CN108603889B - 双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂及其制造方法和使用方法 - Google Patents

双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂及其制造方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

所描述的是用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以进行凝血酶原时间测定的试剂盒。该试剂盒简化并最大限度地缩短了试剂制备时间，并且可稳定保持2年至5年。

Description

双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂及其制造方法和 使用方法
技术领域
本发明的领域涉及用于准备评价患者的凝血试验的试剂，更具体而言，涉及用于凝血酶原时间试验的试剂、用于凝血试验的试剂盒以及准备此类试验的方法。
背景技术
凝血酶原时间(PT)与患者血浆一同用于确定是血液凝固的外部途径中天然存在的缺陷，还是由口服诸如香豆定之类的维生素K拮抗剂(VKAs)的处方所引起的缺陷。PT通常在临床条件下使用人工或自动测试方法进行，该测试方法将促凝血酶原激酶工作液与收集于稳定量的螯合剂(例如，柠檬酸盐)中的人类患者血浆混合。促凝血酶原激酶工作液最低限度地包含与促凝血剂脂膜表面复合的组织因子(天然的(TF)或重组的(rTF))，并且包含钙离子作为必不可少的辅因子用于代替从患者体内抽取血液时在血浆中被螯合的钙离子，从而防止凝血。促凝血酶原激酶工作液以液体或冻干形式存在。
目前可用的液体促凝血酶原激酶在单个小瓶中包括全部组分；这是不利的，因为其在长期稳定性和保存期限方面存在限制，在2℃至8℃下保存时不大于1年。此外，目前可用的冻干的促凝血酶原激酶是不利的，因为其在使用前需要相当长的准备时间以进行重新配制，并且通过重新配制过程在PT测定的精确性方面引入了额外的变量。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以测定患者的凝血酶原时间。在一个实施方案中，试剂盒包括第一容器和第二容器。第一容器包含与脂质混合物结合的凝血因子III(组织因子，CD142)和螯合剂。螯合剂可以为(例如)但不限于柠檬酸盐、EDTA、EGTA、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、酒石酸盐、甘氨酸盐、BAPTA、草酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、多磷酸盐、有机膦酸盐以及它们的组合。螯合剂的浓度为(例如)大于约0mM至约100mM、大于约0至约50mM、大于约0mM至约25mM、约10mM至约50mM，并且(例如)螯合剂为EDTA时浓度为约0.5mM，螯合剂为柠檬酸盐时浓度为约11mM。脂质混合物包括(例如)磷脂、胆固醇、脂肪酸、鞘脂、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯、天然存在的脂质的提取物以及它们的组合。凝血因子III(组织因子)的来源包括但不限于重组组织因子或提取自脑或其他组织的天然组织因子。
本发明的该实施方案的第二容器包含钙溶液，其通常以(例如)约5mM至约500mM、约5mM至约100mM、约10mM至约75mM、约25mM至约50mM、约5mM至约25mM和约9mM至约15.5mM的浓度范围位于缓冲液中。
根据本发明的该实施方案的试剂盒的保存期限为至少2年至5年。
在本发明的该方面的另一实施方案中，试剂盒具有所有的与上述试剂盒相同的特征，不同之处在于螯合剂。
在另一方面，本发明涉及一种用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以测定患者的凝血酶原时间的方法。在本发明方法的一个实施方案中，该方法的第一步骤提供了在上述范围内的上述凝血因子III(组织因子)、来自上述来源的脂质混合物以及在上述浓度范围内的来自上述的组的螯合剂。在第二步骤中，该方法提供了包含上述浓度范围内的钙溶液的第二容器。当保健医疗实验室的专业人员制备用于测定患者的凝血酶原时间的液体促凝血酶原激酶试剂时，将第一容器和第二容器内的内容物混合在一起并可以立即使用。
