JP2022521079A - 止血酵素及びカルボキシメチルキトサンを含む血液凝固検査用組成物及びその用途 - Google Patents

止血酵素及びカルボキシメチルキトサンを含む血液凝固検査用組成物及びその用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、血液凝固検査用組成物及びその用途に関し、より詳細には、止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）及びカルボキシメチルキトサンを含む血液凝固検査用組成物及びその用途に関する。本発明に係る血液凝固検査用組成物は、止血酵素の活性及び凝塊強度を向上させてフィブリン形成速度を増加させるので、高い敏感度かつ速い速度で血液凝固検査を行うことができ、有用である。

Description

本発明は、血液凝固検査用組成物及びその用途に関し、より詳細には、止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）及びカルボキシメチルキトサンを含む血液凝固検査用組成物及びその用途に関する。
フィブリノゲンとトロンビンは、血管損傷後の止血に関与し、血塊形成に必須な重要タンパク質である。フィブリノゲンとトロンビンは、典型的な凝塊（ｃｌｏｔ）形成反応を開始せずに粉末状又は非水性懸濁液で配合され得るので、タンパク質を溶解可能な水性媒質又は他の液体環境中でこれらのタンパク質を水和する前までは、フィブリン凝塊の形成を防止することができる。これらのタンパク質の粉末状の混合物は、局所的止血、組織の復旧、薬物伝達などを含む様々な潜在的な生医学用途を有する。また、これらのタンパク質の混合物は、粉末状でキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）又は基質、又は別の医療装置上にローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）され、例えば、止血装置として使用可能な製品を形成することができる。
フィブリノゲンは、最も頻繁には、凝塊形成の速度を基準にしてフィブリノゲン機能性を測定する、クラウス（Ｃｌａｕｓｓ）が創始した方法により測定される。典型的なクラウス分析法では、未知量の溶解性フィブリノゲンを含有する試料を過量のトロンビンと共に配合する。このようなフィブリノゲンとトロンビンの比率では、フィブリノゲンが速度制限反応物であり、凝塊形成速度はフィブリノゲン濃度の関数となる。速い凝塊形成時間は、フィブリノゲンの濃度が高いということを示すだろう。逆に、長い凝塊形成時間は、機能性フィブリノゲンの濃度が低いということを示すだろう。機能性フィブリノゲンの量は、試料の凝塊形成時間を標準曲線の作成のための一連の標準物の凝塊形成時間と比較することによって定量することができる。試料中のフィブリノゲンの濃度は、標準物の凝塊形成時間から得た方程式に基づいて数学的に測定することができる。
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌａｂ．社のＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｃ試薬は、前記原理のフィブリノゲンの濃度を検出できる診断試薬であるが、敏感度が低いという問題点がある。
一方、蛇毒が人を含む哺乳類の血液凝固系及び血栓溶解系に及ぼす影響は、古くから多く研究されてきており、多数の有効成分が分離され、その活性が明らかにされた。蛇毒を構成する様々な成分は、フィブリン凝固（ｆｉｂｒｉｎ ｃｌｏｔｔｉｎｇ）又は血小板凝集などに直間接的に影響を与え、凝固促進剤（ｐｒｏ－ｃｏａｇｕｌａｎｔ）或いは抗凝固剤（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ）としての機能を有していることが知られている（Ｍｅａｕｍｅ，Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｎ，４：２５５８（１９６６）；Ｍａｔｓｕｉｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１４７７：１４６－１５６（２０００））。このうち一部の成分は、血栓症の診断及び治療に広範囲に用いられている。そのうちフィブリノ－ペプチドを切断してフィブリノゲンをフィブリンに転換させるトロンビン様酵素（ｔｈｒｏｍｎｂｉｎ－ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ）が現在まで２０種以上が報告されており、一部はｃＤＮＡ配列まで究明された。
トロンビン様酵素の作用は、哺乳類本来の血液凝固タンパク質であるトロンビンと違い、初期にはフィブリノゲン分子のフィブリノペプチドＡを加水分解してｄｅｓ－Ａ－フィブリンという不安定なフィブリン凝塊（ｆｉｂｒｉｎ ｃｌｏｔ）を形成するが、時間が経つにつれ、この不安定なフィブリン凝塊は、生体内の血栓溶解系（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）が作動しながら速く分解され、結果的に血中のフィブリノゲン濃度を減少させる（Ｐｉｒｋｌｅ，Ｈ．，ａｎｄ Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｋ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６５：４４４－４５０（１９９１）；Ｍａｒｓｈ，Ｎ．Ａ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，５：３３９－４１０（１９９４））。
