JPWO2007123233A1 - 動脈硬化性疾患関連遺伝子、およびその利用 - Google Patents
動脈硬化性疾患関連遺伝子、およびその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2007123233A1 JPWO2007123233A1 JP2008512182A JP2008512182A JPWO2007123233A1 JP WO2007123233 A1 JPWO2007123233 A1 JP WO2007123233A1 JP 2008512182 A JP2008512182 A JP 2008512182A JP 2008512182 A JP2008512182 A JP 2008512182A JP WO2007123233 A1 JPWO2007123233 A1 JP WO2007123233A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- agtrl1
- site
- prkch
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 265
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 221
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 221
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 265
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 128
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 63
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 42
- 102100030949 Apelin receptor Human genes 0.000 claims description 194
- 101150062385 Prkch gene Proteins 0.000 claims description 175
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 157
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 156
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 139
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 130
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 107
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 96
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 95
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 91
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 88
- 108091008803 APLNR Proteins 0.000 claims description 62
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 53
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 49
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 claims description 49
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 44
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 43
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 42
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 39
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 37
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 34
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 32
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 32
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 claims description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 30
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 25
- 102100030246 Transcription factor Sp1 Human genes 0.000 claims description 25
- 108010053551 Sp1 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 24
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 22
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 17
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 17
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 17
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 16
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 15
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 13
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 13
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 13
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 13
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 12
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 11
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 11
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 claims description 5
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 claims description 3
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 2
- 101000971400 Homo sapiens Protein kinase C eta type Proteins 0.000 claims 16
- 102100021556 Protein kinase C eta type Human genes 0.000 claims 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 abstract description 82
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 abstract description 82
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 101000793362 Homo sapiens Apelin receptor Proteins 0.000 description 308
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 69
- 241000894007 species Species 0.000 description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 description 46
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 44
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 40
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 39
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 37
- 102200116304 rs2230500 Human genes 0.000 description 35
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 32
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 26
- 208000004552 Lacunar Stroke Diseases 0.000 description 25
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 23
- 206010051078 Lacunar infarction Diseases 0.000 description 23
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 21
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 21
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 19
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 19
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 16
- 101150104383 ALOX5AP gene Proteins 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 14
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 14
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 13
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 13
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 13
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 108010027883 protein kinase C eta Proteins 0.000 description 12
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 9
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 8
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 8
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 7
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 7
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 7
- BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N phorbol 12,13-dibutanoate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(=O)CCC)C1(C)C BQJRUJTZSGYBEZ-YVQNUNKESA-N 0.000 description 7
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 101150009243 HAP1 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- -1 SNPs Proteins 0.000 description 5
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 5
- 108010041758 cleavase Proteins 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018746 Apelin Human genes 0.000 description 4
- 108010052412 Apelin Proteins 0.000 description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 4
- 108010037584 Type 4 Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- BWVPHIKGXQBZPV-QKFDDRBGSA-N apelin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=2NC=NC=2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=2NC=NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(O)=O)CCC1 BWVPHIKGXQBZPV-QKFDDRBGSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 102100029170 cAMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase 4D Human genes 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102100024705 182 kDa tankyrase-1-binding protein Human genes 0.000 description 3
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 3
- 102100028166 FACT complex subunit SSRP1 Human genes 0.000 description 3
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000625743 Homo sapiens 182 kDa tankyrase-1-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 101000697353 Homo sapiens FACT complex subunit SSRP1 Proteins 0.000 description 3
- 101001043554 Homo sapiens Leucine-rich repeat-containing protein 55 Proteins 0.000 description 3
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 3
- 101000614332 Homo sapiens P2X purinoceptor 3 Proteins 0.000 description 3
- 102100021931 Leucine-rich repeat-containing protein 55 Human genes 0.000 description 3
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 3
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 3
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 3
- 102100040460 P2X purinoceptor 3 Human genes 0.000 description 3
- 102000042846 PKC family Human genes 0.000 description 3
- 108091082203 PKC family Proteins 0.000 description 3
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 3
- 101100029173 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) SNP2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 3
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 101100094821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SMX2 gene Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000026758 coronary atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 101150083707 dicer1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000029865 regulation of blood pressure Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000023516 stroke disease Diseases 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- SXUXMRMBWZCMEN-UHFFFAOYSA-N 2'-O-methyl uridine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241001484259 Lacuna Species 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 230000007214 atherothrombosis Effects 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000001269 cardiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- PEDOATWRBUGMHU-KQSSXJRRSA-N (2s,3r)-2-[[[9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]purin-6-yl]-methylcarbamoyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C1=NC=2C(N(C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O PEDOATWRBUGMHU-KQSSXJRRSA-N 0.000 description 1
- JDSVHYCXJIIYKT-PNHWDRBUSA-N 1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-(methylaminomethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(=O)NC(=O)N1[C@]1(CNC)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O JDSVHYCXJIIYKT-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- GFYLSDSUCHVORB-IOSLPCCCSA-N 1-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(=N)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O GFYLSDSUCHVORB-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- UTAIYTHAJQNQDW-KQYNXXCUSA-N 1-methylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O UTAIYTHAJQNQDW-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 1
- UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 1-methylpseudouridine Natural products O=C1NC(=O)N(C)C=C1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFCQJGFZUQFYRF-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methylcytidine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RFCQJGFZUQFYRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 2'-O-Methylguanosine Natural products COC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(N)=NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHRRPHCORALGKQ-FDDDBJFASA-N 2'-O-methyl-5-methyluridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 YHRRPHCORALGKQ-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- RFCQJGFZUQFYRF-ZOQUXTDFSA-N 2'-O-methylcytidine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RFCQJGFZUQFYRF-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 2'-O-methylguanosine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=C(N)NC2=O)=C2N=C1 OVYNGSFVYRPRCG-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- WGNUTGFETAXDTJ-OOJXKGFFSA-N 2'-O-methylpseudouridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O WGNUTGFETAXDTJ-OOJXKGFFSA-N 0.000 description 1
- SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 2'-O-methyluridine Chemical compound CO[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 SXUXMRMBWZCMEN-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- IQZWKGWOBPJWMX-UHFFFAOYSA-N 2-Methyladenosine Natural products C12=NC(C)=NC(N)=C2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O IQZWKGWOBPJWMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid boric acid Chemical compound OB(O)O.OB(O)O.OB(O)O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7-methylpurin-9-ium-6-olate Chemical compound C12=NC(N)=NC([O-])=C2N(C)C=[N+]1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- IQZWKGWOBPJWMX-IOSLPCCCSA-N 2-methyladenosine Chemical compound C12=NC(C)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O IQZWKGWOBPJWMX-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- VZQXUWKZDSEQRR-SDBHATRESA-N 2-methylthio-N(6)-(Delta(2)-isopentenyl)adenosine Chemical compound C12=NC(SC)=NC(NCC=C(C)C)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VZQXUWKZDSEQRR-SDBHATRESA-N 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 2-thiocytidine Chemical compound S=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- YXNIEZJFCGTDKV-JANFQQFMSA-N 3-(3-amino-3-carboxypropyl)uridine Chemical compound O=C1N(CCC(N)C(O)=O)C(=O)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YXNIEZJFCGTDKV-JANFQQFMSA-N 0.000 description 1
- RDPUKVRQKWBSPK-UHFFFAOYSA-N 3-Methylcytidine Natural products O=C1N(C)C(=N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 RDPUKVRQKWBSPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RDPUKVRQKWBSPK-ZOQUXTDFSA-N 3-methylcytidine Chemical compound O=C1N(C)C(=N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RDPUKVRQKWBSPK-ZOQUXTDFSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCZUPRDAAVVBSO-MJXNYTJMSA-N 4-acetylcytidine Chemical compound C1=CC(C(=O)C)(N)NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 BCZUPRDAAVVBSO-MJXNYTJMSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- UVGCZRPOXXYZKH-QADQDURISA-N 5-(carboxyhydroxymethyl)uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C(O)C(O)=O)=C1 UVGCZRPOXXYZKH-QADQDURISA-N 0.000 description 1
- 102000004023 5-Lipoxygenase-Activating Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000411 5-Lipoxygenase-Activating Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKLFQTYNHLDMDP-PNHWDRBUSA-N 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C(CNCC(O)=O)=C1 VKLFQTYNHLDMDP-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- RJUNHHFZFRMZQQ-FDDDBJFASA-N 5-methoxyaminomethyl-2-thiouridine Chemical compound S=C1NC(=O)C(CNOC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RJUNHHFZFRMZQQ-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- YIZYCHKPHCPKHZ-PNHWDRBUSA-N 5-methoxycarbonylmethyluridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(CC(=O)OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YIZYCHKPHCPKHZ-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 5-methoxyuridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZXIATBNUWJBBGT-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 5-methyl-2-thiouridine Chemical compound S=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SNNBPMAXGYBMHM-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- ZXQHKBUIXRFZBV-FDDDBJFASA-N 5-methylaminomethyluridine Chemical compound O=C1NC(=O)C(CNC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZXQHKBUIXRFZBV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- USVMJSALORZVDV-UHFFFAOYSA-N 6-(gamma,gamma-dimethylallylamino)purine riboside Natural products C1=NC=2C(NCC=C(C)C)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O USVMJSALORZVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 1
- 108050009086 Angiotensin II receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000001838 Angiotensin II receptor type 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010060965 Arterial stenosis Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008088 Cerebral artery embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 238000003718 Dual-Luciferase Reporter Assay System Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 1
- 102100021056 Ferroptosis suppressor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940122498 Gene expression inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108091027874 Group I catalytic intron Proteins 0.000 description 1
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 241000454273 Hirashima Species 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001095043 Homo sapiens Bone marrow proteoglycan Proteins 0.000 description 1
- 101000818014 Homo sapiens Ferroptosis suppressor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001131990 Homo sapiens Peroxidasin homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000582986 Homo sapiens Phospholipid phosphatase-related protein type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001123334 Homo sapiens Proteoglycan 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000617823 Homo sapiens Solute carrier organic anion transporter family member 6A1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652338 Homo sapiens Transcription factor Sp1 Proteins 0.000 description 1
- 101150031639 IV gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- RSPURTUNRHNVGF-IOSLPCCCSA-N N(2),N(2)-dimethylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N(C)C)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RSPURTUNRHNVGF-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- SLEHROROQDYRAW-KQYNXXCUSA-N N(2)-methylguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(NC)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O SLEHROROQDYRAW-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- USVMJSALORZVDV-SDBHATRESA-N N(6)-(Delta(2)-isopentenyl)adenosine Chemical compound C1=NC=2C(NCC=C(C)C)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O USVMJSALORZVDV-SDBHATRESA-N 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N(6)-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- UNUYMBPXEFMLNW-DWVDDHQFSA-N N-[(9-beta-D-ribofuranosylpurin-6-yl)carbamoyl]threonine Chemical compound C1=NC=2C(NC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(O)=O)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O UNUYMBPXEFMLNW-DWVDDHQFSA-N 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N NSC 29409 Natural products C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- VZQXUWKZDSEQRR-UHFFFAOYSA-N Nucleosid Natural products C12=NC(SC)=NC(NCC=C(C)C)=C2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O VZQXUWKZDSEQRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 101150110109 PDE4D gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100034601 Peroxidasin homolog Human genes 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 1
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100021991 Solute carrier organic anion transporter family member 6A1 Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 208000032851 Subarachnoid Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241001428638 Tobacco ringspot virus satellite RNA Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 101710085924 Transcription factor Sp1 Proteins 0.000 description 1
- 108010062481 Type 1 Angiotensin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000010913 Type 1 Angiotensin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 201000004810 Vascular dementia Diseases 0.000 description 1
- 206010063661 Vascular encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- YXNIEZJFCGTDKV-UHFFFAOYSA-N X-Nucleosid Natural products O=C1N(CCC(N)C(O)=O)C(=O)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 YXNIEZJFCGTDKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 208000007474 aortic aneurysm Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 125000001488 beta-D-galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000005242 cardiac chamber Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000013677 cerebrovascular dementia Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N dihydrouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)CC1 ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 230000003073 embolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006543 gametophyte development Effects 0.000 description 1
