KR20110042108A

KR20110042108A - 새로운 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 질병 치료에서 이들의 사용

Info

Publication number: KR20110042108A
Application number: KR1020117005383A
Authority: KR
Inventors: 샘패스 파타사라티; 샌제이 라자고팔란; 데시칸 라자고팔
Original assignee: 더 오하이오 스테이트 유니버시티 리서치 파운데이션; 인베이스크 테라퓨틱, 인크.
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2009-08-05
Publication date: 2011-04-22
Also published as: RU2011108587A; BRPI0917262A2; US20130157986A1; US8198317B2; CN102149702A; AU2009279667A1; JP2011530525A; WO2010017323A1; IL211076A0; EP2324005A1; CA2733430A1; US20100035849A1

Abstract

본 발명은 새로운 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체, 이들을 만드는 방법, 및 심혈관계 질환, 혈관 질환 및/또는 염증 질환뿐 아니라 고혈압, 뇌졸중, 혈관 및 신장 질환의 위험이 있는 제1형 및 제2형 당뇨병, 그리고 이상지질혈증 환자를 치료하거나 예방하기 위해 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

새로운 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 질병 치료에서 이들의 사용{NOVEL METHYLENEDIOXY PHENOLIC COMPOUNDS AND THEIR USE TO TREAT DISEASE}

새로운 메틸렌디옥시 페놀기반의 화합물 및 그 유도체가, 이들을 제조하는 방법 및 혈관 질환, 심혈관계 질환, 염증 질환, 당뇨 혈관 질환 및 관련된 질환을 치료하거나 예방하는데 이들을 사용하는 방법과 함께 제시된다.

관련된 선행 출원

본 출원은 본 명세서서 전체적으로 참고문헌으로 첨부된 2008.8.5에 출원된 미국 가특허출원 No. 61/086,425의 우선권을 주장한다.

전자적으로 제출된 서열 목록 문헌

서열 목록의 공식적인 문서는, 2009.8.5에 만들어진, ASCII 포멧의 서열 목록으서 EFS-Web을 통해, 용량이 3kilobyte인 "604_29993_Sequence_Listing_OSURF-08051.txt"의 파일 이름으로, 전자적으로 제출되었고, 명세서와 동시에 출원되었다. 상기 ASCII 포멧의 문서에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 전체적으로 본 명세서에 참고문헌으로 첨부된다.

심혈관계 질환 또는 심장 질환은 전 세계에서 제 1 사망요인이며 관련된 위험 인자가 세계적으로 증가하고 있다. 예를 들어, 2025년까지 전 세계적으로 발생률이 40%가 넘게 증가할 것으로 예상되는, 당뇨와 같은 심혈관 및 대사 질환과, 고혈압 및 이상지혈혈증은 질병률 및 사망률의 주요인이다. 이와 더불어, 최근 연구는 젊은 여성과 같이 지금까지는 보호된 집단도 심장 질환에 더욱 걸리기 쉽다는 것을 시사한다. 따라서 새로운 심혈관계 약에 대한 세계적 필요가 점차 증가하고 있다.

죽상경화증에 속발된 심혈관계 질환은 단일 질병이 아니다. 질병에 관련된 다수의 위험 인자가 존재한다. 여기에는 당뇨, 고혈압, 이상지혈혈증, 흡연, 혈전성향증(thrombophilia)(응고 경향 또는 혈전증의 증가) 및 양성 가족력을 포함한다. 종종, 환자는 다수의 위험 인자를 갖고 있고 다수의 약으로 치료된다. 병용 투여(combination therapy)가 효과적인 것으로 증명되었지만, 약물 vs 약물 상호작용, 매일 다수의 투약에 대한 불편함 뿐 아니라 진단되지 않은 위험 인자는 다면적인 접근이 필요하도록 한다.

오늘날, 그 중에 수많은 보편성이 있음에도 많은 위험 인자가 분리된 질병으로서 치료되어 왔다. 예를 들어, 고혈압약은 당뇨에 거의 영향을 미치지 못했고 그 반대도 같다. 최근의 연구는 많은 상기 질병(위험 인자)들이 상승된 염증성 및 산화적 손상과 같은 공통적인 특징을 갖는다는 것을 제안했다. 이와 더불어, 변경된 내피세포 기능은, 상기 위험 인자 대부분과 관련된 흔한 임상적으로 중요한 관측이다.

본 발명은, 심혈관계 질환, 혈관 질환 및/또는 염증 질환뿐 아니라 고혈압, 뇌졸중, 심혈관계 및 신장 질환의 위험이 있는 제1형 및 제2형 당뇨와 이상지혈혈증 환자의 치료의 예방 또는 그 발병과 진행을 지연시키는데 유용한 약제를 제조하는 데 있어 새로운 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체를 사용하는 것을 제공한다.

심혈관계 질환, 염증 질환, 당뇨 혈관 질환 또는 관련된 장애의 하나 이상의 측면이나 증상을 치료하거나 예방할 수 있는 하나 이상의 약을 갖는 것이 바람직할 것이다.

본 발명은, 새로운 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체, 이들을 제조하는 방법 및 심혈관계 질환, 혈관 질환 및/또는 염증 질환뿐 아니라 고혈압, 뇌졸중, 심혈관계 및 신장 질환의 위험이 있는 제1형 및 제2형 당뇨와 이상지혈혈증 환자의 치료, 예방 또는 그 발병과 진행을 지연시키는 데 이들을 사용하는 방법을 제공하여, 상기 문제를 실질적으로 완화한다.

상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는, 죽상경화증(atherosclerosis)의 진행을 막는 능력이 있다. 따라서, 이 화합물은 죽상 경화증의 위험이 있는 사람과 같은 환자에 있어 플라크(plaque)의 축적을 막고, 죽상경화증을 지연시키거나 막는데 유용하다. 상기 화합물이 플라크의 축적을 막고, 죽상경화증을 지연시키거나 막는 데 유용하기 때문에, 심장 마비, 뇌졸중, 사망, 말초동맥질환 및 재관류술(관상동맥 우회로 조성술 또는 하지(lower extremity) 우회술)이 일어나는 것을 막거나 줄이기 위해 복용할 수 있다.

적어도 전사 인자 NFkB(nuclear factor-kappa B)의 활성을 막는 효과에 의해 검증되었듯이, 상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는 항염증 특성을 가지고 있다. 따라서, 상기 화합물은 다양한 염증 장애에 유용한데, 죽상경화증, 당뇨, 관절염(류마티스 관절염, 건선성 관절염), 고혈압 및 노화를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 상기 화합물은 허용 가능한 케리어(carrier)와 결합되어 최근에 심장 마비 또는 뇌졸중을 경험했거나 관상 또는 말초 동맥 혈관에 최근 경피적 성형술을 한 환자에게 투여될 수 있다. 이 조성물은 또한 관상 동맥 및 말초 동맥에 스텐트(stent)를 받은 환자에게 투여하는 데도 유용하다.

상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는, 혈관 인슐린 민감도를 향상시키는 효과를 고려할 때, 당뇨 및 당뇨성 심장 질환, 당뇨성 신장 질환 및 당뇨성 뇌혈관 질환을 막는데 보호효과를 가질 것이다.

상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는 전사 인자 SREBP-2(sterol regulator and binding protein-2)에도 영향을 줄 수 있다. 이 화합물은 SREBP-2의 전사 후 활성인자로 작용하고 SERBP-2의 선택적인 활성인자의 새로운 부류를 대표한다. SREBP-2의 증가는 LDLR(low density lipoprotein receptor)를 증가시키고 LDL 수준을 낮춘다. 따라서, 상기 화합물은 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 및 동형 가족성 고콜레스테롤혈증, 결합성 고지혈증, VLDL(very low density lipoprotein)의 상승 및 당뇨성 이상지질혈증과 같은 상승된 LDL과 관련된 고지혈증을 치료하는데 사용될 수 있다.

죽상경화증 및 염증에 있어 상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체에 의해 제공되는 실질적인 이익의 관점에서, 죽상경화증 및 염증에 효과적이게 하기 위해 당업자에게 알려진 다른 치료와 결합하여 투여될 수도 있는데, 예를 들어 HMG-CoA 환원효소 저해제, 안지오텐신 전환 효소 저해제(ACEI,angiotensin converting enzyme inhibitors), 지방 흡수 저해제, 안지오텐신 수용체 차단제, PPAR-알파(peroxisome proliferation activator receptor-alpha) 및 PPAR-감마 작용제, 아세틸살리실산, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질(CETP, cholesteryl ester transfer protein) 저해제 및 베타-차단제를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는, 약학적으로 허용가능한 케리어와 결합하여, 동물 및 사람에게 투여하기 위한 조성물을 만든다. 이 조성물은 혈관 질환, 심혈관 질환, 염증질환, 당뇨성 혈관 질환 또는 관련된 장애 및 이에 내포된 많은 위험 인자를 치료하고 예방하는데 사용된다. 이 조성물은 다른 치료 화합물과 결합하여 또는 단독으로 투여될 수 있다. 본 발명 조성물 및 하나 이상의 추가적인 치료 화합물의 투여는 분리되어 일어날 수 있다. 대안적으로 본 발명의 조성물 및 하나 이상의 추가적인 치료 화합물은 한번의 투여 또는 전달 방법으로 결합될 수 있는데, 예를 들어, 하나의 캡슐, 하나의 캐플릿(caplet), 또는 한번의 정맥 투여이다.

본 발명의 목적, 특징 및 이점은 다음의 첨부된 실시예와 청구항의 상세한 설명을 검토한 후 더욱 명확해질 것이다.

도면 1A는 INV-7065의 양성자 NMR을 나타내는 것이다.
도면 1B는 INV-7465의 양성자 NMR을 나타내는 것이다.
도면 2는 INV-75의 세포 독성 평가를 나타내는 그래프이다. 혈관 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell)가 실험에서 사용되었다.
도면 3은 INV-75 및 TNF-α에 대한 ICAM-1 및 VCAM-1의 방출을 설명한다.
도면 4는 NFkB(nuclear kappa factor kappa-B)에서 INV-75의 효과를 평가한 다수의 실험을 종합한 것을 보여주는 그래프이다. 이는, 대조군, TNF-a 및 INV-75 + TNF-a 처리 세포에 있어, NFkB의 서브유닛, p65의 핵 vs 세포질 비로 표현된다. 총 세 번의 실험이 실시되었다. ANOVA에 의한 *, p<0.01은 매개체과 비교되었다.
도면 5A는 INV-75와의 SERBP-2(Sterol Regulatory and Binding Protein-2) 활성 측정 경과의 인 비트로(in vitro) 시간 경과를 보여주는 그래프이다. HepG2 세포는 INV-75로 네시간 동안 자극했고, 핵 단백에 대한 SREBP2의 결합 활성도를 EMSA(electrophoretic migration shift assay)로 측정했다. 총 세 번의 실험이 실시되었다. ANOVA에 의한 *, p<0.01은 매개체와 비교되었다.
도면 5B는 SREBP2에서 INV-75의 용량 의존성 효과를 보여주는 그래프이다. HepG2 세포는 다양한 농도의 INV-75로 1시간 동안 자극했고, 핵 단백에서 SREBP2의 결합 활성도를 EMSA(electrophoretic migration shift assay)로 측정했다. 총 세 번의 실험이 실시되었다. ANOVA에 의한 *, p<0.01은 매개체와 비교되었다.
도면 5C는 처리된 세포의 세포질에서 INV-75와 성숙형(mature form)을 평가하여 측정된 인 비트로 시간 경과에 따른 SREBP2 활성을 보여주는 그래프이다. HepG2 세포는 INV-75(0.1mM)로 네시간 동안 자극했고, SREBP2의 성숙형 및 전구체형은 웨스턴 블롯 분석으로 측정했다. 총 세 번의 실험이 실시되었다. ANOVA에 의한 *, p<0.01은 매개체와 비교되었다. 해당하는 웨스턴 블롯은 오른쪽에 그려져 있다. 시간은 시(hours) 단위로 오른쪽에 있다.
도면 5D는 성숙형 INV-75로 평가된 SREBP2에서의 INV-2의 용량 의존성 효과를 보여주는 그래프이다. HepG2 세포는 다양한 농도의 INV-75로 1시간 동안 자극했고, SREBP2의 성숙형 및 전구체형은 웨스턴 블롯 분석으로 측정했다. 총 세 번의 실험이 실시되었다. ANOVA에 의한 *, p<0.01은 매개체와 비교되었다. INV-75의 용량은 로그 몰농도이다.
도면 5E는, RT-PCR(real time polymerase chain reaction)으로 평가된 INV-75와 LDLR(low density lipoprotein receptor) 메신저 RNA(mRNA)의 시간 경과를 보여주는 그래프이다. 총 세 번의 실험이 실시되었다. ANOVA에 의한 *, p<0.01은 매개체와 비교되었다.
도면 5F는, INV-75와의 LDLR(low density lipoprotein receptor) 메신저 RNA(mRNA) 측정의 용량 의존성 실험을 보여주는 그래프이다. HepG2 세포는 다양한 농도의 INV-75로 1시간 동안 자극했고, mRNA 발현은 정량적인 RT-PCR(real time polymerase chain reaction)으로 측정되었다. ANOVA에 의한 *, p<0.01은 매개체와 비교되었다. INV-75의 용량은 로그 몰농도이다.
도면 6A는 대체물로서, ACO(acetyl-CoA Oxidase)를 사용하여, INV-75에 의해 PPARa(Peroxisome Proliferation Activator Receptor-alpha)를 인 비트로 평가한 것을 보여준다. ACO는 PPAR-a 조절된 유전자이다. HepG2 세포는 표시된 시간 동안 INV 75(100μM)로 자극했고, ACO의 mRNA 표현 정도는 real-time RT-PCT로 측정했다. n=3. *, p<0.05 vs 0.
도면 6B는 루시퍼라아제 리포터(luciferase reporter)에 연결된 전체 길이(full length)의 인간 PPARa에 의해 감염된 HepG2 세포를 사용하여, INV-75에 의해 인 비트로 ACO 활성을 보여준다. 세포는 4시간 동안 INV-75로 자극되었고, ACO(acetyl co-enzyme A oxidase)의 mRNA 표현 정도는 실시간 RT-PCT로 측정했다. n=3. *, p<0.05 vs -8.5.
도면 6C는 고효능 특정 PPARa 활성자, WY 14643에 의한 활성과 관련하여 표현된, INV-75에 의한 PPARa 유전자 활성의 시간 경과 실험을 보여준다. HepG2 세포는 총 길이 PPARa 프로모터 리포터 구조(promoter reporter construct)로 감염되었고 INV-75(100μM)으로 자극했다. C에서의 결과는 WY 14643과 비교하여 % 증가량으로 표시된다.
도면 7은 INV-75를 사용한 인 비트로 WHHL 토끼 실험 프로토콜의 개략도이다. *는 플라크 이미지의 MRI 평가에서의 시간을 나타내는 것이다.
도면 8A는 세 번의 다른 시점(기준, 6주 및 12주)에서 MRI에 의해 측정된 죽상경화 플라크 부하(plaque burden)의 평가를 설명한다.
도면 8B는 대조군 WHHL 토끼와 비교하여 INV-75 처리된 WHHL의 복부 대동맥에서 죽상경화 부하가 감소한 것을 나타내는 대표적인 MRI 이미지의 집합이다.
도면 9는 대조군의 복부 대동맥에서 죽상경화 부하의 막대 다이어그램이고, WHHL 토끼의 INV-75 군이 나타나있다. n=5/군. *, 편측성 t 검정(unpaired t test)에 의한 p<0.05 vs 대조군 동물. WHHL 토끼의 죽상경화 부하에서 약 60%의 감소가 대조 치료를 받은 WHHL 군과 비교되었다. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 10은, 편측성 t 검정에 의해 *p<0.05 vs 대조군인, INV-75 처리된 동물에서 WHHL(Watanabe Herirtable Hyperlipidemic Rabnit)의 흉대동맥의 대식세포 침륜도를 형태계측학적으로 분석한 것이다. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 11은, 편측성 t 검정에 의해 *p<0.05 vs 대조군인, 대조군 및 INV-75 처리된 WHHL(Watanabe Herirtable Hyperlipidemic Rabnit) 동물에 항-a-액틴 염색하여, 동맥 벽의 SMC(smooth muscle cell) 증식을 형태계측학적으로 분석한 것이다. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 12은, 일원 분산 분석에 의해 *p<0.05인, 대조군 및 INV-75 처리된 WHHL 동물에 Red oil O 염색하여, 동맥 벽의 지방 축적을 형태계측학적으로 분석한 것이다. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 13은, 일원 분산 분석에 의해 *p<0.05인, 대조군 및 INV-75 처리된 WHHL 동물에 Masson의 3색 염색하여, 동맥 벽의 콜라겐 축적을 형태계측학적으로 분석한 것이다. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 14A는 WHHL 토끼 vs 대조군에서 총 콜레스테롤에 대한 INV-75의 효과를 나타내는 그래프이다. 고지방식(HFC) 이전에 기준 값을 얻었다. 후-HFC=고지방식 시작 후이고 약물 처리 전에 얻은 값. 후 INV-75/대조군은 INC-75의 대조군으로 처리된 이후의 처리 값을 나타낸다. N=4-5/군. 총 콜레스테롤 값은 각 군 간에 차이가 없었다. 모든 동물은 고지방식을 했다. 본 설계에서 총 콜레스테롤의 높은 수준은 총 콜레스테롤에 대한 현저한 영향을 관찰되는 것을 막는 경향이 있었다.
도면 14B는 WHHL 토끼 vs 대조군 치료에서 LDL 조절에 대한 INV-75의 효과를 나타내는 그래프이다. 고지방식(HFC) 이전에 기준 값을 얻었다. 후-HFC=고지방식 시작 후이고 약물 처리 전에 얻은 값. 후 INV-75/대조군은 INC-75의 대조군으로 처리된 이후의 처리 값을 나타낸다. N=4-5/군. LDL 콜레스테롤 값은 각 군 간에 차이가 없었다. 모든 동물은 고지방식을 했다. 본 설계에서 총 콜레스테롤의 높은 수준은 총 콜레스테롤에 대한 현저한 영향을 관찰되는 것을 막는 경향이 있었다.
도면 15는 일원 분산 분석에 의해 *p<0.05인, 대조군 동물 및 INV-75 처리된 WHHL 동물의 혈관수축신경 AngII(angiotensin II)에 의한 수축을 보여주는 그래프이다. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 16은 대조군 및 INV-75 처리 WHHL 동물 N=4-5/군의 염화 칼륨(KCl, 120mM)에 대한 최대 협색(constriction)의 퍼센트로 표현된, 흉부 대동맥에서 페닐에프린에 대한 협색의 %를 보여주는 그래프이다.
도면 17은 대조군 동물 대. INV-75 처리된 동물의 흉부 대동맥 환 분절(segment)에서 아세틸콜린(Ach)(1μM 페닐에프린, PE에 의한 전수축의 %)에 의한 이완을 보여주는 그래프이다. INV-75 vs 대조군(n=5/군)과의 최대 이완의 일원 분산 분석. 아세틸콜린에 의한 최대 이완의 ***p<0.001 vs 대조군.
도면 18은 대조군 동물 및 INV-75 처리된 동물의, 인슐린(1μM 페닐에프린, PE에 의한 전수축의 %)에 의한, 흉부 대동맥 환 분절에서 수축의 이완을 보여주는 그래프이다.
도면 19는 치료 말미에, 대조군 vs INV-75 처리된 WHHL 토끼에서, 산화 스트레스의 기준 수준의 치수로서, 토끼 혈청의 8-에피 프로스타글란딘 F2a(8-이소프로스탄) 효소 결합 면역 검사를 하여 혈청에서의 산화 스트레스를 보여주는 그래프이다. N=4-5토끼/군. 본페로니 검정(Bonferroni correction)에 의해 조정된 스투던트의 t 검정(Student's t test)에 의한 ***p<0.001 vs 대조군.
도면 20은 대조군 동물 vs INV-75 처리된 WHHL 토끼의 흉부 대동맥에서 산화 스트레스를 보여주는 그래프이다. 치료 말미에 대조군 vs INV-75 처리된 WHHL 토끼에서 산화 스트레스의 측정으로서의 대동맥 균질물의 8-에피 프로스타글란딘 F2a(8-이소프로스탄) 효소 결합 면역 검사. N=4-5토끼/군. 본페로니 검정에 의해 조정된 스투던트의 t 검정에 의한 ****p<0.001 vs 대조군.
도면 21은 디히드로에티듐(DHE) 염색으로 정량화된, WHHL(Watanabe Heritable Hyperlipodemic Rabbit) 대동맥 부분에서 기본 인 시추 수퍼옥사이드 생성물에 대한 INV-75 또는 대조군의 효과를 보여주는 그래프이다. 본페로니 검정에 의해 조정된 스투던트의 t 검정에 의한, 대조군에 비교된 INV-75의, *, p<0.01 vs 대조군.
도면 22는 루시제닌 화학발광법에 의해 분석된, INV-75 또는 대조군 중재적 시술을 하는 WHHL(Watanabe Heritable Hyperlipodemic Rabbit)로부터 대동맥 조직 용해물에서 작용제 NADPH에 대한 반응에서, 기본 및 자극된 수퍼옥사이드 생성을 보여주는 그래프이다. 화살표는 NADPH(100mM)의 첨가를 의미하고; n=5/군이다. 본페로니 검정에 의해 조정된 스투던트의 t 검정에 의한 *, p<0.05 vs 대조군. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 23은 염증 표시자로서, VCAM-1, ICAM-1, P-셀렉틴, MCP-1 및 L-셀렉틴을 연구하기 위해 유전자 발현 수준을 보여주는 그래프이다. 총 RNA는 INV-75 또는 대조군이 될 WHHL 토끼의 흉부 대동맥으로부터 준비되었다. 전-염증 유전자의 mRNA 발현 수준은 실시간 PCR로 분석했다. *, p<0.05; 스투던트의 t 검정은 본페로니 검정으로 조정했다. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 24는 WHHL 토끼의 VCAM-1 및 ICAM-1에서 INV-75 및 대조군 중재적 시술의 효과를 보여주는 그래프이다. VCAM-1 및 ICAM-1의 단백질 발현은 웨스턴 블롯으로 분석했다. *, p<0.05; 스투던트의 t 검정은 본페로니 검정으로 조정했다. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 25는 염증의 세포 상호작용으로서, VCAM-1 단백질 발현을 보여주는 그래프이다. INV-75는 HUVEC에서, TNFa 유도된 VCAM-1 발현을 저해시킨다. HUVEC는 매개체, INV75 또는 WY-14643로 2시간 동안 전처리시키고, 그 후 TNFa와 4시간 동안 처리시켰다. VCAM-1 발현은 웨스턴 블롯으로 분석했다. 세가지 동립적인 실험의 대표도 및 요약이 제시되어 있다. *, p<0.05 vs 대조군; #, p<0.05 vs TNFa.
도면 26은 RT-PCR로 측정한, INV-75 또는 대조군으로 2주동안 처리한 정상 식이를 한 C57BL/6 쥐에서 간 LDLR mRNA 발현에서 INV-75의 효과를 보여주는 그래프이다. 대조군과 INV-75 처리된 군의 결과 비교.
도면 27은 INV-75 또는 대조군을 2주 처리한 C57BL/6 쥐에서 LDL 수준을 낮추는 데 INV-75의 효과를 보여주는 그래프이다. *, p<0.01 일원 분산 분석
도면 28은 EMSA로 측정한, INV-75로 2주 처리한 정상 식이한 C57BL/6 쥐 또는 대조군에서 간 SREBP2에서 INV-75의 효과를 보여주는 그래프이다.
도면 29는 NZW(New Zealand White)의 죽상경화증에서 INV-7065의 효과를 실험하기 위해 사용된 생체 실험 프로토콜의 개략도이다.
도면 30A는 INV-7065, 리포산 및 대조군 처리한 고지방식 섭취한 NZW(New Zealand White) 토끼의 중재적 시술에서 죽상경화 부하가 감소한 것을 나타내는 MRI 연구의 요약을 나타내는 막대 그래프이다. * p<0.05, 일원 분산 분석 vs 대조군 종점 값(n=4-5/군).
도면 30B는 두개의 다른 시점, 기준선(A) 및 종점(B)(각각 풍선 박피 수술 후 1주 및 12주)에서 가돌리늄 조영제의 투여에 이어 얻어진 생체 MRI 영상을 보여준다. 각 군의 대표 도면이 나타나있다. 전 조영 복부 대동맥 영상은, 대조군이나 풍선 박피된 동물에 12주 리포산 처리한 군에 비해, IVN-7065가 NZW(New Zealand White) 토끼 대동맥의 조영제 불투명성을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도면 31A는 대조군 동물 및 INV-7065 및 리포산 처리된 동물의 염화 칼륨(KCl, 120mM)에 대한 수축도의 %를 보여주는 그래프이다. 페닐에프린(PE) 용량 반응. INV-7065, 리포산 또는 대조군으(n=4-5/군)로 처리하고 총 14주 후에, 토끼를 죽였고, 흉부 대동맥 분절을 근운동 심실방에 놓았다. 2시간 동안 30mN을 기초 긴장도(baseline tone)에서 평형화시킨 후에, 대동맥 분절을 다양한 농도의 PE로 수축시켰다. 수축은 염화 칼륨과의 최대 수축과 관련하여 표시된다. 일원 분산 분석에 의한 *, p<0.01 vs 리포산 또는 대조군 NZW 토끼. 모든 동물은 고지방식을 했다.
도면 31B는 INV-7065, 리포산 또는 대조군으로 처리된 NZW(New Zealand White) 토끼의 흉부 대동맥 분절에서 인슐린에 대한 혈관 이완 반응을 보여주는 그래프이다. 대동맥 분절은 PE(0.3μM)에 의해 전-수축되었고, 연구된 인슐린에 대한 이완 반응이 있었다. 일원 분산 분석에 의한 *. p<0.01 vs 리포산 또는 대조군 NZW 토끼(n=4-5/군).
도면 31C는 도면 31b에서 서술된 바와 같이, 대조군, INV-7065 및 리포산 처리 동물에서 페닐에프린 PE(0.3μM)에 의한 전수축의 아세틸콜린 % 에 대한 혈관 이완 반응을 보여주는 그래프이다. 일원 분산 분석에 의한 리포산 및 INV-7065 vs 대조군 NZW 토끼의 *, p<0.01. 리포산 및 INV-7065 사이의 반응은 차이가 없었다.(n=4-5/군).
도면 31D는 도면 31B에서 서술된 바와 같이, 고지방식을 한, 대조군, INV-7065 및 리포산처리된 NZW 토끼에서 페닐에프린 PE(0.3μM)에 의한 전-수축의 SNP(sodium nitroprusside) %에 의한 이완을 보여주는 그래프이다.(n=4-5/군).
도면 32A는 INV-7065, 리포산 또는 대조군(n-4-5/군)이 보충된, 고지방식을 한 NZW(New Zealand White) 토끼에서 총 콜레스테롤(TC)에 대한 INV-7065 및 리포산의 효과를 보여주는 그래프이다.
표준 대조군(normal control)과의 비교
도면 32A와 도면 32B, 32C, 32D 및 32E에서, *으로 표시되는 p 값 <0.05로, 일원 분산 분석(one way ANOVA)통계 시험이 사용되었다.
도면 32B은 INV-7065, 리포산 또는 대조군이 보충된, 고지방식을 한 NZW(New Zealand White) 토끼에서 중성 지방(TC)에 대한 INV-7065 및 리포산의 효과를 보여주는 그래프이다. 대조군 처리된 NZW 토끼와 비교하여, INV-7065 및 리포산군은 중성지방 수준을 줄였다. INV-7065와 중성지방에서 추가적인 감소의 경향이 있었으나, 이 결과는 현저하지는 안항T다
도면 32C는 INV-7065, 리포산 또는 대조군이 보충된, 고지방식을 한 NZW(New Zealand White) 토끼에서 HDL에 대한 INV-7065 및 리포산의 효과를 보여주는 그래프이다. 리포산 및 INV-7065 모두에서 기준 및 종점 사이에 차이점은 없었다. 통계학적으로 현저하지는 않지만, 고지방식을 한 대조군 NZW 토끼에서, HDL 수준은 후 고지방식에 의해 감소했다.
도면 32D는 INV-7065, 리포산 또는 대조군이 보충된, 고지방식을 한 NZW(New Zealand White) 토끼에서 LDL에 대한 INV-7065 및 리포산의 효과를 보여주는 그래프이다. 대조군 NZW 토끼와 비교하여, 리포산 및 INV-7065 군에서 LDL 수준이 더 낮았다.
도면 32E는 INV-7065, 리포산 또는 대조군(n=4-5/군)이 보충된, 고지방식을 한 NZW(New Zealand White) 토끼에서 VLDL에 대한 INV-7065 및 리포산의 효과를 보여주는 그래프이다. 대조군 및 리포산 처리된 토끼와 비교하여, INV-7065 군에서 VLDL 수준이 더 낮은 것으로 나타났다.

