FI109764B - Kudostekijään perustuva protrombiiniaikareagenssi - Google Patents

Description

109764

Kudos-tekijään perustuva protrombiiniaikareagenssi Ri st ivi i ttaus sukulai shakemuks iin Tämä hakemus on osittain jatkoa saman siirronsaajan 5 nimissä olevalle US-patenttihakemukselle United States Serial No. 07/612 118, jonka otsikko on Tissue Factor

Based Prothrombin Time Reagent ja joka on jätetty 13. marraskuuta 1990 ja mainitaan tässä viitteenä.

Keksinnön tausta 10 Keksinnön kenttä Tämä keksintö koskee protrombiiniaika(PT-)reagens-sia, jossa käytetään puhdistettua, uudelleen toimivaan muotoon saatettua ihmisen luonnollista tai rekombinattiku-dostekijää (rTF). Tarkemmin määriteltynä keksintö koskee 15 kudostekijän (TF) saattamista fosfolipidivesikkelien tai -misellien muotoon kudostekijään perustuvan PT-reagenssin valmistamiseksi. Tällainen reagenssi mahdolistaa oraalisen antikoagulanttihoidon ja ulkoisen koaguloitumistien vajavaisuuksien spesifisen seurannan.

20 Aiheeseen liittyvän alan kuvaus ja johdatus keksin töön • · ·* * Yleisesti esitettynä liposomit ovat yksi yleinen vesikkeliryhmä ja ne käsittävät yhden tai useampia vesipi-toista tilaa ympäröiviä lipidikaksoiskerroksia. Tähän ryh-:#’.j 25 mään kuuluvat yksilamelliset vesikkelit, jotka koostuvat :*·*: yhdestä kalvosta tai lipidikaksoiskerroksesta, ja monila- melliset vesikkelit, jotka koostuvat useista samankeskisistä kalvoista (tai lipidikaksoiskerroksista). Liposomeja ,·, ; valmistetaan yleisesti fosfolipideistä. Szoka, F. ja Papa- • · t 30 hadjopoulos, D., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 (1980) 467 - 508. Misellit ovat erilaisia kuin liposomit. Misel- • *·· lejä muodostuu, kun molekyylejä, joilla on sekä hydrofobi- siä että hydro f iilisiä ominaisuuksia, kuten detergenttejä, :·* laitetaan vesiväliaineeseen. Molekyylien hydrofobiset osat , 35 aggregoituvat vesiväliaineen välttämiseksi. Yksinkertai- 2 109764 simmassa muodossaan misellit voivat olla pallomaisia; ne voivat kuitenkin muodostaa muodoltaan ja kooltaan vaihte-levia aggregaatteja (kaksoiskerroksia). Misellit eroavat liposomeista siinä suhteessa, että niillä on hydrofobinen 5 sisäosa vesipitoisen sijasta. Misellin muodostavien deter-genttimolekyylien hydrofiiliset päät suuntautuvat esimerkiksi veteen, kun taas hydrofobiset hännät liittyvät yhteen muiden vastaavien hydrofobisten rakenteiden kanssa. Davis, B. D. ja Dulbecco, R., Sterilization and Disin-10 fection, Microbiology, 3. p., Harper & Row (Davis, B. D. et ai., 1980) s. 1270: Mahler, H. R. ja Cordes, E. H., Biological Chemistry, 2. p., Harper & Row Publishers 1971, s. 712 - 714.

Liposomeja on käytetty lääkkeenantojärjestelmänä. 15 Tämä lähestymistapa käyttää hyväkseen sitä, että liposo-meilla on suhteellisen läpäisemätön lipidikaksoiskerros, joka pystyy sulkemaan sisäänsä vesipitoisen tilan ja tarjoamaan siten käyttöön menetelmän erilaisten lääkkeiden koteloimiseksi täysin tähän sisätilaan. Szoka, supra, s. 20 468. Tämäntyyppisen antojärjestelmän yksi tärkeä puoli on, että aktiivinen lääkeaineosa on liposomin ulkopuolella .· ’ olevan vesiväliaineen saavuttamattomissa, kunnes se saa- vuttaa kohteensa. Janoff et ai., US-patentti julkaisu :··: 4 880 635 (1989).

25 On havaittu, että selkärankaisten kudokset sitraat- j’.'; tipitoiseen plasmaan lisättyinä ja uudelleenkalsifioituina lyhentävät olennaisesti hyytymisaikaa. Tätä kudoksen rakenneosaa, jonka on havaittu aktivoivan koagulaatiopro-. . teaasikaskadeja, kutsutaan yleisesti tromboplastiiniksi 30 tai kudostekijäksi (TF).

*;·' Tromboplastiinin (prokoagulanttikudostekijän) käyt- : töä yksivaiheisessa PT-testissä on kuvattu ensimmäisen kerran vuonna 1935 [Quick, J., Biol. Chem. 109 (1935) 73 - 74] . Tässä testissä käytettiin nisäkäskudoksesta pe-. 35 räisin olevaa tromboplastiinia ja standardikäyrä tehtiin 3 109764 käyttämällä yhdistettyjen normaalien ihmisplasmojen laimennoksia. Tämän testin nykyaikainen versio on helppo toteuttaa ja automaatistettavissa.

Protrombiiniaika(PT-)testi on koagulaatiolaborato-5 riossa yleisimmin tehtävä määritys. Tämän testin variaatioilla on joukko käyttötarkoituksia (White et ai., Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, toim. Coleman et ai., J. B. Lippencott Co., Philadelphia 1987, s. 1048 - 1060). Yksi käyttö on ulkoi-10 sen koagulaatiotien (tekijät VII, X ja V ja protrombiini) vajavaisuuksien arviointi. Toinen käyttö on pitkäaikaisessa oraalisessa antokoagulanttihoidossa olevien potilaiden seuraaminen sellaisten häiriöiden kuin toistuvien laskimotukosten ja syövän suhteen [Hirsch, J., Seminars on 15 Thrombosis ans Hemostasis 12 (1986) 1 - 11]. Kolmas käyttö on maksan toimintahäiriöiden tutkiminen.

Antikoagulanttihoidon terapeuttinen alue perustuu verenvuodon ja tukoskomplikaatioiden välttämiseen. Seurattaessa oraalista antikoagulanttihoitoa samoin kuin erilai-20 siä muita tiloja PT-testillä on protrombiiniajan pidentyminen kaksinkertaiseksi toivottavinta pitkäaikaisen hoidon ·* ’ yhteydessä (O'Reilly, Hemostasis and Thrombosis, Basic

Principles and Clinical Practice, toim. Coleman et al., J. -"· B. Lippencott Co., Philadelphia 1987, s. 1367 - 1372).

25 Tämä pidentymiskerroin määritellään protrombiinisuhteeksi ·'·; (PR) ja se lasketaan jakamalla potilaan plasman PT normaa- leista yksilöistä saatujen yhdistettyjen plasmojen PT:llä. Korkeampi PR merkitsee herkempää PT-reagenssia. Herkemmän ; reagenssin käytöstä antikoagulanttihoidon seurannassa on I..- 30 etuna pienempien antikoagulanttilääkeannosten käyttö. Nämä ·;* pienemmät annokset antavat edelleen riittävän suojan trom- j ’·· boemboliasairautta vastaan minimoiden samalla verenvuoto- komplikaatiot.

Kaupallisesti on saatavissa muutamia reagensseja , 35 PTriden määrittämiseksi. Niihin kuuluvat Thromborel S

4 109764 (Curtis Matheson Scientific, Inc., Yorba Linda, CA) ja Simplastin (Organon Teknika Corp., Charlotte, NC). Nämä reagenssit antavat tulokseksi hyvin erilaiset PT:t saman potilaan plasmasta Thromborel S:n antaessa pidemmän ajan 5 kuin Simplastin. Siksi pidentyneiden PTiiden (korkean PR:n) ylläpitämiseksi tarvitaan pienempiä antikoagulantti-lääkeannoksia, kun PT:itä seurataan käyttämällä Thromborel S:ää Simplastinin sijasta. On olemassa tarve saada aikaan vielä herkempi kudostekijään perustuva PT-reagenssi anti-10 koagulanttihoidon ja muiden tilojen seuraamiseksi. Tämä keksintö tarjoaa käyttöön juuri tällaisen herkän reagens-sin hyvin toivottavine PR:ineen.

Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö koskee kudostekijäreagensseja, jotka 15 käsittävät liposomikoostumuksia, joissa on kudostekijää liittyneenä lipidikaksoiskerrokseen ja joissa lipidikak-soiskerros käsittää fosfolipidien seosta, ja menetelmiä mainitunlaisten koostumusten valmistamiseksi. Käyttöön tarjottavissa liposomeissa olevien fosfolipidien lipidi-20 kaksoiskerrossuhde mahdollistaa tuloksena olevan kudoste-kijäreagenssien maksimaalisen koagulanttiaktiivisuuden ja • ‘ " siten reagenssin edullisen herkkyyden tutkittavien ulkois- ten koagulaatiotekijoiden suhteen.