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 102000047215 human APLNR Human genes 0.000 description 1
- 102000052282 human Sp1 Human genes 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004293 human mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000013388 immunohistochemistry analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 201000010849 intracranial embolism Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- WZRYXYRWFAPPBJ-PNHWDRBUSA-N methyl uridin-5-yloxyacetate Chemical compound O=C1NC(=O)C(OCC(=O)OC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WZRYXYRWFAPPBJ-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009862 primary prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000020167 protein autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N s2C Natural products S=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000002784 sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004026 tunica intima Anatomy 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- RVCNQQGZJWVLIP-VPCXQMTMSA-N uridin-5-yloxyacetic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(OCC(O)=O)=C1 RVCNQQGZJWVLIP-VPCXQMTMSA-N 0.000 description 1
- YIZYCHKPHCPKHZ-UHFFFAOYSA-N uridine-5-acetic acid methyl ester Natural products COC(=O)Cc1cn(C2OC(CO)C(O)C2O)c(=O)[nH]c1=O YIZYCHKPHCPKHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- QAOHCFGKCWTBGC-QHOAOGIMSA-N wybutosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N3C(CC[C@H](NC(=O)OC)C(=O)OC)=C(C)N=C3N(C)C=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O QAOHCFGKCWTBGC-QHOAOGIMSA-N 0.000 description 1
- QAOHCFGKCWTBGC-UHFFFAOYSA-N wybutosine Natural products C1=NC=2C(=O)N3C(CCC(NC(=O)OC)C(=O)OC)=C(C)N=C3N(C)C=2N1C1OC(CO)C(O)C1O QAOHCFGKCWTBGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
Abstract
全ゲノムを対象としたSNPによるゲノムワイド相関研究を行い、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に関連する2種の遺伝子を同定することに成功した。また、該遺伝子上に動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査に利用可能な多型変異を見出すことに成功した。該多型変異の有無を指標とすることにより、被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査を効率的に実施することができる。また、該遺伝子の発現もしくは機能を指標とすることにより、動脈硬化性疾患の治療薬のスクリーニング方法が可能である。
Description
本発明は、AGTRL1遺伝子もしくはPRKCH遺伝子の発現、または多型変異を指標とする動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法、並びに、該遺伝子を利用した動脈硬化性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。
1950〜1960年代に、わが国の脳卒中死亡率は世界で最も高かった。その後、1970年代前半からその死亡率は着実に低下して、1990年代に入り欧米諸国と肩を並べるに至っている(非特許文献1)。
しかし、現在でも脳卒中は日本人の死因の第三位を占める主な死因の一つであることに変わりはない。またこの間、脳卒中の発生率も低下傾向にあったが、近年その低下傾向が鈍化し横ばい状態になりつつある(非特許文献2)。ひとたび脳卒中が発生すると、多くの場合に罹患者で身体障害や認知機能障害が残ることから、脳卒中は公衆衛生上の深刻な問題である(非特許文献3)。脳卒中発生率は加齢に伴って直線的に増加するが、わが国では高齢人口が急速に増加しつつあることから、脳卒中の一次予防は世界的に重要な社会的課題となっている。
脳卒中は、脳梗塞、脳出血およびクモ膜下出血に大きく分けられる(非特許文献4)。このうち脳梗塞の頻度が最も高く、脳卒中全体の約70%を占める(非特許文献5)。脳梗塞はさらに、責任血管の大きさや発生機序により、細い穿通動脈の動脈硬化に起因するラクナ梗塞(LA)、頭蓋外および主要な頭蓋内動脈が冒されるアテローム硬化に起因するアテローム血栓性脳梗塞(AT)、心腔内にできた血栓が脳に飛来して発生する心原性脳塞栓性梗塞(CE)のサブタイプに細分される。LAおよびATは主として、脳を灌流する細い動脈または太い動脈におけるアテローム性動脈硬化が原因となって起こる。(非特許文献4)。
脳卒中を初めとする多因子疾患は、環境要因とともに複数の遺伝子が関与する多因子疾患であり患者数も多いことから、その遺伝因子を解明することは、その診断・治療技術の発達や、疾患の予防に大きく貢献するとともに、医療経済に与える影響も大きいと考えられている。これまでの疫学研究で、脳梗塞の危険因子は、高血圧、糖尿病、脂質代謝異常および喫煙などが知られている(非特許文献1、6)。脳卒中の家族歴も危険因子であり、脳卒中のリスクは一卵性双生児の方が二卵性双生児よりも高い(非特許文献7)。これら双生児研究および家族歴研究により、脳梗塞に関する遺伝因子の存在は予想されるものの(非特許文献7)、脳梗塞の遺伝的な決定要因は未だにほとんど解明されていない。
遺伝病ではない一般的な疾患(Common disease)の感受性を与える遺伝子を発見することを目的として、いくつかの研究スタイルが提唱されている(非特許文献8)。候補遺伝子アプローチは広く用いられているが、結果に再現性がないことが問題となっている(非特許文献9)。例えばこの手法を用いて脳梗塞の関連遺伝子が検討され、アテローム性動脈硬化に関係するいくつかの既知の候補遺伝子が報告されている。しかし、それらは他の対象集団では必ずしも再現性が得られていない(非特許文献10)。一方、近年、脳卒中のような複雑な発生機序を有する疾患の関連遺伝子を探索するうえで、信頼性が高い研究手法としてゲノムワイド研究が注目されている(非特許文献14)。ゲノムワイド相関解析により、わが国では心筋梗塞(非特許文献11)、関節リウマチ(非特許文献12)、クローン病(非特許文献13)の関連遺伝子が同定され、異なる集団においてその再現性が確認されている。また、アイスランド人の集団を対象としたゲノムワイドの連鎖解析および相関解析により、ホスホジエステラーゼ4D(PDE4D)(非特許文献15)と5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質(ALOX5AP)(非特許文献16)が脳卒中の新規関連遺伝子として報告されている。しかし、このうちPDE4Dについては、その研究方法に重大な問題があるとの批判がある(非特許文献17)。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
過去に脳梗塞の関連遺伝子として報告されているものは、CADASILにおけるNOTCH3遺伝子の異常およびMELASにおけるミトコンドリアDNAの遺伝子異常があるが、これらは明らかな遺伝性脳梗塞の原因遺伝子であり、一般に認められる脳梗塞の関連遺伝子ではない。一般的な脳梗塞の関連遺伝子としては、これまで主に脳梗塞の発症機序から推測される遺伝子(例えば凝固系遺伝子、ACE遺伝子、MTHFR遺伝子など)の多型を用いた候補遺伝子研究が行われているが一定の見解は得られていない。従って、新たな脳梗塞の関連遺伝子を同定するにはヒトの全ゲノムを対象としたゲノムワイド相関研究が必要である。これまでに脳卒中を対象としたゲノムワイド相関研究の報告としては、アイスランドのdeCODEグループからPDE4D遺伝子およびALOX5AP遺伝子が報告されているのみである。PDE4D遺伝子はアテローム血栓性脳梗塞と心原性塞栓症を併せた解析のみで有意な関連が見られたことから、その結果を疑問視する声があり、他集団での再現性の報告もない。ALOX5AP遺伝子は複数の集団で脳梗塞との関連が確認されているが、その関連はアイスランド以外の集団では極めて弱い。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に関連する遺伝子、および該遺伝子の特徴を利用する用途の提供を課題とする。より具体的には本発明は、動脈硬化性疾患に関連する遺伝子、および該遺伝子上の多型を利用した動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法、並びに、動脈硬化性疾患の治療のための薬剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った。本発明者らは、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に対する遺伝的寄与に関して調べるために、遺伝子をベースとする大規模tag-SNPマーカーを用いてケースコントロール研究を行った。
本発明者らは、プロテインキナーゼC(PKC)ファミリー遺伝子であるPRKCHが、ラクナ梗塞およびアテローム血栓性の梗塞と高度の関連性(p=4.7×10-6)があることを見出した。14年間の前向き追跡研究において、PRKCH中のSNP(1425G>A)はPKC活性に影響を及ぼし、脳梗塞発生のリスクを増大させた(p=0.043、相対リスク2.58)。本発明者らはまた、PKCηがヒトのアテローム硬化病変の血管内皮細胞および泡沫マクロファージで発現され、重症度と相関することも見出した。上記の結果は、PRKCH中のSNPが、そのキナーゼ活性を変化させることにより、脳梗塞に関する新規な遺伝的危険因子となることを示している。
今回、本発明者らは、脳梗塞症例1,112例と年齢・性を対応させた同数の対照例を用いた遺伝子ベースの大規模なケースコントロール研究を行い、PRKCHが脳梗塞に関連する遺伝子であることを新たに見出した。PRKCHのエクソン9中のSNP(1425G>A)は、ラクナ梗塞群およびラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを併せた群と高い関連性があった。PKCηはアテローム硬化病変で発現されており、その発現レベルはアテローム硬化の重症度に伴って上昇した。機能解析により、このアミノ酸置換(V374I)はPKC活性を1.6倍の高さに誘導することが判明した。さらに、前向き追跡研究において、AA遺伝子型を有する対象者では、GA遺伝子型またはGG遺伝子型を有する対象者と比べて、脳梗塞の発生率が2.58倍高かった。これらの結果から、PRKCHは脳梗塞に関与する遺伝子であり、特にPRKCH中の多型変異(SNP)(1425G>A)がその責任部位であることが示された。
さらに発明者らは、AGTRL1遺伝子中のSNPが脳梗塞と関連することを新たに見出した。AGTRL1遺伝子によってコードされるAPJ受容体(アンジオテンシン1型受容体と相同性のある受容体タンパク質)は、心血管系(非特許文献22)および中枢神経系(非特許文献23)で発現され、これは血圧の調節(非特許文献24〜27)ならびに内皮細胞の移動(非特許文献28)および増殖(非特許文献29)に働くことが示されている。インビトロ機能解析により、本発明者らは、Sp1転写因子がAGTRL1のプロモーターおよびイントロン中のSNPと結合し、mRNAの発現レベルに影響を及ぼすことを見出した。これらの結果は、AGTRL1のハプロタイプが、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に対する感受性にかかわる新規の遺伝的決定要因であること、およびアテローム性動脈硬化の発症機序に関与していることを示している。
今回見出された2遺伝子のうちAGTRL1遺伝子は7回膜貫通型G蛋白共役受容体であるAGTRL1をコードする遺伝子であり、高血圧や動脈硬化と深い関連を持つAngiotensin II receptor type 1と30%のホモロジーを有することが知られている。AGTRL1のリガンドとしてApelinが報告されており、これまでにラットの実験でApelinが血圧調節に関与することが報告されている。ヒトにおいては心不全患者でApelinやAGTRL1の発現が上昇していることやApelinの投与により静脈が収縮することが報告されている。従って、これまでの報告からAGTRL1は血圧調節に関与することが推測されるが、ヒトにおいてこれまで脳梗塞との関連を報告したものはない。一方、PRKCH遺伝子はPKCファミリーに属するPKC-etaをコードする遺伝子であり、これまでの報告ではマウスの皮膚に発現が高く癌における細胞増殖やアポトーシスとの関連が示唆されているが、ヒトにおける機能は全く不明でありPKC-etaの基質やシグナル伝達経路もほとんど解明されていない。従って、PKC-etaと脳梗塞との関連はこれまでの知見からでは全く示唆されない。
上述の如く本発明者らは、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に関連する2遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成させた。
本発明は、脳梗塞等の動脈硬化性疾患に関連する遺伝子、および該遺伝子上の多型を利用した動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法、並びに、動脈硬化性疾患の治療のための薬剤のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔1〕 被検者におけるAGTRL1遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔2〕 被検者について、AGTRL1遺伝子におけるDNA変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔3〕 前記変異が、Sp1転写因子との結合を変化させる変異である、〔2〕に記載の検査方法、
〔4〕 被検者におけるPRKCH遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔5〕 被検者について、PRKCH遺伝子におけるDNA変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔6〕 変異が多型変異である、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の検査方法、
〔7〕 被検者について、AGTRL1遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔8〕 多型部位が、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における(1a)1位、(2a)12541位、(3a)21545位、(4a)33051位、(5a)35365位、(6a)39268位、(7a)39353位、(8a)39370位、(9a)39474位、(10a)39553位、(11a)39665位、(12a)41786位、(13a)42019位、(14a)42509位、(15a)43029位、(16a)43406位、(17a)43663位、(18a)46786位、(19a)49764位、(20a)64276位、(21a)74482位、(22a)78162位、(23a)93492位、または(24a)102938位の多型部位である、〔7〕に記載の検査方法、
〔9〕 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の(1b)〜(24b)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される〔8〕に記載の検査方法、
(1b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の1位における相補鎖の塩基種がT
(2b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の12541位における相補鎖の塩基種がT
(3b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の21545位における相補鎖の塩基種がA
(4b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の33051位における相補鎖の塩基種がC
(5b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の35365位における相補鎖の塩基種がT
(6b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位における相補鎖の塩基種がA
(7b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39353位における相補鎖の塩基種がG
(8b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39370位における相補鎖の塩基種がC
(9b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39474位における相補鎖の塩基種がT
(10b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39553位における相補鎖の塩基種がT
(11b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39665位が欠失
(12b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の41786位における相補鎖の塩基種がA
(13b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42019位における相補鎖の塩基種がG
(14b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42509位における相補鎖の塩基種がG
(15b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43029位における相補鎖の塩基種がG
(16b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43406位における相補鎖の塩基種がC
(17b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43663位における相補鎖の塩基種がT
(18b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の46786位における相補鎖の塩基種がC
(19b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の49764位における相補鎖の塩基種がT
(20b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の64276位における相補鎖の塩基種がT
(21b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の74482位における相補鎖の塩基種がC
(22b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の78162位における相補鎖の塩基種がG
(23b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の93492位における相補鎖の塩基種がG
(24b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の102938位における相補鎖の塩基種がC
〔10〕 被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックが検出された場合に動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される方法、
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
〔11〕 被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロック内に存在し互いに連鎖することを特徴とする多型部位の塩基種を決定する工程を含む検査方法、
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
〔12〕 以下の工程(a)および(b)を含む、被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
(a) 被検者におけるAGTRL1遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程
(b)(a)で決定された塩基種が、以下の(A)に記載のハプロタイプを示すAGTRL1遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する工程
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
〔13〕 前記(a)の多型部位が、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における1位、12541位、21545位、33051位、35365位、39268位、39353位、39370位、39474位、39553位、39665位、41786位、42019位、42509位、43029位、43406位、43663位、46786位、49764位、64276位、74482位、78162位、93492位、または102938位のいずれかの多型部位である、〔12〕に記載の検査方法、
〔14〕 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるAGTRL1遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔15〕 被検者について、PRKCH遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔16〕 多型部位が、PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列における(1a)1位、(2a)16212位、(3a)30981位、(4a)32408位、(5a)33463位、(6a)34446位、(7a)39322位、(8a)39469位、(9a)39471位、(10a)49248位、(11a)49367位、または(12a)52030位の多型部位である、〔15〕に記載の検査方法、
〔17〕 〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の(1b)〜(12b)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される〔16〕に記載の検査方法、
(1b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の1位の塩基種がA
(2b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の16212位の塩基種がG
(3b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の30981位の塩基種がA
(4b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の32408位の塩基種がG
(5b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の33463位の塩基種がG
(6b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の34446位の塩基種がT
(7b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39322位の塩基種がT
(8b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39469位の塩基種がA
(9b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39471位の塩基種がC
(10b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49248位の塩基種がC
(11b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49367位の塩基種がG
(12b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の52030位の塩基種がA
〔18〕 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるPRKCHタンパク質の自己リン酸化活性またはキナーゼ活性が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔19〕 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者について、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体を有する場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔20〕 被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、〔1〕〜〔19〕のいずれかに記載の検査方法、
〔21〕 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔22〕 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔23〕 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔24〕 以下の(a)または(b)を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査用試薬、
(a)AGTRL1またはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1またはPRKCHタンパク質を認識する抗体
〔25〕 以下の(a)〜(c)のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬、
(a)AGTRL1遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1タンパク質を認識する抗体
(c)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド
〔26〕 以下の(a)〜(c)のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬、
(a)PRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)PRKCHタンパク質を認識する抗体
(c)PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するPRKCHタンパク質変異体
〔27〕 AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔28〕 AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現抑制物質が、以下の(a)〜(c)からなる群より選択される化合物である、〔27〕に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
(c)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現をRNAi効果による阻害作用を有する核酸
〔29〕 AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能抑制物質が、以下の(a)または(b)の化合物である、〔27〕に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
(a)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体
(b)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子化合物
〔30〕 AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域と、Sp1転写因子との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔31〕 PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔32〕 AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
〔33〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)該AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔34〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔35〕 AGTRL1遺伝子が、以下の(a)または(b)の発現が亢進した変異型AGTRL1遺伝子である、〔32〕〜〔34〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
(a)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42509位における相補鎖の塩基種がGである変異型AGTRL1遺伝子
(b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39353位における相補鎖の塩基種がGである変異型AGTRL1遺伝子
〔36〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド、およびSp1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
(b)前記ポリヌクレオチドとSp1転写因子との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
〔37〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b)PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、自己リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程
〔38〕 前記PRKCHタンパク質が、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体である、〔37〕に記載のスクリーニング方法、
〔39〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b)PRKCHタンパク質のプロテインキナーゼ活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、プロテインキナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程
を、提供するものである。
〔1〕 被検者におけるAGTRL1遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔2〕 被検者について、AGTRL1遺伝子におけるDNA変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔3〕 前記変異が、Sp1転写因子との結合を変化させる変異である、〔2〕に記載の検査方法、
〔4〕 被検者におけるPRKCH遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔5〕 被検者について、PRKCH遺伝子におけるDNA変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔6〕 変異が多型変異である、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の検査方法、
〔7〕 被検者について、AGTRL1遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔8〕 多型部位が、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における(1a)1位、(2a)12541位、(3a)21545位、(4a)33051位、(5a)35365位、(6a)39268位、(7a)39353位、(8a)39370位、(9a)39474位、(10a)39553位、(11a)39665位、(12a)41786位、(13a)42019位、(14a)42509位、(15a)43029位、(16a)43406位、(17a)43663位、(18a)46786位、(19a)49764位、(20a)64276位、(21a)74482位、(22a)78162位、(23a)93492位、または(24a)102938位の多型部位である、〔7〕に記載の検査方法、
〔9〕 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の(1b)〜(24b)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される〔8〕に記載の検査方法、
(1b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の1位における相補鎖の塩基種がT
(2b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の12541位における相補鎖の塩基種がT
(3b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の21545位における相補鎖の塩基種がA
(4b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の33051位における相補鎖の塩基種がC
(5b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の35365位における相補鎖の塩基種がT
(6b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位における相補鎖の塩基種がA
(7b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39353位における相補鎖の塩基種がG
(8b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39370位における相補鎖の塩基種がC
(9b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39474位における相補鎖の塩基種がT
(10b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39553位における相補鎖の塩基種がT
(11b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39665位が欠失
(12b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の41786位における相補鎖の塩基種がA
(13b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42019位における相補鎖の塩基種がG
(14b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42509位における相補鎖の塩基種がG
(15b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43029位における相補鎖の塩基種がG
(16b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43406位における相補鎖の塩基種がC
(17b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43663位における相補鎖の塩基種がT
(18b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の46786位における相補鎖の塩基種がC
(19b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の49764位における相補鎖の塩基種がT
(20b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の64276位における相補鎖の塩基種がT
(21b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の74482位における相補鎖の塩基種がC
(22b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の78162位における相補鎖の塩基種がG
(23b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の93492位における相補鎖の塩基種がG
(24b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の102938位における相補鎖の塩基種がC
〔10〕 被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックが検出された場合に動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される方法、
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
〔11〕 被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロック内に存在し互いに連鎖することを特徴とする多型部位の塩基種を決定する工程を含む検査方法、
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
〔12〕 以下の工程(a)および(b)を含む、被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
(a) 被検者におけるAGTRL1遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程
(b)(a)で決定された塩基種が、以下の(A)に記載のハプロタイプを示すAGTRL1遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する工程
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
〔13〕 前記(a)の多型部位が、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における1位、12541位、21545位、33051位、35365位、39268位、39353位、39370位、39474位、39553位、39665位、41786位、42019位、42509位、43029位、43406位、43663位、46786位、49764位、64276位、74482位、78162位、93492位、または102938位のいずれかの多型部位である、〔12〕に記載の検査方法、
