ES2335874T3 - Composicion farmaceutica que contiene rna como cofactor de la hemostasis. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene una cantidad suficiente de RNA natural o sintético para la activación de la coagulación de la sangre, o de uno o más fragmentos activadores de la coagulación de la sangre de RNA natural o sintético, ácidos nucleicos peptídicos, ribozimas o aptámeros de RNA y un activador para un factor plasmático de la coagulación sanguínea.
Description
Composición farmacéutica que contiene RNA como
cofactor de la hemostasis.
Objeto de la invención son composiciones
farmacéuticas y aplicaciones de estas composiciones, que junto a
factores de coagulación de la sangre contienen adicionalmente ácido
ribonucleico (RNA) natural o sintético o fragmentos biológicamente
activos de RNA o sustancias degradantes de RNA como
ribonucleasas.
Es sabido que los procesos de la hemostasis
(coagulación de la sangre y fibrinólisis), que transcurren limitados
local y temporalmente después de producirse una lesión de los
vasos, están controlados por interacciones específicas entre las
células activadas de la pared de los vasos, las plaquetas y factores
proteínicos. Por interacciones iónicas en la mayoría de los casos
de los factores de coagulación fijadores de calcio y dependientes de
la vitamina K se produce una localización de las proteínas activas
en la hemostasis en biomembranas cargadas sobre todo negativamente
en el sitio de la lesión. In vitro, estas interacciones, y
con ello la activación del sistema de la coagulación sanguínea así
como la magnitud de la formación de un coágulo de fibrina pueden
ser inhibidas por sustancias complejantes tales como ácido
etilenodiamina-tetraacético (EDTA) o citrato. El
empleo de tales anticoagulantes está prohibido in vivo; en
este caso puede inhibirse la fijación de calcio a los factores de
coagulación mediante terapia con antagonistas orales de la vitamina
K, con lo que se reduce la magnitud de la hemostasis.
Además de la formación de fosfolípidos cargados
negativamente por puesta al descubierto de las membranas celulares
de las plaquetas y otras células vasculares, se llega también
después de una lesión de la pared de los vasos a la exposición de
componentes intracelulares, particularmente de las proteínas
citosólicas. Está confirmado que el sistema de la coagulación
sanguínea comprende dos vías de activación diferentes en forma de
cascada de factores de coagulación presentes en el plasma.
Dependiendo del mecanismo desencadenante se utiliza preferiblemente
la vía endógena o la exógena para el comienzo de la coagulación. En
el caso de una lesión tisular, se expone como iniciador de la vía
de coagulación exógena la tromboplastina (factor tisular, TF) con
fosfolípidos de las células afectadas. La función particular del
factor de coagulación VII en estos procesos es conocida por la
memoria descriptiva de patente alemana 199 03 693. La tromboplastina
permanente en las membranas puede fijar tanto el Factor de
coagulación VII (FVII) como el Factor VII activado (FVIIa)
circulante. Este complejo TF-FVIIa conduce, en
presencia de iones calcio y lípidos a la fijación del FX, que por
proteólisis limitada se convierte en su forma activada (FXa). FXa
conduce nuevamente, por activación de la protrombina en trombina, a
la formación de fibrina y con ello finalmente al cierre de la
herida.
Conforme a los conocimientos actuales, la
activación adicional del FVII unido a la tromboplastina se efectúa
sobre todo autocatalíticamente, pero se ve favorecida sobre todo
después de la iniciación de la cascada de coagulación por FXa y
trombina, lo que conduce a una intensificación clara de la cascada
de reacción.
De estos descubrimientos pudo deducirse el
conocimiento de que, en determinadas situaciones clínicas, está
indicada la aplicación de FVIIa o concentrados que contienen FVIIa.