·"· Tämä keksintö perustuu muiden tekijöiden ohella : ·.: 25 niihin yllättäviin havaintoihin, että tämän keksinnön mu- • * ;*·*: kaisen kudostekijäreagenssin, joka käsittää liposomeja, joissa kudotekijä on liittyneenä lipidikaksoiskerrokseen, on havaittu olevan aktiivinen prokoagulanttikompleksi eli ^ . kompleksi, jolla on kyky muuttaa tehokkaasti proentsyymi, 30 tekijä VII, aktiiviseksi koagulaatioproteaasiksi, tekijäk-*;* si Vila. Tämä havainto oli yllättävä, sillä kudostekijä j '·· yksinään liuoksessa ja liposomien lipidikaksoiskerroksen :’ muodostava fosfolipidiseos yksinään eivät ole aktiivisia .·' protrombiiniaikareagenssina. Olen myös havainnut, että , 35 tämän keksinnön mukaisilla koostumuksilla, jotka käsittä- 5 109764 vät lisäksi glysiiniä, on olennaisesti parantunut toimintakyky PT-määrityksissä siinä mielessä, että ne tekevät normaalin ihmisplasman protrombiiniajoista vastaavia kuin kaupallisilla vertailunäytteillä, jotka on suunniteltu 5 jäljittelemään ihmisplasmaa.

Niinpä tämä keksintö koskee yhden edullisen puolen mukaisesti kudostekijäreagensseja, jotka käsittävät pro-trombiiniaikojen määrittämiseen käyttökelpoisia liposomi-koostumuksia, jotka mainitut liposomikoostumukset käsittä-10 vät kudostekijää liitettynä liposomien (tai fosfolipidive-sikkelien) lipidikaksoiskerrokseen, edullisesti puskurissa, joka sisältää sekä matalalämpötilasäilytettä että glysiiniä. Keksinnön toinen puoli koskee menetelmä näiden koostumusten valmistamiseksi.

15 Keksinnön yhden edullisen puolen mukaisesti mene telmässä liposomien valmistamiseksi käytetään detergent-tiä, jolla on suhteellisen korkea kriittinen misellipitoi-suus, pitkälle puhdistettujen fosfolipidien saattamiseksi liuokseen. Yksi erityisen edullinen detergentti on kah-20 taisioninen detergentti 3-[(3-kooliamidopropyyli)dimetyy- liammonio]-1-propaanisulfonaatti (CHAPS). Kudostekijä, .’ * joka on myös liuotettu detergenttiin, lisätään yhdessä kantajaproteiinin kanssa ja poistetaan sitten detergentti.

!'*: Detergentti voidaan poistaa kätevästi tavanomaisin mene- 25 telmin, kuten dialyysillä, hartsikäsittelyllä tai laimen- • · tamalla detergenttiä sisältämättömällä liuoksella. Liposo-meja, joissa on kudostekijää liittyneenä ja sijoittuneena niiden lipidikaksoiskerrokseen, muodostuu spontaanisti . ympäröivän liuoksen detergenttipitoisuuden laskiessa.

30 Määritelmät I | ')* "BHT" tarkoittaa butyroitua hydroksitolueenia.

I ’·· "CHAPS" tarkoittaa 3-[(3-kooliamidopropyyli)dime- : tyyliammonioj-1-propaanisulfonaattia.

"MOPS" taroittaa 3-(N-morfolino )propaanisulfonihap- 35 poa.

6 109764 "OTG" tarkoittaa okstyyli-beeta-D-tioglukopyranosi- dia.

"Fosfolipidi" tarkoittaa joko glyserolista (yleisimmin) tai sfingosiinistä johdettua orgaanista molekyy-5 liä. Glyserolista johdetut fosfolipidit (eli fosfoglyseri-dit) käsittävät glyserolirungon, kaksi rasvahappoketjua esteröityneinä glyserolin ensimmäiseen ja toiseen hiileen ja fosforihapon esteröityneenä kolmanteen hiileen. Fosfo-rihappoon esteröidään mahdollisesti alkoholiryhmittymä.

10 "PC" tarkoittaa fosfatidyylikoliinia, varauksetonta fosfolyseridiä, jossa on koliinista peräisin oleva alkoholiryhmittymä esteröityneenä fosforihappoon.

"PE" tarkoittaa fosfatidyylietanoliamiinia, positiivisesti varautunutta fosfoglyseridiä, jossa on etanoli-15 amiinista peräisin oleva alkoholiryhmittymä esteröityneenä fosforihappoon.

"PG" tarkoittaa fosfatidyyliglyserolia, negatiivisesti varautunutta fosfoglyseridiä, jossa on glyserolista peräisin oleva alkoholiryhmittymä esteröityneenä fosfori-20 happoon.

"PS" tarkoittaa fosfatidyyliseriiniä, negatiivises- * · .* * ti varautunutta fosfoglyseridiä, jossa on seriinistä pe- räisin oleva alkoholiryhmittymä esteröityneenä fosforihap-:'': poon.

25 "Protrombiiniaika" lyhennetään PT ja tarkoittaa • · ajanjaksoa tromboplastiinin tai protrombiiniaikareagenssin lisäämisestä hyytymän ilmaantumiseen vähän verihiutaleita * # · sisältävässä, sitraattipitoisessa plasmassa.

. "Protrombiinisuhde" lyhennetään PR ja tarkoittaa 30 yksilön plasman (joko normaalin tai epänormaalin) protrom- ;· biiniaikaa jaettuna yksilöiden normaalien plasmojen yhdis- I telmän protrombiiniajalla.

"rTF" tarkoittaa rekombinanttikudostekijää.

"TBS" tarkoittaa Tris-liuosta (20 mmol/1, pH 7,5), ‘ t 35 joka sisältää 150 mmol/1 natriumkloridia.

7 109764

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 esittää PT-regenssien, rTF-PT-reagenssin ja Thromborel S:n, protrombiinisuhteita tekijän prosentuaalisen aktiivisuuden funktiona.

5 Kuvio 2 esittää PT-reagenssien suhteellisia herk kyyksiä oraalisessa antikoagulanttihoidossa olevien potilaiden plasmojen suhteen.

Keksinnön yksityskohtainen kuvaus 1. Edullisia kudostekijäreagenssikoostumuksia 10 Tämä keksintö tarjoaa käyttöön kudostekijäreagens- seja, jotka käsittävät liposomeja, joissa on kudostekijää liitettynä liposomien lipidikaksoiskerrokseen sillä tavalla, että kudostekijä on sijoitettu lipidikaksoiskerroksen läpi.

15 Liposomien lipidikaksoiskerros käsittää fosfolipi- dejä, edullisesti fosfoglyseridejä.

Keksinnön toisen puolen mukaisesti tarjotaan vaihtoehtoisesti käyttöön kudostekijäreagensseja, jotka käsittävät foposfolipidimisellikoostumuksia, joissa on kudoste-20 kijää liitettynä fosfolipidimiselleihin sillä tavalla, että kudostekijä on sijoitettu miselliin.

.· · Tämän keksinnön mukaiset kudostekijäreagenssit kä- sittävät noin 0,1 - 3 pg luonnollista tai rekombinattiku-dostekijää 1 mg kohden fosfolipidiseosta. Kudostekijän 25 suhde fosflipidiseokseen voi määrätä tuloksena oleva ku-)'·*. dostekijäreagenssin herkkyyden. Niinpä suhde, joka on noin 1 - 2 pg kudostekijää 1 mg kohden fosfolipidiseosta, voi olla sopiva käytettäväksi kudostekijäreagenssissa, jonka . kansainvälinen herkkyysindeksi ("ISI", International * · · 30 Sensitivity Index) on noin 1,0. Suhde, joka on noin * · ;·’ 0,25 - 0,5 pg kudostekijää 1 mg kohden fosfolipidiseosta, j voi olla sopiva käytettäväksi valmistettaessa kudostekijä- reagenssi, jonka ISI on noin 1,6 - 2,0. Edullisia ovat kudostekijäreagenssit, jotka käsittävät lisäksi noin • i * ‘ , 35 0,5 - 1,5 % (paino/tilavuus) glysiiniä. Kun halutaan, että » | 8 109764 kudostekijäreagenssi pystytään kylmäkuivaamaan varastoinnin ja myöhemmän toimintamuotoon saattamisen mahdollistamiseksi, reagenssi sisältää edullisesti matalalämpötila-säilytettä, edullisesti hiilihydraattisäilytettä, edulli-5 simmin trehaloosia.