根据本发明的方法形成的液体促凝血酶原激酶试剂的保存期限为至少2年。
在本发明的方法的另一个实施方案中，第一容器与上述相同但没有螯合剂。
在另一方面，本发明涉及延长双组分促凝血酶原激酶试剂的保存期限的方法。该方法在以上提供的制备用于测定患者的凝血酶原时间的液体促凝血酶原激酶试剂的步骤之后进行。
附图简要说明
图1A至图1C在表1至表3中示出，根据本发明的双组分即混即用液体促凝血酶原激酶试剂盒能够稳定至少最短24个月以上；
图2A至图2B示出了根据本发明的经螯合剂处理的TF-脂质样品中螯合剂诱导的抗沉淀(即，不稳定性)保护作用；
图3包括表4，其比较了经螯合剂处理的TF-脂质样品与未经处理的TF-脂质对照相比的螯合剂诱导的稳定化；
图4示出了左手侧小瓶底部的未经处理的(浑浊的)样品和右手侧小瓶底部的经螯合剂处理的(澄清的)样品；图3所示的数据对应于左手侧(未经处理的)和右手侧(经螯合剂处理的)小瓶。
图5A示出了在加速条件下(37℃下10天)，含有或不含EDTA螯合剂时，(PLase)诱导的磷脂酰胆碱的脂质降解。图5B示出了含有和不含螯合剂的
Figure BDA0001762973640000031
中，由于磷脂酰胆碱的降解所致的正常对照血浆的PT百分比变化。未经螯合剂处理时，在最高PLase浓度处，降解的磷脂酰胆碱表现为在基线以上的游离胆碱；而经螯合剂处理时，在TF-脂质中的高的PLase/钙的所有浓度下，检测到的胆碱水平均在基线处。
具体实施方式
在本文所述的发明的一个方面涉及延长液体促凝血酶原激酶的保存期限，液体促凝血酶原激酶为用于检测患者血液的凝血能力的凝血酶原时间(PT)试验中的必要试剂。在本发明的第一实施方案中，在用于测定凝血酶原时间的试剂盒中，钙组分(例如，含有或不含缓冲剂的液体组分中的钙离子)和组织因子(TF)-脂质组分(例如，含有或不含缓冲剂的液体组分中的TF-脂质)中是分开的。在本发明的该实施方案中，在即将使用之前，将钙组分与组织因子-脂质组分相合并，并且当混合时，立即形成促凝血酶原激酶工作液。因此，根据本文所述的发明，促凝血酶原激酶的钙组分和TF-脂质组分为独立的试剂，两者在试剂盒中互不接触直至使用前将试剂盒的两种组分混合在一起。促凝血酶原激酶的钙组分和TF-脂质组分构成了根据本发明的试剂盒的第一实施方案的两种组分。
在本发明的该第一实施方案中，在凝血酶原时间试验中进行使用之前，使用者将试剂盒的液体钙组分与试剂盒的液体TF-脂质组分合并，例如，将19体积份的液体钙与1体积份的液体TF-脂质混合，从而制备液体促凝血酶原激酶工作液。通过混合单独的钙组分和TF-脂质组分而制备的促凝血酶原激酶工作液构成了本发明的第一实施方案的“双组分即混(即，混合液体钙组分与液体TF-脂质组分)即用”(即，立即使用促凝血酶原激酶工作液来测定PT)设置。
如上制备的促凝血酶原激酶的“即混即用”设置优于现有技术的液体促凝血酶原激酶，因为该设置至少降低了(如果没有防止)二价金属离子依赖的脂质劣化机制，例如导致沉淀的二价金属离子依赖的囊泡融合或者二价金属离子依赖的脂质降解(如由于污染脂质降解酶而导致的降解)，这会导致试剂盒中TF-脂质组分的性质或稳定性降低。更重要的是，由于所公开的液体促凝血酶原激酶的“即混即用”设置至少降低了(如果没有防止)二价金属离子存在时对于TF-脂质储存的不利作用，因而本文所述的双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶具有比目前可用的单组分版本显著延长的保存期限，例如，当在2℃至8℃保存时至少高达两年的稳定性。
本文所述的双组分液体促凝血酶原激酶发明减轻了应力对TF-脂质试剂的作用，该作用归因于但不限于：热应力(例如，如不适当的储存温度)、化学应力(例如，痕量污染物，如用于制造TF-脂质试剂的原料流中的磷脂酶)或机械应力(例如，如由大规模的过滤所致的应力)。在试剂盒中，这些应力随着下列现象而变得明显：TF-脂质组分中的沉淀、由TF-脂质组分和钙组分的混合物制备的合并的促凝血酶原激酶工作液中的沉淀、或者在由TF-脂质和钙组分的混合物制备的促凝血酶原激酶工作液中，对照血浆的PT相对于基线的巨大改变。在该双组分实施方案中，将液体钙组分和液体TF-脂质组分独立地制备为分开的液体促凝血酶原激酶组分，各自放在单独的隔室中，例如，如下所讨论的单独的容器。在单独的隔室中，实施方案的液体钙组分和液体TF-脂质组分构成了待由使用者组装以形成液体促凝血酶原激酶试剂工作液之前的促凝血酶原激酶。
