CN113577323B - 基于细菌小细胞的生物药物的电离辐射灭菌以及使用方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了通过暴露于电离辐射最终灭菌细菌小细胞或包含细菌小细胞的组合物的方法。还公开了最终灭菌的细菌小细胞、包含所述细菌小细胞的药物组合物、以及使用所述细菌小细胞和所述药物组合物的方法。

Description

基于细菌小细胞的生物药物的电离辐射灭菌以及使用方法

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2015年8月4日提交的美国临时申请第62/200,903号的优先权。将该相关申请的内容通过引用整体明确地并入本文中。

发明背景

领域

本申请涉及用于真细菌小细胞的生产、纯化、配制和最终灭菌的组合物和方法，其用作用于检测、治疗和预防癌症、遗传病症、传染性疾病和其它疾病的诊断、治疗和预防性生物药物产品和药剂。

相关领域的描述

提供以下本发明的背景的描述以帮助理解本发明，但并不是认可其描述或构成了本发明的现有技术。本申请中提及或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和电子可得信息的内容在此通过引用整体并入，至如同每一单独的出版物具体且单独地指明为通过引用并入的程度。申请人保留将来自任何这些文章、专利、专利申请或其它文件中的任何和所有材料和信息物理地并入本申请中的权利。

在设计选择性靶向和治疗癌症和/或用作疫苗的新的生物药物产品的开发中，将细菌小细胞和其它生物相容性微粒和纳米颗粒用作小分子药物和大分子药物递送媒介物已成为越来越受关注的领域。细菌小细胞是球形纳米尺寸(约400nm)的颗粒，其可由重组产小细胞的细菌菌株产生。除了细菌染色体以外，小细胞含有其亲代细菌的所有组分和分子成分。因此，小细胞不是活的，不能复制，并且是非传染性的，使得它们非常适合作为体内递送媒介物和疫苗，而无感染风险。如本文更详细描述的，因为小细胞来源于高度适于重组工程、重组表达技术和简易分子生物学技术的细菌菌株，它们也非常适于重组工程，并且与其它纳米递送技术相比，它们易于转化为靶向药物递送和疫苗媒介物。

开发用于人类的基于重组细菌小细胞的生物药物的主要障碍之一是使用基于常规标准过滤的方法可靠地灭菌这些产物的能力，因为小细胞常常保留在保留物中，并且不容易通过标准的0.22微米过滤膜。如US 2004/0265994中所述，用于将小细胞纯化为生物药物产品的其它基于过滤的方法不能提供使用根据ICH指南的验证灭菌方法一致的无菌性保证。另外，该方法将多个额外的步骤引入小细胞的下游加工，包括在抗生素的存在和高盐浓度下进行长时间孵育，其中每一种都需要额外的表征测试其各自在最终药物产品中去除。

因此，需要有效且可靠的方法来灭菌基于细菌小细胞的生物药物产品。

发明概述

本文公开了产生旨在用于药物用途的最终灭菌的细菌小细胞的方法，其包括使包含多个细菌小细胞的组合物暴露于电离辐射。电离辐射可以是，例如，γ辐射、E-束(电子束、β辐射)辐射、X-射线(光子)辐射和UV辐射。电离辐射的优选类型之一是γ辐射。在一些实施方案中，电离辐射处于约5kGy至约40kGy的剂量。在一些实施方案中，电离辐射处于约25kGy的剂量。在一些实施方案中，γ辐射的剂量足以将组合物灭菌至符合USP 38 NF 33版的USP<71>标准的水平。

在一些实施方案中，所述组合物为包含所述细菌小细胞和药学可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括产生包含所述细菌小细胞和药学可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，药学可接受的赋形剂是海藻糖。在一些实施方案中，所述组合物是包含所述细菌小细胞和药学可接受的稀释剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述方法包括产生包含所述细菌小细胞和药学可接受的稀释剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述药学可接受的稀释剂是无菌水。

在一些实施方案中，所述细菌小细胞作为冷冻悬液被暴露于最终灭菌剂量的电离辐射。在一些实施方案中，所述组合物作为冷冻悬液被暴露于最终灭菌剂量的电离辐射。在一些实施方案中，所述细菌小细胞作为冷冻冻干物被暴露于最终灭菌剂量的电离辐射。在一些实施方案中，所述组合物作为冷冻冻干物被暴露于最终灭菌剂量的电离辐射。

在一些实施方案中，所述细菌小细胞表达和/或展示侵袭素或其功能等同物。所述侵袭素可以为，例如，来自假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)的侵袭素。在一些实施方案中，所述细菌小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(perfringolysin O,PFO)。

本文还公开了包含多个细菌小细胞的药物组合物，其中所述细菌小细胞已经被暴露于电离辐射。在一些实施方案中，所述药物组合物是无菌的。在一些实施方案中，所述细菌小细胞或所述药物组合物已被最终灭菌。在一些实施方案中，所述药物组合物已经被暴露于电离辐射。

在一些实施方案中，所述细菌小细胞包含靶向治疗性小细胞。在一些实施方案中，所述细菌小细胞包含免疫调节小细胞。在一些实施方案中，所述细菌小细胞包含免疫原性小细胞。在一些实施方案中，所述细菌小细胞来源于来自以下属的细菌：埃希氏菌(Escherichia spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、李斯特菌(Listeria spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、不动杆菌(Acinetobacter spp.)、奈瑟氏菌(Neiserria spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)或嗜血杆菌(Haemophilus spp)。

在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学可接受的赋形剂。所述药学可接受的赋形剂可以是，例如，海藻糖。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含药学可接受的稀释剂。所述药学可接受的稀释剂可以是，例如，无菌水。

在一些实施方案中，所述药物组合物中的活微生物污染物处于符合USP 38 NF 33版的USP<71>标准的水平。

在一些实施方案中，所述细菌小细胞表达和/或展示侵袭素或其功能等同物。例如，所述侵袭素可以是来自假结核耶尔森菌的侵袭素。在一些实施方案中，所述细菌小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)。

在一些实施方案中，所述药物组合物为冷冻悬液的形式。在一些实施方案中，所述药物组合物为冷冻冻干物的形式。

本文还提供了这样的生物药物组合物，其包含已经被暴露于灭菌剂量的电离γ辐射的多个细菌小细胞。在一些实施方案中，所述生物药物组合物按照美国药典<71>的规定是无菌的，并且其中所述细菌细胞(i)在所述小细胞表面表达和/或展示侵袭素，以及(ii)包含作为生物活性有效载荷的产气荚膜梭菌溶素O，其活性不受暴露于灭菌剂量的γ辐射的影响。

附图简述

图1是适用于本文所述的实施方案的双特异性抗体和双特异性抗体衍生物的非限制性示例类型的示意图。

图2A-B显示已经被暴露于渐增剂量的γ辐射的含有VAX014小细胞的小瓶(冷冻悬液或冷冻冻干物)。

图3显示在从用于目测的容器中移除之后，已经被暴露于渐增剂量的γ辐射的复溶的冻干VAX014小细胞和解冻的VAX014小细胞冷冻悬液。

图4显示在被暴露于渐增量的电离γ辐射之后VAX014小细胞冷冻悬液和冷冻冻干物的溶血活性(即，产气荚膜梭菌溶素O活性)。

图5A-B是在被暴露于渐增量的电离γ辐射之后VAX014小细胞冷冻悬液或冷冻冻干物的VAX014小细胞介导的细胞杀伤活性(效能)的图。

图6是Kaplan-Meier存活曲线，证明在MB49鼠同源原位膀胱癌模型中，VAX014在25kGy灭菌后由膀胱内施用于荷瘤小鼠后的抗肿瘤活性与预先灭菌的未经辐射的VAX014相比没有损失。

图7A-F显示25kGy的γ辐射之后小细胞的稳定性、完整性或效能没有损失，其中小细胞包含阿霉素并在其表面展示抗人表皮生长因子受体1(EGFR-1)的抗体。

图8A-B显示25kGy的γ辐射之后小细胞的稳定性或完整性没有损失，其中小细胞包含重组表达质粒并在其表面展示抗人表皮生长因子受体1(EGFR-1)的抗体。

发明详述

在下述详述中，参考了形成其一部分的附图。在详述、附图和权利要求中所述的示例性实施方案并非意味着是限制性的。在不背离本文呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其它实施方案，并且可以进行其它变化。将容易理解的是，如本文大体所述，本公开的方面可以以多种不同的形式进行安排、取代、组合和设计，其全部被明确地考虑并且构成本公开的一部分。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有相同于本领域普通技术人员通常理解的含义。虽然已参考实施方案和实施例描述了本申请，但应理解在不背离本发明精神的情况下可以进行各种修改。本文引用的所有参考文献通过引用整体明确地并入本文。

在下述实施例中进一步详细公开了本申请的实施方案，所述实施例并不打算以任何方式限制本申请的范围。

定义

如本文所用，术语“免疫调节小细胞”是指能够以对罹患疾病的哺乳动物受体有益或对其治疗的方式激活、失活或影响免疫系统的小细胞。

如本文所用，术语“免疫原性小细胞”是指能够刺激针对特定抗原、抗原、致病性生物体、机会性生物体、寄生生物体或癌细胞的适应性免疫应答的小细胞(即疫苗)。

如本文所用，术语“免疫疗法”是指使用免疫调节化合物，优选免疫调节小细胞，以产生、增强、阻碍或在以其它方式影响免疫应答，其结果对于消除或减缓疾病，尤其是癌症的进展具有有益效果。

如本文所用，术语“粘附小细胞”是指能够结合并粘附至非组成型吞噬真核细胞的表面而不刺激所述小细胞的可感知的内吞作用的小细胞。

如本文所用，术语“粘膜-粘附小细胞”是指能够结合并粘附至粘膜表面的小细胞。

如本文所用，术语“靶向小细胞”是指已经例如经由重组工程和/或添加外源性靶向部分(例如抗体和抗体衍生物)进行修饰以选择性靶向特定组织、器官和/或细胞的小细胞。

如本文所用，术语“靶向治疗性小细胞”是指已经例如，经由重组工程和/或添加外源性靶向部分(例如抗体和抗体衍生物)进行修饰以选择性靶向特定组织、器官和/或细胞，并且还含有小分子药物、治疗性核酸、治疗性多肽以及前述任意组合的小细胞。

如本文所用，术语“靶向小细胞疫苗”是指封装来源于传染性疾病药剂或选择的肿瘤细胞的蛋白抗原和/或基于核酸的疫苗(例如基于DNA或RNA的疫苗)的细菌小细胞，其中所述小细胞还表达和/或展示靶向部分，所述靶向部分赋予所述小细胞表面(例如，外表面)的免疫系统的抗原递呈细胞特异性，使得它们能够特异性结合、被结合或以一些其它方式特异性识别，从而递送、定位于或聚集于参与受体宿主免疫应答的起源、进展和/或维持的抗原递呈细胞、器官或组织类型，以在体外或体内将小细胞的抗原内容物递送至抗原呈递靶细胞、组织和器官类型。此类靶向小细胞疫苗还可以包含重组趋化因子、细胞因子或白介素蛋白以及编码它们的功能性核酸。

如本文所用，术语“同型小细胞疫苗”是指由致病菌产生的细菌小细胞，使得小细胞疫苗针对所述致病菌具有保护作用。同型小细胞疫苗还可以包含来源于相同传染性疾病药剂的蛋白抗原和/或基于核酸的疫苗(例如基于DNA或RNA的疫苗)。此类同型小细胞疫苗还可以包含重组趋化因子、细胞因子或白介素蛋白以及编码它们的功能性核酸。此类同型小细胞疫苗还可以为靶向小细胞疫苗。

如本文所用，术语“整合素-靶向小细胞”是指表达和/或展示侵袭素(例如，来自假结核耶尔森菌的泛-β1-整合素-靶细胞表面分子侵袭素)及其任何功能等同物的小细胞。

如本文所用，术语“整合素-靶向治疗性小细胞”是指表达和/或展示侵袭素(例如，来自假结核耶尔森菌的泛-β1-整合素-靶细胞表面分子侵袭素)及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞还包含一种或多种生物活性分子，包括但不限于治疗性多肽、小分子药物、治疗性核酸以及前述的任何组合。

如本文所用，术语“整合素靶向的免疫调节小细胞”是指表达和/或展示侵袭素(例如，来自假结核耶尔森菌的泛-β1-整合素-靶细胞表面分子侵袭素)及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞还包含一种或多种生物活性分子，包括但不限于免疫调节多肽、小分子药物、免疫调节核酸以及前述的任何组合。

如本文所用，术语“VAX-IP小细胞”是指表达和/或展示侵袭素(例如，来自假结核耶尔森菌的泛-β1-整合素-靶细胞表面分子侵袭素)及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞还包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)。

如本文所用，术语“VAX014小细胞”是指已经配制在包含无菌D-海藻糖作为赋形剂的药物组合物中的VAX-IP小细胞。

如本文所用，术语“VAX-IPT小细胞”是指表达和/或展示侵袭素(例如，来自假结核耶尔森菌的泛-β1-整合素-靶细胞表面分子侵袭素)及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞还包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和蛋白毒素。

如本文所用，术语“VAX-IPP小细胞”是指表达和/或展示侵袭素(例如，来自假结核耶尔森菌的泛-β1-整合素-靶细胞表面分子侵袭素)及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和除蛋白毒素之外的外源性多肽。

如本文所用，术语“VAX-IPD小细胞”是指表达和/或展示侵袭素(例如，来自假结核耶尔森菌的泛-β1-整合素-靶细胞表面分子侵袭素)及其任何功能等同物的小细胞，其中所述小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和白喉毒素的催化片段。

如本文所用，术语“原核细胞分裂基因”是指编码参与原核细胞分裂过程的基因产物的基因。本领域已经发现并表征了许多细胞分裂基因。细胞分裂基因的实例包括但不限于zipA、sulA、secA、dicA、dicB、dicC、dicF、ftsA、ftsI、ftsN、ftsK、ftsL、ftsQ、ftsW、ftsZ、minC、minD、minE、seqA、ccdB、sfiC和ddlB。

如本文所用，术语“转基因”是指已经自然地或通过任何基因工程技术从一种生物体转移到另一种生物体的基因或遗传物质。在一些实施方案中，转基因是含有已经从一种生物体分离并被导入至不同生物体的基因序列的DNA区段。DNA的这种非天然区段可以保留在转基因生物体中产生RNA和/或蛋白质的能力，或者它可以改变转基因生物体的遗传密码的正常功能。在一些实施方案中，转基因是人工构建的DNA序列，无论它是否含有基因编码序列，其被导入至先前不存在转基因的生物体中。

如本文所用，相对于药剂从其中被纯化的组合物，如果药剂的浓度增加，和/或一种或多种不期望的污染物的浓度降低，则认为该药剂已经在组合物中被“纯化”。在一些实施方案中，纯化包括富集组合物中的药剂和/或从其中分离药剂。

本文使用的术语“充分缺乏活亲代细胞”，与“充分缺乏”同义，是指纯化的小细胞的组合物具有对于靶向治疗性小细胞的毒性特征和/或治疗效果具有很小的影响或没有影响的活亲代细胞污染水平。

本文使用的术语“无菌的”意指充分缺乏生物负载，以满足美国药典USP 38NF 33版的标准无菌测试<71>、其一致的外国对应物和其它经批准的国际药物标准下的要求。

本文使用的术语“最终灭菌”是指药物制备过程中的最后一步，其中发现最终药物产品充分缺乏生物负载，以满足美国药典USP 38NF33版的标准无菌测试<71>、其一致的外国对应物和其它经批准的国际药物标准下的要求。最终灭菌的药物产品可为施用于对象作好准备。