A. Edullisia fosfolipidiseoksia

Soveltuviin fosfolipideihin käytettäviksi tämän keksinnön mukaisissa liposomikoostumuksissa kuuluvat sellaiset, jotka sisältävät rasvahappoja, joissa on 12 - 20 10 hiiliatomia; mainitut rasvahapot voivat olla joko tyydyttyneitä tai tyydyttymättömiä. Soveltuviin fosfolipideihin käytettäviksi tämän keksinnön mukaisesti kuuluvat fosfati-dyylikoliini (PC), fosfatidyylietanoliamiini (PE), fosfa-tidyyliglyseroli (PG) ja fosfatidyyliseriini (PS). Nämä 15 fosfolipidit voivat olla peräisin mistä tahansa luonnon- lähteestä ja fosfolipidit voivat sellaisinaan koostua erilaisia rasvahappoja sisältävistä molekyyleistä. Eri lähteistä peräisin olevia fosfolipidejä käsittäviä fosfolipidiseoksia voidaan käyttää. PC:a, PG:ä ja PE: a voidaan saa-20 da esimerkiksi munankeltuaisesta; PS:ä voidaan saada eläinten aivoista tai selkäytimestä. Nämä fosfolipidit • · .* · voivat yhtä hyvin olla peräisin synteettisistä lähteistä.

Fosfolipidi( PL-)seoksia, joissa yksittäisten PL: ien suhde vaihtelee, voidaan käyttää. Soveltuvat seokset kä-25 eittävät (a) noin 20 - 95 mol-% PC:a; (b) noin 2,5 - • · ;*·*; 50 mol-% PE: a; (c) noin 2,5 - 50 mol-% PS:ä; (d) noin • · 0-40 mol-% PG:ä. Edullisia ovat PL-seokset, jotka käsittävät noin 5-15 mol-% PE:a, noin 3-20 mol-% PS:ä ja ^ . noin 10 - 25 mol-% PG:ä loppuosan, edullisesti noin 50 - • · · 30 90 mol-%, ollessa PC: a. Erityisen edullisia ovat PL-seok- ·;·* set, jotka käsittävät noin 8-12 mol-% PE:a, noin 3 - ; 10 mol-% PS:ä, noin 14 - 20 mol-% PG:ä ja noin 58 - : 75 mol-% PC:a.

./ Vaikka fosfolipidejä voidaan käyttää vaihtelevissa ’ , 35 suhteissa, olemme havainneet, että fosfolipidiseokset, 9 109764 jotka sisältävät määrättyjä määriä yksittäisiä fosfolipide-jä, johtavat kudostekijäreagensseihin, joilla on edullinen aktiivisuus ja aktiivisuuden stabiilius. Vaikka voidaan käyttää laajaa yksittäisten fosfolipidien suhdealuetta, 5 olemme havainneet, että tuloksena olevan kudostekijä-reagenssin edullisen aktiivisuuden ja stabiiliuden kannalta fosfolipidikokonaiskoostumuksessa täytyy olla läsnä määrätty määrä PS:ä. Edullisesti läsnä olevan PS-määrän määräävät jossakin määrin PL-seoksen muut komponentit ja niiden suh-10 teelliset määrät osana PL-kokonaisseosta. PG:n, toisen negatiivisesti varautuneen fosfolipidin, käyttäminen suurina määrinä (vähintään suuruusluokkaa noin 10 %) mahdollistaa esimerkiksi pienempien PS-pitoisuuksien, suuruusluokkaa 3 %, käytön. Jos käytetään PL-seosta, joka sisältää vähän 15 PS:ä, on kuitenkin edullista sisällyttää seokseen vähintään noin 5 %, edullisesti vähintään noin 10 % PE:a.

On kätevää yhdistää fosfolipidejä asianmukaisissa suhteissa, niin että saadaan PL-seos käytettäväksi tämän keksinnön mukaisten kudostekijäreagenssien valmistuksessa. 20 Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa PL-seos voi sisältää *.·. PC:a, PG:ä, PE:a ja PS:ä vastaavasti moolisuhteessa • 67:16:10:7. Yhdessä toisessa edullisessa suoritusmuodossa « · « PL-seos voi sisältää PC:a, PG:ä, PE:a ja PS:ä vastaavasti • ti • · . , moolisuhteessa 7,5:0:1:1.

% · « || I1 25 B. Kudos tekijä * · · • ·1 Tämän keksinnön mukaisissa kudostekijäreagensseissa • · V 1 voidaan käyttää joko luonnollista tai rekombinattikudoste- kijää. Voidaan käyttää eri lajien luonnollisia tai rekom-binattikudostekijöitä.

• · ·1"; 30 Luonnollinen kudostekijä voidaan eristää tavanomai- tt» sin menetelmin. Katso esimerkiksi Broze, Jr., G. J. et ai., • » J. Biol. Chem. 260(20) (1985) 10917 - 10920; Morrisey, J.

’···1 H. et ai., Thrombosis Research 50 (1988) 481 - 493.

• » • a » * » 10 109764

Rekombinanttikudostekijä voidaan valmistaa yhdis-telmä-DNA-tekniikalla käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä ja ilmentymisjärjestelmiä. Katso esimerkiksi Mor-risey, J. H. et ai., Cell 50 (1987) 129 - 135: Summers, M.

5 D., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin 1555 (1987).

Kudostekijä voidaan puhdistaa immuuniaffiniteetti-kromatografiällä tai muilla kromatografisilla menetelmillä, 10 jotka on suunniteltu jonkin määrätyn proteiinin erottamiseen proteiiniepäpuhtauksista.

C. Edullisia matalalämpötilasäilytteitä

Matalalämpötilasuojaus liittyy arkojen aineiden yhtenäisyyden säilyttämiseen, kun niitä sisältävät nesteet 15 pakastetaan ja dehydratoidaan. Hiilihydraatin käyttöä li-posomien yhtenäisyyden suojaajana matalassa lämpötilassa tehtäessä pakastus ja sitä seuraava kylmäkuivaus on kuvattu. Racker, E., Membrane Biol. 10 (1972) 221 - 235; Sreter, F. et ai., Biochim. Biophys. Acta 203 (1970) 254 - 257; 20 Crowe et ai., Biochem. J. 242 (1987) 1 - 10; Crowe et ai., V. Biochim. Biophys. Acta 987 (1988) 367 - 384.

Kun kudostekijäreagenssi kylmä kuivataan ennen va-rastointia myöhempää käyttöä varten, on edullista sisällyt- • · , . tää hiilihydraattia tai hiilihydraatteja matalalämpöti- ♦ * · ' '* 25 lasäilytteeksi liposomien yhtenäisyyden suojaamiseksi tu-• * · loksena olevassa koostumuksessa kylmäkuivauksen ja myöhem- « i V · män uudelleenhydratoinnin aikana. Soveltuviin hiilihydraat- timatalalämpötilasäilytteisiin kuuluvat trehaloosi, maltoo-si, laktoosi, glukoosi ja mannitoli. Keksinnön yhden edul-*"*» 30 lisen puolen mukaisesti sisällytetään (ennen kylmäkuivaus- I I · ta) trehaloosia vesipitoiseen puskuriliuokseen, jota käyte- i · *ti> tään tämän keksinnön mukaisten kudostekijäeagenssien vai- * » ’···* mistuksessa, edullisesti suunnilleen pitoisuudeksi 50 - 250 mmol/1.

» t I I t I · • · 109764 D. Glysiini Tämän keksinnön yhden erityisen edullisen puolen mukaisesti glysiiniä sisällytetään näiden kudostekijärea-genssien yhdeksi lisäkomponentiksi. Glysiinin sisällyttä-5 minen näihin kudostekijäreagensseihin johtaa reagenssei-hin, joilla on olennaisesti parantunut toimintakyky PT-määrityksissä ja jotka antavat normaalin ihmisplasman yhteydessä tulokseksi protrombiiniaikoja, jotka ovat olennaisesti vastaavia kuin kaupallisilla vertailunäytteillä, 10 jotka on suunniteltu jäljittelemään ihmisplasmaa. Siten nämä edulliset kudostekijäreagenssit käsittävät lisäksi noin 0,5 - 1,5 %, edullisemmin noin 0,6 - 1,2 % (paino/ti-lavuus) glysiiniä.

2. Kudostekijäreagenssien valmistus 15 Fosfolipidit, joita on saatavissa valmistajalta or gaanisessa liuotteessa, sekoitetaan yhteen asianmukaisissa suhteissa, niin että saadaan ohjeen mukainen koostumus. Sitten lisätään hapettumisenestoainetta fosfolipidien rasvahappo-osien alkyyliketjujen peroksidaation vähentämisek-20 si ja poistetaan orgaaninen liuote haihduttamalla, jos sellaista on läsnä. Yksi sopiva hapettumisenestoaine on butyroitu hydroksitolueeni. Hapettumisenestoainetta käyte-tään edullisesti noin 0,1 paino-%.