実際の臨床では、このような両面的な酵素特性を用いて、止血剤として用いることもあれば、血栓の予防及び治療剤として応用していることもある。また、この酵素は、血液内の他の凝固因子などには影響を与えない上に、血小板の活性化にも影響を及ぼさない利点があるので、手術の１～２時間前に少量（２ ＮＩＨ ｕｎｉｔ／６０ｋｇ）を筋肉及び静脈注射すると、効果的な止血活性を示す。一方、酵素の投与量及び投与時間を調節することによって、血中内のフィブリノゲン濃度を、血栓溶解酵素を用いるときに発生し得る出血のような副作用なしで下げることができ、この過程で形成されたｄｅｓ－Ａ－フィブリンとＦＤＰ（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の放出によって血管内皮細胞を刺激してプラスミノーゲン活性子の生成を誘導し、トロンビンの活性を抑制して血栓症の予防及び治療にも用いられている。（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．８１：１８７－１９４（１９９６）；及びＢｅｌｌ Ｗ．Ｒ．Ｊｒ．，Ｄｒｕｇｓ，５４：１８－３０（１９９７））。
臨床で実際に用いられているトロンビン様酵素は、全て蛇毒から分離精製した天然型のタンパク質であり、最も代表的なものは中南米の毒蛇であるＢｏｔｈｒｏｐｓ ａｔｒｏｘ ｍｏｏｊｅｎｉの毒から分離したバトロキソビンである。スイスのＰｅｎｔａｐｈａｒｍ社が独占販売しており、レプチラーゼ（ｒｅｐｔｉｌａｓｅ）（止血用）、デフィブラーゼ（ｄｅｆｉｂｒａｓｅ）（血栓溶解用）、レプチラーゼ試薬（ｒｅｐｔｉｌａｓｅ－ｒｅａｇｅｎｔ）（診断試薬用）などの商品名でも市販されている。また、中南米の毒蛇であるＢｏｔｈｒｏｐｓ ｊａｒａｒａｃａの毒から精製したボトロパーゼ（ｂｏｔｒｏｐａｓｅ）（止血用、イタリアＲａｖｉｚｚａ社）、Ｍａｌａｙａｎ ｐｉｔ ｖｉｐｅｒとＣａｌｌｏｓｅｌａｓｍａ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａの毒から分離したアンクロド（ａｎｃｒｏｄ）（米国Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｔｉｃａｌ社）なども販売されている。
また、最近では手術時の出血防止及び縫合目的の自家フィブリン接合剤（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｆｉｂｒｉｎ ｓｅａｌａｎｔ）にバトロキソビンを用いたＶｉｖｏｓｔａｔ Ｓｙｓｔｅｍ（デンマーク、Ｖｉｖｏｓｏｌｕｔｉｏｎ社）などが脚光を浴びている。
韓国特許第１０－１９０１１５０号では、糖鎖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）された組換えバトロキソビンからなる組換えバトロキソビン混合組成物及びこれを含む止血用組成物について開示しているが、組換えバトロキソビンを用いて血液凝固検査に用いる方法は知られていない。
そこで、本発明者らは、上記の問題点を解決し、高い敏感度を有する血液凝固検査用組成物を開発するために鋭意努力した結果、止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）とカルボキシメチルキトサンを含む組成物を用いてフィブリノゲンの濃度を測定する場合、高い敏感度及び正確度でフィブリノゲンの濃度を検出できることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、血液凝固検査用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記組成物を用いたフィブリノゲンの濃度測定方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記組成物を用いた抗凝固物質のスクリーニング方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）及びカルボキシメチルキトサン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ，ＣＭＣＳ）を含む血液凝固検査用組成物を提供する。
本発明は、また、ａ）前記組成物を血清含有サンプルに添加して凝塊（ｃｌｏｔ）形成速度を測定する段階；及びｂ）凝塊形成速度からフィブリノゲン濃度を導出する段階を含む、フィブリノゲン濃度測定方法を提供する。
本発明は、また、ａ）フィブリノゲンを含む血清含有サンプルに止血酵素及びカルボキシメチルキトサンを添加する段階；ｂ）前記混合物に候補物質を添加する段階；ｃ）凝塊（ｃｌｏｔ）形成時間を測定する段階；及びｄ）凝塊形成時間が候補物質を添加していない対照群に比べて増加する候補物質を抗凝固物質として選別する段階を含む、抗凝固物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明は、また、止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）及びカルボキシメチルキトサン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ，ＣＭＣＳ）を含む組成物の血液凝固検査用途を提供する。