在本发明的该实施方案中，单独的液体钙组分和液体TF-脂质组分被设计成19体积份的钙组分与1体积份的TF-脂质组分合并，从而得到具有适合PT试验的必要特征的促凝血酶原激酶工作液试剂。促凝血酶原激酶工作液的必要特征包括组分组成，其使得正常的含柠檬酸盐的人血浆(即，无外源性因素的缺陷或VKA或其他抗凝血剂处理)的PT结果在约10秒至14秒(从凝血开始至血块形成)的典型范围内。为了使正常的含柠檬酸盐的人血浆达到此范围内的PT结果，促凝血酶原激酶工作液需要钙浓度足以超过使含柠檬酸盐的人血浆稳定化的螯合剂，钙浓度通常为0mM至25mM并且TF-脂质浓度通常在0g/L至1000g/L的范围内。
此外，本文所述的本发明的实施方案(如19体积份的钙:1体积份的TF-脂质)还可以构思为制备具有与上述相同的必要特征的促凝血酶原激酶工作液。例如，可替代实施方案包括这样的试剂盒，其设计成将1体积份的钙组分与19体积份的TF-脂质混合以制造促凝血酶原激酶工作液。为了制造具有PT试验的必要特征的促凝血酶原激酶工作液，与具有19体积份的钙:1体积份的TF-脂质的实施方案相比，此类试剂盒(1体积份的钙:19体积份的TF-脂质)的液体钙组分需要高得多的钙浓度，而TF-脂质组分需要低得多的TF-脂质浓度。由于实施方案在试剂盒中采用了分开的钙组分和TF-脂质组分，并且由于促凝血酶原激酶工作液在正常的含柠檬酸盐的患者血浆的PT试验中表现相当，因而根据本发明，两种实施方案均可考虑。
在本发明的另一个(第二)实施方案中，将一种或多种螯合剂以毫摩尔的浓度(例如，大于0mM至约100mM的螯合剂)添加到液体TF-脂质组分中。该一种或多种螯合剂保护促凝血酶原激酶的液体TF-脂质组分免受二价金属离子依赖的劣化。通过针对TF-脂质组分中二价金属离子依赖的不稳定性而提供保护，在试剂盒的双组分的液体TF-脂质组分中含有螯合剂或螯合试剂进一步延长了液体TF-脂质组分的保存期限稳定性。通过针对二价金属离子依赖的不稳定性(例如，如上所述由对TF-脂质组分的化学应力、机械应力或热应力所导致)而提供保护，经螯合剂处理的TF-脂质组分的延长的保存期限稳定性进一步使双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶的保存期限稳定性延长至超过两年，例如2年至5年或更久。
在该第二实施方案中，本文所述的发明涉及在试剂盒中使钙组分(例如，缓冲液组分中的钙离子)与TF-脂质组分分开，并且在该分开的液体TF-脂质组分中含有螯合剂或螯合试剂以防止二价金属离子依赖的脂质劣化，从而延长液体促凝血酶原激酶的保存期限。此类二价金属离子可能通过以下方式而存在于TF-脂质组分中：在制造工艺期间以痕量引入原料流、诸如石膏之类的空气传播污染物、或在制造期间从与TF-脂质接触的设备、器皿或容器中浸出。
根据该第二实施方案的试剂盒包括第一容器和第二容器，所述第一容器包含组织因子-脂质组分缓冲液以及浓度范围在大于0mM至约100mM之间的一种或多种螯合剂，所述第二容器包含钙组分(例如，Ca++离子)缓冲液，例如，浓度范围在约5mM至约500mM之间的钙组分。
在上述第一实施方案中，TF-脂质组分和钙组分为分开的，但TF-脂质中不存在螯合剂，试剂盒的保存期限为至少1年至2年。例如，图1A至图1C中的表1至表3示出了根据本发明的双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂盒的三个不同批次(图1A＝批次1；图1B＝批次2并且图1C＝批次3)的实时稳定性数据，其中所述双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂盒在2℃至8℃下储存最短24个月以上。
简言之，为了产生图1A至图1C中的数据，将上述第一实施方案的双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂盒(不含螯合剂)在2℃至8℃下储存，定期(例如，在不同的月度时间点至多55个月)取出，并在ACL
Figure BDA0001762973640000071
仪器(Instrumentation
Figure BDA0001762973640000072