本文使用的术语“结构域”或“蛋白结构域”是指共有共同的物理和/或化学特征的分子或结构的区域。蛋白结构域的非限制性实例包括疏水性跨膜或外周膜结合区、球状酶或受体区、蛋白-蛋白相互作用结构域、和/或核酸结合结构域。

本文使用的术语“真细菌”和“原核生物”与本领域技术人员所使用的这些术语一样。例如，本文使用的术语“原核生物”涵盖真细菌，包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、原核病毒(例如，噬菌体)，以及专性细胞内寄生生物(例如，立克次氏体、衣原体等)。

本文使用的术语“免疫调节多肽”是指当被引入真核生物体或细胞(例如，哺乳动物，如人)时具有免疫调节作用的不同蛋白分子类型的任何集合。免疫调节多肽可以是细胞因子、趋化因子、胆固醇依赖性细胞溶素、功能性酶、抗体或抗体模拟物、活化的半胱天冬酶、半胱天冬酶原(pro-caspase)、细胞因子、趋化因子、细胞穿透肽、或前述的任何组合和/或前述中的多种。不应将该术语与下文分别描述的词语“免疫原”或“抗原”混淆。

术语“免疫原”和“抗原”是可互换的，在本文用于指抗原特异性抗体、细胞和/或过敏反应可以针对的多肽、碳水化合物、脂质、核酸和其它分子。抗原特异性免疫应答将依赖于抗原/免疫原的存在，并且不应被包括在本文使用的免疫调节应答的定义内。

本文使用的术语“过表达”是指宿主细胞中DNA编码的功能性核酸、多肽或蛋白的表达，其中所述核酸、多肽或蛋白通常不存在于宿主细胞中，或者其中所述核酸、多肽或蛋白以比由编码所述核酸、多肽或蛋白的内源基因通常表达的水平更高的水平存在于宿主细胞中。

本文使用的术语“调节”意指直接或间接地与靶标相互作用，以改变靶标的活性来调控生物过程。“调节”的模式包括但不限于增强靶标的活性、抑制靶标的活性、限制靶标的活性、延长靶标的活性和减弱靶标的活性。

本文使用的术语“异源的”是指并非天然存在于小细胞或产小细胞的细菌菌株的蛋白、基因、核酸、显像剂、缓冲组分或任何其它生物活性物质(例如，已经被重组引入或转化至产小细胞的亲代细胞)，其由具有编码所述异源物质或编码能够产生所述异源物质(例如，对亲代细胞不是天然的生物活性代谢物)的基因的重组遗传物质的产小细胞的细菌菌株表达、转录、翻译、扩增或在以其它方式产生。

本文使用的术语“外源的”是指对于细胞不是天然的，或者对于小细胞而言，对于小细胞的亲代细胞不是天然的蛋白(例如，抗体)、基因、核酸、小分子药物、显像剂、缓冲剂、放射性核素或任何其它生物活性或非活性物质(例如，已经被重组引入或转化至产小细胞的亲代细胞中)。外源物质与异源物质的不同之处在于它是分别产生、纯化和添加的事实。

本文使用的术语“治疗的”意指具有抑制、消除、减轻或防止动物(包括人)中的疾病或其它异常生物过程的进展的生物学效应或生物学效应的组合。

本文使用的术语“预防的”意指具有防止或延迟动物(包括人类)中的疾病、疾病状态或其它异常生物过程的进展或建立的生物学效应或生物学效应的组合。

本文使用的术语“诊断的”意指具有检测、监测、追踪和/或鉴定动物(包括人)或来自生物样品的疾病或病况的能力，所述生物样品包括但不限于血液、尿液、唾液、汗液和粪便物。

本文使用的术语“治疗诊断学(theranostic)”意指具有治疗和诊断组合物的组合作用。

本文使用的术语“重组表达的”意指使用现代基因工程技术由人工构建的核酸分子表达一种或多种核酸和/或蛋白质，其中人工构建的核酸酸分子并非天然存在于小细胞和/或产小细胞的细菌菌株中，其中人工核酸分子作为附加型核酸分子存在或作为产小细胞的细菌染色体的一部分存在。

本文使用的术语“附加体”是指独立于给定生物体或细胞的染色体的核酸分子。

本文使用的术语“解毒的”是指对组合物或其组分进行修饰，其导致经修饰的组合物或其组分的急性毒性显著降低，而不管所述组合物或其组分的毒性致病生物学基础是什么。

如本文所用，术语“生物活性分子”是指当引入真核生物体或细胞时对所述真核生物体或细胞(例如哺乳动物，如人)具有生物学效应的分子。生物活性分子的实例包括但不限于治疗性核酸，治疗性多肽(包括蛋白毒素)和治疗性小分子药物。

本公开涉及用于在体外和体内将小分子药物、核酸、多肽和显像剂靶向递送至不同组织、器官和细胞类型的最终灭菌的基于细菌小细胞的组合物的产生和用途，预期用作治疗和预防高等动物中的癌症、传染性疾病、自身免疫病、遗传病症和其它生物学疾病(包括但不限于在脊索动物门中发现的那些)的药物。

本公开提供产生基于细菌小细胞的药物、诊断和疫苗产品的组合物和方法，其中使用电离辐射，例如高剂量电离辐射来灭菌产品。在产生无菌的基于细菌小细胞的生物药物的情况下，本文公开的方法在确保无菌的同时，使用较少的步骤且无需添加额外的抗生素或高渗条件来去除活的污染的亲代细胞和其它外来微生物，同时保存小细胞完整性、稳定性和产品功能。

细菌小细胞是无染色体的、膜包封的生物纳米颗粒(直径大约250-500nm)，其由细菌在细菌细胞的正常分裂装置破坏后形成。实质上，小细胞是正常细菌细胞中除了染色体DNA外的小的代谢活性复制物，因此是不分裂的、不能存活的和非传染性的。细菌小细胞可以由多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的物种和菌株产生，包括但不限于埃希氏菌、沙门氏菌、假单胞菌、李斯特菌、伯克霍尔德菌(Burkholderia,spp.)、志贺氏菌、芽孢杆菌、不动杆菌、弗朗西斯氏菌(Franciscella spp.)、军团菌(Legionella spp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)、梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)、弯曲杆菌(Campylobacterspp.)、奈瑟氏菌(Neisseria spp.)、衣原体(Chlamydia spp.)等。虽然小细胞不含细菌染色体，但是已显示质粒DNA分子(比染色体小)、(所有亚型和结构的)RNA分子、天然和/或重组表达的蛋白、核酸和其它代谢物均被分隔进入小细胞中。小细胞独特地适合体内靶向药物递送剂，因为它们可以被工程化以表达和/或展示表面定位的细胞特异性靶向配体，如抗体或细菌粘附素和侵袭素与在单个颗粒中的一种或多种不同的天然存在的异源或外源治疗分子组分的组合。简言之，小细胞可以被“工程化”以优先包封、偶联或吸收生物活性分子(包括但不限于核酸、蛋白质、小分子药物及其任何组合)，其用于随后在期望预防、维持和/或抑制疾病的预防性和治疗性药物应用中的递送和产生应答。

基因工程化的细菌小细胞已经被直接用作抗癌剂，如美国专利第7,183,105号中所述，将其通过引用整体并入本文。例如，美国专利第7,183,105号描述了小细胞可以被工程化成使用小细胞表面定位的抗体将小分子药物、肽、蛋白和各种核酸一起或共同直接靶向和递送至癌细胞以发挥直接靶向的抗癌作用。关于将小细胞用作靶向递送媒介物，其他研究者也已经报道了与U.S.7,183,105中的教导相同的发现，如美国专利公布第20070298056号和第20080051469号，以及美国专利第9,169,495号中所示，将其各自通过引用并入本文。早期的工作已经描述了将细菌小细胞用作潜在疫苗和疫苗载体，起初用作异源多肽抗原载体，后来用作基于核酸的疫苗载体。最近的工作已经将基于细菌小细胞的疗法的库进一步扩展成包括免疫调节组合物和方法。

无论最终的基于细菌小细胞的产品类型，如果旨在用于肠胃外或局部药用或诊断用途，可靠地消除来自最终活性药物成分(API)或最终药物产品(DP)的活的污染的亲代细胞和任何其它外来微生物，对于可靠的产品安全和发布使用极为重要。过去已经使用许多方法来尝试从产生细菌小细胞的活亲代细胞中纯化所述细菌小细胞。研究人员纯化细菌小细胞的最常见方法是差速离心和使用线性或阶梯密度梯度进行一轮或多轮进一步纯化的联合。其它方法包括但不限于基于过滤的方案、裂解性噬菌体的诱导、以及用抗生素与渗透休克和/或超声联合的选择性处理。使用这些方法的一般纯度水平范围为在10⁵-10⁸个小细胞中有1个活的污染的亲代细胞。近年来，已经描述了更新的方法。例如，美国专利第7,611,885号描述了这样的方法，其组合(i)差速离心，(ii)两轮密度梯度纯化，(iii)通过0.45uM过滤器的交叉流过滤，(iv)用高浓度盐处理以诱导导致亲代细胞丝状形成的渗透休克，(v)用抗生素处理，(vi)通过0.2uM过滤器的交叉流过滤，(vii)通过第二个0.45uM的交叉流过滤，(viii)通过100kDa过滤器的小细胞的浓缩，(ix)用偶联至磁珠的抗内毒素抗体处理，(x)结合至所述珠的内毒素的磁性分离，(xi)小细胞的收集，然后可能(xii)配制成赋形剂或其它媒介物用于最终API产生。虽然美国专利第7,611,885号中所述的方法预言性地希望将活的污染的亲代细胞减少至低至10¹¹个小细胞中有1个的水平，但是该方法同时导致相当大的小细胞的损失，添加外源抗生素和/或盐以及在处理期间可能引入外来微生物的多个过滤步骤。最重要的是，最终过滤步骤依赖于终端过滤(即保留小细胞)，因此不被FDA、根据ICH指南运营的其它管理机构和其它经批准的国际药物标准认为是最终灭菌事件。

本公开涉及出乎意料的发现：细菌小细胞可以通过暴露于电离辐射，例如高剂量电离辐射被最终灭菌，而不损失效能、靶向能力或稳定性，同时实现完全消除活的污染的亲代细胞的益处。该发现允许使用更可扩展的、常规的、GMP-相容的/符合GMP的小细胞纯化方法，同时给予使基于细菌小细胞的生物药物产品最终灭菌至足以满足USP38NF 33版USP<71>下的无菌测试标准及其一致的外国对应物的水平的机制。

众所周知，电离辐射能够实现无菌，因而它是医疗装置和手术器械产品所选择的灭菌方法。在灭菌的情况下，电离辐射通过产生游离氧自由基起作用。游离氧自由基是高度反应性分子物质，其迅速引起核酸和蛋白质的共价键断裂，导致细胞和/或微生物死亡。在无菌应用中，通常认为5kGy的剂量足以最终灭菌，尽管通常使用25kGy的较高剂量以确保无菌并且完全没有活的微生物生长。因为通过在这些剂量水平的电离辐射的灭菌对于杀死微生物是有效的、非选择性方法，随之而来的逻辑是它对细菌小细胞的稳定性和活性也具有有害作用。暴露于灭菌剂量的电离辐射对于细菌小细胞没有作用，然而使得所有污染的亲代细胞不能存活的事实是完全出乎意料的。不受任何具体理论的束缚，认为一种可能性是电离辐射仅影响核酸并且不影响蛋白组分，以及因为细菌细胞具有染色体而小细胞不具有染色体，基于此它们被选择性消除。然而，如果蛋白质不受影响，则暴露于任何水平的电离辐射的细菌细胞将能够利用这些基于蛋白质的DNA修复系统来恢复。细菌不会从暴露于超过～3kGy的电离辐射水平恢复，这强烈地支持了蛋白质在这些剂量下也受到影响的观点。其它研究者已经描述了当暴露于6-8kGy的γ辐射时，细菌中的蛋白功能降低至低至10％的水平，这进一步支持了细菌中的蛋白功能受γ辐射的负面影响的观点(参见Kato等人,Journal of Radiation Research and Applied Sciences,2014,Volume 7,pp.568-71)。此外，暴露于电离辐射的分离的蛋白或蛋白混合物也迅速变得无活性的。本公开中所述的方法与已知关于电离辐射对含有功能性蛋白的生物材料和细菌的作用相悖，并且如本文所证明的，细菌小细胞和基于细菌小细胞的生物药物产品可以通过暴露于电离辐射被最终灭菌，而没有损失完整性、特异性、稳定性、效能和体内活性，同时消除所有活的污染的亲代细胞和/或外来微生物。

由于任何污染的亲代细胞的活力或脂多糖(内毒素)的存在，为进一步最大化安全性和限制毒性，在一些实施方案中，本文公开的小细胞来源于产小细胞的菌株，其包含下文公开的三种安全性特征中的一种或多种。在一些实施方案中，产小细胞的菌株包含这三种协同安全特征中的一种或多种。例如，产小细胞的菌株可以包含这三种安全特征中的一种、两种或所有。第一是在已经完成小细胞形成步骤之后杀死残余的活亲代细胞而不裂解它们(并排出游离的脂多糖)的基因自杀机制。本申请并入利用调控的基因自杀机制，在暴露于适当的诱导物时，向产小细胞的亲代细胞的染色体引入不能修补的损伤，如US2010-0112670中所述，将其通过引用并入本文。自杀机制的作用是将不能修补的双链断裂引入亲代细胞的染色体，并且可以被用作常规分离技术的辅助手段以改善小细胞纯化。第二安全特征是限定的营养缺陷型，优选但非必须在二氨基庚二酸(DAP)生物合成途径中，并且最优选在大肠杆菌产小细胞的菌株的dapA基因中。表现出DAP营养缺陷型(dapA-)的大肠杆菌产小细胞的菌株在没有补充DAP的情况下不能在实验室外存活。而且，在包括人的哺乳动物中未发现DAP，因此存在于小细胞产物中的任何产小细胞的亲代细胞将不能在实验室或生产设施外的环境或体内存活。对于不同的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，该主题存在许多变化。例如，在沙门氏菌中，芳香族氨基酸生物合成途径(aro基因)中的营养缺陷型实际上产生相同结果。在志贺氏菌的情况下，鸟嘌呤生物合成途径中的营养缺陷型实际上产生相同结果。第三安全特征需要大肠杆菌产小细胞的菌株中lpxM基因的缺失。lpxM基因的缺失可导致脱毒的脂多糖(LPS)分子的产生。lpxM基因(也被称为msbB基因)用以将末端肉豆蔻酸(myristolic acid)基团添加至LPS分子的脂质A部分，该基因的去除(通过消除lpxM基因)导致LPS的明显脱毒。具体地，脱毒的特征在于促炎细胞因子的产生响应于暴露于LPS而减少。应注意，关于免疫调节小细胞组合物，这种修饰没有教导背离本发明，因为仍可发生响应于脱毒形式的LPS的细胞因子产生，尽管与野生型LPS未处在相同水平。脱毒仅控制产生的细胞因子的水平，使得可以抑制急性败血症样促炎应答，同时允许实现更稳健的Th1和/或Th2免疫应答而无明显的毒性。可以将这种缺失引入到任何革兰氏阴性或革兰氏阳性产小细胞的菌株的任何功能上等同的基因中以实现相同效果。增强的安全特征可以降低发展败血症的风险和可能性。从调控和生产角度来看，还优选从产小细胞的亲代细胞菌株的细菌染色体中消除抗生素抗性标志物。一种或多种安全特征可以是任选的。