En el caso de pacientes, que padecen por ejemplo hemofilia A y como
consecuencia de la administración de FVIII han desarrollado
anticuerpos contra FVIII, se aprovecha la denominada "actividad
de bypass del inhibidor FVIII" (FEIBA) del FVIIa. En este caso
se ha observado que FVIIa es satisfactoriamente compatible y no
conduce a tendencia alguna de trombosis, pero para ello es
apropiado asegurar la coagulación en una proporción limitada pero
suficiente. FVIIa recombinante se utiliza ya terapéutica y
profilácticamente. El FVII obtenido a partir de plasma sanguíneo
puede activarse asimismo y utilizarse luego. Para esta activación
pueden utilizarse, conforme a los conocimientos actuales, proteasas
tales como trombina que, sin embargo, activan fuertemente por sí
mismas como tales la coagulación y pueden conducir a un riesgo de
trombosis. Por esta razón, es necesaria la eliminación o
desactivación subsiguiente de la trombina y conduce a pérdidas de
rendimiento. El empleo de FXa o FIIa (trombina) está contraindicado
en muchos casos, debido al riesgo de trombosis asociado al mismo, y
se indica únicamente en casos de emergencia, por ejemplo en casos
de pérdida extremada de sangre y hemorragias incoercibles.
FVIIa se encuentra solo en concentraciones muy
pequeñas en el plasma de las personas sanas. Acerca de la formación
y procedencia del FVIIa circulante en la sangre se sabe muy poco
hasta ahora. Por esta razón, se supuso que trazas de tromboplastina
expresada o liberada por una destrucción celular podrían jugar un
papel en este contexto. A pesar de las investigaciones intensivas
de todos los fenómenos relacionados con la coagulación de la sangre,
no han podido encontrarse hasta ahora datos de ningún tipo a favor
de que componentes de las células lesionadas pudieran jugar un
papel decisivo en el desencadenamiento de los procesos
hemostáticos.
Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que
entre los componentes liberados por los tejidos y células
lesionados, el RNA extracelular representa un cofactor inicial
importante para el desencadenamiento de la cascada de coagulación
(a) extrínseca y (b) intrínseca. Esta observación da lugar a
investigar más a fondo la función del RNA o de fragmentos
biológicamente activos del RNA o de RNAsas en los procesos
hemostáticos y desarrollar preparaciones farmacéuticas a las cuales
se añaden para la activación de la hemostasis RNA natural o
sintético o fragmentos de RNA biológicamente activos, o a las
cuales se añaden las ribonucleasas respectivas para la inhibición de
las funciones extracelulares del RNA. El RNA extracelular
representa en este caso la superficie natural "extraña" para
la activación del sistema de la fase de contacto plasmática, cuya
iniciación ha sido descrita hasta ahora in vitro por caolín
u otras sustancias polianiónicas.
Objeto de la invención es por tanto una
composición farmacéutica, que contiene una cantidad suficiente para
la activación de la coagulación sanguínea de RNA natural o sintético
o de uno o varios de los fragmentos de RNA activadores de la
coagulación, ácidos nucleicos peptídicos, ribozimas o aptámeros de
RNA. Una preparación de este tipo comprende adicionalmente un
activador para un factor de la coagulación plasmático. Como
activador es particularmente apropiada (a) la proteasa activadora
del Factor VII (FSAP) o su proenzima, y (b) componentes de la fase
de contacto como Factor XII, quininógeno y precalicreína.
Adicionalmente es objeto de la invención la utilización de una
composición farmacéutica para la producción de un medicamento que
contiene ribonucleasas, que suprimen o inhiben la acción
procoagulante del RNA.
Las composiciones farmacéuticas correspondientes
a la invención están basadas en la idea de que el RNA representa el
cofactor más eficaz para la proenzima de la FSAP y conduce a la
activación de esta enzima. Esta interacción se consigue no sólo
para RNA natural de homogeneizados de células o sobrenadantes de
trombocitos activados, sino también con fracciones obtenidas a
partir de RNA citosólico (sobre todo RNA ribosómico) o RNA
sintético. En este caso no existe ostensiblemente ningún efecto de
cofactor específico de las células, dado que incluso el RNA
bacteriano y viral es eficaz y que las moléculas de RNA en los
diferentes tipos de células son muy análogas, por lo que
manifiestamente la alta carga negativa en exceso determina las
funciones del RNA como cofactor de la FSAP.
