) 대상의 유전자형이 만성 변비를 치료하는데 있어서 테가세로드의 효능을 나타내는 경우 테가세로드를 대상에게 투여하거나, (ii) 대상의 유전자형이 만성 변비를 치료하는데 있어서 테가세로드의 효능을 나타내지 않는 경우 대체 치료제를 대상에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상에서 만성 변비를 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 만성 변비가 변비 우세형 과민성 대장증후군 (C-IBS)인 방법.
  14. 제12항에 있어서, TPH1에 대한 유전자가 서열 13 및 서열 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군 중에서 선택된 서열을 갖는 것인 방법.
  15. 유전자의 반수체형과 위장관 장애 특질 사이의 연관성을 확인하는 방법으로서, 위장관 장애 특질을 나타내는 집단에서의 반수체형의 빈도를 참조 집단에서의 반수체형의 빈도와 비교하는 것을 포함하고, 참조 집단보다 위장관 장애 특질 집단에서 반수체형의 보다 높은 빈도가 반수체형이 위장관 장애 특질과 연관됨을 나타내고, 상기 유전자가 5-HT4 수용체 (HTR4)에 대한 유전자; 5-HT3 수용체, 서브유닛 B (HTR3B)에 대한 유전자; 모틸린 (MLN)에 대한 유전자; 아쿠아포린 3 수분 채널 (AQP3)에 대한 유전자; 나트륨/칼륨/클로라이드 동시수송체 1 (NKCC1)로도 알려진 용질 캐리어 패밀리 12, 멤버 A2 (SLC12A2)에 대한 유전자; 아밀로라이드-감수성 상피 나트륨 채널 알파 서브유닛 (ENaC 알파)로도 알려진 비-전압 게이팅된 나트륨 채널, 알파 서브유닛 (SCNN1A)에 대한 유전자; 및 트립토판 히드록실라제 1 (TPH1)에 대한 유전자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  16. 5-HT4 수용체 (HTR4)에 대한 유전자; 5-HT3 수용체, 서브유닛 B (HTR3B)에 대한 유전자; 모틸린 (MLN)에 대한 유전자; 아쿠아포린 3 수분 채널 (AQP3)에 대한 유전자; 나트륨/칼륨/클로라이드 동시수송체 1 (NKCC1)로도 알려진 용질 캐리어 패밀리 12, 멤버 A2 (SLC12A2)에 대한 유전자; 아밀로라이드-감수성 상피 나트륨 채널 알파 서브유닛 (ENaC 알파)로도 알려진 비-전압 게이팅된 나트륨 채널, 알파 서브유닛 (SCNN1A)에 대한 유전자; 및 트립토판 히드록실라제 1 (TPH1)에 대한 유전자로 이루어진 군 중에서 선택된 유전자의 유전자 산물의, 약물 활성에 대한 표적 으로서의 용도로서,
    (a) 약물을, 만성 변비에 대해 테가세로드를 사용하는 치료에 대해 높은 반응성을 나타내는 선택된 유전자의 구역 내의 다형성 부위에 뉴클레오티드 쌍을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 제1 유전자 산물과 접촉시키고;
    (b) 상기 제1 유전자 산물에 대한 약물의 활성을 확인하고;
    (c) 약물을, 만성 변비에 대해 테가세로드를 사용하는 치료에 대해 낮은 반응성을 나타내는 선택된 유전자의 구역 내의 다형성 부위에 뉴클레오티드 쌍을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 제2 유전자 산물과 접촉시키고;
    (d) 상기 제2 유전자 산물에 대한 약물의 활성을 확인하고;
    (e) 단계 (b)에서 확인된 활성과 단계 (d)에서 확인된 활성 사이의 유사성 및 차이를 확인하는 단계
    를 포함하는 용도.
KR1020077017948A 2005-01-04 2006-01-03 만성 변비 환자에서 테가세로드의 효능을 확인하기 위한바이오마커 KR20070111475A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US64123805P 2005-01-04 2005-01-04
US60/641,238 2005-01-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070111475A true KR20070111475A (ko) 2007-11-21

Family

ID=36648087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077017948A KR20070111475A (ko) 2005-01-04 2006-01-03 만성 변비 환자에서 테가세로드의 효능을 확인하기 위한바이오마커