)上检测正常对照血浆(NC)、低异常对照血浆(低Ab Con)和高异常对照血浆(高Abn)中的功能性性能(凝血酶原时间(PT)(秒)和纤维蛋白原(dFib)(mg/dL))。这些研究中使用的异常血浆导致PT延长而大于正常对照血浆通常的10秒至14秒。将这些时间点的平均值与基线(0个月)处获得的值进行比较。如下所示计算不同时间点的百分比差异：％差异＝(应力平均值-基线平均值)/(基线平均值)×100。满足图1中表1至表3的规格的值(对于NC的PT，％差异<10％；对于低Ab Con或高Abn的PT，％差异<15％；对于NC、低Ab Con或高Abn的dFib，％差异<15％)表明双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂盒是稳定的。因此，由图1中的表1至表3总结的结果表明，上述实施方案的不含螯合剂的双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂盒可稳定至少最短24个月以上。
在本发明的第二实施方案中，其中将一种或多种螯合剂添加到双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂盒中(特别是将诸如EDTA之类的螯合剂添加到液体TF-脂质组分中)，双组分“即混即用”液体促凝血酶原激酶试剂盒可稳定24个月(2年)至60个月(5年)。
在本发明的该第二实施方案中，提供了上述用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以测定凝血酶原时间的试剂盒，该试剂盒包括第一容器，其包含位于缓冲液中的组织因子(TF)-脂质组分和螯合剂。螯合剂浓度为(例如)大于约0mM至约100mM、大于约0至约50mM、大于约0mM至约25mM、约10mM至约50mM，并且(例如)螯合剂为EDTA时浓度为约0.5mM，螯合剂为柠檬酸盐时浓度为约11mM。根据本发明该实施方案的试剂盒还包括第二容器，其包含钙组分(例如Ca++离子)，如浓度范围为约5mM至约500mM之间的缓冲的钙组分。
在该第二实施方案中，包括第一容器的内容物和第二容器的内容物的试剂盒的保存期限为约2年至5年。
根据本文所述的发明的双组分液体促凝血酶原激酶试剂所涉及的第一实施方案和第二实施方案的组织因子可以选自重组组织因子或天然组织因子或重组组织因子和天然组织因子这二者的组合。组织因子也已知为其他同义词，如但不限于促凝血酶原激酶组织因子、因子III、凝血因子III、CD142或血小板组织因子：本发明的范围内包括组织因子的同义词。
通常，天然组织因子提取自脑或其他组织，如脑、肝脏、肾脏、心脏、血管、胎盘或内皮细胞、血小板、血细胞(如，但不限于单核细胞、嗜中性粒细胞和其他粒细胞)、肿瘤细胞、组织因子阳性微粒、内皮细胞或亚内皮细胞(如，但不限于平滑肌细胞或成纤维细胞)，以及卵、大豆、植物组织、酵母和细菌。
根据本文所述的发明的双组分液体促凝血酶原激酶试剂所涉及的第一实施方案和第二实施方案的钙(例如，Ca++离子)溶液的浓度在约大于0mM至约500mM的范围内。例如，钙溶液为大于0mM至约90mM、大于0mM至约80mM、大于0mM至约70mM、大于0mM至约60mM、大于0mM至约50mM、大于0mM至约40mM、大于0mM至约30mM、大于0mM至约20mM、大于0mM至约10mM、约5mM至约100mM或约10mM至约30mM、约10mM至约20mM或约9mM至约15.5mM。钙:TF-脂质的优选比例为19:1。
根据本文所述的发明的双组分液体促凝血酶原激酶试剂所涉及的第二螯合剂实施方案的螯合剂选自(但不限于)柠檬酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、酒石酸盐、甘氨酸盐、BAPTA((1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)、草酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、多磷酸盐或有机膦酸盐或上述物质的组合。
根据本文所述的发明的双组分液体促凝血酶原激酶试剂所涉及的第二螯合剂实施方案的螯合剂或螯合试剂(例如，EDTA)的浓度在约大于0mM至约100mM的范围内。例如，螯合试剂的浓度范围为(例如)约0mM至约100mM、大于约0至约50mM、大于约0mM至约25mM、约10mM至约50mM，并且(例如)螯合剂为EDTA时浓度为约0.5mM，螯合剂为柠檬酸盐时浓度为约11mM。