본 발명은, 새로운 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체, 이들을 제조하는 방법 및 이들을 사용하여 심혈관계 질환, 혈관 질환 및/또는 염증 질환 뿐 아니라 고혈압, 뇌졸중, 심혈관 및 신장 질환의 위험이 있는 제1형 및 제2형 당뇨와, 이상지질혈증 환자의 치료 예방 또는 그 발병과 진행을 지연시키는 방법을 사용하여, 상기 문제를 실질적으로 완화시킨다. 본 명세서에서 환자는 동물 및 인간을 말하는 것이다.

본 발명은 또한, 심혈관계 질환, 혈관 질환 및/또는 염증 질환 뿐 아니라 고혈압, 뇌졸중, 심혈관 및 신장 질환의 위험이 있는 제1형 및 제2형 당뇨와, 이상지질혈증 환자의 치료 예방 또는 그 발병과 진행을 지연시키는데 유용한 약을 제조하는 데 있어,새로운 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체의 사용을 제공한다.

화학 조성물

일부 실시예에서, 본 발명의 화합물은 아래 식 I로 표시되는 화합물을 포함한다:

식 I

R1의 치환기는 다음을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다:

수소,

아세틸, 에틸 에스테르, 프로필 에스테르, 부틸 에스테르, H₃COC,

리포일,

디히드로리포일,

페룰릴(ferulyl), 및

이성체-페룰릴.

R2의 치환기는 존재하지 않거나 존재할 수 있고, 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다:

및

-메톡시, -에톡시, 1 내지 8개 탄소의 분지형 사슬 알킬, 아세틸, 리포일, 디히드로리포일, 페룰릴 및 이미다졸, 퀴날린(quinaline), 이소퀴날린, 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 피롤리딘, 피페리딘과 같은 헤테로고리,

카르복시기, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 지방족 아미드(1 내지 3개 탄소), 지환족 아미드, 예를 들어 피롤리딘, 피페리딘 및 아닐린, 치환된 아닐린과 같은 방향족 아미드,

아민, 알킬화(1 내지 3개 탄소) 아민, 리포산, 디히드로리포산를 통한 아미드 기능기, 페룰릴산, 신남산과 같은 방향족산, 프롤린, 치환된 프롤린 피페콜리닌산(pipecolinic acid)에서 유래된 헤테로고리 아미드 기능기,

할로겐 치환, 플루오르, 브롬, 염소, 요오드.

R3의 치환기는 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다:

알킬, 직쇄(1 내지 3개 탄소) 및 분지형(3 내지 5 탄소 사슬) 사슬,

자유 카복시산, 에스테르 및 아미드, 자유 히드록시기, 및 알킬화된 에테르 유도체의 기능기를 갖는 알킬기,

아민, 알킬화 아민, 지방족 아미드, 방향족 아미드, 및 이미다졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 티오졸린, 티아졸리딘디온, 피페라진, CH₂-CH₂-티아졸리딘디온, CH₂-CH₂-CH₃-CO-리포일, CH₂-CH₂-F를 포함하는 헤테로고리 아미드, 알킬 플루오라이드(1 내지 3 탄소 사슬)과 같은 할로겐 기.

본 발명의 특정 실시예는 다음 화합물을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다:

INV-73 = 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트

INV-75 = 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트

INV-74 = 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀

INV-7065 = 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트

INV-7465 = 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트

약학적 조성물

동물 또는 사람에게 투여하기 위해, 본 발명의 치료 화합물 또는 분자는 허용 가능한 케리어와 결합하여 약학적 조성물을 형성하고, 동물 또는 사람에게 투여된다. 본 발명의 치료 화합물은 사용 또는 투여 전에 모든 약학적으로 허용 가능한 케리어로 재구성될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 케리어(pharmaceutically acceptable carrier)

약학적으로 허용 가능한 케리어: 본 발명에서 약학적으로 허용 가능한 케리어(매개체)는 통상적인 것이다. E.W.Martin의 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition(1975)은 본 명세서에서 서술된 하나 이상의 치료 화합물 또는 분자의 약학적 운반에 적합한 조성물 및 배합물을 서술한다.

일반적으로, 케리어의 성질은 사용되는 특정 투여 방법에 의존할 것이다. 예를 들어, 보통 비경구제형은, 물, 생리 식염수, 평형염용액(balanced salt solution), 수용성 덱스트로오스, 글리세롤 등과 같이 약학적으로 그리고 생리학적으로 허용 가능한 액체를 매개체로 포함하는, 주입형 액체를 포함한다. 고체 조성물에 있어(예, 분말, 환약, 타블렛 또는 캡슐 형태), 통상적인 비독성 고체 케리어는, 예를 들어 약학적 수준의 만니톨, 락토오스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 케리어와 더불어, 투여될 약학적 조성물은 적은 양으로 비독성 보조 물질을 포함할 수 있는데, 예를 들어 아세트산 나트륨 또는 모노라우레이트산 소르비탄과 같은, 습윤제나 유화제, 보존제 및 pH 버퍼제 등이다.

투여, 제형, 및 복용량의 대표적인 방법

상기 치료 화합물은 인간이나 동물 대상으로 투여하기 위해 약학적으로 허용 가능한 케리어나 매개체와 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 더 많은 치료 화합물이 결합되어 단일 조제약을 만들 수 있다. 치료 화합물은 통상적으로 1회 복용량 형태로 나타날 수 있고, 통상적인 약학적 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 기술은 활성 성분 및 약학적 케리어나 부형제와 결합되는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 단일하게 제조되고, 활성 성분이 액상 케리어와 직접적으로 결합된다. 비경구 투여에 적절한 제형은 수성 및 비수성 멸균 주사 용액을 포함하고, 이는 항산화제, 버퍼, 세균 발육 저해제 및 제형이 목적하는 수용체의 혈액과 등장이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있고; 현탁제 및 농축제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁물을 포함한다. 제형은, 밀폐형 앰플 및 유리병과 같은 1회 복용량 또는 다회 복용량 용기에 있을 수 있고, 사용 전 즉시 주입용 물과 같은 멸균 액상 케리어의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조 조건에서 저장될 수 있다. 임시 투여 용액 및 현탁물은, 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 멸균 분말, 미립자(granule) 및 타블렛으로부터 제조될 수 있다.

특정 실시예에서, 1회 복용량 제형은, 투여되는 성분을 1회 복용량 또는 적절한 분획으로 포함하는 것이다. 상기에서 특히 언급된 성분과 더불어, 본 명세서에 포함된 제형은 당업자가 일반적으로 사용하는 다른 제제를 포함할 수 있다.

심혈관계 장애와 같은 질병을 치료하는데 사용되는 것을 포함하는, 본 명세서에서 설시된 약학적 조성물은, 다른 방법으로 투여될 수 있는데, 예를 들어 볼쪽 및 혀 밑쪽을 포함하는 구강, 직장, 비경구형, 분무형, 코, 근육 내, 복강 내, 혈관 내, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내, 피하, 피부 내, 및 국소로 투여된다. 이는 다른 형태로 투여될 수 있는데, 용액, 에멀전 및 현탁물, 마이크로스피어(microsphere), 입자, 미세입자, 나노입자, 및 리포솜을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일 실시예에서, 치료 화합물은 허용 가능한 케리어와 결합하여, 환약, 캡슐 또는 음식과 함께 구강 투여하기 위해, 약학적 조성물을 만든다.

다른 실시예에서, 약학적 조성물을 국부적으로 치료가 필요한 부분에 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 제한하는 것은 아니나, 예를 들어, 시술 중 국부 또는 국소 주입이나 관류, 혈관으로의 직접 관류로 이루어질 수 있는데, 예를 들어 죽상경화 혈관(atherosclerotic vessel), 국부 도포(예, 상처 드레싱, 약이 도포된 스텐트), 주사, 카테터(catheter), 좌약, 또는 임플란트(기공성, 비공성, 또는 젤라틴 재료로 만들어진 임플란트로, 실라스틱 막 또는 섬유와 같은 막을 포함) 등이 있다. 일 실시예에서, 심장이나 말초 혈관과 같이 피료될 조직 부분(또는 그 전 부분)에 직접 주사하여 도포될 수 있다. 다른 실시예에서, 약학적 조성물은 매개체, 특히 리포좀(Langer, Science 249:1527-1533, 1990; Treat 등, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, N.Y., pp.353-365, 1989 참조)에서 이동된다. 투여 방법의 조합 역시 사용될 수 있는데, 예를 들어 본 발명의 치료 화합물로 코팅된 스텐트를 올리기 전, 이후, 또는 도중에, 본 발명의 치료 화합물이 전신 또는 국소 주입될 수 있다.

또 다른 실시예에서, 약물학적 조성물은 조절된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 일 실시예에서, 펌프가 사용될 수 있다(예, Langer Science 249:1527-15833, 1990; Sefton Crit Rev. Biomed. Eng. 14:201-240, 1987; Buchwald 등, Surgery 88:507-516, 1980; Saudek 등, N. Engl. J.Med.321:574-579. 1989 참조). 또 다른 실시예에서, 고분자 재료가 사용될 수 있다(예, Langer 등, Macromol., Sci. Rec. Macromol. Chem. 23:61-64, 1983; Levy et al., Scientce 228:190-192, 1985; During 등, Ann. Neurol. 25:351-356, 1989; 및 Howard 등, J.Neurosug. 71:105-112, 1989 참고). Langer(Sicence 249:1527-1533, 1990)에 의한 검토에서 논의된 것과 같은 다른 조절된 방출 시스템도 사용될 수 있다.

효과를 미칠 약학적 조성물의 양은, 치료될 질병 또는 질환의 성격 뿐 아니라 질병 또는 질환의 정도에 의존한다. 효과적인 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 제형에서 사용될 정확한 복용량은 투여 방법에도 의존할 것이고, 건강 관리 전문가의 소견 및 각 대상의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러한 복용 범위의 예로는, 1회 또는 나눠진 복용량으로서, 0.1 내지 200mg/kg, 5.0 내지 100mg/kg가 있다. 다른 복용 범위는 1.0 내지 150mg/kg, 1.0 내지 100mg/kg, 5.0 내지 100mg/kg, 10 내지 75mg/kg 체중을 1회 또는 나눠진 복용량으로 포함한다. 상기 범위 이내의 모든 복용량이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.

특정 대상에 대해, 특정 복용량 수준 및 복용 빈도는 다양할 수 있고, 다양한 요인에 의존할 것인데, 여기에는 특정 화합물의 활성도, 대사 안정성 및 상기 화합물의 활동 길이, 나이, 체중, 일반적인 건강상태, 성별, 식이, 투여 방법 및 시간, 분비 속도, 약물 조합 및 치료를 받는 대상의 질환의 심각도를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료 기간 전반에 거의 같은 복용량에서, 상승 용량, 또는 부하용량(예, 부하 용량이 유지용량의 약 2배 내지 5배)으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 복용량은 치료 과정 중에, 치료되는 대상의 질환, 질병이나 질환의 심각도, 치료에 대한 명백한 반응 및/또는 당업자에 의해 결정되는 다른 요인들을 기반으로 하여 다양하다. 복용량는 복용 방법에 따라 다양할 것이다. 실시예로서, 근육 내 주입은 약 0.1ml 내지 약 1.0ml의 범위일 수 있다. 당업자는 다른 투여방법에 따른 적절한 양을 알 것이다.