Estas ideas se ven respaldadas por la
observación de que FSAP puede fijarse específicamente al RNA y
disociarse nuevamente por una solución hipertónica de sal común.
Por tanto, es notable que, en condiciones fisiológicas, pueda
comprobarse una fijación específica de FSAP solamente por RNA, pero
no por DNA.
La invención está basada así pues en la idea de
que, por la interacción de RNA con FSAP, que es el factor más
activo de los factores proenzimáticos VII de la coagulación, se
induce la activación extrínseca de la coagulación sanguínea. Esta
vía de la coagulación activada específicamente por lesiones
tisulares se pone en marcha por tanto por el nuevo cofactor RNA
(natural o sintético).
Al mismo tiempo, el RNA representa el cofactor
natural para la activación del sistema de la fase de contacto, lo
que se ha observado en sangre entera, plasma y en el sistema
purificado. Con ello se abren vías nuevas y totalmente diferentes
para asumir influencia positiva o negativa en los procesos de la
hemostasis mediante composiciones farmacéuticas apropiadas.
Un nuevo punto de partida para ello es la
utilización de compuestos degradantes e inhibidores del RNA para la
producción de un medicamento para influir en los procesos
hemostáticos. Si por adición de sustancias disociadoras o
inhibidoras del RNA se desactiva el RNA cofactor que influye en la
coagulación sanguínea, el mismo ya no está disponible luego para la
activación de la FSAP o del sistema de la fase de contacto. De esto
se deduce que las RNAsas suprimen el efecto de FSAP y por
consiguiente pueden hacer también inactivo el Factor VII de la
coagulación o la coagulación intrínseca. Ello tiene como
consecuencia un nuevo principio anticoagulante, que tiene utilidad
terapéutica. Los componentes degradantes o enmascaradores del RNA
(como p.ej. las proteínas de fijación) pueden desplegar por tanto
efectos terapéuticos importantes, que inhiben de modo muy
específico, sin efectos secundarios, y selectivamente la iniciación
del sistema de la coagulación, y por consiguiente tienen un efecto
anticoagulante o antitrombótico evidente.
Las composiciones farmacéuticas correspondientes
a la invención pueden emplearse como agentes coagulantes, sea solas
o junto con otras sustancias que aumentan la actividad de las
proteasas, tales como heparina o las sustancias análogas a
heparina, tales como sulfato de heparano y/o iones calcio. La
utilización de un agente de esta clase puede estar indicada, por
ejemplo, por aprovechamiento de su propiedad de salvar en bypass el
inhibidor FVIII (FEIBA), cuando existen incompatibilidades frente a
los Factores FVIII y/o FIX y/o FXI y/o las proteínas de la fase de
contacto, como FXII, debido por ejemplo a la presencia de
anticuerpos, o cuando están presentes situaciones carenciales de
otro tipo. Asimismo, la utilización ex vivo para la profilaxis de
hemorragias generales o para la supresión de las hemorragias, puede
realizarse con la composición farmacéutica correspondiente a la
invención con objeto de activar la coagulación sanguínea.
Detalles adicionales de la invención se ilustran
en los ejemplos siguientes, sin que el objeto de la invención deba
considerarse limitado por ellos en modo alguno.