〔14〕 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるAGTRL1遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔15〕 被検者について、PRKCH遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法、
〔16〕 多型部位が、PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列における(1a)1位、(2a)16212位、(3a)30981位、(4a)32408位、(5a)33463位、(6a)34446位、(7a)39322位、(8a)39469位、(9a)39471位、(10a)49248位、(11a)49367位、または(12a)52030位の多型部位である、〔15〕に記載の検査方法、
〔17〕 〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の(1b)〜(12b)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される〔16〕に記載の検査方法、
(1b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の1位の塩基種がA
(2b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の16212位の塩基種がG
(3b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の30981位の塩基種がA
(4b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の32408位の塩基種がG
(5b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の33463位の塩基種がG
(6b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の34446位の塩基種がT
(7b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39322位の塩基種がT
(8b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39469位の塩基種がA
(9b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39471位の塩基種がC
(10b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49248位の塩基種がC
(11b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49367位の塩基種がG
(12b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の52030位の塩基種がA
〔18〕 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるPRKCHタンパク質の自己リン酸化活性またはキナーゼ活性が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔19〕 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者について、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体を有する場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法、
〔20〕 被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、〔1〕〜〔19〕のいずれかに記載の検査方法、
〔21〕 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔22〕 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔23〕 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬、
〔24〕 以下の(a)または(b)を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査用試薬、
(a)AGTRL1またはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1またはPRKCHタンパク質を認識する抗体
〔25〕 以下の(a)〜(c)のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬、
(a)AGTRL1遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1タンパク質を認識する抗体
(c)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド
〔26〕 以下の(a)〜(c)のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬、
(a)PRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)PRKCHタンパク質を認識する抗体
(c)PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するPRKCHタンパク質変異体
〔27〕 AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔28〕 AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現抑制物質が、以下の(a)〜(c)からなる群より選択される化合物である、〔27〕に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
(c)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現をRNAi効果による阻害作用を有する核酸
〔29〕 AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能抑制物質が、以下の(a)または(b)の化合物である、〔27〕に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
(a)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体
(b)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子化合物
〔30〕 AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域と、Sp1転写因子との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔31〕 PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤、
〔32〕 AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
〔33〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)該AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔34〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔35〕 AGTRL1遺伝子が、以下の(a)または(b)の発現が亢進した変異型AGTRL1遺伝子である、〔32〕〜〔34〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
(a)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42509位における相補鎖の塩基種がGである変異型AGTRL1遺伝子
(b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39353位における相補鎖の塩基種がGである変異型AGTRL1遺伝子
〔36〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド、およびSp1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
(b)前記ポリヌクレオチドとSp1転写因子との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
〔37〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b)PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、自己リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程
〔38〕 前記PRKCHタンパク質が、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体である、〔37〕に記載のスクリーニング方法、
〔39〕 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法、
(a)PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b)PRKCHタンパク質のプロテインキナーゼ活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、プロテインキナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程
を、提供するものである。
さらに本発明は、以下を提供する。
〔40〕 下記(a)〜(e)のいずれかに記載の物質の、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬の製造における使用。
(a) 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド
(b) 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相
(c) 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド
(d) AGTRL1またはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(e) AGTRL1またはPRKCHタンパク質を認識する抗体
〔41〕 下記(a)〜(f)のいずれかに記載の物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬の製造における使用。
(a)AGTRL1遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1タンパク質を認識する抗体
(c)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド
(d)PRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(e)PRKCHタンパク質を認識する抗体
(f)PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するPRKCHタンパク質変異体
〔42〕 AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤の製造における使用。
〔43〕 以下の(a)または(b)に記載の物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤の製造における使用。
(a) AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域と、Sp1転写因子との結合を阻害する物質
(b) PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性を阻害する物質
〔44〕被検者(ヒト、またはその他哺乳動物等、好ましくは、動脈硬化性疾患の患者等)へ本発明の薬剤を投与する工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防方法。
〔40〕 下記(a)〜(e)のいずれかに記載の物質の、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬の製造における使用。
(a) 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド
(b) 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相
(c) 〔8〕の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、〔16〕の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチド
(d) AGTRL1またはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(e) AGTRL1またはPRKCHタンパク質を認識する抗体
〔41〕 下記(a)〜(f)のいずれかに記載の物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬の製造における使用。
(a)AGTRL1遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1タンパク質を認識する抗体
(c)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド
(d)PRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(e)PRKCHタンパク質を認識する抗体
(f)PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するPRKCHタンパク質変異体
〔42〕 AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤の製造における使用。
〔43〕 以下の(a)または(b)に記載の物質の、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤の製造における使用。
(a) AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域と、Sp1転写因子との結合を阻害する物質
(b) PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性を阻害する物質
〔44〕被検者(ヒト、またはその他哺乳動物等、好ましくは、動脈硬化性疾患の患者等)へ本発明の薬剤を投与する工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防方法。
本発明者らは、脳梗塞等の動脈硬化性疾患と関連する遺伝子として、AGTRL1遺伝子およびPRKCH遺伝子を同定し、さらに、該遺伝子の発現もしくは機能に関与する多型変異(SNP)を同定した。また、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能の亢進は動脈硬化性疾患の発症と深く関連していることが見出された。被検者について、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現が亢進していれば、動脈硬化性疾患のリスク素因を有する(動脈硬化性疾患に罹患しやすい体質である)ものと判定することが可能である。
本発明において「動脈硬化性疾患」とは、通常、動脈硬化を起因とする疾患を指す。具体的には、脳梗塞(例えば、ラクナ梗塞、アテローム性血栓性梗塞を含む)、心筋梗塞、動脈硬化症(例えば、アテローム性動脈硬化症を含む)、閉塞性動脈硬化症、大動脈瘤、腎動脈狭窄等を例示することができる。また、上記のラクナ梗塞は細動脈硬化を起因とする疾患であり、例えば、脳血管性痴呆(特にビンスワンガー病)、無症候性脳梗塞、微小心筋梗塞等も、本発明の動脈硬化性疾患に含まれる。
AGTRL1遺伝子またはPRKCH遺伝子上の多型変異または発現等を指標とすることにより、動脈硬化症のリスク素因の有無の検査が可能であることが、本発明者らによって初めて見出された。
本発明は、まず、被検者(被検者由来の生体試料)におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法を提供する。
従って、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性(機能)を指標とすることにより、被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査することができる。
本発明におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の塩基配列、およびそれら遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する情報は、上記のGenBankのアクセッション番号から、容易に取得することが可能である。また当業者においては、遺伝子表記(遺伝子名)を基に、公共の遺伝子データベースあるいは文献データベース等から遺伝子の塩基配列、および該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に関する情報を容易に入手することが可能である。
AGTRL1遺伝子およびPRKCH遺伝子の、それぞれの塩基配列およびアミノ酸配列に関するGenBank等の公共のデータベースのアクセッション番号および配列表における配列番号を以下に示す。
AGTRL1mRNA:NM_005161(RefSeq)(配列番号:3)、アミノ酸:NP_005152(配列番号:4)
PRKCH mRNA:NM_006255(RefSeq)(配列番号:5)、アミノ酸:NP_006246(配列番号:6)
AGTRL1mRNA:NM_005161(RefSeq)(配列番号:3)、アミノ酸:NP_005152(配列番号:4)
PRKCH mRNA:NM_006255(RefSeq)(配列番号:5)、アミノ酸:NP_006246(配列番号:6)
なお、AGTRL1遺伝子を含むゲノムDNA領域の塩基配列を、配列番号:1に示す。また、PRKCH遺伝子を含むゲノムDNA領域の塩基配列を、配列番号:2に示す。なおAGTRL1遺伝子およびPRKCH遺伝子ともに、配列表はプラス鎖を掲載している。
本発明において「被検者」とは、通常ヒトであるが、本発明の検査方法は必ずしもヒトのみを被検対象とする方法に限定されない。ヒト以外の生物(好ましくは、脊椎動物であり、より好ましくはマウス、ラット、サル、イヌ、ネコ等の哺乳動物)を検査対象とする場合は、被検対象とする生物が有する内在性のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子に相当する遺伝子について、その発現量を指標として検査を行う。従って本発明における「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子」には、例えば、配列番号:1または2に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性のDNA(AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子ホモログ等)が含まれる。
また、配列番号:1もしくは2に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、配列番号:1もしくは2に記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上(例えば、95%以上、さらには96%、97%、98%または99%以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、配列番号:1もしくは2に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1%SDS、50℃」、「2×SSC、0.1%SDS、42℃」、「1×SSC、0.1%SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1%SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の生物におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。
また本発明は、被検者におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される、動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法を提供する。
上記方法においては、通常、被検者由来の生体試料を被検試料とする。該被検試料におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量の測定は、当業者においては公知の技術を用いて適宜実施することが可能である。
なお、上記遺伝子の「発現」には、該遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」が含まれる。
遺伝子の発現量を、該遺伝子の翻訳産物(タンパク質)の生成量を指標として測定する場合、例えば、被検試料からタンパク質試料を調製し、該タンパク質試料に含まれるAGTRL1もしくはPRKCHの量を測定する。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法(ELISA)、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法(蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.5(2002)、蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.8(2002))、2次元電気泳動法、SDSポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、これらに限定されない。
遺伝子の発現量を、該遺伝子の転写産物(mRNA)の生成量を指標として測定する場合、例えば、被検試料からRNA試料を調製し、該RNA試料に含まれるAGTRL1もしくはPRKCHをコードするRNAの量を測定する。また、被検試料からcDNA試料を調製し、該cDNA試料に含まれるAGTRL1もしくはPRKCHをコードするcDNAの量を測定することによって、発現量を評価することも可能である。被検試料からのRNA試料やcDNA試料は、被検者由来の生体試料から、当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を挙げることができる。
なお、上記「対照」とは、通常、健常者由来の生体試料におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量を指す。なお、本発明におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現とは、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子から転写されるmRNAの発現、またはAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の両方を意味するものである。
また本発明は、被検者について、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子における変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法を提供する。
本発明において「動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査」には、被検者について動脈硬化性疾患の非リスク素因を有するか否かの検査、または、被検者について動脈硬化性疾患に罹患する可能性が高いか低いかを判定するための検査が含まれる。本発明の方法においては、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子において変異が検出された場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有する、または、動脈硬化性疾患の非リスク素因を有さない、あるいは動脈硬化性疾患に罹患しやすい体質を有すると判定される。
一方、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子において変異が検出されない場合に、被検者は動脈硬化性疾患の非リスク素因を有する、または動脈硬化性疾患のリスク素因を有さない等と判定される。
また本発明の方法により、動脈硬化性疾患を罹患していない被検者であっても、動脈硬化性疾患を罹患する可能性が高いか低いかを判定することができる。
なお、本明細書で用いられる「治療」とは、通常、薬理学的なおよび/または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、疾患や症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であってもよく、疾患の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であっても良い。本明細書における「治療」とは、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療すべてを含んでいる。そしてさらに、疾患のリスク素因があるが未だ発病していると診断されていない被検者の発病の予防、疾患の進行を抑制すること、または疾患を軽減させること、発症を遅らせることなどもこの「治療」に含まれる。
本発明の検査方法により、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを判定し、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定された患者は、発症する前に適切な治療を選択し、動脈硬化性疾患の発症を事前に予防することができると考えられる。
本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のDNA配列としては、具体的には、それぞれ配列番号:1または2に記載の配列が挙げられる。
上記本発明の検査方法における「変異」の位置は、通常、上記AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のORF中、あるいは上記遺伝子の発現を制御する領域(例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン等)中などに存在するが、これらに限定されるものではない。また、この「変異」とは、通常、上記遺伝子の発現量を亢進させる、mRNAの安定性を向上させる、あるいは上記遺伝子によってコードされるタンパク質の有する活性を上昇させるような変異であることが好ましい。本発明の変異の種類としては、例えば、塩基の付加、欠失、置換、挿入変異等を挙げることができる。
AGTRL1遺伝子においては、Sp1転写因子の結合活性が変化するような「変異」であることが好ましい。該変異の好ましい例としては、後述の実施例において示すSNP4多型変異(配列番号:1に記載の塩基配列上において42509位の多型部位の塩基種がC(その相補鎖における塩基種がG)またはSNP9多型変異(配列番号:1に記載の塩基配列上において39353位の多型部位の塩基種がC(その相補鎖における塩基種がG)を挙げることができる。
また、PRKCH遺伝子の場合には、好ましい態様として、該遺伝子によってコードされるPRKCHタンパク質のアミノ酸配列において、374位のバリンがイソロイシンへ変化させるようなDNA変異を例示することができる。
また、PRKCH遺伝子の場合には、好ましい態様として、該遺伝子によってコードされるPRKCHタンパク質のアミノ酸配列において、374位のバリンがイソロイシンへ変化させるようなDNA変異を例示することができる。
本発明者らは、被検者におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子において、動脈硬化性疾患に対して有意に関連する多型変異を見出すことに成功した。従って、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子上の多型部位について変異の有無を指標とする(塩基種を決定する)ことにより、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査を行なうことが可能である。
本発明の好ましい態様においては、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子における多型変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査する方法である。
多型とは、遺伝学的には、人口中1%以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義されるが、本発明における「多型」は、この定義に制限されない。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型、一から数十塩基(時には数千塩基)が欠失あるいは挿入している多型等が挙げられる。さらに、多型部位の数も、1個に限定されず、複数個の多型であってもよい。
また本発明は、被検者について、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査する方法を提供する。
本発明の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査する方法における「多型部位」は、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子上、もしくはその周辺領域に存在する多型であれば、特に制限されない。AGTRL1上に見出される多型部位に関する情報を表1−1〜表1−6、PRKCH遺伝子上に見出される多型部位に関する情報を表2−1〜表2−6にそれぞれ示す。表中、「ストランド」の列における「+」はプラス鎖を、「−」はマイナス鎖を表す。また、「多型の種類」の列における「snp」は一塩基多型変異を、「in-del」は挿入・欠失変異を表す。
即ち、本発明の好ましい態様においては、上記の表に記載された多型部位について塩基種を決定することを特徴とする方法である。
本発明の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法に利用可能な多型部位としては、上記の多型部位の中でも、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子もしくは該遺伝子の周辺領域上の部位であることが好ましい。例えば、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における1位、296位、824位、932位、1042位、1072位、1666位、1840位、3096位、3181位、3225位、3381位、3416位、3778位、3911位、4243位、4257位、4665位、5057位、5179位、5417位、5448位、5530位、6002位、6401位、6563位、6878位、6897位、6961位、7496位、8690位、9040位、9159位、9440位、10350位、10499位、10535位、11235位、11290位、12541位、13104位、13735位、13793位、13855位、14025位、14955位、15071位、16909位、18281位、19106位、19474位、19654位、21090位、21545位、21776位、21890位、22337位、22374位、22992位、23248位、23297位、23643位、23694位、23845位、23926位、24060位、25119位、25448位、25463位、25738位、25794位、25893位、25959位、26569位、26826位、27070位、27131位、27892位、28039位、28121位、28634位、29116位、29129位、29190位、29305位、29389位、29727位、29854位、30221位、30289位、30290位、31284位、31581位、32022位、32477位、32611位、32707位、32776位、33051位、33395位、33521位、33656位、33781位、34650位、34876位、35091位、35274位、35365位、36267位、36325位、36596位、36619位、36681位、36682位、36689位、37100位、37110位、37112位、37119位、37123位、38159位、38577位、39052位、39268位、39353位、39370位、39474位、39553位、39593位、39689位、39947位、41023位、41786位、42019位、42291位、42509位、43029位、43050位、43406位、43663位、43988位、44040位、44043位、44158位、44355位、44368位、45099位、45245位、45624位、45978位、46786位、47018位、47040位、47086位、47533位、47544位、47856位、48601位、49486位、49612位、49717位、49764位、49955位、50184位、50690位、51270位、51277位、51345位、51927位、52104位、52105位、52111位、52199位、52565位、52805位、53178位、53204位、53294位、53344位、53374位、53803位、53950位、53951位、54173位、54176位、54503位、54675位、54759位、54878位、54999位、55126位、55741位、55844位、56311位、56685位、57034位、57481位、57532位、57958位、58146位、58306位、58349位、58819位、58857位、58897位、58905位、58922位、59043位、59241位、59591位、59839位、59902位、59985位、60094位、60414位、60607位、60787位、61115位、62272位、63956位、64000位、64276位、64346位、64347位、64822位、65200位、65728位、66097位、67396位、67439位、67621位、67686位、67735位、68077位、68365位、68404位、68569位、68708位、69107位、69600位、70230位、70323位、70848位、71415位、71661位、71905位、72191位、72470位、73045位、73202位、73320位、73587位、73796位、73828位、73880位、73896位、74007位、74013位、74072位、74117位、74146位、74176位、74203位、74482位、74690位、74836位、74894位、75641位、75692位、75814位、75855位、76163位、76390位、76580位、76805位、77111位、77112位、77277位、77312位、77831位、78162位、78588位、78820位、79154位、79207位、79365位、79434位、80159位、80450位、80452位、80885位、80988位、83257位、83725位、83991位、84278位、84739位、84837位、85040位、85626位、86221位、86546位、86668位、86693位、86853位、87029位、87233位、87347位、87395位、88324位、89226位、89277位、89449位、89939位、91547位、92560位、93492位、93934位、94294位、94335位、94472位、95090位、95492位、95874位、95941位、95991位、96195位、97257位、97738位、97753位、97792位、97812位、98004位、98851位、98887位、99073位、99807位、99951位、100013位、100179位、101328位、101571位、102318位、102423位、102662位、または102938位の多型部位が好ましい。
本発明の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法に利用可能な多型部位としては、上記の多型部位の中でも、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子もしくは該遺伝子の周辺領域上の部位であることが好ましい。例えば、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における1位、296位、824位、932位、1042位、1072位、1666位、1840位、3096位、3181位、3225位、3381位、3416位、3778位、3911位、4243位、4257位、4665位、5057位、5179位、5417位、5448位、5530位、6002位、6401位、6563位、6878位、6897位、6961位、7496位、8690位、9040位、9159位、9440位、10350位、10499位、10535位、11235位、11290位、12541位、13104位、13735位、13793位、13855位、14025位、14955位、15071位、16909位、18281位、19106位、19474位、19654位、21090位、21545位、21776位、21890位、22337位、22374位、22992位、23248位、23297位、23643位、23694位、23845位、23926位、24060位、25119位、25448位、25463位、25738位、25794位、25893位、25959位、26569位、26826位、27070位、27131位、27892位、28039位、28121位、28634位、29116位、29129位、29190位、29305位、29389位、29727位、29854位、30221位、30289位、30290位、31284位、31581位、32022位、32477位、32611位、32707位、32776位、33051位、33395位、33521位、33656位、33781位、34650位、34876位、35091位、35274位、35365位、36267位、36325位、36596位、36619位、36681位、36682位、36689位、37100位、37110位、37112位、37119位、37123位、38159位、38577位、39052位、39268位、39353位、39370位、39474位、39553位、39593位、39689位、39947位、41023位、41786位、42019位、42291位、42509位、43029位、43050位、43406位、43663位、43988位、44040位、44043位、44158位、44355位、44368位、45099位、45245位、45624位、45978位、46786位、47018位、47040位、47086位、47533位、47544位、47856位、48601位、49486位、49612位、49717位、49764位、49955位、50184位、50690位、51270位、51277位、51345位、51927位、52104位、52105位、52111位、52199位、52565位、52805位、53178位、53204位、53294位、53344位、53374位、53803位、53950位、53951位、54173位、54176位、54503位、54675位、54759位、54878位、54999位、55126位、55741位、55844位、56311位、56685位、57034位、57481位、57532位、57958位、58146位、58306位、58349位、58819位、58857位、58897位、58905位、58922位、59043位、59241位、59591位、59839位、59902位、59985位、60094位、60414位、60607位、60787位、61115位、62272位、63956位、64000位、64276位、64346位、64347位、64822位、65200位、65728位、66097位、67396位、67439位、67621位、67686位、67735位、68077位、68365位、68404位、68569位、68708位、69107位、69600位、70230位、70323位、70848位、71415位、71661位、71905位、72191位、72470位、73045位、73202位、73320位、73587位、73796位、73828位、73880位、73896位、74007位、74013位、74072位、74117位、74146位、74176位、74203位、74482位、74690位、74836位、74894位、75641位、75692位、75814位、75855位、76163位、76390位、76580位、76805位、77111位、77112位、77277位、77312位、77831位、78162位、78588位、78820位、79154位、79207位、79365位、79434位、80159位、80450位、80452位、80885位、80988位、83257位、83725位、83991位、84278位、84739位、84837位、85040位、85626位、86221位、86546位、86668位、86693位、86853位、87029位、87233位、87347位、87395位、88324位、89226位、89277位、89449位、89939位、91547位、92560位、93492位、93934位、94294位、94335位、94472位、95090位、95492位、95874位、95941位、95991位、96195位、97257位、97738位、97753位、97792位、97812位、98004位、98851位、98887位、99073位、99807位、99951位、100013位、100179位、101328位、101571位、102318位、102423位、102662位、または102938位の多型部位が好ましい。