Kuivattu (haihdutettu) fosfolipidiseos liuotetaan '· ” 25 sitten uudelleen detergentin vesiliuokseen. Soveltuviin : detergentteihin kuuluvat sellaiset, joilla on suhteellisen ·'.·'· korkea kriittinen misellikonsentraatio (CMC). Womack et ai., Biochim. Biophys. Acta 733 (1983) 210. Tällaisiin :*·.· detergentteihin kuuluvat detergentit, joiden CMC on kor- » · 30 keampi kuin noin 2 mmol/1. Edullisia ovat detergentit, joiden CMC on suunnilleen 2-25 mmol/1. Tällaisiin edul-• “ lisiin detergentteihin kuuluvat 3-[(3-kooliamidopropyy- li )dimetyyliammonio]-1-propaanisulfonaatti (CHAPS) ja al-kyyliglukopyranosidit, kuten oktyyli-beeta-D-glukopyrano-35 sidi, oktyyli-beeta-D-tioglukopyranosidi ja vastaavat.

12 109764

Detergenttiliuos voi mahdollisesti sisältää muita komponentteja. Näitä komponentteja voivat olla puskurisuolat, kuten HEPES, Tris, fosfaatti ja vastaavat; erilaiset muut suolat, kuten NaCl, KC1 ja vastaavat; hiilihydraattimata-5 lalämpötilasäilyte, kuten trehaloosi, maltoosi, glukoosi ja vastaavat; ja glysiini. Tämän keksinnön yhden edullisen suoritusmuodon mukaisesti detergenttiliuos sisältää 20 mmol/1 Trisiä (pH 7,5) ja 150 mmol/1 NaCl:a (TBS), 100 mmol/1 CHAPS:a, 150 mmol/1 trehaloosia ja 0,8 % gly-10 siiniä. Tämän edullisen suoritusmuodon mukaisesti fosfoli-pidit liuotetaan uudelleen tähän liuokseen siten, että loppupitoisuudeksi tulee noin 20 mg/ml.

Kudostekijä ja kantajaproteiini yhdistetään uudel-leenliuotettuihin fosfolipideihin ja tuloksena olevan se-15 oksen tilavuus säädetään edellä kuvatulla puskurilla, joka sisältää edullisesti matalalämpötilasäilytettä (edullisimmin trehaloosia) ja glysiiniä mutta ei detergenttiä. Kuten edellä mainittiin, tämän keksinnön mukaisten kudostekijä-reagenssien valmistuksessa käytettävä kudostekijä voi olla 20 peräisin joko luonnollisesta tai rekombinattilähteestä.

.. Tämän keksinnön yhden edullisen suoritusmuodon mukaisesti • · '. käytetään rekombinattikudostekijää (rTF). Lisätään kudos- • · · ···· tekijä ja sen jälkeen kantajaproteiini, kuten naudan gam- • * · · ’ ’ maglobuliini, ja lisätään riittävästi puskuria, niin että • · 25 lopulliseksi kudostekijäpitoisuudeksi tulee 1 mg/ml, fos- • · · • folipidipitoisuudeksi 4 mg/ml ja detergenttipitoisuudeksi « * · : 20 mmol/1. Soveltuviin puskureihin kuuluu TBS, joka sisäl tää 150 mmol/1 trehaloosia ja 0,8 % glysiiniä. Tuloksena j oleva kirkas väritön liuos ei tarvitse pyörösekoitusta ,··*. 30 eikä äänikäsittelyä yhteisliukenemisen takaamiseksi.

* Fosfolipidi-kudostekijäseoksessa oleva detergentti » » : " voidaan poistaa joukolla menetelmiä, jotka johtavat sta- • * · hiiliin liposomikoostumukseen, jossa kudostekijä on liit-j’. tyneenä lipidikaksoiskerrokseen ja sijoittuneena sen läpi.

35 Soveltuviin menetelmiin detergentin poistamiseksi kuuluvat 13 109764 dialyysi, tangentiaalivirtausdiasuodatus, poikittaisvir-tausontelokuitusuodatus, käsittely hydrofobisella kromto-grafiahartsilla ja yksinkertainen laimennus.

Yhdessä edullisessa menetelmässä detergentin pois-5 tamiseksi fosfolipidi-kudostekijäseoksesta käytetään vähintään 30 tuntia kestävää ja huoneenlämpötilassa tehtävää dialysointia dialyysikalvoletkussa puskuria vastaan, kuten 150 mmol/1 trehaloosia, 0,8 % glysiiniä ja 0,05 % NaN3:ä sisältävää TBS:ää vastaan, jolloin detergentti poistuu. 10 Yhdessä toisessa edullisessa menetelmässä detergentin poistamiseksi käytetään hartsikäsittelyä. Soveltuviin hartseihin kuuluvat hydrofobiset kromatografiahartsit, kuten Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania) tai Bio-Beads SM-2 (BioRad, Richmond, Kali-15 fornia). Hartseja voidaan käyttää detergentin poistoon joko saattamalla ne suoraan kosketukseen fosfolipidi-ku-dostekijäliuoksen kanssa tai erotettuina liuoksesta dia-lyysikalvolla. Detergentin poistumisnopeus fosfolipidi-kudostekijäliuoksesta on verrannollinen liuoksessa olevan 20 detergentin ja kromatografiahartsihelmien massasuhteeseen.

., Detergentinpoistovaiheen tuloksena olevan liposomi- • · ' # liuoksen CdCl2-pitoisuus säädetään sitten arvoon 5 mmol/1.

I I « ···· Yhden edullisen suoritusmuodon mukaisesti täysin aktiivis- ' ta kudostekijää sisältävä liposomiliuos laimennetaan si- • · ·/·: 25 ten, että se sisältää 50 mmol/1 Trisiä (pH 7,5), 75 mmol/1 I « | •trehaloosia, 0,8 % glysiiniä ja 10 - 15 mmol/1 CaCl2:a επί nen käyttöä. Vaihtoehtoisesti voidaan laimennettu reagens- si kylmäkuivata sen toimintaominaisuuksien säilyttämiseksi : pitkäaikaisesti ja saattaa sitten myöhemmin käyttövalmiik- » * » * · ,···. 30 si suspendoimalla se veteen ennen käyttöä.

’* Yhdessä toisessa edullisessa menetelmässä detergen- : · tin poistamiseksi vältetään sekä dialyysin että hartsikä- sittelyn käyttö ja saadaan silti aikaan aktiivisen TF-rea-genssin valmistus. Tämän menetelmän mukaisesti detergen-35 tiliä liuokseen saatetut TF-pitoiset fosfolipidit laimen- 109764 14 netaan detergenttiä sisältämättömällä puskurilla, jolloin saadaan TF-pitoisia seosmisellejä, jotka voidaan edelleen aktivoida täysin CdCl2:lla. Keksinnön tämän puolen mukaisesti fosfolipidit liuotetaan pitoisuudeksi 20 mg/ml pus-5 kuriin, joka sisältää detergenttiä, edullisesti alkyyli-glukopyranosidia. Yksi sopiva puskuri-detergenttiliuos on HEPES-puskuri (20 mmol/1, pH 6), joka sisältää 50 mmol/1 aktyyli-beeta-D-tioglukopyranosidia (OTG) ja 150 mmol/1 NaCl:a. Sitten lisätään kantajaproteiini, TF ja CdCl2 ja 10 seosta laimennetaan edelleen detergenttiä sisältämättömällä puskurilla, kuten HEPES-puskurilla (20 mmol/1, pH 6), joka sisältää 150 mmol/1 NaCl:a, niin että lopulliseksi TF-pitoisuudeksi tulee 10 pg/ml, kantajaproteiinipitoisuu-deksi (naudan gammaglobuliini) 1 mg/ml, CdCl2-pitoisuudeksi 15 5 mmol/1, fosfolipidipitoisuudeksi 4 mg/ml ja OTG-pitoi- suudeksi 10 mmol/1. Reagenssi voidaan kylmäkuivata varastointia varten edellä kuvatulla tavalla tai laimentaa edellä kuvatulla tavalla ennen käyttöä.

Keksinnön yhden toisen puolen mukaisesti tämä rea- 20 genssi voidaan valmistaa noudattamalla menetelmiä vesikke- . , lien ja detergentti-fosfolipidiseosmisellien valmistami- • < seksi fosfolipideistä, menetelmillä, jotka perustuvat me- • · · ··· kaanisiin keinoihin, poistamalla orgaaniset liuotteet, ' : poistamalla detergentti ja muuttamalla kokoa, kuten ovat 25 kuvanneet D. Lichtenberg ja Y. Barenholz [Methods of Bio- j chemical Analysis 33 (1988) 337 - 462], joka julkaisu mai- nitaan tässä viitteenä.