本文公开的一些实施方案提供了制备免疫调节小细胞的方法，其包括培养本文公开的免疫调节产小细胞的细菌，以及将免疫调节小细胞与产小细胞的亲代细胞基本分离，从而产生包含免疫治疗小细胞的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括从产小细胞的亲代细胞的培养物中诱导免疫调节小细胞形成。在一些实施方案中，所述方法还包括诱导编码遗传性自杀内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，通过选自下述的一种或多种化合物的存在来诱导小细胞形成：异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四环素。在一些实施方案中，编码遗传性自杀内切酶的基因的表达是通过改变温度来诱导的。在一些实施方案中，所述方法还包括从组合物中纯化免疫调节小细胞。在一些实施方案中，免疫调节小细胞通过选自下述的方法基本上与亲代细胞分离，所述方法包括但不限于离心、过滤、超滤、超速离心、密度梯度、免疫亲和、免疫沉淀以及前述纯化方法的任何组合。在一些实施方案中，免疫调节小细胞被冻干。在一些实施方案中，免疫调节小细胞被冷冻。在一些实施方案中，免疫调节小细胞被冻干，然后被冷冻。在一些实施方案中，免疫调节小细胞被配制成冷冻保护剂赋形剂或其它药学可接受的载体或GRAS物质中的冷冻悬液。在一些实施方案中，免疫调节小细胞被暴露于电离辐射。在一些实施方案中，免疫调节小细胞通过暴露于电离辐射被最终灭菌。在一些实施方案中，免疫调节小细胞通过暴露于电离γ辐射被最终灭菌。

一些实施方案提供了制备免疫原性小细胞，例如疫苗的方法，其包括培养本文公开的适当的产免疫原性小细胞的细菌，以及将免疫原性小细胞与产小细胞的亲代细胞基本分离，从而产生包含免疫原性小细胞的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括从产小细胞的亲代细胞的培养物中诱导免疫原性小细胞形成。在一些实施方案中，所述方法还包括诱导编码遗传性自杀内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，通过选自下述的一种或多种化合物的存在来诱导小细胞形成：异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四环素。在一些实施方案中，编码遗传性自杀内切酶的基因的表达是通过改变温度来诱导的。在一些实施方案中，所述方法还包括从组合物中纯化免疫原性小细胞。在一些实施方案中，免疫原性小细胞通过选自下述的方法基本上与亲代细胞分离，所述方法包括但不限于离心、过滤、超滤、超速离心、密度梯度、免疫亲和、免疫沉淀以及前述纯化方法的任何组合。在一些实施方案中，免疫原性小细胞被冻干。在一些实施方案中，免疫原性小细胞被冷冻。在一些实施方案中，免疫原性小细胞被冻干，然后被冷冻。在一些实施方案中，免疫原性小细胞被配制成冷冻保护剂赋形剂或其它药学可接受的载体或GRAS物质中的冷冻悬液。在一些实施方案中，免疫原性小细胞被暴露于电离辐射。在一些实施方案中，免疫原性小细胞通过暴露于电离辐射被最终灭菌。在一些实施方案中，免疫原性小细胞通过暴露于电离γ辐射被最终灭菌。

一些实施方案提供了制备靶向治疗性小细胞的方法，其包括培养本文公开的产靶向治疗性小细胞的细菌，以及将靶向治疗性小细胞与产小细胞的亲代细胞基本分离，从而产生包含靶向治疗性小细胞的组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括从产小细胞的亲代细胞的培养物中诱导靶向治疗性小细胞形成。在一些实施方案中，所述方法还包括诱导编码遗传性自杀内切酶的基因的表达。在一些实施方案中，通过选自下述的一种或多种化合物的存在来诱导靶向治疗性小细胞形成：异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、蜜二糖和四环素。在一些实施方案中，编码遗传性自杀内切酶的基因的表达是通过改变温度来诱导的。在一些实施方案中，所述方法还包括从组合物中纯化靶向治疗性小细胞。在一些实施方案中，靶向治疗性小细胞通过选自下述的方法基本上与亲代细胞分离，所述方法包括但不限于离心、过滤、超滤、超速离心、密度梯度、免疫亲和、免疫沉淀以及前述纯化方法的任何组合。在一些实施方案中，靶向治疗性小细胞被冻干。在一些实施方案中，靶向治疗性小细胞被冷冻。在一些实施方案中，靶向治疗性小细胞被冻干，然后被冷冻。在一些实施方案中，靶向治疗性小细胞被配制成冷冻保护剂赋形剂或其它药学可接受的载体或GRAS物质中的冷冻悬液。在一些实施方案中，靶向治疗性小细胞被暴露于电离辐射。在一些实施方案中，靶向治疗性小细胞通过暴露于电离辐射被最终灭菌。在一些实施方案中，靶向治疗性小细胞通过暴露于电离γ辐射被最终灭菌。

其它实施方案提供了包含外膜的免疫调节、免疫原性和靶向治疗性小细胞，其中外膜的脂多糖成分包含不具有肉豆蔻酰部分的脂质A分子(“脱毒的脂多糖”或“脱毒的LPS”)。与来源于相应野生型细菌的真细菌小细胞的外膜诱导的炎性应答相比，脱毒的LPS导致哺乳动物宿主中促炎免疫应答的减少。

1.小细胞产生

小细胞是无染色体的、膜包封的生物纳米颗粒(直径大约250-500nm，取决于使用的菌株类型和生长状况)，其由细菌在正常细胞分裂装置破坏后形成。实质上，小细胞是正常细菌细胞的小的代谢活性复制物，除了它们不含有染色体DNA因而是不分裂的且不能存活的。虽然小细胞不含染色体DNA，但已经显示质粒DNA、RNA、天然和/或重组表达的蛋白和其它代谢物均被分隔进入小细胞中。小细胞可以由下述一系列细菌物种和菌株制备，包括但不限于埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弧菌(Vibrio spp.)、奈瑟氏菌、弯曲杆菌、假单胞菌、耶尔森氏菌(Yersinia spp.)、衣藻(Chlamydomonas spp.)、不动杆菌、李斯特菌、芽孢杆菌、嗜血杆菌、梭状芽孢杆菌、弗朗西斯氏菌(Francisella spp.)、立克次氏体(Rickettsia spp.)等。

染色体复制与细胞分裂之间协调的破坏导致从大多数杆状原核生物的极性区形成小细胞。可以通过参与中隔形成和二分裂的一些基因的过表达来促进染色体复制与细胞分裂之间协调的破坏。可选地，可以在具有参与中隔形成和二分裂的基因突变的菌株中产生小细胞。如在许多不同原核生物中所显示的，受损的染色体分离机制也可导致小细胞形成。

类似地，可以通过参与新生染色体分离至子细胞的基因的过表达或突变来实现小细胞产生。例如，已证明大肠杆菌parC或mukB基因座中的突变可产生小细胞。两者均影响肠杆菌科中染色体分离过程中单独的必需步骤。可以假定，如同上文所述的细胞分裂基因，导致小细胞产生的参与染色体分离过程的任何给定基因的野生型水平的操作将对其它家族成员具有类似作用。

由于细胞分裂和染色体复制过程对存活至关重要，因而对于负责这些过程的基因，在原核生物家族成员之间存在高水平的遗传和功能保守性。因此，能够驱动一个家族成员中小细胞产生的细胞分裂基因的过表达或突变可以用于在另一个家族成员中产生小细胞。例如，已经显示大肠杆菌ftsZ基因在其它肠杆菌科家族成员，如沙门氏菌和志贺氏菌以及其它类别成员(如假单胞菌)中的过表达将导致类似水平的小细胞产生。

在肠杆菌科的基于突变的产小细胞菌株中可以证明这一点。例如，min基因座在任何肠杆菌科家族成员中的缺失导致小细胞产生。来自其中突变可以导致小细胞形成的肠杆菌科的细胞分裂基因包括但不限于min基因(MinCDE)。尽管来自min突变株的小细胞产生是可能的，但在基于小细胞的生物药物的产生菌株方面，这些菌株具有有限的商业价值。在min基因内具有缺失或突变的菌株使得小细胞处于组成性低水平，在商业化和规模经济方面存在问题，以及严重限制了利用重组表达技术产生旨在用于递送的生物活性分子。来自min突变株的小细胞产量相对较低，这可增加产生足够数目的小细胞以支持给定生物药物的市场需求所需的生产成本和/或规模。此外，min基因座中的缺失赋予这些菌株恒定的选择压力，并且补偿性抑制基因突变的自发产生可导致产小细胞的表型的丧失。这种可能性会对小细胞产量具有潜在的负面影响。此外，使用细胞分裂突变株来产生包封生物活性分子(其由产小细胞的亲代细胞重组表达，例如用于诊断或治疗递送的蛋白质、RNA、DNA和其它分解代谢物)的小细胞是有问题的。因为突变株中小细胞产生的开始不能被控制并且以组成性低水平发生，所以采用使用亲代细胞重组产生旨在用于递送的生物活性分子的方法会产生不一致的产物，其中一些小细胞将不含有生物学活性分子(即在重组表达之前制备小细胞)，而其它小细胞将含有广泛可变量的生物活性分子。总之，基于突变的产小细胞的菌株的缺点可能导致制造复杂化，这可能限制其在商业目的的小细胞生产中的应用。

过表达细胞分裂基因(“过表达子(overexpresser)”)的产小细胞的菌株优于基于突变的菌株，因为只要将待过表达的细胞分裂基因置于可诱导的或其它条件性激活的真细菌启动子系统的控制下，产生小细胞的表型就是可控的。研究人员使用基于质粒的互补研究在大肠杆菌中鉴定必要的细胞分裂基因，发现过表达细胞分裂基因ftsZ的菌株产生小细胞。在这些研究中，ftsZ基因以每个细胞超过10个拷贝存在。证明ftsZ的多个基因拷贝的存在产生小细胞和极长的丝状细胞。最终，这种转变为不可逆的丝状表型负面影响来自多拷贝质粒的过表达ftsZ的菌株的小细胞产量，尽管产生的小细胞数目仍高于任何突变株产生的数目。已经证明，通过将ftsZ基因拷贝数减少到单一染色体重复，产生的小细胞数目增加超过ftsZ位于多拷贝质粒上的那些菌株，以及丝状表型不太重要。因此，优选的组合物之一包含产小细胞的菌株，其诱导性地过表达来自重复的染色体整合的ftsZ拷贝的ftsZ基因。所用的重复ftsZ基因可以直接来自其中产小细胞表型正在被工程化的细菌种类，并且也可以来源于来自其它细菌种类的ftsZ基因序列。通过非限制性示例的方式，可以使用大肠杆菌(Escherichia coli)的ftsZ基因的过表达来从大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)产生小细胞。所得菌株包含野生型ftsZ基因和染色体上ftsZ基因的单独、重复和可诱导拷贝，以及美国专利公开第2010/0112670号中所述的诱导型基因自杀机制，将其整体并入本文。通过非限制性示例的方式，可以被过表达以在肠杆菌科中产生小细胞的分裂基因包括但不限于ftsZ、minE、sulA、ccdB和sfiC。优选的组合物是在稳定整合至给定真细菌菌株的染色体中的诱导型启动子的控制下具有细胞分裂基因的复制拷贝。本领域技术人员容易认识到，如果诱导型细胞分裂基因盒存在于细胞中存在的质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、重组噬菌体或其它附加体DNA分子上，则可以给予这一相同策略。

小细胞产生的这种诱导型表型方法与突变系统相比有若干明显的优势。首先，因为在这些菌株中没有组成型基因突变，所以在正常生长期间不存在选择压力，并且在小细胞表型被诱导之前培养细胞保持非常稳定和正常的生理机能。最终的结果是诱导型产小细胞的菌株更健康且更稳定，最终导致更高的小细胞产量。使用小细胞产生的诱导型表型方法的另一明显优势是在小细胞将被用于递送生物活性分子，如蛋白质、治疗性RNA、质粒DNA和其它生物活性分解代谢物的情况下，(由产小细胞的亲代细胞在产小细胞的表型诱导之前(预诱导)或期间(共诱导)重组表达这些分子)，使得产生的小细胞包封那些重组生物活性分子。在这些情况下，优选的方法是在诱导小细胞表型之前诱导亲代细胞内生物活性分子的形成，使得所产生的所有小细胞将含有期望量的生物活性分子。可选地，小细胞自身能够在从亲代细胞分离后产生生物活性分子。这包括但不限于：由位于小细胞内的编码生物活性分子的附加体核酸或RNA形成生物活性分子，或者通过从亲代细胞分离后的小细胞中预先存在的的蛋白质组分形成生物活性分子。可以使用这些表达策略中的任一种来表达和/或展示小细胞表面上的结合部分。这些优势在组合使用时得到较高质量和数量的小细胞。另外，如下文更详细描述的，这些小细胞还可以包含可以装载到小细胞中的小分子药物。

2.小细胞纯化

因为小细胞来源于一些致病性或机会致病性细菌，所以重要的是，在作为生物药物产品施用之前任何污染的亲代细胞都能从给定群体中功能性地消除。本文公开的任何或所有方法可以单独或组合用于在通过电离辐射进行最终灭菌之前纯化小细胞。

通常，已经通过物理手段或生物手段或两者来消除活亲代细胞。物理手段包括使用基于离心的分离程序、过滤方法、色谱方法或其任何组合。生物消除通过但不限于下述来实现：亲代细胞的优先裂解、营养缺陷型亲代菌株的使用、抗生素处理、UV辐射处理、必需代谢物剥夺(包括但不限于二氨基庚二酸(DAP)剥夺)_、选择性吸附亲代细胞、用其它DNA损伤剂处理和诱导自杀基因。

亲代细胞的优先裂解通常通过诱导溶原性前噬菌体的裂解周期来介导。在产小细胞菌株的情况下，使用有裂解能力但在再次感染时有缺陷的前噬菌体是最有用的，使得小细胞在裂解表型活化期间后不被感染和裂解。可选地，并且通过非限制性实例，可以表达单个基因，如分类为穿孔素(holin)基因家族成员的那些基因，以实现类似水平的裂解，而不为使用溶原性前噬菌体固有的再感染担心。两种方法均受限于以下事实：无论用于实现裂解事件的方法，该裂解事件将不可接受量的游离内毒素排出到介质中。去除这样大量的游离内毒素是困难的、耗时的、具有批次之间的可变性，并且最终成本过高。

营养缺陷型菌株的使用引起对逆转的担忧，因此仅可用于由细菌的共生或非致病菌株产生的小细胞的情况。因此，对于被用作消除小细胞产生中使用的活的非致病性亲代细胞的方法，它们的应用是受限的。

UV辐射处理可以用于消除小细胞生产运行中的活亲代细胞，除了在一些实施方案中，UV辐射对核酸的作用是随机的，并且结果在批次之间是高度可变的。在一些实施方案中，当小细胞被用于递送治疗性或预防性核酸时不使用UV辐射，因为UV辐射随机损伤所有核酸。例如，质粒DNA极易受UV辐射的DNA损伤，并且可能变得不起作用，尽管仍然由小细胞有效递送。

二氨基庚二酸(DAP)剥夺可以用于消除活亲代细胞，除了该方法受限于可使用其的物种的数目。换言之，并非所有能够产生小细胞的亲代细胞种类都需要DAP才能存活。大肠杆菌产小细胞的菌株中的DAP突变体具有很大优势，并且在一些情况下优于野生型。使用DAP的优势是该化合物(二氨基庚二酸，大肠杆菌细胞壁成分)对于大肠杆菌的生长是关键的，并且不存在于动物中或动物不会产生。因此，如果将“活的”大肠杆菌产小细胞的亲代细胞与靶向小细胞一起施用，则亲代细胞将不能生长，因此对动物是惰性的并且针对小细胞活性。类似的方法可以用于基于沙门氏菌的产小细胞的亲代菌株，除了aro基因，优选aroB被去除的情况。

关于从活亲代细胞纯化小细胞，尚未探索选择性吸附方法。选择性吸附被定义为由于亲代细胞或小细胞对底物的亲和力，亲代细胞或小细胞被优先吸附至底物的任何过程。通过非限制性实例，高亲和力蛋白-蛋白相互作用可以用于该用途。通过非限制性实例，新的小细胞外膜蛋白Lpp-OmpA::蛋白A对于大多数抗体的Fc区具有高亲和力。编码Lpp-OmpA::蛋白A的基因在可以容易地被引入至产小细胞的菌株的染色体上的诱导型启动子的控制之下。在Lpp-OmpA::蛋白A基因的表达活化之前，可以从该菌株产生小细胞，使得产生的小细胞不在其表面表达或展示Lpp-OmpA::蛋白A。一旦从菌株产生期望数量的小细胞，培养物中的活细胞可以被给予信号以产生Lpp-OmpA::蛋白A蛋白，使得Lpp-OmpA::蛋白A仅在活细胞上表达并展示。一旦Lpp-OmpA::蛋白A优先在活亲代细胞表面表达，它们可以被容易地吸附至包被有抗体或其它含Fc区的蛋白的底物上。一旦被吸附，根据使用的底物类型，通过许多不同的手段可将小细胞选择性地从活的亲代细胞中纯化出来。底物包括但不限于用于重力过滤应用中的固相色谱柱、磁珠、离子交换柱或HPLC柱。

在一些实施方案中，小细胞与包含小细胞的组合物中的产小细胞的亲代细胞基本分离。例如，在分离之后，包含小细胞的组合物多于约99.99％、99.95％、99.9％、99.5％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％不含产小细胞的亲代细胞。在一些实施方案中，在通过电离辐射灭菌之前，组合物含有少于约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％的产小细胞的亲代细胞。

在一些实施方案中，有利的是最终组合物含有足够少的污染的亲代细胞(活的或其他)，从而为了治疗目的而在体内施用时毒性不会太大或不干扰靶向小细胞的活性。

3.将小细胞靶向特定细胞、组织和器官

已经通过暴露于电离辐射而最终灭菌的基于小细胞的生物药物产品可以用于靶向和递送生物活性分子或使用若干方法向特定受体、蛋白质、核酸、细胞、组织和器官类型以其它方式施加其免疫调节、免疫原性和治疗性质。靶向小细胞的策略包括但不限于两类。第一类是使用来源于对感兴趣的特定细胞、组织或器官具有天然亲和力或向性的细菌物种的小细胞。第二类方法是工程化小细胞以靶向选择的特定受体、蛋白质、核酸、细胞、组织和器官。例如，第二类方法可以进一步分为两大类，其包括：(i)外源多肽靶向蛋白的重组表达和表面展示，或(ii)将外源添加的靶向部分并入小细胞表面。在本文中更详细地描述这些方法的非限制性应用和效用。

如本领域技术人员所理解的，小细胞可以由多种细菌物种和菌株制备，包括但不限于埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弧菌、奈瑟氏菌、弯曲杆菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、衣原体、不动杆菌、李斯特菌、芽孢杆菌、嗜血杆菌、梭状芽孢杆菌、弗朗西斯氏菌和立克次氏体。许多这些细菌物种和菌株的对于独特的受体、蛋白质、核酸、细胞、组织和器官类型具有天然向性。来源于对独特的受体、蛋白质、核酸、细胞、组织和器官类型具有天然向性的这些细菌物种和菌株的小细胞具有与它们所源自的活的含染色体的亲代细胞相同的向性，并且靶向与它们所源自的活的含染色体的亲代细胞相同的独特受体、蛋白质、核酸、细胞、组织和器官。

小细胞可以被工程化，例如，以通过细胞特异性靶向部分的重组表达和小细胞-表面展示优先靶向特定细胞类型。该方法包括使用细菌膜蛋白融合和展示技术，以及异源细菌粘附素和其它细菌细胞附着或侵袭素分子的表达。在前者的情况下，将小细胞工程化以表达和/或展示与细胞靶向多肽融合的外膜蛋白，使得细胞靶向多肽以足以赋予所述小细胞细胞特异性靶向性质的数量展示在小细胞表面上。可以与细胞靶向多肽融合并展示在小细胞表面上的此类外膜蛋白包括但不限于Lpp-OmpA、LamB、TraA、OmpC、OmpF、FliC、FliD、IgAP、菌毛(fimbrae)蛋白和纤毛蛋白。靶向待融合和展示的多肽包括但不限于对真核细胞膜蛋白特异的单链抗体片段(scFv)、真核生物受体配体(EGF、VEGF、PDGF等)、以及通过正交筛选技术如噬菌体展示得到的非天然存在的靶向多肽。细菌细胞表面定位的粘附素和侵袭素蛋白的重组表达也被用于赋予小细胞细胞特异的靶向性质。在这种情况下，对真核细胞膜蛋白具有天然特异性的细菌粘附素以足以赋予小细胞优先靶向表达所述膜蛋白的真核细胞的数量被重组表达并展示在小细胞表面上。细菌粘附素和侵袭素分子的实例包括但不限于来自假结核耶尔森菌的侵袭素、来自大肠杆菌的FimH、内化素A、内化素B和IV型纤毛。

可以使用非共价或共价偶联技术通过将细胞特异性靶向部分偶联至小细胞表面上来将小细胞工程化以优先靶向特定细胞类型。共价偶联技术结合使用化学交联剂以将多种靶向部分连接至小细胞表面。此类部分包括但不限于多肽、核酸和小分子，并且本领域技术人员可以容易地为每种部分类型选择各自适合的交联试剂。交联试剂包括但不限于表1中所列的那些试剂。共价连接至小细胞表面的优选靶向部分包括但不限于抗体和抗体衍生物。抗体衍生物包括但不限于Fc、Fab、单一重链或轻链、以及其中可变区和互补决定区在其赋予特定表位的特异性方面起作用的任何其它抗体衍生物。使用的其它类型的靶向部分包括受体特异性多肽配体(例如生长因子)、受体特异性激素配体和适配子。

表1列出了用于将不同靶向分子缀合至小细胞表面的化学交联试剂的非限制性类型，以及哪些交联剂对于不同目的是最适合的描述。如表中所列，许多化学交联剂也可以用于产生基于双特异性抗体的靶向分子，为了使所述小细胞能够靶向特定细胞、组织或器官类型的目的，其可以被放置在小细胞表面。在使用交联剂以将靶向分子直接共价连接至小细胞表面的情况下，靶向分子(优选抗体或抗体衍生物)根据交联剂制造商产品插页中提供的说明书在一个反应中被官能化，而待偶联的小细胞根据制造商的另外的说明书在单独的反应(通常用还原剂，如二硫苏糖醇、2-β巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦进行处理)中被官能化。例如，按照交联剂制造商产品插页中的说明书，可以将官能化的靶向部分和官能化的小细胞优选以大于1个靶向分子与1个小细胞的摩尔比混合在一起，并进行孵育以完成偶联反应。在一些实施方案中，在两次简短的洗涤步骤(例如，在缓冲溶液，优选磷酸盐缓冲盐水中使小细胞沉淀并重新悬浮靶向小细胞)后，可以通过在室温或4℃共孵育2-24小时用小分子药物或小核酸有效载荷来进一步装载靶向小细胞。在一些实施方案中，在孵育之后，洗去过量的药物和小核酸(再次通过沉淀和重新悬浮)，并将靶向的含有有效载荷的小细胞配制在药学可接受的赋形剂中，优选药物级稀释剂中的GRAS物质。在一些实施方案中，在药学可接受的赋形剂(例如在注射用无菌水中的D-海藻糖)中重新悬浮之后，可以将小细胞置于单个密封的带有塞子的小瓶中，并作为冷冻悬液储存，或进一步冻干并冷冻储存冻干物。然后，以冻干物或冷冻悬液含有小细胞的小瓶可以通过暴露于电离辐射而最终灭菌并在使用前冷冻储存。

表1.可以用于将靶向部分连接至细菌小细胞的非限制性化学交联剂类型

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可以用来辅助将小细胞靶向疾病的原因、进展、维持或表现中涉及的特定组织、器官和细胞类型的抗体，可以来源于任何免疫球蛋白或免疫球蛋白亚类或为任何免疫球蛋白或免疫球蛋白亚类的一部分，包括但不限于IgA、IgM、IgD、IgG和IgE。旨在促进小细胞的靶向功能的任何亚类的抗体可以是“人源化的”，尽管针对细胞特异性抗原的任何亚类的任何抗体可以在已知通过适应性免疫产生抗体应答的任何动物中产生，以实现相同的目标。实际上，产生抗体使得它们含有两个独立的臂(Fab's)，每个臂识别特定抗原的相同表位。然而，如下文所述，分子生物学的进步使得研究人员能够修饰每个臂(或在一些情况下分子的Fc区)的特异性以识别相同或不同抗原中可能存在或可能不存在的明显不同的表位。这些抗体衍生物被称为‘双特异性’抗体或‘双特异性’靶向部分。

在实验室中，抗体可以被工程化为对不同抗原具有独立特异性，使得单个抗体同时靶向两种单独的抗原。通过非限制性实例，抗体可以被重组工程化以识别双特异性抗体的一个Fab’上给定真细菌小细胞的推定的表面组分(例如，LPS O-抗原或孔蛋白)，以及另一个Fab’可以被工程化以识别真核细胞特异性表面抗原。在该主题的另一个非限制性变型中，抗体重链的Fc区可以被基因工程化以特异性结合给定抗原(例如LPS)内的特定表位，而分子的Fab’部分识别在单独的真核细胞特异性表面抗原中的不同表位，或反之亦然。可以对双抗体、三抗体、四抗体、双-scFv、Fab₂和微型抗体可以采用通过重组手段产生双特异性抗体的相同方法，其中的每一个均可以被工程化以含有对小细胞表面分子特异的一个臂以及针对靶标真核细胞上的抗原或受体的另一个臂。

此外，本领域技术人员将容易认识到，具有单独特异性的两个单独的抗体可以通过将它们偶联至可溶性蛋白A、蛋白G或蛋白A/G(或识别并结合两种或更多种抗体的任何其它结合分子)进行非共价连接，以形成能够粘附至小细胞表面的双特异性抗体衍生物，其中复合物内的一个抗体特异性粘附至小细胞表面，另一抗体显示出特异性识别并从而“靶向”体内表达真核细胞特异性表面抗原的特定细胞、组织或器官类型。类似地，本领域技术人员将认识到，可以使用无数交联技术将具有单独特异性的两个单独的抗体共价连接以实现相同的作用。

靶向部分的非共价连接包括使用双特异性配体和双特异性抗体，其中一部分的双特异性配体或双特异性抗体识别小细胞表面，另一部分的双特异性配体或抗体识别真核细胞膜蛋白。双特异性抗体和抗体衍生物被定义为含有对小细胞表面分子特异的一个或多个互补决定区(CDR)和对真核细胞特异的一个或多个CDR的那些双特异性抗体和抗体衍生物。适合用于本文公开的方法和组合物中的双特异性抗体和双特异性抗体衍生物的非限制性实例显示于图1中。在一些实施方案中，双特异性配体可以含有对小细胞表面特异的一个或多个部分和对真核细胞特异的另一部分。在WO/2012/112,696中描述了抗体和其它配体与小细胞非共价连接的优选方法之一，将其通过引用整体并入本文。WO/2012/112,696中描述的技术利用了如下方法：通过融合蛋白在小细胞表面展示蛋白A或蛋白G的Fc-结合区，并将那些小细胞偶联至含Fc区的抗体或其它多肽配体，以赋予所述微细胞靶向性质。

如图1中所示，本领域通常公认的各种类型的多价抗体衍生物亚型可以用于产生靶向小细胞。在实施例1中所示的各非限制性实例中，所用抗体衍生物的至少一个臂对一个或多个小细胞表面结构是特异的，包括但不限于孔蛋白、鞭毛、纤毛和O-抗原，而一个或多个另外的臂对一个或多个真核生物靶标是特异的。利用交联剂(双特异性(mab)₂和双特异性F(ab’)₂)制备的双特异性抗体利用图1中列出的任何适当成员生成，尤其是用SPDP或其任何列出的衍生物生成。使用本领域技术人员通常公知的已建立的重组、选择、纯化和表征技术来制备示出的其它多价抗体类型。

在利用抗体或其它靶向部分的共价和非共价连接的应用中，在偶联靶向部分之前，从亲代细胞中先纯化小细胞是优选但非强制的。如下文更详细描述的，纯化的小细胞在纯化时已经含有它们各自的治疗性、免疫调节性和免疫原性有效载荷，或者在纯化后将有效载荷添加至小细胞中。在一些情况下，可取的是使用这两种方法的组合。在后两种情况中，由本领域技术人员判断，可以在向小细胞添加外源有效载荷之前或之后添加靶向部分。然后将最终的小细胞组合物进一步处理并制备用于通过电离辐射进行最终灭菌。

在靶向治疗性小细胞表面上的抗体、抗体衍生物或其它靶向分子可以优先识别但不限于识别的细胞特异性表面抗原，包括但不限于α3β1整合素、α4β1整合素、α5β1整合素、α_vβ3整合素、α_vβ1整合素、β1整合素、5T4、CAIX、CD4、CD13、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD31、CD33、CD34、CD40、CD44v6、CD45、CD51、CD52、CD54、CD56、CD64、CD70、CD74、CD79、CD105、CD117、CD123、CD133、CD138、CD144、CD146、CD152、CD174、CD205、CD227、CD326、CD340、Cripto、ED-B、GD2、TMEFF2、VEGFR1、VEGFR2、FGFR、PDGFR、ANGPT1、TIE1、TIE2、NRP1、TEK(CD202B)、TGFβR、死亡受体5(Trail-R2)、DLL4、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8,EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、FAP、GPNMB、ICAM、VCAM、PSMA、HER-2/neu、IL-13Rα2、MUC-1、MUC16、EGFR1(HER-1)、EGFR2(HER-2/neu)、EGFR3(HER-3)、IGF-1R、IGF-2R、c-Met(HGFR)、间皮素、PDGFR、EDGR、TAG-72、转铁蛋白受体、EpCAM、CTLA-4、PSMA、肌腱蛋白C、甲胎蛋白、波形蛋白、C242抗原、TRAIL-R1、TRAIL-R2、CA-125、GPNMB、CA-IX、GD3神经节苷脂、RANKL、BAFF、IL-6R、TAG-72、HAMA和CD166。

在一些实施方案中，选择靶向部分，部分是因为展示对抗原特异的抗体靶向部分、抗体衍生物和/或其它靶向分子的小细胞表面的结合诱导靶向小细胞的内化，促进细胞内有效载荷递送。在一些实施方案中，用作靶向组分的先前所述的靶标特异性抗体包括但不限于mAb3F8、mAb CSL362、mAb CSL360、mAb J591、阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿托珠单抗(Afutuzumab)、阿珠单抗(Alacizumab)、ALD518、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿妥莫单抗(Altumomab)、安莫单抗(Anatumomab)、安芦珠单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿特朱单抗(Atlizumab)、阿托木单抗(Atorolimumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzmab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利木单抗(Belimumab)、贝那利珠单抗(Benralizumab)、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、比西单抗(Biciromab)、比伐珠单抗(Bivatuzumab)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、Brentuximab、Briakinumab、卡那单抗(Canakinumab)、美坎珠单抗(Cantuzumab)、卡罗单抗(Capromab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、CC49、西利珠单抗(Cedelizumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、mAb528、西他珠单抗(Citatuzumab)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、Clivatuzumab、可那木单抗(Conatumumab)、CR6261、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达利珠单抗(Daclizumab)、达雷木单抗(Daratumumab)、地诺单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、阿托度单抗(Dorlimomabaritox)、Dorlixizumab、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依芬古单抗(Efungumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、恩莫单抗(Enlimomab)、依匹莫单抗(Epitumomab)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、伊瑞西珠单抗(Etaracizumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法勒珠单抗(Farletuzumab)、非维珠单抗(Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、加利昔单抗(Galiximab)、Gantenerumab、加维莫单抗(Gavilimomab)、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗(Girentuximab)、Glembatumumab、戈利木单抗(Golimumab)、戈利昔单抗(Gomiliximab)、Ibalizumab、替伊莫单抗(Irbitumomab)、伊戈伏单抗(Igovomab)、英西单抗(Imciromab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、英妥木单抗(Intetumumab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、伊珠单抗(Inotuzumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)、伊妥木单抗(Iratumumab)、J591、凯利昔单抗(Keliximab)、拉贝珠单抗(Labetuzumab)、来金珠单抗(Lebrikizumab)、来马索单抗(Lemalesomab)、乐地单抗(Lerdelimumab)、来沙木单抗(Lexatumumab)、利韦单抗(Libivirumab)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、洛妥珠单抗(Lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)、鲁昔单抗(Lumiliximab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马妥珠单抗(Matuzumab)、美泊利单抗(Mepolizomab)、美替木单抗(Metelimumab)、米拉珠单抗(Milatuzumab)、明瑞莫单抗(Minretumomab)、米妥莫单抗(Mitumomab)、莫罗木单抗(Morolimumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫罗单抗(Muromonab)、那可单抗(Nacolomab)、那莫单抗(Naptumomab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈昔木单抗(Necitutumab)、奈瑞莫单抗(Nerelimomab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、Nofetumomab、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、Olaratumab、奥马珠单抗(Omalizumab)、莫奥珠单抗(Oportuzumab)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥昔珠单抗(Otelixizumab)、帕吉昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕诺库单抗(Panobacumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、帕尼单抗(Pemtumomab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普立昔单抗(Priliximab)、普托木单抗(Pritumumab)、PRO140、瑞非韦鲁单抗(Rafivirumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、瑞西库单抗(Raxibacumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞利珠单抗(Resilizumab)、利妥木单抗(Rilotumumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗利珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、鲁利珠单抗(Ruplizumab)、沙妥莫单抗(Satumomab)、司韦单抗(Sevirumab)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、Siltuximab、西利珠单抗(Siplizumab)、苏兰珠单抗(Solanezumab)、Sonepcizumab、索土珠单抗(Sontuzumab)、司他莫鲁单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、他珠单抗(Tacatuzumab)、他度珠单抗(Tadocizumab)、他利珠单抗(Talizumab)、他尼珠单抗(Tanezumab)、他莫单抗(Taplitumomab)、替非珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomabaritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替利珠单抗(Teplizumab)、TGN1412、替西木单抗(Ticilimumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、TNX-650、托珠单抗(Tocilizumab)、托利珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、曲妥单抗(Trastuzumab)、曲美木单抗(Tremelimumab)、Tucotuzumab、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、尤特克单抗(Ustekinumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、伏妥莫单抗(Votumumab)、扎芦木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)、阿佐莫单抗(Zolimomabaritox)以及前述的任何组合。

4.将有效载荷装载至小细胞

真细菌小细胞能够包封和递送对动物，例如哺乳动物(例如人)具有治疗性、免疫调节性、免疫原性和/或诊断益处的若干类生物活性化合物。可以通过小细胞递送的生物活性化合物(载荷)的类型包括但不限于小分子(包括小分子药物)、核酸、多肽、放射性同位素、脂质、脂多糖及其任何组合。用生物活性载荷装载小细胞的方法包括两类方法，并且可以组合这两类方法。第一类方法是经由物理或化学手段将外源载荷装载至小细胞中。第二类方法是在小细胞中重组产生或表达生物活性载荷。

用载荷装载小细胞的第一种方法适用于但不限于外源小分子药物的装载。如本文所用，术语“小分子”是指具有生物学效应并且具有小于5000道尔顿的分子量的分子。在一些实施方案中，小分子具有小于2500道尔顿的分子量。在一些实施方案中，小分子具有小于1000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，小分子具有小于800道尔顿的分子量。在一些实施方案中，小分子具有小于500道尔顿的分子量。小分子药物包括导致动物(包括人类)药理学治疗益处的那些小分子。

在一些实施方案中，通过在高浓度的所述小分子中孵育小细胞将小分子装载到小细胞中。随着时间的推移，小分子被动地扩散到小细胞中，在那里它们与小细胞的各种分子成分相互作用，从而包埋在小细胞中。在一些实施方案中，一旦小细胞被内化到核内体中并且随后进行降解/释放过程，小分子可以由小细胞释放到靶细胞中。

与用于小细胞相容的小分子药物种类可以选自但不限于抗生素(抗感染药、抗肿瘤药和抗病毒药)、抗组胺和抗炎性药理学小分子药剂。可以用于本上下文中的抗生素(抗感染药、抗肿瘤药和抗病毒药)包括但不限于：(1)DNA损伤剂和抑制DNA合成的药剂，如蒽环类药物(阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表阿霉素(epirubicin)，烷化剂(苯达莫司汀(bendamustine)、白消安(busulfan)、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪(dacarbazine)、六甲嘧胺、异环磷酰胺(ifosphamide)、洛莫司汀(lomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、米托坦(mitotane)、丝裂霉素、哌泊溴烷(pipobroman)、甲苄肼(procarbazine)、链脲菌素、塞替派(thiotepa)和三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)，铂衍生物(顺铂、卡铂、顺-二胺二氯铂)，端粒酶和拓扑异构酶抑制剂(伊立替康(Camptosar)，(2)微管和微管蛋白结合剂，包括但不限于紫杉烷和紫杉烷衍生物(紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、BAY 59-8862)，(3)抗代谢物，如卡培他滨(capecitabine)、氯脱氧腺苷、阿糖胞苷(cytarabine)(及其活化形式、ara-CMP)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氟尿苷、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟尿嘧啶、5-DFUR、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、喷司他丁(pentostatin)、三甲曲沙(trimetrexate)和6-硫鸟嘌呤，(4)抗血管生成剂(沙利度胺(thalidomide)、舒尼替尼(sunitinib)、来那度胺(lenalidomide)，血管破坏剂(类黄酮/黄酮，DMXAA，考布他汀(combretastatin)衍生物，如CA4DP、ZD6126、AVE8062A等)，(5)内分泌疗法，如芳香酶抑制剂(4-羟雄烯二酮、依西美坦(exemestane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)，(6)抗雌激素药(他莫昔芬(Tamoxifen)、托瑞米芬(Toremifene)、雷洛昔芬(Raloxifene)、氟维司群(Faslodex)，类固醇如地塞米松，(7)免疫调节剂，如Toll样受体激动剂或拮抗剂，(8)整合素、其它黏附蛋白和基质金属蛋白酶的抑制剂，(9)组蛋白脱乙酰酶抑制剂，(10)信号转导抑制剂，如酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼(imatinib)(格列卫(Gleevec)，(11)热休克蛋白抑制剂，(12)类视黄醇，如全反式视黄酸，(13)生长因子受体或生长因子自身的抑制剂，(14)抗有丝分裂化合物，如长春瑞滨(navelbine)、长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨，(15)抗炎药，如COX抑制剂，(16)细胞周期调节剂，如检查点调节剂和端粒酶抑制剂，(17)转录因子抑制剂和细胞凋亡诱导物，如Bcl-2、Bcl-x和XIAP的抑制剂，以及前述(1-17)的任何组合。

用治疗性、免疫调节性和免疫原性有效载荷装载小细胞的第二种方法可以是经由小细胞中有效载荷的重组表达或产生。在产生小细胞之前或同时，产小细胞的亲代细胞可以用于重组表达/产生一种或多种治疗性、免疫调节性和/或免疫原性核酸分子和/或多肽。使重组核酸和/或多肽表达，分离并用小细胞包封，然后在体内或体外由靶向小细胞递送至真核细胞。

由小细胞递送的重组表达/产生的治疗性、免疫调节性和/或免疫原性核酸的实例包括但不限于：RNA干扰分子或核酶、双链治疗性RNA(例如，dsRNA或siRNA)、单链治疗性RNA(例如，shRNA)、微RNA、长的非编码的RNA、CRISPR RNA、适配子、核酶、编码治疗性多肽和/或治疗性核酸的真核生物表达质粒、以及前述的任何组合。核酸的重组表达可以是来自本领域已知的多种附加型重组原核表达载体中任一种表达的结果，所述载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒和细菌人工染色体(BAC)、以及前述的任何组合。重组表达还可以通过产小细胞的亲代细胞染色体的一个或多个拷贝中存在的染色体定位的原核表达盒来实现。在待递送的核酸分子通过“基因沉默”作用机制发挥其作用的情况下，核酸对一种或多种不同的真核生物mRNA转录本是特异的。可以通过相同的小细胞递送核酸，使得一个或多个基因通过单次递送事件沉默。还可以使用靶向小细胞来组合递送这些核酸中的任何一种。另外，使用靶向小细胞与一种或多种核酸配合递送一种或多种小分子药物。

在治疗性核酸分子以由原核表达盒(位于染色体或附加体)重组表达的方式由亲代细胞预先形成，然后作为双链RNA(例如siRNA)或能够自身向后折叠以形成发夹结构的单链RNA(例如，shRNA)而包装在小细胞内的情况下，通过使用产小细胞的细菌菌株来增加小细胞内治疗性RNA的半衰期，所述产小细胞的细菌菌株具有负责细胞内双链和/或发夹RNA分子降解的RNase基因(例如，原核RNase III)的缺失或其它非功能性突变。在不存在RNase的情况下，治疗性RNA分子积聚至更高水平，增加了递送治疗性核酸分子的靶向小细胞的效能。在产小细胞菌株是大肠杆菌的情况下，突变或缺失被引入到rnc基因中，该基因编码该物种中唯一已知的体细胞RNaseIII。

由靶向小细胞递送的重组表达的治疗性、免疫调节性和免疫原性多肽包括但不限于：蛋白毒素、胆固醇依赖性细胞溶素、功能性酶、活化的半胱天冬酶、半胱天冬酶原、细胞因子、趋化因子、细胞穿透肽、疫苗抗原、以及前述实例的任何组合，包括它们与设计以调节极性和/或延长半衰期的分子(例如脂质或聚乙二醇)的缀合物。多肽的重组表达可以是来自本领域已知的多种附加型重组原核表达载体中的任一种表达的结果，所述载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒和细菌人工染色体(BAC)、以及前述实例的任何组合。以类似的方式，可以通过产小细胞的亲代细胞染色体的一个或多个拷贝中存在的染色体定位原核表达盒来实现重组表达。使用本申请的靶向小细胞递送蛋白毒素是期望在体内选择性消除细胞的应用中的有利方法。可以促进有效载荷的核内体递送和/或作为有毒有效载荷发挥功能的蛋白毒素包括但不限于：白喉毒素的片段A/B，白喉毒素的片段A，炭疽毒素LF和EF，腺苷酸环化酶毒素，白树毒素，肉毒杆菌溶素B(botulinolysin B)，肉毒杆菌溶素E3，肉毒杆菌溶素C，肉毒菌毒素，霍乱毒素，梭菌毒素A、B和α，蓖麻毒素，志贺A毒素，志贺样A毒素，霍乱A毒素，百日咳S1毒素，产气荚膜梭菌溶素O，假单胞菌外毒素A，大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)，蜂毒素，李斯特菌溶素O的pH稳定变体(不依赖于pH的；氨基酸取代L461T)，李斯特菌溶素O的热稳定变体(氨基酸取代E247M、D320K)，李斯特菌溶素O的pH和热稳定变体(氨基酸取代E247M、D320K和L461T)，链球菌溶素O，链球菌溶素O c，链球菌溶素O e，球菌溶素(sphaericolysin)，炭疽杆菌溶素O(anthrolysin O)，蜡状芽孢杆菌溶素(cereolysin)，苏云金芽孢杆菌溶素O(thuringiensilysin O)，韦氏芽孢杆菌溶素(weihenstephanensilysin)，蜂房类芽胞杆菌溶素(alveolysin)，短芽孢杆菌溶素(brevilysin)，丁酸芽孢梭菌溶素(butyriculysin)，破伤风溶素O，诺维氏芽孢梭菌溶素(novyilysin)，凝集素溶素(lectinolysin)，肺炎球菌溶素，缓症链球菌溶素(mitilysin)，假肺炎球菌溶素，猪链球菌溶素(suilysin)，中间链球菌素(intermedilysin)，伊氏李斯特菌溶素(ivanolysin)，斯氏李斯特菌溶素O(seeligeriolysin O)，阴道加德纳菌溶素(vaginolysin)和化脓隐秘杆菌溶素(pyolysin)以及前述的任何组合。细胞因子可以在小细胞中重组表达，并且通过小细胞递送以给予治疗性和免疫调节性作用。可以在小细胞中表达并且通过小细胞递送的细胞因子包括但不限于：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、干扰素α2b(IFN-α2b)、白介素-2(IL-2)、白介素-1a(IL-1a)、白介素-12(IL-12)和TRAIL。可以被重组表达并递送的疫苗抗原包括但不限于在细菌、病毒和寄生生物体的基因组中编码的那些抗原。可以被重组表达并递送的疫苗抗原还包括在癌细胞上存在的那些抗原和新抗原，包括但不限于：致癌胚胎抗原(CEA)、间皮素、粘蛋白-1(MUC1)、BAGE、GAGE、MAGE、SSX、EGFRvIII、Her-2、Gp100、Melan-A/Mart-1、酪氨酸酶、PSA、乳腺珠蛋白-A、p53、livin、生存蛋白、β-连环蛋白-m、HSP70-2/m、HLA-A2-R17OJ、WT1、PR1、E75、ras、AFP、URLC10、突变型p53和NY-ESO-1。

根据本领域技术人员的判定，可以将多肽定位于小细胞的不同亚细胞区室。当本文公开的靶向小细胞来源于革兰氏阴性亲代产小细胞的菌株时，由其产生的重组表达的多肽可以定位于胞质溶胶、内膜的内小叶、内膜的外小叶、周质、外膜的内小叶、小细胞的外膜、以及前述的任何组合。当本文公开的靶向小细胞来源于革兰氏阳性亲代产小细胞的菌株时，由其产生的重组表达的治疗性多肽可以定位于胞质溶胶、细胞壁、膜的内小叶、小细胞膜和前述的任何组合。

在多肽有效载荷以原核表达盒(位于染色体或附加体)重组表达的方式由亲代细胞预先形成，然后作为有效载荷包装在小细胞内的情况下，通过使用产小细胞的细菌菌株来增加小细胞内多肽有效载荷的半衰期，所述产小细胞的细菌菌株具有负责蛋白酶解的蛋白酶基因(例如，大肠杆菌的lon蛋白酶)的缺失或其它非功能性突变。在不存在蛋白酶的情况下，多肽有效载荷分子积聚至更高水平，增加了递送多肽有效载荷分子的靶向小细胞的效能。在产小细胞菌株是大肠杆菌的情况下，可以将突变或缺失引入下述基因中的一种或多种：lon、tonB、abgA、ampA、ampM、pepP、clpP、dcp、ddpX/vanX、elaD、frvX、gcp/b3064、hslV、hchA/b1967、hyaD、hybD、hycH、hycI、iadA、ldcA、ycbZ、pepD、pepE、pepQ、pepT、pmbA、pqqL、prlC、ptrB、sgcX、sprT、tldD、ycaL、yeaZ、yegQ、ygeY、yggG、yhbO、yibG、ydpF、degS、ftsH/hflB、glpG、hofD/hopD、lepB、lspA、pppA、sohB、spa、yaeL、yfbL、dacA、dacB、dacC、degP/htrA、degQ、iap、mepA、nlpC,pbpG、tsp、ptrA、teas、umuD、ydcP、ydgD、ydhO、yebA、yhbU、yhjJ和nlpD基因。

如果递送的多肽和/或核酸在被释放至靶向真核细胞的胞质溶胶之前暴露于核内体区室的富含蛋白酶和核酸酶的环境中太长时间，则可能限制通过受体介导的内吞作用有效递送治疗性、免疫调节性和免疫原性多肽和核酸有效载荷。大多数多肽和核酸没有逃逸核内体区室的固有能力。蛋白质毒素家族有一些例外，包括胆固醇依赖性细胞溶素/毒素(例如LLO、产气荚膜梭菌溶素O(PFO)和链球菌溶素O(SLO)、以及白喉毒素的片段A/B(片段B介导的逃逸)、蓖麻毒素和假单胞菌外毒素A。确实含有固有的核内体逃逸性质的那些蛋白毒素不一定需要在靶向小细胞中共同存在单独的核内体破坏组分来起作用，并且包括核内体破坏剂的决定由技术人员的判定。其它多肽和核酸不具有逃逸核内体区室的固有能力，因此，本领域技术人员将认识到通过核内体途径递送的许多不同治疗性多肽的增强的核内体逃逸是可取的。细胞内革兰氏阳性致病菌单核球增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的李斯特菌溶素O(LLO)蛋白能够并入本申请的那些实施方案中，包括但不限于需要核内体逃逸以给予最佳活性的多肽或核酸有效载荷组分或者其它治疗性有效载荷。在一些实施方案中，将全长LLO(含有信号分泌序列)用作核内体破坏剂。在一些实施方案中，使用本领域已知的重组技术在基因水平去除LLO的信号序列(产生cLLO)，并将cLLO用作核内体破坏剂。在一些实施方案中，使用LLO的热稳定和/或非pH依赖性形式(具有突变E247M，D320K和/或L461T，sLLOpH)。当在也表达治疗性多肽和/或核酸的产小细胞的细菌菌株中表达时，可以将LLO(或任何LLO变体或其它核内体逃逸促进剂)与治疗性多肽和/或核酸共同包封在小细胞内。靶向小细胞后，受体介导的内吞作用将小细胞携带至核内体中。核内体中的恶劣环境开始降解吞噬的小细胞，共同释放有效载荷和核内体破坏剂(例如，LLO、其任何变体或其它核内体破坏剂)。然后所释放的核内体破坏剂组分促进有效载荷从核内体释放到胞质溶胶中，在那里有效载荷可以发挥其生物学效应。除了LLO之外，优选的核内体破坏剂包括其它细胞溶素，如PFO和SLO及其衍生物，以及磷脂酶如PI-PLC或PC-PLC。

除了被用作靶向治疗性、免疫调节性和免疫原性小细胞之外，本文公开的小细胞还可以被用作靶向免疫原性小细胞疫苗。通过利用对由这些抗原递呈细胞子集表达的真核细胞表面标志物特异的抗体或其它小细胞表面展示的分子，负载蛋白抗原和/或DNA疫苗的小细胞直接靶向免疫系统的抗原递呈细胞的不同子集。在一些实施方案中，包含LLO或其变体之一(如上所述)以促进抗原或DNA疫苗转移至真核细胞胞质溶胶来促进刺激细胞免疫的MHC I类负载也是可取的，但不是必需的。通过将抗原保持在发生大部分MHC II类结合的核内体区室内，促进MHC II类装载来刺激体液(抗体介导的)免疫力也是可取的。这可以通过消除或减少靶向小细胞疫苗的LLO组分来实现。另外，靶向疫苗小细胞被进一步工程化以表达或负载本领域技术人员认为合适的外源佐剂。佐剂可以是普通佐剂(例如匙孔血蓝蛋白或完全弗氏佐剂)或可以是靶向分子佐剂。靶向分子佐剂包括Toll样受体的拮抗剂或激动剂，以及具有免疫调节性质的其它细胞成分。靶向疫苗为传染性疾病药剂提供受体免疫力，所述传染性疾病药剂包括但不限于细菌、病毒和寄生性来源的那些传染性疾病药剂。靶向疫苗还提供对肿瘤和其它自体性质的异常疾病的受体免疫力。

在任何前述小细胞组合物的构建和任何所需要的表征之后，将所述小细胞组合物配制成药物组合物，填充到无菌药物级容器中，塞紧，密封并通过辐射进行最终灭菌。

5.药物组合物

本申请还涉及组合物，包括但不限于药物组合物。本文使用的术语“药物组合物”是指包含至少一种赋形剂，优选生理学可接受的赋形剂和一种或多种小细胞组合物的混合物。药物组合物还可以包含一种或多种“稀释剂”或“载体”。

本文使用的术语“赋形剂”是指不抑制或阻止生物活性肽掺入细胞或组织的化合物或化合物的组合。赋形剂是任何有点惰性的物质，其可以添加到组合物中以给予合适的性质，例如活性物质的靶标浓度、合适的稠度、稳定性和/或实现促进将活性物质递送到靶标的性质(例如药物制剂)。合适的赋形剂特别包括填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；助流剂；崩解剂；粘合剂；润滑剂；聚合物(持续释放)；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、琼脂、果胶、黄原胶、瓜耳胶、刺槐豆胶、透明质酸、酪蛋白马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚丙烯酸酯、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；共溶剂，如乙醇、聚乙二；表面活性剂；抗氧化剂；防腐剂；调味剂；络合剂；冻干保护剂和冷冻保护剂。通过电离辐射进行最终灭菌的小细胞制剂中的一种优选赋形剂是在无菌水中的D-海藻糖。虽然可以使用D-海藻糖的替代浓度或替代稀释剂，但D-海藻糖的优选浓度是12％(w/v)，并且优选的稀释剂是无菌水。

“稀释剂”是药学可接受的溶剂，例如促进组合物在溶剂中溶解的水性溶剂，并且其还可以用来稳定组合物或其一种或多种组分的生物活性形式。本领域中将盐溶解于水中来制备缓冲溶液用作稀释剂，并且优选的稀释剂是含有一种或多种不同盐的缓冲溶液。优选的缓冲溶液的非限制性实例是磷酸盐缓冲盐水(特别是与旨在用于药物施用的组合物相配合)，因为其模拟人血液的盐条件，尽管缓冲溶液也可以在极端pH下制备并使用，这取决于施用途径、缓冲能力和施用产品的体积。由于缓冲盐可以以低浓度控制溶液的pH，所以缓冲稀释剂很少改变给定化合物或药物组合物的生物活性。

本文所用的“载体”是惰性物质，其允许将活性成分配制或混合成合适的剂型[例如微粒(例如微球)、丸剂，胶囊、片剂、溶液、胶体、悬浮液、乳液、薄膜、凝胶、乳膏、软膏；糊剂等]。“生理学可接受的载体”是适合在不消除(减少、抑制或预防)化合物的生物学活性和性质的生理条件下使用的化合物。优选地，载体是生理学可接受的载体，优选药学或兽医学可接受的载体。

“药物组合物”是指其中的赋形剂是药学可接受的赋形剂的组合物，而“兽医学组合物”是其中的赋形剂是兽医学可接受的赋形剂的组合物。本文使用的术语“药学可接受的赋形剂”或“兽医学可接受的赋形剂”包括不为生物学上或其它方面不期望的任何介质或材料，即赋形剂可以与小细胞组合物一起施用于生物体而不引起任何不期望的生物学效应或以有害的方式与复合物或其任何组分或生物体相互作用。药学可接受的赋形剂的实例在The United States Pharmacopeia,The National Formulary,United StatesPharmacopeial Convention,Inc.,Rockville,Md.1990中提供，在此通过引用将其并入本申请。术语“治疗有效量”和“药学有效量”是指足以在生物体的靶细胞、组织或体内诱导或实现治疗应答的量。什么构成治疗有效量将取决于多种因素，熟练的从业人员为获得期望的剂量方案时将考虑这些因素。

如果需要，还可以包含崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。其它合适的赋形剂和载体包括水凝胶、可胶凝的水解胶体和壳聚糖。壳聚糖微球和微胶囊可用作载体。参见例如WO 98/52547(其描述了用于将化合物靶向胃的微球制剂，所述制剂包含含有一种或多种活性成分的内核(任选包括胶凝的水胶体)，由水不溶性聚合物(例如，乙基纤维素)组成的膜以控制活性成分的释放速率，以及由生物粘附性阳离子聚合物(例如阳离子多糖、阳离子蛋白和/或合成的阳离子聚合物)组成的外层)；美国专利第4,895,724号。通常，使用合适的试剂例如戊二醛、乙二醛、表氯醇和丁二醛交联壳聚糖。使用壳聚糖作为载体的组合物可以被配制成各种剂型，包括丸剂、片剂、微粒和微球，包括提供活性成分控释的那些剂型。其它合适的生物粘附性阳离子聚合物包括：酸性明胶、聚半乳糖胺，聚氨基酸如聚赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸，聚季铵化合物，醇溶蛋白，聚亚胺，二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE)，DEAE-亚胺，DEAE-甲基丙烯酸酯，DEAE-丙烯酰胺，DEAE-葡聚糖，DEAE-纤维素，聚对氨基苯乙烯，聚环氧乙烷(polyoxethane)，共聚甲基丙烯酸酯，聚酰氨胺，阳离子型淀粉，聚乙烯基吡啶和聚硫代二乙基氨基甲基乙烯。

可以以任何合适的方式配制组合物。例如，小细胞组合物可以均一地(均质地)或不均一地(非均质地)分散在载体中。小细胞组合物的合适制剂包括但不限于胶体溶液、干粉、冷冻悬液、液体悬液和冻干制剂。干燥制剂包括冷冻干燥的和冻干的粉末，其特别适合于喷雾递送至窦或肺，或者长期储存，随后在施用之前在合适的稀释剂中复溶。其它优选的干燥制剂包括其中本文公开的组合物被压制成适合口服施用的片剂或丸剂形式或混配成持续释放制剂的那些干燥制剂。当组合物旨在用于口服施用以递送至肠中的上皮时，在一些实施方案中，将制剂用肠溶衣包封以保护该制剂并防止其中包含的小细胞组合物过早释放是有利的。如本领域技术人员所理解的，本文公开的组合物可以被置于任何合适的剂型中。丸剂和片剂代表了此类剂型中的一些剂型。例如，通过压制、浸渍、锅包衣、喷雾干燥等，组合物也可以被包封到任何合适的胶囊或其它包衣材料中。合适的胶囊包括由明胶和淀粉制成的那些胶囊。进而，如果需要，此类胶囊可以包被有一种或多种另外的材料，例如肠溶衣。液体制剂包括水性制剂、凝胶和乳液。

一些优选的实施方案提供了包含生物粘附剂，优选粘膜粘附剂包衣的组合物。“生物粘附剂包衣”是允许物质(例如，小细胞组合物)比在没有包衣的情况下更好地粘附至生物表面或物质上的包衣。“粘膜粘附剂包衣”是优选的生物粘附剂包衣，其允许物质，例如组合物比在没有包衣的情况下更好地粘附于粘膜。例如，小细胞可以包被有粘膜粘附剂。然后可以将包衣颗粒组装成适合递送至生物体的剂型。优选地，并且取决于待靶向的细胞表面转运部分表达的位置，使剂型包被有另一包衣以保护制剂直至其到达期望的位置，其中粘膜粘附剂在组合物与靶细胞表面转运部分相互作用时使制剂能够被保留。

本文公开的组合物可以施用于任何生物体，优选动物，优选哺乳动物、鸟、鱼、昆虫或蛛形纲动物。优选的哺乳动物包括牛科动物、犬科动物、马科动物、猫科动物、绵羊和猪科动物以及非人灵长类。人类是特别优选的。本领域存在施用或递送化合物的多种技术，包括但不限于眼部、耳部、口腔、口服、直肠(例如灌肠或栓剂)、阴道、经尿道、鼻部、肺部、肠胃外和局部施用。优选地，递送足够量的生物活性肽以达到预期效果。待递送的组合物的具体量将取决于许多因素，包括待实现的效果，递送组合物的生物体类型，递送途径，剂量方案以及生物体的年龄、健康状况和性别。因此，掺入至给定制剂中的组合物的具体剂量由普通技术人员判定。

本领域技术人员应理解，当本文公开的组合物作为药剂施用以实现可以包括治疗、诊断或保护作用(包括疫苗接种)的特别期望的生物学结果时，可以将小细胞组合物与合适的药物载体组合。选择药物载体并制备小细胞作为治疗剂或保护剂，将取决于预期用途和施用模式。治疗剂的合适制剂和施用方法包括但不限于用于口服、肺部、鼻部、口腔、眼部、皮肤、直肠、静脉内、膀胱内、鞘内、颅内、瘤内、胸膜或阴道递送的那些。

根据使用的递送模式，可以以多种药学可接受的形式递送上下文相关的功能实体。例如，可以掺入到丸剂、胶囊、片剂、栓剂、气雾剂、液滴或喷雾剂中以固体、悬浮液、溶液、乳液、分散体等形式递送上下文相关的功能实体。丸剂，片剂，栓剂，气雾剂，粉剂，液滴和喷雾剂可以具有复杂的多层结构，并且具有大范围的尺寸。气雾剂、粉末、液滴和喷雾剂的平均尺寸范围可以从小(亚微米)尺寸到大(≥200微米)尺寸。

本文公开的药物组合物可以以固体、冻干粉末、溶液、乳液、分散体等形式使用，其中所得到的组合物包含本文公开的一种或多种化合物作为活性成分，混合有适于肠内或肠胃外应用的有机或无机载体或赋形剂。例如，可以将活性成分与用于片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳液、悬浮液和适合使用的任何其它形式的通常无毒的药学可接受的载体混合。可以使用的赋形剂包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯胶、明胶、甘露糖醇、海藻糖、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、硅胶、马铃薯淀粉、尿素、中等链长甘油三酯、葡聚糖和适用于制备固体、半固体或液体形式的制剂的其它载体。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、调味剂和着色剂。稳定剂的实例包括海藻糖，优选浓度为0.1％或更高(参见例如美国专利第5,314,695号)。活性化合物以足以对疾病的过程或状况产生期望作用的量包含在药物组合物中。

6.通过电离辐射最终灭菌细菌小细胞组合物

一旦产生治疗性、免疫调节性和/或免疫原性小细胞，并将其配制和填充至药学可接受的容器(包括但不限于小瓶或注射器)中，将其密封并在所述容器中用电离辐射进行最终灭菌。电离辐射的非限制性实例包括γ辐射、高频电磁辐射、E-束(电子束、β辐射)辐射、X-射线(光子)辐射和UV辐射。用于本文公开的方法和组合物的电离辐射优选类型之一是γ辐射。

适合用于本文公开的方法和组合物的电离辐射的剂量可以变化。在一些实施方案中，将亲代细胞和外来微生物生物负载减少至可接受的无菌标准所需的电离辐射的剂量可以凭经验确定。辐射剂量的非限制性示例性范围为5kGy至40kGy，例如辐射可以处于、或处于约5kGy、8kGy、10kGy、11kGy、12kGy、13kGy、14kGy、15kGy、16kGy、17kGy、18kGy、19kGy、20kGy、21kGy、22kGy、23kGy、24kGy、25kGy、28kGy、30kGy、35kGy、40kGy或任何这些值之间的范围的剂量。在一些实施方案中，辐射为约5kGy至约30kGy或约10kGy至约25kGy的剂量。在一些实施方案中，辐射为25kGy的剂量。适合被辐射用于灭菌的包含小细胞的组合物可以是各种形式，包括但不限于液体悬液、冷冻悬液和冷冻干燥冻干的(冻干物)块状物制剂。在一些实施方案中，通过电离辐射灭菌包含小细胞的组合物的制剂是冷冻悬液或冷冻冻干物。在一些实施方案中，通过电离辐射最终灭菌包含小细胞的组合物包含或为处于25kGy剂量的最终灭菌电离γ辐射。

基于小细胞的生物药物产品的无菌性可以使用本领域已知的方法确定，例如USP38NF 33版的USP<71>标准中所述。总之，USP<71>下的无菌性被定义为在辐射后，在32.5℃±2.5℃历经14天孵育的液体硫乙醇酸盐培养基(通过验证的方法灭菌的培养基)中无生长(与阴性对照相比的浊度)。根据USP<71>，如果将小细胞生物药物产品配制成1mL或更少的液体，则整个小瓶用于接种生长培养基进行无菌测试。如果超过1mL但小于40mL，则使用一半容器但不小于1mL来接种无菌测试培养基。如果大于40mL但小于100mL，则应使用20mL。如果超过100mL，则应使用10％的容器内容物，但不少于20mL。如果配制成固体，包括冻干物，那么如果小于50mg，则必须使用整个容器内容物。如果大于50mg且小于300mg，则使用质量的一半，但不少于50mg。如果大于300mg且小于5g，则使用150mg。如果大于5g，则使用500mg。在USP<71>下给定的生产批次中要测试的容器数目包括，如果少于100个容器，10％或4个容器，以最多者为准。如果超过100个容器但少于500个容器，则使用10个容器。如果超过500个容器，则使用2％或20个容器，以较少者为准。对于眼科和其它不可注射的生物药物产品，如果不超过200个容器，则使用5％或2个容器，以较多者为准。如果超过200个容器，则需要测试10个容器。

7.治疗适应症和施用途径

本申请涉及设计以针对癌症、传染性疾病、遗传病症、自身免疫病况和其它疾病有效的基于小细胞的生物药剂。

癌症包括但不限于实体瘤、转移瘤和液体瘤。实体瘤和转移瘤包括上皮、成纤维细胞、肌肉和骨髓来源的那些癌症，并且包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、口腔癌、舌癌、咽癌、肝癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、食道癌、膀胱癌、胆囊癌、皮肤癌、子宫癌、阴道癌和肾癌。可以用本文公开的小细胞治疗的其它实体癌症类型包括但不限于腺癌、肉瘤、纤维肉瘤以及眼癌、脑癌和骨癌。可以通过本文公开的小细胞治疗的液体肿瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤，骨髓瘤，霍奇金淋巴瘤，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，急性髓性白血病，慢性髓性白血病和其它白血病。

可以使用免疫原性小细胞或靶向小细胞疫苗组合物预防性地治疗传染性疾病，其通过在对象下次暴露于所述疫苗旨在预防的传染因子之前免疫对象。可选地，可以向当前罹患由疫苗旨在预防的传染因子引起的疾病的对象给予治疗性疫苗。传染性疾病包括但不限于细菌、病毒、真菌和寄生性来源的那些疾病。

设计免疫原性小细胞和靶向疫苗小细胞以预防的细菌病原体包括但不限于埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弧菌、奈瑟氏菌、弯曲杆菌、假单胞菌、耶尔森氏菌、衣原体、不动杆菌、李斯特菌、芽孢杆菌、嗜血杆菌、梭状芽孢杆菌、弗朗西斯氏菌、立克次氏体等。针对这些试剂的免疫原性小细胞和靶向小细胞疫苗可以由来源于产小细胞的致病菌株的小细胞产生，或者由来源于非致病菌株但工程化为重组表达或产生来自致病菌株的异源抗原的小细胞产生。

设计免疫原性小细胞和靶向疫苗小细胞以预防的病毒病原体包括但不限于流感的所有毒株和亚株、副流感病毒、人免疫缺陷病毒、EB病毒、呼吸道合胞病毒、水痘带状疱疹、人乳头瘤病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、MERS病毒、SARS病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒等。

设计免疫原性小细胞和靶向疫苗小细胞以预防的真菌病原体包括但不限于念珠菌属(Candida spp.)、曲霉菌属(Aspergillus spp.)、隐球菌属(Cryptococcus spp.)、组织胞浆菌属(Histoplasma spp.)、肺囊虫属(Pneumocystis spp.)、葡萄穗霉属(Stachybotrys spp.)等。

设计免疫原性小细胞和靶向免疫小细胞以预防的寄生性病原体包括但不限于棘阿米巴原虫(Acanthamoeba)、蛔虫(Ascaris lumbricoides)、结肠小袋虫(Balantidiumcoli)、螺旋蝇(Cochliomyia hominivorax)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、利什曼原虫(Leishmania)、罗阿丝虫(Loa loa)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、血吸虫(Schistosoma)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、锥虫(Trypansoma)、班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)等。

可以将已经通过暴露于电离辐射而最终灭菌并旨在治疗或以其它方式预防上文列出的疾病类型和传染因子的基于小细胞的生物药物通过肠胃外或局部施用于对象。肠胃外施用途径需要注射，并且包括但不限于静脉内、玻璃体内、鞘内、腹膜内、瘤内、肌内和皮下施用途径。局部施用途径包括但不限于膀胱内、直肠内、阴道、粘膜、耳部、口服、鼻部、肺部、胸腔内(通过胸膜导管)和皮肤施用途径。

8.基于小细胞的药物组合物

本文公开的一些实施方案涉及产生优化的菌株并制备来自但不限于细菌肠杆菌科的靶向治疗性、免疫调节性和免疫原性小细胞；将所述小细胞配制成药物组合物；填充至无菌小瓶或注射器；密封以及通过暴露于电离辐射最终灭菌基于小细胞的药物组合物。

本文还公开了包含多个细菌小细胞的药物组合物，其中细菌小细胞和/或药物组合物已经被暴露于电离辐射。药物组合物可以，例如，包含一种或多种药学可接受的赋形剂或药学可接受的稀释剂。药学可接受的赋形剂可以是，例如，海藻糖(例如，在稀释剂中的海藻糖)。药学可接受的稀释剂可以是，例如，无菌水(例如，用于注射的无菌水)。在一些实施方案中，药物组合物和/或其中含有的多个细菌细胞已经被最终灭菌。在一些实施方案中，药物组合物是无菌的。例如，药物组合物可以含有处于符合USP 38NF 33版的USP<71>标准的水平的活微生物污染物。已经被暴露于电离辐射(例如，γ辐射)的药物组合物中活微生物污染物的水平可以，例如，小于1×10⁸个菌落形成单位(CFU)/mL、小于1×10⁷个CFU/mL、小于1×10⁶个CFU/mL、小于1×10⁵个CFU/mL、小于1×10⁴个CFU/mL、小于1×10³个CFU/mL、小于1×10²个CFU/mL、小于10个CFU/mL或小于1个CFU/mL。在一些实施方案中，已经被暴露于电离辐射(例如，γ辐射)的药物组合物中活微生物污染物的水平可以为，或者可以为约1×10⁸个CFU/mL、5×10⁷个CFU/mL、1×10⁷个CFU/mL、5×10⁶个CFU/mL、1×10⁶个CFU/mL、5×10⁵个CFU/mL、1×10⁵个CFU/mL、5×10⁴个CFU/mL、1×10⁴个CFU/mL、5×10³个CFU/mL、1×10³个CFU/mL、5×10²个CFU/mL、1×10²个CFU/mL、50个CFU/mL、10个CFU/mL、5个CFU/mL、1个CFU/mL、或这些值中任何两个之间的范围。

在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活微生物污染物污染的水平可以是，例如，10²个小细胞中小于1个小细胞、10³个小细胞中小于1个小细胞、10⁴个小细胞中小于1个小细胞、10⁵个小细胞中小于1个小细胞、10⁶个小细胞中小于1个小细胞、10⁷个小细胞中小于1个小细胞、10⁸个小细胞中小于1个小细胞、10⁹个小细胞中小于1个小细胞、10¹⁰个小细胞中小于1个小细胞、10¹¹个小细胞中小于1个小细胞、10¹²个小细胞中小于1个小细胞、10¹³个小细胞中小于1个小细胞、10¹⁴个小细胞中小于1个小细胞、10¹⁵个小细胞中小于1个小细胞、或10¹⁶个小细胞中小于1个小细胞。

药物中包含的小细胞的类型、基因型和表型可以变化。在一些实施方案中，所述细菌小细胞在其表面表达和/或展示侵袭素或其功能等同物。例如，侵袭素可以是，但不限于来自假结核耶尔森菌的侵袭素。细菌小细胞可以，例如，包含产气荚膜梭菌溶素O(PFO)。在一些实施方案中，细菌小细胞在其表面表达和/或展示侵袭素或其功能等同物，并且包含PFO。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10⁵个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10⁶个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10⁷个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10⁸个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10⁹个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是小细胞10¹⁰个小细胞中小于1个小细胞。

在优选实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10¹¹个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10¹²个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10¹³个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10¹⁴个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10¹⁵个小细胞中小于1个小细胞。

在一些实施方案中，在暴露于电离辐射后药物组合物中产小细胞的活亲代细胞污染水平是10¹⁶个小细胞中小于1个小细胞。

在暴露于电离辐射后，包含小细胞的药物组合物(例如，基于小细胞的生物药物产品)在例如32.5℃±2.5℃下于液体硫乙醇酸盐培养基中，在或在约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天之后或这些数值中的任何两个之间的范围之后，没有生长。在一个优选的实施方案中，在暴露于电离辐射后，基于小细胞的生物药物产品在32.5℃±2.5℃下于液体硫乙醇酸盐培养基中14天之后没有生长，因而根据USP 38NF 33版的USP<71>标准的定义是无菌的。

实施例

上文论述的实施方案的一些方面在下述实施例中进一步详细公开，所述实施例并不打算以任何方式限制本公开的范围。

实施例1

在暴露于5、15和25kGy剂量的电离γ辐射后冷冻悬液中VAX-IP(VAX014)小细胞的 性质没有变化

该实施例显示在暴露于5、15和25kGy剂量的电离γ辐射后冷冻悬液中VAX-IP(VAX014)小细胞的性质没有变化。

VAX014小细胞(含有侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O两者)由亲代菌株VAX20B9制备，VAX20B9是重组大肠杆菌K-12产小细胞的菌株，其具有L-鼠李糖-可诱导的细菌表达质粒pVX-336(在pRHA_BAD启动子的控制下含有侵袭素与产气荚膜梭菌溶素O之间的转录融合物)。将一瓶VAX20B9研究细胞库在室温解冻，并将整个小瓶内容物用于接种基于大豆胨的MSB-NaCl培养基的1L起子培养物，所述培养基含有卡那霉素(50μg/mL)、二氨基庚二酸(100μg/mL)、赖氨酸(55μg/mL)和0.2％D-葡萄糖。将起子培养物在30℃生长18小时，第二天，将200mL用于接种14L不含D-葡萄糖的相同培养基。监测生长直至OD₆₀₀达到0.1，此时添加L-鼠李糖以诱导来自pVX-336的侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O的表达。然后，监测生长直至OD₆₀₀达到1.0，此时添加IPTG至20μM的最终浓度以诱导小细胞产生表型并使培养物生长过夜。通过差速离心(在2,000xg下15min)使培养物去除亲代细胞团块，并且通过切向流动过滤(TFF)浓缩富集小细胞的上清液，然后使用两轮连续线性密度蔗糖梯度进一步纯化。通过(TFF)浓缩最终的小细胞级分，然后通过高速离心(在11,000xg下20min)沉淀，并将最终的VAX014小细胞沉淀物以3.33x10¹⁰个VAX014小细胞/毫升的浓度重新悬浮在含12％无菌D-海藻糖的药物级水中，以制备原料药。到靶标浓度时，将100μL原料药铺板于含有二氨基庚二酸(100μg/mL)和赖氨酸(55μg/mL)的基于大豆胨的MSB-NaCl固体琼脂培养基上，并允许其在30℃生长过夜以确定通过γ辐射灭菌之前污染的VAX20B9亲代细胞和任何另外的外来微生物的数目。然后，通过半自动手工填充，将VAX014原料药装入5mL透明的血清小瓶中(每个小瓶3mL—每个小瓶1x10¹¹个VAX014小细胞)，并将每个小瓶用塞子塞住并密封。然后，将装入小瓶的VAX014药物暴露于三个辐射剂量之一(5、15或25kGy，在每个剂量水平辐射25个小瓶)，同时冷冻。在辐射后第7天，随机选择3个小瓶在室温解冻，并使用一系列特征测试表征VAX014药物产品，所述表征测试包括浓度均匀性、外观、容器闭合完整性、目测、pH测试、产物聚集和微粒物质存在的显微镜评价、使用针对侵袭素的单克隆抗体通过FACS确定VAX014小细胞表面的侵袭素的量、产气荚膜梭菌溶素O在全部柠檬酸化绵羊血液中的溶血活性、VAX014针对HTB-9人尿路上皮癌细胞的细胞杀伤效能、以及最终活菌落形成单位计数作为来自未经辐射的物质的生物负载减少的量度。

实验结果总结在表2中。如表2中所示，与未经辐射的物质相比，在被暴露于5kGy、15kGy和25kGy剂量的电离γ辐射之后，对于VAX014小细胞的冷冻悬液，未观察到产物完整性、稳定性、特征和效能的变化。在每个剂量水平，生物负载都降低至零。

表2.在γ辐射之前和之后包含小细胞的组合物的性质

实施例2

在暴露于5、15和25kGy剂量的电离γ辐射后冷冻冻干物中VAX-IP(VAX014)小细胞 的性质没有变化

该实施例显示在暴露于5、15和25kGy剂量的电离γ辐射后冷冻冻干物中VAX-IP(VAX014)小细胞的性质没有变化。

VAX014小细胞(含有侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O两者)由亲代菌株VAX20B9制备，VAX20B9是重组大肠杆菌K-12产小细胞的菌株，其具有L-鼠李糖-可诱导的细菌表达质粒pVX-336(在pRHA_BAD启动子的控制下含有侵袭素与产气荚膜梭菌溶素O之间的转录融合物)。将一瓶VAX20B9研究细胞库在室温解冻，并将整个小瓶内容物用于接种基于大豆胨的MSB-NaCl培养基中的1L起子培养物，该培养基含有卡那霉素(50μg/mL)、二氨基庚二酸(100μg/mL)、赖氨酸(55μg/mL)和0.2％D-葡萄糖。将起子培养物在30℃生长18小时，第二天，将200mL用于接种14L不含D-葡萄糖的相同培养基。监测生长直至OD₆₀₀达到0.1，此时添加L-鼠李糖以诱导来自pVX-336的侵袭素和产气荚膜梭菌溶素O的表达。然后，监测继续生长直至OD₆₀₀达到1.0，此时添加IPTG至20μM的最终浓度以诱导小细胞产生表型并使培养物生长过夜。通过差速离心(在2,000xg下15min)使培养物去除亲代细胞团块，并且通过切向流动过滤(TFF)浓缩富集小细胞的上清液，然后使用两轮连续线性密度蔗糖梯度进一步纯化。通过(TFF)浓缩最终的小细胞级分，然后通过高速离心(在11,000xg下20min)沉淀，并将最终的VAX014小细胞沉淀物以3.33x10¹⁰个VAX014小细胞/毫升的浓度重新悬浮在含12％无菌D-海藻糖的药物级水中以制备原料药。到靶标浓度时，将100μL原料药铺板于含有二氨基庚二酸(100μg/mL)和赖氨酸(55μg/mL)的基于大豆胨的MSB-NaCl固体琼脂培养基上，并允许其在30℃生长过夜，以确定通过γ辐射灭菌之前污染的VAX20B9亲代细胞和任何另外的外来微生物的数目。然后，通过半自动手工填充，将VAX014原料药装入5mL透明的血清小瓶中(每个小瓶3mL—每个小瓶1x10¹¹个VAX014小细胞)，并将每个小瓶用NovaPure冻干相容的塞子塞住。将小瓶内容物冻干，然后应用外密封件(overseals)。然后，将装入小瓶的冻干的VAX014药物暴露于三个辐射剂量之一(5、15或25kGy，在每个剂量水平辐射25个小瓶)，同时冷冻。在辐射后第7天，随机选择3个小瓶在室温解冻，并使用一系列特征测试表征VAX014药物产品，所述表征测试包括浓度均匀性、外观、容器闭合完整性、目测、pH测试、产物聚集和微粒物质存在的显微镜评价、使用针对侵袭素的单克隆抗体通过FACS确定VAX014小细胞表面的侵袭素的量、产气荚膜梭菌溶素O在全部柠檬酸化绵羊血液中的溶血活性、VAX014针对HTB-9人尿路上皮癌细胞的细胞杀伤效能、以及最终活菌落形成单位计数作为来自未经辐射的物质的生物负载减少的量度。未观察到产物完整性、稳定性、特征和效能的变化，同时在每个剂量水平，生物负载都降低至零。

实验结果总结在表3中。如表3中所示，与未经辐射的物质相比，在暴露于5kGy、15kGy和25kGy剂量的电离γ辐射之后，冷冻冻干的VAX014小细胞的性质和特征没有变化。

表3.在γ辐射之前和之后包含小细胞的组合物的性质

实施例3

在暴露于γ辐射之后包含小细胞的组合物的研究

为了确保和证明施用增加水平的电离γ辐射的目的，选择透明的小瓶。将含有小细胞的小瓶暴露于5kGy、15kGy或25kGy的γ辐射，并且与未经辐射的对照(即，0kGy)进行比较。图2A-B显示辐射后在小瓶水平进行的最初目测结果。发现小瓶随着增加的辐射剂量水平而变暗，然而产物(包括体积和药物)看上去没有损失。图2A显示密封的小瓶，以及图2B显示目测时已经去除密封件但塞子保持完整的小瓶。在外密封件或塞子中肉眼未见异常。

图3进一步显示与未经辐射的对照相比，辐射的VAX014药物产品从小瓶中取出时，按照二次目测外观(包括颜色、稠度和不透明性)没有变化。在目测之前，将冻干物复溶在3mL注射用无菌水中。

研究了暴露于γ辐射之后含小细胞的组合物的溶血活性。如图4中所示，与未经辐射的对照相比，VAX014小细胞裂解物中产气荚膜梭菌溶素O蛋白毒素的结构-功能不受γ辐射任何测试水平(包括5kGy、10kGy和25kGy)的影响。在本研究中，用EDTA和溶菌酶处理经辐射的和未经辐射的小细胞，然后渗透休克以产生完整的小细胞裂解物，然后将其针对固定数目的绵羊红细胞在37℃滴定1小时，同时摇动。在1小时共孵育后，将红细胞(RBC)沉淀，除去上清液并评价血红蛋白释放作为溶血活性的量度。平行产生使用重组PFO的标准曲线，并将其用于计算1x10⁸个VAX014小细胞中产气荚膜梭菌溶素O的浓度。因此，在暴露于增加量的电离γ辐射之后，VAX014小细胞冷冻悬液或冻干冻干物中的产气荚膜梭菌溶素O(蛋白毒素)活性没有损失。

还使用针对HTB-9人尿路上皮癌细胞的细胞杀伤效能试验，与未经辐射的对照相比，评价了γ辐射(处于5kGy、10kGy或25kGy)后小细胞的效能。将经辐射的和未经辐射的VAX014小细胞的小瓶在室温解冻，并立即针对固定数目的HTB-9细胞进行滴定以产生EC₅₀曲线(0小时，图5A)。另外，使解冻的小瓶在添加HTB-9细胞之前于室温保持4小时，以证明在该温度下(室温(RT)下4小时，图5B)在此时间范围内没有活性损失。如图5A-B中所示，所有EC₅₀值重叠，表明在暴露于增加量的γ辐射之后，VAX014小细胞冷冻悬液或冷冻冻干物的效能没有损失。

还使用鼠同源原位MB49膀胱癌模型，与未经辐射的对照相比，在体内研究了γ辐射(处于5kGy、10kGy或25kGy)后小细胞的药理学活性。在这些实验中，将50μL体积的DMEM细胞培养基中的100,000个MB49细胞经由导尿管直接灌输至麻醉的雌性C57BL/6只小鼠(每组n＝8)的膀胱内。在灌输之前，使用连接至Bovie电烙术装置的铂导丝并在两个独立的膀胱内接触点(提供肿瘤附着位点)施加5W的2秒单极脉冲，在两个位点使膀胱麻木。在肿瘤细胞出现(installation)后，将膀胱用100μL无菌盐水冲洗一次，然后将盐水(媒介物对照)或相等数目的经辐射(25kGy)或未经辐射的VAX014小细胞以50μL体积作为单剂量治疗施用。将导管锁定总共1小时的治疗暴露时间，然后移除，并允许动物恢复。每周监测动物两次，持续70天，并将评价的比较存活曲线作为药理学效力的量度。结果总结于图9中，表明VAX014药理学活性在体内没有损失。

结果总结于图9所示的Kaplan-Meier存活曲线中。如图9中所示，在MB49鼠同源原位膀胱癌模型中，，VAX014在25kGy灭菌后由膀胱内施用于荷瘤小鼠后的抗肿瘤活性与预先灭菌的未经辐射的VAX014相比没有损失。

还评价了含有阿霉素的EGFR-1靶向小细胞的完整性、稳定性和活性对增加水平的γ辐射的反应。通过使具有诱导型小细胞表型的大肠杆菌K-12菌株(菌株VAX8I3)在含有二氨基庚二酸(100μg/mL)和赖氨酸(55μg/mL)的基于大豆胨的MSB-NaCl培养基中于30℃生长，从该菌株产生小细胞，直至OD₆₀₀达到1.0。此时，添加IPTG以诱导小细胞产生表型，并允许培养物继续生长过夜。使用差速离心，随后使用两轮连续线性密度蔗糖梯度收获小细胞。纯化后，通过与阿霉素以400μg/mL/1.0x10¹⁰个小细胞的浓度在室温共孵育过夜，同时摇动，使小细胞(3x10¹²)负载有阿霉素。第二天，使用重组蛋白A/G(Pierce,Thermo-Fisher)，通过将人EGFR-1特异性小鼠单克隆抗体mAb528与蛋白质A纯化的多克隆兔抗小细胞抗体试剂以1：1的摩尔比偶联来产生双特异性抗体。在添加蛋白A/G之前，将抗体以等摩尔量混合。在添加蛋白A/G后，将反应混合物保持在室温下，同时轻轻摇动1小时，以制备双特异性抗体。将负载有阿霉素的小细胞通过沉淀洗涤两次，重新悬浮于980μL 1X PBS中，添加20μL双特异性抗体复合物，并在4℃共孵育1小时，同时轻轻摇动。抗体连接至小细胞后，将负载有阿霉素的抗体包被的小细胞通过沉淀洗涤两次，并重新悬于12％的D-海藻糖中至浓度为3.33x10¹⁰/mL。配制成靶标浓度时，将负载阿霉素的EGFR-1靶向小细胞通过半自动方法无菌手工填充到5mL棕色血清小瓶中、用塞子塞住、外密封并冷冻。与未经辐射的对照相比，将负载有阿霉素的EGFR-1靶向小细胞的小瓶以25kGy的剂量进行γ辐射同时冷冻，并进行分析。使用阿霉素的天然红色荧光(对照设置的左上象限)和检测mAb528的Alexa-Flour 388缀合的山羊多克隆抗小鼠抗体(对照设置的右下象限)，通过双色流式细胞术验证抗EGFR-1抗体的存在和阿霉素的保留。双信号(右上象限)指示来自小细胞表面包含阿霉素和mAb528的小细胞的信号(即双阳性)。在建立对照设置之后，使用该方法分析在25kGy的γ辐射后小细胞表面上mAb528的留存和阿霉素的保留。还通过荧光显微镜和肉眼观察在25kGy的γ辐射之前和之后的小细胞小球来监测阿霉素保留。通过针对A549人非小细胞癌细胞(过表达EGFR-1)的滴定，在γ辐射之前和之后评价EGFR-1靶向的负载有阿霉素的小细胞的效能。如图7A-F中所示，未观察到由EC₅₀曲线确定的效能响应于增加水平的γ辐射的差异。

研究了在冷冻悬液的γ辐射后包含功能性核酸(质粒DNA)的EGFR-1靶向小细胞的稳定性。通过使用对小细胞中的质粒构建体特异的引物的PCR来评价质粒完整性，并与裸质粒对照(直接从相等数目的小细胞中纯化的质粒对照)进行比较。使用与上文关于图7A-F所述相同的蛋白A/G方法，将抗EGFR-1抗体mAb528偶联至小细胞表面，并使用相同的流式细胞术方法和二级Alexa Flour 388-缀合的山羊抗小鼠多克隆抗体试剂，分析辐射后其在小细胞表面上的存在。如图8A-B中所示，在含有小细胞的冷冻悬液暴露于γ辐射之后，未观察到质粒完整性或稳定性的损失。

在至少一些先前所述的实施方案中，在一个实施方案中使用的一个或多个元件可以互换地用于另一实施方案中，除非此类替换在技术上不可行。本领域技术人员应理解，在不背离要求保护的主题的范围的情况下，可以对上文所述的方法和结构进行各种其它省略、添加和修改。所有此类修改和变化旨在落入由所附权利要求限定的主题的范围内。

关于本文使用的实质上任何复数和/或单数术语，根据适合于上下文和/或应用，本领域技术人员可从复数转化成单数和/或从单数转化成复数。为了清楚起见，不同单数/复数变换可以在本文清楚地列出。

本领域技术人员将理解，通常，本文所用的术语，尤其是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应该被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员将会进一步理解，如果旨在引入权利要求叙述的具体数目，则此类意图将在权利要求中明确地叙述，在没有此种叙述的情况下，不存在此类意图。例如，为有助于理解，所附权利要求可以含有介绍性短语“至少一个(种)”和“一个或多个/一种或多种”的使用以引入权利要求叙述。然而，此类短语的使用不应被解释为意味着由不定冠词“一个/一种(a/an)”引入的权利要求叙述将含有此类引入的权利要求叙述的任何特定权利要求限于仅含有一个此类的叙述的实施方案，即使当相同的权利要求包括介绍性短语“一个或多个/一种或多种”或“至少一个/种”以及诸如“一个/一种(a/an)”的不定冠词(例如，“一个/一种(a/an)”，应被解释为意指“至少一个/种“或”“一个或多个/一种或多种”)；对于使用用于引入权利要求叙述的定冠词也是如此。另外，即使明确叙述了引入的权利要求叙述的具体数目，本领域技术人员也将认识到，此类叙述应当被解释为意指至少所述数目(例如，没有其它修饰语的“两个叙述”的简要叙述意指至少两个叙述或者两个或更多个叙述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个/种”的惯例的那些情况下，通常此类结构为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C和/或同时具有A、B和C等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常此类结构为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如“具有A、B或C中的至少一个的系统“将包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C和/或同时具有A、B和C等的系统)。本领域技术人员将会进一步理解，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，实际上任何呈现两个或更多个替代术语的分离性词语和/或短语应当被理解为预期包括术语之一、术语中的任一个或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

另外，其中公开的特征或方面按照马库什组(Markush group)描述，因而本领域技术人员将认识到本公开也按照马库什组中的任何单个成员或成员亚组来描述。

如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，例如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以被容易地认为充分描述并且使得相同的范围能够被分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性实例，本文论述的每个范围可以被容易地分解成低三等份、中三等份和高三等份等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包括所叙述的数字，并且指可以随后被分解成如上文所论述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等。

虽然本文已经公开了多个方面和实施方案，但其它方面和实施方案对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本文公开的多个方面和实施方案是为了说明的目的，而不打算为限制性的，下述权利要求表明了真正的范围和精神。

本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及本文尚未达到引用程度的参考文献，通过引用整体并入本文。在合并的文献和相似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾的情况下，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术或类似物，以本申请为准。

Claims (33)

1.产生用于药物用途的最终灭菌的细菌小细胞的方法，其包括使包含多个细菌小细胞的组合物暴露于电离γ辐射，其中所述细菌小细胞展示侵袭素或其功能等同物，以及其中所述电离γ辐射的剂量足以将所述组合物灭菌至符合USP 38NF 33版的USP<71>标准的水平。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述电离γ辐射为5kGy至40kGy的剂量。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述电离γ辐射为约25kGy的剂量。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述组合物是包含所述细菌小细胞和药学可接受的赋形剂的药物组合物。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述药学可接受的赋形剂是海藻糖。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物是包含所述细菌小细胞和药学可接受的稀释剂的药物组合物。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述药学可接受的稀释剂是无菌水。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为冷冻悬液的形式。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物为冷冻冻干物的形式。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌小细胞包含一个或多个小分子药物。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述侵袭素为来自假结核耶尔森菌的侵袭素。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O。

13.通过权利要求1-12中任一项所述的方法产生的细菌小细胞组合物。

14.药物组合物，其包含多个最终灭菌的细菌小细胞，其中所述细菌小细胞已经被暴露于电离γ辐射，其中所述细菌小细胞展示侵袭素或其功能等同物，以及其中所述电离γ辐射的剂量足以将所述药物组合物灭菌至符合USP 38NF 33版的USP<71>标准的水平。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。

16.如权利要求14或15所述的药物组合物，其中所述药物组合物已经被暴露于电离辐射。

17.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述细菌小细胞包含靶向治疗性小细胞。

18.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述细菌小细胞包含免疫调节性小细胞。

19.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述细菌小细胞包含免疫原性小细胞。

20.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述细菌小细胞来源于来自以下属的细菌：埃希氏菌、沙门氏菌、李斯特菌、假单胞菌、不动杆菌、奈瑟氏菌、志贺氏菌、芽孢杆菌或嗜血杆菌。

21.如权利要求14所述的药物组合物，其还包含药学可接受的赋形剂。

22.如权利要求21所述的药物组合物，其中所述药学可接受的赋形剂是海藻糖。

23.如权利要求14所述的药物组合物，其还包含药学可接受的稀释剂。

24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述药学可接受的稀释剂是无菌水。

25.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物组合物中的活微生物污染物处于符合USP 38NF 33版的USP<71>标准的水平。

26.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述细菌包含一个或多个小分子药物。

27.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述侵袭素是来自假结核耶尔森菌的侵袭素。

28.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述细菌小细胞包含产气荚膜梭菌溶素O。

29.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物组合物为冷冻悬液的形式。

30.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述药物为冷冻冻干物的形式。

31.生物药物组合物，其包含已经被暴露于灭菌剂量的电离γ辐射的多个细菌小细胞，其中所述生物药物组合物按照美国药典<71>的规定是无菌的，并且其中所述细菌小细胞(i)在所述小细胞表面展示侵袭素或其功能等同物，以及(ii)包含作为生物活性有效载荷的产气荚膜梭菌溶素O，其活性不受暴露于灭菌剂量的γ辐射的影响。

32.如权利要求31所述的生物药物组合物，其中所述侵袭素是来自假结核耶尔森菌的侵袭素。

33.如权利要求31所述的生物药物组合物，其中所述γ辐射为5kGy至25kGy的剂量。