根据本文所述的发明的双组分液体促凝血酶原激酶试剂所涉及的第一实施方案和第二实施方案的组织因子-脂质组分中的缓冲液选自Tris或任何生物学缓冲液或其衍生物，包括但不限于Hepes、MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、柠檬酸盐、ADA缓冲液、ACES缓冲液、PIPES缓冲液、咪唑/咪唑鎓缓冲液、Bis-Tris丙烷缓冲液、马来酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液、BES缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、DIPSO缓冲液、MOBS缓冲液、TAPSO缓冲液、HEPPSO缓冲液、POPSO缓冲液、EPPS(HEPPS)缓冲液、Tricine缓冲液、Gly-Gly缓冲液、Bicine缓冲液、HEPBS缓冲液、TAPS缓冲液、AMPD缓冲液、TABS缓冲液、AMPSO缓冲液、甲基丙二酸盐缓冲液、二乙基丙二酸盐缓冲液或甘氨酰胺盐酸盐缓冲液。
根据本文所述的发明的双组分液体促凝血酶原激酶试剂所涉及的第一实施方案和第二实施方案的钙组分中的钙组分缓冲液选自Tris或任何生物学缓冲液或其衍生物，包括但不限于Hepes、MES缓冲液、Bis-Tris缓冲液、柠檬酸盐、ADA缓冲液、ACES缓冲液、PIPES缓冲液、咪唑/咪唑鎓缓冲液、Bis-Tris丙烷缓冲液、马来酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液、BES缓冲液、MOPS缓冲液、TES缓冲液、DIPSO缓冲液、MOBS缓冲液、TAPSO缓冲液、HEPPSO缓冲液、POPSO缓冲液、EPPS(HEPPS)缓冲液、Tricine缓冲液、Gly-Gly缓冲液、Bicine缓冲液、HEPBS缓冲液、TAPS缓冲液、AMPD缓冲液、TABS缓冲液、AMPSO缓冲液、甲基丙二酸盐缓冲液、二乙基丙二酸盐缓冲液或甘氨酰胺盐酸盐缓冲液。
根据本文所述的发明的双组分液体促凝血酶原激酶试剂所涉及的第一实施方案和第二实施方案的组织因子-脂质的脂质组分影响功能性活性，并且由下列物质制成(但不限于此)：磷脂混合物、胆固醇、各种脂肪酸、鞘脂、单酸甘油酯、甘油二酯或甘油三酯或天然存在的物质的脂质提取物，所述天然存在的物质包括但不限于卵、大豆或其他植物组织、酵母、细菌或动物组织，如心脏、脑、肝脏等。
另一方面，本发明涉及一种用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以测定凝血酶原时间的方法。该方法包括提供包括第一容器的试剂盒，该第一容器容纳有液体形式试剂，所述试剂包含组织因子和脂质(例如磷脂)，并且提供包含位于缓冲液中的钙溶液(例如，钙-缓冲组分)的第二容器，在该第二容器中，钙溶液的浓度范围为约5mM至约500mM。
在随后的步骤中，将第一容器中的包含组织因子和脂质的液体形式试剂与第二容器中的钙溶液混合，从而在室温下形成液体促凝血酶原激酶试剂。
不添加螯合剂的液体形式促凝血酶原激酶试剂的保存期限为至少约2年。
另一方面，本发明包括用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以测定凝血酶原时间的方法。该方法包括提供包括第一容器的试剂盒。第一容器容纳有液体形式试剂，其包含组织因子、脂质(例如磷脂混合物)和螯合剂(螯合剂浓度范围为大于0mM至约100mM)，并且该方法还包括提供包含位于缓冲液中的浓度范围为约5mM至约500mM的钙溶液(例如，钙缓冲组分)的第二容器。
在随后的步骤中，将含有组织因子、脂质和螯合剂的液体形式试剂与钙溶液混合，从而在室温下形成液体促凝血酶原激酶试剂。
上述含有螯合剂的液体形式促凝血酶原激酶试剂的保存期限为至少大于1年，并且优选2年至5年。
另一方面，本发明涉及延长试剂盒中双组分液体促凝血酶原激酶试剂的保存期限(或稳定化)的方法，包括提供含有液体形式的组织因子和磷脂的组合的组分(a)，提供螯合剂(b)并将螯合剂(b)添加到组分(a)中，提供含有浓度范围为约5mM至约100mM的钙溶液的组分(c)，从而形成保存期限延长的含有螯合剂的双组分液体促凝血酶原激酶试剂。本文所述的含有螯合剂的双组分促凝血酶原激酶试剂的保存期限为至少大于1年且至少为约2年，优选2年至5年。
本文公开的发明所提供的优点包括但不限于：
·提供了用于PT试验的试剂盒和液体试剂，其中液体试剂比现有技术的液体促凝血酶原激酶具有更长的保存期限，为至少超过一年且长达至少5年。