치료되는 질병 또는 질환

본 발명은, 새로운 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체, 이들을 제조하는 방법, 및 혈관 질환(심혈관계 질환, 뇌혈관계 질환, 말초혈관계 질환 및 당뇨 혈관 질환 포함), 염증 질환 또는 관련된 질병 및 이를 기초로 하는 많은 위험 인자를 치료 또는 예방하는데 이들을 사용하는 방법을 제공한다.

상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는 죽상경화증의 진행을 막는 성능이 있다. 따라서, 이 화합물은 죽상 경화증의 위험이 있는 사람과 같은 환자에 있어 플라크(plaque)의 축적을 막고, 죽상경화증을 지연시키거나 막는데 유용하다. 상기 화합물이 플라크의 축적을 막고, 죽상경화증을 지연시키거나 막는 데 유용하기 때문에, 심장 마비, 뇌졸중, 말초동맥질환 및 재관류술(관상동맥 우회로 조성술 또는 하지(lower extremity) 우회술)이 일어나는 것을 막거나 줄이기 위해 복용할 수 있다.

적어도 전사 인자 NFkB(nuclear factor-kappa B)의 활성을 막는 효과에 의해 검증되었듯이, 상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는 항염증 특성을 가지고 있다. 따라서, 상기 화합물은 다양한 염증 장애에 유용한데, 죽상경화증, 당뇨, 관절염(류마티스 관절염, 건선성 관절염), 고혈압 및 노화를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 상기 화합물은 허용 가능한 케리어(carrier)와 결합되어 최근에 심장 마비 또는 뇌졸중을 경험했거나 관상 또는 말초 동맥 관에 최근 경피적 성형술을 한 환자에게 투여될 수 있다. 이 조성물은 또한 관상 동맥 및 말초 동맥에 스텐트(stent)를 받은 환자에게 투여하는 데도 유용하다.

상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는 전사 인자 SREBP-2(sterol regulator and binding protein-2)에도 영향을 줄 수 있다. 이 화합물은 SREBP-2의 전사 후 활성인자로 작용하고 SERBP-2의 선택적인 활성인자의 새로운 부류를 대표한다. SREBP-2의 증가는 LDLR를 증가시키고 LDL 콜레스테롤 수준을 낮춘다. 따라서, 상기 화합물은 이형 가족성 고콜레스테롤혈증 및 동형 가족성 고콜레스테롤혈증, 결합성 고지혈증, VLDL의 상승 및 당뇨성 이상지질혈증과 같은 상승된 LDL과 관련된 고지혈증을 치료하는데 사용될 수 있다.

병합 치료

죽상경화증 및 염증에 있어 상기 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체가 제공하는 실질적인 이익의 관점에서, 죽상경화증 및 염증에 효과적이게 하기 위해 당업자에게 알려진 다른 치료와 결합하여 투여될 수도 있는데, 예를 들어 HMG-CoA 환원효소 저해제, ACEI(angiotensin converting enzyme inhibitors), 지방 흡수 저해제, 안지오 텐신 수용체 차단제, PPAR-알파(예, Rosiglitazone, Pioglitazone) 및 PPAR-감마 작용제(Gemfibrozil, Fenofibrate, Bezafibrate), 아세틸살리실산, CETP(cholesteryl ester transfer protein) 저해제(Anacetrapib), 리포산 및 베타-차단제 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 메틸렌디옥시 페놀 화합물 및 그 유도체는, 다른 치료 화합물과 결합하여 또는 단독으로 투여될 수 있다. 본 발명 조성물 및 하나 이상의 추가적인 치료 화합물의 투여는 분리되어 일어날 수 있다. 대안적으로 본 발명의 조성물 및 하나 이상의 추가적인 치료 화합물은 한번의 투여 또는 전달 방법으로 결합될 수 있는데, 예를 들어, 하나의 캡슐, 하나의 캐플릿(caplet), 또는 한번의 정맥 투여이다.

ACE 저해제

ACE 저해제는, 효소 ACE(angiotensin converting enzyme)에 의해 안지오텐신 I가 안지오텐신 II로 전환되는 것을 막는 화합물이다. 안지오텐신 II는 혈관이 이완되고 팽창되어 혈압이 상승하는 것을 막는다. ACE 저해제는 고혈압을 치료하는데 사용되고, 항고혈압제의 종류에 해당하며, 심혈관계 질환으로 인한 사망을 20% 내지 40%로 줄일 수 있다. ACE를 저해하는 것은 혈관을 이완시키고 혈압을 낮춘다. ACE 저해제는 동맥 저항성을 낮추고, 정맥 용량을 높이며, 심박출량과 심장 지수, 심박출일(stroke work)과 부피를 증가시키며, 신혈관 저항성을 낮추고, 나트륨뇨 배설을 항진시킨다(소변에서 나트륨의 배출). 전염병학적이고 임상적인 연구는 ACE 저해제가 혈압 저하 효과와 독립적으로 당뇨병성 신장병증의 진행을 줄인다는 것을 밝혔다. ACE 저해제의 상기 활성은 당뇨병성 신부전증을 예방하는데 사용된다.

ACE 저해제는 정상 혈압인 환자에 있어서도, 고혈압이 아닌 징후에도 효과적인 것으로 나타났다. 그러한 환자에게 ACE 저해제를 최대 복용량으로 사용하는 것이(당뇨병성 신장병증, 울혈성 심부전의 예방, 심혈관 질환의 예방을 포함) 바람직한데, 이는 ACE 저해제의 혈압 강하 효과와 상관 없이, 임상적인 결과를 향상시키기 때문이다.

충분하게 혈압이 낮은 사람들이 ACE 저해제에 내성이 있음에도 불구하고, 일반적으로, ACE 저해제는 신장 문제가 있거나 혈압이 낮은 사람들에게는 처방되지 않는다. ACE 저해제는 임산부에게 사용되어서는 안 된다. 일부 ACE 저해제는 울혈성 심부전을 치료하는데 사용되거나 의사에 의해 판단된 다른 질환에 사용될 수 있다.

ACE 저해제는 화합물의 기능기에 따라 분류될 수 있다. 예를 들어, 설프히드릴(sulfhydryl)기를 포함하는 화합물은 캡토프릴(captopril)(CAPOTEN®, Bristol-Myers Squibb)를 포함한다. 디카르복실레이트를 포함하는 화합물은 에날라프릴(enalapril)(Merck의 VASOTEC®), 퀴나프릴(quinapril)(Pfizer의 ACCUPRIL®), 리지노프릴(lisinopril)(Merck의 PRINIVIL® 또는 Astra-Zeneca의 Zestril), 페린도프릴(perindopril)(Rhone-Polenc Rorer의 ACEON®) 및 라미프릴(ramipril)(Hoechst Marion Roussel, King Pharmaceuticals의 ALTACE®)을 포함한다. 포스페이트를 포함하는 화합물은 페린도프릴(perindopril)(Rhone-Polenc Rorer)을 포함한다.

다른 ACE 저해제는 베나즈프릴(benazepril)(Novartis의 LOTENSIN®), 포시노프릴(fosinopril)(Bristol-Myers Squibb의 MONOPRIL®), 모엑시프릴(moexipril)(Schwarz Pharma의 UNIVASC®), 트란도라프릴(trandolapril)(Knoll Pharmaceutical(BASF)의 MAVIK®) 등을 포함한다. ACE 저해제는 설프히드릴, 포스페이트 및 디카르복실레이트 화합물로 분류될 수 있다.

상기 화합물 중에서, 일부 ACE 저해제는 일반적으로 항고혈압제로 사용된다. 여기에는 베나즈프릴, 캡토프릴, 실라자프릴(cilazapril), 에날라프릴, 에날라프릴렛(enalaprilat), 포지노프릴, 리지노프릴, 모엑시프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴 및 트란돌라프릴을 포함한다.

일부 ACE 저해제는 일반적으로 혈관 확장제로 사용되거나, 울혈성 심부전의 치료에 사용된다. 여기에는 베나즈프릴, 캡토프릴, 실라자프릴, 에날라프릴, 포지노프릴, 리지노프릴, 퀴나프릴, 라미프릴 및 란돌라프릴을 포함한다.

리지노프릴, 캡토프릴, 라미프릴 및 트란돌라프릴은 심장 마비 후의 일부 환자에게 사용된다. 심장 마비 후, 일부 심장 근육은 손상되고 약해진다. 심장 근육은 시간 경과에 따라 계속 약해질 수 있다. 이는 심장이 혈액을 펌프하는 것을 어렵게 만든다. 리지노프릴은 생존률을 높이기 위해 심장 마비 후 24시간 이내에 그 사용을 시작할 수 있다. 캡토프릴, 라미프릴 및 프란돌라프릴은 심장이 더욱 약해지는 것을 늦춘다.

캡토프릴도 당뇨병 조절을 위해 인슐린을 사용하는 일부 당뇨 환자들에게, 신장 이상을 치료하기 위해 사용된다. 일정 시간이 흐르면, 신장 이상은 더 나빠질 수 있다. 캡토프릴은 신장 이상이 더욱 악화되는 것을 늦추는 것을 도울 수 있다.

라미프릴은 ACE 저해제와 함께, 관상동맥 질환, 울혈성 심부전, 고혈압 및 고혈압이 있는 당뇨병과 같은(이에 한정되지는 않음) 혈관 질환 및 관련된 질환을 치료하는데 사용된다.

여기에 열거되지 않았지만, 안지오텐신 I을 안지오텐신 II로 전환되는 것을 줄이거나 저해시키는 촉매 행동을 하는 다른 화합물도 본 발명의 사용에 고려될 수 있다.

일 실시예에서 ACE 저해제의 양은 약 0.1mg/day 내지 약 100mg/day이다. 다른 실시예에서, ACE 저해제는 약 1mg/day 내지 약 80mg/day의 복용양으로 투여된다. 또 다른 실시예에서, ACE 저해제는 약 5mg/day 내지 약 50mg/day의 복용량으로 투여된다. ACE 저해제의 복용량은 매일 5, 10, 또는 20mg의 초기 복용량으로 투여될 수 있다.

알파 리포산

치옥트산(tioctic acid)로도 알려져 있는, 알파-리포산은 체내에서 필수적인 에너지 생성 반응에 있어 보조 인자인, 디설파이드 화합물이다. 또한 강력한 생물학적 항산화제이다. 알파-리포산은 동물 및 사람에 있어 비타민인 것으로 생각되었었다. 그러나 알파 리포산이 조건부적으로 필수적인, 당뇨병성 말초신경병증과 같은 특정 경우가 있다. 알파-리폰산은 식물 및 동물 급원원에서 널리 발견된다.

알파-리폰산이 참여하는 대부분의 대사 반응은 미토콘드리아에서 일어난다. 이는 피루베이트 탈수소 효소 착화합물에 의한 피부르산(피루베이트로서)의 산화 및 알파-케토글루타레이트 탈수소 효소 착화합물에 의한 알파-케토글루타레이트의 산화를 포함한다. 이는 또한 분지형 사슬 알파-케토산 탈수소 효소 착화합물을 통한 분지형 사슬 아미노산(류신, 이소류신 및 발린)의 산화에서 보조 인자이다.

알파-리포산은 독일에서, 당뇨병과 알콜 다발신경병증과 같은 다발신경병증 및 간 질환의 치료용 약물로 승인받았다. 알파-리포산은 카이랄 중심을 가지며 두개의 거울상 이성질체, 자연의 R- 또는 D- 거울상 이성질체 및 S- 또는 L- 거울상 이성질체로 구성되어 있다. 알파-리포산의 상업적인 조제품은 라세믹 혼합물, 즉 R- 및 S-거울상 이성질체의 50/50 혼합물로 구성되어 있다.

알파-리포산 및 이를 환원시킨 대사산물, DHLA(dihydrolipoic acid)는 산화-환원쌍을 형성하고 넓은 범위의 활성 산소 종을 제거할 수 있다. 알파-리포산 및 DHLA 모두는 히드록시 라디칼, 산화 질소 라디칼, 퍼옥시니트리트, 과산화수소 및 히포클로라이트를 제거할 수 있다. DHLA가 아닌 알파-리포산만이 일중항 산소를 제거하고, 알파-리포산이 아닌 DHLA만이 수퍼옥사이드(superoxide) 및 퍼옥시 활성 산소 종을 제거할 수 있다.

외인성 알파-리포산은 운동하고 있는 심장 모델에서 저산소증 이후 재산소화 중에 ATP 생산 및 대동맥 혈류량을 증가시키는 것으로 보인다. 이는, 궁극적으로 에너지 생산을 증진시키는, 미토콘드리아에서 피루베이트 및 알파-케토글루타레이트의 산화에서의 역할 때문인 것으로 생각된다. 상기 활성도 및 항산화 활성은 당뇨병성 다발신경병증에서 가능한 이점으로 생각될 수 있다.

대부분의 약물 동력학적 연구는 동물에서 이루어졌다. 알파-리포산은 소장에서 흡수되어 문맥 순환을 통해 간으로, 및 체순환을 통해 다양한 조직으로 분배된다. 자연 R-거울상이성질체는 S-거울상이성질체보다 더욱 쉽게 흡수되고 더욱 활성 형이다. 알파-리포산은 혈뇌장벽을 통과한다. 다양한 체내 조직으로 분포된 이후에, 세포 내에, 미토콘드리아 내에, 및 세포 외에서 발견된다.

디히드로리포산(Dihydrolipoic acid)

알파-리포산은 미토콘드리아 리포아미드 탈수소 효소에 의해 환원된 형태, DHLA(dihydrolipoic acid)로 대사된다. DHLA는 리포산과 함께 산화-환원쌍을 형성한다. 이는 또한 피루베이트 및 알파-케토글루타레이트의 산화적 탈카르복시화를 촉진시키는 다중효소 착화합물에서 리포산 보조 인자로 기능하는, 리포아미드로 대사될 수도 있다. 알파-리포산은 이화 작용될 수 있는 디티올 옥탄산으로 대사될 수 있다.

지금까지, 최대 하루 600밀리그람 용량의 알파-리포산이 내성이 있어왔다. 당뇨병성 신경병증과 같은 일부 질환에서, 알파-리포산 300밀리그람이 매일 분할된 투여량으로 투여되었다.

DHLA은, 상기 알파-리포산에서 언급되었듯이, ACE 저해제로도 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 투여된 리포산 또는 리포산 유도체의 양은 약 1mg/day 내지 약 1000mg/day이다. 다른 실시예에서, 리포산 및 리포산 유도체는 약 10mg/day 내지 약 600mg/day에서 투여된다. 또 다른 실시예에서, 리포산 및 리포산 유도체는 약 100mg/day 내지 약 400mg/day의 복용량으로 투여된다. 리포산 또는 리포산 유도체의 복용량은 매일 300mg, 400mg, 500mg, 또는 600mg의 초기 복용량으로 투여한다.

스타틴(statin)

본 발명의 조성물과 결합하여 사용할 수 있는 다른 치료 또는 이들의 조합에는 스타틴을 포함한다.

스타틴(또는 HMG-CoA 환원 효소 저해제)은 심혈관계 질환이 있거나 그 위험이 있는 사람에 있어 콜레스테롤 수준을 낮추기 위해 약학적으로 사용되는, 일종의 지질강하제를 만든다. 이들은 콜레스테롤 합성 속도에 관여하는 효소인, 효소 HMG-CoA 환원 효소를 저해시켜, 콜레스테롤을 낮춘다. 간에서 상기 효소의 저해는, 혈류에서 LDL 제거를 늘리고, 혈액 콜레스테롤 수준을 낮추는, LDL-수용체를 자극한다. 최초 결과는 사용 일주일 후에 볼 수 있고, 그 효과는 4 내지 6주 후에 최대가 된다.

스타틴은 아토바스타틴(atorvastatin)(LIPITOR®, TORVAST®); 플루바스타틴(fluvastatin)(LESCOL®), 로바스타틴(lovastatin)(MEVACOR®, ALTOCOR®), 메파스타틴(mevatatin), 피타바스틴(pitavastin)(LIVALO®, PITAVA®), 프라바스타틴(pravastatin)(PRAVACHOL®, SELEKTINE®, LIPOSTAT®), 로수바스틴(rosuvastatin)(CRESTOR®) 및 심바스타틴(simvastatin)(ZOCOR®, LIPEX®)을 포함한다.

일 실시예에서, 스타틴의 양은 약 1mg/day 내지 약 100mg/day이다. 다른 실시예에서, 스타틴은 약 10mg/day 내지 약 80mg/day의 양으로 투여된다. 또 다른 실시예에서, 스타틴은 약 20mg/day 내지 약 60mg/day에서 투여된다.

그 외 유용한 치료제

본 발명의 약물학적 조성물은 본 문단에 기재된 하나 이상의 치료 물질과 함께 투여될 수도 있다. 아스피린과 같은 항염증 약품이 투여될 수 있다. 지방산 재흡수 저해제 에제티미브(ezetimibe)(Zetia® MSP Singapore Company, LLC, Whitehouse Station, NJ) 역시 본 조성물에 유용하다. 에제티미브도, Vytorin®(MSP Singapore Company, LLC, Whitehouse Station, NJ)과 같은 복합약을 제조하기 위해, 스타틴과 결합될 수 있다. 클로피도그렐 비설페이트(clopidogrel bisulfate)와 같이 혈소판 응집 또는 헤파린과 같이 응고에 대한 경향성을 줄이는 약도 투여될 수 있다. 심혈관계에 직접 또는 간접적으로 작용하는 약제가 본 카테고리에 포함되어 있는데, 니아신, 페노피브레이트(fenofibrate)와 젬피브로질(gemfibrozil)과 같은 피브레이트(fibrate) 및 티아졸리딘디온(thiazolidinedione)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

다음의 실시예는, 본 발명을 더욱 설명하지만, 이와 동시에 이를 제한하는 것은 아니다. 반대로, 본 명세서를 읽고 난 후에, 본 발명의 목적에서 벗어나지 않고 당업자가 제안할 수 있는, 다양한 실시예, 변형 및 그와 동등한 것에 지지되어야한다는 것이 명확하게 이해되어야 한다.

실시예 1

3,4- 메틸렌디옥시페닐 아세테이트, 3,4- 메틸렌디옥시 -6- 니트로페닐 아세테이트 및 3,4- 메틸렌디옥시 -6-니트로페놀 합성

3,4 메틸렌디옥시페놀( Sesamol 이라고도 함)[#1]로 부터 3,4- 메틸렌디옥시페 닐 아세테이트(O- 아세틸메틸렌디옥시페놀 이라고도 함)[#2] 합성

단계I에서, 중간체 화합물(O-아세틸메틸렌디옥시페놀 및 여기서는 INV-73이라고도 불리는 3,4-메틸렌디옥시페닐)이 3,4 메틸렌디옥시페놀[#1]을 아세틸화하여 만들여진다.

본 실시예에서, 아세틸화는 무수 아세트산을 사용하여 이루어졌다. 아세틸화된 생성물은, 니트로, 아미노, 및 카르복시 유도체와 같은 다른 많은 유도체 조성물의 시작점이 된다. 특정 이론에 국한되지 않고, 본 발명자들은 아세틸 기능이 아스피린(아세틸 살리실산)에서의 아세틸기와 유사한 역량을 가질 수 있고 혈소판의 응집을 방해할 수 있는 것으로 믿는다.