止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）とカルボキシメチルキトサンの組合せによるシナジー効果を確認したグラフであり、（Ａ）は血漿において凝塊（ｃｌｏｔ）時間を比較したグラフで、（Ｂ）はフィブリノゲンにおいて凝塊（ｃｌｏｔ）時間を比較したグラフで、（Ｃ）はｒＴＬＨ濃度別凝塊（ｃｌｏｔ）時間を示すグラフで、（Ｄ）はＣＭＣＳ濃度別凝塊（ｃｌｏｔ）時間を示すグラフである。
様々な種類の止血酵素（組換え止血酵素（ｒＴＬＨ）、天然型バトロキソビン（ｎＢａｔ）、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ボトロパーゼ（Ｂｏｔｒｏｐａｓｅ）、アンクロド（Ａｎｃｒｏｄ）、スリング（Ｓｕｌｉｎｇ）の血漿凝塊時間（Ａ）、及びフィブリノゲン凝塊時間（Ｂ）を測定した結果であり、酵素単独及びカルボキシメチルキトサンを含む酵素組成物を比較した結果である。
カルボキシメチルキトサンの有無によって、組換え止血酵素によりフィブリノゲンアルファ鎖（α－ｃｈａｉｎ）が切られる時間を確認した結果である。
合成基質を用いて、カルボキシメチルキトサンによる組換え止血酵素（ｒＴＬＨ）の活性を測定した結果であり、（Ａ）は組換え止血酵素の活性程度を示すグラフで、（Ｂ）は定量的に測定した数値を整理した表である。
組換え止血酵素の凝塊（ｃｌｏｔ）形成強度をカルボキシメチルキトサンの濃度に従って測定した結果であり、（Ａ）は凝塊形成程度を示すグラフで、（Ｂ）は定量的数値を示す表である。
本発明に係る組換え止血酵素及びカルボキシメチルキトサンを用いてフィブリノゲン濃度を測定した結果である。
本発明に係る組換え止血酵素及びカルボキシメチルキトサン含有組成物に塩化カルシウムを追加してフィブリノゲン濃度を測定した結果である。
本発明に係る組換え止血酵素及びカルボキシメチルキトサン含有組成物に塩化カルシウムを追加して血清内の低い濃度のフィブリノゲンを検出した結果である。
本発明に係る組換え止血酵素及びカルボキシメチルキトサン含有組成物を用いてフィブリノゲンを測定するとき、結果値に影響を与え得る干渉因子であるヘモグロビン、ビリルビン、ヘパリンなどを含有量別にプラズマに添加してフィブリノゲン濃度を検出した結果である。
本発明に係る組換え止血酵素及びカルボキシメチルキトサン含有組成物を用いて測定したフィブリノゲン測定値が国際標準物質の結果値と一致するか否かを確認した結果である。
別の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法及び以下に記述する実験方法は、本技術分野によく知られており、通常用いられるものである。
本発明では、止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）とカルボキシメチルキトサンを含有した組成物を用いて血液凝固検査を行う場合、高い敏感度及び速い速度で血液凝固検査を行うことができる、ということを確認しようとした。
すなわち、本発明の一実施例では、カルボキシメチルキトサンが止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）の酵素活性と凝塊強度（ｃｌｏｔ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を向上させるということを確認し（図１～図５）、トロンビン様酵素（ＴＬＥ；Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｌｉｋｅ Ｅｎｚｙｍｅ）及びカルボキシメチルキトサンを含む組成物を用いてフィブリノゲン濃度を測定する場合、商用製品に比べて低い濃度のフィブリノゲンが検出できることを確認した（図６～図８）。
したがって、本発明は一観点において、止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）及びカルボキシメチルキトサン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ，ＣＭＣＳ）を含む血液凝固検査用組成物に関する。
本発明において、前記止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）は、止血効果を示す酵素であれば制限なく利用可能であるが、好ましくは、天然型若しくは組換えトロンビン様酵素（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ，ＴＬＥ）、又は天然型若しくは組換え止血酵素（ｒＴＬＨ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ｌｉｋｅ Ｈｅｍｏｃｏａｇｕｌａｓｅ）であってよく、より好ましくは、トロンビン、組換えバトロキソビン、天然型バトロキソビン（ｎＢａｔ）、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、ボトロパーゼ（Ｂｏｔｒｏｐａｓｅ）、アンクロド（Ａｎｃｒｏｄ）及びスリング（Ｓｕｌｉｎｇ）よりなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されない。