- a)
- fibroblastos humanos cultivados (rRNA),
- b)
- levadura (tRNA),
- c)
- E. coli,
- d)
- fagos Q\beta (RNA monocatenario)
- e)
- fuente sintética (poli IC, poli C, poli AU)
se empleó en igual concentración sin y después
de pretratamiento con RNAsa A en un test de coagulación
turbidimétrico y se midió el tiempo de recalcificación. Todos los
tipos de RNA eran capaces de acortar significativamente el tiempo
de coagulación (cuantificación en "Unidades Equivalentes de Caolín
(KEU/ml)"), mientras que el DNA no exhibía efecto alguno. El
pretratamiento de las muestras de RNA con RNAsa A conducía a la
desactivación de la actividad procoagulante; exclusivamente en el
caso del RNA de E. coli era ésta parcialmente resistente frente al
tratamiento con RNAsa A. Por consiguiente, se demuestra claramente
que diferentes formas de RNA polianiónico poseen actividad
procoagulante; la rotura de estos tipos de RNA en fragmentos de
menor peso molecular conduce a la pérdida de la actividad
procoagulante. En comparación con rRNA o tRNA auténticos, el RNA
monocatenario y bicatenario sintéticos presentaban actividad
procoagulante en los tests de coagulación en el escalonamiento
siguiente: poli IC > poli C > poli AU > poli didC.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque las ribonucleasas existentes en la sangre
(y en otros fluidos corporales) controlan la cantidad de RNA
circulante, fue posible determinar la función procoagulante del RNA
en el plasma. Para esclarecer esta relación, se siguió el destino
de una cantidad determinada de RNA en el plasma a lo largo del
tiempo: si bien el RNA de alta molecularidad se degradaba en el
plasma con un tiempo de semivida de aprox. 5 min y al cabo de 30
minutos ya no era detectable, la actividad procoagulante de este RNA
podía comprobarse todavía después de 90 minutos y más tiempo. Este
fenómeno de "memoria del RNA" está basado probablemente en la
activación de componentes dependientes del RNA en el plasma, que
después de la recalcificación contribuyen al inicio de la
coagulación sanguínea. Muy probablemente, por tanto, el RNA es
responsable también en el plasma sanguíneo del fenómeno de la
coagulación "latente" o de un estado "hipercoagulable",
cuya predicción o prevención adquiere una relevancia muy importante
en la diagnosis y la terapia de las complicaciones trombóticas.
\vskip1.000000\baselineskip
Mientras que el RNA añadido al plasma podía
aumentar la coagulación sanguínea inducida por factor tisular para
cada concentración de este cofactor, en el caso de la coagulación
sanguínea inducida por caolín se mostraba un efecto equivalente del
RNA. Esto demuestra en el caso de la intervención del RNA como
cofactor aniónico (superficie extraña) durante la iniciación del
sistema de la fase de contacto de la coagulación. Para esclarecer
esta circunstancia, se hicieron reaccionar en un sistema purificado
precalicreína y quininógeno y se determinó la cantidad de
calicreína formada. En comparación con los controles de tampón, la
adición de RNA conducía a un aumento significativo de la formación
de calicreína, mientras que el pretratamiento del RNA con RNAsa A
inhibía este efecto. Experimentos con plasmas deficientes en Factor
XII y Factor VIII pusieron de relieve la función del RNA como
cofactor de la fase de contacto, y en plasma deficiente en
precalicreína el RNA no mostraba efecto alguno (en comparación con
el plasma normal). Considerados en conjunto, estos resultados
demuestran que, de modo equivalente al caolín (material
artificial), el material RNA natural después de exposición al
sistema de la fase de contacto pone en marcha la iniciación
intrínseca de la coagulación sanguínea.