·提供了用于PT试验的试剂盒和液体试剂，其中试剂被保护以抵抗应力诱导的(例如，污染物诱导的机械、化学或热诱导的应力)用于测定凝血酶原时间的试剂的不稳定性。
·简化并最大限度地缩短用于PT试验的试剂制备时间。
本发明的各种实施方案的实施例
根据本文所述发明的双组分即混即用液体促凝血酶原激酶包括与液体组织因子-脂质部分(天然或重组TF-脂质)分开的组分中的钙离子(Ca++)，并且在使用前通过在缓冲液(例如，钙缓冲组分)中稀释天然或重组TF-脂质来制备促凝血酶原激酶工作液。该“即混即用”的设置在液体促凝血酶原激酶的市场中是独特的，并且使易感脂质免受有害的脂质降解机制的影响，如钙依赖的囊泡融合或金属离子依赖的脂质降解。此外，为了进一步防止导致促凝血酶原激酶不稳定和沉淀的金属离子囊泡融合，可以将诸如EDTA和柠檬酸盐之类的螯合剂引入到TF-脂质部分中，从而抑制这种金属离子诱导的机制。试剂部分中适度的(即，毫摩尔)螯合剂水平的存在不会影响促凝血酶原激酶工作液，因为与组分中过量的钙混合覆盖了最终的促凝血酶原激酶工作液中的螯合剂水平。在现有技术的单组分促凝血酶原激酶中，这种使用螯合剂的保护机制是不可能的，因为单组分促凝血酶原激酶中的螯合剂浓度需要在促凝血酶原激酶工作液中过量以超过人血浆中的柠檬酸盐螯合剂，因此激活凝血所需的钙水平必然会超过添加至TF-脂质组分中的任何和所有螯合剂。此外，本文所述的液体促凝血酶原激酶的“即混即用”设置最大限度地缩短了即用型促凝血酶原激酶试剂所需的试剂制备时间，其中在使用促凝血酶原激酶试剂之前几乎不需要孵育时间。这是与现有技术的促凝血酶原激酶试剂的区别，并且比现有技术的促凝血酶原激酶试剂更为用户友好且有效。
在双组分即混即用液体促凝血酶原激酶的开发期间，确定了TF-脂质部分中的不稳定性的一些来源。在久置的试剂盒的降解的TF-脂质组分中，检测到不同水平的痕量磷脂酶活性(例如，磷脂酶D、磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C)，特别是磷脂酶D活性。可以证明磷脂酶D活性来自rTF原料，并且使用对于磷脂酶D的预定性检验使这些活性在原料流中最小化。此外，机械应力(如来自筒式过滤)在热应力(37℃)中引起可见的暂时的不稳定性，其在2℃至8℃储存四个月后会自行解决。在37℃下，随着时间的推移，这种不稳定性伴随有混浊TF-脂质试剂小瓶的数量增加。通过在TF-脂质试剂小瓶中使用mM(例如，大于0mM至约100mM)水平的螯合剂来减轻这两个问题的影响。如图2A和图2B所示，含有最少0.5mM的EDTA(图2A)或10.88mM的柠檬酸钠(图2B)以剂量依赖的方式完全消除了在PT试剂
Figure BDA0001762973640000121
(仪器实验室公司,贝德福德,马萨诸塞州)中由大规模的过滤过程所引起的不稳定性。
此外，参考图3中的表4，螯合剂的存在还提供了显著水平的功能性保护作用以防止PT的延长。对于制造的批次“P4”(批号N1042691：19份钙，1份TF-脂质，稀释剂中相同浓度(通常为9mM至15.5mM)的钙，TF-脂质含有3g/L脂质和3.375mg/L至4.5mg/L的TF)，表4比较了在生产TF-脂质组分期间通过10英寸的0.2微米螺旋筒式过滤器过滤的材料，该材料在37℃下应激10天之前经EDTA处理(图3中的上表)和未经EDTA处理(图3中的下表)。在用匹配的钙组分(1份TF-脂质，19份钙组分)稀释以制成促凝血酶原激酶工作液之后，含有EDTA的样品显示出对过滤诱导的应力易感性的显著保护作用，并如预期那样提供了对于未受应力的双组分即混即用液体促凝血酶原激酶的对照材料的凝血酶原时间。因此，图3和图4举例说明了与未经处理的样品相比，螯合剂(例如，EDTA)能够使经螯合剂处理的样品(例如，TF-脂质部分)稳定并产生稳固的稳定性。大多数不含螯合剂的样品显示出沉淀并且未通过测试。图4示出了位于左手侧小瓶底部的浑浊(沉淀)样品，其未经螯合剂处理(左手侧小瓶)，以及位于右手侧小瓶底部的澄清(无沉淀)样品，其经螯合剂处理。