本発明で使われる用語“組換えバトロキソビン”は、天然型バトロキソビンのｃＤＮＡ配列を変形させてピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で製造したバトロキソビンを意味し、これの製造方法は公開特許ＷＯ２００９／０８４８４１に詳細に開示されており、この公開特許文献は本発明に参照によって組み込まれる。
本発明において、用語“ＢＵ”は、バトロキソビン単位（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ ｕｎｉｔ）を意味し、２ＢＵは、血漿を１９±０．２秒で固める量のことを意味する。ＢＵは、天然型バトロキソビン（ＮＩＢＳＣ）の力価スタンダードグラフを用いて力価計算ができる。
本発明において、前記血液凝固検査は、血液凝固反応と関連した検査であれば制限なく利用可能であるが、好ましくは、トロンビン時間（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ，ＴＴ）測定、レプチラーゼ時間（Ｒｅｐｔｉｌａｓｅ ｔｉｍｅ）測定、及びフィブリノゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）濃度測定よりなる群から選ばれることを特徴とし得る。
本発明において、トロンビン時間は、標準化された量のトロンビンを血漿に添加してから凝塊が形成されるまでの時間を測定する方法であり、この際のトロンビンを本発明の組成物に代替可能である。本発明の組成物を用いれば、ヘパリン、アスピリンなどのような抗凝固剤の影響を受けない。
本発明において、レプチラーゼ時間は、バトロキソビンを血漿に添加してから凝塊が形成されるまでの時間を測定する方法であり、この際のバトロキソビンを本発明の組成物に代替可能であり、抗凝固剤の影響を受けない。
本発明において、フィブリノゲン濃度は、クラウス方法（ｃｌａｕｓｓ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて得ることを特徴とし得る。
クラウス方法は、過量のトロンビン（３５～２００Ｕ／ｍｌ）を希釈したサンプル血漿に投入して凝塊形成時間を測定し、標準曲線と比較してフィブリノゲン濃度を決定する方法である。
標準曲線は、フィブリノゲン濃度を知っている標準血漿を希釈して作製したサンプルで凝塊形成時間を測定することによって濃度と時間との相関関係を示すグラフであり、ｇ／１形式で構成される。
本発明の血液凝固検査は、標準曲線を生成して直接比較分析することができるが、好ましくは、自動化機器を用いて行うことを特徴とし得る。
本発明において、前記自動化機器は、血液凝固検査を行える機器であれば制限なく利用可能であり、好ましくは、ＡＣＬ Ｆａｍｉｌｙ、ＡＣＬ Ｆｕｔｕｒａ、ＡＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ、ＡＣＬ ＴＯＰ Ｆａｍｉｌｙ、ＡＣＬ１００００（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌａｂ．）、Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｍｅｒ（Ｂｅｈｎｋ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ）、Ｓｙｓｍｅｘ ＣＡ１５００、ＣＡ６６０、ＣＡ６２０、ＣＳ５１００、ＣＳ２５００、ＣＳ１６００（Ｓｉｍｅｎｓ）、ＳＴＡ－Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、ＳＴＡ－Ｒ Ｍａｘ、ＳＴＡ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｍａｘ及びＳＴＡ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ（Ｓｔａｇｅ）よりなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに限定されない。
本発明において、前記組換え止血酵素は、０．１～１００ＢＵ／ｍｌの濃度で含むことができ、好ましくは０．５～９０、０．５～８０、１～７０、２～６０、２．５～５０ＢＵ／ｍｌの濃度で含むことができ、最も好ましくは５０ＢＵ／ｍｌ濃度で含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記カルボキシメチルキトサンは、０．１～１００ｍｇ／ｍｌ濃度で含むことができ、好ましくは０．５～３０、０．５～２０、０．５～１５、０．５～１２、０．５～１０、０．８～３０、０．８～２０、０．８～１５ｍｇ／ｍｌ濃度で含むことができ、最も好ましくは１ｍｇ／ｍｌ濃度で含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記組成物は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）をさらに含むことができ、その濃度は、０～１００ｍＭ、好ましくは０．５～３０、０．５～２０、０．５～１５、０．５～１２、０．５～１０、０．８～３０、０．８～２０、０．８～１５、０．