Tämän keksinnön ymmärtämisen helpottamiseksi an-: netaan seuraavat esimerkit, joissa kuvataan yhden koesar- • t ,···, 30 jän tuloksia. Seuraavat keksintöön liittyvät esimerkit ovat valaisevia, eikä niitä tulisi tietenkään ymmärtää : ·* keksintöä erityisesti rajoittaviksi. Lisäksi keksinnön sellaiset tällä hetkellä tiedossa olevat tai myöhemmin ;·. kehitettävät variaatiot, jotka olisivat ammattimiehen toi- 35 mialan piirissä, on ymmärrettävä kuuluviksi tämän, jäljem- • · ,, 109764 15 pänä patenttivaatimuksin määriteltävän keksinnön suoja-alan piiriin.

Esimerkit Esimerkki 1 5 Anti-rTF-affiniteettigeelin valmistus TF:n vastainen monoklonaalinen vasta-aine TF8-5G9 saatiin tohtori T. S. Edgingtonilta, ja se oli valmistettu Morrisseyn et ai. menetelmällä [Thrombosis Research 42 (1988) 247 - 261]. TF8-5G9-vesivatsaneste puhdistettiin 10 IgG:ksi DEAE-kromatografiällä käyttämällä menettelyä, jota kuvataan teoksessa Harlow, E. ja Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988, s. 304 - 305.

Immuuniaffiniteetihartsi valmistettiin sitomalla 15 puhdistettu vasta-aine kovalenttisesti Affigel 10:een (Biorad Laboratories, Richmond, Kalifornia) valmistajan suosittelemalla menettelyllä. Siten dialysoitiin 200 mg DEAE-puhdistettua monoklonaalista vasta-ainetta MOPS-liuokseen (0,1 mol/1, pH 7,5), niin että saatiin liuos, 20 jossa pitoisuus oli 10 mg/ml. 20 ml tätä liuosta lisättiin . . sitten 20 ml:aan Affigel 10:ä. Seoksen annettiin sitten • / inkuboitua yön yli lämpötilassa 2 - 8 °C ja sitä sekoitet- tiin pyörittämällä astiaa vaaka-akselinsa ympäri. 16 - 24 ' ’ tunnin kuluttua lisättiin 20 ml etanoliamiiniliuosta ·.**: 25 (0,1 mol/1, pH 8), joka liittyy mahdollisten reagoimatto- • mien ryhmien kanssa ja keskeyttää reaktion. Hartsi valu- : : : tettiin ja pestiin MOPS-liuoksella (0,1 mol/1, pH 7,5); immuuniaffiniteettihartsi säilytettiin lämpötilassa 2 -8 °C. Ky tkey tyrni s tehon havaittiin olevan yli 95 %.

• · ,···, 30 Esimerkki 2 • Rekombinattikudostekijän (rTF) valmistus ·' " Yhdistelmäkudostekijä (rTF) puhdistettiin soluly- saateista seuraavalla menetelmällä. rTF:ää tuottavat solut pestiin TBS:llä ja suspendoitiin uudelleen pitoisuudeksi 3 5 2*107/ml TBS:ään, joka sisälsi 0,25 % Triton X100:aa, 16 109764 10 pg/ml soijapaputrypsiini-inhibiittoria ja 1 mmol/1 EDTAa. Kun oli sekoitettu 30 min lämpötilassa 4 °C, solu-jätteet poistettiin sentrifugoimalla 20 min suunnilleen kiihtyvyydellä 5000 G lämpötilassa 4 °C.

5 Selkeytetty lysaatti laimennettiin 2,5-kertaiseen tilavuuteen TBS:llä, niin että Triton-pitoisuus laski 0,1 %:ksi, ja johdettiin sitten immuuniaffiniteettihartsin (valmistettu esimerkissä 1) läpi, joka sisälsi kovalentti-sesti kytkettyä TF:n vastaista monoklonaalista vasta-ai-10 netta. Hartsikerros pestiin 2- - 3-kertaisella tilavuudella TBS:ää, joka sisälsi 0,1 % Triton X100:aa, 2- - 3-kertaisella tilavuudella Tris-puskuria (20 mmol/1, pH, 7,5), joka sisälsi 0,5 mol/1 NaCl:a ja 0,1 % Triton X100:aa, ja lopuksi 2- - 3-kertaisella tilavuudella liuosta, joka si-15 sälsi 0,5 mol/1 NaCl:a ja 0,1 % Triton X100:aa. Sitoutunut proteiini eluoitiin hartsista liuoksella, joka sisälsi 0,1 mol/1 glysiiniä (pH 2,5) ja 0,1 % Triton X100:aa. Fraktiot, jotka kerättiin puskurin vaihduttua glysiiniin, neutraloitiin välittömästi sopivalla tilavuudella Tris-20 puskuria (1 mol/1, pH 8). rTF:ää havaittiin fraktioissa, . . jotka olivat aivan lähellä pistettä, jossa kolonnin eff- * . luentin pH muuttui.

···· rTF:ää sisältävät fraktiot yhdistettiin, dialysoi- tiin 0,1 5 Triton Xl00:aa sisältävää Tris-puskuria *. *i 25 (20 mmol/1, pH 8) vastaan ja konsentroitiin sitten sito- • · · • maila rTF kerrostilavuudeltaan pieneen DEAE Trisacryl -ko- • * * : : : lonniin (IBF Biotechniques, Columbia, Maryland). Triton X100 korvattiin CHAPS :11a pesemällä hartsikerros vähintään

.'.j 10-kertaisella tilavuudella Tris-puskuria (20 mmol/1, pH

• · .···, 30 8), joka sisälsi 10 mmol/1 CHAPS:a. rTF eluoitiin yhdessä vaiheessa Tris-puskurilla (20 mmol/1 pH 8), joka sisälsi • “ 0,5 mol/1 NaCl:a ja 10 mmol/1 CHAPS:a.

Esimerkki 3

Fosfolipidien valmistus 35 Fosfatidyylikoliini (PC), fosfatidyylietanoliamiini (PE), fosfatidyyliseriini (PS) ja fosfatidyyliglyseroli 17 109764 (PG) saatiin kloroformiliuoksina Avanti Polar Lipideiltä, Alabaster, Alabama, tai Calbiochem Corporationilta, La Jola, Kalifornia, suljetuissa lasiampulleissa ja se säilytettiin typen alla lämpötilassa -20 °C. CHAPS, muut deter-5 gentit ja naudan gammaglobuliini saatiin Calbiochemiltä. Tris-emäs ja glysiini ostettiin BioRad Laboratoriesilta, Richmond, Kalifornia. Kaikki muut kemikaalit ja biokemi-kaalit hankittiin Sigmalta, St Louis, Missouri.

Fosfolipidit preparoitiin uudelleenliuottamista 10 varten seuraavasti. PC, E, PS ja PG lämmitettiin huoneenlämpötilaan ja yhdistettiin sopivassa putkessa tai pullossa määrätyissä moolisuhteissa. Hapettumisenestoaine, buty-roitu hydroksitolueeni (BHT), liuotettiin kloroformiin ja sitä lisättiin fosfolipidiseokseen 0,1 paino-% (BHT:n 15 osuus fosfolipidien kokonaismäärästä). Orgaaninen liuote poistettiin haihduttamalla kuivan typpivirran alla tai alennetussa paineessa pyöröhaihduttimessa. Jäljelle jäänyt orgaaninen liuote poistettiin pitämällä vakuumipumpun avulla vielä 1 tunti yllä korkeintaan 1,3 Pa:n (10 pm) 20 paine huoneenlämpötilassa. Fosfolipidiseos liuotettiin .. uudelleen pitoisuudeksi 20 mg/ml Tris-puskuriin (20 mmol/1, pH 7,5), joka sisälsi 150 mmol/1 NaCl:a (TBS) ···· ja 100 mmol/1 CHAPS: a.