图5表明螯合剂为ReadiPlasTin的TF-脂质部分提供保护，以免新制备的试剂(TF-脂质批号N1065947)中引入磷脂酶(PLase)污染。来自磷脂酰胆碱(Thermo Fisher,AmplexRed试剂盒#A12219)的降解以游离胆碱形式而被检测出的含有磷脂酶D活性的级分分离自Sf9昆虫细胞提取物，其为制备ReadiPlasTin中所使用的TF的相同原料。不同于TF级分(级分6至级分12)，在Superdex 200凝胶过滤洗脱系统中对含有PLase的级分进行检测和分离(级分14至级分16，GE Healthcare Bio-Sciences公司，匹兹堡,PA 15264-3065)，在搅拌式细胞浓缩器中用YM-10(EMD Millipore HeadquartersBillerica公司,MA 01821)渗滤膜进行合并和浓缩约200倍(～0.5mg/mL)，以25mM钙、使用5倍浓缩(“5x”)Amplex Red胆碱检验缓冲液将其稳定至5mM钙(4体积浓缩物+1体积“5x”，然后每次使用稀释至5mM钙的“5x”Amplex Red胆碱检验缓冲液以1:10稀释8次)。将得到的具有PLase D活性的一系列10倍稀释的原液以1％体积添加(10μL添加到1.0mL的TF-脂质组分中)，从而对使用或未使用1.0mM的EDTA螯合剂进行预处理的ReadiPlasTin N1065947小瓶的TF-脂质部分进行掺杂。在37℃下应激10天的加速试验之后，利用灵敏的Amplex Red PLase-D荧光检验(试剂盒#A12219；Thermo Fisher Scientific Headquarters公司,MA02451)对每个小瓶进行胆碱检测，以测定制剂的TF-脂质组分中的磷脂酰胆碱是否降解为游离胆碱。
在未经螯合剂处理的TF-脂质组分的系列中(图5A)，在PLase最高(5E-3至5E-5；即，5x10-3mg/mL至5x10-5mg/mL，菱形，图5A)的小瓶中检测到胆碱高于基线(即，1μM至18μM)，但在经螯合剂处理的小瓶中(正方形，图5A)检测不到胆碱(即，接近0μM)。对于由这些样品制备的促凝血酶原激酶工作液，发现经螯合剂处理的TF-脂质组分与未经处理的TF-脂质组分具有相似的保护作用(图5B)。对于经螯合剂处理的TF-脂质系列(1mM的EDTA，正方形，图5B)，正常对照血浆的PT与基线的测量值的％差异低，且在PLase D污染物的所有浓度下恒定(-0％至-5％)。对于未经处理的(无EDTA)TF-脂质系列(菱形，图5)，正常对照血浆的PT与基线的测量值的％差异在全部PLase D污染物的范围内较高(-2％至-13％)。并且在最高水平超出了所允许的PT％差异的规格(对于正常对照，<10％)。图5所示的结果证明了在ReadiPlasTin的TF-脂质部分中使用螯合剂防止了在加速(例如热应激)条件下由PLase污染物引起的磷脂酰胆碱磷脂的降解。
虽然已经依据某些示例性实施方案对本发明进行了描述，但是本领域普通技术人员将容易理解和领会的是，本发明不限于此，并且可以在所要求保护的本发明的范围内对优选实施方案进行许多添加、删除和修改。

Claims (15)

1.一种用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以测定凝血酶原时间的试剂盒，包括：
第一容器，其包含位于缓冲液中的与脂质混合物结合的凝血因子III，和螯合剂，其中所述螯合剂包括下列中的一种或多种：柠檬酸盐、EDTA、液体形式的EGTA、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、草酸盐、三磷酸盐、二磷酸盐、多磷酸盐、有机膦酸盐或它们的组合，所述螯合剂的浓度范围为大于0mM至约100mM；以及
第二容器，其包含位于缓冲液中的浓度范围为约5mM至约500mM的钙溶液，其中钙的浓度超过所述螯合剂的浓度，并且其中当将所述第一容器中的内容物与所述第二容器中的内容物混合后，所述钙的浓度足以覆盖所述螯合剂的浓度至少至这样的程度：有足够的游离钙来激活血液样本的凝固。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒的保存期限为至少2年。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述凝血因子III包括重组组织因子或天然组织因子中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述脂质混合物提取自动物组织。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述钙浓度在约9mM至约15.5mM的范围内。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述脂质混合物选自由下列组成的组中：磷脂、胆固醇、脂肪酸、鞘脂、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯以及天然存在的物质的脂质提取物，所述天然存在的物质选自由下列组成的组中：卵、大豆、植物组织、酵母、细菌和动物组织。