また、PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列における1位、670位、1055位、1087位、1494位、1569位、1636位、1673位、1967位、1976位、2000位、2135位、2432位、2531位、2707位、4528位、5037位、5356位、5691位、6055位、6420位、7157位、7421位、7671位、7997位、8045位、8197位、8421位、9171位、9174位、9193位、9561位、9990位、10026位、10028位、10046位、10048位、10056位、10064位、10081位、10091位、10275位、10498位、11304位、11566位、11727位、12205位、12208位、12565位、12756位、12848位、12939位、13045位、13186位、13810位、14069位、14712位、15222位、15681位、16212位、16283位、16556位、17323位、17660位、17662位、17680位、18386位、18453位、18769位、19092位、19612位、20731位、21172位、21232位、21524位、21869位、22215位、22308位、22447位、22637位、23306位、23341位、23523位、23562位、24341位、24407位、24573位、24901位、25146位、25484位、26387位、26538位、26577位、27368位、27379位、28687位、30299位、30379位、30635位、30981位、31231位、31400位、31814位、31848位、31849位、31850位、31866位、31878位、32151位、32408位、33352位、33463位、34226位、34373位、34446位、34826位、34932位、35303位、35431位、35443位、35552位、35706位、35940位、36119位、36475位、36491位、36572位、36631位、36635位、36771位、37157位、37691位、37707位、38017位、38079位、38109位、39236位、39322位、39370位、39445位、39469位、39471位、39851位、39965位、40516位、41394位、41744位、41765位、42501位、42815位、42948位、43148位、43179位、43210位、43536位、44467位、44584位、44761位、45165位、45767位、45908位、45959位、46156位、46169位、46382位、46433位、47238位、48148位、48524位、48529位、48707位、48766位、48821位、49248位、49367位、49430位、49721位、50038位、50612位、50627位、51150位、51226位、51404位、51462位、51545位、51547位、51773位、51850位、51989位、または52030位の多型部位が好ましい。(なお、本明細書においては、該多型部位を単に『本発明の多型部位』と記載する場合がある)。
なお、当業者においては掲載されたdbSNPデータベースのrs番号をもとに、当該部位についての塩基種の情報を適宜取得することができる。また、SNP IDの記載内容は、先頭にrsが付くものはdbSNPデータベースの登録IDのうちNCBIにより一配列に一意に定まるIDを付与されたものである。また、dbSNPデータベースはウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html)に公開されており、SNP IDに記載された登録ID番号を用いてウェブサイト上で検索することにより、塩基配列におけるSNPsの詳細な情報(例えば、染色体上の位置、多型部位の塩基の種類、前後の配列等)が入手できる。これらの情報を用いた場合、当業者においては、本発明に記載する検査を容易に行うことができる。
当業者においては、通常、本明細書において開示された多型に付与された登録ID番号、例えばdbSNPデータベースにおけるrs番号によって、本発明の多型部位の実際のゲノム上の位置および前後の配列等を容易に知ることができる。これによって、知ることができない場合であっても、当業者においては、配列番号:1で示される塩基配列および多型部位等に関する情報から、適宜、該多型部位に相当する実際のゲノム上の位置を知ることは容易である。例えば、公開されているゲノムデータベース等と照会することにより、本発明の多型部位のゲノム上の位置を知ることができる。即ち、配列表に記載の塩基配列とゲノム上の実際の塩基配列との間に若干の塩基配列の相違がみられた場合であっても、配列表に記載の塩基配列を基にゲノム配列と相同性検索等を行うことにより、本発明の多型部位について、実際のゲノム上の位置を正確に知ることが可能である。また、ゲノム上の位置が特定できない場合でも、本明細書に記載の配列表および多型部位の情報から本発明に記載する検査を行うことは容易である。
また、ゲノムDNAは、通常、互いに相補的な二本鎖DNA構造を有している。従って、本明細書においては、便宜的に一方の鎖におけるDNA配列を示した場合であっても、当然の如く、当該配列(塩基)に相補的な配列も開示したものと解釈される。当業者にとって、一方のDNA配列(塩基)が判れば、該配列(塩基)に相補的な配列(塩基)は自明である。なお、現在ヒトゲノム配列については、ほぼ最終版といわれているヒトゲノム国際プロジェクトbuild35が発表されており、本明細書に記した配列等はヒトゲノム国際プロジェクトbuild35の結果に基づいている。
本発明の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法においては、以下に記載の多型部位について検査を行なうことが好ましい。
また本発明のさらに好ましい態様においては、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法においては、以下の(1a)の多型部位と(24a)の多型部位との間の領域に含まれる多型部位、好ましくは、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における(1a)1位、(2a)12541位、(3a)21545位、(4a)33051位、(5a)35365位、(6a)39268位、(7a)39353位、(8a)39370位、(9a)39474位、(10a)39553位、(11a)39665位、(12a)41786位、(13a)42019位、(14a)42509位、(15a)43029位、(16a)43406位、(17a)43663位、(18a)46786位、(19a)49764位、(20a)64276位、(21a)74482位、(22a)78162位、(23a)93492位、または(24a)102938位の多型部位について検査を行う。
本発明の好ましい態様においては、上記(1a)〜(24a)に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の(1b)〜(24b)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される。被検者の動脈硬化性疾患の罹患の有無に関係無く、動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の判定を行うことができる。
(1b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の1位における相補鎖の塩基種がT
(2b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の12541位における相補鎖の塩基種がT
(3b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の21545位における相補鎖の塩基種がA
(4b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の33051位における相補鎖の塩基種がC
(5b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の35365位における相補鎖の塩基種がT
(6b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位における相補鎖の塩基種がA
(7b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39353位における相補鎖の塩基種がG
(8b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39370位における相補鎖の塩基種がC
(9b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39474位における相補鎖の塩基種がT
(10b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39553位における相補鎖の塩基種がT
(11b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39665位が欠失
(12b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の41786位における相補鎖の塩基種がA
(13b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42019位における相補鎖の塩基種がG
(14b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42509位における相補鎖の塩基種がG
(15b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43029位における相補鎖の塩基種がG
(16b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43406位における相補鎖の塩基種がC
(17b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43663位における相補鎖の塩基種がT
(18b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の46786位における相補鎖の塩基種がC
(19b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の49764位における相補鎖の塩基種がT
(20b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の64276位における相補鎖の塩基種がT
(21b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の74482位における相補鎖の塩基種がC
(22b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の78162位における相補鎖の塩基種がG
(23b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の93492位における相補鎖の塩基種がG
(24b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の102938位における相補鎖の塩基種がC
(1b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の1位における相補鎖の塩基種がT
(2b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の12541位における相補鎖の塩基種がT
(3b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の21545位における相補鎖の塩基種がA
(4b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の33051位における相補鎖の塩基種がC
(5b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の35365位における相補鎖の塩基種がT
(6b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位における相補鎖の塩基種がA
(7b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39353位における相補鎖の塩基種がG
(8b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39370位における相補鎖の塩基種がC
(9b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39474位における相補鎖の塩基種がT
(10b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39553位における相補鎖の塩基種がT
(11b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39665位が欠失
(12b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の41786位における相補鎖の塩基種がA
(13b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42019位における相補鎖の塩基種がG
(14b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42509位における相補鎖の塩基種がG
(15b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43029位における相補鎖の塩基種がG
(16b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43406位における相補鎖の塩基種がC
(17b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43663位における相補鎖の塩基種がT
(18b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の46786位における相補鎖の塩基種がC
(19b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の49764位における相補鎖の塩基種がT
(20b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の64276位における相補鎖の塩基種がT
(21b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の74482位における相補鎖の塩基種がC
(22b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の78162位における相補鎖の塩基種がG
(23b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の93492位における相補鎖の塩基種がG
(24b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の102938位における相補鎖の塩基種がC
なお、上記の塩基種は、本発明の遺伝子の塩基配列の+鎖もしくは−鎖のいずれかの鎖における塩基種を表す。当業者であれば、本明細書に開示された情報を基に、当該多型部位において検出すべき塩基の種類を適宜判断することができる。
また別の態様においては、また本発明のさらに好ましい態様においては、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法においては、以下の(1a)の多型部位と(12a)の多型部位との間の領域に含まれる多型部位、好ましくはPRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列における(1a)1位、(2a)16212位、(3a)30981位、(4a)32408位、(5a)33463位、(6a)34446位、(7a)39322位、(8a)39469位、(9a)39471位、(10a)49248位、(11a)49367位、または(12a)52030位の多型部位について検査を行う。
本発明の好ましい態様においては、上記(1a)〜(12a)に記載の多型部位における塩基種が、以下の(1b)〜(12b)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される。被検者の動脈硬化性疾患の罹患の有無に関係無く、動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の判定を行うことができる。
(1b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の1位の塩基種がA
(2b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の16212位の塩基種がG
(3b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の30981位の塩基種がA
(4b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の32408位の塩基種がG
(5b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の33463位の塩基種がG
(6b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の34446位の塩基種がT
(7b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39322位の塩基種がT
(8b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39469位の塩基種がA
(9b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39471位の塩基種がC
(10b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49248位の塩基種がC
(11b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49367位の塩基種がG
(12b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の52030位の塩基種がA
(1b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の1位の塩基種がA
(2b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の16212位の塩基種がG
(3b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の30981位の塩基種がA
(4b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の32408位の塩基種がG
(5b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の33463位の塩基種がG
(6b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の34446位の塩基種がT
(7b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39322位の塩基種がT
(8b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39469位の塩基種がA
(9b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39471位の塩基種がC
(10b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49248位の塩基種がC
(11b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49367位の塩基種がG
(12b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の52030位の塩基種がA
本発明の方法において、上述の多型変異は一方のゲノムについて(ヘテロで)検出されればよいが、特に制限されないが、双方のゲノムにおいて(ホモで)検出されることが好ましい。
例えば、PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列における39469位の遺伝子型がAA(ホモ)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと好適に判定される。
本発明においては、上記多型部位以外であっても、該多型部位とその周辺のDNA領域は強く連鎖しているものと考えられることから、この強く連鎖しているDNAブロック上に存在する多型変異を検出することにより、本発明の検査方法を実施することも可能である。
例えば、AGTRL1遺伝子については、多型部位の塩基種が上記(1b)〜(24b)の塩基種であるような、動脈硬化性疾患の患者を含むヒトの小集団について、この「近傍の多型部位」(例えば、上記表1−1〜表1−6に記載の多型部位)における塩基種を予め決定する。
次いで、この「近傍の多型部位」について被検者における塩基種を決定し、予め決定された前記塩基種と比較することにより、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査を行うことができる。予め決定された塩基種と同一の塩基種である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される。本発明の検査方法により、被検者の動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを判定することができ、治療方針の決定や薬剤投与量の決定等に利用することができる。
例えば、AGTRL1遺伝子上の配列番号:1に記載の塩基配列における39268位の多型部位の塩基種がAである動脈硬化性疾患を罹患している人を含むヒトの小集団について、近傍の多型部位、例えば296位の多型部位の塩基種を決定する。この部位の塩基種が上記の動脈硬化性疾患を罹患している人においてTである頻度が、上記動脈硬化性疾患を発症していない人に比べ高かった場合、被検者について1位の多型部位の塩基種を調べ、この部位の塩基種が同様にTであった場合には、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される。
以上のように、本発明により、動脈硬化性疾患に関連する遺伝子上の領域が明らかになったことにより、当業者に過度の負担を強いることなく、上記動脈硬化性疾患のリスク素因の有無について検査を行うことができる。
また、ヒトゲノムの解析が進み全塩基配列やSNP、マイクロサテライト、VNTR、RFLPsなどの多型情報も充実してきた。ゲノムの塩基配列について詳細が明らかになりつつある現在、最大の関心事は遺伝子あるいは特定の配列と機能(疾患・疾患の進行性などの表現型)との関連を解析することである。これを解決するための有力な手法の一つがハプロタイプを用いた遺伝統計学的解析である。
ヒトの染色体は2本1組で存在し、それぞれ父親と母親から由来している。ハプロタイプとは、その一方に関する個体の遺伝子型の組み合わせをいい、それぞれ父母由来の1本の染色体上に遺伝子座がどのように並んでいるかを示すものである。染色体を父母から1本ずつ受け継ぐので、配偶子形成の際に組み換えが起きないとすれば1本の染色体上にのっている遺伝子は必ず一緒に子に伝えられる、すなわち連鎖する事になる。しかし、実際は減数分裂の際に組み換えが起きるため、1本の染色体上にのっている遺伝子であっても必ずしも連鎖しているわけではない。しかし逆に、遺伝的組み換えが起きた場合であっても同一染色体上の距離が近い遺伝子座は強く連鎖する。
このような現象を集団において観察し、アリルの非独立が認められる事を連鎖不平衡という。例えば、3つの遺伝子座を観察した場合、これらの間に連鎖不平衡がないとすると、存在するハプロタイプは23通りと予測され、それぞれの頻度は各遺伝子座の頻度から予測される値となるが、連鎖不平衡がある場合には23通りより少ないハプロタイプしか存在せず、その頻度も予測と異なる値を示す結果となる。
近年、ハプロタイプが連鎖不平衡解析に有用である事が示されており(Genetic Epidemiology 23:221-233)研究が行われているが、ゲノム上には組換えが起きやすい部位と起きにくい部位があり、1つの領域として先祖から子孫へと伝えられる部分(ハプロタイプによって特定される領域)は人種を越えて共通性がある事が明らかになっている(Science 226, 5576:2225-2229)。即ち、強く連鎖するDNA領域が存在し、この領域は一般的にDNAブロックと呼ばれる。本発明においては、本発明の多型部位を含むDNAブロックの存在の有無を検出することによっても、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査を行うことができる。
即ち本発明の好ましい態様においては、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックの存在が検出された場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定されることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査する方法を提供する。
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
本発明において、DNAブロックとは、各遺伝子座間で強い連鎖不平衡を示す部位(領域)を指す。動脈硬化性疾患と関連するDNAブロックが見出されれば、該DNAブロックを検出することにより、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査が可能となる。
動脈硬化性疾患と関連するハプロタイプ(を示すDNAブロック)が見出されれば、該ハプロタイプを検出することにより、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査が可能となる。本発明者らは、鋭意研究により、動脈硬化性疾患に対する感受性と関連するハプロタイプを見出すことに成功した。
従って、本発明はAGTRL1遺伝子上に存在する、動脈硬化性疾患と関連するハプロタイプ(を示すDNAブロック)を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法を提供する。
本方法においては、被検者について「動脈硬化性疾患と関連するハプロタイプ」を検出することで、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを判定することができる。これらの判定は例えば治療方針の決定等に利用することができる。
上記「動脈硬化性疾患と関連するハプロタイプ(を示すDNAブロック)」とは、具体的には以下のようなハプロタイプ(を示すDNAブロック)を挙げることができる。
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
本発明の上記方法の好ましい態様においては、被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロック内に存在し互いに連鎖することを特徴とする多型部位の塩基種を決定する工程を含む検査方法である。
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
即ち、本明細書において具体的に記載された部位以外の多型部位であっても、上記DNAブロック上に含まれる多型であって、本発明の多型部位と互いに連鎖している多型部位であれば、本発明の検査方法に利用することが可能である。
上記方法の好ましい態様においては、以下の工程(a)および(b)を含む、被検者が動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法である。
(a) 被検者におけるAGTRL1遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程、
(b)(a)で決定された塩基種が、以下の(A)に記載のハプロタイプを示すAGTRL1遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する工程
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
(a) 被検者におけるAGTRL1遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程、
(b)(a)で決定された塩基種が、以下の(A)に記載のハプロタイプを示すAGTRL1遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する工程
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ
なお、上記工程(a)における多型部位としては、例えば、上記表1−1〜1−6に記載の各多型部位を挙げることができるが、好ましくは、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における1位、12541位、21545位、33051位、35365位、39268位、39353位、39370位、39474位、39553位、39665位、41786位、42019位、42509位、43029位、43406位、43663位、46786位、49764位、64276位、74482位、78162位、93492位、または102938位のいずれかの多型部位を示すことができる。
本発明の多型部位における塩基種の決定は、当業者においては種々の方法によって行うことができる。一例を示せば、本発明の多型部位を含むDNAの塩基配列を直接決定することによって行うことができる。
本発明の検査方法に供する被検試料は、通常、予め被検者から取得された生体試料であることが好ましい。生体試料としては、例えばDNA試料を挙げることができる。本発明においてDNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、手術により採取あるいは切除した組織または細胞、検査等の目的で採取された体液等から抽出した染色体DNA、あるいはRNAを基に調製することができる。
即ち本発明は、通常、被検者由来の生体試料(予め被検者から取得された生体試料)を被検試料として検査に供する方法である。
当業者においては、公知の技術を用いて、適宜、生体試料の調製を行うことができる。例えば、DNA試料は、本発明の多型部位を含むDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって調製することができる。
本方法においては、次いで、単離したDNAの塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配列の決定は、当業者においては、DNAシークエンサー等を用いて容易に実施することができる。
本発明の多型部位は、通常、その部位の塩基種のバリエーションが既に明らかになっている。本発明における「塩基種の決定」とは、必ずしもその多型部位についてA、G、T、Cのいずれかの塩基種であるかを判別することを意味するものではない。例えば、ある多型部位について塩基種のバリエーションがAまたはGであることが判明している場合には、その部位の塩基種が「Aでない」もしくは「Gでない」ことが判明すれば充分である。
予め塩基のバリエーションが明らかにされている多型部位について、その塩基種を決定するための様々な方法が公知である。本発明の塩基種の決定のための方法は、特に限定されない。例えば、PCR法を応用した解析方法として、TaqMan PCR法、AcycloPrime法、およびMALDI-TOF/MS法等が実用化されている。またPCRに依存しない塩基種の決定法としてInvader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明における多型部位の塩基種の決定に応用できる。
[TaqMan PCR法]
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アリルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアリルを含む領域にハイブリダイズするように設計される。
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アリルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアリルを含む領域にハイブリダイズするように設計される。
TaqManプローブのTmに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、1塩基の相違によってTaqManプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。TaqManプローブの存在下でPCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたTaqManプローブに到達する。このときDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって、TaqManプローブはその5'末端から分解される。TaqManプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、TaqManプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、TaqManプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。1塩基の相違のためにTaqManプローブのハイブリダイズが低下すればTaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。
多型に対応するTaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時に塩基種の判定を行うこともできる。例えば、レポーター色素として、あるアリルのアリルAのTaqManプローブに6-carboxy-fluorescein(FAM)を、アリルBのプローブにVICを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアリルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、FAMまたはVICのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アリルAまたはアリルBのホモであることが判明する。他方、アリルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてPCRと塩基種の決定を同時に行うことができる。そのため、TaqMan PCR法は、多くの被検者についての塩基種を決定できる方法として有用である。
[AcycloPrime法]
PCR法を利用した塩基種を決定する方法として、AcycloPrime法も実用化されている。AcycloPrime法では、ゲノム増幅用のプライマー1組と、多型検出用の1つのプライマーを用いる。まず、ゲノムの多型部位を含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっている多型部位に隣接する領域にアニールするようにデザインされている。
PCR法を利用した塩基種を決定する方法として、AcycloPrime法も実用化されている。AcycloPrime法では、ゲノム増幅用のプライマー1組と、多型検出用の1つのプライマーを用いる。まず、ゲノムの多型部位を含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっている多型部位に隣接する領域にアニールするようにデザインされている。
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体(ターミネータ)を用いる。その結果、多型部位に相当する位置の塩基に相補的な塩基が1塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光(Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる2種類のラベルを用いれば、特定のSNPsが2種類の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、1度の解析でアリルがホモかヘテロかを判定することもできる。
[MALDI-TOF/MS法]
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによって塩基種の決定を行うこともできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、タンパク質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによる塩基種の決定のためには、まず解析対象であるアリルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アリルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによって塩基種の決定を行うこともできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、タンパク質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによる塩基種の決定のためには、まず解析対象であるアリルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アリルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。
MALDI-TOF/MSを利用した塩基種の決定には、PCR産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確な塩基種の決定が期待できる。また複数の場所の多型の同時検出にも応用することができる。
[IIs型制限酵素を利用したSNPs特異的な標識方法]
PCR法を利用した更に高速な塩基種の決定が可能な方法も報告されている。例えば、IIs型制限酵素を利用して多型部位の塩基種の決定が行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素(II型)は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。従って、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうど多型部位で増幅産物を切断することができる。
PCR法を利用した更に高速な塩基種の決定が可能な方法も報告されている。例えば、IIs型制限酵素を利用して多型部位の塩基種の決定が行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素(II型)は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。従って、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうど多型部位で増幅産物を切断することができる。
IIs型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、SNPsの塩基を含む付着末端(cohesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、多型変異に対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物は多型部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。
前記IIs型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー(capture primer)を組み合せてPCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。例えばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、塩基種を決定することができる。
[磁気蛍光ビーズを使った多型部位における塩基種の決定]
複数のアリルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアリルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化多型タイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。
複数のアリルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアリルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化多型タイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。
磁気蛍光ビーズを利用した多重化多型タイピングにおいては、各アリルの多型部位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各アリルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両者は組み合せられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハイブリダイズしたときに、当該アリル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴDNAを調製する。