단계 II에서, 3,4-메틸렌디옥시페닐 아세테이트[#2, INV-73]로부터 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(O-아세틸 니트로메틸렌디옥시페놀, 또는 여기서 INV-75라고도 함)이 아래와 같이 합성되었다:

[#2 INV 73] [#3, INV-75]

단계 III에서, 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트[#3, INV-75]로부터 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(니트로메틸렌디옥시페놀 및 여기서 INV-74라고도 함)이 아래와 같이 합성되었다:

실시예 2

3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(O-아세틸 니트로메틸렌디옥시페놀 또는 여기서는 INV-75라고도 함)의 생물학적 실험: 검체(in vitro) 연구

세포 배양: 모든 실험은, 배양된 혈관 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC--Gibco, Invitrogen)으로 수행했고, 보충된 배지(Sigma, 10% 열 비활성화된 FCS(fetal calf serum), 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 10mM HEPES, pH7.4, 헤파린 12I.U./ml, 1% 레티날 기원 성장 인자의 M199) 내의 1% 젤라틴으로 먼저 코팅된 조직 배양 플라스크 상에서, 5% CO₂ 습식 배양기(humidified incubator)에서 37℃로 합류(confluence)되도록 키웠다. 트립신 처리에 이어, 세포는 플라스크에서 떨어졌고, 최종 단층을 HUVEC를 젤라틴-전코팅된 배양 접시에 시딩(seeding)한 후 합류되도록 24-48시간 배양시켜 준비했다. 네번째 계대 까지의 세포가 실험에서 사용되었다. 재조합 인간 TNF-a를 R&D Systems(MN, Minneapolis)에서 구입했다.

세포 독성 검사: 세포 독성은 세포 생존 평가에 있어 상업적으로 사용가능한 검사법인, MTT[3,(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드]로 평가했다. INV-75를 HUVEC에 24시간 동안 첨가했고, 이 기간의 마지막에 독성을 평가했다. MTT 검사법은 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 강하게 착색된 포르마잔 생성물로 양전하화된 테트라졸린 염을 세포 환원시키는 것에 의한다. 포르마잔 생성물은, 저하된 미트콘드리아 산화 환원 기능과 향상된 자유 라디컬 생성이 있는 경우 감소하고, 따라서 실험에 대한 세포 생존 반응의 지표로 사용될 수 있다.

짧게 하면, 배양기에서 마이크로티터 판(microtiter plate)을 제거한 후에, 재구성된 MTT[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드; 최종 농도: 0.5mg/ml]를 고정된 부피로 포함하는 새로운 매질을 웰(well)에 넣었고, 판은 2시간 동안 5% CO2 환경에서 37℃로 유지시켰으며, 그 후 제조품인 MTT 가용화 용액을 가했다. 양성자화된 테트라졸륨 염을 환원된 상태로 전환시켜 생성된 포르마잔 생성물은 낮은 수성 용해도(aqueous solubility)를 가지고, 보라색 결정으로 나타난다. 가용화 버퍼(키트에 제공됨)로 포르마잔을 용해시키는 것은 그 형성에 있어 편리한 정량을 가능하게 한다. 그 후 흡광도 판 분석기(absorbance plate reader)에서 OD 570nm로 광학밀도를 각 웰에서 측정했다. 검사에서, 및 검사 사이의 생존률은 각각 3 및 5%였다. 다양한 농도의 INV-75를 상기 언급된 바 대로 MTT 검사법을 사용하는 세포 기반 검사법으로 실험하였다. 실험한 농도는 1mM 내지 10nM의 범위였고 세포는 계속 24시간 동안 노출되었다(도면2).

1mM(모든 다른 용량과 비교할 때, 1mM에 있어 p=0.001)에서 74%인 것과 비교하여, 상기 결과는, 100mM까지의 농도가 10nM, 1μm, 10μm 및 100μm에서 2%, 4%, 8%, 및 7% 세포 독성을 보여주는 결과를 낳는다는 것을 설명한다. 이 결과는 다른 화합물 INV-73, INV-74 및 INV-7065에서 얻은 결과와 동일했다. 이 결과는 INV-73, INV-74, INV-7065가 10nM 내지 100μM의 용량 범위 전반에 걸쳐 안전하다는 것을 확인한다.

효소 면역법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA): 세포 표면 접합 분자의 표현을 측정하기 위해, ELISA 기술이 사용된다(MN, Minneapolis, R and D Systems). 96-웰 판의 합류 인간 제대 HUVEC를, 6시간 동안 2ng/mL TNF-a로 자극시키기 전에, INV-75와 다양한 농도(1mM, 10μM, 1μM 100nM 및 1nM)에서 24시간 동안 전처리했다.

INV-75 전처리로 한 실험 후에 배양 매질을 ELISA 분석한 결과가 도면 3에 나타나 있고, ICAM-1 및 VCAM-1의 방출로 인한 현저한 감소를 나타낸다(통계자료가 나타나지는 않음). 그 이후의 실험에서, 우리는 웨스턴 블롯에 의한 VCAM-1 발현에서 INV-75의 효과도 실험했다. 이 결과는 INV-75 전처리에 의한 VCAM-1 단백질 수준 감소를 나타냈으나, 대조군(매개체) 단독 처리로는 나타나지 않았다(도면 24 및 관련 부분 참조).

NF-κB 전위 검사법(NF-κB translocation assay): TNF-a 및 인터루킨-1(IL-1)과 같은 사이토카인은 내피세포에서 전염증(proinflammatory) 반응을 활성화시킨다. 이 반응의 초기 현상은 NF-κB 전사 인자의 핵 전위이다. 이 전위는 유도될 접합 분자 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selection과 같은 전염증 유전자를 전사하게 한다.

NF-κB는, p65 및 p50 서브유닛으로 구성된 헤테로다이머(heterodimer)이다. 핵 전위는 고정된 세포에서 NF-κB의 p65 서브유닛의 국부 면역법(immunolocalization)에 의해 관찰되고, 핵 vs 세포질 NF-κB 신호의 비율을 측정하여 정량화한다. 일차 인간 혈관 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)와 같이 자극된 세포 내의 NF-κB를 핵 전위시키는 것은 따라서, 전염증 자극에 대한 내피 조직의 반응에서 생리활성(bioactive) 화합물의 효과를 연구하는데 사용될 수 있는 정보를 제공한다. HUVEC는 INV-75와 24시간 동안 다양한 농도(10nM 내지 1μM) 또는 대조군(INV-75가 없음)에서 전처리했다. 그 후 6시간 동안 매질을 10ng/lml TNFa 또는 1μg/ml 보닌 세럼 알부민(매개체)를 포함하는 것으로 변경했다. p65 분포를 관심있는 부분에서 세포질과 핵에서의 농도로 계산했다. HPF(high power field) 당 적어도 5개의 세포가 사용되었고, 약물 농도 당 적어도 5 HPF가 사용되었다. 농도는 그 후 HPF 당 적어도 5개의 세포에서 염색하여, 핵 vs 세포질의 비로 표현되었다. 자료는 그 후 TNF-a 없이 핵 vs 세포질 비로 표현되었다.

NF-κB 활성을 평가하는 대안적인 실험에서, 추출 시약이 사용되어, 핵을 추출하는데 사용되었고, HUVEC 세포로부터의 세포질 분획은, 6시간 동안 2ng/mL TNF-a로 자극받기 전에, INV-75와 다양한 농도에서 6-24시간 동안 전처리되었다. VCAM-1 및 ICAM-1은 웨스턴 블롯 검사에 의해 6시간의 자극 동안의 TNF-a 자극 후에 평가되었다. 핵 및 세포질 추출물에서 p65 수준은 그 후 상기 언급된 웨스턴 블롯에 의해 검사되었다. NF-κB 전위 검사법에서의 INV-75 효과는, INV-75가 10nM 농도로 시작하여 p65에서 핵으로의 전위를 막는다는 것을 보여준다.

INV-75로의 다양한 실험의 집합이 도면4에서 나타난다. 핵 vs 세포질 비는, TNF-a에 대하여 및 약물과 배양한 24시간 후의 TNF-a에 대하여, 매개체 단독으로 처리된 대조군 세포 사이에서 비교되었다. INV-75와의 전처리는 핵 p65 표현의 현저한 저해의 결과를 초래한다.(일원 분산 분석, n=3, p<0.01)

스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBP-2) 연구 및 결과

전사 인자 설계된 SREBP(sterol regulatory element binding protein)의 집합은 콜레스테롤 및 지방산의 합성을 조절한다. 그 중에서, SREBP-2는 콜레스테롤 합성 효소와 LDL 수용체 발현을 변경하여 콜레스테롤 생합성을 주로 조절한다(SREBP-1은 주로 지방산 합성을 조절함). SREBP-2는 전사후 메커니즘을 통해 우세하게 조절되고, 소포체로부터 이동한 후에 성숙한 형태로 골지체에서 처리된다. SREBP에서 INV-75의 효과를 연구하기 위해, 다음의 검체 실험을 수행했다: HepG2(Human liver carcinoma cell line) 세포를 INV-75(0.1mM)로 한 시간 동안 자극했고, EMSA(electrophoretic migration shift assay)에 의해 상응하는 SREBP2 핵결합을 분석했다. 이 용량과의 시간 경과 및 용량 의존성을 분석했다. 그 후 우리는 웨스턴 분석법으로 세포질 내의 SREBP-2의 전구체 및 성숙한 형태 모두의 발현을 검토했다. SREBP-2 성숙 형의 시간 경과 및 용량 의존성 모두 분석했다.

도면 5A 및 5B는 SREBP-2의 핵 결합에 대한 INV-75의 효과를 묘사한다. INV-75는 처리 후에 <1시간 이내에 SREBP-2의 핵 결합을 증가시켰다(도면 5A). 100nM 정도의 용량이 핵으로의 SREBP-2 전위를 유도하는데 효과적이었다. 도면 5B는 상기 두 실험의 합계를 보여준다.

도면 5C 및 도면 5D는 세포질에서 SREBP-2의 처리에 있어 INV-75의 시간 경과를 제공한다. 이 자료들은, SREBP-2의 성숙형을 증가시키는데 영향을 미치면서, 10nM 정도의 용량에서 용량 의존성의 방식으로 INV-75가 SREBP-2를 전구체(미성숙 형)로부터 성숙형으로 처리하는 것을 빠르게 증가시킨다는 것을 보여준다.

그 후 우리는, 용량 및 시간 의존성을 평가하기 위해 비슷한 프로토콜을 사용하여 도일한 세포에서 LDL 수용체 발현을 조절하는데 있어 INV-75의 효과를 연구했다. 도면 5E 및 5F는 INV-75에 대한 반응으로 LDL 수용체 발현의 시간 경과 및 용량 의존성을 묘사한다. 이 결과는, INV-75가 시간 의존적 및 용량 의존적인 방식으로 LDL 수용체 발현을 증가시킨다는 것을 명백하게 보여준다. 상기 두개의 결과를 결합하여 보면, INV-75가 SREBP-2 의존적 경로를 통해 LDL 수용체 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다. INV-75는 SREBP-1 조절에 영향을 미치지 않는다(자료가 나타나지 않음). 동시에, 콜레스테롤 합성 및 조절에 관여하는 여러가지 유전자, 지단백질 지단백질 발현 및 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)의 발현을 실험했다. 후자의 유전자는, LDLR(low-density lipoprotein receptor) 분해를 유도하면서 LDLR의 EGF-A(epidermal growth factor-like repeat A) 도메인에 결합하여 LDL 수용체 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. PSCK9 기능을 막는 것은 콜레스테롤 수치를 낮추는 방법으로 최근에 밝혀졌다. INV-75의 PCSK9 발현에 대한 효과가 없는 것으로 밝혀졌다.

PPAR 활성 평가 및 결과

우리는 PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor)의 작용제를 관찰하기 위해 HepG2에서 표시 유전자(reporter gene) 검사법을 사용했다. PPAR 및 핵 호르몬 수용체 군의 다른 일부는 대사 질환을 처리하는데 있어 중요한 약물 표적이다. PPAR은 지질 및 글루코스 대사에 있어 각각 중요한 역할을 한다. 따라서, 상기 수용체의 활성체를 빠르게 밝히는 것을 돕는 방법을 관찰하는 것이 상당히 가치있을 것이다. INV-75는 전통적인 PPARa 유전자, ACO(Acetyl-CoA Oxidase)를용량 의존적 및 시간 의존적 방식으로 활성화시킨다(도면 6A). 시간 경과 실험을 최대 15시간 동안 INV-75의 존재 하에 수행했다. 그 후, 우리는 인간 총 길이 PPARa 프로모터-리포터 구조로 감염시켰고 INV-75가 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 증가시킨다는 것을 설명했다(도면 6B). 다음 실험에서, 우리는 PPARa 활성의 시간 경과를 추적했고 <1 시간에서의 활성 및 최대 15시간에 PPARa 활성에 대한 지속적인 효과를 증명했다(도면 6C). 우리는 그 후 이스트 GAL4-PPARa-LBD 플라스미드 + UAS-루시퍼레이즈; GAL4-PPARδ-LBD 플라스미드 + UAS-루시퍼레이즈 및 GAL4-PPARa-LBD 플라스미드 + UAS-루시퍼레이즈로 감염된 HepG2 세포에서 실험을 수행하여, PPARa의 INV-75 특성을 검사했다. PPARa, PPARδ 및 PPARγ 결합 평가를, 다양한 농도의 INV-75(1μM, 10μM, 100μM, 및 1000μM)를 사용하여 수행했다. 루시퍼레이즈 활성 수준은 PPAR 활성의 정도에 상응한다. 결과는, WY-14643(PPARa 작용제), Bezafibrate(PPARδ 작용제) 및 Rosiglitazone(PPARa 작용제)와 같은 전통적인 PPAR 작용제와 비교했다. 상기 결과는 PPARa 또는 PPARγ활성에 대한 효과 없이, 선택적인 방법으로 INV-75가 PPARa 리간드 결합 활성을 증가시킨다는 것을 보여준다. 따라서 INV-75는 선택적이나, PPARa 활성에 부분적으로 작용 특성을 갖는다.

실시예3

3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(O-아세틸 니트로메틸렌디옥시페놀 또는 여기서 INV-75라고도 함)의 생물학적 실험: 생체 연구

INV-75로 처리된 6마리의 토끼에 과콜레스테롤혈성 토끼(Watanabe Heritable Hyperlipidemic Rabbit:WHHL) 생체 실험을 했다. 4마리의 토끼를 대조군으로 하였다.

동물 모델: 2개월 째 약 2kg의 무게인 WHHL 토끼를 Alabama의 Brown Family에서 구매했고 Laboratory Animal Center 기관에서 사육했다. 6개월 생 토끼를 모든 실험에서 사용했다. 토끼는 자유롭게 물을 마실 수 있었고 Harlan Tekad TD 7251로부터의 고콜레스테롤식(2% 콜레스테롤)을 했다. 동물 관리 및 실험 프로토콜은 국가적으로 승인 받은 지침에 따라 수해했다. 토끼가 한 프로토콜이 도면 7에 대략 나타나 있다. INV-75를 90% 에탄올에 용해시키고 고 지방식에 분무했다. 에탄올을 제거하기 위해 식이-약물 혼합물을 그 후 밤새도록 진공 건조한 후 토끼 사료로 사용했다.

생체 프로토콜(토끼):

각 동물에 세가지 MRI 연구를 했다: 첫번째는 고지방식 이전(약물 투여 전의 기준); 두번째는 약물 치료 중간; 및 마지막 연구는 약물 치료 12주 후이다(도면 7). WHHL 토끼는, 기준 MRI 측정 및 혈액 활동이 고 콜레스테롤식 이전에 얻어진 것에 도달한 후에, 새로운 환경에 적응하도록 했다. INV-75의 약물치료는 고지방식 후 4-6주에 시작했다. 약물 치료 중에 중간 지점 측정을했다. 연구 마지막에, 모든 동물은 플라크 부피 정량화를 위해 MRI 연구를 했다. 마지막 MRI 이후 즉시 토끼를 안락사시켰고 대동맥을 취하여 추가 검사를 했다(조직병리학, 유전자 및 단백질 발현). 연구 프로토콜은 동물 실험 위원회(institutional animal research committee)에서 승인받았다. 시술용 마취(MRI 연구)를 케타민(30mg/kg) 및 자일라진(2.2mg/kg)를 근육 내 주사하여 유도했다. 복강동맥 위의 복부 대동맥 약 5cm를 무균 도구를 사용하여 절개했고, 살균된 PBS(phosphate buffered saline)에서 세척하였으며, 즉시 액체 질소에 냉동시켜 유전자 및 단백질 발현이 진행될 때까지 -80℃로 저장했다. 모든 동물은 "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"에 따라 사람이 사육했다.

비침습성 MRI 프로토콜 및 결과

고해상 비침습성 MRI를 상응하는 처리 전 또는 이후에 죽상경화증의 정도를 측정하기 위해 수행했다. WHHL 토끼의 복부 대동맥에서 죽상경화성 플라크를, 표시된 시간 지점에서 생체 MRI 스캔을 통해 검사했다(도면 7). 이 실험 설계는 각 동물이, 플라크 진행/퇴화에서의 정확한 시리얼 데이타를 가능하게 할 뿐 아니라 처리군 간의 비교를 가능하게 하는, 자체 대조군이 되도록 하였다. MRI 연구는, 동물을 감싸고 있는 위상 배열 심장 코일(phased array cardiac coil)을 이용하는 1.5-T 자석(독일, Magnetom Sonata, Siemens Medical Solutio, Erlangen)을 사용하여 수행했다. 경사 에코(gradient echo) 관상 및 시상 봉합 영상을, 복부 대동맥을 배치화하는데 사용했고, TURBO Flash 순서를 사용하여 장골분기(iliac bifurcation)까지의 복강동맥 위에서부터 복부 대동맥의 연속적인 횡근 영상(간격 없이 3-mm 두께의 단편)을 얻었다. 거의 장골분기로부터 가장 좋은 신장의 상극으로 회전하는 마흔 여덟 개의 4mm 두께인 축 슬라이스를, T1-중량 경사 에코 터보 FLASH 프로토콜(TR/TE 230/5.0, 3 평균, 슬라이스 간에 5.2mm 간격인 4.0mm 두께 슬라이스 및 약 11분의 획득 시간)을 사용하여 얻었다. 복부 대동맥이 상대적으로 동잡음이 없기 때문에 호흡 또는 심장 동기(gating)가 필요했다. 플라크 부하는 EEM(external elastic lamina) 및 내강연(luminal border)(L)를 수동으로 추적하고 Siemens viewer software을 사용하여 각 경계 내의 면적을 측정하여 검토했다. 슬라이스 부피(V)는 V=(EEM-L)*4.0 으로 계산했고, 동물 당 총 벽(wall) 부피는 TWV=Σ[(EEM-L)*4]의 식을 사용하여 계산했고 mm³으로 표현했다. NWV=(TWV/n)*m 식인 가독성(readable) 슬라이스의 숫자를 다양화하기 위하여, 각 시간 당 각 동물의 TWV를 표준화했다; n=각 동물에서 가독성 슬라이스의 숫자이고 m= 모든 시간 지점 동안 모든 동물에서의 가독성 슬라이스의 평균 수이다. 죽상동맥성 플라크의 지표인, 토끼 복부 대동맥 내의 벽 부피는 일련의 생체 MRI 스캔을 통해 검사했다. 고 콜레스테롤 식이를 한 4-6주 후에, WHHL 토끼는, 동년생의 정상 식이한 뉴질랜드 토끼 보다 복부 동맥 벽 부피가 더 컸고, 이는 죽상경화증이 발생했다는 것을 증명한다.

도면 8A는 MRI로 평가되었듯이, 플라크의 진행에 있어 INV-75 처리의 효과를 묘사한다. MRI 평가는 HFC의 기준에서 수행되었으나, INV-75의 개시 이전에, 약물 처리 중 중간 지점에, 죽기 직전에 수행되었다. MRI 연구는 분석을 위해 PC로 이송되었고 플라크 부피를 Image J software를 사용하여 분석했다. 영상은 신동맥과 장골분기로부터의 거리를 사용하여 해부학적 자세와 맞춰, 죽상경화증 변화에 대한 정확한 시리얼 데이터를 얻을 수 있도록 했다. 대동맥은 복강동맥에서 말단인 대동맥이 혈관 벽 측정을 위해 선택되었다. 팔 연구 또는 조직 병리학적 데이터에 결합되어 모든 MRI 영상을 얻고 분석했다. INV-75 섭취 이전에, 기준에서 대조군 및 INV-75 군의 평균(SEM) 평준화된 벽 부피(NWV)는 각각 0.27cm³(.021cm³) 및 0.24cm³(0.0099cm³)이었다. 이는 유의하게 다르지 않았다(일원 분산 분석, p=0.0001). 6주의 초기 시점 역시 대조군 처리와 비교하여 통계학적으로 현저했다. 도면 8B는 다양한 시점에서 대조군 또는 INV-75 처리된 복부 대동맥 플라크의 대표적인 MRI 영상을 보여준다.