８～１２ｍＭの濃度で含むことができ、最も好ましくは１０ｍＭの濃度で含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記組成物は、１～１００ｍＭのバッファーをさらに含むことができ、前記バッファーは、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＥＳ）、マレイン酸塩（Ｍａｌｅａｔｅ）、クエン酸塩（Ｃｉｔｒａｔｅ）、ビス－トリス（ＢＩＳ－Ｔｒｉｓ）、リン酸塩（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＡＤＡ）、炭酸塩（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ，Ｎ’－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＣＥＳ）、３－モルフォリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（３－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＯＰＳＯ）、イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、ビス－トリス－プロパン（ＢＩＳ－Ｔｒｉｓ－Ｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ，Ｎ－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＢＥＳ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＯＰＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル]－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ－［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＴＥＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＥＰＥＳ）、３－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸（３－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＤＩＰＳＯ）、３－［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（３－［Ｔｒｉｓ－（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］－２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ Ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄ，ＴＡＰＳＯ）、トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＴＥＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（Ｎ－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ'－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＥＰＰＳＯ）、ピペラジンー－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－３ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ＰＯＰＳＯ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン（Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、トリス（Ｔｒｉｓ）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］プロパン－１－スルホン酸（３－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＥＰＰＳ，ＥＰＰＳ）、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸（Ｎ－［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＴＡＰＳ）、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（２－Ａｍｉｎｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ，ＡＭＰＤ）、Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（Ｎ－（１，１－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－３－ａｍｉｎｏ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＭＰＳＯ）、タウリン（Ｔａｕｒｉｎｅ）及びホウ酸（Ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ）よりなる群から選ばれる一つ以上であることを特徴とし、最も好ましくは、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（３－Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＯＰＳ）を含むことを特徴とし得るが、これに限定されない。