アリルを含む領域を非対称PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プローブと蛍光標識オリゴDNAをハイブリダイズさせ、更に両者をライゲーションする。磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、多型部位の塩基に相補的な塩基配列であった場合には効率的にライゲーションされる。逆にもしも多型のために末端の塩基が異なれば、両者のライゲーション効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズには、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的な塩基種であった場合に限り、蛍光標識オリゴDNAが結合する。
磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリゴDNAの存在を検出することにより、塩基種が決定される。磁気蛍光ビーズは、フローサイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類の多型部位について、単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。
[Invader法]
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。例えば、Invader法では、アリルプローブ、インベーダープローブ、およびFRETプローブの3種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、塩基種の決定を実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。例えば、Invader法では、アリルプローブ、インベーダープローブ、およびFRETプローブの3種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、塩基種の決定を実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。
アリルプローブは、検出すべきアリルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アリルプローブの5'側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アリルプローブは多型部位の3'側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。
一方インベーダープローブは、多型部位の5'側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって3'末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアリルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。
多型部位がアリルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアリルプローブの両者がアリルにハイブリダイズすると、アリルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入(invasion)した構造が形成される。cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアリルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアリルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアリルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってcleavaseによるフラップの切断が起こらない。
FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。FRETプローブは5'末端側に自己相補配列を有し、3'末端側に1本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。FRETプローブの3'末端側に配置された1本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがFRETプローブにハイブリダイズすると、FRETプローブの自己相補配列の5'末端部分にフラップの3'末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。cleavaseは侵入構造を認識して切断する。FRETプローブのcleavaseによって切断される部分を挟んで、TaqMan PCRと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、FRETプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもFRETプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアリルプローブの状態で存在しているフラップとでは、FRETに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、FRETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。
Invader法に基づいて塩基種を決定するためには、アリルAとアリルBのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、2種類のアリルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのFRETプローブも2種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、TacMan PCR法と同様の考え方によって、塩基種を決定することができる。
Invader法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがFRETプローブのみであることである。FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。従って、大量生産が可能である。一方アリルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、結局、ジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。
[RCA法]
PCR法に依存しない塩基種の決定方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の1本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第2のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。
PCR法に依存しない塩基種の決定方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の1本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第2のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。
RCA法には、鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって2本鎖となった部分は、より5'側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。例えば、環状DNAを鋳型とする相補鎖合成反応は、1周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い1本鎖DNAが生成される。一方、環状DNAを鋳型として生成した長い1本鎖DNAには、第2のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。RCA法において生成される1本鎖DNAは、環状のDNAを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。従って、長い1本鎖の連続的な生成は、第2のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる1本鎖部分が連続的に生成される。こうして、DNAの増幅が達成される。
RCA法に必要な環状1本鎖DNAが多型部位の塩基種に応じて生成されれば、RCA法を利用して塩基種の決定をすることができる。そのために、直鎖状で1本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、5'末端と3'末端に検出すべき多型部位の両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。多型部位がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アリルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をDNAリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、RCA法の反応がトリガーされる。DNAリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。従って、ライゲーションの有無をRCA法で確認することによって、多型部位の塩基種の決定が可能である。
RCA法は、DNAを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アリル毎に反応を行わなければ、通常、塩基種を決定することができない。これらの点を塩基種の決定のために改良した方法が公知である。例えば、モレキュラービーコンを利用して、RCA法に基づいて1チューブで塩基種の決定を行うことができる。モレキュラービーコンは、TaqMan法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの5'末端と3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはRCA法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アリル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる2種類のモレキュラービーコンを組み合わせれば、1チューブで塩基種の決定が可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、通常、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らない塩基種決定法も古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、1本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。PCR-SSCP法は、PCR産物を1本鎖DNAに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、1本鎖DNAの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル(denaturant gradient gel electrophoresis: DGGE法)等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に1本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
具体的には、まずPCR法等によって多型部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブDNAをハイブリダイズさせて2本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブDNAとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたDNA断片では、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。
更にDNAアレイを使って塩基種を決定することもできる(細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一)。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA(あるいはRNA)をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、例えば、多数の多型部位について同時に解析するには、DNAアレイは有用である。
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。
本発明において、ヌクレオチドの固定(アレイ)方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インビトロ(in vitro)で合成される。例えば、photolithographicの技術(Affymetrix社)、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
オリゴヌクレオチドは、検出すべきSNPsを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。更に、一般にDNAアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション(非特異的ハイブリダイゼーション)による誤差を避けるために、ミスマッチ(MM)プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ(PM)プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。
DNAアレイ法によるジェノタイピングのための試料は、被検者から採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検者の血液、末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出した染色体DNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべき多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体DNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数の多型部位を解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。
一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。例えば、まず多型部位を含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。
上記方法をより具体的に示せば、被検者から調製した本発明の多型部位を含むDNA、およびヌクレオチドプローブが固定された固相、を取得した後、次いで、該DNAと該固相を接触させる。さらに、固相に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、本発明の多型部位の塩基種を決定する。
本発明において「固相」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な材料を意味する。本発明の固相は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、具体的には、マイクロプレートウェル、プラスチックビーズ、磁性粒子、基板などを含む固相等を例示することができる。本発明の「固相」としては、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。また、本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アリル特異的オリゴヌクレオチド(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダイゼーション法が利用できる。アリル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべき多型部位が存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によって多型部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。
本発明の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬(検査薬)として利用できる。これは遺伝子発現を指標とする検査、または遺伝子多型を指標とする検査に使用される。
該オリゴヌクレオチドは、本発明の多型部位を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下(例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第2版1989に記載の条件)において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出する遺伝子もしくは該遺伝子の近傍DNA領域における本発明の多型部位を含む塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1%SDS、50℃」、「2×SSC、0.1%SDS、42℃」、「1×SSC、0.1%SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1%SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」及び「0.2×SSC、0.1%SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1%SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1%SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1%SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1%SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1%SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明の多型部位を含むDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
本発明は、本発明の多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー、および多型部位を含むDNA領域にハイブリダイズするプローブを提供する。
本発明において、多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーには、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーも含まれる。該プライマーは、多型部位を含むDNAにおける、多型部位の3'側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。たとえば、DNAチップによる解析のためのプライマーであれば、多型部位を含む領域として、20〜500、通常50〜200塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。当業者においては、多型部位を含む周辺DNA領域についての塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。例えば、IIs型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、IIs型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。例えば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種のジェノタイピング方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。
一方本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。従って、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。
言いかえれば、ゲノムDNA上の本発明の多型部位、または多型部位に隣接する部位にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。例えば、Invader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおける本発明の多型部位の周辺DNA領域の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。
本発明のプライマーまたはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムDNAに相補的な塩基配列の長さは、通常15〜100、一般に15〜50、通常15〜30である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合には、適宜、放射性同位体または非放射性化合物などで標識して用いられる。また、プライマーとして使用する場合には、例えば、オリゴヌクレオチドの3'末端側の領域を標的とする配列に対して相補的にし、5'末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。このような少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のmRNAに対してハイブリダイズすることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然以外の塩基、例えば、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、2’-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、β-D-ガラクトシルキュェオシン、2’-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β-D-マンノシルキュェオシン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-D-リボフラノシル-2-メチルリオプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチルカルバモイル)トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、2’-O-メチル-5-メチルウリジン、2’-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン等を必要に応じて含んでいてもよい。
本発明はまた、動脈硬化性疾患のリスク素因の有無の検査方法に使用するための試薬(検査薬)を提供する。本発明の試薬は、前記本発明のプライマーおよび/またはプローブを含む。動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査においては、本発明の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーおよび/またはプローブを用いる。
本発明の試薬には、塩基種の決定方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを組み合せることができる。酵素としては、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、あるいはIIs制限酵素などの、上記の塩基種決定方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、例えば、相補鎖合成用の基質等が用いられる。
更に本発明の試薬には、多型部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照は、予め多型部位の塩基種が明らかなゲノム、あるいはゲノムの断片を用いることができる。ゲノムは、細胞から抽出されたものでもよいし、細胞あるいは細胞の分画を用いることもできる。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムDNAの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、多型部位を含む塩基配列からなるDNAを対照として用いることもできる。具体的には、本発明の多型部位における塩基種が明らかにされたゲノム由来のDNAを含むYACベクターやBACベクターは、対照として有用である。あるいは多型部位に相当する数百ベースのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。
さらに、本発明における試薬の別の態様は、本発明の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬である。
これらは本発明の多型部位を指標とする検査に使用される。これらの調製方法に関しては、上述の通りである。
また、本発明の好ましい態様においては、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程を含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法に関する。
従って、該検査方法においてAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物の検出の際にプローブとして利用可能な、例えば、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、本発明の検査用試薬の一例である。
また、該検査方法においてAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の翻訳産物の検出の際に利用可能な、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質を認識する抗体(抗AGTRL1タンパク質抗体、もしくは抗PRKCHタンパク質抗体)もまた、本発明の検査用試薬の好ましい具体例である。
本発明者らによって、AGTRL1遺伝子の発現亢進が、動脈硬化性疾患と関連することが明らかとなった。またPRKCHタンパク質の自己リン酸化が脳梗塞等の動脈硬化性疾患と関連することが示された。従って、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能(活性)を抑制する物質は、動脈硬化性疾患の治療薬もしくは予防薬となるものと考えられる。
本発明は、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の発現、または、該遺伝子によってコードされるタンパク質(AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質)の機能(活性)を抑制する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患治療薬を提供する。
本発明の好ましい態様においては、まず、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現の発現抑制物質を有効成分として含む、動脈硬化性疾患治療薬(動脈硬化性疾患治療もしくは予防のための薬剤・医薬組成物)を提供する。
本発明においてAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現抑制物質には、例えば、AGTRL1もしくはPRKCHの転写もしくは該転写産物からの翻訳を抑制する物質が含まれる。本発明の上記発現抑制物質の好ましい態様として、例えば、以下の(a)〜(c)からなる群より選択される化合物(核酸)を挙げることができる。
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
(c)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現をRNAi効果により抑制する作用を有する核酸
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
(c)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現をRNAi効果により抑制する作用を有する核酸
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また、所謂PNA (peptide nucleic acid)等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た3次元構造を有する。
特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する(平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.)。
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで、所望の動物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物が持つ内在性AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子(AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子)の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は、必ずしもこの長さに限定されない。
本発明のアンチセンスは、特に制限されないが、例えば、配列番号:1または2に記載の塩基配列を基に作成することができる。
また、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現の抑制は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.)。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている(Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.)。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる(Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.)。
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.)。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている(Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.)。このように、リボザイムを用いて本発明におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉(RNA interferance;RNAi)によっても行うことができる。本発明のRNAi効果による抑制作用を有する核酸は、一般的にsiRNAとも言われる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる二本鎖RNAを細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組み換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目を集めている。RNAiに用いるRNAは、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
本発明の上記(c)の核酸の好ましい態様として、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子に対してRNAi(RNA interference;RNA干渉)効果を有する二本鎖RNA(siRNA)を挙げることができる。より具体的には、配列番号:1に記載の塩基配列の部分配列に対するセンスRNAおよびアンチセンスRNAからなる二本鎖RNA(siRNA)を挙げることができる。
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素(RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種)が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。
例えば、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を動脈硬化性疾患治療薬として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子(siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
なお、上記RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る一本鎖RNA分子もまた本発明に含まれる。
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号:1もしくは2に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号:1もしくは2に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖(例えば、配列番号:1もしくは2に記載の塩基配列)が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖(相補鎖)の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA(ベクター)もまた、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA(ベクター)は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
また、本発明の発現抑制物質には、例えば、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現調節領域(例えば、プロモーター領域)と結合することにより、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を抑制する化合物が含まれる。該化合物は、例えば、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また、当業者においては、所望の化合物について、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現を抑制するか否かの判定を、公知の方法、例えば、レポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。
また、本発明者らは、AGTRL1遺伝子上に存在する多型変異「SNP4」、「SNP9」によって該AGTRL1遺伝子の発現が亢進することを示した。
これら多型変異は転写調節因子であるSp1と結合するDNA領域中に存在する。これらの多型変異によって、該DNA領域に対するSp1転写因子の結合活性が変化し、AGTRL1遺伝子の発現が亢進する。
従って、上記多型を含むAGTRL1遺伝子のDNA領域と、Sp1転写因子との結合活性を低下させる化合物は、AGTRL1遺伝子の転写を抑制するものと考えられ、本発明の上記発現抑制物質の好ましい態様の一つと言える。上記DNA領域としては、例えば、多型部位「SNP4」または「SNP9」を含むDNA領域を挙げることができる。
また、本発明の多型変異を有するDNA配列であって、Sp1転写因子との結合活性が変化したDNA配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、後述の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法に、好適に用いることが可能であり有用である。例えば、以下の(a)または(b)のポリヌクレオチドは、動脈硬化性疾患の治療薬のスクリーニングのための用途に利用できる。
(a)配列番号:1に記載のDNA配列の部分断片ポリヌクレオチドであって、42509位、または39353位の多型部位を含むポリヌクレオチド
(b)上記(b)のポリヌクレオチド配列において1もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、Sp1転写因子との結合能が上昇していることを特徴とするポリヌクレオチド
(a)配列番号:1に記載のDNA配列の部分断片ポリヌクレオチドであって、42509位、または39353位の多型部位を含むポリヌクレオチド
(b)上記(b)のポリヌクレオチド配列において1もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、Sp1転写因子との結合能が上昇していることを特徴とするポリヌクレオチド
さらに、本発明の多型変異を有するDNAによってコードされるタンパク質であって、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性が亢進したタンパク質を含むポリペプチドは、例えば、後述の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法に好適に利用することができる。例えば、以下の(a)または(b)のポリペプチドは、動脈硬化性疾患の治療薬のスクリーニングのための用途に利用可能である。
(a)PRKCHタンパク質の全長もしくは断片ポリペプチドであって、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたポリペプチド
(b)上記(b)のポリペプチド配列において1もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリペプチドであって、自己リン酸化活性が上昇していることを特徴とするポリペプチド
(a)PRKCHタンパク質の全長もしくは断片ポリペプチドであって、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたポリペプチド
(b)上記(b)のポリペプチド配列において1もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換された塩基配列からなるポリペプチドであって、自己リン酸化活性が上昇していることを特徴とするポリペプチド
また本発明は、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能抑制物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患治療薬を提供する。
本発明におけるAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能抑制物質としては、例えば、以下の(a)または(b)の化合物を挙げることができる。
(a)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体
(b)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子化合物
(a)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体
(b)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子化合物
本発明者らによって、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性の亢進と動脈硬化性疾患との関連性が見出された。従って、本発明における上記機能抑制物質としては、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性の亢進を阻害する抗体もしくは低分子化合物を好適に例示することができる。
AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体(抗AGTRL1タンパク質抗体、もしくは抗PRKCHタンパク質抗体)は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナント(組み換え)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞(ハイブリドーマ)の中から、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質は、その由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて、適宜、取得することができる。
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基(N)末端断片やカルボキシ(C)末端断片あるいは中央部のキナーゼ活性部位等が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明における抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFv)(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, Vol. 113, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag (1994) pp. 269-315)、ヒト化抗体、多特異性抗体(LeDoussal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. 78: 118-32; Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537-9; Zimmermann (1986) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; VanDijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)、並びに、Fab、Fab’、F(ab')2、Fc、Fv等の抗体断片が含まれる。このような抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。また、β‐ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、GST、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質として製造して、二次抗体を用いずに検出できるようにすることも可能である。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の検出、回収を行い得るように改変することもできる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に対する抗体は、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質と結合することにより、該タンパク質の機能を抑制し、例えば、脳梗塞等の動脈硬化性疾患の治療や改善効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的(抗体治療)で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
さらに本発明は、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能を抑制し得る物質として、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子量物質(低分子化合物)も含有する。本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。
上記(b)のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子化合物には、例えば、AGTRL1もしくはPRKCHに対して親和性が高い化合物が含まれる。
さらに、本発明のAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能を抑制し得る物質として、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質変異体を挙げることができる。「AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。
また、既にAGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能を阻害することが知られている物質(化合物)は、本発明の上記「AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能を抑制し得る物質」の具体例として、好適に示すことができる。
また、本発明の機能抑制物質は、本発明のAGTRL1もしくはPRKCHの有する活性を指標とするスクリーニング方法により、適宜、取得することができる。
また、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性またはプロテインキナーゼ活性を阻害(抑制)する物質もまた、本発明の動脈硬化性疾患治療薬として有用である。従って本発明は、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性またはプロテインキナーゼ活性を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患治療薬を提供する。
また本発明は、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤(候補化合物)のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の一態様は、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを指標とする方法である。AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを低下させる化合物は、動脈硬化性疾患治療もしくは予防のための薬剤となることが期待される。
本発明の上記方法は、例えば、以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)該AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)該AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本方法においては、まずAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。用いられる「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、鳥など、ペット、家畜等に由来する細胞が挙げられるが、これら由来に制限されない。「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現している細胞、または外来性のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子が発現した細胞は、通常、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
本方法においては、次いで、該AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはRT-PCR法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合(対照)と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤となる。
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として同定する方法である。
本発明の上記方法は、例えば、以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞と、被検化合物を接触させる工程
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞と、被検化合物を接触させる工程
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本方法においては、まず、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクトアミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。
本方法における「接触」は、「AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下(抑制)させる化合物を選択する。低下(抑制)させる化合物は、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤となる。
また、本発明の上記スクリーニング方法におけるAGTRL1もしくはPRKCH遺伝子は、通常、野生型の遺伝子を用いることができるが、本発明者らによって見出された発現亢進に関与する多型変異(「SNP4」、「SNP9」)を含むAGTRL1遺伝子(変異型AGTRL1遺伝子)を好適に使用することも可能である。
この変異型AGTRL1遺伝子は、もともと遺伝子の発現が亢進していることから、該遺伝子の発現を抑制する(低下させる)物質のスクリーニングに好適である。また、実際の脳梗塞患者において見出された変異型AGTRL1遺伝子について、その亢進された遺伝子発現を抑制する(低下させる)物質は、格好の脳梗塞等の動脈硬化性疾患の予防もしくは治療薬となることが期待される。
本発明のスクリーニング方法の他の態様は、AGTRL1遺伝子上のSp1転写因子との結合DNA領域と、Sp1転写因子との相互作用活性(結合活性)を指標とする方法である。
本発明の上記方法は、例えば、以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
(a)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における42509位または39353位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド、およびSp1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
(b)前記ポリヌクレオチドとSp1転写因子との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
(a)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における42509位または39353位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド、およびSp1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
(b)前記ポリヌクレオチドとSp1転写因子との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程
本方法においては、まず、AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における42509位または39353位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド、およびSp1転写因子と、被検化合物を接触させる。
次いで該ポリヌクレオチドとSp1転写因子の相互作用活性(結合活性)を測定する。この相互作用活性は、当業者においては公知の種々の方法を利用して、評価することが可能である。
一例を示せば、シフトアッセイにより相互作用活性を評価することができる。具体的には、後述の実施例9に記載の方法によって適宜実施することができる。
さらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、相互作用活性を低下(抑制)させる化合物を選択する。低下(抑制)させる化合物は動脈硬化性疾患治療のための薬剤となる。
本発明のスクリーニング方法のさらに他の態様は、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を指標とする方法である。該活性を低下させる化合物は、動脈硬化性疾患に対する治療効果が期待される。
本発明の上記方法は、例えば、以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法である。
(a)PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b)PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
(a)PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b)PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
本方法においては、まず、PRKCHタンパク質と、被検化合物を接触させる。この「接触」は、例えば、PRKCHタンパク質を発現させた細胞と被検化合物を接触させることにより実施することも可能である。
次いでPRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を測定する。上記方法において使用するPRKCHタンパク質は、好ましくは、自己リン酸化活性が亢進した変異タンパク質であることが好ましい。該変異タンパク質としては、例えば、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体を好適に示すことができる。また、変異を含まない野生型タンパク質を利用することも可能である。さらに、PRKCHタンパク質においてリン酸化を受ける部位を含む部分ポリペプチド、もしくは該部位を含む変異ポリペプチドであってもよい。
なおPRKCHタンパク質における自己リン酸化されるアミノ酸部位としては、例えば、T510(510番目のスレオニン)、T650(650番目のスレオニン)、S672(672番目のセリン)を挙げることができる。このうち1箇所(T510位)がPKD1でリン酸化され、残りの2箇所(T650位、S672位)が自己リン酸化されることが知られている(B.D.Gomperts et al., 上代淑人監訳、「シグナル伝達」、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、p206)。本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、上記のアミノ酸部位の自己リン酸化状態を指標とする方法である。
リン酸化活性の測定は当業者に公知の手法によって行うことができるが、例えば、リン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロット法等により測定することができる。より具体的には、リン酸化活性の測定は、後述の実施例に記載の方法によって適宜実施することができる。
上記方法においてはさらに、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記リン酸化活性を低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性もしくはプロテインキナーゼ活性を抑制する結果、動脈硬化性疾患に対する治療もしくは予防効果を発揮するものと期待される。
また、上記の各種スクリーニング方法において使用される化合物もまた、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬として有用である。
本発明の上記試薬の具体例としては、以下の(a)〜(d)のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬を挙げることができる。
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質を認識する抗体
(c)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド
(d)PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するPRKCHタンパク質変異体
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質を認識する抗体
(c)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド
(d)PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するPRKCHタンパク質変異体
さらに本発明は、本発明の検査方法またはスクリーニング方法を実施するために用いられる各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。
本発明のキットは、例えば、本発明の上述の各種試薬の中から、実施する検査方法あるいはスクリーニング方法に合わせて適宜選択することができる。例えば、本発明のキットは、本発明の遺伝子、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体等を構成要素とすることができる。より具体的には、(1)本発明のプライマーオリゴヌクレオチド、およびPCR用反応試薬(Taq ポリメラーゼ、緩衝液等)、または(2)本発明のプローブオリゴヌクレオチド、およびハイブリダイゼーション用緩衝液、(3)本発明の抗AGTRL1タンパク質抗体もしくは抗PRKCHタンパク質抗体、およびELISA用試薬、等を例示することができる。
さらに、本発明のキットには、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
さらに、本発明のキットには、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
また本発明は、本発明の薬剤を被検者へ投与する工程を含む、動脈硬化性疾患を治療もしくは予防する方法に関する。本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
<PRKCH遺伝子に関する各種実験の材料および手法等>
被験集団
ゲノムワイド・ケースコントール研究に関しては、九州大学の7つの関連病院からの脳梗塞の症例を登録した。症例はすべて、脳卒中に熟練した内科医により、臨床情報および脳画像検査を用いて診断・分類された。脳梗塞のサブタイプは、米国国立神経疾患・脳卒中研究所によって提唱された脳血管疾患分類III(Whisnant JP, et al., Stroke; 21: 637-676 (1990).)、ならびに急性脳卒中治療におけるOrg 10172の治験(TOAST)試験(Adams, HP Jr.et al., Stroke 24, 35-41 (1993).)および脳塞栓症タスクフォース(No authors listed Arch.Neurol. 43, 71-84 (1986).)の診断基準に基づいて判定した。
被験集団
ゲノムワイド・ケースコントール研究に関しては、九州大学の7つの関連病院からの脳梗塞の症例を登録した。症例はすべて、脳卒中に熟練した内科医により、臨床情報および脳画像検査を用いて診断・分類された。脳梗塞のサブタイプは、米国国立神経疾患・脳卒中研究所によって提唱された脳血管疾患分類III(Whisnant JP, et al., Stroke; 21: 637-676 (1990).)、ならびに急性脳卒中治療におけるOrg 10172の治験(TOAST)試験(Adams, HP Jr.et al., Stroke 24, 35-41 (1993).)および脳塞栓症タスクフォース(No authors listed Arch.Neurol. 43, 71-84 (1986).)の診断基準に基づいて判定した。
対照被験者は久山町研究の参加者から組み入れた。久山町研究は、1961年に設定された地域集団を用いた心血管疾患に関する進行中の前向き疫学研究である。この研究の詳細は以前に記載されている(Kubo, M. et al., Stroke 34, 2349-2354 (2003).、Kiyohara, Stroke. 34, 2343-2348 (2003).)。2002年から2003年までの間に、本研究のためのスクリーニング調査を行った。手短に述べると、40歳以上の参加者計3,328例(参加率78%)が健康状態の検査に参加することに同意し、包括的評価を受けた。脳卒中または冠動脈疾患の既往のある被験者を除外した後に、本発明者らは年齢(5歳以内)および性別を一致させた対照被験者を、乱数を用いて1:1に対応するように選択した。
脳梗塞の発生に関するrs2230500のリスクを検討するために、本発明者らは、1988年に設定された久山町研究のコホート集団を用いた(Kubo, M. et al., Stroke 34, 2349-2354 (2003).)。手短に述べると、1988年に40歳以上の久山町住民2,742人が健康状態の検査に参加した(参加率80.0%)。脳卒中または冠動脈疾患の既往のある被験者を除外した後に、2,637人の参加者を心血管疾患または死亡の発生に関して連続的に追跡した。このコホート対象のうち、2002年には1,683人の対象が検査に参加した。
本発明者らは、すべての試験対象から、九州大学大学院医学研究院、東京大学医科学研究所および各参加病院の倫理審査委員会によって承認された通りに署名によるインフォームド・コンセントを得た。
SNPジェノタイピング
ゲノムDNAは末梢血白血球から標準的なプロトコールによって抽出した。SNPのジェノタイピングは、PCRを用いる複合的インベーダーアッセイ(Third Wave Technologies, Madison, Wis.)をOhnishiらの記載の通り(Ohnishi Y, et al., J. Hum. Genet. 46,471-477 (2001).)に用いるか、またはABI3700キャピラリー式シークエンサー(Applied Biosystems)を標準的なプロトコールに従って用いるPCR産物の直接シークエンシングによって行った。
ゲノムDNAは末梢血白血球から標準的なプロトコールによって抽出した。SNPのジェノタイピングは、PCRを用いる複合的インベーダーアッセイ(Third Wave Technologies, Madison, Wis.)をOhnishiらの記載の通り(Ohnishi Y, et al., J. Hum. Genet. 46,471-477 (2001).)に用いるか、またはABI3700キャピラリー式シークエンサー(Applied Biosystems)を標準的なプロトコールに従って用いるPCR産物の直接シークエンシングによって行った。
細胞培養、トランスフェクションおよび免疫沈降
293T細胞は、10%ウシ胎仔血清および1 %抗生物質を加えたDMEM中において37℃、5%CO2下で維持した。完全長PKCη-374Vを発現するプラスミドは、ヒト胸腺cDNAをp3xFLAG-CMV-14発現ベクター(Sigma)中にクローニングすることによって構築した。完全長PKCη-374Iを発現するプラスミドは、p3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Vベクターから、QuikChange XL Site-Directed Mutagenesisキット(Stratagene)を製造元の指示に従って用いて構築した。一過性トランスフェクションのためには、293T細胞を15 cm培養皿にプレーティングしてほぼ集密化させた上で、FuGENE6(Roche)を製造元の指示に従って用いてp3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Vおよびp3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Iをトランスフェクトした。48時間後に細胞を収集し、1% Nonidet P-40、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、1 mMジチオトレイトール、0.1%プロテアーゼ阻害薬混合物セットIII(Calbiochem)を含むライシスバッファー中にて4℃で溶解させた。氷上で30分間インキュベートした後に、溶解液を15,000 rpm、4℃で15分間遠心した。上清を、rec-タンパク質G-Sepharose 4B結合物(Zymed)およびマウス正常IgGによる30分間の前処理後に、抗Flag M2アフィニティーゲル(Sigma)とともに4℃で3〜4時間インキュベートした。インキュベーション後に、ゲルをライシスバッファーで2回、1×TBSバッファーで1回洗浄し、3×Flagペプチド(Sigma)15μgを添加することによってFlag標識タンパク質を溶出させた。免疫沈降物の純度および量はクーマシーブリリアントブルー染色によって評価した。タンパク質濃度はBradford法によって測定した。
293T細胞は、10%ウシ胎仔血清および1 %抗生物質を加えたDMEM中において37℃、5%CO2下で維持した。完全長PKCη-374Vを発現するプラスミドは、ヒト胸腺cDNAをp3xFLAG-CMV-14発現ベクター(Sigma)中にクローニングすることによって構築した。完全長PKCη-374Iを発現するプラスミドは、p3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Vベクターから、QuikChange XL Site-Directed Mutagenesisキット(Stratagene)を製造元の指示に従って用いて構築した。一過性トランスフェクションのためには、293T細胞を15 cm培養皿にプレーティングしてほぼ集密化させた上で、FuGENE6(Roche)を製造元の指示に従って用いてp3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Vおよびp3xFLAG-CMV-14-PKCη-374Iをトランスフェクトした。48時間後に細胞を収集し、1% Nonidet P-40、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、1 mMジチオトレイトール、0.1%プロテアーゼ阻害薬混合物セットIII(Calbiochem)を含むライシスバッファー中にて4℃で溶解させた。氷上で30分間インキュベートした後に、溶解液を15,000 rpm、4℃で15分間遠心した。上清を、rec-タンパク質G-Sepharose 4B結合物(Zymed)およびマウス正常IgGによる30分間の前処理後に、抗Flag M2アフィニティーゲル(Sigma)とともに4℃で3〜4時間インキュベートした。インキュベーション後に、ゲルをライシスバッファーで2回、1×TBSバッファーで1回洗浄し、3×Flagペプチド(Sigma)15μgを添加することによってFlag標識タンパク質を溶出させた。免疫沈降物の純度および量はクーマシーブリリアントブルー染色によって評価した。タンパク質濃度はBradford法によって測定した。
PKC活性および自己リン酸化アッセイ
PKC自己リン酸化活性およびキナーゼ活性は、Ikutaらが記載した方法に従って測定した(Ikuta, T. et al., Cell Growth Diff. 5, 943-947 (1994).)。PKC自己リン酸化アッセイに関しては、モック、PKCη-374VおよびPKCη-374Iの免疫沈降物を、20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM MgSO4、1 mM EGTAおよび5μCiの[γ-32P]ATPを10μMホスファチジルセリン(PS、Sigma)および100 nMホルボール-12,13-ジブチレート(PDBu、Sigma)とともに含む合計容積50μlの反応混合物中において指定の期間にわたり30℃でインキュベートした上で、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーに供した。プロテインキナーゼ活性は、[γ-32P]ATPからのミエリン塩基性タンパク質(MBP)ペプチド(Sigma)への32P取り込みによって測定した。インキュベーション混合物には、合計容積50μl中に、20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM MgSO4、1 mM EGTA、100μM ATP、1μCiの[γ-32P]ATP、10μg MBPペプチドおよびPKCη免疫沈降物を、10μM PSおよび100 nM PDBuとともに含めた。30℃での3分間のインキュベーションを行った後に、P81 phosphocellulose square(Upstate)に直接適用することによって反応を停止させ、その後に75 mMリン酸で洗浄した上で放射能をカウントした。活性1単位は、ATPからMBPへの放射性リン酸1 nmol/分の取り込みと定義した。
PKC自己リン酸化活性およびキナーゼ活性は、Ikutaらが記載した方法に従って測定した(Ikuta, T. et al., Cell Growth Diff. 5, 943-947 (1994).)。PKC自己リン酸化アッセイに関しては、モック、PKCη-374VおよびPKCη-374Iの免疫沈降物を、20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM MgSO4、1 mM EGTAおよび5μCiの[γ-32P]ATPを10μMホスファチジルセリン(PS、Sigma)および100 nMホルボール-12,13-ジブチレート(PDBu、Sigma)とともに含む合計容積50μlの反応混合物中において指定の期間にわたり30℃でインキュベートした上で、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーに供した。プロテインキナーゼ活性は、[γ-32P]ATPからのミエリン塩基性タンパク質(MBP)ペプチド(Sigma)への32P取り込みによって測定した。インキュベーション混合物には、合計容積50μl中に、20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM MgSO4、1 mM EGTA、100μM ATP、1μCiの[γ-32P]ATP、10μg MBPペプチドおよびPKCη免疫沈降物を、10μM PSおよび100 nM PDBuとともに含めた。30℃での3分間のインキュベーションを行った後に、P81 phosphocellulose square(Upstate)に直接適用することによって反応を停止させ、その後に75 mMリン酸で洗浄した上で放射能をカウントした。活性1単位は、ATPからMBPへの放射性リン酸1 nmol/分の取り込みと定義した。
リアルタイムPCRを用いたPRKCH発現の定量
本発明者らは、ABI 7700(Applied Biosystems)をSYBR Premix ExTag(TaKaRa)とともに製造元の指示に従って用いて、リアルタイム定量的PCRを行った。種々の組織由来のヒト全RNA(Clonetech)を購入し、オリゴd(T)12-18プライマーおよびSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen)を用いて1μgの全RNAにより単鎖cDNAを合成した。PRKCH mRNAの相対的発現は、製造元により記載されている標準曲線法を用いることにより、同じcDNA中のベータアクチンの量に対して標準化した。
本発明者らは、ABI 7700(Applied Biosystems)をSYBR Premix ExTag(TaKaRa)とともに製造元の指示に従って用いて、リアルタイム定量的PCRを行った。種々の組織由来のヒト全RNA(Clonetech)を購入し、オリゴd(T)12-18プライマーおよびSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen)を用いて1μgの全RNAにより単鎖cDNAを合成した。PRKCH mRNAの相対的発現は、製造元により記載されている標準曲線法を用いることにより、同じcDNA中のベータアクチンの量に対して標準化した。
冠動脈の免疫組織化学検査および形態計測解析
久山町の住民であった年齢68〜91(81.1±6.2)歳の日本人患者16例から、死亡16時間以内に九州大学での剖検時に心臓を入手した(男性8例および女性8例)。冠動脈にカニューレを挿入し、0.1 mol/L リン酸緩衝食塩水、pH 7.4で洗浄した上で、4%(wt/vol)パラホルムアルデヒド(0.1 mol/L リン酸ナトリウム、pH 7.4中)1 Lを100 mmHgで灌流した。続いて、心臓を4%パラホルムアルデヒド中に4℃で少なくとも24時間浸漬した。右冠動脈および左前下行枝冠動脈を心臓の表面から切除し、長軸に対して直交方向に3 mm間隔で切断した上でパラフィン中に包埋した。60個のブロックを入手し、3μm厚連続切片を直ちに作成した。各ブロックからの切片に対して、ヘマトキシリン・エオジン染色、エラスチカ・ワンギーソン染色およびマッソントリクローム染色、ならびに免疫組織化学検査を連続的に行った。AHAのCommittee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosisによって提唱された定義(Stary, HC. et al., Circulation. 92, 1355-74 (1995).)に従い、各切片のアテローム硬化病変のタイプを慎重に分類した。
久山町の住民であった年齢68〜91(81.1±6.2)歳の日本人患者16例から、死亡16時間以内に九州大学での剖検時に心臓を入手した(男性8例および女性8例)。冠動脈にカニューレを挿入し、0.1 mol/L リン酸緩衝食塩水、pH 7.4で洗浄した上で、4%(wt/vol)パラホルムアルデヒド(0.1 mol/L リン酸ナトリウム、pH 7.4中)1 Lを100 mmHgで灌流した。続いて、心臓を4%パラホルムアルデヒド中に4℃で少なくとも24時間浸漬した。右冠動脈および左前下行枝冠動脈を心臓の表面から切除し、長軸に対して直交方向に3 mm間隔で切断した上でパラフィン中に包埋した。60個のブロックを入手し、3μm厚連続切片を直ちに作成した。各ブロックからの切片に対して、ヘマトキシリン・エオジン染色、エラスチカ・ワンギーソン染色およびマッソントリクローム染色、ならびに免疫組織化学検査を連続的に行った。AHAのCommittee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosisによって提唱された定義(Stary, HC. et al., Circulation. 92, 1355-74 (1995).)に従い、各切片のアテローム硬化病変のタイプを慎重に分類した。
免疫組織化学検査はNakanoらが記載した通りに行った(Nakano, T. et al., Hum Pathol. 36, 330-40 (2005).)。手短に述べると、脱パラフィン処理した切片を3%脱脂乳とともにインキュベートした上で、ヒトPKCη(Santa Cruz)、内皮細胞(抗ヒトCD31、Dako)、単球/マクロファージ(抗ヒトCD68、Dako)および平滑筋細胞(抗ヒトα-SMA、Sigma)に対する一次抗体に続いて、ペルオキシダーゼ標識した二次抗体(Dako)とインキュベートした。このスライドを3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸(DAB)とともにインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。各アイソタイプの非免疫ウサギIgGまたは非免疫マウスIgGも、それぞれの一次抗体の代わりに各陰性対照として用いた。ヒト乳腺から採取した組織ブロックをPKC-ηに関する陽性対照として用いた(Masso-Welch, PA. et al., Breast Can. Res. Treat. 68, 211-223 (2001))。PKCη陽性病変の定量はアテローム硬化病変のタイプを知らされていない単一の観察者が行い、アテローム硬化内膜における陽性領域を判定することによって分析した。すべての画像の取り込みおよび解析は米国国立衛生研究所(National Institute of Health)の画像ソフトウエアによって行った。
統計分析
別記する場合を除き、データは平均±sdとして提示した。関連性およびHardy-Weinberg平衡に関する評価は、カイ二乗検定およびFisherの直接法によって行った。連鎖不平衡指数、Δ指数の算出および図1dの描写はTokuhiroらが記載した通りに行った(Tokuhiro, S. et al., Nat. Genet. 35, 341-348 (2003).)。多重検定の調整のために、本発明者らはSAS9.12ソフトウエア中のMULTTEST法を用いて、ランダム並べ替え検定を10,000回繰り返し行った。rs2230500遺伝子型による脳梗塞の14年間の発生率の差に関しては、年齢および性別に関する調整後にCox比例ハザードモデルを用いて評価した。臨床的危険因子の調整のためには、SASソフトウエアにより、ケースコントロール研究に関してはロジスティック回帰モデルを用い、前向きコホート研究に関してはCox比例ハザード回帰モデルを用いた。動脈アテローム硬化のグレード間でのPKCη陽性面積の比較に関しては、Bonferroni補正を伴うSpearmanの順位相関法によって解析した。
別記する場合を除き、データは平均±sdとして提示した。関連性およびHardy-Weinberg平衡に関する評価は、カイ二乗検定およびFisherの直接法によって行った。連鎖不平衡指数、Δ指数の算出および図1dの描写はTokuhiroらが記載した通りに行った(Tokuhiro, S. et al., Nat. Genet. 35, 341-348 (2003).)。多重検定の調整のために、本発明者らはSAS9.12ソフトウエア中のMULTTEST法を用いて、ランダム並べ替え検定を10,000回繰り返し行った。rs2230500遺伝子型による脳梗塞の14年間の発生率の差に関しては、年齢および性別に関する調整後にCox比例ハザードモデルを用いて評価した。臨床的危険因子の調整のためには、SASソフトウエアにより、ケースコントロール研究に関してはロジスティック回帰モデルを用い、前向きコホート研究に関してはCox比例ハザード回帰モデルを用いた。動脈アテローム硬化のグレード間でのPKCη陽性面積の比較に関しては、Bonferroni補正を伴うSpearmanの順位相関法によって解析した。
〔実施例1〕 遺伝子ベースのSNPマーカーを用いた大規模ケースコントロール研究
脳梗塞に対する感受性と関連性のある遺伝子を同定するために、本発明者らは、脳梗塞患者1,112例、ならびに年齢および性別が一致する対照被験者1,112例を用いて、大規模なゲノムワイドケースコントロール研究を実施した。本ケースコントロール研究の被験集団の臨床的特徴を表3に示す。
脳梗塞に対する感受性と関連性のある遺伝子を同定するために、本発明者らは、脳梗塞患者1,112例、ならびに年齢および性別が一致する対照被験者1,112例を用いて、大規模なゲノムワイドケースコントロール研究を実施した。本ケースコントロール研究の被験集団の臨床的特徴を表3に示す。
本発明者らはまず、JSNPデータベース(Tsunoda, T. et al., Hum. Mol. Genet. 13, 1623-1632 (2004).)から選択した遺伝子ベースの52,608箇所のtag-SNPを用いて、脳梗塞を有する日本人症例188例、ならびに年齢および性別が一致する対照例188例のジェノタイピングを行った。これらのうち、ジェノタイピングに成功した48,083箇所のSNP(全体的な成功率は91.4%)のアレル頻度を比較し、症例と対照との間でp<0.01であった1,098箇所のSNPを同定した。
本発明者らは次に、2回目のスクリーニングで、これらのSNPに関して残りの症例および対照のジェノタイピングを行った。被験者を脳梗塞サブタイプ毎に層別化したところ、ラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群と高度の相関性があるSNPがいくつか同定された。これらのうち、染色体14q22-23上にあるPRKCHのイントロン6中のSNP_15(IMS-JST140193、rs3783799)は、ラクナ梗塞(アレル頻度に関してp=4.73×10-6)およびラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群(優性モデルにおいてp=7.91×10-6、表5)と高度の相関性があった。2回目のスクリーニングでジェノタイピングを行ったすべてのSNPを用いた並べ替え検定の後にも、SNP_15は依然としてラクナ梗塞(p=0.0036)およびラクナ・アテローム血栓複合型梗塞(p=0.0063)と関連性があった。このことから、本発明者らは、ラクナ梗塞およびアテローム血栓性梗塞に対する感受性座位がSNP_15周辺に存在する可能性があると考えた。
以下の表4は、ジェノタイピングを行ったPRKCH遺伝子中のSNPの位置(NCBIビルド35)を示す。
上記表5中、アレル1はリスクアレルとしている。P値は、スクリーニングで検討したすべてのSNPに関して、104回の並べ替え検定により調整した。c.i.は信頼区間を指す。
次に本発明者らは、45箇所のSNPを用いてPRKCHの高精度マッピングを行い、SNP_15のLDの範囲を、ラクナ梗塞およびアテローム血栓性梗塞の症例、ならびに年齢および性別が一致する対照を用いて評価した。これらのSNPのジェノタイピングを行い、マイナーアレル頻度が0.2を上回る27種のSNPに関してD'およびΔ指数を算出した(図1d)。PRKCH中に2つのLDブロックが同定され、SNP_15はブロック1内部に位置づけられた(図1d)。本発明者らはまた、症例と対照との間のアレル頻度も比較し、その関連性がPRKCHのブロック1で最大であり、5'領域および3'領域では徐々に低下することを見いだした。これらの結果から、本発明者らは、PRKCHがラクナ性およびアテローム血栓性の脳梗塞に対する感受性遺伝子であると結論づけた。
続いて本発明者らは、症例48例および対照48例から、5'および3'非翻訳領域を含む、PRKCH中の全エクソンのシークエンシングを行った結果、4つのSNPが同定された:rs3742633(695A>G、エクソン2中)、rs2230500(1425G>A、エクソン9中)、rs17098388(1427A>C、エクソン9中)、rs1088680(1979C>T、エクソン12中)。これらのうち、rs3742633およびrs1088680はブロック1の外側に位置し、関連性を示さなかった。rs2230500およびrs17098388は互いに1塩基の隔たりがあり、ブロック1に位置していた。さらに、rs2230500はバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸置換を引き起こしたが(V374I、図2a)、一方、rs17098388は同義SNPであった。シークエンシングの結果、これらの2つのSNPは完全に連鎖していた。
続いて本発明者らは、ラクナ性およびアテローム血栓性梗塞の全症例、ならびに年齢および性別が一致する対照において、直接シークエンシングにより、rs2230500のジェノタイピングを行った。Ileへのアミノ酸変化を引き起こすrs2230500のAアレルは症例において高頻度に観察され、これはラクナ梗塞(p=9.84×10-6、オッズ比(OR)1.66、95 %信頼区間(c.i.)1.33〜2.09、アレル頻度モデルの場合、表7)およびラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群(p=4.92×10-5、OR 1.42、95 %c.i. 1.20〜1.68)のいずれとも高度の関連性があった。PRKCHにおけるジェノタイピングを行った45箇所のSNP間での並べ替え検定を適用したところ、ラクナ梗塞に関してはp=0.0004、ラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群に関してはp=0.0014が得られた。これらの結果はいずれも統計学的に有意であった。