INV-75의 항-죽상경화 효과를 평가하는 형태계측학적 분석

하행 흉부 대동맥의 단편이 Optimal Cutting Temperature 화합물(Tissue-Tek Sakura Finetek USA Inc, Torrance, Calif)에 매봉되어 있었고 드라이아이스에 냉각되어 있었다. 그 후 얼굴 단면(en face section)을 제조했다. 죽상경화 부하를 분석하기 위해, 8개의 단면(4μm 두께)을 20μm 간격으로 집합시켰다. H&E 염색이후에, 각 단면을 디지털 카메라로 디지털화하였고, NIH(National Institutes of Health) 영상 소프트 웨어 버전 1.61로 된 현미경(Spot I 디지털 카메라로 된 Zeiss Axioskop, Jena, 독일)을 사용하여 분석했다. 결과는 mm²로 표현되었다. 12주 말미에 흉부 대동맥 내 플라크 부하의 형태계측학적 평가가, MRI에 의해 복부 대동맥에서의 INV-75의 항-죽상경화 효과를 입증했다. WHHL 토끼의 대조군 및 INV-75 군의 복부 대동맥에서 죽상경화 부하의 요약이 나타나 있다. n=5/군. *, p<0.05 vs 대조군 동물, n=4, 편측성 t 검정 사용. WHHL 토끼에서 대조군에 비해 죽상경화 부하가 약 60%가 감소한 것으로 나타났다(도면 9).

면역조직화학적 접근 및 결과:

면역조직화학적 염색은, 일차 항체(1:200 농도) 및 탐지 시스템(Immunoperoxidase Secondary Detection System; Chemicon International, Temecula, CA)를 사용하여 염증량을 평가하기 위해 수행되었고, 카메라 시스템(Spot I 디지털 카메라의 Zeiss Axioskop)으로 영상을 디지털화한 후에 소프트웨어(NIH Image)으로 정량화했다. CD68에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology Incorporated(Santa Cruz, CA)에서 구입했다. 다클론성 항-a-액틴 항체를 Upstate Cell Signaling Solutions(Lake Placid, NY)에서 구입했다. T 세포 수용체 β항체는 Biolegend (San Diego, CA)에서 구입했다. 염색을 정량화하기 위해, 4개의 음성 대조군(일차 항체가 없는 것) 단면의 평균 밀도를 역치로 설정했고, 양성 면적은 소프트웨어로 구했다. 결과는 최종적으로 외 탄력막에 의해 내강 사이로 형성된 면적 또는 내중막 부피로 표준화되었다. 대조군과 비교할 때 대식세포 및 평활근에서 INV-75의 효과는 각각 CD68 및 a-액틴 면역조직화학으로 평가되었다. INV-75가 감소된 대식 세포의 수 vs 대조군 및 보든 군의 총합이 도면 10에 막대 그래프로 나타나있다(n=4-5동물/군). *p<0.05 vs 대조군 동물/

p<0.05는, 3 이상의 매치 값(matched value)은 가우시안이고, 값들은 통계학적 제한 이내에 있다는 것을 나타낸다. 흉부 대동맥 단면의 면역조직화학 검사는 죽상경화 플라크에서 CD68+ 세포가 감소하지만, 평활근 증식이 증가한다는 것을 나타낸다(도면 10 및 도면 11).

대동맥 내 지질 침착은 약물 처리 후 총 14시간 후에 밝혀졌고, 토끼를 죽이고 복부 대동맥을 4% 파라포름알데히드에서 고정시켰다. 대동맥 벽 내에 지질 침착은 그 후 오일 레드(oil red)로 염색하여 가시화되었다. 복부 대동맥의 Oil Red O 염색은, 대조군에 비하여 INV-75 처리된 동물의 복부 대동맥 단면의 역치 면적의 퍼센트로 측정된, 플라크 면적에서 지방 함량이 감소한 것으로 나타났다. INV-75는 현저하게 지방성분 vs 대조군을 낮췄다. 복부 대동맥의 Masson의 3색 염색은 대조군에 비하여 INV-75 처리된 동물의 복부 대동맥 단면의 역치 면적의 퍼센트로 측정된, 플라크 면적에서 콜라겐 함량이 감소한 것으로 나타났다(도면 13).

지방 프로파일(profile): TC, TG, HDL, LDL 및 VLDL

과콜레스테롤혈증 및 산화 스트레스는 죽상경화증의 진행에 있어 중요한 기능을 한다. 혈액 내 지질(콜레스테롤 및 LDL)은 기준 및 종점 측정 모두에서 혈액 샘플을 분석하여 측정했다. 귓볼 혈관의 혈액 1ml을 고 콜레스테롤 식이를 시작할 때 및 다시 죽이고 나서의 시간에 K EDTA 튜브에 놓았다. 모든 값은 평균 ±SD로 표현되었다. 고지방식 후이나 시술 전에, 그리고 INV-75와 대조군의 시술 종점에 이어, 고지방식 시작 이전의 기준에서 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤에 대한 각 군의 막대그래프가 나타나 있다(도면 14A 및 도면 14B). INV-75와의 처리 종점에서 총 콜레스테롤 또는 LDL 콜레스테롤에 있어 차이가 없었다. 효과가 없는 것은, 현저하게 높은 지질을 갖고 LDL 수용체의 돌연변이를 갖는 유전 모델(WHHL)과 관련이 있을 수 있다. INV-75가 LDL 수용체 발현의 증가를 통해 LDL 제거를 높이는 기능이 있는 것으로 알려져 있기 때문에, LDL 콜레스테롤 및 총 콜레스테롤(기준선 및 고지방식에 대한 본 모델의 주요 지단백질)에 대한 효과가 없는 것은 이해할 수 있는 것이다.

내피세포 기능: 혈관성 생리학적 효과를 연구를 위한 심방실 기관 실험(Organ Chamber experiment)

치사량의 펜토바르비탈을 주사하여 토끼를 안락사시켰다. 상행 대동맥을 제거했고 2mm 흉부 대동맥 환을, 37℃에서 산소 내에 5% 이산화탄소가 지속적으로 주입된, 생리식염수 버퍼(염화 나트륨 130mEq/L; 염화칼륨, 4.7mEq/L; 황산마그네슘, 1.17mEq/L; 이인산칼륨, 1.18mEq/L; 이탄산나트륨, 14.9mEq/L; EDTA, 0.026mEq/L; 및 글루코오스, 99.1mEq/L[5.5mmol/L]; pH7.4)로 채워진 각 심방실 기관에 달았다. 혈관은 상기 언급된 대로 작용제의 용량이 나누어지기 전에 30mN의 휴지 장력에서 적어도 1시간 동안 평형시켰다. 혈관 수축 작용제는 페닐에프린(PE), 엔도텔린-1(ET-1) 또는 안지오텐신 II를 포함했다. 반응은 염화 칼륨 120mEq/L에 대한 최대 반응의 퍼센트로 표시되었다. PE 처리되는 혈관은 철저하게 세척되었고, 아세틸콜린, SNP(sodium nitroprusside) 또는 인슐린과의 실험을 시작하기 전에 1시간 동안 평형화시켰다. 안정적인 수축 후에, PE(0.1μM)로 안정기에 도달했고, 환은 내피세포 의존성 작용제 아세틸콜린, 인슐린 또는 내피세포 비의존성 작용제 SNP에 나누어진 용량으로 노출시켰다. 결과는 PE(0.1μM)에 의한 전수축의 퍼센트로 표현되었다. 아세틸콜린에 노출된 환은 완전히 세척했고 1시간 동안 평형화시켰다. 안정적인 수축 후에, PE(0.1μM)로 안정기에 도달했고, 그 후 세척 및 SNP에 대한 반응에 이어 인슐린을 누적하는 방법으로 첨가했다. 결과는 PE(0.1μM)에 의한 전수축의 퍼센트로 표현되었다. INV-75는 안지오텐신 II에 의해 대동맥 수축을 감소시켰으나, 페닐에프린에는 영향이 없었다(도면 15 및 도면 16).

안지오텐신 II에의 반응에 현저한 영향을 미치는 것과 반대로, INV-75는 PE, 엔도텔린-1에의 반응에 영향을 미치지 않는다. INV-75는 아세틸콜린 의존성 혈관확장에 대한 현저한 효과 및 최소한의, 인슐린에 대한 현저하지 않은 효과를 나타낸다(도면 17 및 도면 18). INV-75는 SNP, 내피세포 비의존성 혈관 확장에는 영향이 없다(나타나지 않음). INV-75 토끼에서 안지오텐신 II에 대한 반응 감소는 안지오텐신 II 제1형 수용체의 mRNA 감소와 필적한다(자료가 나타나 있지 않음). 표1은 WHHL 토끼의 흉부 대동맥에서 다양한 작용제에 대한 반응의 요약을 나타낸 것이다.

PE

ET-1

AII

Ach

SNP

인슐린

최대
z

로그
EC5
0

최대

로그
EC5
0

최대

로그
EC5
0

최대

로그
EC5
0

최대

로그
EC5
0

최대

로그
EC5
0

CON

132
±7

6.6±
0.1

52±
10

7.3±
0.3

20±
1

8.1±
0.1

27±
4

5.7±
0.2

81±
7

6.6±
0.2

69.3±
10.7

3.7±
1.2

INV-75

135
±5

6.7±
0.1

47±
9

7.5±
0.4

13±
1

8±0.
2

74±
2***

6.3±
0.1*

72±
6

6.8±
0.1

71±
9.9

4.2±
0.7

*p<0.01; ***p<0.001

산화 스트레스 측정: 8-에피 프로스타글란딘 F2a(8-이소프로스탄) 효소 결합 면역 검사

플라즈마 및 간 샘플을 WHHL 토끼가 죽는 시점에 얻었다. 간 용해물을 PBS에서 균질화하여 제조했다. 두가지 샘플 모두 친화 정제(affinity purification)(Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich)했고 rm 후 stat-8-Isoprostan ELISA 키트(Cayman Chemical, Ann Arbor, Mich)와 8-이소프로스탄을 측정했다. 간에서의 수치는 단백질로 조절했다. 간 용해물 내의 단백질 수준은 BCA 단백질 검사법(Pierce, Rockford, IL)로 측정했다.

플라즈마 및 대동맥 균질 현탁액 내에서 8-에피 프로스타글란딘 F2a(8-이스프로스탄) 생성은 대조군에 비해 INV-75가 현저하게 낮았다(도면 19, 도면 20)

디히드로에티듐 염색에 의한 수퍼옥사이드(O₂ ^·-) 검출

O₂ ^·-의 인 시추(in situ)검출이 OCT 화합물(Tissue-Tek®, Sakura Finetek USA Inc, Torrance, CA)에 침전된 스냅 냉동된(snap frozen) 대동맥 조직에서 수행했다. 조직 샘플을 20μm의 두께로 냉동절편하였고, Superfrost Plus slide(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)에 모았으며, 필요할 때까지 -80℃에 저장했다. 각 쥐(조직 블록)에서 무작위 선택된 네 개의 슬라이드를 상온에서 30분 동안 PBS(phosphate buffered saline)에 넣었고, 그 후 어두운 습한 방에서 PBS에서 디히드로에티듐(DHE, 10μM, Molecular Probes, IN., Eugene, OR)으로 20분 동안 염색시켰다. 슬라이드를 PBS로 넓게 행궜고, 커버슬립(coverslip)하였으며, 현미경으로 디지털 영상화 하였다(Spot I 디지털 카메라의 Zeiss Axioskop, Jena, 독일). DHE는 세포에 자유롭게 투과되고, O₂ ^·- 존재 하에 이 전자 산화되어, DNA로 삽입되어 세포 내에 같힌 DNA-결합 형광 브롬화 에티듐을 형성할 수 있다. 반응은 세포 퍼옥시다아제 및 수소 퍼옥사이드에 의해 유도된 최소한으로 산화되는 상대적으로 O₂ ^·-에 특이적이다. 저해제 연구에서, DHE로 염색시키기 전에, 슬라이드는 300μm 아포시닌(apocynin)(Sigma), 10μM 디페닐아이오도늄(DPI, Fisher Scientific) 또는 PEG-SOD(250U/ml)과 30분 동안 배양시켰다. 모든 군의 결과 요약은 막대로 나타나 있고, *, p<0.01은 3 이상의 매치 값이 Gaussian 이고 값들이 통계학적 제한 내에 있다는 것을 나타낸다.

NADPH 유래 수퍼퍼옥사이드(O₂ ^·-)의 루시제닌(lucigenin) 화학 발광: INV-75의 효과

산화 스트레스는 죽상경화증과 관련이 있다. NADPH로부터 유래된 수퍼옥사이드(O₂ ^·-)는, 잠재적으로 죽상경화 플라크 형성을 촉진시킬 수 있는 자유 라디컬 사슬 반응을 잠재적으로 유발할 수 있다. 토끼 대동맥은 PBS에서 균질화되고, 단백질 농도는 5μg/μl으로 조절했다. 세포 용해물의 20μl/웰을 Kreps-Hepes Buffer(pH=7.4; 초기에 95% O₂, 및 5% CO₂ )내의 96-웰 마이크로플레이트에 놓았다. 기준 O₂ ^·-의 생성은 5μM 루시제닌으로 측정했다. NADPH 유도된 O₂ ^·-생성은 NADPH(100μM)를첨가하여 측정했다. Berthold Luminometer LB 960으로 측정했다. Luminometer 설정은 0.1s 측정 및 30s 동력으로 했다.

대동맥 조직 용해물에서 기본적이고 자극된 수퍼옥사이드 생성은 보통 대조군과 비교하여 낮은 것으로 밝혀졌고, 통계학적 분석은 n=5/군을 기준으로 하여 이루어졌다. 수퍼옥사이드 제조에서 *, p<0.05 vs 대조군 동물(도면 22).

INV-75 및 대조군에 대한 반응에 있어 염증 유전자 및 단백질 발현

혈관성 염증이 죽상경화증에서 중요한 역할을 하기 때문에, 전-염증 유전자 발현 및 단백질 발현을 평가하는 것은 INV-75의 항-염증 효과에 대한 추가적인 정보를 준다.

정량적인 RT-PCR 분석

총 RNA를 TRIzol 시약(Invotrogen)으로 분리시켰다. 무작위 헥사머(hexmaer) 및 ThermoScript RT-PCR System(Invitrogen)으로, 총 RNA의 4microgram을 역 전사시켰다. 정량적인 실시간 PCR은 SYBER Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Forster City, CA)를 사용하여 Stratagene Mx3005로 실시했다. GAPDH와 비교하여 상대적인 발현 수준이 얻어졌다. 본 실험에서 사용된 프라이머는 아래 표에 묘사되어 있고 Invitrogen에서 구입했다.

유전자	센스/안티센스	서열 ID 번호	서열
토끼 ICAM-1	센스 안티센스	1 2	5'-GCC TGA GGT CCA GTT CTG TG-3' 5'-GCG GAC ACA GCT CTC AGT AG-3'
토끼 GAPDH	센스 안티센스	3 4	5'-GCC TGG AGA AAG CTG CTA AG-3' 5'-CCA GCA TCG AAG GTA GAG GA-3'
토끼 CVAM-1	센스 안티센스	5 6	5'-TGC CGA GCT AAA TTA CAT ATC G-3' 5'-TCA TTG TCA CAG AGC CAC CT-3'
토끼 P-셀렉틴	센스 안티센스	7 8	5'-CGG ACC AGA AAG ACT GGA CT-3' 5'-GTT CCT CAC ATG GTG CTG GAC-3'
토끼 L-셀렉틴	센스 안티센스	9 10	5'-GCT CAG AAG GAG CCG AGT TA-3' 5'-TTA CCA TGA CTG CCA CAG GA-3'
토끼 MCP-1	센스 안티센스	11 12	5'-AGC ACC AAG TGT CCC AAA GA-3' 5'-TGT GTT CTT GGG TTG TGG AA-3'

웨스턴 블롯 분석

0.25% 소디움디옥시콜레이트 및 1.0% Nonidet P-40과 함께, 방사성면역침강법(radioimmunoprecipitation) 버퍼(50mM Tris-HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM NaF, 1mM Na₃VO₄)및1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드에서 표본을 균질화 및 용해시켰고, 10,000g에서 4℃로 30분 동안 원심분리했다. 상청액을 모았고 웨스턴 블롯 분석을했다. 간단하게, 단백질 40μg을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분리했고 그 후 니트로셀룰로오스 막에 이동시켰다. 막은 그 후 다음으로 배양되었다: 단일클론 안티-β-틴액(Sigma, St. Louis, MO), 단일클론 안티-VCAM(R&D Systems, Minneapolis, MN), 단일클론 안티-ICAM(R&D Systems, Minneapolis, MN), 단일클론 안티-포스포-eNOS(pS1177)(BD Bioscience, Billerica, MA), 토끼 안티-eNOS(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 토끼 안티-포스포-Akt(Thr308)(Cell Signalling Technology, Dancers, MA), 염소 안티-Akt(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 및 토끼 안티-p65(Cell Signalling Technology, Dancers, MA). 마지막으로 상기 막은 당근과산화효소(horseradish peroxidase)-결합된 이차 항체로 배양되었고 향상된 화학발광 키트(Amersham Bioscience Inc., Piscataway, NJ)로 가시화되었다. 대역 밀도는 ImageJ를 사용하여 밀도 분석을 하여 정량화하였다.

INV-75는, 흉부 대동맥에서 VCAM-1, ICAM-1, MCP-1 및 L-셀렉틴의 mRNA 발현을 감소시켰다(도면 23). 우리는 단백질 수준에서 상기 접합 분자의 발현을 측정하여, 대동맥 내 VCAM-1 및 ICAM 유전자 발현에서 INC-75의 효과를 입증했다. 도면 24는 VCAM-1 및 ICAM-1 발현에서 웨스턴 블롯 분석한 것을 요약한 것이다. INV-75는 VCAM-1 및 ICAM-1의 단백질 발현을 현저하게 감소시킨다.

우리는 또한 접합 분자 VCAM-1의 조절에 대한 효과를 이해하기 위해, 세포 배양에서 INV)75의 효과를 검사했다. 우리는 INV-75가 NF-kB 활성 및 HUVEC 세포에서 VACM-1과 ICAM-1의 발현을 줄인다는 것을 위에서 밝혔었다(도면 3 및 도면 4 참고). 우리는 이 발견을 재확인하였으나, 우리가 INV-75가 PPARa 수용체 및 ACO와 같이 PPARa 조절된 유전자를 활성화한다는 것을 입증했던, 상기 도면 6에서 전술되었듯이 상기 결과가 PPARa의 활성과 관련되어 있는지에 대해 추가적으로 의문을 제기했다. HUVEC는 매개체, INV-75 또는 WY-14643과 2시간 동안 전처리했고, 그 후 TNFa와 4시간동안 처리했다. VCAM-1 발현은 기간 말미에 검사했다. 세가지 독립적인 실험의 대표 및 요약이 나타나있다. *, p<0.05 vs 대조군; #, p<0.05 vs TNFa(도면 25). 이 실험은, INV-75와 함께 보이는 VCAM-1의 감소가 PPARa 활성에 대한 효과와 관련이 있을 수 있다는 것을 보여준다.