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20090118350A1 (ko)
EP (1) EP1835909A2 (ko)
JP (1) JP2008526775A (ko)
KR (1) KR20070111475A (ko)
CN (1) CN101132791A (ko)
AU (1) AU2006204146A1 (ko)
BR (1) BRPI0606369A2 (ko)
CA (1) CA2593695A1 (ko)
IL (1) IL184029A0 (ko)
MX (1) MX2007008159A (ko)
RU (1) RU2007129672A (ko)
WO (1) WO2006074127A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015026135A1 (ko) 2013-08-19 2015-02-26 서울대학교 산학협력단 약물 부작용 방지를 위한 개인별 단백질 손상 정보 기반의 약물 선택 방법 및 시스템
KR20160117973A (ko) 2015-04-01 2016-10-11 인제대학교 산학협력단 신규한 slco2b1 다형성 마커 및 이의 용도

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080085524A1 (en) * 2006-08-15 2008-04-10 Prometheus Laboratories Inc. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
KR102218512B1 (ko) 2010-05-25 2021-02-19 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ｂａｍｂａｍ：고처리율 서열분석 데이터의 병렬 비교 분석
US9646134B2 (en) 2010-05-25 2017-05-09 The Regents Of The University Of California Bambam: parallel comparative analysis of high-throughput sequencing data
WO2013169939A2 (en) 2012-05-08 2013-11-14 Aeromics, Llc New methods
WO2015069961A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Aeromics, Llc Novel prodrug salts
US11227692B2 (en) * 2017-12-28 2022-01-18 International Business Machines Corporation Neuron model simulation
CN113797197B (zh) * 2021-09-17 2023-12-12 中国海洋大学 替加色罗或其药学上可接受的盐在药物转运中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2369485A1 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Methods for obtaining and using haplotype data
GB0307440D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Novartis Ag Organic compounds

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015026135A1 (ko) 2013-08-19 2015-02-26 서울대학교 산학협력단 약물 부작용 방지를 위한 개인별 단백질 손상 정보 기반의 약물 선택 방법 및 시스템
EP3495504A1 (en) 2013-08-19 2019-06-12 Cipherome, Inc. Method and system for selecting drug on basis of individual protein damage information for preventing side effects of drug
KR20160117973A (ko) 2015-04-01 2016-10-11 인제대학교 산학협력단 신규한 slco2b1 다형성 마커 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
EP1835909A2 (en) 2007-09-26
CN101132791A (zh) 2008-02-27
WO2006074127A2 (en) 2006-07-13
US20090118350A1 (en) 2009-05-07
JP2008526775A (ja) 2008-07-24
MX2007008159A (es) 2007-10-11
IL184029A0 (en) 2008-12-29
BRPI0606369A2 (pt) 2009-06-23
RU2007129672A (ru) 2009-02-20
AU2006204146A1 (en) 2006-07-13
CA2593695A1 (en) 2006-07-13
WO2006074127A3 (en) 2007-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2326735T3 (en) Genetic changes of isocitrate dehydrogenase and other genes in malignant glioma
KR20070111475A (ko) 만성 변비 환자에서 테가세로드의 효능을 확인하기 위한바이오마커
KR20090019848A (ko) 알쯔하이머 병의 진행에 대한 생체마커
EP1869214A2 (en) Biomarkers for pharmacogenetic diagnosis of type 2 diabetes
JPWO2007123233A1 (ja) 動脈硬化性疾患関連遺伝子、およびその利用
WO2006130527A2 (en) Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
JP2010501186A (ja) アルツハイマー病の進行に関するバイオマーカー
WO2006060429A2 (en) Identification of variants in histone deacetylase 1 (hdac1) to predict drug response
US20070065821A1 (en) Methods for the prediction of suicidality during treatment
WO2006110478A2 (en) Mutations and polymorphisms of epidermal growth factor receptor
AU2005250142B2 (en) Biomarkers for the prediction of responsiveness to clozapine treatment
US10258606B2 (en) Endothelin single nucleotide polymorphisms and methods of predicting β-adrenergic receptor targeting agent efficacy
KR20080005926A (ko) 항고혈압제로서 알리스키렌의 효능에 대한 바이오마커
US7790390B2 (en) Methods for identifying an individual at increased risk of developing coronary artery disease
JP4979382B2 (ja) 薬剤誘発肝細胞毒性を予測するための遺伝子多型の使用
RU2408363C2 (ru) Биомаркеры для оценки эффективности алискирена в качестве гипертензивного агента
WO2007109183A2 (en) Mutations and polymorphisms of fms-related tyrosine kinase 1
JP2006500930A (ja) 免疫抑制療法に際してのコレステロール上昇予知方法
US20110039344A1 (en) Method and testing a subject thought to be predisposed to lung cancer
KR20070022710A (ko) 클로자핀 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 바이오마커
WO2007058991A2 (en) Mutations and polymorphisms of c-abl

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid