CN102149702A - 新型亚甲二氧基酚化合物和其治疗疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型亚甲二氧基酚化合物和其衍生物，制备其的方法和使用其治疗或预防心血管疾病、血管疾病和/或炎性疾病以及处于发生高血压、中风、心血管和肾病的风险中的I型和II型糖尿病和血脂异常患者的方法。

Description

新型亚甲二氧基酚化合物和其治疗疾病的用途
之前的相关申请
本申请要求2008年8月5日提交的美国临时专利申请61/086,425(其以其全文通过引用合并入本文)的优先权。
关于以电子方式提交的序列表
通过EFS网以电子方式提交序列表的官方拷贝，其为2009年8月5日创建的ASCII格式的序列表，文件命名为″604_29993_Sequence_Listing_OSURF-08051.txt″，具有3千字节的大小，并且与说明书一起提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是说明书的一部分并且以其全文通过引用合并入本文。
发明领域
提供了新型的基于亚甲二氧基酚的化合物及其衍生物，以及制备其的方法和使用其治疗或预防血管疾病、心血管疾病、炎性疾病、糖尿病性血管疾病和相关病症的方法。
发明背景
心血管疾病和心脏病是世界范围的头号杀手并且相关风险因素在全球范围正不断增加。例如，心血管疾病和代谢疾病例如糖尿病(其中预期到2025年在世界范围内发病率将增加40％以上)，代谢综合征，高血压和血脂异常是发病率和死亡率的首要原因。此外，最近的研究表明，甚至迄今受保护的亚群体(subset)例如年轻妇女正变得越来越易受到心脏病的伤害。因此，对新型心血管药的全球需要正在稳定增加。
继发于动脉粥样硬化的心血管疾病不是单一疾病。多个风险因素与该疾病关联。这类因素包括糖尿病、高血压、血脂异常、吸烟、血栓形成倾向(thrombophilia)(增加的凝血倾向或血栓形成)和阳性家族史。通常，患者具有多个风险因素并且用多种药物进行治疗。虽然联合治疗已被证明是有效的，但通常药物间相互作用、每日多次给药的不便性等以及未诊断出的风险因素使得必需采取多管齐下的方法。
迄今为止，许多此类风险因素已被处理为单独的疾病，尽管在它们之间存在大量共同之处。例如，抗高血压药物对糖尿病几乎没有影响并且反之亦然。最近的研究已显示，许多此类疾病(风险因素)具有共同的特征例如提高的炎性和氧化性应激。此外，改变的内皮功能是与几乎所有此类风险因素关联的共同的临床上显著的现象。
本发明提供了新型亚甲二氧基酚化合物和其衍生物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗、预防或延迟心血管疾病、血管疾病和/或炎性疾病的发作和进展以及处于发生高血压、中风、心血管和肾病的风险中的I型和II型糖尿病和血脂异常患者。
期望具有一种或多种可治疗或预防心血管疾病、炎性疾病、糖尿病性血管疾病或相关病症的一个或多个因素或症状的药物。
发明概述
本发明通过提供新型亚甲二氧基酚化合物和其衍生物、制备其的方法和使用其治疗、预防或延迟心血管疾病、血管疾病和/或炎性疾病的发作和进展以及处于高血压、中风、心血管和肾病的风险中的I型和II型糖尿病及血脂异常患者的方法，大大缓解了这些问题。
这些亚甲二氧基酚化合物和其衍生物具有预防动脉粥样硬化的进展的能力。因此，此类化合物可用于预防斑块(plaque)的积累以及延迟或预防个体例如处于发生动脉粥样硬化的风险中的个体的动脉粥样硬化。由于此类化合物在预防斑块的积累以及延迟或预防动脉粥样硬化中是有用的，因此可施用其以预防或减少心脏病发作、中风、死亡、外周动脉疾病和血管重建事件(冠状动脉旁路移植手术或下肢搭桥术)的发生。
此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物具有抗炎性质，如至少由对转录因子核因子κB(NFkB)的激活的阻止的效应所证明的。因此，此类化合物可用于多种炎性病症包括但不限于动脉粥样硬化、糖尿病、炎性关节炎(类风湿性关节炎、银屑病关节炎)、高血压和衰老(aging)。例如，可将此类化合物与可接受的载体组合并且给最近遭受心脏病发作或中风的患者或最近已经历对冠状或外周动脉血管的经皮介入(percutaneous intervention)的患者施用。此类组合物还可用于给在冠状动脉和外周动脉中接受支架的患者施用。
鉴于它们在改善血管胰岛素敏感性中的作用，此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物在糖尿病和预防糖尿病性血管疾病(包括糖尿病性心脏病、糖尿病性肾病和糖尿病性脑血管疾病)中将具有保护作用。
此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物还影响转录因子，固醇调节和结合蛋白-2(SREBP-2)。此类化合物用作SREBP-2的转录后激活物并且代表新种类的SREBP-2的选择性激活物。SREBP-2的增加增加了低密度脂蛋白受体(LDLR)并且降低了LDL胆固醇水平。因此，此类化合物可用于治疗与升高的LDL水平相关的高脂血症例如杂合性家族性高胆固醇血症和纯合性家族性高胆固醇血症、混合性高脂血症、极低密度脂蛋白(VLDL)胆固醇和糖尿病性血脂异常的升高。
鉴于此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物在动脉粥样硬化和炎症中提供的显著有益性，还可将它们与本领域技术人员已知的在动脉粥样硬化和炎症中有效的其他治疗(包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、脂肪吸收抑制剂(fat uptake inhibitor)、血管紧张素受体阻断剂、过氧化物酶体增殖激活受体α(PPAR-α)和PPAR-γ激动剂、乙酰水杨酸、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂和β-阻断剂)组合施用。
将本发明的亚甲二氧基酚化合物和其衍生物与药学可接受的载体组合以形成用于给动物或人施用的组合物。此类组合物用于治疗或预防血管疾病、心血管疾病、炎性疾病、糖尿病性血管疾病或相关病症以及许多其基础性风险因素。可单独地或与另一种治疗性化合物组合施用此类组合物。本发明的组合物与一种或多种另外的治疗性化合物的此类施用可分开地进行。可选择地，可将本发明的组合物以及一种或多种另外的治疗性化合物组合在一次施用或递送方法中，例如组合在一个胶囊、一个囊片(caplet)或一次静脉内施用中。
在阅览下列公开的实施方案和权利要求的详细描述后，本发明的这些和其他目的、特征和有利方面将变得明了透彻。
附图概述
图1A显示INV-7065的质子NMR。
图1B显示INV-7465的质子NMR。
图2是显示INV-75的基于细胞的毒性测定的图。将人脐静脉内皮细胞用于实验。
图3显示ICAM-1和VCAM-1响应INV-75和TNF-α的释放。
图4是显示评估INV-75对核κ因子κ-B(NFkB)的效应的多个实验的集合的图。这表示为对照、TNF-α和INV-75+TNF-α处理的细胞的p65(NFkB的亚基)的细胞核对细胞质的比。进行总共3个实验。*，p＜0.01，使用ANOVA，与媒介物相比较。
图5A是显示固醇调节和结合蛋白-2(SREBP2)活性测量的过程(使用INV-75)的体外时程的图。用INV-75(0.1mM)刺激HepG2细胞4小时并且通过电泳迁移率变动测定(electrophoretic migration shift assay，EMSA)测量SREBP2对核蛋白质的结合活性。进行总共3个实验。*，p＜0.01，利用ANOVA，与媒介物相比较。
图5B是显示INV-75对SREBP2活性的剂量依赖性效应的图。用多个浓度的INV-75刺激HepG2细胞1小时，并且通过电泳迁移率变动测定(EMSA)测量SREBP2对核蛋白质的结合活性。进行总共3个实验。*，p＜0.01，利用ANOVA，与媒介物相比较。
图5C是显示在经处理的细胞的细胞质中通过估量成熟形式来测量的SREBP2激活(使用INV-75)的体外时程的图。用INV-75(0.1mM)刺激HepG2细胞4小时，通过western印迹分析测量SREBP2的成熟和前体形式。进行总共3个实验。*，p＜0.01，利用ANOVA，与媒介物相比较。相应的western印迹描绘于右边。时间在右边以小时表示。
图5D是显示利用成熟形式评估的INV-75对SREBP2激活的剂量依赖性效应的图。用多个浓度的INV-75刺激HepG2细胞1小时并且利用western印迹分析测量SREBP2的成熟和前体形式。进行总共3个实验。*，p＜0.01，利用ANOVA，与媒介物相比较。INV-75的剂量是对数摩尔浓度(log molar concentration)。
图5E是显示通过定量实时聚合酶链式反应(RT-PCR)评估的低密度脂蛋白受体(LDLR)信使RNA(mRNA)的时程(使用INV-75)的图。进行总共3个实验。*，p＜0.01，利用ANOVA，与媒介物相比较。
图5F是显示利用INV-75进行的低密度脂蛋白受体(LDLR)信使RNA(mRNA)的测量的剂量依赖性实验的图。用多个浓度的INV-75刺激HepG2细胞1小时并且通过定量实时聚合酶链式反应(RT-PCR)测量LDL mRNA表达。进行总共3个实验。*，p＜0.01，利用ANOVA，与媒介物相比较。INV-75的剂量是对数摩尔浓度。
图6A显示使用乙酰-CoA氧化酶(ACO)作为替代物利用INV-75进行的过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)的体外评估。ACO是PPAR-α调控的基因。用INV 75(100μM)刺激HepG2细胞，进行指定的时间，通过实时RT-PCR分析ACO的mRNA表达水平。n＝3。*，p＜0.05，与0时相比。
图6B显示使用用与萤光素酶受体连接的全长人PPARα转染的HepG2细胞，利用INV-75产生的ACO的体外激活。用INV-75刺激细胞4小时，并且通过实时RT-PCR分析乙酰辅酶A氧化酶(ACO)的mRNA表达水平。n＝3。*，p＜0.05，相对于-8.5。
图6C显示相对于通过高效特异性PPARα激活物WY 14643产生的激活，由INV-75产生的PPARα基因激活的时程实验。用全长PPARα启动子报告构建体转染HepG2细胞，然后用INV-75(100uM)进行刺激。C中的结果表示为相对于WY 14643的百分比增加。
图7是使用INV-75的体内WHHL兔实验方案的示意性举例说明。*表示用于斑块成像的MRI评估的时间安排。
图8A举例说明在3个不同的时间点(基线、6周和12周)上通过MRI测定的动脉粥样硬化斑块负荷的评估。
图8B是显示与对照WHHL兔相比较INV-75处理的WHHL兔的腹主动脉中动脉粥样硬化负荷减少的代表性MRI影像的集合。
图9是显示WHHL兔的对照组和INV-75组的腹主动脉中动脉粥样硬化负荷的条形图。n＝5/组。*，p＜0.05，相对于对照动物，利用非配对t检验。与接受对照干预的WHHL组相比较，WHHL兔中的动脉粥样硬化负荷减少大约60％。全部动物喂以高脂食物。
图10是INV-75处理的动物中Watanabe遗传性高脂血症兔(WHHL)的胸主动脉中巨噬细胞浸润的形态测定分析，*p＜0.05，相对于对照，利用非配对t检验。全部动物喂以高脂食物。
图11是通过对对照和INV-75处理的WHHL动物进行抗α肌动蛋白染色而进行的主动脉壁中平滑肌细胞(SMC)增殖的形态测定分析，*p＜0.05，相对于对照，利用非配对t检验。全部动物喂以高脂食物。
图12是通过对对照和INV-75处理的WHHL动物进行RedoilO染色而进行的主动脉壁中脂质沉积的形态测定分析，*p＜0.05，单因素方差分析。全部动物喂以高脂食物。
图13是通过对对照和INV-75处理的WHHL动物进行马森三色染色而进行的主动脉壁中胶原沉积的形态测定分析，*p＜0.05，单因素方差分析。全部动物喂以高脂食物。
图14A是显示INV-75在WHHL兔中对总胆固醇的效应(相对于对照)的图。在饲喂高脂食物(HFC)之前获得基线值。Post-HFC＝在开始高脂食物后但在用药物处理前获得的值。Post INV-75/对照表示在用INV-75的对照处理后的值。N＝4-5/组。总胆固醇值在组间没有差异。全部动物喂以高脂食物。该模型中高水平的总胆固醇可能妨碍对总胆固醇的显著效应的观察。
图14B是显示INV-75在WHHL兔中对控制LDL胆固醇的效应(相对于对照干预)的图。在饲喂高脂食物之前获得基线值。Post-HFC＝在开始高脂食物后但在用药物处理前获得的值。Post INV-75/对照表示在用INV-75的对照处理后的值。N＝4-5/组。LDL胆固醇值在组间无差异。全部动物喂以高脂食物。该模型中高水平的LDL胆固醇可能妨碍对总胆固醇的显著效应的观察。
图15是显示血管收缩剂(vasoconstrictor)血管紧张素II(AngII)对对照动物和INV-75处理的WHHL动物产生的收缩(氯化钾，KCl，120mM的％)的图，*p＜0.05，单因素方差分析，N＝4-5/组。全部动物喂以高脂食物。
图16是显示对照和INV-75处理的WHHL动物的胸主动脉中针对去氧肾上腺素的收缩的百分比(表示为针对氯化钾(KCl，120mM)的峰值收缩的百分比)的图，N＝4-5/组。全部动物喂以高脂食物。
图17是显示对照动物(相对于INV-75处理的动物)的胸主动脉环区段中通过乙酰胆碱(Ach)产生的松弛(由1μM去氧肾上腺素PE产生的预收缩的百分比)的图。单因素方差分析用于分析INV-75对对照的峰值松弛(n＝5/组)。***p＜0.001，相对于对照，关于通过乙酰胆碱产生的峰值松弛。在用INV-75或对照干预处理结束时在处死时从WHHL兔子获得胸主动脉。全部动物接受高脂食物。
图18是显示对照动物和INV-75处理的动物的胸主动脉环区段中由胰岛素产生的正常伸缩性(tone)松弛(由1μM去氧肾上腺素PE产生的预收缩的百分比)的图。
图19是显示处理结束时对照和INV-75处理的WHHL兔子的血浆中的氧化性应激的图，兔子血浆的8-表氧前列腺素F2α(8-异前列烷)酶联免疫测定用于测量氧化性应激的基线水平。N＝4-5只兔子/组。****p＜0.001，相对于对照，利用通过Bonferroni correction校正的学生氏t检验。
图20是显示对照动物(相对于INV-75处理的WHHL兔子)的胸主动脉中的氧化性应激的图。主动脉匀浆物的8-表氧前列腺素F2α(8-异前列烷)酶联免疫测定用于测量处理结束时对照和INV-75处理的WHHL兔子中的氧化性应激。N＝4-5只兔子/组。****p＜0.001，相对于对照，利用通过Bonferroni correction校正的学生氏t检验。
图21是显示通过二氢乙锭(DHE)染色定量的INV-75或对照对Watanabe遗传性高脂血症兔(WHHL)主动脉片段上基线原位超氧化物产生的效应的图，*，p＜0.01，INV-75与对照相比较，利用通过Bonferroni correction校正的学生氏t检验。
图22是显示通过光泽精化学发光测定分析的经历INV-75或对照干预的Watanabe遗传性高脂血症兔(WHHL)的主动脉组织裂解物中响应激动剂NADPH的基线和刺激的超氧化物产生的图。箭头指示NADPH(100mM)的加入；n＝5/组。*，p＜0.05，相对于对照动物，利用通过Bonferroni correction校正的学生氏t检验。全部动物喂以高脂食物。
图23是显示用于研究作为炎症标志物的VCAM-1、ICAM-1、P-选择蛋白、MCP-1和L-选择蛋白的基因表达水平的图。从经历INV-75或对照的WHHL兔子的胸主动脉制备总RNA。通过实时PCR分析促炎性基因的mRNA表达水平。*，p＜0.05；通过Bonferroni correction校正的学生氏t检验。全部动物喂以高脂食物。
图24是显示INV-75和对照干预对WHHL兔子中VCAM-1和ICAM-1表达的效应的图。利用Western分析来分析VCAM-1和ICAM-1的蛋白质表达水平。*，p＜0.05；通过Bonferroni correction校正的学生氏t检验。全部动物喂以高脂食物。
图25是显示作为炎症的细胞相关性的VCAM-1蛋白表达水平的图。INV-75在HUVEC中抑制TNFα诱导的VCAM-1表达。用媒介物、INV75或WY-14643预处理HUVEC 2小时，然后用TNF α处理4小时。利用Western印迹分析VCAM-1的表达。显示3次独立实验的代表性概述。*，p＜0.05，相对于对照；#，p＜0.05，相对于TNFα。
图26是显示利用RT-PCR测量的INV-75对用INV-75或对照处理2周的喂以正常食物的C57BL/6小鼠中肝LDLR mRNA表达的效应的图。比较对照与INV 75处理组的结果。
图27是显示INV-75在降低用INV-75或对照处理2周的C57BL/6小鼠的LDL水平中的效应的图，*，p＜0.01，单因素方差分析。
图28是显示通过EMSA测量的INV-75对用INV-75或对照处理2周的喂以正常食物的C57BL/6小鼠中肝SREBP2的效应的图。
图29是用于测试新西兰白(NZW)兔模型中INV-7065在动脉粥样硬化中的效应的体内实验方案的示意性举例说明。
图30A是显示表明用INV-7065，硫辛酸和对照干预处理的高脂食物喂养的新西兰白(NZW)兔中动脉粥样硬化负荷的减轻的MRI研究的概述的条形图。*p＜0.05，单因素方差分析，相对于对照终点值。(n＝4-5/组)。
图30B显示在2个不同的时间点基线(A)和终点(B)(分别在球囊剥脱手术(balloon denudation surgery)后1周和12周)上在施用钆照影剂(contrast)后获得的体内MRI图像。显示了每一个组的代表性图像。注入造影剂前的腹主动脉成像显示，在球囊剥脱的动物中在12周的处理后，与对照组或硫辛酸处理组相比，INV-7065减少新西兰白(NZW)兔的主动脉的照影剂浑浊化。全部动物喂以高脂食物。
图31A是显示对照动物以及INV-7065和硫辛酸处理的动物的针对氯化钾(KCl，120mM)的收缩的百分比的图。去氧肾上腺素(PE)剂量反应。在用INV-7065，硫辛酸或对照(n＝4-5/组)处理总共14周后，将兔子处死，将胸主动脉区段置于肌动描记器室中。在于30mN的基线调上平衡2小时后，利用不同浓度的PE收缩主动脉区段。收缩表示为与用氯化钾产生的最大收缩的关系。*，p＜0.01，相对于硫辛酸或对照NZW兔，利用单因素方差分析。全部动物喂以高脂食物。
图31B是显示用INV-7065、硫辛酸或对照处理的新西兰白兔中胸主动脉区段响应胰岛素的血管松弛的图。利用PE(0.3μM)预收缩主动脉区段并且研究响应胰岛素的松弛。*，p＜0.01，相对于硫辛酸或对照NZW兔，使用单因素方差分析。(n＝4-5/组)。
图31C是显示在图31b中所述的对照、INV-7065和硫辛酸处理的动物中响应乙酰胆碱的血管松弛(由去氧肾上腺素PE(0.3μM)产生的预收缩的百分比)的图。*，p＜0.01，硫辛酸和INV-7065相对于对照NZW兔，利用单因素方差分析。硫辛酸与INV-7065之间的响应没有不同。(n＝4-5/组)。
图31D是显示如图31B中所述的对照、INV-7065和硫辛酸处理的喂以高脂食物的新西兰白兔中由硝普钠(SNP)产生的松弛(由去氧肾上腺素PE(0.3μM)产生的预收缩的百分比)的图。(n＝4-5/组)。
图32A是显示喂以补充有INV-7065、硫辛酸或对照的高脂食物的新西兰白(NZW)兔中INV-7065和硫辛酸对总胆固醇(TC)的效应的图(n＝4-5/组)。
与正常对照比较。
在图32A以及图32B、32C、32D和32E中，使用单因素方差分析(ANOVA)统计检验，用*表示p值＜0.05。
图32B是显示喂以补充有INV-7065、硫辛酸或对照的高脂食物的新西兰白(NZW)兔中INV-7065和硫辛酸对甘油三酯(TG)的效应的图。与对照处理的NZW兔相比较，INV-7065和硫辛酸降低甘油三酯水平。虽然对于INV-7065存在甘油三酯进一步减少的趋势，但这些结果不显著。
图32C是显示喂以补充有INV-7065、硫辛酸或对照的高脂食物的新西兰白(NZW)兔中INV-7065和硫辛酸对HDL的效应的图。对于硫辛酸和INV-7065，在基线和终点之间不存在差异。在喂以高脂食物的对照NZW兔中，HDL水平在饲喂高脂食物后降低，虽然这在统计学上不显著。
图32D是显示喂以补充有INV-7065、硫辛酸或对照的高脂食物的新西兰白(NZW)兔中INV-7065和硫辛酸对LDL的效应的图。与对照NZW兔相比较，硫辛酸和INV-7065组中的LDL水平更低。
图32E是显示喂以补充有INV-7065、硫辛酸或对照的高脂食物的新西兰白(NZW)兔(n＝4-5/组)中INV-7065和硫辛酸对VLDL的效应的图。与对照和硫辛酸处理的兔子相比较，INV-7065组中的VLDL水平显示降低。
发明详述
本发明通过提供新型亚甲二氧基酚化合物和其衍生物、制备其的方法和使用其治疗、预防或延迟心血管疾病、血管疾病和/或炎性疾病的发作和进展以及处于发生高血压、中风、心血管和肾病的风险中的I型和II型糖尿病和血脂异常患者的方法来大大地缓解了这些问题。术语患者在本文中是指动物和人。
本发明还提供了这些新型亚甲二氧基酚化合物和其衍生物在制备药剂中的用途，所述药剂用于治疗、预防或延迟心血管疾病、血管疾病和/或炎性疾病的发作和进展以及处于高血压、中风、心血管和肾病的风险中的I型和II糖尿病和血脂异常患者。
化学组合物
在一些实施方案中，本发明的化学实体包括由下式I描述的化合物：
Figure BDA0000049735770000111
用于R1的取代基包括但不限于下列：
氢，
Figure BDA0000049735770000112
乙酰基、乙酯、丙酯、丁酯、H3COC，
硫辛酰基，
Figure BDA0000049735770000114
二氢硫辛酰基，
Figure BDA0000049735770000115
阿魏酰基(ferulyl)，和
Figure BDA0000049735770000116
异构-阿魏酰基。
用于R2的取代基可以不存在或存在，并且包括但不限于下列：
Figure BDA0000049735770000117
-甲氧基、乙氧基、1至8个碳的支链烷基(branched alkyl)、乙酰基、硫辛酰基、二氢硫辛酰基、阿魏酰基和杂环例如咪唑、喹啉、异喹啉、噻唑烷二酮、吡咯烷、哌啶，
Figure BDA0000049735770000121
羧基、甲酯、乙酯、脂肪族酰胺(aliphatic amide)(1至3个碳)、脂环族酰胺例如吡咯烷、哌啶和芳酰胺如苯胺、经取代的苯胺，
Figure BDA0000049735770000122
胺，烷基化的(1至3个碳)胺，经由硫辛酸、二氢硫辛酸、芳香酸如阿魏酸、肉桂酸的酰胺官能团，从脯氨酸、经取代的脯氨酸、2-哌啶酸(pipecolinic acid)衍生的杂环酰胺，和
Figure BDA0000049735770000123
卤素取代、氟、溴、氯、碘。
用于R3的取代基可以存在或不存在，并且包括但不限于下列：
烷基，正链(normal chain)(1至3个碳)和支链的(3至5个碳链)，
具有游离羧酸、酯和酰胺的官能团的烷基以及游离羟基和烷基化醚衍生物，
烷基(1至3个碳链)，其具有选自下列的官能团，胺、烷基化的胺、脂肪族、芳香族和杂环酰胺包括咪唑、喹啉、异喹啉、噻唑啉(thiozoline)、噻唑烷二酮、哌嗪、CH2CH2-噻唑烷二酮、CH2CH2CH3-CO-硫辛酰基、CH2CH2-F，或
卤代的基团例如烷基氟化物(1至3个碳链)。
本发明的特定实施方案包括但不限于下列化合物：
Figure BDA0000049735770000124
INV-73＝3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯
Figure BDA0000049735770000125
INV-75＝3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯
INV-74＝3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚
INV-7065＝3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯
Figure BDA0000049735770000132
INV-7465＝3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯
Figure BDA0000049735770000133
药物组合物
为了给动物或人施用，将本发发明的治疗性化合物或分子与可接受的载体组合以形成药物组合物并且给动物或人施用。可在使用或施用前在任何药学可接受的载体中重构本发明的治疗性化合物。
药学可接受的载体
药学可接受的载体：可用于本公开内容的药学可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences，by E.W.Martin，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)描述了适合于本文描述的一种或多种治疗性化合物或分子的药物递送的组合物和制剂。
通常，载体的性质将取决于待使用的特定施用模式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射液体(其包括药学上和生理上可接受的液体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等)作为媒介物。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒性固体载体可包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体外，待施用的药物组合物可包含少量无毒性辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯(sorbitan monolaurate)。
施用的代表性方法、制剂和剂量
可将提供的治疗性化合物与药学可接受的载体或媒介物组合以施用给人或动物受试者。在一些实施方案中，可将多于一种的治疗性化合物组合以形成单一制剂。可以以单位剂型方便地提供治疗性化合物和使用常规制药技术制备所述化合物。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。一般地，通过均一和紧密地将活性成分与液体载体结合来制备制剂。适合于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射液(其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期的受者的血液等渗的溶质)；以及水性和非水性无菌悬浮液(其可包括混悬剂和增稠剂)。可以在单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中提供制剂，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下进行贮存(在即将使用之前只需要加入无菌液体载体例如注射用水)。可从本领域技术人员通常使用的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备临时注射液和悬浮液。
在某些实施方案中，单位剂量制剂是包含一个剂量或单位或其适当分数的施用成分的制剂。应当理解，除了上文中特别提及的成分外，本文中包括的制剂可包括本领域技术人员常用的其他试剂。
可通过不同途径例如口服(包括口腔和舌下)、直肠、胃肠外、气雾剂、经鼻、肌内、腹膜内、血管内、静脉内、动脉内、关节内、皮下、真皮内和局部施用途径来施用本文中提供的药物组合物，包括用于治疗病症例如心血管疾病的药物组合物。它们可以以不同的形式(包括但不限于溶液，乳液和悬浮液，微球体，颗粒，微粒，纳米颗粒和脂质体)施用。在一个实施方案中，将治疗性化合物与可接受的载体组合以形成用于以丸剂、胶囊或与食物一起口服施用的药物组合物。
在另一个实施方案中，可能期望将药物组合物局部施用至需要治疗的区域。这可以通过例如但不限于下列来实现：在手术期间的局部或区域性灌注或输注、至血管例如动脉粥样硬化血管内的直接输注、局部应用(例如，创伤敷料、药物包被的支架)、注射、导管、栓剂或植入(例如，由多孔的、无孔的或凝胶状的材料形成的植入物，包括膜例如硅橡胶膜或纤维)等。在一个实施方案中，可通过在待治疗的组织位置(或以前的位置(former site))例如心脏或外周血管系统直接注射来进行施用。在另一个实施方案中，药物组合物可以在小囊泡(vesicle)中、在特定的脂质体中递送(参见，例如，Langer，Science 249：1527-1533，1990；Treat等人，于Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，N.Y.，pp.353-365，1989中)。还可使用施用方法的组合，例如在放置用本发明的治疗性化合物包被的支架之前、之后或期间，全身性或局部输注本发明的治疗性化合物。
在另一个实施方案中，可以在控释系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见，例如，Langer Science 249：1527-1533，1990；Sefton Crit.Rev.Biomed.Eng.14：201-240，1987；Buchwald等人，Surgery 88：507-516，1980；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574-579，1989)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参见，例如，Ranger等人，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61-64，1983；Levy等人，Science 228：190-192，1985；During等人，Ann.Neurol.25：351-356，1989；和Howard等人.，J.Neurosurg.71：105-112，1989)。还可使用其他控释系统，例如由Langer撰写的综述(Science 249：1527-1533，1990)中论述的系统。
有效的药物组合物的量取决于待治疗的病症或病况的性质以及病症或病况的分期。可通过标准临床技术确定有效量。待用于制剂的精确剂量还取决于施用途径，并且应当根据卫生保健医生的判断和各受试者的情况来确定。这样的剂量范围的实例是单个剂量或分份剂量的0.1至200mg/kg体重。其他剂量范围包括单个剂或分份剂量的1.0至150mg/kg、1.0至100mg/kg、5.0至100mg/kg、10至75mg/kg体重。应当理解，可使用这些范围内的任何剂量。
用于任何特定受试者的特定剂量水平和给药频率可发生变化并且将取决于多种因素，包括特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间长度、年龄、体重、整体健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄速率、药物组合和正在经历治疗的受试者的病况的严重度。
可在整个治疗期间以大约相同的剂量、以不断升高的剂量方案或以负荷剂量方案(loading-dose regime)(例如，其中负荷剂量为维持剂量的约2至5倍)施用本公开内容的药物组合物。在一些实施方案中，可在治疗过程中基于正在治疗的受试者的状况、疾病或病症的严重度、对治疗的表观反应和/或其他因素(如由本领域技术人员判断的)改变剂量。施用的体积视施用途径变化而变化。例如，肌内注射的范围可在大约0.1ml至大约1.0ml之间。本领域技术人员了解用于不同施用途径的适当体积。
待治疗的疾病或病症
本发明提供了新型亚甲二氧基酚化合物和其衍生物，制备其的方法和使用其治疗或预防血管疾病(包括但不限于心血管疾病、脑血管疾病、外周血管疾病和糖尿病性血管疾病)、炎性疾病或相关病症和许多其基础风险因素的方法。
此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物具有预防动脉粥样硬化的进展的能力。因此，此类化合物可用于在个体例如处于发生动脉粥样硬化的风险中的个体中预防斑块的积累和延迟或预防动脉粥样硬化。由于此类化合物对于预防斑块的积累和延迟或预防动脉粥样硬化是有用的，因而可施用其以预防或减少心脏病发作、中风、外周动脉疾病和血管重建事件(冠状动脉旁路移植手术或下肢搭桥术)的发生。
此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物具有抗炎性质，如至少由对转录因子核因子κB(NFkB)的激活的效应所证明的。因此，此类化合物可用于多种炎性病症，包括但不限于动脉粥样硬化、糖尿病、炎性关节炎(类风湿性关节炎、银屑病关节炎)、高血压和衰老。例如，可将此类化合物与可接受的载体组合并且给最近遭受心脏病发作或中风的患者或最近已经历对冠状或外周动脉血管的经皮介入的患者施用。此类组合物还可用于给在冠状动脉和外周动脉中接受支架的患者施用。
鉴于它们在改善血管胰岛素敏感性中的作用，此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物在糖尿病和预防糖尿病性血管疾病(包括糖尿病性心脏病、糖尿病性肾病和糖尿病性脑血管疾病)中将具有保护作用。
此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物还影响转录因子，固醇调节和结合蛋白-2(SREBP-2)。此类化合物用作SREBP-2的转录后激活物并且代表新种类的SREBP-2的选择性激活物。SREBP-2的增加增加了LDLR并且降低了LDL胆固醇水平。因此，此类化合物可用于治疗与升高的LDL水平相关的高脂血症例如杂合性家族性高胆固醇血症和纯合性家族性高胆固醇血症、混合性高脂血症、VLDL胆固醇和糖尿病性血脂异常的升高。
联合治疗
鉴于此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物在动脉粥样硬化和炎症中提供的显著有益性，还可将它们与本领域技术人员已知的在动脉粥样硬化和炎症中有效的其他治疗(包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、脂肪吸收抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、PPAR-α(例如，罗格列酮(Rosiglitazone)、吡格列酮(Pioglitazone))和PPAR-γ激动剂(吉非贝齐、非诺贝特、苯扎贝特)、乙酰水杨酸、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂(Anacetrapib)、硫辛酸和β-阻断剂及其组合)组合施用。
可单独地或与另一种治疗性化合物一起施用本发明的此类亚甲二氧基酚化合物和其衍生物。本发明的组合物与一种或多种另外的治疗性化合物的此类施用可分开地进行。可选择地，可将本发明的组合物以及一种或多种另外的治疗性化合物组合在一次施用或递送方法中，例如组合在一个胶囊、一个囊片或一次静脉内施用中。
ACE抑制剂
ACE抑制剂是抑制血管紧张素I通过酶血管紧张素转换酶(ACE)转化成血管紧张素II的化合物。血管紧张素II阻止血管松弛和扩张，从而升高血压。ACE抑制剂被用于治疗高血压，属于抗高血压种类的药物并且可减小死于心血管疾病的风险20％至40％。抑制ACE允许血管松弛并且降低血压。ACE抑制剂降低小动脉阻力和增加静脉容量，增加心输出量和心脏指数(cardiac index)、每搏功(stroke work)和容积，降低肾血管阻力和导致增加的尿钠排泄(natriuresis)(尿中钠的排泄)。流行病学和临床研究已显示，ACE抑制剂不依赖于其降血压作用而减弱糖尿病性肾病的进展。ACE抑制剂的该作用用于预防糖尿病性肾衰竭。
已显示ACE抑制剂甚至在具有正常血压的患者中对于除了高血压外的适应症是有效的。在此类患者中使用最大剂量的ACE抑制剂(包括用于预防糖尿病性肾病、充血性心力衰竭、预防心血管事件)是合理的，因为其不依赖于ACE抑制剂的降血压效应而改善了临床结果。
通常，不给具有肾脏问题或具有低血压的患者使用ACE抑制剂，虽然具有低血压的患者令人惊讶地通常充分耐受ACE抑制剂。不应当将ACE抑制剂用于孕妇。一些ACE抑制剂被用于治疗充血性心力衰竭或可被用于由医生确定的其他病况。
可基于化合物上的官能团的存在分类ACE抑制剂。例如，含巯基化合物包括卡托普利(
Figure BDA0000049735770000191
Bristol-Myers Squibb)。含二羧酸化合物包括依那普利(
Figure BDA0000049735770000192
Merck)、喹那普利(
Figure BDA0000049735770000193
Pfizer)、赖诺普利(
Figure BDA0000049735770000194
Merck，或Zestril，Astra-Zeneca)、培哚普利(
Figure BDA0000049735770000195
Rhone-Polenc Rorer)和雷米普利(
Figure BDA0000049735770000196
Hoechst Marion Roussel，King Pharmaceutieals)。含磷酸化合物包括培哚普利(
Figure BDA0000049735770000201
Rhone-Polenc Rorer)。
其他ACE抑制剂包括贝那普利(
Figure BDA0000049735770000202
Novartis)、福辛普利(Bristol-Myers Squibb)、莫昔普利(
Figure BDA0000049735770000204
SchwarzPharma)、群多普利(
Figure BDA0000049735770000205
Knoll Pharmaceutical(BASF))等。可将ACE抑制剂分类为巯基、磷酸和二羧酸化合物。
在此类化合物当中，几种ACE抑制剂通常被用作抗高血压药。此类抑制剂包括贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利和群多普利。
几种ACE抑制剂通常用作血管扩张剂或用于治疗充血性心力衰竭。此类抑制剂包括贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、喹那普利、雷米普利和群多普利。
赖诺普利、卡托普利、雷米普利和群多普利在心脏病发作后用于一些患者。在心脏病发作后，一些心肌被破坏和削弱。心肌可随时间流逝而持续衰弱。这使得心脏更难以泵动血液。可在心脏病发作后24小时内开始使用赖诺普利以增加存活率。卡托普利、雷米普利和群多普利帮助减缓心脏的进一步衰弱。
卡托普利还用于在一些使用胰岛素控制其糖尿病的糖尿病患者中治疗肾脏问题。随着时间流逝，这些肾脏问题可能恶化。卡托普利可帮助减缓肾脏问题的进一步恶化。
雷米普利被用于与ACE抑制剂一起治疗血管疾病和相关病症，包括但不限于具有冠状动脉疾病、充血性心力衰竭、高血压以及伴有高血压的糖尿病的患者。
本文中未列出的但对减少或抑制血管紧张素I至血管紧张素II的催化具有作用的其他化合物也预期用于本发明。
在一个实施方案中，ACE抑制剂的量为约0.1mg/天至约100mg/天。在其他实施方案中，以约1mg/日至约80mg/日的剂量施用ACE抑制剂。在其他实施方案中，以约5mg/日至约50mg/日的剂量施用ACE抑制剂。以每日5、10或20mg的起始剂量施用一剂ACE抑制剂。
α硫辛酸
α硫辛酸，也称为硫辛酸，是二硫化物化合物，其是体内至关重要的产生能量的反应中的辅因子。其也是有效的生物抗氧化剂。α硫辛酸曾经被认为是动物和人的维生素。然而，存在某些情况例如糖尿病性多发性神经病变，其中α硫辛酸可能是有条件地必需的。α硫辛酸被广泛地发现于植物和动物来源中。
大多数α硫辛酸参与的代谢反应在线粒体中发生。此类反应包括通过丙酮酸脱氢酶复合物进行的丙酮酸(以丙酮酸盐的形式)的氧化和通过α酮戊二酸脱氢酶复合物进行的α酮戊二酸的氧化。其也是用于通过支链α酮酸脱氢酶复合物进行的支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的氧化的辅因子。
α硫辛酸在德国被批准用作治疗多发性神经病变例如糖尿病性和酒精性多发性神经病变以及肝病的药物。α硫辛酸包含手性中心且由两个对映体天然R-或D-对映体和S-或L-对映体组成。α硫辛酸的商业制剂由外消旋混合物即R-和S-对映体的50/50混合物组成。
α硫辛酸和其经还原的代谢产物二氢硫辛酸(DHLA)形成氧化还原耦(redox couple)并且可清除范围广泛的活性氧种类。α硫辛酸和DHLA都可清除羟基自由基、一氧化氮自由基、过氧亚硝酸盐、过氧化氢和次氯酸盐。α硫辛酸但非DHLA可清除单态氧，并且DHLA但非α硫辛酸可清除超氧化物和过氧基活性氧种类。
已显示外源性α硫辛酸在工作心脏模型(working heart model)中在缺氧后再充氧过程中增加ATP的产量和主动脉血流量。据认为这归因于其在线粒体中在丙酮酸盐和α酮戊二酸的氧化中的作用。该活性和可能地其抗氧化剂活性可解释其在糖尿病性多发性神经病变中的可能益处。
已在动物中进行了大部分药物代谢动力学研究。α硫辛酸被小肠吸收并且通过门静脉循环被分配至肝和通过体循环被分配至体内的各种组织。天然R对映体比S对映体更容易被吸收，从而是更具活性的形式。α硫辛酸容易地穿过血脑屏障。在其被分配至各种身体组织后，在细胞内、线粒体内和细胞外发现了其。
二氢硫辛酸
α硫辛酸通过线粒体硫辛酰胺脱氢酶代谢成其还原形式二氢硫辛酸(DHLA)。DHLA和硫辛酸一起形成氧化还原耦。其还被代谢成硫辛酰胺，硫辛酰胺在催化丙酮酸和α酮戊二酸的氧化脱羧的多酶复合物中用作硫辛酸辅因子。α硫辛酸可被代谢成二硫辛酸，其可进行分解代谢。
迄今为止，达到每日600毫克的剂量的α硫辛酸已被良好耐受。在一些病症例如糖尿病性神经病变中，以分份剂量的形式每日施用300毫克α硫辛酸。
如上针对α硫辛酸所描述的，还可将二氢硫辛酸(DHLA)与ACE抑制剂一起使用。
在本发明的一个实施方案中，施用的硫辛酸或硫辛酸衍生物的量为约1mg/日至约1000mg/日。在其他实施方案中，以约10mg/日至约600mg/日的剂量施用硫辛酸或硫辛酸衍生物。在其他实施方案中，以约100mg/日至约400mg/日的剂量施用硫辛酸或硫辛酸衍生物。以300mg、400mg、500mg或600mg的起始日剂量施用一剂硫辛酸或硫辛酸衍生物。
他汀(statins)
可与本发明的组合物或其组合组合的另一种疗法包括他汀。
他汀(或HMG-CoA还原酶抑制剂)形成一类降血脂药(hypolipidemic agent)，用作在具有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中的人中降低胆固醇水平的药物。其通过抑制酶HMG-CoA还原酶(牵涉胆固醇合成速率的酶)引起胆固醇降低。在肝中该酶的抑制刺激LDL受体，这导致LDL从血流的清除增加以及血液胆固醇水平的降低。在一周的使用后可看到第一结果并且该效应在4至6周后最大。
他汀包括阿托伐他汀
Figure BDA0000049735770000221
氟伐他汀洛伐他汀
Figure BDA0000049735770000223
美伐他汀、匹伐他汀
Figure BDA0000049735770000224
Figure BDA0000049735770000225
Pravastatin
Figure BDA0000049735770000226
瑞舒伐他汀
Figure BDA0000049735770000227
和辛伐他汀
在一个实施方案中，他汀的量为约1mg/日至约100mg/日。在其他实施方案中，以约10mg/日至约80mg/日的剂量施用他汀。在其他实施方案中，以约20mg/日至约60mg/日施用他汀。
其他有用的治疗剂
还可将本发明的药物组合物与一种或多种本段落中公开的治疗物质一起施用。可施用抗炎药物例如阿司匹林。脂肪酸重吸收抑制剂依泽替米贝(
Figure BDA0000049735770000231
MSP Singapore Company，LLC，Whitehouse Station，NJ)也可用于本组合物。还可将依泽替米贝与他汀组合以产生组合药物例如
Figure BDA0000049735770000232
(MSP Singapore Company，LLC，Whitehouse Station，NJ)。还可施用减少血小板聚集的倾向(例如硫酸氢氯吡格雷)或凝血的倾向(例如肝素)的药物。对心血管系统具有直接或间接作用的试剂包括在该分类中，包括但不限于烟酸，贝特类药(fibrates)例如非诺贝特和吉非贝齐，以及噻唑烷二酮。
下列实施例用于进一步举例说明本发明，然而同时不构成对本发明的任何限制。相反地，应清楚地理解，本发明包括各种实施方案，其变动和等同物，在阅读本说明书后，本领域技术人员可以理解，其没有背离本发明的精神。
实施例1
3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯、3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯和 3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚的合成
从3，4-亚甲二氧基苯酚(也称为芝麻酚)[#1]合成3，4-亚甲二氧基 苯基乙酸酯(也称为O-乙酰亚甲二氧基苯酚)[#2]。
在步骤I中，通过3，4亚甲二氧基苯酚[#1]的乙酰化制备中间化合物(3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯，在本文中也称为O-乙酰亚甲二氧基苯酚和INV-73)。
在该实施例中，使用乙酸酐来实现乙酰化。乙酰化的产物用作许多其他衍生组合物例如硝基、氨基和羧基衍生物的起始点。然而不希望受到理论束缚，本发明者相信乙酰基官能团可以以与阿斯匹林(乙酰水杨酸)中的乙酰基类似的能力起作用并且可用于抑制血小板的凝集。
Figure BDA0000049735770000241
在步骤II中，如下实现从3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯[#2，INV-73]合成3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(在本文中也称为O-乙酰硝基亚甲二氧基苯酚或INV-75)：
Figure BDA0000049735770000242
在步骤III中，如下实现从3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯[#3，INV-75]合成3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(在本文中也称为硝基亚甲二氧基苯酚和INV-74)[#4]：
Figure BDA0000049735770000243
实施例2
3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(在本文中也称为O-乙酰硝基 亚甲二氧基苯酚或INV-75)的生物学测试：体外研究
细胞培养：使用培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs--Gibco，Invitrogen)进行全部实验并且在5％CO2潮湿培养箱中于37℃下将其在组织培养瓶上培养至汇合，所述组织培养瓶之前用在补充培养基(具有10％的热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、10mM HEPES，pH 7.4、肝素12 I.U./ml、1％视网膜源性生长因子的M199，Sigma)中的1％明胶包被。在胰蛋白酶处理后，从培养瓶分离细胞，通过将HUVEC接种在预先包被明胶的培养板上，然后温育24至48小时以确保汇合来制备最终的单层。将培养多至第4代的细胞用于全部实验。重组人TNF-α购自R&D Systems(Minneapolis，MN)。
细胞毒性测定：利用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物]测定(用于评估细胞活力的商购可得的测定)评估细胞毒性。将INV-75加至HUVEC，进行24小时，在该时期结束时进行毒性测定。MTT测定依赖于通过线粒体脱氢酶进行的带正电荷的四唑盐至其强烈着色的甲臜(formazan)产物的细胞还原。甲臜产量在受损的线粒体氧化还原功能和增加的自由基产量存在的情况下减少，从而可用作响应实验干预的细胞活力的指标。
简而言之，在从培养箱取出微量滴定板后，向孔中加入含有固定体积的重构的MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物；终浓度：0.5mg/ml]的新鲜培养基；将板在5％ CO2环境中于37℃下保持2小时，然后加入由制造商提供的MTT增溶溶液。通过将带正电荷的四唑盐转化成还原状态而形成的甲臜产物具有低水溶性并且以紫色晶体存在。用增溶缓冲液(试剂盒中提供的)溶解甲臜允许方便定量其形成。然后在酶标仪(absorbance plate reader)上测量各孔在OD 570 nm处的光密度。测定内和测定间的变化性分别为3和5％。如上所述，使用MTT测定在基于细胞的测定中测试不同浓度的INV-75。测试的浓度范围在1mM至10nM之间并且将细胞持续暴露24小时以上(图2)。
这些结果证明，与在1mM处的74％相比较，直至100mM的浓度导致2％、4％、8％和7％的细胞展示毒性(在10nM、100nM、1μM、10μM和100μM处)(p＝0.001，将1mM与所有其他剂量相比较)。这些结果与对于其他化合物INV-73、INV-74和INV-7065获得的结果一致。这些结果确认了INV-73、INV-74、INV-7065在10nM至100μM的剂量范围内的安全性。
酶联免疫吸附测定(ELISA)：为了测量细胞表面粘着分子的表达，使用ELISA技术(R and D Systems，Minneapolis，MN)。在用2ng/mL TNF-α刺激6小时之前，用不同浓度(1mM，10μM，1μM，100nM和1nM)的INV-75预处理96孔板中汇合的人脐带HUVEC，进行24小时。
在用INV-75预处理的一个实验后培养基的ELISA分析结果示于图3中，该结果显示ICAM-1和VCAM-1的释放显著减少(未显示统计值)。在随后的实验中，我们还利用western印迹测试了INV-75对VCAM-1的表达的效应。这些结果显示，INV-75预处理而非单独的对照(媒介物)处理引起VCAM-1蛋白水平的降低(参见部分和图24)。
NF-κB转运测定：细胞因子例如TNF-α和白细胞介素-1(IL-1)激活内皮细胞中的促炎应答(pro-inflammatory response)。该应答中的早期事件是NF-κB转录因子的核转运。该转运引起促炎基因例如粘着分子VCAM-1、ICAM-1和E-选择蛋白的转录被诱导。
NF-κB是异二聚体，由p65和p50亚基组成。通过在固定的细胞中免疫定位NF-κB的p65亚基来监控核转运并且通过测量细胞核比细胞质NF-κB信号的比来对其进行定量。受刺激的细胞例如原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中NF-κB的核转运因而提供读出(readout)，该读出可用于研究生物活性化合物对内皮对促炎性刺激物的应答的作用。用不同浓度(10nM至1μM)的INV-75或对照(无[INV-75)预处理HUVEC 24小时。然后将培养基更换成含有10ng/ml TNFα或1μg/ml牛血清白蛋白(媒介物)的培养基，进行6小时。将p65分布计算为目的区域的细胞质和细胞核中的强度。使用至少5个细胞/高倍视野和使用至少5个高倍视野/药物浓度。然后将强度表示为每高倍视野至少5个细胞的细胞核比细胞质染色的比。然后将数据表示为在TNF-α不存在的情况下的细胞核比细胞质的比。
在评估NF-κB激活的可选择实验中，使用提取试剂从HUVEC细胞提取细胞核和细胞质级分，所述细胞在用2ng/mL TNF-α刺激6小时之前已用不同浓度的INV-75预处理了6至24小时。在TNF-α刺激6小时后，利用western印迹分析估计VCAM-1和ICAM-1的表达。然后如上所述利用western印迹分析细胞核和细胞质提取物中的p65水平。INV-75对NF-κB转运的效应显示，INV-75从10nM浓度开始抑制p65至细胞核的转运。
利用INV-75的多个实验的集合示于图4中。比较用单独的媒介物处理的对照细胞响应TNF-α和在与药物一起温育24小时后响应TNF-α的之间的细胞核比细胞质的比。使用INV-75的预处理导致细胞核p65表达的显著抑制(n＝3，p＜0.01，利用单因素方差分析)。
固醇调节元件结合蛋白(SREBP-2)的研究和结果：
称为SREBP(固醇调节元件结合蛋白)的转录因子家族调节胆固醇和脂肪酸的合成。在这类转录因子当中，SREBP-2主要通过改变胆固醇合成酶和LDL受体表达来调节胆固醇生物合成(SREBP-1c主要调节脂肪酸合成)。SREBP-2主要通过转录后机制被调节并且在从内质网运输后在高尔基体中被加工成成熟形式。为了研究INV-75对SREBP的效应，进行下列体外实验：用INV-75(0.1mM)刺激HepG2(人肝癌细胞系)4小时，通过电泳迁移率变动测定(EMSA)测定相应的SREBP2细胞核结合。分析该剂量的时程和剂量依赖性。然后我们利用western分析评估细胞质中SREBP-2的前体和成熟形式的表达。分析SREBP-2的成熟形式的时程和剂量依赖性。
图5A和5B描述了INV-75对SREBP-2的细胞核结合的效应。在处理后1小时内，INV-75增加SREBP-2的细胞核结合(图5A)。低至100nM的剂量在诱导SREBP-2至细胞核的转运中是有效的。图5B提供了两个这样的实验的集合。
图5C和图5D提供了INV-75对细胞质中SREBP-2的加工的时程。这些数据表明，INV-75以剂量依赖方式快速增加SREBP-2从前体(未成熟形式)至成熟形式的加工，低至10nM的剂量在增加SREBP-2的成熟形式中具有作用。
然后，我们使用相似的方案在相同的细胞中观察INV-75在调控LDL受体的表达中的效应，从而评估剂量和时间依赖性。图5E和5F描述了响应INV-75的LDL受体表达的时程和剂量依赖性。这些结果明确地显示INV-75以时间依赖性和剂量依赖性方式增加LDL受体表达。结合起来，这些结果表明INV-75可通过SREBP-2依赖性途径增加LDL受体表达。INV-75对SREBP-1调控没有效应(数据未显示)。同时测试了参与胆固醇合成和调控的多个基因，载脂蛋白基因的表达和PCSK9(蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的表达。已知后一种基因通过结合低密度脂蛋白受体(LDLR)的表皮生长因子样重复A(EGF-A)结构域，诱导LDLR降解来调控LDL受体表达。目前正将PSCK9功能的抑制开发为降低胆固醇水平的方法。结果显示INV-75对PCSK9表达没有效应。
PPAR激活测定和结果
我们在HepG2细胞中使用报告基因测定筛选过氧化物酶体增殖物激活受体的激动剂。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)和细胞核激素受体家族的其他成员是用于治疗代谢疾病的重要药物靶。PPAR分别在脂质和葡萄糖代谢中起着至关重要的作用。因此，帮助快速鉴定此类受体的激活物的筛选方法应当是极具价值的。INV-75以剂量依赖和时间依赖方式激活经典PPARα基因，乙酰-CoA氧化酶(ACO)(图6A)。在INV-75存在的情况下进行时程实验达15小时。然后我们用人全长PPARα启动子-报告基因构建体转染细胞，并且证实INV-75增加萤光素酶激活(图6B)。在接下来的实验中，我们阐明了PPARα激活的时程并且显示其在1小时内激活并且对PPARα激活的持续作用达到15小时(图6C)。我们接着通过在用酵母GAL4-PPARα-LBD质粒+UAS-萤光素酶、GAL4-PPARδ-LBD质粒+UAS-萤光素酶和GAL4-PPARα-LBD质粒+UAS-萤光素酶转染的HepG2细胞中进行实验来测试INV-75对于PPARα的特异性。使用多个浓度的INV-75(1μM、10μM、100μM和1000μM)进行PPARα、PPARδ和PPARγ结合测定。萤光素酶活性的水平相应于PPAR激活的程度。将结果与经典PPAR激动剂例如WY-14643(PPARα激动剂)、苯扎贝特(PPARδ激动剂)和罗格列酮(PPARα激动剂)相比较。这些结果显示INV-75以选择性方式增加PPARα配体结合活性而对PPARα或PPARγ无作用。因此INV-75对PPARα激活具有选择性但部分激动剂性质。
实施例3
3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(在本文中也称为O-乙酰基硝 基亚甲二氧基苯酚或INV-75)的生物学测试：体内研究
在用INV-75处理的6只兔子中进行关于高胆固醇血症兔(Watanabe遗传性高脂血症兔，WHHL)的体内实验。4只兔用作对照。
动物模型：2月龄的重约2kg的WHHL兔购自Alabama的Brown Family，并且被关养在研究所的实验动物中心。将6月龄的兔子用于全部实验。让兔子自由获取水并且喂以来自Harlan Tekad TD 7251的高胆固醇食物(2％胆固醇)。动物管理和实验方案遵循国家批准的指南。使兔子经历的方案概述于图7中。将INV-75溶解于90％乙醇中并且喷洒在高脂肪食物上。然后将膳食-药物混合物真空干燥过夜以除去乙醇，然后用于饲喂兔子。
体内方案(兔子)：
每一个动物经历3个MRI研究：第一个研究在高脂肪饲喂之前(药物施用前的基线)；第二个研究在药物治疗的中点上；和最后一个研究在12周的药物治疗后(图7)。使WHHL兔在到达后适应它们的新环境，之后在高胆固醇食物喂养之前获得基线MRI测量值和血液工作(blood work)。使用INV-75的药物治疗始于高脂肪食物喂养后4至6周。在药物治疗过程中获得中点测量值。在研究结束时，全部动物经历MRI研究以进行斑块体积定量。在最后的MRI后立即无痛致死兔子，收获主动脉，并进行处理以进一步分析(组织病理学、基因和蛋白质表达)。研究方案由研究所动物研究委员会批准。通过肌内注射氯胺酮(30mg/kg)和赛拉嗪(2.2mg/kg)诱导麻醉处理(MRI研究)。用无菌工具在腹腔干上方切取约5cm的腹主动脉，将其在经高压灭菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中进行清洗，然后立即在液氮中冷冻，于-80℃下贮藏直至就基因和蛋白质的表达进行处理。全部动物遵照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”接受人护理。
非侵袭性MRI方案和结果
在相应的处理之前和之后，将高分辨率非侵袭性MRI用于评估动脉粥样硬化的程度。在指定的时间点上利用体内MRI扫描分析WHHL兔的腹主动脉中的粥样硬化斑块(图7)。该实验设计允许每一个动物用作其自已的对照，从而允许获得关于斑块进展/消退的真实连续数据以及允许处理组之间的比较。通过使用1.5-T磁铁(Magnetom Sonata，Siemens Medical Solutions，Erlangen，Germany)，使用环绕动物的相控阵心脏线圈(cardiac coil)进行MRI研究。使用梯度回波冠状和矢状图像定位腹主动脉，使用TURBO Flash序列从腹腔干上方至髂分叉处获得腹主动脉的连续横断图像(无间隙的3-mm厚的片段)。使用T1-加权梯度回波turbo FLASH方案(TR/TE 230/5.0，3个平均值，4.0mm的层面厚度，层面之间5.2mm的间隙以及约11分钟的获取时间)获得48个4mm-厚的轴向层面(跨越大致髂分叉处至最高的肾的上极)。无呼吸或心脏门控是必需的，以便腹主动脉相对地无运动伪影。通过手工描绘外弹性膜(external elastic lamina，EEM)和腔缘(luminal border，L)以及使用Siemens Viewer软件测定每一个边界内的面积来测定斑块负荷。层面体积(V)计算为V＝(EEM-L)*4.0，使用公式TWV＝∑[(EEM-L)*4]计算每只动物的总壁体积并且以mm3表示。使用公式NWV＝(TWV/n)*m就可读层面的变化数量标准化各时间点上每一只动物的TWV；n＝各动物中可读层面的数量以及m＝在所有时间点上在全部动物中可读层面的平均数量。所有标准化的壁体积以mm3表示。利用连续体内MRI扫描分析兔腹主动脉的壁体积，粥样硬化斑块的指标。在用高胆固醇食物喂养4至6周后，WHHL兔具有比年龄匹配的喂养正常食物的新西兰兔更大的腹主动脉壁体积，从而证明已产生动脉粥样硬化。
图8A描述了使用INV-75的处理对斑块进展的影响，如MRI评估的。在基线(在HFC开始后但在INV-75开始前)、在药物治疗过程中的中点上和在即将处死之前进行MRI测量。将MRI研究转移至PC上以进行分析，使用Image J软件分析斑块体积。通过使用肾动脉至髂分叉处的距离使图像与解剖位置匹配，以便可获得关于动脉粥样硬化变化的真实连续数据。选择紧接腹腔干远端的主动脉用于血管壁测量。获取全部MRI图像并且在不知道研究方案(study arm)或组织病理学数据的情况下进行分析。对照和INV-75组中基线(在补充INV-75之前)处的平均(SEM)标准化壁体积(NWV)分别为0.27cm3(0.021cm3)和0.24cm3(0.0099cm3)。这些数据无显著不同(p＝0.2775，利用单因素方差分析)。
在用INV-75补充膳食6周后，与对照比较，腹主动脉中的壁体积显著减少。在研究中点，在用INV-75处理后，对照和INV-75组中平均(SEM)斑块体积分别为0.60cm3(0.037cm3)和0.35cm3(0.019cm3)。这些体积显著不同(p＝0.0004，利用单因素方差分析)。在12周结束时，接受INV-75处理的组中斑块的进展速率更显著地减慢，对照和INV-75组中壁体积(SEM)在第12周分别为0.66cm3(0.029cm3)和0.37cm3(0.025cm3)。这些体积显著不同(p＝0.0001，利用单因素方差分析)。与对照处理相比较，6周的更早时间点在统计上也是显著的。图8B描述了在不同时间点上经历对照或INV-75的动物中腹主动脉斑块的代表性MRI图像。
评估INV-75的抗动脉粥样硬化效应的形态测定分析
将胸降主动脉的片段包埋在Optimal Cutting Temperature化合物(Tissue-Tek，Sakura Finetek USA Inc，Torrance，Calif)中并且在干冰上冷冻。然后制备En面切片。为了分析动脉粥样硬化负荷，以20μm的间隔收集8个切片(4μm厚)。在H&E染色后，用数码相机拍摄每一个切片的数码图像，使用显微镜(具有Spot I数码相机的Zeiss Axioskop，Jena，Germany)利用国立卫生研究院(NIH)图像软件版本1.61进行分析。结果表示为mm2。在12周结束时胸主动脉中斑块负荷的形态测定评估确证了通过对腹主动脉进行MRI产生的INV-75的抗动脉粥样硬化效应。显示了WHHL兔的对照和INV-75组的腹主动脉中动脉粥样硬化负荷的概述。n＝5/组。*，p＜0.05，相对于对照动物，n＝4，使用非配对t检验。在WHHL兔中观察到约60％的动脉粥样硬化负荷的减少(与对照组相比较)(图9)。
免疫组织化学方法和结果：
使用一抗(1∶200的浓度)和检测系统(Immunoperoxidase Secondary Detection System；Chemicon International，Temecula，CA)进行免疫组织化学染色以评估炎性含量并且在用照相机系统(具有Spot I数码相机的Zeiss Axioskop)对图像进行数码化后，用软件(NIH Image)进行定量。抗CD68抗体购自Santa Cruz Biotechnology Incorporated(Santa Cruz，CA)。多克隆抗α肌动蛋白抗体获自Upstate Cell Signaling Solutions(Lake Placid，NY)。T细胞受体β抗体获自Biolegend(San Diego，CA)。为了定量染色，将4个阴性对照(无一抗)切片的平均密度设置为阈值，通过软件获得阳性区域。最终利用由外弹性膜至腔界面包括的面积或内膜体积来标准化结果。分别利用CD68和α-肌动蛋白免疫组织化学评估与对照组相比较INV-75对巨噬细胞和平滑肌细胞的效应。相对于对照，INV-75减少巨噬细胞的数量并且整个组的概述由图10中的条形图表示(n＝4-5只动物/组)。*p＜0.05，相对于对照动物，使用非配对t检验)。INV-75处理的组显示显著的对巨噬细胞浸润的抑制，如图10中举例说明的。INV-75增加平滑肌含量(总面积的百分比)(相对于对照)，组合的结果表示为条形图n＝5/组(n＝每组使用的动物的数量)。*p＜0.05，相对于对照动物。
p＜0.05表示3或更多个匹配的值为Gaussian，并且值在统计限制内。胸主动脉切片的免疫组织化学分析显示，CD68+细胞在动脉粥样硬化斑块中减少但平滑肌增殖增加(图10和图11)。
在用药物处理总共14周后鉴定主动脉中的脂质沉积，处死兔子并且将腹主动脉固定在4％的多聚甲醛中。然后通过油红染色显现主动脉壁中的脂质沉积。腹主动脉的Oil Red O染色显示与对照组相比较，斑块区域中脂质含量(计算为INV-75处理的动物的腹主动脉切片的阈值面积的百分比)减少。相对于对照，INV-75显著减少脂质含量(图12)。腹主动脉的马森三色染色显示与对照组相比较，斑块区域中胶原含量(计算为INV-75处理的动物的腹主动脉切片的阈值面积的百分比)减少(图13)。
脂质特征：TC、TG、HDL、LDL和VLDL
高胆固醇血症和氧化性应激在动脉粥样硬化的进展中具有重要的功能。通过分析基线和终点测量处的血液样品评估血液中的脂质(胆固醇和LDL)。在高胆固醇膳食开始时和在处死时，将1ml耳垂静脉的血液置于K EDTA管中。全部值表示为平均值±SD。提供在开始高脂食物之前的基线处、在高脂食物后但在干预之前和在用INV-75和对照干预结束时的每一组的总胆固醇和LDL胆固醇的条形图。(图14A和图14B)。在利用INV-75的处理结束时在总胆固醇或LDL胆固醇上不存在差异。效应的缺乏可能与具有极高的脂质值和LDL受体的突变的遗传模型(WHHL)相关。据信，INV 75通过增加LDL清除(通过LDL受体表达的增加)起作用，因此对LDL胆固醇和总胆固醇(该模型中基线处和响应高脂食物饲喂的主要脂蛋白的分数)的效应的缺乏是可以理解的。
内皮功能：研究血管生理效应的器官槽(Organ Chamber)实验
通过注射致死剂量的戊巴比妥无痛致死兔子。取出升主动脉，将2mm胸主动脉环在37℃下悬浮于充满生理盐溶液缓冲液(氯化钠，130mEq/L；氯化钾，4.7mEq/L；氯化钙，1.6mEq/L；硫酸镁，1.17mEq/L；磷酸氢钾，1.18mEq/L；碳酸氢钠，14.9mEq/L；EDTA，0.026mEq/L；和葡萄糖，99.1mg/dL[5.5mmol/L]；pH，7.4)、用氧气中的5％二氧化碳持续充气的单独的器官槽中。让血管在30mN的静息张力下平衡至少1小时，然后经历梯度剂量的激动剂，如之前描述的。血管收缩激动剂包括去氧肾上腺素(PE)、内皮素-1(ET-1)或血管紧张素II。响应表示为对120mEq/L氯化钾的峰值响应的百分比。充分清洗经历PE的血管，让其平衡1小时，然后开始使用乙酰胆碱、硝普钠(SNP)或胰岛素的实验。在利用PE(0.1μM)达到稳定的收缩平台期后，将环暴露于梯度剂量的内皮依赖性激动剂乙酰胆碱、胰岛素或不依赖于内皮的激动剂SNP。结果表示为由PE(0.1μM)产生的预收缩的百分比。充分清洗暴露于乙酰胆碱的环，让其平衡1小时。在利用PE(0.1μM)达到稳定的收缩平台期后，以累积的方式加入胰岛素，然后进行清洗和对SNP的剂量响应。结果表示为由PE(0.1μM)产生的预收缩的百分比。INV-75减少由血管紧张素II产生的主动脉收缩但对去氧肾上腺素没有影响(图15和图16)。
与对针对血管紧张素I I的响应的显著效应相反，INV-75对针对PE、内皮素-1的响应没有影响。INV 75对乙酰胆碱依赖性血管舒张没有显著效应和对胰岛素基本上无显著效应(图17和图18)。INV-75对SNP(内皮依赖性血管扩张剂)没有效应(结果未显示)。INV-75兔子中对血管紧张素II的减小的响应与血管紧张素II 1型受体的减少的mRNA表达平行(数据未显示)。表1举例说明WHHL兔的胸主动脉中对各种激动剂的响应的概述。
氧化性应激测量：8-表氧前列腺素F2α(8-异前列烷)酶联免疫测 定
在处死时从WHHL兔获得血浆和肝样品。通过在PBS中匀浆制备肝裂解物。将两种样品经历亲和纯化(Cayman Chemical，Ann Arbor，Mich)，然后使用Stat-8-Isoprostane ELISA试剂盒(Cayman Chemical，Ann Arbor，Mich)测量8-异前列烷。调整肝中蛋白质的水平。利用BCA蛋白质测定(Pierce，Rockford，I L.)测定肝裂解物中的蛋白质水平。
与对照组相比较，在INV-75组中血浆和主动脉匀浆物中8-表氧前列腺素F2α(8-异前列烷)的产量显著降低(图19，图20)。
通过二氢乙锭染色检测超氧化物(O 2 ·- )
在包埋于OCT化合物(
Figure BDA0000049735770000342
Sakura Finetek USA Inc，Torrance，CA)中的急冻主动脉组织中进行O2 ·-的原位检测。以20μm的厚度将组织样品冷冻切片，收集在Superfrost Plus载玻片(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)上，于-80℃下贮藏直到需要时。将从每一只大鼠(组织块)随机选择的4张载玻片在室温下置于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中30分钟，然后在湿盒中于暗处用PBS中的二氢乙锭(DHE，10μM，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)染色20分钟。用PBS充分漂洗载玻片，盖上盖玻片，用显微镜(具有Spot I数码相机的Zeiss Axioskop，Jena，Germany)进行数码成像。DHE可自由渗透入细胞并且在O2 ·-存在的情况下可经历双电子氧化以形成通过嵌入DNA而在细胞内被捕获的DNA结合荧光团溴化乙锭。该反应对于O2 ·-是相对特异性的，最低氧化由细胞过氧化物酶和过氧化氢诱导。为了进行抑制剂研究，在用DHE染色前，用300μM夹竹桃麻素(Sigma)、10μM二苯基碘(DPI，Fisher Scientific)或PEG-SOD(250U/ml)温育载玻片30分钟。整个组的结果的概述用条形图显示，*，p＜0.01，表示3或更多个匹配的值为Gaussian并且值在统计限度内。
结果显示用INV-75处理的组的主动脉中基础超氧化物的产量降低(图21)。
用于NADPH衍生的超氧化物(O 2 ·- )检测的光泽精化学发光：INV-75 的效应
氧化性应激牵涉动脉粥样硬化。衍生自NADPH的超氧化物(O2 ·-)可潜在地引发自由基链式反应(free radical chain reaction)，该反应可潜在地催化动脉粥样硬化斑块形成。在PBS中匀浆兔子的主动脉，将蛋白质浓度调整至5μg/μl。将20ul/孔的细胞裂解物于Kreps-Hepes缓冲液(pH＝7.4；最初充入95％O2和5％CO2)中置于96孔板上。使用5μM光泽精测量基线O2 ·-产量。通过加入NADPH(100μM)测量NADPH诱导的O2 ·-的产量。使用Berthold Luminometer LB 960进行测量。光度计设置为0.1s测量和30s动力学。
发现与正常对照相比较，主动脉组织裂解物中基础和刺激的超氧化物的产量更低，基于n＝5/组进行统计分析。*，p＜0.05，关于超氧化物的产量，相对于对照动物(图22)。
响应INV-75和对照的炎性基因和蛋白质的表达
由于血管炎症在动脉粥样硬化中起着中枢作用，因此促炎性基因的表达和蛋白质的表达的评估提供了关于INV-75的抗炎效应的另外信息。
定量RT-PCR分析
使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA。利用随机六聚物和ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen)逆转录4微克总RNA。使用Stratagene Mx3005，利用SYBER Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行定量实时PCR。获得与GAPDH相比较的相对表达水平。用于实验的引物描述于下表中并且购自Invitrogen。
表2：
Figure BDA0000049735770000361
Western印迹分析
在放射免疫沉淀测定缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1mM EDTA，1mM NaF，1mM Na3VO4)和1mM苯甲磺酰基氟，以及0.25％脱氧胆酸钠和1.0％Nonidet P-40)中匀浆和溶解样品，在10,000g和4℃下离心30分钟。收集上清液，将其经历Western印迹分析。简而言之，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离40μg蛋白质，然后将其转移至硝酸纤维素膜。然后将膜与：单克隆抗β肌动蛋白(Sigma，St.Louis，MO)、单克隆抗VCAM(R&D Systems，Minneapolis，MN)、单克隆抗ICAM(R&D Systems，Minneapolis，MN)、单克隆抗phospho-eNOS(pS1177)(BD Biosciences，Billerica，MA)、兔抗eNOS(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、兔抗phospho-Akt(Thr308)(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)、山羊抗Akt(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)和兔抗p65(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)一起温育。最后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗一起温育，用增强的化学发光试剂盒(Amersham Biosciences Inc.，Piscataway，NJ)进行显现。使用ImageJ通过密度测定分析定量条带密度。
INV-75减少VCAM-1、ICAM-1、MCP-1和L-选择蛋白在胸主动脉中的mRNA表达(图23)。我们通过在蛋白质水平上测量此类粘着分子的表达确证了INV 75对VCAM-1和ICAM基因在主动脉中的表达的效应。图24描述了VCAM-1和ICAM-1表达的western印迹分析的概述。INV-75显著减少VCAM-1和ICAM-1的蛋白质表达。
我们还已检查了细胞培养物中INV-75的效应以理解其对粘着分子VCAM-1的调控的效应。我们之前已显示iNV-75在HUVEC细胞中减少NF-kB的激活以及VCAM-1和ICAM-1的表达(参见图3和图4)。我们再次确认了这些发现但另外提出问题：这些结果是否与PPARα的激活(如之前在图6中所显示的，其中我们显示INV-75激活PPARα受体和PPARα调控的基因例如ACO)相关。用媒介物、INV-75或WY-14643预处理HUVEC2小时，然后用TNFα处理4小时。在该过程结束时分析VCAM-1的表达。显示了3个独立实验的代表性概述。*，p＜0.05，相对于对照；#，p＜0.05，相对于TNFα(图25)。这些实验表明对于INV-75看到的VCAM-1的减少可能与其对PPAR α激活的效应相关。
固醇调节元件结合蛋白(SREBP-2)活性：体内实验
由于我们之前已显示INV-75在细胞培养物中在调节SREBP-2和LDL受体中的效应，我们在小鼠模型(C57B1/6小鼠)中体内确认这些结果。为了研究INV-75对SREBP活性的效应，如下进行体内实验：用INV-75(20mg/kg/日，进行2周)腹膜内注射C57b1/6小鼠(6/组)。通过电泳迁移率变动测定(EMSA)测量肝匀浆物的核蛋白中SREBP2的结合活性。还同时研究肝中参与胆固醇合成和调控的多个基因，载脂蛋白基因的表达和PCSK9(蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的表达。已知PCSK9通过结合低密度脂蛋白受体(LDLR)的表皮生长因子样重复A(EGF-A)结构域，诱导LDLR降解来调节LDL受体表达。
结果显示INV-75显著降低LDL但不降低其他脂蛋白(图27)。这同时伴随肝中LDL受体表达的增加，如通过实时RT-PCR(图26)和western印迹(数据未显示)测量的。INV-75还显著激活SREBP2(调节LDLR的至关重要的转录因子)，如通过电泳迁移率变动测定(EMSA)测量的(图28)。
这些结果确认INV-75可通过激活SREBP2上调LDLR，从而降低LDL胆固醇水平。这些结果进一步加强我们的发现：INV-75对LDL的降低具有显著的有益效应。
实施例4
从亚甲二氧基苯酚和d1-硫辛酸合成3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯 (O-硫辛酰基亚甲二氧基苯酚)(INV-7065)。
化合物3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(C15H18O4S2)(在本文中也称为O-硫辛酰基亚甲二氧基苯酚和INV-7065)具有326.43的分子量(MW)和具有C15H18O4S2的分子式。通过在氮气氛下使用卤化溶剂处理硫辛酸和亚甲二氧基苯酚来制备INV 70-65。
在250mL圆底烧瓶中，在室温下将4.5g(0.033摩尔)3，4-亚甲二氧基苯酚(Aldrich，catalog # S3003-25G-A)和5g(0.4摩尔)二甲氨基吡啶(Aldrich，catalog # 522821)和120mL二氯甲烷充分搅拌15分钟。在10分钟的时间内逐步加入7.4g(0.036摩尔)α硫辛酸(Geronova Research Inc)。在45分钟的时间内加入N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺氯化氢(EDCI Aldrich，catalog #：E7750)8.6g(0.8摩尔)并且继续搅拌过夜。全部溶剂是商业级的并且购自Fisher Scientific。应理解，可使用其他卤化溶剂，包括但不限于氯仿和四氯化碳。应理解，可使用其他偶联剂，包括但不限于二环碳二亚胺(DCC)和二异丙基碳二亚胺(DIC)。
在大约24小时的反应时间后，检查粗制产物的薄层层析(3∶1己烷∶乙酸乙酯溶剂系统)与起始材料以检查产物的形成和起始材料3，4-亚甲二氧基苯酚的消失。在完全反应后，在减压下蒸发二氯甲烷。获得稠密黄色团块，其使用快速柱层析利用3∶1己烷∶乙酸乙酯溶剂系统直接纯化。从柱层析缓慢洗脱溶剂是以更高的纯度获得产物所必需的。通过结晶方法再纯化获得的黄色松散固体。使用90％乙醇进行结晶，该方法包括在持续搅拌的条件下在10分钟的时间内将化合物INV-7065(约2g)缓慢加入温热乙醇(约35mL)中。在化合物完全溶解后，快速过滤淡黄色溶液，将其静置以缓慢结晶过夜。将闪烁的松散固体过滤，使用真空干燥器进行干燥。总产率为65％-73％。使用高分辨率质子NMR表征结晶的产物。下列是反应的示意图：
Figure BDA0000049735770000391
NMR表征：利用高分辨率质子NMR表征结晶的化合物，产物的经典质子化学位移值为(CDCl3)：6.77-6.75(1H，双重峰)、6.59-6.58(1H，双重峰)，6.52-6.49(1H，双重峰的双重峰)，5.97(2H，单重峰)，3.61-3.57(1H，多重峰)，3.19-3.10(2H，多重峰)，2.56-2.52(2H，三重峰)，2.51-2.45(2H，多重峰)，1.95-1.86(2H，多重峰)，1.79-1.73(4H，多重峰)，1.58-1.53(2H，多重峰)。图1B。
实施例5
3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV 70-65)的生物活性
由于INV 70-65是通过处理硫辛酸和亚甲二氧基苯酚制备的，因此我们试图理解其效应(特别是与单独的硫辛酸的效应相比)以帮助区分硫辛酸的效应与亚甲二氧基苯酚的效应。因此在我们的实验(包括体内测试)中，比较组之一是硫辛酸。
动物模型：15只雄性新西兰白兔(Charles River，MA)喂以高脂膳食(HFD)(具有0.5％胆固醇的Harlan Teklad兔食，TD 87251)。在4周的高脂膳食后，将兔子随机分成3个不同的处理组：正常对照(n＝5)、硫辛酸(100mg/kg/日)(n＝5)、INV 70-65(100mg/kg/日)(n＝5)。通过将药物与高脂膳食混合，通过食物将这些药物施用给动物。在仔细地计算每只兔子的食物摄入后，每天将固定量的食物和混合在食物中的药物给所有动物喂食。将药物溶解在100％乙醇中，并且喷洒在食物上，在真空下保持以让乙醇蒸发过夜。在施用与HFD混合的药物或对照两(2)周后，使所有兔子经历主动脉球囊剥脱手术，然后进行12周的与HFD混合的药物或对照的连续施用。图29提供了实验设计的概述。
用于评估动脉粥样硬化的磁共振成像方案
在两个时间点进行MRI实验：球囊剥脱操作之后1周和12周(图29)。在MRI获取之前，通过赛拉嗪(2mg/kg)和氯胺酮(40mg/kg)的肌内注射麻醉兔子，将i.v.导管(Surflo 24G×3/4”，
Figure BDA0000049735770000401
Medical Corp.，Elkton，MD)置于耳缘静脉中以便随后施用造影剂。使用1.5T 32-通道全身MR系统(MAGNETOM Avanto，Siemens，Germany)获得前和后MRI图像，以使用双反转T1加权梯度回波turbo FLASH序列评估动脉粥样硬化。为了进行成像，将兔子以俯卧位放置，并且裹上易曲的6元件相控阵体线圈(6-element phase array body coil)。使用：TR/TE＝260/5ms，312x312 μm面内分辨率，带宽120kHz，3个信号平均值和12分钟29秒的总扫描时间获得垂直于跨越大致髂分叉处至最上方的肾的上极的降主动脉的30个4mm-厚横截层面(层面之间4.6mm的间隙)。在注入造影剂前的获取后，通过导管注射7-10ml的0.1mmol/Kg Magnevist(Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc.Wayne，NJ)的溶液，用2ml盐水冲洗。在施用照影剂后大约6分钟30秒，开始注入造影剂前的暗血扫描(dark blood scan)的重复。在注入造影剂后的扫描后，让兔子恢复。使用Siemens Leonardo Workstation(Siemens Healthcare Inc.Germany)分析MR图像。
为了评估每一个兔子组的动脉粥样硬化斑块进展的不同速率，在两个MRI时间点上在注入造影剂前的图像中鉴定主动脉壁。对于每一只动物在10至22个图像中围绕内和外血管壁边界手绘目的区域(ROI)。通过从由血管壁的外边界包围的面积减去管腔面积在各层面中获得血管壁面积。通过将层面厚度(4.6mm)乘以总血管壁面积(以mm表示)获得每一只动物的总血管壁体积。为了说明层面的可变数量，对于每一只兔子计算标准化的主动脉壁体积。
为了评估不同处理组中斑块新血管系统进展，只使用球囊剥脱后12周的MR图像。在7至11张注入造影剂之前和之后的MRI图像中手绘包围主动脉壁的相同的ROI。每一个层面的信噪比(SNR)计算为获自血管壁的平均信号除以来自身体外部区域的噪音的标准差。通过除以注入照影剂之前和之后计算的SNR获得每一只兔子的SNR增强的比率。
图30A描述了不同组中斑块负荷的MRI评估。与对照动物相比较，在12周的处理之后，INV 70-65导致斑块负担的显著减弱。在本实验中硫辛酸处理与INV 70-65处理之间无差异。喂以HFD的对照动物持续增加动脉粥样硬化斑块负荷。
图30B描述了不同处理组中在施用钆后主动脉的对比度增强。图30B描述了与对照和硫辛酸处理相比较，在INV 70-65处理后钆增强作用下降。
血管功能：研究与对照和硫辛酸处理相比较的INV 70-65的血管生 理效应的肌动描记器实验
通过注射致死剂量的戊巴比妥无痛处死兔子。收集胸主动脉以进行肌动描记器研究。在37℃下将两(2)mm胸主动脉环悬浮于充满生理盐溶液缓冲液(氯化钠，130mEq/L；氯化钾，4.7mEq/L；氯化钙，1.6mEq/L；硫酸镁，1.17mEq/L；磷酸氢钾，1.18mEq/L；碳酸氢钠，14.9mEq/L；EDTA，0.026mEq/L；和葡萄糖，99.1mg/dL[5.5mmol/L]；pH，7.4)、用氧气中的5％二氧化碳持续充气的单独的器官槽中。让血管在30mN的静息张力下平衡至少1小时，然后经历梯度剂量的激动剂。使用血管收缩激动剂去氧肾上腺素(PE)并且将响应表示为针对120mEq/L氯化钾的峰值响应的百分比。充分清洗经历PE的血管，让其平衡1小时，然后开始使用乙酰胆碱或硝普钠(SNP)的实验。在利用PE(0.1μM)达到稳定的收缩平台期后，将环暴露于梯度剂量的血管扩张剂，其包括内皮依赖性激动剂乙酰胆碱和胰岛素或不依赖于内皮的激动剂SNP。血管扩张剂的结果表示为由PE(0.1μM)产生的预收缩的百分比。表3概述了血管响应，而图31A-31D描述了结果。
表3.在12周的INV 70-65结束时胸主动脉中血管响应的概述
Figure BDA0000049735770000411
图31A和图31B描述了INV 70-65对针对去氧肾上腺素和胰岛素的响应的差别效应。与硫辛酸相比较，INV 70-65改善了响应峰值剂量的胰岛素的松弛，但对EC50剂量没有影响。
相反地，当与对照相比较时，INV 70-65在改善对乙酰胆碱的响应中与硫辛酸无差异(图31C)。相反地，任一组在对不依赖于内皮的激动剂硝普钠(SNP)的响应上无差异。这些结果表明INV 70-65减少了针对α受体激动剂的血管收缩性并且增加了血管胰岛素敏感性。
免疫组织化学方法和结果
高胆固醇血症和氧化性应激在动脉粥样硬化的发展中起着重要作用。处死兔子并且将腹主动脉固定在4％PFA(多聚甲醛)中。然后通过油红染色显现主动脉壁中的脂质沉积。腹主动脉的Oil Red O染色显示与对照组相比较，斑块区域中的脂质含量(计算为3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯和硫辛酸处理的动物的腹主动脉切片的阈值面积的百分比)减少。*，p＜0.05，单因素方差分析。
我们观察到，与对照相比较INV-7065处理的动物的主动脉壁中脂质沉积减少约80％和当与硫辛酸相比较时减少约40％。
血浆脂质特征研究
在总共12周的使用药物的处理后，进行脂质特征分析(胆固醇、甘油三酯、直接HDL、LDL和VLDL)。在高胆固醇膳食开始时和在处死时，将一(1)ml耳垂静脉的血液置于装有K EDTA的管中。所有值表示为平均值±SD。显示每一个组在基线和终点测量时的条形图。使用单因素方差分析进行统计分析。与正常对照相比较，对于INV-75和硫辛酸组在处理结束时TC和LDL水平适度降低，图32A和图32D。
在另一方面，与对照相比较，在INV-7065和硫辛酸组中甘油三酯(TG)水平显著降低，图32B。在硫辛酸组中HDL水平适度增加，然而INV-7065显示不显著的变化，图32C。INV-7065处理的动物显示VLDL的轻微减少，然而与对照相比较，硫辛酸处理的动物未显示VLDL水平的变化，图32E。这些结果表明与对照和硫辛酸处理的动物相比较，INV-7065在控制脂质特征中适度有效。
实施例6
3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(O-硫辛酰基硝基亚甲二氧基 苯酚)(INV-7465)的合成和纯化
3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯具有371.43的分子量和C15H17NO6S2的分子式。3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯在本文中也称为O-硫辛酰基硝基亚甲二氧基苯酚和INV-7465。
3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯的合成和纯化方法，方法-I
通过硝基亚甲二氧基苯酚(3，4-亚甲二氧基6-硝基苯酚)与α硫辛酸的反应实现3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯的合成并且其示意性显示于下面。在本专利申请中之前描述了硝基亚甲二氧基苯酚(INV-74)的合成。
Figure BDA0000049735770000431
在100mL圆底烧瓶中，在室温下将0.17g(0.001摩尔)3，4-亚甲二氧基6-硝基苯酚和0.1g(140μL)(0.2摩尔)三乙胺(Aldrich，catalog #：471283)和50mL二氯甲烷充分搅拌10分钟。溶液颜色变成红橙色。在5分钟的时间内加入α硫辛酸0.25g(0.0015摩尔Geronova Research Inc)。在15分钟的时间内加入N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸(EDCI Aldrich，catalog #：E7750)0.4g(0.002摩尔)并且持续搅拌过夜。全部溶剂是商业级的并且购自Fisher Scientific。应理解，可使用其他卤化溶剂，包括但不限于氯仿和四氯化碳。应理解，可使用其他偶联剂，包括但不限于二环碳二亚胺(DCC)和二异丙基碳二亚胺(DIC)。
在约36小时的反应时间后，检查粗制产物的薄层层析(20％己烷∶乙酸乙酯溶剂系统)与起始材料以评估产物的形成和起始材料3，4-亚甲二氧基6-硝基苯酚的消失。在完全反应后，在减压下蒸发二氯甲烷。获得稠密黄色物质，其使用20％己烷∶乙酸乙酯溶剂系统在制备型薄层层析上直接纯化。从板上刮取适当的条带并且用乙酸乙酯小心地洗脱。获得淡黄色固体，并且使用结晶方法进行再纯化。使用95％乙醇进行结晶，该方法包括在持续搅拌的条件下在5分钟的时间内将化合物(INV-7465)(约50mg)缓慢加入温热乙醇(60-65C)(约10mL)中。在化合物完全溶解后，快速过滤所得的溶液，将其静置以缓慢结晶过夜。将黄色固体过滤，并且使用真空干燥器干燥。总产率为42％。使用高分辨率质子NMR表征结晶的产物。
NMR表征：利用高分辨率质子NMR表征结晶的化合物，产物的经典质子化学位移值为(CDCl3)：7.59(1H，单重峰)，6.45(1H，单重峰)，6.15(2H，单重峰)，3.68-3.60(1H，多重峰)，3.21-3.13(2H，多重峰)，2.66-2.64(2H，三重峰)，2.52-2.47(2H，多重峰)，1.97-1.92(2H，多重峰)，1.84-1.75(4H，多重峰)，1.74-1.58(2H，多重峰)。图1B。
3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯的合成，方法-II
合成3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯的可选择方法包括将硝基引入至3，4-亚甲二氧基硫辛酸酯上，合成方案示于下文。在本专利申请的之前部分提供了3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(称为INV-7065)的合成。
Figure BDA0000049735770000441
在100mL锥形瓶中，将0.3g(0.001摩尔)3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯置于20mL冰乙酸中，在室温下连续搅拌30分钟并且在冰浴中进行冷却。在搅拌的同时，在45分钟的时期内缓慢地将10mL冰乙酸中的浓硝酸(4mL)加入化学混合物中。反应混合物颜色变成亮黄色并且继续搅拌3小时。在连续搅拌的情况下将所得的溶液直接倾倒至碎冰上。用二氯甲烷(2 X 50mL)萃取沉积在烧瓶底部的淡黄色半固体。在无水硫酸镁上方干燥组合的有机萃取物，在减压下蒸发溶剂。在制备型薄层层析上纯化所得的黄色物质。使用95％乙醇通过重结晶再次纯化终产物。反应的总产率是36％。进行表征，将其与真实样品(通过薄层层析)比较。
实施例7
3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(在本文中也称为0-硫辛酰基 硝基亚甲二氧基苯酚和INV 7465)的生物活性
INV 74-65对p65的核转运的抑制：体外细胞培养实验
细胞培养：使用培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs--Gibco，Invitrogen)进行全部实验，并且在5％CO2潮湿培养箱中于37℃下将所述细胞在组织培养瓶中培养至汇合，所述组织培养瓶之前用补充培养基(具有10％的热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、10mM HEPES，pH 7.4、肝素12I.U./ml、1％视网膜源性生长因子的M199，Sigma)中的1％明胶包被。在胰蛋白酶处理后，从培养瓶分离细胞，通过将HUVEC接种在预先包被明胶的培养板上，然后温育24至48小时以确保汇合来制备最终的单层。直至第4代的细胞用于全部实验。重组人TNF-α购自R&D Systems。
人肿瘤坏死因子α(TNFα)以同三聚体形式存在，其由3个17kDa亚基组成，分子量为约51kDa。其是调节嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和T和B淋巴细胞的活性、以及调节血管内皮的性质的促炎性、促凋亡细胞因子。为了研究3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯对炎性细胞因子(TNF-α)的生物活性作用，进行体外细胞培养实验。
细胞培养：使用培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs--Gibco，Invitrogen)进行实验，在5％ CO2潮湿培养箱中于37℃下将所述细胞在组织培养瓶中培养至汇合，所述组织培养瓶之前用补充培养基(具有10％的热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、10mM HEPES，pH 7.4、肝素12U.I./ml、1％视网膜源性生长因子的M199，Sigma)中的1％明胶包被。在胰蛋白酶处理后，从培养瓶分离细胞，通过将HUVEC接种在预先包被明胶的培养板上，然后温育24至48小时以确保汇合来制备最终的单层。直至第4代的细胞用于全部实验。重组人TNF-α购自R&D Systems。
酶联免疫吸附测定(ELISA)和结果：为了测量细胞表面粘着分子的表达，使用ELISA技术。在用2ng/mL TNF-α刺激6小时之前，用不同浓度(1nM、10nM、100nM、1μM和10μM)的INV-7465预处理96孔板中汇合的HUVEC，进行24小时。在TNF-α刺激6小时后评估VCAM-1和ICAM-1的表达。在INV-7465预处理人HUVEC细胞12至24小时，然后用2ng/mL TNF-α刺激6小时后培养基的ELISA分析的结果显示VCAM和ICAM-1的释放显著减少。
在全部测试的浓度上，INV-7465抑制促炎细胞因子TNF-α的效应，这被观察为p65的细胞核比细胞质染色的比的减少。3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)具有有效的抗炎效应且拮抗炎性分子TNF-α的效应。
实施例8
心血管患者的治疗
55岁的男性在他的胸的中部以及肩，臂，颈，颌和背中呈现不舒服的压迫、挤压和疼痛。他显示呼吸短促和升高的血压的其他症状。在用血管造影术进行评估后，他被诊断为患有动脉粥样硬化且在冠状动脉中具有斑块形成。给患者施用包含有效量的3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)(1.0至100mg/kg)的组合物。可选择的疗法包括3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV 73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV 74；3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)或3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)。任选地使用本领域技术人员已知的剂量，将组合物与疗法例如阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀、血管紧张素转换酶抑制剂和/或肝素或其组合的施用组合施用。患者报告胸痛、呼吸短促的改善。再次用血管造影术评估他以测量他的动脉中减少的斑块。
实施例9
胸痛(心绞痛)心血管患者的治疗
55岁的男性在他的胸的中部呈现30分钟以内的不舒服的压迫、挤压和疼痛。对他采用心血管造影术(适合于怀疑的不稳定型心绞痛)。他显示呼吸短促和无规律的心跳的其他症状。在用血管造影术进行评估后，他被诊断为患有动脉粥样硬化且在冠状动脉中具有斑块形成。给患者施用包含有效量的3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)(1.0至100mg/kg)的组合物。任选地使用本领域技术人员已知的剂量，将组合物与疗法例如阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀、依泽替米贝、硫辛酸、血管紧张素转换酶抑制剂和/或肝素或其组合的施用组合施用。患者报告胸痛、呼吸短促的改善。再次用血管造影术评估他以测量他的动脉中减少的斑块。
实施例10
胸痛(心绞痛)心血管患者的治疗
55岁的男性在他的胸的中部呈现30分钟以内的不舒服的压迫、挤压和疼痛。对他采用心血管造影术(适合于怀疑的不稳定型心绞痛)。他显示呼吸短促和无规律的心跳的其他症状。在用血管造影术进行评估后，他被诊断为患有动脉粥样硬化且在冠状动脉中具有斑块形成。给患者施用包含有效量的3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7465)(1.0至100mg/kg)的组合物。任选地使用本领域技术人员已知的剂量，将组合物与疗法例如阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀、依泽替米贝、硫辛酸、血管紧张素转换酶抑制剂和/或肝素或其组合的施用组合施用。患者报告胸痛、呼吸短促的改善。再次用血管造影术评估他以测量他的动脉中减少的斑块。
实施例11
具有急性非ST段抬高心肌梗死的心血管患者的治疗
55岁的男性在他的胸的中部以及肩，臂，颈，颌和背中呈现不舒服的压迫、挤压和疼痛，持续4小时以上。他还主诉呼吸短促。在急诊室中对他进行评估并且发现肌钙蛋白I升高，他的EKG显示与心肌缺血相符的变化。给他提供阿斯匹林、氯吡格雷、硝酸盐和IV肝素并且把他带到导管插入术实验室。在使用血管造影术进行评估后，他被诊断为遭受小于90％的冠状动脉左前降支的堵塞。在导管插入术实验室给患者施用包含有效量的3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基硫辛酸酯(INV 7465)(1.0至100mg/kg)的组合物。患者报告胸痛、呼吸短促的改善。再次用血管造影术评估他以测量他的动脉中减少的斑块。
实施例12
具有急性非ST段抬高心肌梗死的心血管患者的治疗
55岁的男性在他的胸的中部以及肩，臂，颈，颌和背中呈现不舒服的压迫、挤压和疼痛，持续4小时以上。他还主诉呼吸短促。在急诊室中对他进行评估并且发现肌钙蛋白I升高，他的EKG显示与心肌缺血相符的变化。给他提供阿斯匹林、氯吡格雷、硝酸盐和IV肝素并且把他带到导管插入术实验室。在使用血管造影术进行评估后，他被诊断为遭受小于90％的冠状动脉左前降支的堵塞。在导管插入术实验室给患者施用包含有效量的INV-75(1.0至100mg/kg)的组合物。患者报告胸痛、呼吸短促的改善。再次用血管造影术评估他以测量他的动脉中减少的斑块。
实施例13
具有急性ST段抬高心肌梗死的患者的治疗
50岁的男性呈现通常放射至左臂或颈的左侧的突然胸痛、呼吸短促、恶心和具有呕吐和出汗的心悸。在用心电图(EKG，ECG)、胸部X光检查和检测心脏标志物的升高的血液测试(检测心肌损伤的血液测试)进行评估后，他被诊断为患有急性ST段抬高心肌梗死。给患者静脉内施用包含有效量的3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)(1.0至100mg/kg)的组合物。任选地使用本领域技术人员已知的剂量，将组合物与疗法例如溶栓药例如组织纤溶酶原激活物(tPA)或链激酶以及阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀和/或肝素或其组合的施用结合施用。患者报告胸痛、呼吸短促和心悸的改善。
实施例14
具有急性ST段抬高心肌梗死的患者的治疗
50岁的男性呈现通常放射至左臂或颈的左侧的突然胸痛、呼吸短促、恶心和具有呕吐和出汗的心悸。在用心电图(EKG，ECG)、胸部X光检查和检测心脏标志物的升高的血液测试(检测心肌损伤的血液测试)进行评估后，他被诊断为患有急性ST段抬高心肌梗死。给患者静脉内施用包含有效量的3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 7465)(1.0至100mg/kg)的组合物。任选地使用本领域技术人员已知的剂量，将组合物与疗法例如溶栓药例如组织纤溶酶原激活物(tPA)或链激酶以及阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀和/或肝素或其组合的施用结合施用。患者报告胸痛、呼吸短促和心悸的改善。
实施例15
具有急性ST段抬高心肌梗死的患者的治疗
50岁的男性呈现通常放射至左臂或颈的左侧的突然胸痛、呼吸短促、恶心和具有呕吐和出汗的心悸。在用心电图(EKG，ECG)、胸部X光检查和检测心脏标志物的升高的血液测试(检测心肌损伤的血液测试)进行评估后，他被诊断为患有急性ST段抬高心肌梗死。给患者静脉内施用包含有效量的3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 7065)(1.0至100mg/kg)的组合物。任选地使用本领域技术人员已知的剂量，将组合物与疗法例如溶栓药例如组织纤溶酶原激活物(tPA)或链激酶以及阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀和/或肝素或其组合的施用结合施用。患者报告胸痛、呼吸短促和心悸的改善。
实施例16
具有近期发生的心肌梗死的患者的治疗(二级预防)
50岁的男性呈现通常放射至左臂或颈的左侧的突然胸痛、呼吸短促、恶心和具有呕吐和出汗的心悸。在用心电图(EKG，ECG)、胸部X光检查和检测心脏标志物的升高的血液测试(检测心肌损伤的血液测试)进行评估后，他被诊断为患有心肌梗死。给患者施用疗法例如阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀、IV肝素并且将他带到导管插入术实验室，在所述实验室中他经历冠状动脉支架置入。让他恢复12至24小时的时间。开始使用3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)(1.0至100mg/kg)的口服治疗并且持续至少1年。在一个月以后的随访期间，患者报告症状的改善。
实施例17
具有近期发生的心肌梗死的患者的治疗(二级预防)
50岁的男性呈现通常放射至左臂或颈的左侧的突然胸痛、呼吸短促、恶心和具有呕吐和出汗的心悸。在用心电图(EKG，ECG)、胸部X光检查和检测心脏标志物的升高的血液测试(检测心肌损伤的血液测试)进行评估后，他被诊断为患有心肌梗死。给患者施用疗法例如阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀、IV肝素并且将他带到导管插入术实验室，在所述实验室中他经历冠状动脉支架置入。让他恢复12至24小时的时间。开始使用3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 7065)(1.0至100mg/kg)的口服治疗并且持续至少1年。在一个月以后的随访期间，患者报告症状的改善。
实施例18
具有近期发生的心肌梗死的患者的治疗(二级预防)
50岁的男性呈现通常放射至左臂或颈的左侧的突然胸痛、呼吸短促、恶心和具有呕吐和出汗的心悸。在用心电图(EKG，ECG)、胸部X光检查和检测心脏标志物的升高的血液测试(检测心肌损伤的血液测试)进行评估后，他被诊断为患有心肌梗死。给患者施用疗法例如阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀、IV肝素并且将他带到导管插入术实验室，在所述实验室中他经历冠状动脉支架置入。让他恢复12至24小时的时间。开始使用3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 7465)(1.0至100mg/kg)的口服治疗并且持续至少1年。在一个月以后的随访期间，患者报告症状的改善。
实施例19
患有慢性心肌梗死的患者的治疗(二级预防)
对具有1年前心脏病发作(心肌梗死)的既往史的50岁男性进行评估。他是无症状的。给患者施用包含有效量的3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)(1.0至100mg/kg)的组合物。可选择的疗法包括3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV 73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV 74)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)；3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)或3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)。使用本领域技术人员已知的剂量，将组合物与疗法例如阿斯匹林、减少血小板聚集的倾向的药物例如硫酸氢氯吡格雷、他汀、依泽替米贝、血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体阻断剂以及其他抗高血压剂例如β阻断剂结合施用。患者记录在总胆固醇和LDL胆固醇方面的附加益处和炎性标志物例如C反应蛋白的减少。
实施例20
患有慢性心肌梗死伴慢性稳定型心绞痛的患者的治疗
对具有10年前心脏病发作(心肌梗死)的既往史的50岁男性进行评估。他主诉心绞痛样胸痛(其用一种舌下含服硝酸甘油(sub-lingual nitroglycerin)缓解)并且这些疼痛已成为慢性。给患者施用包含有效量的口服3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)(1.0至100mg/kg)的组合物。可选择的疗法包括3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV 74)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)；或3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)。患者在进行药物治疗2周后记录该方案给他的胸痛带来的附加益处。
实施例21
施用本发明的化合物以治疗人中已产生的动脉粥样硬化
已知具有已产生的动脉粥样硬化(在冠状动脉、颈动脉或外周动脉中具有斑块)的个体处于发生进一步的心血管事件例如心脏病发作和中风的风险中。此类个体已接受治疗例如他汀和抗高血压剂例如ACE抑制剂、利尿药或钙通道阻断剂。他们还将接受可接受剂量的长期口服的组合物(持续时间超过12个月)，所述组合物在可接受的载体中包含本发明的化合物。在一个研究中，给此类个体施用3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV 73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV 74)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)；3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)或3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)。在治疗期结束时进行重复IVUS测量以评估组合物的输注对靶血管中冠状动脉粥样硬化的效应。在治疗后动脉粥样硬化冠状动脉中的斑块减小，从而证实本发明的此类化合物治疗动脉粥样硬化的功效。
实施例22
施用本发明的化合物以治疗人中的动脉粥样硬化(一级预防)
已知具有动脉粥样硬化的风险因素例如家族史、高血压和高胆固醇的个体处于发生进一步的心血管事件例如心脏病发作和中风的风险中。此类个体正进行一级预防治疗例如降血脂药物疗法例如他汀类药物阿司匹林和抗高血压剂例如ACE抑制剂、利尿药或钙通道阻断剂。他们还将接受可接受剂量的长期口服的组合物(持续时间超过12个月)，所述组合物在可接受的载体中包含本发明的化合物。在一个研究中，给此类个体施用3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV 73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV 74)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)；3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)或3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)。在治疗期结束时进行重复IVUS测量以评估组合物的输注对靶血管中冠状动脉粥样硬化的效应。在治疗后动脉粥样硬化冠状动脉中的斑块减小，从而证明本发明的此类化合物治疗动脉粥样硬化的功效。
实施例23
施用本发明的化合物以预防或延迟人中动脉粥样硬化的发作
对具有已纪录的患动脉粥样硬化的风险因素和具有高血浆胆固醇水平的个体进行冠状动脉(IVUS)、颈动脉(IMT)或腘动脉的超声分析以建立基线测量值。在约1至6个月的时期内每周1至3次给一部分此类个体以2mg/kg至50mg/kg的剂量静脉内(iv)或肌内(im)每日施用组合物，所述组合物在可接受的载体中包含本发明的化合物。给此类个体施用下列化合物：3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV 73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV 74)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)；3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)或3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)。其他个体只接受载体。在治疗期结束时的新超声分析在接受载体的个体的血管中显示更高水平的斑块。该实例表明本发明的各化合物在预防或减少处于发生动脉粥样硬化的风险中的个体的动脉粥样硬化以及减少冠状动脉、颈动脉或腘动脉中的斑块累积中是有效的。
实施例24
施用本发明的化合物以治疗具有I型和II型糖尿病的患者
具有I型和II型糖尿病的个体处于发生进一步的心血管事件例如心脏病发作、中风和肾病的风险中。此类个体正进行预防性治疗例如降血脂药治疗例如他汀和抗高血压剂例如ACE抑制剂。他们已接受降低糖血的策略例如胰岛素、PPARγ试剂、二甲双胍或磺酰脲疗法。他们还将长期口服地接受可接受剂量的组合物(持续时间超过12个月)，所述组合物在可接受载体中包含本发明的化合物。在一个研究中，给此类个体施用3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)或3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)。患者经历下列测量：HbA1C(以评估血糖控制)、尿微量白蛋白(urinary microalbuminura)、血压和脂质测量。在12个月的治疗结束时，HbA1C和尿微量白蛋白降低。对于任一此类治疗[(3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV 73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV 74)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)；3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)或3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)]，VLDL胆固醇得到改善并且甘油三酯下降。
实施例25
施用本发明的化合物以治疗患I型和II型糖尿病的患者的血脂异常
具有I型和II型糖尿病的个体处于发生进一步的心血管事件例如心脏病发作、中风和肾病的风险中。此类个体通常具有脂质异常例如甘油三酯和VLDL胆固醇的升高。他们正进行治疗例如与降糖血策略例如胰岛素、PPARγ试剂、二甲双胍或磺酰脲疗法结合的降血脂药物疗法例如他汀和贝特类药(吉非贝齐或非诺贝特)以降低胆固醇水平。除了此类疗法外，他们还将长期口服地接受可接受剂量的组合物(持续时间超过12个月)，所述组合物在可接受载体中包含本发明的化合物。在一个研究中，给此类个体施用3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV 73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV 74)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)。患者在基线处和在持续12个月的治疗结束时经历脂质测量。在12个月的治疗结束时，VLDL胆固醇降低并且甘油三酯减少。
实施例26
施用本发明的化合物以治疗炎性关节炎
患类风湿性关节炎、银屑病关节炎和全身性红斑狼疮的个体遭受炎性关节炎的反复发作的痛苦。他们通常接受治疗例如非固醇类试剂例如环加氧酶抑制剂、抗TNFα疗法和其他类型的免疫疗法。除了此类疗法外，他们还将长期口服地接受可接受剂量的组合物(持续时间超过6个月)，所述组合物在可接受的载体中包含本发明的化合物。在一个研究中，给此类个体施用3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV 75)。患者经历关节疼痛和炎性标志物例如C反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率的评估。在6个月的治疗结束时，关节疼痛和炎症的标志物得到显著改善。
上述所有专利、公开案和摘要以其全文通过引用合并入本文。应当理解，上述内容只涉及本发明的优选实施方案并且可在其中进行许多变动或改变而不背离如下列权利要求界定的本发明的精神和范围。
Figure IDA0000049735820000011
Figure IDA0000049735820000031

Claims (54)

1.一种化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000011
其中
R1是乙酰基、乙酯、丙酯、丁酯、氢、硫辛酰基、二氢硫辛酰基、阿魏酰基或异构-阿魏酰基；
R2不存在或是N2O、羟基、甲氧基、乙氧基、1至8个碳的支链烷基、乙酰基、硫辛酰基、二氢硫辛酰基、阿魏酰基、选自咪唑、喹啉、异喹啉、噻唑烷二酮、吡咯烷酮和哌啶的杂环、羧基、甲酯、乙酯、1至3个碳的脂肪族酰胺、选自吡咯烷酮和哌啶的脂环族酰胺、选自苯胺和经取代的苯胺的芳香族酰胺、胺、1至3个碳的烷基化胺、通过硫辛酸或二氢硫辛酸的酰胺官能团、选自阿魏酸和肉桂酸的芳香酸、从脯氨酸、经取代的脯氨酸或2-哌啶酸衍生的杂环酰胺或卤素；和
R3不存在或是1至3个碳的线性烷基、3至5个碳的支链烷基、具有游离羧酸、酯或酰胺的官能团的烷基、游离羟基衍生物或烷基化醚衍生物、具有选自胺和烷基化胺的官能团的1至3个碳的烷基、脂肪族酰胺、芳香族酰胺或选自咪唑、喹啉、异喹啉、噻唑啉和哌嗪的杂环酰胺或卤代基团；
除了其中所述化合物不是3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV-73)；3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV-74)或3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV-75)。
2.权利要求1的化合物，其包含：3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)：
Figure FDA0000049735760000012
3.权利要求1的化合物，其包含：3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)：
Figure FDA0000049735760000021
4.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000022
5.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000023
6.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000024
7.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000025
8.权利要求1的化合物，其包含：
9.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000032
10.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000033
11.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000034
12.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000035
13.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000036
14.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000041
15.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000042
16.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000043
17.权利要求1的化合物，其包含：
Figure FDA0000049735760000044
18.包含权利要求1的化合物和药学可接受的载体的组合物。
19.包含权利要求1的化合物的组合物，其还包含一种或多种治疗性化合物，所述治疗性化合物选自：硫辛酸、HMG-CoA还原酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、脂肪吸收抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、PPARα激动剂、PPARγ激动剂、乙酰水杨酸、血小板聚集的抑制剂、胆固醇酯转移蛋白抑制剂、噻唑烷二酮、烟酸、贝特类药、凝块形成的抑制剂或β-阻断剂或其组合。
20.治疗或预防患者的心血管疾病、血管疾病、炎性疾病以及处于发生高血压、中风、心血管病及肾病的风险中的I型和II型糖尿病和血脂异常患者的方法，其包括给所述患者施用包含化合物以及药学可接受的载体的组合物，所述化合物包含：
Figure FDA0000049735760000051
其中
R1为乙酰基、乙酯、丙酯、丁酯、氢、硫辛酰基、二氢硫辛酰基、阿魏酰基或异构-阿魏酰基；
R2不存在或是N2O、羟基、甲氧基、乙氧基、1至8个碳的支链烷基、乙酰基、硫辛酰基、二氢硫辛酰基、阿魏酰基、选自咪唑、喹啉、异喹啉、噻唑烷二酮、吡咯烷酮和哌啶的杂环、羧基、甲酯、乙酯、1至3个碳的脂肪族酰胺、选自吡咯烷酮和哌啶的脂环族酰胺，选自苯胺和经取代的苯胺的芳香族酰胺、胺、1至3个碳的烷基化胺、通过硫辛酸或二氢硫辛酸的酰胺官能团、选自阿魏酸和肉桂酸的芳香酸、从脯氨酸、经取代的脯氨酸或2-哌啶酸衍生的杂环酰胺或卤素；和
R3不存在或是1至3个碳的线性烷基、3至5个碳的支链烷基、具有游离羧酸、酯或酰胺的官能团的烷基、游离羟基衍生物或烷基化醚衍生物、具有选自胺和烷基化胺的官能团的1至3个碳的烷基、脂肪族酰胺、芳香族酰胺或选自咪唑、喹啉、异喹啉、噻唑啉和哌嗪的杂环酰胺或卤代基团；
其中施用所述组合物以治疗或预防患者的心血管疾病、血管疾病、炎性疾病以及处于发生高血压、中风、心血管病和肾病的风险中的I型和II型糖尿病和血脂异常患者。
21.权利要求20的方法，其中R1是氢并且R2是N2O或不存在。
22.权利要求20的方法，其中R1是乙酰基并且R2是N2O或不存在。
23.权利要求20的方法，其中R1是硫辛酰基并且R2是N2O或不存在。
24.权利要求20的方法，其中所述化合物是：
3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV-73)，
3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV-74)，
3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV-75)，
3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)，或
3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)。
25.权利要求20的方法，其还包括施用硫辛酸、HMG-CoA还原酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂、脂肪吸收抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、PPAR-α激动剂、PPAR-γ激动剂、乙酰水杨酸、血小板聚集的抑制剂、胆固醇酯转移蛋白抑制剂、噻唑烷二酮、烟酸、贝特类药、凝块形成的抑制剂或β-阻断剂或其组合。
26.制备3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)的方法，其包括如下顺序步骤：
将二甲氨基吡啶和3，4-亚甲二氧基苯酚与卤化溶剂在氮气氛下混合以形成混合物；
向所述混合物中加入α硫辛酸；
向所述混合物中加入偶联试剂；
搅拌所述混合物；和，
除去所述卤化溶剂。
27.制备3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)的方法，其包括如下顺序步骤：
将三乙胺和3，4-亚甲二氧基6-硝基苯酚与卤化溶剂混合以形成混合物；
向所述混合物中加入α硫辛酸；
向所述混合物中加入偶联试剂；
搅拌所述混合物；和，
除去所述卤化溶剂。
28.权利要求26的方法，其还包括纯化3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)。
29.权利要求27的方法，其还包括纯化3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)。
30.治疗有此需要的受试者的方法，其包括：以有效地治疗心血管疾病的量给需要这样的治疗的受试者施用调节NF-κB的p65亚基的表达的试剂，其中所述试剂包含权利要求1的化合物。
31.用于在有此需要的受试者中增加LDL受体的表达的组合物，其包含有效量的INV-75或其药理活性类似物。
32.用于在有此需要的受试者中以选择性方式增加PPAR-α配体结合活性而对PPARα或PPARγ无影响的组合物，其包含有效量的INV-75或其药理活性类似物。
33.膳食补充剂，其包含有效量的足以在有此需要的受试者中改善心脏、血管、炎性、I型及II型糖尿病和/或血脂异常症状的INV-75。
34.用于在有此需要的受试者中减缓斑块的进展速率的组合物，其包含：有效量的INV-75或其药理活性类似物。
35.用于在有此需要的受试者中抑制巨噬细胞浸润的组合物，其包含：有效量的INV-75或其药理活性类似物。
36.用于在有此需要的受试者中增加平滑肌含量的组合物，其包含：有效量的INV-75或其药理活性类似物。
37.用于在有此需要的受试者中通过增加LDL受体表达来增加LDL清除的组合物，其包含：有效量的INV-75或其药理活性类似物。
38.用于在有此需要的受试者中通过血管紧张素II减少主动脉收缩的组合物，其包含：有效量的INV-75或其药理活性类似物。
39.用于在有此需要的受试者中调节乙酰胆碱依赖性血管舒张的组合物，其包含：有效量的INV-75或其药理活性类似物。
40.一种抗炎组合物，其包含：有效量的INV-75或其药理活性类似物。
41.用于在有此需要的受试者中减弱斑块负荷的组合物，其包含：有效量的权利要求3的化合物(INV-7065)或其药理活性类似物。
42.用于在有此需要的受试者中减小针对α受体激动剂的血管收缩性和/或增加血管胰岛素敏感性的组合物，其包含：有效量的权利要求3的化合物(INV-7065)或其药理活性类似物。
43.用于在有此需要的受试者中减少主动脉壁中的脂质沉积的组合物，其包含有效量的权利要求3的化合物(INV-7065)或其药理活性类似物。
44.用于在有此需要的受试者中降低甘油三酯(TG)水平的组合物，其包含：有效量的权利要求3的化合物(INV-7065)或其药理活性类似物。
45.抗炎组合物，其包含有效量的至少一种权利要求1的化合物或其药理活性类似物。
46.用于在有此需要的受试者中治疗人主动脉斑块形成的药物组合物，其包含：至少一种权利要求1的化合物和药学可接受的载体。
47.用于在有此需要的受试者中减少斑块形成的方法，其包括步骤：施用有效量的至少一种权利要求1的化合物和药学可接受的载体。
48.化合物在制备药剂中的用途，所述化合物包含：
Figure FDA0000049735760000091
其中
R1是乙酰基、乙酯、丙酯、丁酯、氢、硫辛酰基、二氢硫辛酰基、阿魏酰基或异构-阿魏酰基；
R2不存在或是N2O、羟基、甲氧基、乙氧基、1至8个碳的支链烷基、乙酰基、硫辛酰基、二氢硫辛酰基、阿魏酰基、选自咪唑、喹啉、异喹啉、噻唑烷二酮、吡咯烷酮和哌啶的杂环、羧基、甲酯、乙酯、1至3个碳的脂肪族酰胺、选自吡咯烷酮和哌啶的脂环族酰胺，选自苯胺和经取代的苯胺的芳香族酰胺、胺、1至3个碳的烷基化胺、通过硫辛酸或二氢硫辛酸的酰胺官能团、选自阿魏酸和肉桂酸的芳香酸、从脯氨酸、经取代的脯氨酸或2-哌啶酸衍生的杂环酰胺或卤素；和
R3不存在或是1至3个碳的线性烷基、3至5个碳的支链烷基、具有游离羧酸、酯或酰胺的官能团的烷基、游离羟基衍生物或烷基化醚衍生物、具有选自胺和烷基化胺的官能团的1至3个碳的烷基、脂肪族酰胺、芳香族酰胺或选自咪唑、喹啉、异喹啉、噻唑啉和哌嗪的杂环酰胺或卤代基团；
所述药剂用于治疗或预防患者的心血管疾病、血管疾病、炎性疾病以及处于发生高血压、中风、心血管病和肾病的风险中的I型和II型糖尿病和血脂异常患者。
49.权利要求48的用途，其中R1是氢并且R2是N2O或不存在。
50.权利要求48的用途，其中R1是乙酰基并且R2是N2O或不存在。
51.权利要求34的用途，其中R1是硫辛酰基并且R2是N2O或不存在。
52.权利要求48的用途，其中所述化合物是
3，4-亚甲二氧基苯基乙酸酯(INV-73)，
3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯酚(INV-74)，
3，4-亚甲二氧基-6-硝基苯基乙酸酯(INV-75)，
3，4-亚甲二氧基苯基硫辛酸酯(INV-7065)，或
3，4-亚甲二氧基6-硝基苯基硫辛酸酯(INV-7465)。
53.权利要求48的用途，其还包括向药剂中加入一种或多种治疗性化合物。
54.权利要求53的用途，其中所述一种或多种治疗性化合物包括硫辛酸、HMG-CoA还原酶抑制剂、血管紧张素转换酶抑制剂、脂肪吸收抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、PPAR-α激动剂、PPAR-α激动剂、乙酰水杨酸、血小板聚集的抑制剂、胆固醇酯转移蛋白抑制剂、噻唑烷二酮、烟酸、贝特类药、凝块形成的抑制剂或β-阻断剂或其组合。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305102A (zh) * 2019-08-13 2019-10-08 陕西中医药大学 1,3-苯并二噁茂天然多酚酸酯类化合物及其降血脂应用
CN112745291A (zh) * 2019-10-29 2021-05-04 浙江大学宁波理工学院 一种具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物、药物组合物及应用
CN115047092A (zh) * 2022-04-07 2022-09-13 济宁医学院 一种血管紧张素转移酶ii抑制剂的筛选方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI1007600A2 (pt) * 2009-04-23 2019-09-24 Invasc Therapeutics Inc composições e métodos para tratamento de doenças cardiovasculares
CN106957298B (zh) * 2017-04-18 2019-07-16 湖南中医药大学 一种硫辛酸苯酚酯衍生物及其制备方法和应用
US11306076B2 (en) * 2020-05-11 2022-04-19 Xi'an Taikomed Pharmaceutical Technology Co., Ltd. Silibinin lipoic acid ester with hepatoprotective activity and a method of preparing the same

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010031275A1 (en) * 1998-02-09 2001-10-18 Forse R Armour Sesamol inhibitor of delta-5-desaturase activity and uses therefor
ES2239203T3 (es) 2001-01-31 2005-09-16 Pfizer Products Inc. Derivados nicotinamida y sus mimeticos como inhibidores de isozimas pde4.
WO2002060896A1 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Pfizer Products Inc. Ether derivatives useful as inhibitors of pde4 isozymes

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110305102A (zh) * 2019-08-13 2019-10-08 陕西中医药大学 1,3-苯并二噁茂天然多酚酸酯类化合物及其降血脂应用
CN110305102B (zh) * 2019-08-13 2020-11-24 陕西中医药大学 1,3-苯并二噁茂天然多酚酸酯类化合物及其降血脂应用
CN112745291A (zh) * 2019-10-29 2021-05-04 浙江大学宁波理工学院 一种具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物、药物组合物及应用
CN115047092A (zh) * 2022-04-07 2022-09-13 济宁医学院 一种血管紧张素转移酶ii抑制剂的筛选方法
CN115047092B (zh) * 2022-04-07 2023-10-20 济宁医学院 一种血管紧张素转移酶ii抑制剂的筛选方法

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