\vskip1.000000\baselineskip
La extracción de sangre realizada en presencia
de aprox. 200 unidades/ml de inhibidor de RNasa con preparación
subsiguiente del plasma o, alternativamente, después de la
extracción de sangre y la utilización del plasma se añadió a éste
el estabilizador PAQ-gen (Qiagen), a fin de inhibir
la hidrólisis del RNA. Después de la preparación del RNA (por el
método Trizol) se inmovilizó éste sobre un filtro de nailon, y se
cuantificó con oligonucleótidos específicos de rRNA marcados
radiactivamente, la cantidad de RNA plasmático con ayuda de una
curva de calibración después de hibridación. En los plasmas de
pacientes con infarto agudo de miocardio o sepsis, se identificaron
con ayuda de esta analítica muestras positivas, cuyo contenido de
RNA se encontraba en torno al de los donantes sanos.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad procoagulante del RNA, referida
sobre todo a la iniciación del sistema de la fase de contacto
plasmática, puede ser inhibida por pretratamiento del RNA con RNasa
A. Así pues, es verosímil que un aumento de la concentración de
ribonucleasas en el plasma conduzca a la disociación hidrolítica del
ácido nucleico y por consiguiente que las ribonucleasas desplieguen
su efecto anticoagulante. Dado que las células endoteliales
producen progresivamente RNasa A y la secretan en la sangre, como se
ha observado en cultivos de células (Landre et al., J. Cell.
Biochem. 86, 540-552, 2002), está muy próxima a una
terapia anticoagulante con ribonucleasas del principio de la
regulación natural en el sistema vascular. Alternativamente, las
ribonucleasas podrían desplegar también un efecto anticoagulante
frente a las ribozimas o los aptámeros de RNA, dado que estas
sustancias, análogamente al RNA natural, podrían exhibir una
activación de la fase de contacto.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado que el RNA posee un tiempo de supervivencia
en medio plasmático, se testó el efecto de este material
polianiónico sobre las células de la pared de los vasos, a saber la
monocapa de células endoteliales en cultivo. Un test funcional muy
sensible para el efecto celular del RNA extracelular es el cambio de
la permeabilidad de las células endoteliales, que se investigó
sobre monocapas densas de endotelios cerebrales microvasculares de
cerdo. De una manera dependiente de la concentración, el RNA
aumentaba la permeabilidad de estas células, mientras que una
preincubación con RNAsa podía inhibir este efecto del RNA
extracelular. Dado que una influencia en la permeabilidad de las
células endoteliales en la región de un punto de lesión vascular es
importante para las reacciones de curación de las heridas a
iniciar, se atribuye a esta función celular del RNA extracelular
una gran importancia.
Claims (8)
1. Composición farmacéutica,
caracterizada porque contiene una cantidad suficiente de RNA
natural o sintético para la activación de la coagulación de la
sangre, o de uno o más fragmentos activadores de la coagulación de
la sangre de RNA natural o sintético, ácidos nucleicos peptídicos,
ribozimas o aptámeros de RNA y un activador para un factor
plasmático de la coagulación sanguínea.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque contiene como
activador la proteasa activadora del Factor VII (= FSAP) o su
proenzima.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque contiene como
activador componentes de la fase de contacto, particularmente
Factor XII, quininógeno y/o precalicreína.
4. Utilización de una composición farmacéutica
para la producción de un medicamento para la activación de la
coagulación sanguínea, caracterizada porque contiene una
cantidad suficiente de RNA natural o sintético para la activación
de la coagulación sanguínea, o de uno o más fragmentos activadores
de la coagulación sanguínea de RNA natural o sintético, ácidos
nucleicos peptídicos, ribozimas o aptámeros de RNA.
5. Utilización de una composición farmacéutica
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la producción
de un medicamento para la activación de la coagulación
sanguínea.
6. Utilización de una composición farmacéutica
según la reivindicación 4 ó 5 para el desencadenamiento de la
cascada de coagulación extrínseca.
7. Utilización de una composición farmacéutica
según la reivindicación 4 ó 5 para el desencadenamiento de la
cascada de coagulación intrínseca.
8. Utilización de una composición farmacéutica
para la producción de un medicamento para la inhibición de la
coagulación y/o la supresión o prevención del efecto procoagulante
del RNA, caracterizada porque la misma contiene una cantidad
suficiente para la inhibición de la coagulación de una o más
ribonucleasas, que suprimen o inhiben la acción procoagulante del
RNA.
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