本発明において、前記組成物は、０．１～１０ｍｇ／ｍｌの安定化剤をさらに含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記安定化剤は、糖アルコール、マルトース、ソルビトール、マンノース、グルコース、トレハロース、アルブミン、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、グリシン、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、ＰＥＧ及びＴｗｅｅｎ ８０から選ばれる一つ以上であることを特徴とし得るが、これに限定されない。
本発明は、また、ａ）前記組成物を血清含有サンプルに添加して凝塊（ｃｌｏｔ）形成速度を測定する段階；及びｂ）凝塊形成速度からフィブリノゲン濃度を導出する段階を含む、フィブリノゲン濃度測定方法に関する。
本発明において、前記血清含有サンプルは血液であってよく、好ましくは、血液から分離された血清であることを特徴とし得るが、これに限定されない。
本発明は、他の観点において、ａ）フィブリノゲンを含む血清含有サンプルに止血酵素及びカルボキシメチルキトサンを添加する段階；ｂ）前記混合物に候補物質を添加する段階；ｃ）凝塊（ｃｌｏｔ）形成時間を測定する段階；及びｄ）凝塊形成時間が候補物質を添加していない対照群に比べて増加する候補物質を抗凝固物質として選別する段階を含む、抗凝固物質のスクリーニング方法に関する。
本発明において、前記候補物質は、天然化合物、合成化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、酵素、リガンド、細胞抽出物又は哺乳動物の分泌物であることを特徴とし得る。また、タンパク質、非ペプチド性化合物、発酵生産物、植物抽出液又は血漿などがあり、前記化合物は、新規化合物又は周知の化合物であってよく、好ましくは合成又は天然化合物のライブラリーから得ることができる。
このような化合物のライブラリーを得る方法は、当業界に公知されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ．（ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ＵＳＡ）、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＵＳＡ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から商業的に購入可能であり、天然化合物のライブラリーは、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）及びＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から商業的に購入可能である。試料は、当業界に公知の様々な組合せライブラリー方法によって得ることができ、例えば、生物学的ライブラリー、空間アドレッサブルパラレル固相又は液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、デコンボリューションが要求される合成ライブラリー方法、“１－ビード１－化合物”ライブラリー方法、そして親和性クロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー方法によって得ることができる。分子ライブラリーの合成方法は、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９，１９９３；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４などに開示されている。
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１：組換えバトロキソビン発現ベクターの構築、分離、精製
大韓民国特許第１０－１８０１１５０号に開示された方法で組換えバトロキソビン発現ベクターを構築して分離及び精製した後、冷蔵庫（２～８℃）に保管して後の分析に活用した。
実施例２：組換えバトロキソビン及びカルボキシメチルキトサンのシナジー効果の確認
２－１．血漿凝塊時間の確認
ヒト血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅｒｃｈ，米国）を購入して１ｍｌずつ分注して凍結しておいた。測定時に３７℃で迅速に溶かして用いた。