• * Esimerkki 4 • · •,‘••25 rTF-protrombiiniaika (rTF-PT-) reagenssin valmistus « · · • ' l dialyysillä

Fosfolipidejä yhdistettiin määrätyissä PC-, PE-, PS- ja PG-moolisuhteissa ja liuotettiin sitten uudelleen : esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Uudelleenliuotetut fosfo- • · ♦ • · ...30 lipidit yhdistettiin immuuniaffiniteettipuhdistettuun rTF:ään (esimerkistä 2) ja naudan gammaglobuliiniin. Li- : ’·* sättiin vielä TBS:ää, joka sisälsi 150 mmol/1 trehaloosia, •,,.; niin että lopulliseksi kokonaisfosfolipidipitoisuudeksi tuli 4 mg/ml, rTF-pitoisuudeksi 10 pg/ml, naudan gammaglo- , ,,,:35 buliinipitoisuudeksi 1 mg/ml ja CHAPS-pitoisuudeksi » · 109764 18 20 mmol/1. Tämä kirkas ja väritön liuos laitettiin dia-lyysikalvoletkuun (SpectraporeR, Spectrum Medical Industries, moolimassaraja 12 000 - 14 000) ja dialysoitiin vähintään 30 tuntia huoneenlämpötilassa TBS:ää vastaan, joka 5 sisälsi 150 mmol/1 trehaloosia ja 0,05 % NaN3:ä. Dialyysin jälkeen määritettiin dialysaatin tilavuus ja säädettiin se tarvittaessa takaisin alkuperäiseen arvoon dialyysipusku-rilla. Lisättiin CdCl2:a loppupitoisuudeksi 5 mmol/1 ja liuosta inkuboitiin lämpötilassa 37 °C 2 tuntia.

10 Liuos jäädytettiin hiilihappojäällä ja kylmäkuivat- tiin sitten 48 tunnin ajan käyttämällä sykliä, joka alkoi lämpötilassa -40 °C ja päättyi huoneenlämpötilaan. Li-posomit saatettiin siten käyttöpitoisuuteen Tris-puskurilla (0,1 mol/1, pH 7,5), joka sisälsi 150 mmol/1 trehaloosia, 15 jolloin saatiin liuos, joka sisälsi noin 1-2 pg/ml rTF:ää, noin 400 - 800 pg/ml fosfolipidejä ja 50 - 100 pg/ml naudan gammaglobuliinia.

Edellä valmistettuja rTF-PT-reagensseja käytettiin Thromboscreen-vertailuplasmojen (Curtin Matheson Scienti-20 fic, Yorba Linda, Kalifornia) ja yhdistettyjen normaalien ihmisplasmojen protrombiiniaikojen määrittämiseen. Laitet-tiin 100 μΐ plasmaa ja 100 μΐ laimennettuja liposomeja koa-gulometrin näytesyvennykseen. Laite lisäsi 100 μΐ CaCl2_ • · . . liuosta (20 mmol/1) ja määritti automaattisesti protrom-• » » .|.‘25 biiniajan. Tulokset esitetään alla olevassa taulukossa I.

• · · • · IM • » 1 • · • · · • · I i 1 I | • » · · • » • · t · · • · · • · 19 109764

Taulukko I

Dialyysillä ja erilaisia fosfolipidisuhteita käyttämällä valmistetun PT-reagenssin protrombiiniajat Fosfolipidisuhde NHPb Keskimääräiset PT-ajat (s)

5 (PC:PE:PS:PG)a Taso 1° Taso II Taso III

1:1:1:0 13,5 13,8 25,9 49,0 1:1:0:0 50,0 164,2 108,1 245,1 1:0:1:0 12,6 14,7 30,4 52,7 10 3:1:1:0 13,4 19,5 53,4 69,9 3:1:0:0 77,5 229,4 -d 231,1 3:0:1:0 17,3 27,5 70,1 98,2 5:1:1:0 11,1 13,1 35,2 65,4 5:0:1:0 10,7 13,5 34,8 66,1 15 10:1:1:0 12,4 16,4 48,4 89,2 10:0:1:0 14,9 21,0 62,7 112,6 20:1:1:0 18,4 27,5 82,9 147,6 7,5:1:0,5:1 10,2 18,6 48,8 82,7 8,5:0:0,5:1 13,6 27,6 78,2 131,8 20 8:1:0,25:1 13,8 27,2 76,1 128,1 9:0:0,25:1 17,5 35,7 103,4 187,6 ·' : 7:1:0,25:2 10,7 18,4 54,5 98,0 8:0:0,25:2 13,7 26,1 76,8 118,8 7:1:0,1:2 12,6 23,0 70,2 119,8 :/.:25 8:0:0,1:2 17,4 34,1 108,2 193,7 # * « * » · « » • t //; aFosfolipidien suhde ilmoitetaan moolisuhteena fos- fatidyylikoliini: fosfatidyylietanoliamiini: fosfatidyylise- ,·, : riini: fosfatidyyliglyseroli .

,’..*30 bNormaali-ihmisyhdistelmä (NHP) koostuu 10 normaali- yksilöstä saatujen plasmojen yhdistelmästä, joka on jaettu • ’·· pieniksi annoksiksi ja pikapakastettu.

/ cTasot I, II ja III ovat Thromboscreen-vertailuplas- ;·, moja (Curtin Matheson Scientific, Yorba Linda, Kalifor- • *1 " .35 nia), ja ne on suunniteltu simuloimaan potilaita, jotka 20 109764 saavat oraalista antikoagulanttihoitoa 3 eri tasolla eli voimakkuudella.

dAika oli yli 300 s.

Tulokset osoittivat, että (1) laaja moolisuhdealue 5 on rTF-PT-reagenssissa hyväksyttävä rTF-välitteisen hyyty-mismekanismin käynnistyksen kannalta, (2) reagenssi vaatii fosfolipidikoostumusta, jolla on negatiivinen nettovaraus, kuten PS:ä tai PG:ä, rTF:n indusoiman hyytymisaktiivisuu-den aikaansaamiseksi ja (3) reagenssi vaatii sekä PE:a 10 että PG:ä, kun PS-pitoisuus laskee olennaisesti.

Taulukossa I käytetyt vertailuplasmat on suunniteltu simuloimaan plasmoja, jotka ovat peräisin oraalisessa antikoagulanttihoidossa olevilta potilailta. Protrombiini-ajat, joita saatiin käyttämällä niitä, eivät osoita min-15 kään yksittäisen koagulaatiotekijän puutetta vaan heijastavat muutamien tekijöiden aktiivisuuksien alentumista.

Kuviossa 1 esitetään yksi esimerkki siitä, miten rTF-PT-reagenssi reagoi muutamien ulkoiseen koagulaatio-tiehen osallistuvien tekijöiden (tekijät V, VII ja X) 20 alentuneisiin tasoihin. Protrombiiniajat määritettiin seu-,, raavasti. Normaalien ihmisplasmojen yhdistelmä laimennet- ·* * tiin suhteissa 1:2, 1:4, 1:10, 1:20 ja 1:40 NaCl-liuoksel-

I I I

la (0,15 mol/1), niin että tekijä-aktiivisuuksiksi tuli 50, 25, 10, 5 ja vastaavasti 2,5 %. Plasmanäytteet, joista • · •,'' j2 5 puuttui koagulaatiotekijöitä (Thromboscreen, Curtis j * : Matheson Scientific, Inc.) rehydratoitiin valmistajan oh- jeiden mukaisesti ja käytettiin laimentamattomina. Tässä yhteydessä käytetty rTF-PT-reagenssi oli valmistettu käyt-.·. : tämällä fosfolipidisuhdetta 10:1:1 (PC, PE ja vastaavasti * i * ’..*30 PS) ja sisälsi 10 mmol/1 CaCl2:a. Thromborel S (Berhing Diagnostics, Somerville, New Jersey) rehydratoitiin ja • ’·· käsiteltiin valmistajan suosituksen mukaisesti. 100 μΐ * ! » ί>(>ί normaalia ihmisplasmaa ( NHP ) ja 100 μΐ koagulaatioteki jöi- t ;·, den suhteen puutteellista plasmaa laitettiin koagulometrin » I · ’ .35 näytesyvennykseen. Laite lisäsi 200 μΐ PT-reagenssia ja » · 2i 109764 määritti PT:n automaattisesti. Protrombiinisuhde (PR) laskettiin jakamalla koagulaatiotekijoiden suhteen puutteellisen plasman PT laimentamattomalle NHP:lle saadulla PT:llä ja piirrettiin käyrä NHP:n tuoman tekijän prosentu-5 aalisen osuuden funktiona.

Kuviossa 1 esitettävät tulokset osoittavat, että rTF-PT-reagenssin käyttö johti korkeampiin PR-arvoihin kaikilla testatuilla plasmalaimennoksilla. PT-reagenssin, jolla on korkeampi PR kuin toisen PT-reagenssin samalla 10 normaaliplasmalaimennoksella, sanotaan olevan herkempi reagenssi. Siksi rTF-PT-reagenssi on herkempi kuin Thromborel S tutkittujen koagulaatiotekijöiden puutteen suhteen.