症例と対照との間の差の交絡的影響を明らかにするために、本発明者らはロジスティック回帰モデルを用いて臨床的危険因子を調整した。脳梗塞に対する遺伝子型リスクは、年齢、性別、高血圧、高脂血症および糖尿病に関する調整後も実質的に変化しなかった(表8)。このため、本発明者らは、PRKCHにおけるV374Iというアミノ酸置換がPKCηのシグナル伝達に影響を及ぼして脳梗塞の発生をもたらす可能性があるという仮説を立てた。
以下の表6は、ラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群のサブグループに関する、PRKCH遺伝子中の45種のSNPのケースコントロール相関解析の結果を示す。
上記表6において、P値は、PRKCH遺伝子検討したすべてのSNPに関して、104回の並べ替え検定により調整した。MAFはマイナーアレル頻度を示す。
さらに以下の表7は、rs2230500(1425G>A、V374I)のケースコントロール研究の結果を示す。
上記表7において、P値は、PRKCH遺伝子中の検討したすべてのSNPに関して、104回の並べ替え検定により調整した。c.i.は信頼区間を指す。
以下の表8は、ラクナ梗塞群とアテローム血栓性梗塞群とを合計した群のサブグループにおけるrs2230500(1425G>A、V374I)の多変量ロジスティック解析の結果を示す。
上記表8において、多変量解析は年齢、性別、高血圧(あり/なし)、高脂血症(あり/なし)および糖尿病(あり/なし)に関して調整した。
本発明者らは、STRUCTUREおよびgenomic controlを用いて、症例と対照との間の集団階層化に関して調べたが、いずれの解析からも本発明者らの被験者における有意な集団階層化は示されなかった。
〔実施例2〕 PKCη活性に対するV374Iの影響
PKCηにおけるV374Iというアミノ酸置換は、PKCファミリーにおいて保存されているATP結合部位の内部に存在する(図2b、図3)(Osada, S. et al., Cell Growth Diff. 4, 167-175 (1993).)。そこで本発明者らは、PKCηキナーゼ活性に対するV374Iの影響について調べた。本発明者らはFlag-PKCη-374VおよびFlag-PKCη-374Iの発現ベクターを構築し、それらを293T細胞に対してトランスフェクトした。一過性トランスフェクション後に、両方のタンパク質を免疫沈降させ、抗Flag M2アガロースゲルを用いることによって精製した。免疫沈降物の質および濃度はクーマシーブリリアントブルー染色およびウェスタンブロット法によって評価した(図2c、d)。PKCηは自己リン酸化により活性化されることが報告されているため(Nishizuka, Y. Science. 258, 607-614 (1992).)、本発明者らは各タンパク質のキナーゼ活性を自己リン酸化アッセイによって調べた。10 nMホスファチジルセリン(PS)および100 nMホルボール12,13-ジブチレート(PDBu)による刺激後に、PKCηの自己リン酸化が少なくとも1分間にわたって観察され、自己リン酸化の程度はPKCη-374Iの方がPKCη-374Vよりも高かった(図2d)。これらの結果を確かめるために、ミエリン塩基性タンパク質を基質として用いることによってPKC活性を検討したところ、PKCη-374Iにおける活性は、PKCη-374Vの1.6倍であった(p=0.009、図2e)。これらの結果は、PKCηにおける374Vから374Iへのアミノ酸変化が、刺激後のより高度の自己リン酸化およびキナーゼ活性を誘導し、下流シグナル伝達経路の活性化をもたらす可能性を示唆する。
PKCηにおけるV374Iというアミノ酸置換は、PKCファミリーにおいて保存されているATP結合部位の内部に存在する(図2b、図3)(Osada, S. et al., Cell Growth Diff. 4, 167-175 (1993).)。そこで本発明者らは、PKCηキナーゼ活性に対するV374Iの影響について調べた。本発明者らはFlag-PKCη-374VおよびFlag-PKCη-374Iの発現ベクターを構築し、それらを293T細胞に対してトランスフェクトした。一過性トランスフェクション後に、両方のタンパク質を免疫沈降させ、抗Flag M2アガロースゲルを用いることによって精製した。免疫沈降物の質および濃度はクーマシーブリリアントブルー染色およびウェスタンブロット法によって評価した(図2c、d)。PKCηは自己リン酸化により活性化されることが報告されているため(Nishizuka, Y. Science. 258, 607-614 (1992).)、本発明者らは各タンパク質のキナーゼ活性を自己リン酸化アッセイによって調べた。10 nMホスファチジルセリン(PS)および100 nMホルボール12,13-ジブチレート(PDBu)による刺激後に、PKCηの自己リン酸化が少なくとも1分間にわたって観察され、自己リン酸化の程度はPKCη-374Iの方がPKCη-374Vよりも高かった(図2d)。これらの結果を確かめるために、ミエリン塩基性タンパク質を基質として用いることによってPKC活性を検討したところ、PKCη-374Iにおける活性は、PKCη-374Vの1.6倍であった(p=0.009、図2e)。これらの結果は、PKCηにおける374Vから374Iへのアミノ酸変化が、刺激後のより高度の自己リン酸化およびキナーゼ活性を誘導し、下流シグナル伝達経路の活性化をもたらす可能性を示唆する。
〔実施例3〕 アテローム硬化におけるPKCηの発現
PKCηはマウスでは、皮膚、消化管および気道を含む上皮組織で主に発現する(Osada, S. et al., J Biol. Chem. 265, 22434-22440 (1990).)。ヒトにおけるPKCηの発現パターンは未確定であり、マウスにおけるこの分布パターンからはPKCηと脳梗塞との間の関係を説明することができない。
PKCηはマウスでは、皮膚、消化管および気道を含む上皮組織で主に発現する(Osada, S. et al., J Biol. Chem. 265, 22434-22440 (1990).)。ヒトにおけるPKCηの発現パターンは未確定であり、マウスにおけるこの分布パターンからはPKCηと脳梗塞との間の関係を説明することができない。
ヒト組織におけるPKCηの発現パターンを検討するために、本発明者らは種々の組織においてヒトcDNAを用いる定量的リアルタイムPCRを行った。PKCηは種々のヒト組織で普遍的に発現しており、胸腺および脾臓における発現が幾分高度であった(図4)。この結果および脳梗塞との関連性から、本発明者らはアテローム硬化病変におけるPKCηの発現を調べた。剖検時に入手した冠動脈標本の免疫組織染色により、PKCηは動脈内膜内の内皮細胞および一部の泡沫マクロファージ、ならびに動脈内膜および中膜内の紡錘状平滑筋細胞において発現していることが示された(図5−1のb−e)。外膜では、PKCηは一部の血管内皮細胞によって定常的に発現していた(非提示データ)。この発現は、免疫原性ペプチドまたは正常ウサギIgGを用いて前吸収を行った標本ではみられなかった。
PKCηとアテローム硬化との関係についてさらに検討するために、剖検時に入手した60件の冠動脈標本を、アテローム硬化病変のタイプ(AHA分類(Stary, HC. et al., Circulation. 92, 1355-74 (1995).))別に慎重に分類した。PKCη陽性細胞をNIH像によって定量したところ、PKCηの発現は冠動脈アテローム硬化の重症度と合致しており、進行した病変でより高頻度に観察された(p<0.0001、図5−2のf)。これらの結果は、PKCηが、ヒトにおけるアテローム硬化の発生および進行に密接に関係していることを示唆する。
〔実施例4〕 集団ベースの前向きコホートを用いたV374Iのバリデーション試験
ケースコントロール研究には、被験者、特に対照例の選択バイアスが原因となって偽陽性の結果が誘発される恐れがある。このため、1件の相関解析で同定された候補SNPを異なる集団でも検証すべきである。しかし、本発明者らの相関解析におけるマーカーSNPとしたSNP_15(IMS-JST140193)のマイナーアレル頻度は、日本人群では0.239、中国人群では0.229、アフリカ人群では0.022、欧州人群では0.00であった。これらのデータは、PRKCH中の候補SNPはアジア系集団に特異的であり、白人では再現性を得ることが難しいことを示唆する。
ケースコントロール研究には、被験者、特に対照例の選択バイアスが原因となって偽陽性の結果が誘発される恐れがある。このため、1件の相関解析で同定された候補SNPを異なる集団でも検証すべきである。しかし、本発明者らの相関解析におけるマーカーSNPとしたSNP_15(IMS-JST140193)のマイナーアレル頻度は、日本人群では0.239、中国人群では0.229、アフリカ人群では0.022、欧州人群では0.00であった。これらのデータは、PRKCH中の候補SNPはアジア系集団に特異的であり、白人では再現性を得ることが難しいことを示唆する。
この問題を克服するために、本発明者らは、1988年に構築した集団ベースの前向きコホートにおいてrs2230500の関連性を検証した。14年間の追跡調査の間に、ベースライン検査時には脳卒中の病歴がなかった被験者1642例のうち67例の被験者に初めて脳梗塞が生じた。脳梗塞の発生率をrs2230500遺伝子型別に比較した結果、本発明者らは、GGからGA、AA遺伝子型の順(これはアミノ酸置換VV、VIからIIに対応する)に発生率が直線的に増加することを見いだした(図6)。年齢および性別で調整した脳梗塞の発生率に関する相対リスクは、GG遺伝子型と比較して、GA遺伝子型の場合は1.31(95 %c.i.、0.78〜2.19)であり、AA遺伝子型の場合は2.83(95 %c.i.、1.11〜7.22)であった(表9)。AA遺伝子型の被験者における脳梗塞の発生に対するリスクは、GA遺伝子型またはGG遺伝子型の被験者におけるものよりも有意に高かった(p=0.043、相対リスク2.58、95 %c.i.、1.03〜6.44)。この関係は、年齢、性別、高血圧、糖尿病、血清コレステロール、喫煙および飲酒の習慣を含む、ベースラインの臨床的危険因子の調整後も実質的に変化しなかった。同じコホート内の被験者1661例を用いた冠動脈疾患の発生に対するrs2230500のリスクも同様の結果を示した(図7)。これらの結果は、PRKCH中のrs2230500が脳梗塞および心筋梗塞の発生にかかわる遺伝的危険因子であることを示している。この所見は他の前向き研究でも再現される必要があるが、本発明者らは将来、rs2230500によって脳梗塞のリスクが予測される可能性があると考えている。
以下の表9は、14年間追跡した日本人一般集団1,638人における、rs2230500遺伝子型別にみた、脳梗塞の発生に関する、年齢および性別を調整し、多変量解析に関して調整した相対リスクを示す。
上記表9中、HRはハザード比、ciは信頼区間を指す。多変量解析に関する調整は年齢、性別、高血圧、糖尿病、コレステロール、喫煙および飲酒に関して行った。
<AGTRL1遺伝子に関する各種実験の材料および手法等>
被験集団
1961年以来、本発明者らは、福岡市(日本)に隣接した近郊地域である久山町の住民における心血管疾患に関して、地域集団を用いたコホート研究を行っている(Hata J, et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2005; 76: 368-372.、Tanizaki Y, et al., Stroke 2000; 31: 2616-2622.)。2002〜2003年の間に、本発明者らは久山町の住民におけるスクリーニング研究を実施し、年齢40歳以上の3,328人(この年齢群の全人口の78 %)がこの研究に参加した。彼らのうち3,196人(96 %)が、自らの臨床情報およびDNAサンプルを本研究に用いることに同意した。
被験集団
1961年以来、本発明者らは、福岡市(日本)に隣接した近郊地域である久山町の住民における心血管疾患に関して、地域集団を用いたコホート研究を行っている(Hata J, et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2005; 76: 368-372.、Tanizaki Y, et al., Stroke 2000; 31: 2616-2622.)。2002〜2003年の間に、本発明者らは久山町の住民におけるスクリーニング研究を実施し、年齢40歳以上の3,328人(この年齢群の全人口の78 %)がこの研究に参加した。彼らのうち3,196人(96 %)が、自らの臨床情報およびDNAサンプルを本研究に用いることに同意した。
本発明者らは、九州大学病院および福岡都市部の6つの協同施設病院(独立行政法人国立病院機構九州医療センター、独立行政法人国立病院機構福岡東医療センター、福岡赤十字病院、白十字病院、今津赤十字病院、誠愛リハビリテーション病院)からの脳梗塞患者を登録した。被験症例は全例、神経内科医により、コンピュータ断層撮影法(CT)および/または磁気共鳴画像法(MRI)を含む臨床情報および脳画像検査を用いて脳卒中と診断され、LA、AT、CEおよび他のサブタイプに細分された。被験者はすべて日本人であり、研究への参加に関して文書によるインフォームド・コンセントを得た。
本研究は、九州大学大学院医学研究院、東京大学医科学研究所および各参加病院の倫理委員会による承認を得ている。
相関解析
本発明者らは、ゲノムワイド相関解析を、1回目および2回目のスクリーニングからなる段階的な様式で行った。1回目のスクリーニングでは、脳梗塞に罹患した被験症例188例を無作為に選択した。各症例に対して、脳卒中および冠動脈疾患に罹患したことがない久山町住民から、年齢および性別が一致する対照被験者1例を無作為に選択した。
本発明者らは、ゲノムワイド相関解析を、1回目および2回目のスクリーニングからなる段階的な様式で行った。1回目のスクリーニングでは、脳梗塞に罹患した被験症例188例を無作為に選択した。各症例に対して、脳卒中および冠動脈疾患に罹患したことがない久山町住民から、年齢および性別が一致する対照被験者1例を無作為に選択した。
2回目のスクリーニングでは、LAおよびATを有する被験症例860例を対象として組み入れた。CEおよび脳梗塞の他のサブタイプは、LAおよびATとは異なる機序を有するという理由から、2回目のスクリーニングには含めなかった。各被験症例に対して、年齢および性別が一致する対照被験者1例を久山町住民から無作為に選択した。両群とも平均年齢±s.d.は70±10歳であり、被験者の60.7 %が男性であった。
SNPジェノタイピング
ゲノムDNA試料は全血から標準的な方法によって抽出した。各ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて多数のゲノム断片を増幅し、インベーダーアッセイによってSNPのジェノタイピングを行った(Ohnishi Y, et al., J Hum Genet 2001; 46: 471-477.、Lyamichev V, et al., Nat Biotech 1999; 17: 292-296.)。
ゲノムDNA試料は全血から標準的な方法によって抽出した。各ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて多数のゲノム断片を増幅し、インベーダーアッセイによってSNPのジェノタイピングを行った(Ohnishi Y, et al., J Hum Genet 2001; 46: 471-477.、Lyamichev V, et al., Nat Biotech 1999; 17: 292-296.)。
細胞培養
ヒト胃腺癌SBC-3細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%抗生物質・抗真菌薬溶液(SIGMA)を含むRPMI 1640培地中で増殖させた。ヒト胚性腎線維芽細胞293T細胞は、10 %FBSおよび1 %抗生物質・抗真菌薬溶液(SIGMA)を含むダルベッコ変法イーグル培地中で増殖させた。いずれの細胞も、5 %CO2を含む37℃の加湿空気中でインキュベートした。
ヒト胃腺癌SBC-3細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%抗生物質・抗真菌薬溶液(SIGMA)を含むRPMI 1640培地中で増殖させた。ヒト胚性腎線維芽細胞293T細胞は、10 %FBSおよび1 %抗生物質・抗真菌薬溶液(SIGMA)を含むダルベッコ変法イーグル培地中で増殖させた。いずれの細胞も、5 %CO2を含む37℃の加湿空気中でインキュベートした。
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
EMSAに用いるプローブは、図9aに示されているように、各多型の周辺の25 bp二本鎖オリゴヌクレオチドとして構築した。Sp1-コンセンサスオリゴヌクレオチド(SantaCruz, sc-2502)を、Sp1の結合に関する陽性対照として用いた。各プローブを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(TOYOBO)を用いて[γ-32P]-ATP(Amersham)で標識した。SBC-3核抽出物10μgを、15 mM Tris-HCl(pH 7.5)、6.5%グリセロール、50 mM KCl、0.7 mM EDTA(pH 8.0)、0.2 mMジチオトレイトール、1 mg/mlウシ血清アルブミン、ポリ(dI-dC)1μgおよびサケ精子DNA 0.1μgを含む反応混合物中において、プローブ(>500000 cpm)とともに室温で30分間インキュベートした。Sp1スーパーシフトアッセイに関しては、抗ヒトSp1ヤギポリクローナル抗体(SantaCruz, sc-59X)2μgを添加し、室温でさらに30分間インキュベートした。この混合物を、0.5×Tris-ホウ酸-EDTA緩衝液を含む4%ポリアクリルアミドゲル上での120 V、3時間の電気泳動にかけた。ゲルを乾燥させた後にX線フィルムに対して露光させた。
EMSAに用いるプローブは、図9aに示されているように、各多型の周辺の25 bp二本鎖オリゴヌクレオチドとして構築した。Sp1-コンセンサスオリゴヌクレオチド(SantaCruz, sc-2502)を、Sp1の結合に関する陽性対照として用いた。各プローブを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(TOYOBO)を用いて[γ-32P]-ATP(Amersham)で標識した。SBC-3核抽出物10μgを、15 mM Tris-HCl(pH 7.5)、6.5%グリセロール、50 mM KCl、0.7 mM EDTA(pH 8.0)、0.2 mMジチオトレイトール、1 mg/mlウシ血清アルブミン、ポリ(dI-dC)1μgおよびサケ精子DNA 0.1μgを含む反応混合物中において、プローブ(>500000 cpm)とともに室温で30分間インキュベートした。Sp1スーパーシフトアッセイに関しては、抗ヒトSp1ヤギポリクローナル抗体(SantaCruz, sc-59X)2μgを添加し、室温でさらに30分間インキュベートした。この混合物を、0.5×Tris-ホウ酸-EDTA緩衝液を含む4%ポリアクリルアミドゲル上での120 V、3時間の電気泳動にかけた。ゲルを乾燥させた後にX線フィルムに対して露光させた。
Sp1の過剰発現および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)
完全長ヒトSp1cDNAをpCAGGS発現ベクター中にサブクローニングした(pCAGGS-Sp1)。6ウェル培養プレート内でほぼ集密化するまで増殖させた293T細胞に対して、1ウェル当たり3μlのFuGENE6(Roche)を用いて、1μgのpCAGGS-Sp1またはモックpCAGGSをトランスフェクトした。トランスフェクションの前または後の種々の時点で全RNAを収集し、RNeasy Mini KitおよびRNase-free DNase Set(QIAGEN)を用いて精製した。cDNAはSuperscript II逆転写酵素(Invitrogen)により合成した。ヒトAGTRL1およびハウスキーピング遺伝子B2Mの発現レベルは半定量的RT-PCRを用いて決定し、リアルタイムRT-PCRによって定量的に確かめた。
完全長ヒトSp1cDNAをpCAGGS発現ベクター中にサブクローニングした(pCAGGS-Sp1)。6ウェル培養プレート内でほぼ集密化するまで増殖させた293T細胞に対して、1ウェル当たり3μlのFuGENE6(Roche)を用いて、1μgのpCAGGS-Sp1またはモックpCAGGSをトランスフェクトした。トランスフェクションの前または後の種々の時点で全RNAを収集し、RNeasy Mini KitおよびRNase-free DNase Set(QIAGEN)を用いて精製した。cDNAはSuperscript II逆転写酵素(Invitrogen)により合成した。ヒトAGTRL1およびハウスキーピング遺伝子B2Mの発現レベルは半定量的RT-PCRを用いて決定し、リアルタイムRT-PCRによって定量的に確かめた。
半定量的RT-PCRに関しては、ExTaq DNAポリメラーゼ(TaKaRa)および以下のプライマー対のそれぞれを用いてcDNAを増幅した;AGTRL1(5'-CTGTGGGCTACCTACACGTAC-3'/配列番号:7および5'-TAGGGGATGGATTTCTCGTG-3'/配列番号:8)ならびにB2M(5'-CACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'/配列番号:9および5'-TACCTGTGGAGCAACCTGC-3'/配列番号:10)。
リアルタイムPCRに関しては、SYBR Premix ExTaq(TaKaRa)を用いてcDNAを増幅し、ABI PRISM 7700(Applied Biosystems)および以下のプライマー対のそれぞれによって分析した:AGTRL1(5'-TGCCATCTACATGTTGGTCTTC-3'/配列番号:11および5'-GTCACCACGAAGGTCAGGTC-3'/配列番号:12)ならびにB2M(5'-TCTCTCTTTCTGGCCTGGAG-3'/配列番号:13および5'-AATGTCGGATGGATGAAACC-3'/配列番号:14)。mRNAの定量は、得られたPCR閾値サイクルをcDNA標準曲線に対して関連づけることによって行った。標準化されたAGTRL1発現量は、AGTRL1値をB2M値によって除算することによって得た。
ルシフェラーゼアッセイ
SNP4(rs9943582)のいずれかのアレルを含むAGTRL1の5'隣接領域のnt-291から-248までに、および/または、SNP9(rs2282624)のいずれかのアレルを含むイントロンのnt+1329から+1381までに対応するDNA断片を合成し、pGL3-basicレポータープラスミド(Promega)のマルチクローニングサイトにクローニングした。24ウェル培養プレート内でほぼ集密化するまで増殖させたSBC-3細胞に対して、1ウェル当たり0.6μlのFuGENE6(Roche)を用いて、各レポーター構築物90 ng、トランスフェクション効率に関する内部対照としたpRL-CMVベクター10 ng、およびpCAGGS-Sp1またはモックpCAGGSベクターのいずれか100 ngをそれぞれトランスフェクトした。48時間後に細胞を収集し、Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
SNP4(rs9943582)のいずれかのアレルを含むAGTRL1の5'隣接領域のnt-291から-248までに、および/または、SNP9(rs2282624)のいずれかのアレルを含むイントロンのnt+1329から+1381までに対応するDNA断片を合成し、pGL3-basicレポータープラスミド(Promega)のマルチクローニングサイトにクローニングした。24ウェル培養プレート内でほぼ集密化するまで増殖させたSBC-3細胞に対して、1ウェル当たり0.6μlのFuGENE6(Roche)を用いて、各レポーター構築物90 ng、トランスフェクション効率に関する内部対照としたpRL-CMVベクター10 ng、およびpCAGGS-Sp1またはモックpCAGGSベクターのいずれか100 ngをそれぞれトランスフェクトした。48時間後に細胞を収集し、Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
統計分析
相関解析およびHardy-Weinberg平衡に関する統計分析は、Yamadaらが記載した通りに行った(Yamada R, et al., Am J Hum Genet 2001; 68: 674-685.)。多重検定の調整のために、本発明者らはSASソフトウエア(SAS Institute)のMULTITEST法を用いて10,000回の並べ替え検定を行った。ハプロタイプ頻度および連鎖非平衡係数(D'およびΔ2)を、期待値最大化アルゴリズムを用いて評価した。相対的ルシフェラーゼ活性はStudentのt検定によって比較した。
相関解析およびHardy-Weinberg平衡に関する統計分析は、Yamadaらが記載した通りに行った(Yamada R, et al., Am J Hum Genet 2001; 68: 674-685.)。多重検定の調整のために、本発明者らはSASソフトウエア(SAS Institute)のMULTITEST法を用いて10,000回の並べ替え検定を行った。ハプロタイプ頻度および連鎖非平衡係数(D'およびΔ2)を、期待値最大化アルゴリズムを用いて評価した。相対的ルシフェラーゼ活性はStudentのt検定によって比較した。
URL
JSNPデータベースは、http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.htmlにある。国際HapMapプロジェクトのデータベースは、http://www.hapmap.orgにある。米国の国立バイオテクノロジー研究センター(National Center of Biotechnology Information)によって提供されているdbSNPデータベースは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.htmlにある。GENSCANプログラムは、http://genes.mit.edu/GENSCAN.htmlにある。MATCHプログラムは、http://www.gene-regulation.com/にある。
JSNPデータベースは、http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.htmlにある。国際HapMapプロジェクトのデータベースは、http://www.hapmap.orgにある。米国の国立バイオテクノロジー研究センター(National Center of Biotechnology Information)によって提供されているdbSNPデータベースは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.htmlにある。GENSCANプログラムは、http://genes.mit.edu/GENSCAN.htmlにある。MATCHプログラムは、http://www.gene-regulation.com/にある。
〔実施例5〕 ゲノムワイド相関解析
本発明者らはゲノムワイド相関解析を段階的な様式で行った。1回目のスクリーニングに関しては、脳梗塞の日本人患者188例ならびに年齢および性別が一致する対照被験者188例を用いて、ハイスループットの複合的PCR-インベーダーアッセイ法(Ohnishi Y, et al., J Hum Genet 2001; 46: 471-477.)により、遺伝子をベースとする52,608箇所のSNPをJSNPデータベース(Haga H, et al., J Hum Genet 2002; 47: 605-610.)から選択した。症例と対照との間で遺伝子型およびアレル頻度を比較し、p値が0.01未満であることが示された1098種のSNPを同定した。
本発明者らはゲノムワイド相関解析を段階的な様式で行った。1回目のスクリーニングに関しては、脳梗塞の日本人患者188例ならびに年齢および性別が一致する対照被験者188例を用いて、ハイスループットの複合的PCR-インベーダーアッセイ法(Ohnishi Y, et al., J Hum Genet 2001; 46: 471-477.)により、遺伝子をベースとする52,608箇所のSNPをJSNPデータベース(Haga H, et al., J Hum Genet 2002; 47: 605-610.)から選択した。症例と対照との間で遺伝子型およびアレル頻度を比較し、p値が0.01未満であることが示された1098種のSNPを同定した。
本発明者らは続いて、2回目のスクリーニングを目的として、LAまたはATを有する患者860例ならびに年齢および性別が一致する対照被験者860例を用いて、これらの1098種のSNPのジェノタイピングを行った。本発明者らは、これらのうち、AGTRL1遺伝子中のSNP(SNP6、rs948847)が、アレル頻度モデル(p=0.000028)および劣性モデル(p=0.000057)において低いp値を示すことを見いだした。多重検定に関する並べ替え検定を行った後の、劣性モデルにおける調整p値は0.0498であった。本発明者らは、SNP6が脳梗塞と関連性のあるマーカーSNPの候補であると考えた。
〔実施例6〕 マーカーSNP6周辺の高精度マッピング
SNP6が位置する染色体11q12領域を検討するために、本発明者らは全被験者を用いて、AGTRL1周辺の240 kb領域内部の48種のSNPのジェノタイピングを行った。この領域はPRG2、PRG3、P2RX3、SSRP1、TNKS1BP1、AGTRL1およびLRRC55という7つの遺伝子をカバーしていた。これらのうち、10種のSNPがAGTRL1中にあり、マイナーアレル頻度が20 %を上回る他の38種のSNPが、国際HapMapプロジェクト(The International HapMap Consortium. Nature 2005; 437: 1299-1320.)のデータベースおよびJSNPデータベース(Haga H, et al., J Hum Genet 2002; 47: 605-610.)から選択された。
SNP6が位置する染色体11q12領域を検討するために、本発明者らは全被験者を用いて、AGTRL1周辺の240 kb領域内部の48種のSNPのジェノタイピングを行った。この領域はPRG2、PRG3、P2RX3、SSRP1、TNKS1BP1、AGTRL1およびLRRC55という7つの遺伝子をカバーしていた。これらのうち、10種のSNPがAGTRL1中にあり、マイナーアレル頻度が20 %を上回る他の38種のSNPが、国際HapMapプロジェクト(The International HapMap Consortium. Nature 2005; 437: 1299-1320.)のデータベースおよびJSNPデータベース(Haga H, et al., J Hum Genet 2002; 47: 605-610.)から選択された。
本発明者らは、この領域における連鎖不平衡(LD)地図を構築した(図8a)。これらのD'値により、マーカーSNP6が、5つの遺伝子(P2RX3、SSRP1、TNKS1BP1、AGTRL1およびLRRC55)によってカバーされる領域と関連づけられることが示された。その結果、脳梗塞に関する単一の候補遺伝子をLDマッピングのみによって決定することは困難であった。
引き続いて、本発明者らは、この領域内での相関解析におけるP値を評価した(図8b)。最も有意な関連性がみられたSNPはTNKS1BP1遺伝子とAGTRL1遺伝子との間に位置していたが、この領域には遺伝子も発現配列タグも報告されておらず、GENSCANプログラムによってオープンリーディングフレームも推定されなかった。P2RX3、SSRP1、TNKSBP1およびLRRC55中のSNPは、AGTRL1遺伝子中のマーカーSNP6よりも関連性の有意さの程度が低かった。さらに、AGTRL1の産物であるAPJ受容体は、心血管系(Kleinz MJ, et al., Regul Pept 2005; 126: 233-240.)および中枢神経系(O’Carroll AM, et al., J Neuroendocrinol 2003; 15: 661-666.)で発現されること、ならびに心血管系(Kagiyama S, et al., Regl Pept 2005; 125: 55-59.、Seyedabadi M, et al., Auton Neurosci. 2002; 101: 32-38.、Katugampola SD, et al., Br J Pharmacol 2001; 132: 1255-1260.、Tatemoto K, et al., Regul Pept 2001; 99: 87-92.、Masri B, et al., FASEB J 2004; 18: 1909-1911.、Hashimoto Y, et al., Int J Mol Med 2005; 16: 787-792.)に関係する機能を有することが報告されていることから、本発明者らはAGTRL1を脳梗塞に関する候補遺伝子として選択した。
〔実施例7〕 AGTRL1遺伝子におけるSNP解析
AGTRL1遺伝子は、2つのエクソンおよび1つのイントロンからなる(図8c)。タンパク質コード領域はエクソン1のみに存在する。以前の報告(Saito S, et al., J Hum Genet 2003; 48: 461-468.)における直接シークエンシングにより、AGTRL1遺伝子における遺伝的変異は転写開始部位の2 kb上流から最終エクソンまでの範囲にわたる領域がスクリーニングされている。その報告では、9つのSNP、2つの単一反復多型および1つの挿入/欠失(I/D)多型が発見されている。本発明者らは、以前の報告では発見されていないが、dbSNPデータベース中にrs11544374としてすでに登録されていたさらに1つのSNP(SNP5)を、エクソン1の5'非翻訳領域(UTR)で見いだした。本発明者らは、LAおよびATを有する被験症例860例ならびに対照被験者860例を用いて、これらの10種のSNPのジェノタイピングを行った。イントロン中のI/D多型についても直接シークエンシングによってジェノタイピングを行ったところ、これはSNP7およびSNP10と絶対的連鎖があることが判明した。
AGTRL1遺伝子は、2つのエクソンおよび1つのイントロンからなる(図8c)。タンパク質コード領域はエクソン1のみに存在する。以前の報告(Saito S, et al., J Hum Genet 2003; 48: 461-468.)における直接シークエンシングにより、AGTRL1遺伝子における遺伝的変異は転写開始部位の2 kb上流から最終エクソンまでの範囲にわたる領域がスクリーニングされている。その報告では、9つのSNP、2つの単一反復多型および1つの挿入/欠失(I/D)多型が発見されている。本発明者らは、以前の報告では発見されていないが、dbSNPデータベース中にrs11544374としてすでに登録されていたさらに1つのSNP(SNP5)を、エクソン1の5'非翻訳領域(UTR)で見いだした。本発明者らは、LAおよびATを有する被験症例860例ならびに対照被験者860例を用いて、これらの10種のSNPのジェノタイピングを行った。イントロン中のI/D多型についても直接シークエンシングによってジェノタイピングを行ったところ、これはSNP7およびSNP10と絶対的連鎖があることが判明した。
このケースコントロール研究において脳梗塞と有意な関連性のある多型は9つ(SNP2、3、4、5、6、7、9、10およびI/D)であった(表10)。
以下の表10は、AGTRL1遺伝子のケースコントロール相関解析結果を示す。
上記表10中、1はリスクアレル、2は非リスクアレル、ORはオッズ比、CIは 信頼区間を指す。
さらに脳梗塞全体における相関解析の結果を以下の表11−1および11−2に示す。またラクナ群およびアテローム群における相関解析の結果を以下の表12−1および12−2に示す。
アミノ酸の置換を引き起こすSNPはなかった。このことから、本発明者らは、これらの多型のいくつかはAGTRL1遺伝子のプロモーター活性またはエンハンサー活性を変化させる可能性があると考えた。
〔実施例8〕 AGTRL1遺伝子におけるハプロタイプ解析
本発明者らは、AGTRL1におけるハプロタイプのセットを構築した。脳梗塞と有意に関連づけられた9種のSNPのうち、SNP2、3および4は完全連鎖している。同様に、I/D、SNP7および10も完全連鎖していた。これらのSNPを検討した上で、本発明者らは5種類のタグSNP(SNP2、SNP5、SNP6、SNP9およびSNP10)をハプロタイプの推定のために用い、両群の被験者の90 %超をカバーする高頻度のハプロタイプ3種を見いだした(表13)。
本発明者らは、AGTRL1におけるハプロタイプのセットを構築した。脳梗塞と有意に関連づけられた9種のSNPのうち、SNP2、3および4は完全連鎖している。同様に、I/D、SNP7および10も完全連鎖していた。これらのSNPを検討した上で、本発明者らは5種類のタグSNP(SNP2、SNP5、SNP6、SNP9およびSNP10)をハプロタイプの推定のために用い、両群の被験者の90 %超をカバーする高頻度のハプロタイプ3種を見いだした(表13)。
以下の表13は、AGTRL1遺伝子のハプロタイプ解析の結果を示す。
上記表13において、5つのSNPs (SNP2, 5, 6, 9, 10) がハプロタイプの推定に利用された。ORはオッズ比、CIは信頼区間を指す。
Hap1におけるSNPはすべてリスクアレルであった。Hap1における脳梗塞のリスクは他のハプロタイプよりも有意に高かった(オッズ比(OR)=1.60,(95 %信頼区間(CI)、1.22〜2.09);p=0.00058、劣性モデルにおける)。これに対して、Hap3におけるSNPはすべて非リスクアレルであり、Hap3における脳梗塞のリスクは他のものよりも有意に低かった(OR=0.76(95%CI、0.65〜0.88;p=0.00032、アレル頻度モデルにおける)。その結果、Hap1、Hap2およびHap3はそれぞれリスク型、中間型および非リスク型のハプロタイプであると判断された。
〔実施例9〕 Sp1転写因子はAGTRL1遺伝子のSNP4およびSNP9のリスクアレルと結合する
AGTRL1 mRNAを高発現する細胞系を選択するために、本発明者らは89種の細胞系からのcDNAを用いてRT-PCRを行った。その結果、SBC-3細胞がAGTRL1 mRNAを最も高度に発現した(非提示データ)。
AGTRL1 mRNAを高発現する細胞系を選択するために、本発明者らは89種の細胞系からのcDNAを用いてRT-PCRを行った。その結果、SBC-3細胞がAGTRL1 mRNAを最も高度に発現した(非提示データ)。
SNP周辺のDNA配列と転写因子との間の結合を評価するためにEMSAを行った。9つの多型候補の各アレルに対して、32P標識した二本鎖DNAプローブを構築し、SBC-3細胞からの核抽出物とインキュベートした上で電気泳動を行った(図9a)。本発明者らは、DNA-タンパク質結合が、SNP4のリスクアレルSNP4(-279G)では検出されるが、同じ結合が非リスクアレル(-279A)では検出されないことを見いだした。本発明者らはまた、DNA-タンパク質結合がSNP9のリスクアレル(+1355G)では検出されるが、非リスクアレル(+1355A)では検出されないことも見いだした。293T細胞からの核抽出物を用いることによっても同様の結果が得られた(非提示データ)。このアッセイに用いたプローブの配列は図9bに示されている。これらの結果は、何らかの転写因子がアレル特異的な様式で結合してAGTRL1の発現をトランス活性化する可能性を示唆している。
TRANSFACデータベースを利用したMATCHプログラムでは、転写因子Sp1はSNP4およびSNP9のリスクアレル周辺のDNA配列と結合することが推測された(図9c)。これらのSNPとSp1との結合をインビトロで確かめるために、本発明者らは特異抗体を用いるSp1スーパーシフトアッセイを行った(図9d)。SNP4のリスクアレルにおけるDNA-タンパク質複合体のバンドは、抗Sp1抗体の存在下では上方にスーパーシフトした。SNP9のリスクアレルでも同様のスーパーシフトが検出された。
以上より、本発明者らは、Sp1転写因子が SNP4およびSNP9のリスクアレル周辺のDNA配列と結合すると結論づけた。本発明者らは、Sp1とこれらのSNPとの間の相互作用がAGTRL1遺伝子のプロモーター活性またはエンハンサー活性に影響を与える可能性があるとの仮説を立てた。
〔実施例10〕 Sp1はAGTRL1 mRNAの転写を誘導する
Sp1がAGTRL1遺伝子の転写に影響を及ぼすという仮説を確かめるために、本発明者らは293T細胞に対して、pCAGGSモックベクターまたはSp1-発現ベクター(pCAGGS-Sp1)のいずれかをトランスフェクトし、種々の時点で半定量的RT-PCRによりAGTRL1 mRNAレベルを比較した(図10a)。本発明者らは、内因性293T細胞ではAGTRL1 mRNAは検出されないが、Sp1の過剰発現がAGTRL1 mRNAの転写を顕著に誘導することを見いだした。リアルタイムRT-PCRによっても同じ結果が定量的に確かめられた(図10b)。
Sp1がAGTRL1遺伝子の転写に影響を及ぼすという仮説を確かめるために、本発明者らは293T細胞に対して、pCAGGSモックベクターまたはSp1-発現ベクター(pCAGGS-Sp1)のいずれかをトランスフェクトし、種々の時点で半定量的RT-PCRによりAGTRL1 mRNAレベルを比較した(図10a)。本発明者らは、内因性293T細胞ではAGTRL1 mRNAは検出されないが、Sp1の過剰発現がAGTRL1 mRNAの転写を顕著に誘導することを見いだした。リアルタイムRT-PCRによっても同じ結果が定量的に確かめられた(図10b)。
〔実施例11〕 Sp1はSNP4のリスクアレルにおけるプロモーター機能を活性化する