스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBP-2) 활성: 생체 실험

우리는 이전에 세포 배양에서 SREBP-2 및 LDL 수용체를 조절하는데 있어 INV-75의 효과를 관찰했기 때문에, 우리는 상기 결과를 생체 쥐 모델(C57B1/6마리 쥐)에서 확인하기 위해 진행했다. SREBP 활성에 대한 INV-75의 효과를 연구하기 위해, 생체 실험이 다음과 같이 수행되었다: C57B1/6마리 쥐(6/군)에 INV-75로 복강내 주사하였다(20mg/kg/day, 2주). 간 균질물의 핵 단백질에서 SREBP-2의 결합 활성은 EMSA(electrophretic migration shift assay)로 측정되었다. 동시에 콜레스테롤 합성 및 조절에 관여하는 다수의 유전자, 지단백질 유전자 발현 및 PCSK9(Propotein convertase subtilisin/kexin type 9)의 발현 역시 간에서 연구되었다. PCSK9은, LDLR(low density lipoprotein receptor) 분해를 유도하면서, LDLR의 EFG-A(epidermal growth factor-like repeat A)도메인과 결합하여, LDL 수용체를 조절하는 것으로 알려져있다.

결과는 INV-75가 LDL을 현저하게 낮췄으나 다른 지단백질은 그렇지 않았다는 것을 나타낸다(도면 27). 이는 실시간 RT-PCR(도면 26) 및 웨스턴 블롯(자료가 나타나지 않음)에 의해 측정되었듯이 간에서 LDL 수용체 발현이 증가한 것과 대비된다. EMSA(electrophoretic migration shift assay)로 측정했을 때, INV-75는 또한 LDLR을 조절하는 결정적 전사 인자인, SREBP-2를 현저하게 활성화시켰다(도면 28).

이 결과는, INV-75가 SREBP-2의 활성을 통해 LDLR을 과조절하여, LDL 콜레스테롤 수준을 낮출 수 있다는 것을 확인했다. INV-75는 LDL을 낮추는 유리한 효과가 있다는 것에 대한 우리의 발견을 더욱 강화시킨다.

실시예 4

메틸렌디옥시페놀 및 dl-리포산(INV-7065)으로부터 3,4-메틸렌디옥시페닐 리포에이트(O-리포일 메틸렌디옥시페놀) 합성.

화합물 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(C₁₅H₁₈O₄S₂)(O-리포메틸렌디옥시페놀 및 여기서 INV-7065라고도 함)은 326.43의 분자량(MW)을 갖고, C₁₅H₁₈O₄S₂의 식을 갖는다. INV-7065는 질소에서 할로겐화된 용매를 사용하여, 리포산 및 메틸렌디옥시페놀을 처리하여 만들어졌다.

250mL 환저 플라스크에서, 4.5g(0.033mole)의 3,4-메틸렌디옥시페놀(Aldrich, catalog #S3003-25G-A) 및 5g의 디메틸아미노 피리딘(Aldrich, catalog #522821) 및 120mL의 디클로로메탄을 상온에서 15분 동안 잘 교반했다. 7.4g(0.036mole)의 알파 리포산(Geronova Research Inc)를 10분 동안 분할하여 첨가했다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(EDCI Aldrich, catalog #:E7750) 8.6g(0.8mole)을 45분 동안 첨가했고, 밤새도록 계속 교반했다. 모든 용매는 상업 등급(commercial grade)이고, Fisher Scientific에서 구매했다. 다른 할로겐화된 용매가 사용될 수 있고, 여기에는 클로로포름 및 카본 테트라클로라이드를 포함하나 여기에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 할 것이다. 다른 커플링제(coupling agent)가 사용될 수 있고, 여기에는 디사이클로카르보디이미드(DCC) 및 디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 포함하나 여기에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 할 것이다.

약 24 시간의 반응 시간 이후에, 정제 전 생성물(crude product)의 얇은 막 크로마토그래피(3:1 헥산: 에틸 아세테이트 용매 시스템)을 시작 물질로 확인하여, 생성물의 형성 및 시작 물질 3,4-메틸렌디옥시 페놀의 소멸을 확인했다. 반응 완료 후에, 디클로로메탄이 감소된 압력에서 증발되었다. 3:1 헥산: 에틸 아세테이트 용매 시스템으로 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 직접 정제시켜 두꺼운 황색 물질을 얻었다. 컬럼 크로마토그래피로부터의 용매의 느린 용리는 더 높은 순도의 생성물을 얻기 위해 필요하다. 얻은 황색의 푹신한 고체는 결정화 방법에 의해 재정제화되었다. 결정화는 90% 에탄올을 사용하여 수행하였고, 그 절차는 화합물 INV-7065(약 2g)을 10분 동안 따뜻한 에탄올(약 35mL)에 연속적으로 교반하면서 천천히 첨가하는 것을 포함한다. 화합물을 완전하게 용해시킨 후에, 연한 황색 용액이 빠르게 걸러졌고 느린 결정화를 위해 밤새 놓아두었다. 반짝이는 폭신한 고체가 걸러졌고 진공 건조기를 사용하여 건조시켰다. 총 수득률은 65%-73%였다. 결정화된 생성물은 고해상도의 양성자 NMR을 사용하는 것을 특징으로 한다. 다음은 상기 반응의 개략적인 대표도이다:

NMR 특성: 결정화된 화합물은 고해상도 양성자 NMR로 특징되고, 생성물의 전형적인 양성자 화학적 이동 값은 (CDCl3): 6.77-6.75(1H, 이중선), 6.59-6.58(1H, 이중선), 6.52-6.49(1H, 이중선의 이중선), 5.97(2H, 단일선), 3.61-3.57(1H, 다중선), 3.19-3.10(2H, 다중선), 2.56-2.52(2H, 삼중선), 2.51-2.45(2H, 다중선), 1.95-1.86(2H, 다중선), 1.79-1.73(4H, 다중선), 1.58-1.53(2H 다중선). 도면 1B.

실시예 5

3,4-메틸렌디옥시페놀 리포에이트(INV 70-65)의 생물학적 활성

INV 70-65가 리포산 및 메틸렌디옥시페놀을 처리하여 만들어졌기 때문에, 우리는 리포산의 효과 vs 메틸렌디옥시페놀의 효과를 구별하기 위해, 특히 리포산 단독과 비교하여, 그 효과를 이해하려고 시도하였다. 따라서, 생체 실험을 수반하는 우리 실험에서 비교군 중 하나는 리포산이다.

동물 모델: 15 수컷 New Zealand White rabbit(Charles River, MA)를고지방식(HFD)시켰다(0.5% 콜레스테롤으로 Harlan Teklad 토끼 식이, TD 87251). 고지방식 4주 후에, 토끼를 무작위로 세개의 다른 처리 군, 보통 대조군(n=5), 리포산군(100mg/kg/day)(n=5), INV 70-65군(100mg/kg/day)(n=5)으로 나누었다. 상기 약물은, 약물을 고지방식과 혼합하여, 사료를 통해 동물에 투여되었다. 정해진 양의 사료 및 사료에 혼합된 약물을, 각 토끼의 식품 섭취량을 주의 깊게 계산한 후에 모든 동물에게 매일 먹였다. 약물은 100% 에탄올에 녹였고, 식품에 분사하였으며, 에탄올이 증발하도록 밤새 진공하에 보관했다. 약물 또는 HFD 혼합된 대조군 2 주 후에, 모든 토끼를 대동맥 풍선 박피(aorta balloon denudation) 수술을 했고 이어서, 약물 또는 HFD 혼합된 대조군의 연속적인 투여를 12주 동안 했다. 도면 29는 실험 설계의 대략을 보여준다.

죽상경화증 평가를 위한 자기 공명 영상 프로토콜

MRI 실험을 두번의 시점에서 수행했다: 풍선 박피 절차 후 1주 및 12주(도면 29). MRI 획득 전에, 토끼를 자일라진(2mg/kg) 및 케타민(40mg/kg)를 근육 내 주사하여 안락사시켰고, i.v. 카테터(Surflo 24G×3/4", TERUMO® Medical Corp., Elkton, MD)를 다음의 조영 투여를 위해 귓볼 혈관에 놓았다. 이중 역전 T1-중량 경사 에코 터보 FLASH 서열을 사용하여 죽상경화증을 평가하기 위해, 전 및 후 MRI 영상을 1.5T 32-채널 전신 MR 시스템(MAGNETON Avanto, Siemens, 독일)을 사용하여 얻었다. 영상을 위해, 토끼를 복와위로 놓았고, 구부리기 쉬운 6-원소 위상 배열 바디 코일(flexible 6-element phase array body coil)로 묶었다. 장골분기로부터 최고 신장의 상극까지 거의 신장되어 있는 하향 대동맥에 수직인, 서른 개의 4mm 두께 횡단 슬라이스(슬라이스 간에 4.6mm 간격)를 다음과 함께 얻었다: TR/TE=260/5ms, 평면 내 해상도 312×312μm, 대역폭 120kHz, 세 개의 신호 평균 및 총 스캔 시간 12분, 29초. 전-조영 획득에 이어, 0.1mmol/Kg Magnevist 7-10ml 용액(Bayer HealthCare Pharmaceuticals Inc. Wayne, NJ)을 카테터를 통해 주사하였고, 염수 2ml를 흘렸다. 전-조영 검은 혈액 스캔의 반복을 약 6분 및 30초 후-조영 투여로 시작했다. 후-조영 스캔 후에, 토끼를 회복시켰다. MR 영상은 Siemens Leonardo Workstation(Siemens Healthcare Inc., 독일)을 사용하여 분석했다.

각 토끼 군의 죽상경화 플라크 진행의 다른 속도를 평가하기 위해, 대동맥 벽을, 두 MRI 시점에서 전-조영 영상에서 확인했다. 관심영역(ROI)을 각 동물 당 10 내지 22 영상에서, 내부 및 외부 혈관 벽 경계 주변으로 자유롭게 손으로 그렸다. 혈관 벽 외부 경계에 의해 싸인 면적으로부터 루멘(lumen) 면적을 감하여 각 슬라이스에서 혈관 벽 부분을 얻는다. 각 동물 당 총 혈관 벽 부피는 슬라이스 두께(4.6mm) 와 총 혈관 벽 면적(mm)을 곱하여 얻는다. 각 토끼의, 슬라이스의 다양한 숫자를 계산하기 위하여, 표준화된 대동맥 벽 부피를 계산했다.

다른 처리 군에서 플라크 신생 혈관 진행을 평가하기 위해, 12주 후-풍선 박피 MR 영상만을 사용했다. 대동맥 벽을 막고 있는 동일한 ROI는 7 내지 11개의 전- 및 후-조영 MRI 영상에서 손으로 그렸다. 각 슬라이스의 신호 vs 잡음비(SNR)를 몸 밖의 부분으로부터의 잡음의 표준편차로 나눈 혈관 벽에서 얻은 평균 신호로 계산했다. 각 토끼의 SNR 향상 비는 후 및 전 조영 계산된 SNR으로 나누어 얻었다.

도면 30A는 다양한 군에서 플라크 부하의 MRI 평가를 한 것을 보여준다. INV 70-65는, 대조군 동물과 비교하여 12주 처리에 이어 플라크 부하의 두드러진 감쇠를 초래했다. 본 실험에서 리포산 처리 및 INV 70-65 처리군 간에 차이가 없었다. HFD를 먹인 대조군 동물은 죽상경화 플라크 부하가 계속 증가했다.

도면 30B는 다양한 군에서 가돌리늄 투여에 이어 대동맥의 조영 강화를 묘사한다. 도면 30B는 대조군 및 리포산 처리군에 비해, INV 70-65 처리군에 이어 가돌리늄 강화가 줄어들었음을 보여준다.

혈관 기능: 대조군 및 리포산 처리군과 비교하여, INV 70-65의 혈관 생리적 효과를 연구하기 위한 근운동 실험

토끼에 치사량의펜토바르비탈을 주사하여 안락사시켰다. 흉부 대동맥을 근운동 연구를 위해 모았다. 2mm 흉부 대동맥 환을 37℃에서 산소 내에 5% 이산화탄소가 지속적으로 주입된, 생리식염수 버퍼(염화 나트륨 130mEq/L; 염화칼륨, 4.7mEq/L; 황산마그네슘, 1.17mEq/L; 이인산 칼륨, 1.18mEq/L; 이탄산 나트륨, 14.9mEq/L; EDTA, 0.026mEq/L; 및 글루코오스, 99.1mEq/L[5.5mmol/L]; pH7.4)로 채워진 각 심방실 기관에 달았다. 혈관은 작용제의 용량이 나누어지기 전에 30mN의 휴지 장력에서 적어도 1시간 동안 평형화시켰다. 혈관 수축 작용제, 페닐에프린(PE)이 사용되었고 반응은 염화 칼륨 120mEq/L에 대한 최대 반응의 퍼센트로 표시되었다. PE 처리되는 혈관은 철저하게 세척되었고, 아세틸콜린 또는 SNP(sodium nitroprusside)와의 실험을 시작하기 전에 1시간 동안 평형화시켰다. 안정적인 수축 후에, PE(0.1μM)로 안정기에 도달했고, 환은 내피세포 의존성 작용제 아세틸콜린, 인슐린 또는 내피세포 비의존성 작용제 SNP에 나누어진 용량으로 노출시켰다. 혈관 확장 결과는 PE(0.1μM)에 의한 전수축의 퍼센트로 표현되었다. 표 3은 혈관 반응을 요약한 것이고, 도면 31A-31D는 결과를 나타낸다.

INV 70-65를 12주 처리한 말미에 흉부 대동맥에서의 혈관 반응 요약

	대조군		리포산		3,4메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-7065)
	LogEC50(M)	최대효과(%)	LogEC50(M)	최대효과(%)	LogEC50(M)	최대효과(%)
Ach	-5.99±0.33	-12.27±2.54	-6.47±0.18	-33.00±2.94^*	-6.67±0.16	-29.84±2.09*
PE	-6.65±0.08	159.4±6.12	-6.48±0.09	154.0±7.24	-6.28±0.08	109.1±4.78^†
SNP-1	-6.92±0.19	-84.36±6.24	-6.75±0.21	-89.04±7.67	-7.09±0.16	-83.06±4.95
인슐린	1.72±0.12	-114.7±14.53	1.39±0.09	-107.8±7.68	1.47±0.139	-132.5±14.59^†

= p<0.05 vs 리포산; *p<0.05 vs 다조군

도면 31A 및 도면 31B는, 페닐에프린 및 인슐린에 대한 반응에서 INV 70-65의 차별적인 효과를 나타낸다. INV 70-65는 리포산에 비교하여 인슐린의 피크 용량까지의 이완을 향상시켰으나, EC50 용량에는 영향을 미치지 않았다.

반대로, INV 70-65는, 대조군과 비교했을 때, 아세틸콜린에 대한 반응을 향상시키는 데 있어 리포산과 차이점이 없었다(도면 31C). 반대로, 내피세포 비의존성 작용제 SNP(sodium nitroprusside)에 대하여 모든 군에서 차이점이 없었다. 이 결과는 INV 70-65이 혈관 수축성을 알파 수용체 작용제로 감소시키고, 혈관 인슐린 민감성을 증가시킨다는 것을 보여준다.

면역 조직 화학 접근 및 결과

고콜레스테롤혈증 및 산화 스트레스는 죽상경화증의 발달에 중요한 역할을 한다. 토끼를 죽이고 복부 대동맥을 4% PFA(paraformaldehyde)에서 고정시켰다. 대동맥 벽에서 지질 침착은 그 후 오일 레드 염색에 의해 가시화되었다. 복부 대동맥의 Oil Red O 염색은, 대조군에 비해, 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트 및 리포산 처리된 동물의 복부 대동맥 부분의 역채 면적의 퍼센트로 계산된 플라크 면적에서, 지질 함량이 감소한 것을 보여주었다. *, p<0.05, 일원 분산 분석.

우리는 대조군과 비교하여 INV-7065 처리한 동물의 대동맥 벽에서 지질 침착이 약 80% 감소했다는 것과 리포산과 비교하여 약 40% 감소했다는 것을 관찰했다.

혈장 지질 프로파일 연구

지질 프로파일(콜레스테롤, 중성지방, 직접 HDL, LDL 및 VLDL)을 약물로 처리한 총 12 주 후에 수행했다. 귓볼 혈관으로부터의 혈액 1ml를, 고 콜레스테롤 식이를 시작할 때 및 죽이는 시점에 다시, K EDTA를 포함하는 튜브에 놓았다. 모든 값은 평균±SD로 표기되었다. 기준 및 종점 측정 모두에서 각 군의 막대 그래프가 나타나 있다. 통계학적 분석은 일원 분산 분석으로 했다. 일반 대조군과 비교하여 INV-75 및 리포산 군 처리의 말미에 TC 및 LDL 수준이 완만하게 감소했다, 도면 32A 및 도면 32D.

반면에, 중성지방(TG) 수준은 대조군과 비교하여 INV-7065 및 리포산 군이 현저하게 감소했다, 도면 32B. 리포산 군의 HDL 수준은 완만하게 증가한 반면, INV-7065는 적은 변화가 있었다, 도면 32C. INV-7065 처리한 동물은 VLDL이 약간 감소한 반면에, 리포산 처리한 동물은 대조군에 비해 VLDL 수준에 변화가 없었다, 도면 32E. 이 결과는 INV-7065가 대조군 및 리포산 처리한 동물에 비하여 지질 프로파일을 조절하는 데 있어 적당히 효과적이라는 것을 보여준다.

실시예

3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트(O-리포일 니트로메틸렌디옥시페놀)(INV-7465)의 합성 및 정제

3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트는 371.43의 분자량 및 C15H17NO6S2의 식을 갖는다. 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트는 또한 O-리포일 니트로메틸렌디옥시페놀 및 여기서는 INV-7465라고도 한다.

3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트의 합성 및 정제 방법

방법-I

3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트의 합성은 니트로메틸렌디옥시페놀(3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페놀) 및 알파 리포산의 반응으로 이루어지고 아래에 대략적으로 나타나 있다. 니트로메틸렌디옥시페놀(INV-74)의 합성은 본 명세서의 앞부분에서 서술했다.

100mL 환저 플라스크에서, 0.17g(0.001mole)의 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페놀(Aldrich, catalog #:471283) 및 0.1g(140μL)(0.2mole)의 트리에틸아민(Aldrich, catalog #: 471283)과 50mL의 디클로로메탄을 상온에서 10분 동안 잘 교반했다. 용액은 주홍색이 되었다. 0.25g(0.0015mole)의 알파 리포산(Geronova Research Inc)를 5분 동안 첨가했다. N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(EDCI Aldrich, catalog #:E7750) 0.4g(0.002mole)을 15분 동안 첨가했고, 밤새도록 계속 교반했다. 모든 용매는 상업 등급(commercial grade)이고, Fisher Scientific에서 구매했다. 다른 할로겐화된 용매가 사용될 수 있고, 여기에는 클로로포름 및 카본 테트라클로라이드를 포함하나 여기에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 할 것이다. 다른 커플링제(coupling agent)가 사용될 수 있고, 여기에는 디사이클로카르보디이미드(DCC) 및 디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 포함하나 여기에 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 할 것이다.

약 36 시간의 반응 시간 이후에, 정제 전 생성물(crude product)의 얇은 막 크로마토그래피(20% 헥산: 에틸 아세테이트 용매 시스템)을 시작 물질로 확인하여, 생성물의 형성 및 시작 물질 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페놀의 소멸을 확인했다. 반응 완료 후에, 디클로로메탄이 감소된 압력에서 증발되었다. 20% 헥산: 에틸 아세테이트 용매 시스템을 사용하여 예비의 얇은 막 크로마토그레피에서 직접 정제되는 두꺼운 황색 물질을 얻었다. 적절한 밴드는 판에서 스크래치되었고 에틸아세테이트로 조심스럽게 희석되었다. 옅은 황색 고체를 얻었고 결정화 방법에 의해 재정제화되었다. 결정화는 95% 에탄올을 사용하여 수행하였고, 그 절차는 화합물 INV-7065(약 50mg)을 5분 동안 따뜻한 에탄올(60-65℃)(약 10mL)에 연속적으로 교반하면서 천천히 첨가하는 것을 포함한다. 화합물을 완전하게 용해시킨 후에, 결과 용액은 빠르게 걸러졌고 느린 결정화를 위해 밤새 놓아두었다. 황색 고체가 걸러졌고 진공 건조기를 사용하여 건조시켰다. 총 수득률은 42%였다. 결정화된 생성물은 고해상도의 양성자 NMR을 사용하여 특징화하였다.