Esimerkki 5 15 rTF-protrombiiniaika(rTF-PT-)reagenssin valmistus ilman dialyysiä

Fosfolipidit preparoitiin uudelleenliuottamista varten seuraavasti. PC, PE ja PS lämmitettiin huoneenlämpötilaan ja yhdistettiin sopivassa putkessa tai pullossa 20 molisuhteessa 7,5:1:1 PC:a, PE:a ja vastaavasti PS:ä. Ha- pettumisenestoaine, butyroitu hydroksitolueeni (BHT), • · ·* * liuotettiin kloroformiin ja sitä lisättiin fosfolipidi- seokseen 0,1 paino-% (BHT:n osuus fosfolipidien kokonais-·"· määrästä). Orgaaninen liuote poistettiin haihduttamalla :/.:25 kuivan typpivirran alla tai alennetussa paineessa pyörö-haihduttimessa. Jäljelle jäänyt orgaaninen liuote poistet- • « tiin pitämällä vakuumipumpun avulla vielä 1 tunti yllä korkeintaan 1,3 Pa:n (10 pm) paine huoneenlämpötilassa.

.*, ; Fosfolipidiseos liuotettiin uudelleen liuokseen, f t >

J.,'30 joka sisälsi 50 mmol/1 oktyyli-beeta-D-tioglukopyranosidia '!* (OTG) ja 150 mmol/1 NaCl:a HEPES-puskurissa (20 mmol/1, pH

• '·· 6), loppupitoisuudeksi 4 mg/ml. Esimerkissä 2 valmistettu / rTF ja naudan gammaglobuliini sekoitettiin uudelleenliuo- ;·, tettujen fosfolipidien kanssa. Lisättiin riittävästi .35 HEPES-puskur.ia (20 mmol/1, pH 6), joka sisälsi 150 mmol/1 22 109764

NaCl:a, niin että loppupitoisuuksiksi tuli 10 pg/ml rTF:ää, 1 mg/ml naudan gammaglobuliinia, 4 mg/ml fosfoli-pidejä ja 10 mmol/1 0TG:a. Lisättiin CdCl2:a loppupitoisuu-deksi 5 mmol/1 rTF:n aktivoimiseksi. Tuloksena olevat 5 rTF:stä, OTG:sta ja fosfolipideistä koostuvat seosmisellit laimennettiin HEPES-puskurilla (20 mmol/1, pH 6), joka sisälsi 150 mmol/1 NaCl:a, liuokseksi, joka sisälsi noin 0,5 - 1 pg/ml rTF:ää, noin 500 - 700 pg/ml fosfolipidejä ja 25 - 50 pg/ml naudan gammaglobuliinia, jolloin saatiin 10 rTF-PT-reagenssi.

Tätä reagenssia käytettiin tässä esimerkissä Thromboscreen-vertailuplasmojen ja normaali-ihmisplasma-yhdistelmän PT:n määrittämiseen. Valmistetaan plasmaver-tailunäytteitä plasmojen jäljittelemiseksi, joissa koagu-15 laatiotekijäiden II, V, VII ja X aktiivisuudet vaihtele-vat. Vertailunäytteessä I aktiivisuustasot ovat lähes normaalit, vertailunäytteessä II keskinkertaiset ja vertailu-näytteessä III alimmat. Odotetaan, että PT:iden pitäisi olla lyhimpiä vertailunäytteen I kohdalla ja pisimpiä ver-20 tailunäytteen III kohdalla. Alla olevassa taulukossa II esitettävät tulokset valaisevat, että asia on näin.

»’ * Taulukko II

Vertailuplasmojen protrombiiniajat käytettäessä **'· ilman dialyysiä valmistettua Corvasin rTF-PT-reagenssiaa * · !t'.J25 Plasmanäyte Keskimääräinen PT (s) i · « * · · .............- - - ._ • i * ·

Normaali-ihmisplasmayhdistelmä 12,5

Thromboscreen-vertailuplasmat: : Taso I 13,7 * » » ’ .‘30 Taso II 37,1 * * '

Taso III 81,1 ( t ! ti>: aNormaali ihmisplasma ja Thromoboscreen-vertailu- ;·, plasmat preparoidaan taulukon I alahuomautuksessa kuvatul- • : · .35 la tavalla.

23 1 0 9 7 6 4 Tämän rTF-PT-reagensin herkkyyttä verrattiin myös muihin kaupallisiin protrombiiniaika(PT-)reagensseihin käyttämällä oraalisessa antikoagulanttihoidossa olevien potilaiden plasmaa. Kaupalliset reagenssit olivat Thrombo-5 rel S (Berhing Dianostics, Somerville, New Jersey) ja Simplastin (Organon Teknika Corporation, Charlotte, Poh-jois-Carolina). Plasmanäytteet, joita oli otettu normaaleista yksilöistä ja oraalisessa anikoagulanttihoidossa olevista potilaista, saatiin pakastettuina paikallisesta 10 sairaalasta.

Määritettiin kunkin plasmanäytteen protrombiiniaika käyttämällä kutakin kolmesta PT-reagenssista. Siten laitettiin 100 μΐ plasmaa ja 100 μΐ rTF-PT-reagenssia koagu-lometrin näytesyvennykseen. Laite lisäsi 100 μΐ CaCl2-15 liuosta (20 mmol/1) ja määritti automaattisesti protrom- biiniajan. Thromborel S:n ja Simplastinin ollessa kyseessä laitettiin 100 μΐ plasmaa näytesyvennykseen ja laite lisäsi 200 μΐ PT-reagenssia. Piirrettiin käyrä, joka kuvasi kustakin potilasnäytteestä rTF-PT-reagenssilla ja Simplas-20 tinilla saadun protrombiiniajan logaritmia Thromborel S:llä saadun vastaavan arvon funktiona. Kuviossa 2 esitet- • · • · ' tävät tulokset osoittavat, että rTF-PT-reagenssin ja

Thromborel S:n ollessa kyseessä kulmakerroin on 0,81. Kul-makerroin 1,0 osoittaisi kyseisten kahden PT-reagenssin * * !'.25 identtisen toiminnan. Siten rF-PT-reagenssi on noin 20 % herkempi kuin Thromborel S. Simplastinia ja Thromoborel ;' ·'j S:ää vertaavan käyrän kulmakerroin on kuitenkin 1,62, mikä » osoittaa, että Smplastin on paljon vähemmän herkkä kuin ; Thromborel S. Edellä esitetyt tulokset vahvistavat sen * » · !,/30 taulukosta II tehdyn johtopäätöksen, että rTF-PT-reagenssi 'on herkempi koagulaatioteki j äaktiivisuuksien laskun suh- i ; ’’· teen ja tämä herkkyys havaitaan sekä todellisilla että * i * ί ! simuloiduilla potilasnäytteillä.

? s 1 I * 1 i 24 109764

Esimerkki 6 rTF-protrombiiniaikareagenssin valmistus diasuoda- tuksella

Fosfolipidit yhdistettiin moolisuhteessa 7,5:1:1 5 (PC:PE:PS), kuivattiin orgaanisen liuotteen poistamiseksi ja liuotettiin sitten uudelleen esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Fosfolipidit, jotka oli liuotettu uudelleen pitoisuudeksi 15 mg/ml TBS:ään, joka sisälsi 100 mmol/1 CHAPS:a, yhdistettiin immuuniaffiniteettipuhdistetun rTF:n 10 (esimerkistä 2) ja naudan gammaglobuliinin kanssa. Lisättiin vielä 150 mmol/1 trehaloosia sisältävää TBS:ää siten, että lopullisiksi pitoisuuksiksi tuli 4 mg/ml fosfolipi-diä, 10 pg/ml rTF:a, 1 mg/ml naudan gammaglobuliinia ja 20 mmol/1 CHAPS:a.

15 Detergentti (CHAPS) poistettiin tangentiaalivir- tausdiasuodatuksella käyttämällä Pyrostart- tai Ultra-start-suodatinyksikköä (Sartorius Corp., Bohemia, NY, moo-limassaraja 20 000) ja 150 mmol/1 trehaloosia sisältävää TBS:ää dialyysipuskurina. Noin 95 - 100 % CHPAS:sta voi-20 daan poistaa johtamalla 10-kertainen tilavuus dialyysipus-kuria laitteen läpi. Diasuodatuksen jälkeen määritettiin V: dialysaatin tilavuus ja säädettiin se (tarvittaessa) ta- > j · kaisin alkuperäiseen arvoon TBS:llä, joka sisälsi 150 mmol/1 trehaloosia ja 0,05 % NaN3:ä. Lisättiin CdCl2:a : 25 loppupitoisuudeksi 5 mmol/1 ja inkuboitiin liuosta 2 tun- tia lämpötilassa 37 °C.