SNP4におけるプロモーター活性を評価するために、本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターベクター(pGL3-basic)に、リスクアレルおよび非リスクアレルに相当するSNP4周囲の44 bp断片を含めたもの(それぞれ-279G-Lucおよび-279A-Luc)を構築した上で、それらをモックpCAGGSベクターまたはpCAGGS-Sp1ベクターのいずれかと同時トランスフェクトしたSBC-3細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った(図11a)。モックpCAGGSをトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性がSNP4断片によって上昇することはなかった。Sp1を過剰発現させた細胞では、ルシフェラーゼ活性はリスクアレルの方が対照(pGL3-basic)よりも2.3倍の高さであった。非リスクアレルでは、活性は対照の1.7倍の高さに過ぎなかった。すなわち、SNP4周辺のプロモーター機能はSp1転写因子の存在下では活性化され、リスクアレルは非リスクアレルよりも有意に強い活性を示した(p=0.003)。
SNP4におけるプロモーター活性を評価するために、本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターベクター(pGL3-basic)に、リスクアレルおよび非リスクアレルに相当するSNP4周囲の44 bp断片を含めたもの(それぞれ-279G-Lucおよび-279A-Luc)を構築した上で、それらをモックpCAGGSベクターまたはpCAGGS-Sp1ベクターのいずれかと同時トランスフェクトしたSBC-3細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った(図11a)。モックpCAGGSをトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性がSNP4断片によって上昇することはなかった。Sp1を過剰発現させた細胞では、ルシフェラーゼ活性はリスクアレルの方が対照(pGL3-basic)よりも2.3倍の高さであった。非リスクアレルでは、活性は対照の1.7倍の高さに過ぎなかった。すなわち、SNP4周辺のプロモーター機能はSp1転写因子の存在下では活性化され、リスクアレルは非リスクアレルよりも有意に強い活性を示した(p=0.003)。
〔実施例12〕 SNP4およびSNP9の組み合わせはAGTRL1の転写に影響を及ぼす
本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターベクター(pGL3-basic)に、表13で明らかにした3つのハプロタイプ別にSNP4周囲の44 bp断片およびSNP9周囲の53 bp断片を含めたものを構築した上で、それらをモックpCAGGSベクターまたはpCAGGS-Sp1ベクターと同時トランスフェクトしたSBC-3細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った(図11b)。モックpCAGGSをトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性ではHap1構築物(リスクハプロタイプ)で最も高く、Hap3構築物(非リスクハプロタイプ)で最も低かった。Hap2構築物(中間型ハプロタイプ)は中間の活性を示した。その結果、AGTRL1遺伝子のプロモーター活性を増強させるイントロン性エンハンサーはSNP9のリスクアレル(+1355G)周辺に存在した。これらのデータは、ハプロタイプ解析におけるオッズ比の結果と整合する(表11)。Sp1を過剰発現させた細胞では、活性はさらに増強された。
本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターベクター(pGL3-basic)に、表13で明らかにした3つのハプロタイプ別にSNP4周囲の44 bp断片およびSNP9周囲の53 bp断片を含めたものを構築した上で、それらをモックpCAGGSベクターまたはpCAGGS-Sp1ベクターと同時トランスフェクトしたSBC-3細胞を用いてルシフェラーゼアッセイを行った(図11b)。モックpCAGGSをトランスフェクトした細胞では、ルシフェラーゼ活性ではHap1構築物(リスクハプロタイプ)で最も高く、Hap3構築物(非リスクハプロタイプ)で最も低かった。Hap2構築物(中間型ハプロタイプ)は中間の活性を示した。その結果、AGTRL1遺伝子のプロモーター活性を増強させるイントロン性エンハンサーはSNP9のリスクアレル(+1355G)周辺に存在した。これらのデータは、ハプロタイプ解析におけるオッズ比の結果と整合する(表11)。Sp1を過剰発現させた細胞では、活性はさらに増強された。
本発明者らは、全ゲノムを対象としたSNPによるゲノムワイド相関研究を行い、脳梗塞の関連遺伝子の同定を行った。患者群は九州大学大学院病態機能内科学および関連施設に通院中の脳梗塞患者1,112例であり、対照群は2002年から2003年に施行した久山町住民健診受診者の中から患者群1例に対し性別および年齢を対応させた対照者を無作為に選出した。文部科学省・厚生労働省・経済産業省共同の「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」に基づき、説明者による説明後、書面によるインフォームドコンセントを取得し、血液サンプルおよび臨床情報を得た。この患者群1,112例および対照群1,112例の中から無作為に188例ずつを選び、全ゲノムに分布する52,608ヶ所のSNPを測定し、1次スクリーニングを行った。1次スクリーニングにおいて患者群と対照群の間に関連が認められた1098ヶ所のSNPについて全対象者を用いた2次スクリーニングを行い、脳梗塞に関連する遺伝子の同定を行った。全ゲノムにおけるSNPの測定には、東京大学医科学研究所のインベーダー法を利用した大量高速SNPタイピングシステムを用いた。
その結果、AGTRL1(Angiotensin II receptor-like 1)遺伝子とPRKCH(Protein kinase C eta)遺伝子を脳梗塞の関連遺伝子として同定した。AGTRL1遺伝子においては、5’側、遺伝子内および3’側に存在するSNPのほとんどが患者群と対照群の間にp<1x10-4の有意差を認めた。この関連は対象者を動脈硬化と関連する脳梗塞(ラクナ梗塞およびアテローム血栓性梗塞)患者に限った場合にも認められた。また、ルシフェラーゼアッセイおよびゲルシフトアッセイによりAGTRL1遺伝子のSNP間で転写因子の結合に差が見られ、5’側または3’側のSNPを含む領域への転写因子の結合の差がAGTRL1遺伝子のmRNA発現量を変化させることが明らかとなった。従って、AGTRL1遺伝子においては5’または3’側のSNPを含む領域への転写因子の結合の差によりAGTRL1の発現量が変化し脳梗塞等の動脈硬化性疾患の発症に関与すると考えられた。
一方、PRKCH遺伝子においては遺伝子内の中央部分(イントロン5-イントロン10)の領域のみで動脈硬化と関連する脳梗塞患者群(ラクナ梗塞群およびアテローム血栓性梗塞群)の間にp<1x10-4の有意差を認めた。この領域のダイレクトシークエンスによりアレルがGからAに変わることにより374番目のアミノ酸がバリン(Val)からイソロイシン(Ile)に置換されるSNP(rs2230500)を認め、Ile(Aアレル)をもつ人は脳梗塞患者群に有意に多かった。In vitro autophosphorylation assayを用いてこのアミノ酸置換がPRKCHの遺伝子産物であるプロテインキナーゼη(Protein kinase C eta; PKC-eta)の活性に与える影響を検討したところ、ValからIleへのアミノ酸置換はPKC-etaの自己リン酸化反応を亢進させる事が明らかとなった。すなわち、PKC-etaの374番目のアミノ酸をValからIleに置換するSNP(rs2230500)はPKC-etaの活性に影響しており、この活性の差が脳梗塞と関連していると考えられた。また、PKC-etaの市販抗体(ラビットポリクローナル抗体、Santa Cruz)を用いてヒトの剖検例の冠状動脈の免疫組織染色を行った所、PKC-etaはヒト冠状動脈の内皮細胞および動脈硬化巣に発現しており、その程度は動脈硬化の程度と強く相関していた。すなわちPKC-etaはヒトの動脈硬化の発症・進展に深く関与していることが明らかとなった。さらに、PKC-etaのアミノ酸置換を伴うSNP(rs2230500)がヒトの動脈硬化性疾患の発症に関与するかどうかを検討するために、1988年に久山町一般住民健診を受けて長期観察中の久山町研究の第3集団のうち2002年から2003年にゲノムDNAを収集した1,683例を用いて、脳梗塞および心筋梗塞発症との関連を検討した。14年間の追跡期間中67例の脳梗塞発症および37例の心筋梗塞発症を認め、rs2230500のアレルがGGである人と比べ、AAの人の脳梗塞のリスクは2.83倍と有意に高かった。同様に心筋梗塞のリスクもGGの人に比べAAの人は2.89倍上昇していた。以上の結果より、PRKCH遺伝子のエクソン9に存在する374番目のアミノ酸をValからIleへ置換するSNP(rs2230500)は、アミノ酸置換によりPKC-etaの活性が上昇し、種々のシグナル伝達を介してヒトにおける動脈硬化を進行させ、最終的に一般住民における脳梗塞や心筋梗塞のリスクを上昇させていると考えられる。
従来の高血圧、心筋梗塞、脳卒中、糖尿病、慢性関節リウマチなどの一般的な疾患(common disease)におけるゲノムワイド相関研究を用いた候補遺伝子の探索においては、疾患群と対照群におけるSNPの頻度の差を比較し候補領域の絞込みを行うケース・コントロール研究が用いられている。しかし、脳梗塞などの疾患は加齢とともに発症率が上昇し、またその発症率に男女差があることもよく知られている。従って、患者群と対照群のSNPの差を比べる際には、両群間の年齢、男女比を考慮する必要がある。しかしながら、これまでの報告においては疾患群と対照群とを完全に一致させたものは見当たらない。その理由のひとつとして、患者群は病院に通院している患者であるため比較的容易にサンプルの収集が可能であるが、対照群は病気を持たない一般住民であるためサンプルの収集が困難であり、また性別や年齢を一致させるためには患者群より数倍多いサンプルの収集が必要となることがある。久山町の疫学集団は一般住民の健診受診者からなる集団であるため、これまでの研究では収集が困難である病気をもたない人を多数含んでおり、患者群の1例ごとに性別・年齢を一致させた対照群を設定することが可能であった。また、ケース・コントロール研究では対照群の設定に偏りがあると疾患群・対照群の差が本来とは異なる結果を生じることが知られている(selection bias)。久山町の住民は、これまでの疫学調査の結果より、性、年齢構成等が日本人の標準的構成であることから、日本人全体のサンプル集団であると証明されており、その集団の中から無作為に設定された対照群には偏りがないと考えられる。従って、今回の脳梗塞の関連遺伝子を探索する際に久山町集団を対照群に設定したことにより従来の報告と比べ、より正確に高い精度で疾患と関連する遺伝子を同定できていると考えられる。
久山町住民を用いることによる最大の利点は、この集団が一般住民を対象とした長期前向き追跡研究のための集団である点にある。ゲノムワイド相関研究で見つけ出される疾患関連遺伝子やその遺伝子多型が真に疾患と関係しているかどうかを検証するために、現時点では疾患関連遺伝子を選び出した集団とはまったく別の集団を用いてケース・コントロール研究を行い再現性が得られるかどうかを検討している。しかしながら、ケース・コントロール研究は対象集団の選択による偏りの可能性が否定できないため別の集団を用いて再現性が得られても疑陽性の可能性が否定できない。一般的に疾患と危険因子の関連を検討する場合、疾患を発症していない集団を長期に追跡し、危険因子が疾患の発症に及ぼす影響を検討する前向き追跡研究(コホート研究)の研究手法がもっとも精度の高い方法と考えられているが、対象者の収集及び追跡調査に莫大な時間・労力・費用がかかるためこれまでにこの方法を用いて疾患と遺伝子多型の関連を検討した報告はない。久山コホートはこの目的のために設定された集団であり、しかも以前の集団も追跡調査が継続されているため今回のPRKCH遺伝子のように遺伝子多型と脳梗塞との関連を14年間にわたる長期前向き追跡調査のデータを元に検証することが可能となった。今回の結果は一般住民レベルで遺伝子多型が疾患の発症と関連していることを証明した世界で始めてのケースである。また、久山コホートは、性、年齢構成等が日本人の標準的構成であることから、日本人全体のサンプル集団であるということができ、今回の結果は久山町住民だけでなく日本人全体に当てはまると考えられる。
Claims (39)
- 被検者におけるAGTRL1遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
- 被検者について、AGTRL1遺伝子におけるDNA変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
- 前記変異が、Sp1転写因子との結合を変化させる変異である、請求項2に記載の検査方法。
- 被検者におけるPRKCH遺伝子の発現を指標とすることを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
- 被検者について、PRKCH遺伝子におけるDNA変異を検出することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
- 変異が多型変異である、請求項1〜5のいずれかに記載の検査方法。
- 被検者について、AGTRL1遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
- 多型部位が、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における(1a)1位、(2a)12541位、(3a)21545位、(4a)33051位、(5a)35365位、(6a)39268位、(7a)39353位、(8a)39370位、(9a)39474位、(10a)39553位、(11a)39665位、(12a)41786位、(13a)42019位、(14a)42509位、(15a)43029位、(16a)43406位、(17a)43663位、(18a)46786位、(19a)49764位、(20a)64276位、(21a)74482位、(22a)78162位、(23a)93492位、または(24a)102938位の多型部位である、請求項7に記載の検査方法。
- 請求項8の(1a)〜(24a)に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の(1b)〜(24b)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される請求項8に記載の検査方法。
(1b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の1位における相補鎖の塩基種がT
(2b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の12541位における相補鎖の塩基種がT
(3b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の21545位における相補鎖の塩基種がA
(4b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の33051位における相補鎖の塩基種がC
(5b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の35365位における相補鎖の塩基種がT
(6b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位における相補鎖の塩基種がA
(7b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39353位における相補鎖の塩基種がG
(8b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39370位における相補鎖の塩基種がC
(9b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39474位における相補鎖の塩基種がT
(10b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39553位における相補鎖の塩基種がT
(11b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39665位が欠失
(12b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の41786位における相補鎖の塩基種がA
(13b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42019位における相補鎖の塩基種がG
(14b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42509位における相補鎖の塩基種がG
(15b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43029位における相補鎖の塩基種がG
(16b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43406位における相補鎖の塩基種がC
(17b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の43663位における相補鎖の塩基種がT
(18b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の46786位における相補鎖の塩基種がC
(19b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の49764位における相補鎖の塩基種がT
(20b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の64276位における相補鎖の塩基種がT
(21b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の74482位における相補鎖の塩基種がC
(22b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の78162位における相補鎖の塩基種がG
(23b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の93492位における相補鎖の塩基種がG
(24b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の102938位における相補鎖の塩基種がC - 被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロックが検出された場合に動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される方法。
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ - 被検者について動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、以下に記載のハプロタイプを示すDNAブロック内に存在し互いに連鎖することを特徴とする多型部位の塩基種を決定する工程を含む検査方法。
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ - 以下の工程(a)および(b)を含む、被検者について、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
(a) 被検者におけるAGTRL1遺伝子上の多型部位について、塩基種を決定する工程
(b)(a)で決定された塩基種が、以下の(A)に記載のハプロタイプを示すAGTRL1遺伝子における前記多型部位の塩基種と同一であった場合に、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する工程
(A)AGTRL1遺伝子上の多型部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39268位、39353位、41786位、42019位、および43406位の多型部位における相補鎖の塩基種が、それぞれA、G、A、GおよびCであるハプロタイプ - 前記(a)の多型部位が、AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における1位、12541位、21545位、33051位、35365位、39268位、39353位、39370位、39474位、39553位、39665位、41786位、42019位、42509位、43029位、43406位、43663位、46786位、49764位、64276位、74482位、78162位、93492位、または102938位のいずれかの多型部位である、請求項12に記載の検査方法。
- 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるAGTRL1遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法。
- 被検者について、PRKCH遺伝子における多型部位の塩基種を決定することを特徴とする、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法。
- 多型部位が、PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列における(1a)1位、(2a)16212位、(3a)30981位、(4a)32408位、(5a)33463位、(6a)34446位、(7a)39322位、(8a)39469位、(9a)39471位、(10a)49248位、(11a)49367位、または(12a)52030位の多型部位である、請求項15に記載の検査方法。
- 請求項16の(1a)〜(12a)に記載の多型部位における塩基種が、それぞれ以下の(1b)〜(12b)である場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定される請求項16に記載の検査方法。
(1b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の1位の塩基種がA
(2b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の16212位の塩基種がG
(3b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の30981位の塩基種がA
(4b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の32408位の塩基種がG
(5b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の33463位の塩基種がG
(6b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の34446位の塩基種がT
(7b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39322位の塩基種がT
(8b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39469位の塩基種がA
(9b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の39471位の塩基種がC
(10b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49248位の塩基種がC
(11b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の49367位の塩基種がG
(12b)PRKCH遺伝子上の部位であって、配列番号:2に記載の塩基配列の52030位の塩基種がA - 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者におけるPRKCHタンパク質の自己リン酸化活性またはキナーゼ活性が対照と比較して上昇している場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法。
- 動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査方法であって、被検者について、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体を有する場合に、被検者は動脈硬化性疾患のリスク素因を有するものと判定する方法。
- 被検者由来の生体試料を被検試料として検査に供する、請求項1〜19のいずれかに記載の検査方法。
- 請求項8の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、請求項16の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬。
- 請求項8の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、請求項16の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された固相からなる、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬。
- 請求項8の(1a)〜(24a)に記載の多型部位、または、請求項16の(1a)〜(12a)に記載の多型部位を含むDNAを増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かを検査するための試薬。
- 以下の(a)または(b)を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患のリスク素因を有するか否かの検査用試薬。
(a)AGTRL1またはPRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1またはPRKCHタンパク質を認識する抗体 - 以下の(a)〜(c)のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬。
(a)AGTRL1遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)AGTRL1タンパク質を認識する抗体
(c)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド - 以下の(a)〜(c)のいずれかを有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング用試薬。
(a)PRKCH遺伝子の転写産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
(b)PRKCHタンパク質を認識する抗体
(c)PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたアミノ酸配列を有するPRKCHタンパク質変異体 - AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
- AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現抑制物質が、以下の(a)〜(c)からなる群より選択される化合物である、請求項27に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
(c)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現をRNAi効果による阻害作用を有する核酸 - AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質の機能抑制物質が、以下の(a)または(b)の化合物である、請求項27に記載の動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
(a)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する抗体
(b)AGTRL1もしくはPRKCHタンパク質に結合する低分子化合物 - AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域と、Sp1転写因子との結合を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
- PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性を阻害する物質を有効成分として含有する、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤。
- AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現量または該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)該AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
(a)AGTRL1もしくはPRKCH遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程 - AGTRL1遺伝子が、以下の(a)または(b)の発現が亢進した変異型AGTRL1遺伝子である、請求項32〜34のいずれかに記載のスクリーニング方法。
(a)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の42509位における相補鎖の塩基種がGである変異型AGTRL1遺伝子
(b)AGTRL1遺伝子上の部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列の39353位における相補鎖の塩基種がGである変異型AGTRL1遺伝子 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
(a)AGTRL1遺伝子上の塩基部位であって、配列番号:1に記載の塩基配列における39353位または42509位の部位を含むDNA領域からなるポリヌクレオチド、およびSp1転写因子と、被検化合物とを接触させる工程
(b)前記ポリヌクレオチドとSp1転写因子との結合活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記結合活性を低下させる化合物を選択する工程 - 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
(a)PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b)PRKCHタンパク質の自己リン酸化活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、自己リン酸化活性を低下させる化合物を選択する工程 - 前記PRKCHタンパク質が、PRKCHタンパク質のアミノ酸配列において374位のバリンがイソロイシンへ置換されたタンパク質変異体である、請求項37に記載のスクリーニング方法。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む、動脈硬化性疾患の治療もしくは予防のための薬剤のスクリーニング方法。
(a)PRKCHタンパク質と、被検化合物とを接触させる工程
(b)PRKCHタンパク質のプロテインキナーゼ活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、プロテインキナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006121284 | 2006-04-25 | ||
JP2006121284 | 2006-04-25 | ||
PCT/JP2007/058780 WO2007123233A1 (ja) | 2006-04-25 | 2007-04-24 | 動脈硬化性疾患関連遺伝子、およびその利用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2007123233A1 true JPWO2007123233A1 (ja) | 2009-09-10 |
Family
ID=38625130
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008512182A Pending JPWO2007123233A1 (ja) | 2006-04-25 | 2007-04-24 | 動脈硬化性疾患関連遺伝子、およびその利用 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090324610A1 (ja) |
EP (1) | EP2017355A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2007123233A1 (ja) |
WO (1) | WO2007123233A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8673848B2 (en) | 2012-01-27 | 2014-03-18 | Novartis Ag | Synthetic apelin mimetics for the treatment of heart failure |
WO2013109144A1 (en) * | 2012-01-18 | 2013-07-25 | Stichting Katholieke Universiteit | Annexin a5 snp in atherosclerosis |
US10308979B2 (en) * | 2012-06-01 | 2019-06-04 | Agilent Technologies, Inc. | Target enrichment and labeling for multi-kilobase DNA |
US8921307B2 (en) | 2012-11-20 | 2014-12-30 | Novartis Ag | Synthetic linear apelin mimetics for the treatment of heart failure |
UY35144A (es) | 2012-11-20 | 2014-06-30 | Novartis Ag | Miméticos lineales sintéticos de apelina para el tratamiento de insuficiencia cardiaca |
AP2016009021A0 (en) | 2013-07-25 | 2016-02-29 | Novartis Ag | Cyclic polypeptides for the treatment of heart failure |
SG11201600208RA (en) | 2013-07-25 | 2016-02-26 | Novartis Ag | Bioconjugates of synthetic apelin polypeptides |
CN108531584A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-09-14 | 成都中创清科医学检验所有限公司 | 一种用于检测脑中风易感性相关的snp位点的引物及检测方法 |
JP2020092660A (ja) * | 2018-12-13 | 2020-06-18 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター | 脳梗塞発症リスク予測方法 |
CN111440862A (zh) * | 2020-05-19 | 2020-07-24 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 一种评估慢性心力衰竭患者预后的引物组、试剂盒及方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2313246A1 (en) * | 1997-12-24 | 1999-07-08 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Polypeptide, their production and use |
DE19962987A1 (de) | 1999-12-24 | 2001-07-05 | Mahle Filtersysteme Gmbh | Kolbenmotor |
DE10138569A1 (de) * | 2001-08-06 | 2003-04-30 | Bayer Ag | Regulation des APJ-Rezeptors |
JP2005531609A (ja) | 2002-06-05 | 2005-10-20 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ | キナーゼ阻害剤としてのシスインドリル−マレイミド誘導体 |
SE0202608D0 (sv) | 2002-09-04 | 2002-09-04 | Biovitrum Ab | New sequences |
WO2006019193A1 (ja) * | 2004-08-20 | 2006-02-23 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 阻害剤・促進剤の用途 |
-
2007
- 2007-04-24 WO PCT/JP2007/058780 patent/WO2007123233A1/ja active Application Filing
- 2007-04-24 US US12/298,484 patent/US20090324610A1/en not_active Abandoned
- 2007-04-24 JP JP2008512182A patent/JPWO2007123233A1/ja active Pending
- 2007-04-24 EP EP07742215A patent/EP2017355A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20090324610A1 (en) | 2009-12-31 |
EP2017355A4 (en) | 2010-01-06 |
WO2007123233A1 (ja) | 2007-11-01 |
EP2017355A1 (en) | 2009-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPWO2007123233A1 (ja) | 動脈硬化性疾患関連遺伝子、およびその利用 | |
De Marco et al. | FZD6 is a novel gene for human neural tube defects | |
Yamada et al. | Germline alterations in the CDH1 gene in familial gastric cancer in the Japanese population | |
CA2735129C (en) | Syngap1 dysfunctions and uses thereof in diagnostic and therapeutic applications for mental retardation | |
US20070082347A1 (en) | Gene variants and use thereof | |
US20090041862A1 (en) | Detecting disease association with aberrant glycogen synthase kinase 3beta expression | |
US20060040293A1 (en) | Method for detecting the risk of and for treatment of type 2 diabetes | |
US20080152589A1 (en) | Diagnostics and Therapeutics of Neurological Disease | |
US7488576B2 (en) | Methods for diagnosis and treatment of psychiatric disorders | |
US10767227B2 (en) | Compositions and methods for determining genetic polymorphisms in the TMEM216 gene | |
CN101132791A (zh) | 用于鉴定替加色罗在慢性便秘患者中的功效的生物标记 | |
JP2008524999A (ja) | 精神障害を治療するための組成物及び方法 | |
US11473143B2 (en) | Gene and mutations thereof associated with seizure and movement disorders | |
EP2297325A1 (en) | Methods of stratifying, prognosing and diagnosing schizophrenia, mutant nucleic acid molecules and polypeptides | |
Napolitano et al. | Novel autophagic vacuolar myopathies: phenotype and genotype features | |
JP2006526986A (ja) | 炎症性大腸炎の診断方法 | |
US20070009927A1 (en) | Methods and compositions for prenatal diagnosis of mental retardation | |
JP2011125296A (ja) | 動脈硬化性関連遺伝子、およびその利用 | |
JPWO2006112456A1 (ja) | Grk5パーキンソン病関連遺伝子、およびその利用 | |
JP2009189304A (ja) | 慢性閉塞性肺疾患における肺機能低下に関連する多型、およびその利用 | |
JPWO2004084797A1 (ja) | 2型糖尿病関連遺伝子、およびその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100302 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120621 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20121011 |