NMR 특성: 결정화된 화합물은 고해상도 양성자 NMR로 특징화 되고, 생성물의 전형적인 양성자 화학적 이동 값은 (CDCl3): 7.59(1H, 단일선), 6.45(1H, 단일선), 6.15(2H, 단일선), 3.68-3.60(1H, 다중선), 3.21-3.13(2H, 다중선), 2.66-2.64(2H, 삼중선), 2.52-2.47(2H, 다중선), 1.97-1.92(2H, 다중선), 1.84-1.75(4H, 다중선), 1.74-1.58(2H, 다중선)이다. 도면 1B.

3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트 합성. 방법-II

3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트를 합성하는 대안적인 방법은, 니트로기를 3,4-메틸렌디옥시리포에이트에 도입하는 것을 수반하며, 합성 개략도가 아래에 나타나 있다. 3,4- 메틸렌디옥시페닐 리포에이트의 합성은 INV-7065가 있는 본 발명의 명세서에 앞서 제시했다.

100mL 환저 플라스크에서, 0.3g(0.001mole)의 3,4-메틸렌디옥시페닐 리포에이트를 빙초산 20mL에 넣고 상온에서 30분 동안 계속 교반했고, 얼음 냉각 배스에서 냉각시켰다. 교반하는 동안, 빙초산 10mL의 농축된 질산(4mL)이 화학 혼합물에 45분 동안 천천히 첨가되었다. 반응 혼합물은 밝은 노란색으로 변했고 교반은 3시간 동안 지속했다. 결과 용액을 지속적 교반하면서 부서진 얼음에 직접 부었다. 플라스크 바닦에 위치한 옅은 노란색 반 고체는 디클로로메탄(2×50mL)으로 추출했다. 결합된 유기 추출물은 무수 황산 마그네슘에서 건조되었고 감압 하에 용매는 증류되었다. 결과물 황색 물질은 예비 얇은 막 크로마토그레피에서 정제되었다. 최종 생성물은 95% 에탄올을 사용하여 재결정화하여 재정제하였다. 본 발명의 총 수율은 36%였다. 이를 얇은 막 크로마토그래피에 의해 출처가 확실한 샘플을 비교하여 특징화하였다.

실시예 7

3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트(O-리포일 니트로메틸렌디옥시페놀 및 여기서 INV 7465라고도 함)의 생물학적 활성

INV 74-65에 의한 p65의 핵 전위 저해: 검체 세포 배양 실험

세포 배양: 모든 실험은 배양된 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, Invitrogen)으로 수행했고 보충된 배지(Sigma, 10% 열 비활성화된 FCS(fetal calf serum), 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 10mM HEPES, pH7.4, 헤파린 12I.U./ml, 1% 레티날 기원 성장 인자의 M199) 내의 1% 젤라틴으로 먼저 코팅된 조직 배양 플라스크 상에서, 5% CO2 습식 배양기(humidified incubator)에서 37℃로 합류(confluence)되도록 자랐다. 트립신 처리에 이어, 세포는 플라스크에서 떨어졌고, 최종 단층을 HUVEC를 젤리틴-전코팅된 배양 접시에 합류되도록 24-48시간 배양시켰다. 네번째 계대까지의 세포가 실험에서 사용되었다. 재조합 인간 TNF-a를 R&D Systems에서 구입했다.

인간 종양 괴사 인자 알파(TNFa)는, 약 51kDaml 몰 질량으로 세 개의 17kDa 서브유닛으로 구성된, 호모트리머(homotrimer)로 존재한다. 이는, 호중성 백혈구, 호산 백혈구와 T 및 B 림프구의 활성을 조절하고 혈관 내피세포의 특성을 조정하는 전염증성(proinflammatory), 전구세포사멸(pro-apoptotic) 사이토카인이다. 염증성 사이토카인(TNF-a)에서 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트의 생물학적 활성 역할을 연구하기 위해, 검체 세포 배양 실험을 하였다.

효소 면역법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 및 결과: 세포 표면 접합 분자의 표현을 측정하기 위해, ELISA 기술이 사용된다. 96-웰 판의 합류 HUVEC를, 6시간 동안 2ng/mL TNF-a로 자극시키기 전에, INV-75와 다양한 농도(1nM, 10nM, 100nM, 1μM 및 1μM)에서 24시간 동안 전처리했다. 6시간 동안 2ng/mL TNF-a 자극 후에, VCAM-1 및 ICAM-1의 발현이 평가되었다. 6시간 동안 2ng/mL TNF-a의 자극에 이어 12-24 시간 동안 인간 HUVEC 세포를 INV-7465 전처리한 후에 배양 매질을 ELISA 분석한 결과는, VCAM 및 ICAM-1의 방출이 현저하게 줄였음을 보여준다.

실험한 모든 농도에서, INV-7465는 전염증 사이토카인, TNF-a의 효과를 저해했는데, 이는 p65의 핵 vs 세포질 염색비가 감소한 것으로 관찰되었다. 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465)는 잠재적인 항 염증 효과를 가지고, 염증성 분자 TNF-a의 효과와 반대된다.

실시예 8

심혈관 환자의 치료

가슴 중앙 뿐 아니라 어깨, 팔 목, 턱 및 허리에 불편한 압력, 스퀴징(squeezing) 및 통증이 있는 55세 남성. 그는 숨가쁨 및 혈압 상승과 같은 다른 증상도 보인다. 조영술로 평가된 후에, 관상동맥에 플라크 형성이 있는 죽상경화를 겪는 것으로 진단된다. 환자는 효과적인 양의 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV 75)(1.0 내지 100mg/kg)를 포함하는 조성물을 투여한다. 대안적인 치료제는, 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV 73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐(INV 74; 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트(NV-7465) 또는 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-9065)를 포함한다. 조성물은 선택적으로 다음과 같은 치료와 결합하여 투여되는데, 당업자에게 알려진 용량을 사용하여, 예를 들어 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린의 투여, 예를 들어 중황산 클로피도그렐, 스타틴, 안지오텐신 전환 효소 저해제 및/또는 헤파린 또는 이의 조합을 투여한다. 환자의 동맥에 감소된 플라크를 측정하기 위해 조영술로 다시 측정한다.

실시예 9

흉통(협심증)이 있는 심혈관 환자의 치료

가슴 중앙에 30분 미만으로 불편한 압력, 스퀴징(squeezing) 및 통증이 있는 55세 남성. 그는 의심스러운 불안정한 협십증에 적절한 심장 조영술을 한다. 그는 숨가쁨 및 불규칙한 심장박동과 같은 다른 증상도 보인다. 조영술로 평가된 후에, 관상동맥에 플라크 형성이 있는 죽상경화를 겪는 것으로 진단된다. 환자는 효과적인 양의 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV -7565)(1.0 내지 100mg/kg)를 포함하는 조성물을 투여한다. 조성물은 선택적으로 다음과 같은 치료와 결합하여 투여되는데, 당업자에게 알려진 용량을 사용하여, 예를 들어 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린의 투여, 예를 들어 중황산 클로피도그렐, 스타틴, 에제티미브(ezetimibe), 리포산, 안지오텐신 전환 효소 저해제 및/또는 헤파린 또는 이의 조합을 투여한다. 환자는 흉통, 숨가쁨이 향상된 것으로 보여진다. 환자의 동맥에 감소된 플라크를 측정하기 위해 조영술로 다시 측정한다.

실시예 10

흉통(협심증)이 있는 심혈관 환자의 치료

가슴 중앙에 30분 미만으로 불편한 압력, 스퀴징(squeezing) 및 통증이 있는 55세 남성. 그는 의심스러운 불안정한 협십증에 적절한 심장 조영술을 한다. 그는 숨가쁨 및 불규칙한 심장박동과 같은 다른 증상도 보인다. 조영술로 평가된 후에, 관상동맥에 플라크 형성이 있는 죽상경화를 겪는 것으로 진단된다. 환자는 효과적인 양의 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV -7465)(1.0 내지 100mg/kg)를 포함하는 조성물을 투여한다. 조성물은 선택적으로 다음과 같은 치료와 결합하여 투여되는데, 예를 들어 당업자에게 알려진 용량을 사용하여, 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린의 투여, 중황산 클로피도그렐, 스타틴, 에제티미브(ezetimibe), 리포산, 안지오텐신 전환 효소 저해제 및/또는 헤파린 또는 이의 조합을 투여한다. 환자는 흉통, 숨가쁨이 향상된 것으로 보여진다. 환자의 동맥에 감소된 플라크를 측정하기 위해 조영술로 다시 측정한다.

실시예 11

급성 비-ST 상승 심근 경색(Acute Non-ST Elevation Myocardial Infarction)이 있는 심혈관 환자의 치료

가슴 중앙 뿐 아니라 어깨 팔, 목, 턱 및 허리에 불편한 압력, 스퀴징(squeezing) 및 통증이 4시간 넘게 있는 55세 남성. 그는 숨가쁨 역시 호소한다. 그는 응급실에서 평가되었고 Troponin I이 상승한 것으로 나타났으며, 그의 EKG는 심근 경색과 일치하여 변화된 것을 보여준다. 그는 아스피린, 클로피도그렐, 니트레이트(nitrate) 및 IV 헤파린을 먹고, 카테터술(catheterization laboratory)를 한다. 조영술로 평가한 후에, 그는 왼쪽 전대 하향 관상 동맥에서 <90%로 막혀있는 것으로 진단된다. 환자는 카테터술에서 효과적인 양의 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465)(1.0 내지 100mg/kg)를 포함하는 조성물을 투여한다. 환자는 흉통, 숨가쁨이 향상된 것으로 보여진다. 환자의 동맥에 감소된 플라크를 측정하기 위해 조영술로 다시 측정한다.

실시예 12

가슴 중앙 뿐 아니라 어깨 팔, 목, 턱 및 허리에 불편한 압력, 스퀴징(squeezing) 및 통증이 4시간 넘게 있는 55세 남성. 그는 숨가쁨 역시 호소한다. 그는 응급실에서 평가되었고 Troponin I이 상승한 것으로 나타났으며, 그의 EKG는 심근 경색과 일치하여 변화된 것을 보여준다. 그는 아스피린, 클로피도그렐, 니트레이트(nitrate) 및 IV 헤파린을 먹고, 카테터술(catheterization laboratory)를 한다. 조영술로 평가한 후에, 그는 왼쪽 전대 하향 관상 동맥에서 <90%로 막혀있는 것으로 진단된다. 환자는 카테터술에서 효과적인 양의 INV-75(1.0 내지 100mg/kg)를 포함하는 조성물을 투여한다. 환자는 흉통, 숨가쁨이 향상된 것으로 보여진다. 환자의 동맥에 감소된 플라크를 측정하기 위해 조영술로 다시 측정한다.

실시예 13

급성 ST 상승 심근 경색(Acute Non-ST Elevation Myocardial Infarction)이 있는 환자의 치료

전형적으로 왼쪽 팔이나 목의 왼쪽으로 확산되는 갑작스러운 흉통, 숨가쁨, 구역 및 구토 및 발한을 동반한 두근거림이 있는 50세 남성. 심장 표시자(cardiac marker)에서 상승을 검출하기 위해 심전도(EKG, ECG), 흉부 X-선 및 혈액 검사(혈액 검사는 심장근 손상 검출)를 한 후에, 그는 급성 ST 상승 심근 경색을 겪는 것으로 진단된다. 환자는 효과적인 양의 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV-75)(1.0 내지 100mg/kg)를 포함하는 조성물을 정맥 내 투여한다. 조성물은 선택적으로 다음과 같은 치료와 결합하여 투여되는데, 예를 들어 당업자에게 알려진 용량을 사용하여, tPA(tissue plasminogen activator) 또는 스트렙토키나아제와 같은 혈전 용해 약물과 같은 치료, 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린의 투여, 중황산 클로피도그렐, 스타틴, 및/또는 헤파린 또는 이의 조합을 투여한다. 환자는 흉통, 숨가쁨 및 두근거림이 향상된다.

실시예 14

전형적으로 왼쪽 팔이나 목의 왼쪽으로 확산되는 갑작스러운 흉통, 숨가쁨, 구역 및 구토 및 발한을 동반한 두근거림이 있는 50세 남성. 심장 표시자(cardiac marker)에서 상승을 검출하기 위해 심전도(EKG, ECG), 흉부 X-선 및 혈액 검사(혈액 검사는 심장근 손상 검출)를 한 후에, 그는 급성 ST 상승 심근 경색을 겪는 것으로 진단된다. 환자는 효과적인 양의 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV-7465)(1.0 내지 100mg/kg)를 포함하는 조성물을 정맥 내 투여한다. 조성물은 선택적으로 다음과 같은 치료와 결합하여 투여되는데, 예를 들어 당업자에게 알려진 용량을 사용하여, tPA(tissue plasminogen activator) 또는 스트렙토키나아제와 같은 혈전 용해 약물과 같은 치료, 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린의 투여, 중황산 클로피도그렐, 스타틴, 및/또는 헤파린 또는 이의 조합을 투여한다. 환자는 흉통, 숨가쁨 및 두근거림이 향상된다.

실시예 15

전형적으로 왼쪽 팔이나 목의 왼쪽으로 확산되는 갑작스러운 흉통, 숨가쁨, 구역 및 구토 및 발한을 동반한 두근거림이 있는 50세 남성. 심장 표시자(cardiac marker)에서 상승을 검출하기 위해 심전도(EKG, ECG), 흉부 X-선 및 혈액 검사(혈액 검사는 심장근 손상 검출)를 한 후에, 그는 급성 ST 상승 심근 경색을 겪는 것으로 진단된다. 환자는 효과적인 양의 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV-7065)(1.0 내지 100mg/kg)를 포함하는 조성물을 정맥 내 투여한다. 조성물은 선택적으로 다음과 같은 치료와 결합하여 투여되는데, 예를 들어 당업자에게 알려진 용량을 사용하여, tPA(tissue plasminogen activator) 또는 스트렙토키나아제와 같은 혈전 용해 약물과 같은 치료, 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린의 투여, 중황산 클로피도그렐, 스타틴, 및/또는 헤파린 또는 이의 조합을 투여한다. 환자는 흉통, 숨가쁨 및 두근거림이 향상된다.

실시예 16

최근의 심근경색이 있는 환자의 치료(이차 예방)

전형적으로 왼쪽 팔이나 목의 왼쪽으로 확산되는 갑작스러운 흉통, 숨가쁨, 구역 및 구토 및 발한을 동반한 두근거림이 있는 50세 남성. 심장 표시자(cardiac marker)에서 상승을 검출하기 위해 심전도(EKG, ECG), 흉부 X-선 및 혈액 검사(혈액 검사는 심장근 손상 검출)를 한 후에, 그는 심근 경색을 겪는 것으로 진단된다. 환자에 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린과 같은 치료제, 중황산 클로피도그렐, 스타틴, IV 헤파린과 같이 혈소판 응고를 줄이는 경향이 있는 약물을 투여하고 관상 동맥의 스탠트를 하는 카테터술을 한다. 환자를 12-24시간 동안 회복시킨다. 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV-7065)(1.0 내지 100mg/kg)로 경구 치료를 시작하고 적어도 일년 동안 지속한다. 일 개월 후 추적 방문 중에 환자는 증상이 향상된 것으로 전한다.

실시예 18

최근의 심근경색이 있는 환자의 치료(이차 예방)

전형적으로 왼쪽 팔이나 목의 왼쪽으로 확산되는 갑작스러운 흉통, 숨가쁨, 구역 및 구토 및 발한을 동반한 두근거림이 있는 50세 남성. 심장 표시자(cardiac marker)에서 상승을 검출하기 위해 심전도(EKG, ECG), 흉부 X-선 및 혈액 검사(혈액 검사는 심장근 손상 검출)를 한 후에, 그는 심근 경색을 겪는 것으로 진단된다. 환자에 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린과 같은 치료제, 중황산 클로피도그렐, 스타틴, IV 헤파린과 같이 혈소판 응고를 줄이는 경향이 있는 약물을 투여하고 관상 동맥의 스탠트를 하는 카테터술을 한다. 환자를 12-24시간 동안 회복시킨다. 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV-7465)(1.0 내지 100mg/kg)로 경구 치료를 시작하고 적어도 일년 동안 지속한다. 일 개월 후 추적 방문 중에 환자는 증상이 향상된 것으로 전한다.

실시예 19

만성 심근 경색이 있는 환자의 치료(이차 예방)

평가를 위해 1년 전에 심장마비(심근 경색)의 이전 병력이 있는 50세 남성. 자각 증상이 없음. 환자에 효과적인 양의 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465)(0.1 내지 100mg/kg)를포함하는 조성물을 투여한다. 대안적인 치료로는, 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV 73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV 74); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV 75); 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465) 또는 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-7065)를 포함한다. 상기 조성물은 다음과 같은 치료제와 함께 투여될 수 있는데, 예를 들어 당업자에게 알려진 용량으로, 환자에 혈소판 응고 경향을 낮추는 약인 아스피린과 같은 치료제, 중황산 클로피도그렐, 스타틴, 에제티미브, 안지오텐신 전환 효소 저해제나 안지오텐신 수용체 차단제 및 베타-차단제와 같은 다른 항-고혈압제가 있다. 환자는 총 및 LDL 콜레스테롤에 있어 향상되었고 C 반응성 단백질과 같은 염증 표시자가 감소했음을 나타낸다.

실시예 20

만성 안정 협심증(Chronic Stable Angina)의 만성 심근 경색이 있는 환자의 치료

평가를 위해 1년 전에 심장마비(심근 경색)의 이전 병력이 있는 50세 남성. 자각 증상이 없음. 하나의 설하선 니트로글리세린으로 완화되는 협심 흉통을 호소했고 이 통증을 만성적으로 가졌다. 환자에 효과적인 양으로 경구 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465)(1.0 내지100mg/kg)을 포함하는 조성물을 투여했다. 대안적인 치료로는, 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV 73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV 74); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV 75); 또는 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-7065)를 포함한다. 환자는 2주 동안 약물을 섭추한 후에 상기 처방으로 흉통에 있어 유리해짐을 보고한다.

실시예 21

사람의 만성의 죽상경화증 치료를 위한 본 발명의 화합물 투여

관상 동맥, 경동맥, 또는 말초 동맥에 플라크의 증거가 있는 만성 죽상경화증이 있는 사람들은, 이후에 심장마비 및 뇌졸중과 같은 심혈관계 발병의 위험이 있는 것으로 알려져 있다. 이들은 스타틴 및 ACE 저해제, 이뇨제 또는 칼슘 채널 차단제와 같은 항고혈압제와 같은 치료를 한다. 이들은 또한 경구로 허용가능한 케리어에, 12개월이 넘는 기간동안 장기간으로, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 허용가능한 양으로 먹을 것이다. 한 연구에서, 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV 73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV 74); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV 75); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465) 또는 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-7065)가 상기 환자에게 투여된다. 치료 기간 말미에 반복적 IVUS 측정이 이루어져, 목표 혈관 내의 관상 죽상경화증에서 조성물이 효과적으로 주입되었는지 평가한다. 죽상경화증을 치료하는 본 발명의 상기 화합물의 효능을 증명하는 상기 치료에 이어, 플라크는 죽상경화 관상 동맥에서 감소된다.