7.一种用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以测定凝血酶原时间的方法，包括：
a)提供包含脂质混合物和钙螯合剂的液体形式试剂，所述钙螯合剂包括下列中的一种或多种：柠檬酸盐、EDTA、EGTA、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、草酸盐、三磷酸盐、二磷酸盐、多磷酸盐、有机膦酸盐或它们的组合，所述钙螯合剂的浓度范围为约0mM至约100mM；
b)提供浓度范围为约5mM至约500mM的钙溶液，其中钙的浓度超过所述螯合剂的浓度，并且其中所述钙的浓度足以覆盖所述螯合剂的浓度至少至这样的程度：有足够的游离钙来激活血液样本的凝固；以及
c)在室温下将所述液体形式试剂和所述钙溶液混合在一起，从而形成所述液体促凝血酶原激酶试剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述液体形式试剂的保存期限为至少2年。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述脂质混合物包括下列中的一种或多种：磷脂、胆固醇、脂肪酸、鞘脂、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯以及天然存在的物质的脂质提取物，所述天然存在的物质选自由下列组成的组中：卵、大豆、植物组织、酵母、细菌和动物组织。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述动物组织包括心脏、脑或肝脏中的一种或多种。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述钙溶液的浓度范围为约5mM至约500mM。
12.一种延长双组分促凝血酶原激酶试剂的保存期限的方法，包括：
a)提供液体形式的组分a)，其包含促凝血酶原激酶组织因子和脂质混合物的组合；
b)提供组分b)，其包含浓度范围为约5mM至约500mM的钙溶液；以及
c)将螯合剂添加至组分a)，其中所述螯合剂包括下列中的一种或多种：柠檬酸盐、EDTA、液体形式的EGTA、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、草酸盐、三磷酸盐、二磷酸盐、多磷酸盐、有机膦酸盐或它们的组合，所述螯合剂的浓度范围为大于0mM至约100mM，其中所述钙的浓度超过所述螯合剂的浓度，并且其中所述钙的浓度足以覆盖所述螯合剂的浓度至少至这样的程度：有足够的游离钙来激活血液样本的凝固。
13.一种用于制备液体促凝血酶原激酶试剂以测定凝血酶原时间的试剂盒，包括：
第一容器，其包含位于缓冲液中的与液体形式的脂质结合的促凝血酶原激酶组织因子和螯合剂，其中所述螯合剂包括下列中的一种或多种：柠檬酸盐、EDTA、液体形式的EGTA、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、草酸盐、三磷酸盐、二磷酸盐、多磷酸盐、有机膦酸盐或它们的组合，所述螯合剂的浓度范围为大于0mM至约100mM；以及
第二容器，其包含位于缓冲液中的浓度范围为约5mM至约500mM的钙溶液，其中该第二容器中的所述钙溶液的浓度超过所述螯合剂的浓度，并且其中当将所述第一容器中的内容物与所述第二容器中的内容物混合后，所述钙的浓度足以覆盖所述螯合剂的浓度至少至这样的程度：有足够的游离钙来激活血液样本的凝固。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述脂质选自由下列组成的组中：磷脂、胆固醇、脂肪酸、鞘脂、单酸甘油酯、甘油二酯、甘油三酯以及天然存在的物质的脂质提取物。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述天然存在的物质的脂质提取物选自由下列组成的组中：卵、大豆、植物组织、酵母、细菌和包括心脏、脑和肝脏中的一种或多种的动物组织。
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