Liuos voidaan jäädyttää hiilihappo jäällä ja kylmä-·' ’ kuivata sitten 48 tunnin aikana käyttämällä sykliä, joka alkaa lämpötilasta -40 °C ja päättyy huoneenlämpötilaan. 30 Tuloksena oleva reagenssi voidaan palauttaa käyttöpitoi-suuteen lisäämällä Tris-puskuria (0,1 mol/1, pH 7,5), joka ;·, sisältää 150 mmol/1 trehaloosia, niin että saadaan liuos, • * t ,···, joka sisältää noin 1-2 pg/ml rTF:a, noin 400 - 800 pg/ml fosfolipidejä ja 50 - 100 pg/ml naudan gammaglobuliinia.

25 109764

Reagenssin toiminta oli samanlainen kuin taulukossa II esitetty.

Esimerkki 7 rTF-protrombiiniaikareagenssin valmistus lisäämällä 5 XÄD-2-hartsia

Fosfolipidit yhdistettiin moolisuhteessa 67:16:10:7 (PC:PG:PE:PS), kuivattiin orgaanisen liuotteen poistamiseksi ja liuotettiin sitten uudelleen esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Fosfolipidit, jotka oli liuotettu uudelleen 10 pitoisuudeksi 15 mg/ml TBS:ään, joka sisälsi 100 mmol/1 CHAPS:a ja 0,8 % glysiiniä, yhdistettiin immuuniaffini-teettipuhdistetun rTF:n (esimerkistä 2) ja naudan gammaglobuliinin kanssa. Lisättiin vielä 150 mmol/1 trehaloosia ja 0,8 % glysiiniä sisältävää TBS:ää siten, että lopulli-15 siksi pitoisuuksiksi tuli 3 mg/ml fosfolipidiä, 4,5 pg/ml rTF:a, 1 mg/ml naudan gammaglobuliinia ja 20 mmol/1 CHAPS:a.

Hydrofobisia kromatografiahartseja, kuten Amberlite XAD-2:a (Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pa) tai Bio- 20 Beads SM-2:a (BioRad, Richmond, Ca), voidaan myös käyttää detergentin (CHAPS) poistamiseen joko suorassa kosketuk- V; sessa fosfolipidiliuoksen kanssa tai erotettuna siitä dia- lyysikalvolla. Poistoaste oli verrannollinen liuoksessa olevan detergentin ja kromatografiahartsihelmien painosuh- . . 25 teeseen. Poistoaste on itse asiassa verrannollinen sekä » · · lisätyn hartsin määrään että lisäysnopeuteen. Määrä, joka * » · tarvitaan poistamaan detergentti kokonaan, lasketaan hart-'*' sin kapasiteetista (valmistajan ilmoittama) ja poistet tavan detergentin kokonaismassasta. Lisäksi 99,9-%:inen 30 detergentin poisto voidaan saavuttaa joko 1 tunnissa tai 24 tunnissa lämpötilassa 30 °C tämän hartsimäärän lisäys-;·, nopeuden mukaan. Lisättiin CdCl2:a loppupitoisuudeksi • 5 mmol/1 ja liuosta inkuboitiin 2 tuntia lämpötilassa *” 37 °C. Liposomit laimennettiin sitten käyttöpitoisuuteen ! ’·· 35 Tris-puskurilla (50 mmol/1, pH 7,5), joka sisälsi 26 109764 75 mmol/1 trehaloosia, 15 mmol/1 CaCl2:a, 0,8 % glysiiniä, 1 % maltoosia ja 0,05 % NaN3:ä, niin että saatiin liuos, joka sisälsi noin 0,04 - 0,20 pg/ml rTF:a, noin 40 -150 pg/ml fosfolipidejä ja 50 - 100 pg/ml naudan gammaglo-5 buliinia.

Liuos jäädytettiin hiilihappojäällä ja kylmäkuivat-tiin sitten 48 tunnin aikana käyttämällä sykliä, joka alkaa lämpötilasta -40 °C ja päättyy huoneenlämpötilaan. Kylmäkuivatu reagenssi saatettiin ennen käyttöä toiminta-10 valmiiksi tislatulla vedellä.

Määritettiin rTF-PT-reagenssin toimintakyky ja tulokset esitetään alla olevassa taulukossa III. Laitettiin 100 μΐ normaalien ihmisplasmojen yhdistelmää tai Ortho-vertailuplasmoja koagulometrin näytesyvennykseen. Laite 15 lisäsi 200 μΐ rTF-PT-reagenssia ja määritti PT:n.

Taulukko II

Vertailuplasmojen protrombiiniajat käytettäessä XAD-2-käsittelyillä valmistettua Corvasin rTF-PT-reagenssia 20 Plasmanäyte Keskimääräinen PT (s) :: Normaali-ihmisplasmayhdistelmä 12,1 ·*· Ortho-vertailuplasmat:

Taso I 11,8 25 Taso II 35,7 ,·,·! Taso III 63,1 i · t 4 · • · • ·

aNormaali-ihmisyhdistelmä (NHP) koostuu 10 normaali-yksilöstä saatujen plasmojen yhdistelmästä, joka on jaettu • 30 pieniksi annoksi ja pikapakastettu. Tasot I, II ja III

..." ovat Ortho Diagnostic Systems -vertailuplasmoja (Raritan,

New Jersey) ja ne on suunniteltu simuloimaan potilaita, ,···. jotka saavat oraalista antikoagulanttihoitoa 3 eri tasolla eli voimakkuudel1a.

« · · 27 109764

Tulokset osoittavat, että rTF-PT-reagenssi antaa tulokseksi tältä keksinnöltä toivotun toimintakyvyn. Ensinnäkin erilaisille vertailunäytteille saadut PT:t heijastavat odotettuja muutoksia, koska nämä vertailuplasmat 5 on suunniteltu simuloimaan eriasteisessa antikoagulantti-hoidossa olevien potilaiden plasmoja. Toiseksi normaalille ihmisplasmalle saadut PT:t ovat yhtäpitäviä tason I ver-tailuplasman arvojen kanssa. Viimeksi mainittu ilmiö johtuu glysiinin sisällyttämisestä reagenssiin. Vertaa taulu-10 koissa I ja III esitettyjä tuloksia.

· » » · i · * ·

Claims (9)

1. Puhdistettua luonnollista kudostekijää tai yhdistelmäkudostekijää sisältävä protrombiiniaikareagenssi, 5 tunnettu siitä, että se käsittää liposomi-koostumuksen, joka käsittää (a) fosfolipidiseosta, joka käsittää (i) noin 20 - 95 mol-% fosfatidyylikoliinia; (ii) noin 2,5 - 50 mol-% fosfatidyylietanoli- 10 amiinia; (iii) noin 2,5 - 50 mol-% fosfatidyyliseriiniä; (iv) noin 0-40 mol-% fosfatidyyliglyserolia; (b) noin 0,1 - 3 pg kudostekijää 1 mg kohden fosfolipidiseosta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen protrombiini aikareagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi noin 0,5 - 1,5 % glysiiniä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen protrombiiniaikareagenssi, tunnettu siitä, että se 20 käsittää lisäksi hiilihydraattimatalalämpötilasäilytettä, joka valitaan trehaloosin, maltoosin, laktoosin, glukoosin ·' ’ ja mannitolin joukosta.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen protrombiini- aikareagenssi, tunnettu siitä, että hiili- * · *.j 25 hydraattimatalalämpötilasäilyte käsittää trehaloosia suunnilleen 50 - 250 mmol/1.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen protrombiini aikareagenssi, tunnettu siitä, että mainittu ; fosfolipidiseos käsittää noin 5-15 mol-% fosfatidyy- !..* 30 lietanoliamiinia, noin 5-20 mol-% fosfatidyyliseriiniä ja ;· noin 10 - 25 mol-% fosfatidyyliglyserolia loppuosan ollessa | '·· fosfatidyylikoliinia.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen protrombiini- aikareagenssi, tunnettu siitä, että mainittu fos- ’ . 35 folipidiseos käsittää noin 8-12 mol-% fosfatidyyli- etanoliamiinia, noin 3-10 mol-% fosfatidyyliseriiniä, 109764 ΐ noin 14 - 20 mol-% fosfatidyyliglyserolia ja noin 58 - 75 mol-% fosfatidyylikoliinia.

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen protrombii-niaikareagenssi, tunnettu siitä, että mainittu 5 fosfolipidiseos käsittää noin 8-12 mol-% fosfatidyy-lietanoliamiinia, noin 3-10 mol-% fosfatidyyliseriiniä, noin 14 - 20 mol-% f osfatidyyliglyserolia ja noin 58 - 75 mol-% fosfatidyylikoliinia.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen protrombiini-10 aikareagenssi, tunnettu siitä, että mainittu kudostekijä on rekombinanttikudostekijä.

9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen protrombiini-aikareagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää i noin 0,6 - 1,2 % (paino/tilavuus) glysiiniä. 15 « a · > t « t a I • · > · a * t s · · • · i I » t • < · » · i a » a I · • · k * » a • i »* * k a » · a a i a 109764