실시예 22

사람의 죽상경화증을 치료하기 위한 본 발명의 화합물의 투여(일차 예방)

가족력, 고혈압 및 고 콜레스테롤과 같은 죽상경화증의 위험 인자가 있는 사람들은, 심장마비 및 뇌졸중과 같은 이후의 심혈관계 발병의 위험이 있는 것으로 알려져 있다. 이들은 스타틴 아스피린과 같은 고지혈증 약물 치료 및 ACE 저해제, 이뇨제 또는 칼슘 채널 차단제와 같은 항-고혈압제와 같은 일차 예방 치료를 한다. 이들은 또한 경구로 허용가능한 케리어에, 12개월이 넘는 기간동안 장기간으로, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 허용가능한 양으로 먹을 것이다. 한 연구에서, 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV 73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV 74); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV 75); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465) 또는 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-7065)가 상기 환자에게 투여된다. 치료 기간 말미에 반복적 IVUS 측정이 이루어져, 목표 혈관 내의 관상 죽상경화증에서 조성물이 효과적으로 주입되었는지 평가한다. 죽상경화증을 치료하는 본 발명의 상기 화합물의 효능을 증명하는 상기 치료에 이어, 플라크는 죽상경화 관상 동맥에서 감소된다.

실시예 23

사람의 죽상경화증 발병의 예방 또는 지연을 위한 본 발명의 화합물 투여

죽상경화증의 서술된 위험 인자가 있고, 혈장 콜레스테롤 수준이 높은 사람들은 관상동맥(IVUS), 경동맥(IMT) 또는 슬와 동맥의 초음파검사를 하여 기본 측정을 한다. 상기 환자들 중 일부는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을, 정맥(iv)으로 2mg/kg 내지 50mg/kg의 용량에서 허용가능한 케리어에 매일 투여하거나, 또는 근육 내(im)로 약 1 내지 6개월이 넘는 기간 동안 일주일에 1 내지 3회 투여한다. 다음의 화합물의 상기 환자에게 투여된다: 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV 73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV 74); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV 75); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465) 또는 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-7065). 다른 환자들은 케리어만 투여한다. 치료기간 말미에 한 새로 초음파 검사에서, 케리어를 받은 환자의 혈관에서 더 높은 수준의 플라크가 발견되었다. 본 실시예는 본 발명의 화합물이, 죽상경화증 발달의 위험이 있는 환자의 죽상경화증을 예방하거나 감소시키는데 효과적이고, 관상동맥, 경동맥 또는 슬와 동맥에서 플라크 축적을 감소시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.

실시예 24

제1형 및 제2형 당뇨 환자를 치료하기 위한 본 발명 화합물의 투여

제1형 및 제2형 당뇨병이 있는 사람들은 심장마비, 뇌졸중 및 신장 질환과 같은 이후의 심혈관계 질환의 위험이 있다. 상기 환자들은 스타틴과 같은 고지혈증 약물치료와 ACE 저해제와 같은 항고혈압제와 같은 예방치료를 한다. 이들은 인슐린, PPARγ제, 메트포민(Metformin) 또는 술포닐유레아 치료와 같이 혈당을 낮추는 치료를 미리 받는다. 이들은 또한 경구로 허용가능한 케리어에, 12개월이 넘는 기간동안 장기간으로, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 허용가능한 양으로 먹을 것이다. 한 연구에서, 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465) 또는 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-7065)가 상기 환자에게 투여된다. 환자는 다음의 측정을 한다: 혈당 조절을 평가하기 위한 HbA1C, 미세알부민뇨(urinary microalbuminuria), 혈압 및 지질 측정. 치료 12 개월 말미에, HbA1C 및 미세알부민뇨의 저하가 있다. 다음 처리 중 하나로 VLDL 콜레스테롤 향상 및 중성지방의 감소가 있다[3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV 73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV 74); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV 75); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로 페닐 리포에이트(INV-7465) 또는 3,4-메틸렌디옥시 페닐 리포에이트(INV-7065)].

실시예 25

제1형 및 제2형 당뇨병이 있는 사람들은 심장마비, 뇌졸중 및 신장 질환과 같은 이후의 심혈관계 질환의 위험이 있다. 이 환자들은 종종 중성지방 및 VLDL 콜레스테롤의 상승과 같은 지질 이상을 갖는다. 이들은 스타틴 및 피브레이트(Gemfibrozil 또는 Fenofibrate)와 같은 고지혈증 치료약물과 같은 치료를 하여, 인슐린, PPARγ제, 메트포민(Metformin) 또는 술포닐유레아 치료와 같이 혈당을 낮추는 치료와 함께, 콜레스테롤 수준을 낮춘다. 상기 치료와 더불어, 이들은 또한 경구로 허용가능한 케리어에, 12개월이 넘는 기간 동안 장기간으로, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 허용가능한 양으로 먹을 것이다. 한 연구에서, 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV 73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV 74); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV 75)가 상기 환자에게 투여된다. 환자는 12 개월 기간의 치료 말미에, 기준에서 지질 측정을 한다. 치료 12 개월 말미에, VLDL 콜레스테롤이 낮아지고 중성지방이 감소한다.

실시예 26

류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 전신 홍반성 루푸스가 있는 사람들은 염증 관절염이 재발된다. 이들은 주로 사이클로옥시제나아제 저해제와 같은 비스테로이드제, 항-TNFa 치료 및 다른 종류의 염증치료를 한다. 이 치료와 더불어, 이들은 또한 경구로 허용가능한 케리어에, 6개월이 넘는 기간 동안 장기간으로, 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 허용가능한 양으로 먹을 것이다. 한 연구에서, 3,4-메틸렌디옥시-6니트로페닐 아세테이트(INV 75)가 이 환자들에게 투여된다. 환자는 관절통 및 C-반응성 단백질(CRP) 및 적혈구 침강 속도와 같은 염증 표시자를 평가받는다. 6개월의 치료 말미에, 관절통 및 염증 표시자에 현저한 향상이 있다.

상기 언급된 모든 환자, 문헌 및 개요는 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로 첨보되어 있다. 앞서 말한 것이 본 발명의 바람직한 실시예에만 관련된 것이고, 아래의 청구항에서 정의된 본 발명의 범위 및 목적에서 벗어나지 않는 수많은 변형 및 대안이 있을 수 있다는 것이 이해되어야 할 것이다.

<110> RAJAGOPALAN, SANJAY PARTHASARATHY, SAMPATH RAJAGOPAL, DESIKAN <120> Novel Methylenedioxy Phenolic Compounds and Their Use to Treat Disease <150> US 61/086,425 <151> 2008-08-05 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 1 gcctgaggtc cagttctgtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 2 gcggacacag ctctcagtag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 3 gcctggagaa agctgctaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 4 ccagcatcga aggtagagga 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 5 tgccgagcta aattacatat c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 6 tcattgtcac agagccacct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 7 cggaccagaa agactggact 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 8 gttcctcaca tggtgctgga c 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 9 gctcagaagg agccgagtta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 10 ttaccatgac tgccacagga 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 11 agcaccaagt gtcccaaa 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence = synthetic construct <400> 12 tgtgttcttg ggttgtggaa 20

Claims

을 포함하는 화합물로서:
R₁은 아세틸, 에틸 에스테르, 프로필 에스테르, 부틸 에스테르, 수소, 리포일(lipoyl), 디히드로리포일, 페룰릴(ferulyl) 또는 이성체-페룰릴이고;
R₂는 존재하지 않거나, 또는 N₂O, 히드록시, 메톡시, 에톡시, 1 내지 8개 탄소의 분지형 알킬, 아세틸, 리포일, 디히드로리포일, 페룰릴; 미다졸, 퀴날린(quinaline), 이소퀴날린, 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 피롤리딘 및 피페리딘으로 구성된 군에서 선택된 헤테로고리, 카르복실, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 1 내지 3개 탄소의 지방족 아미드, 피롤리돈 및 피페리딘으로 구성된 군으로부터 선택된 지환식 아미드, 아닐린 및 치환된 아닐린으로 구성된 군으로부터 선택된 방향족 아미드, 아민, 1 내지 3개 탄소의 알킬화 아민, 리포산이나 디히드로리포산을 v통한 아미드 기능기, 페룰산(ferulic acid) 및 신남산(cinnamic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 방향족 산, 프롤린, 치환된 프롤린 또는 피페콜린산 유래의 헤테로고리 아미드, 또는 할로겐이며; 및
R₃은 존재하지 않거나, 또는 1 내지 3개 탄소의 선형 알킬기, 3 내지 5개 탄소의 분지형 사슬 알킬기, 자유 카르복시산, 에스테르 또는 아미드, 자유 히드록시 유도체 또는 알킬화 에테르 유도체의 기능기를 갖는 알킬기, 아민 및 알킬화 아민, 지방족 아미드, 방향족 아미드 또는 이미다졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 티오졸린, 및 피페라진으로 구성된 군에서 선택된 헤테로고리 아미드에서 선택된 기능기를 갖는 1 내지 3개 탄소의 알킬기 또는 할로겐화 기이고;
여기서 상기 화합물은 3,4-메틸렌디옥시 페닐 아세테이트(INV-73); 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV-74), 또는 3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV-75)가 아닌, 화합물.
제1항에 있어서, 3,4-메틸렌디옥시페닐 리포에이트(INV-7065)를 포함하는, 화합물:
제1항에 있어서, 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페닐 리포에이트(INV-7465)를 포함하는, 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항에 있어서, 다음을 포함하는 화합물:
제1항의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 케리어(pharmaceutically acceptable carrier)를 포함하는 조성물.
리포산, HMG-CoA 환원효소 저해제, 안지오텐신 전환 효소 저해제, 지방 흡수 저해제, 안지오텐신 수용체 차단제, PPARa 작용제, PPARγ 작용제, 아세틸살리실산, 혈소판 응집 저해제, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질(cholesterol ester transfer protein) 저해제, 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 니아신, 피브레이트(fibrate), 응고괴(clot) 형성 저해제, 또는 베타-차단제, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 치료 화합물을 추가로 포함하는, 제1항의 화합물을 함유하는, 조성물.
심혈관계 질환, 혈관 질환, 염증 질환과 환자 중에서 고혈압, 뇌졸중, 심혈관계 및 신장 질환의 위험이 있는 제I형 및 제II형 당뇨 그리고 이상지혈혈증 환자를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 다음 화합물과 약학적으로 허용가능한 케리어를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 조성물의 투여가 심혈관계 질환, 혈관 질환, 염증 질환과 환자 중에서 고혈압, 뇌졸중, 심혈관계 및 신장 질환의 위험이 있는 제1형 및 제2형 당뇨 그리고 이상지혈혈증 환자를 치료하거나 예방하는, 방법;

R₁은 아세틸, 에틸 에스테르, 프로필 에스테르, 부틸 에스테르, 수소, 리포일, 디히드로리포일, 페룰릴(ferulyl) 또는 이성체-페룰릴이고;
R₂는 존재하지 않거나, 또는 N₂O 히드록시, 메톡시, 에톡시, 1 내지 8개 탄소의 분지형 알킬, 아세틸, 리포일, 디히드로리포일, 페룰릴; 이미다졸, 퀴날린(quinaline), 이소퀴날린, 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 피롤리딘 및 피페리딘으로 구성된 군에서 선택된 헤테로고리, 카르복실, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 1 내지 3개 탄소의 지방족 아미드, 피롤리돈 및 피페리딘으로 구성된 군으로부터 선택된 지환식 아미드, 아닐린 및 치환된 아닐린으로 구성된 군으로부터 선택된 방향족 아미드, 아민, 1 내지 3개 탄소의 알킬화 아민, 리포산이나 디히드로리포산을 통한 아미드 기능기, 페룰산(ferulic acid) 및 신남산(cinnamic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 방향족 산, 프롤린, 치환된 프롤린 또는 피페콜린산 유래의 헤테로고리 아미드, 또는 할로겐이며; 및
R₃은 존재하지 않거나, 또는 1 내지 3개 탄소의 선형 알킬기, 3 내지 5개 탄소의 분지형 사슬 알킬기, 자유 카르복시산, 에스테르 또는 아미드, 자유 히드록시 유도체 또는 알킬화 에테르 유도체의 기능기를 갖는 알킬기, 아민 및 알킬화 아민, 지방족 아미드, 방향족 아미드 또는 이미다졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 티오졸린, 및 피페라진으로 구성된 군에서 선택된 헤테로고리 아미드에서 선택된 기능기를 갖는 1 내지 3개 탄소의 알킬기 또는 할로겐화 기이다.
제20항에 있어서, 상기 R₁이 수소이고 R₂가 N₂O 또는 존재하지 않는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 R₁이 아세틸이고 R₂가 N₂O 또는 존재하지 않는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 R₁이 리포일이고 R₂가 N₂O 또는 존재하지 않는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 화합물이:
3,4-메틸렌디옥시페닐 아세테이트(INV-73),
3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV-74),
3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV-75),
3,4-메틸렌디옥시페닐 리포에이트(INV-7065), 또는
3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페닐 리포에이트(INV-7465)
인, 방법.
제20항에 있어서, 리포산, HMG-CoA 환원효소 저해제, 안지오텐신 전환 효소 저해제, 지방 흡수 저해제, 안지오텐신 수용체 차단제, PPAR-알파 작용제, PPAR-감마 작용제, 아세틸살리실산, 혈소판 응집 저해제, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질(cholesterol ester transfer protein) 저해제, 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 니아신, 피브레이트(fibrate), 응고괴(clot) 형성 저해제, 또는 베타-차단제, 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
3,4-메틸렌디옥시페닐 리포에이트(INV-7065)를 제조하는 방법으로서, 다음의 순차적인 단계를 포함하는, 방법:
질소 환경에서 디메틸아미노 피리딘 및 3,4-메틸렌디옥시페놀을 할로겐화 용매와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;
혼합물에 알파 리포산을 첨가하는 단계;
혼합물에 커플링제(coupling reagent)를 첨가하는 단계;
혼합물을 교반하는 단계; 및
할로겐화 용매를 제거하는 단계.
3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페닐 리포에이트(INV-7465)를 제조하는 방법으로서, 다음의 순차적인 단계를 포함하는, 방법:
트리에틸아민 및 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페놀을 할로겐화 용매와 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;
혼합물에 알파 리포산을 첨가하는 단계;
혼합물에 커플링제(coupling reagent)를 첨가하는 단계;
혼합물을 교반하는 단계; 및
할로겐화 용매를 제거하는 단계.
제26항에 있어서, 3,4-메틸렌디옥시페닐 리포에이트(INV-7065)를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페닐 리포에이트(INV-7465)를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
치료를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법으로서:
심혈관계 질병을 치료하기 위해 효과적인 양으로, NF-κB의 p65 서브유닛의 발현을 조절하는, 제1항의 화합물을 함유하는 약제를, 그러한 치료가 필요한 대상에 투여하는 단계
를 포함하는, 방법.
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 LDL 수용체 발현을 증가시키는 조성물.
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서, PPARα 또는 PPARγ에 영향을 미치지 않고 선택적인 방법으로 PPAR-알파 리간드 결합 활성도를 증가시키는, 조성물.
필요로 하는 대상에서 심장, 혈관, 염증, 제1형 및 제2형 당뇨 및/또는 이상지혈혈증 증상을 호전시키기에 충분한 효과적인 양의 INV-75를 포함하는, 식이 보조제(dietary supplement).
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서 플라크의 진행 속도를 늦추는, 조성물.
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서 대식세포 침윤(infiltration)을 저해하는, 조성물.
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서 평활근 함량을 증가시키는, 조성물.
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서 LDL 수용체 발현을 증가시켜 LDL 제거를 증가시키는, 조성물.
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서 안지오텐신 II에 의해 대동맥 수축을 감소시키는, 조성물.
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서 아세틸콜린 의존성 혈관확장을 조절하는, 조성물.
INV-75, 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
항-염증 조성물.
제3항의 화합물(INV-7065), 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서 플라크 부하를 약화시키는, 조성물.
제3항의 화합물(INV-7065), 또는 약학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서, 알파 수용체 작용제에 대한 혈관 수축성을 감소시키고/감소시키거나 혈관 인슐린 민감성을 증가시키는, 조성물.
제3항의 화합물(INV-7065), 또는 약리학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 대동맥 벽의 지질 침착을 줄이는, 조성물.
제3항의 화합물(INV-7065), 또는 약리학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는:
이를 필요로 하는 대상에서 중성지방(TG) 수준을 감소시키는, 조성물.
제1항 중 적어도 하나의 화합물 또는 이의 약리학적으로 활성인 그 유사물을 효과적인 양으로 포함하는, 항-염증 조성물.
제1항 중 적어도 하나의 화합물의 효과적인 양 및 약학적으로 허용가능한 케리어
를 포함하는, 필요로 하는 대상에서 인간 대동맥 플라크 형성의 치료를 위한, 약학적 조성물.
제1항 중 적어도 하나의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 케리어를 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상에서 플라크 형성을 줄이는, 방법.
하기 화학식을 포함하는 화합물이 심혈관계 질환, 혈관 질환, 염증 질환과 환자 중에서 고혈압, 뇌졸중, 심혈관 및 신장 질환의 위험이 있는 제1형 및 제2형 당뇨 그리고 이상지질혈증을 치료하거나 예방하는데 유용한 약제를 제조하는 데 사용되는 용도:

식에서, R₁은 아세틸, 에틸 에스테르, 프로필 에스테르, 부틸 에스테르, 수소, 리포일, 디히드로리포일, 페룰릴(ferulyl) 또는 이성체-페룰릴이고;
R₂는 존재하지 않거나, 또는 N₂O, 히드록시, 메톡시, 에톡시, 1 내지 8개 탄소의 분지형 알킬, 아세틸, 리포일, 디히드로리포일, 페룰릴, 이미다졸, 퀴날린(quinaline), 이소퀴날린, 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 피롤리딘 및 피페리딘으로 구성된 군에서 선택된 헤테로고리, 카르복실, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, 1 내지 3개 탄소의 지방족 아미드, 피롤리돈 및 피페리딘으로 구성된 군으로부터 선택된 지환식 아미드, 아닐린 및 치환된 아닐린으로 구성된 군으로부터 선택된 방향족 아미드, 아민, 1 내지 3개 탄소의 알킬화 아민, 리포산이나 디히드로리포산을 통한 아미드 기능기, 페룰산(ferulic acid) 및 신남산(cinnamic acid)으로 구성된 군으로부터 선택된 방향족 산, 프롤린, 치환된 프롤린 또는 피페콜린산 유래의 헤테로고리 아미드, 또는 할로겐이며; 및
R₃은 존재하지 않거나, 또는 1 내지 3개 탄소의 선형 알킬기, 3 내지 5개 탄소의 분지형 사슬 알킬기, 자유 카르복시산, 에스테르 또는 아미드, 자유 히드록시 유도체 또는 알킬화 에테르 유도체의 기능기를 갖는 알킬기, 아민 및 알킬화 아민, 지방족 아미드, 방향족 아미드 또는 이미다졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 티오졸린, 및 피페라진으로 구성된 군에서 선택된 헤테로고리 아미드에서 선택된 기능기를 갖는 1 내지 3개 탄소의 알킬기 또는 할로겐화 기이다.
제48항에 있어서, 상기 R₁이 수소이고, R₂가 N₂O이거나 존재하지 않는, 용도.
제48항에 있어서, 상기 R₁이 아세틸이고, R₂가 N₂O이거나 존재하지 않는, 용도.
제48항에 있어서, 상기 R₁이 리포일이고, R₂가 N₂O이거나 존재하지 않는, 용도.
제48항에 있어서, 상기 화합물이:
3,4-메틸렌디옥시페닐 아세테이트(INV-73),
3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페놀(INV-74),
3,4-메틸렌디옥시-6-니트로페닐 아세테이트(INV-75),
3,4-메틸렌디옥시페닐 리포에이트(INV-7065), 또는
3,4-메틸렌디옥시 6-니트로페닐 리포에이트(INV-7465)
인, 용도.
제48항에 있어서, 하나 이상의 치료 화합물을 약제에 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 용도.
제53항에 있어서, 하나 이상의 치료 화합물이, 리포산, HMG-CoA 환원효소 저해제, 안지오텐신 전환 효소 저해제, 지방 흡수 저해제, 안지오텐신 수용체 차단제, PPAR-α작용제, PPAR-γ 작용제, 아세틸살리실산, 혈소판 응집 저해제, 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질(cholesterol ester transfer protein) 저해제, 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 니아신, 피브레이트(fibrate), 응고괴(clot) 형성 저해제, 또는 베타-차단제, 또는 이들의 조합을 포함하는, 용도.