分析用試料としては、ｒＴＬＨ及び天然型バトロキソビン（ｈｙｐｈｅｎ、米国）、トロンビン（Ｓｉｇｍａ、米国）、ボトロパーゼ（Ｒａｖｉｚｚａ、イタリア）、アンクロド（Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｔｉｃａｌ、米国）、スリング（Ｋｏｎｒｕｎｓ、中国）を各１０ＢＵ／ｍｌ（天然型バトロキソビン基準）となるようにサリンで希釈した後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８又はＣＭＣＳ及びＣＳ（ｃｈｉｔｏｓａｎ）と希釈して５ＢＵ／ｍｌの濃度にした。
各試料と血漿は、３７℃で１０分間予熱した後、Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｍｅｒで血漿３００ｕｌに試料１００ｕｌを入れ、凝固までの時間を測定した。
その結果、図１に示すように、カルボキシメチルキトサン含有ｒＴＬＨの血漿凝塊時間が、キトサン含有ｒＴＬＨ又はｒＴＬＨのみ含有組成物に比べて早いことが確認できた。
２－２．フィブリノゲン時間の確認
フィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ，米国）を購入し、２ｍｇ／ｍｌ濃度で溶かした。
分析用試薬は、前記血漿凝塊時間の確認組成物と同様に作った。
試料とフィブリノゲンは、ＡＣＬ１００００のＦＩＢ－Ｃプロトコルに合わせて機械に装着した後、プログラムによって測定した。
その結果、図１及び図２に示すように、ｒＴＬＨ＋ＣＭＣＳ組成物のフィブリノゲン凝塊時間がｒＴＬＨ ｏｎｌｙ又はｒＴＬＨ＋ＣＳ（キトサン）に比べて早いことを確認した。
２－３．フィブリノゲンα鎖切断時間の確認
ヒトフィブリノゲンを２ｍｇ／ｍＬの濃度に溶かし、バッファー又はＣＭＣＳを入れてよく混ぜた後、ｒＴＬＨを入れて反応させた。反応時間は１０～３０秒までにし、反応が終わると直ちに５Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料バッファーを入れ、１００℃で５分間加熱して反応を終えた。サンプルは、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングして２時間電気泳動し、ゲルはクマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色した。
その結果、図３に示すように、ＣＭＣＳを添加していない場合には、３０秒でフィブリノゲンα鎖が完全に切断され、ＣＭＣＳを添加している場合には、１０秒でフィブリノゲンα鎖が完全に切断されることを確認した。
２－４．酵素活性の確認
トロンビン基質であるＳ－２２３８（ｈｙｐｈｅｎ，米国）を購入し、２０ｍＭの濃度に溶かした。ｒＴＬＨ活性測定時の最終濃度を２５、５０、１００、２００、４００ｕＭにして測定し、希釈するために１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ、ｐＨ６．８を添加した。
分析用試料は、ｒＴＬＨを１０ＢＵ／ｍｌ濃度にし、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８又はＣＭＣＳと混合した。
５ＢＵ／ｍｌ又は５ＢＵ／ｍｌ＋１０ｍｇ／ｍｌ ＣＭＣＳで作られた試料は、９６ウェルプレートに各２０ｕｌを入れ、濃度別トロンビン基質を１８０ｕｌずつ入れた後、ＥＬＩＳＡを用いて３７℃で２０分間吸光度を測定した。
その結果、図４に示すように、ＣＭＣＳがｒＴＬＨの酵素活性を増加させることを確認した。
２－５．凝塊強度（ｃｌｏｔ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の確認
ラット全血（Ｒａｔ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）を購入して使用した。
分析用試料は、ｒＴＬＨを５ＢＵ／ｍｌ濃度にした。
ラット全血３００ｕｌにＣＭＣＳを濃度別（０．１、０．２５、０．５ｍｇ／ｍｌ）に２０ｕｌを入れて混ぜた後、ｒＴＬＨ ２０ｕｌ、ＣａＣｌ２ ２０ｕｌ、血３００ｕｌの比率でＲＯＴＥＭを用いて１時間測定した。
その結果、図５に示すように、ＣＭＣＳの濃度に依存して凝塊強度が増加することを確認した。
実施例３：組換えバトロキソビン及びカルボキシメチルキトサン混合物ベースのフィブリノゲン濃度測定
実施例１で製造した組換えバトロキソビン２．５ＢＵ／ｍｌ又は５ＢＵ／ｍｌを含み、カルボキシメチルキトサン１０ｍｇ／ｍｌを含む試薬を用いて、濃度別フィブリノゲンの検出をＡＣＬ１００００ＦＩＢ＿Ｃプロトコルを用いて試みた。
その結果、図６に示すように、０．３ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンが検出可能であることを確認した。
また、前記条件に１０ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を追加して行った結果、図７に示すように、０．２ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲンを検出可能であることが確認できた。
のみならず、前記組成物を用いて血清内のフィブリノゲン濃度０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度まで検出できることを確認したが（図８）、これは、最も優れた商用フィブリノゲン検出試薬の検出限界が０．３５ｍｇ／ｍｌであるのに比べて、著しく優れていることが確認できた。
実施例４：組換えバトロキソビン及びカルボキシメチルキトサン混合物ベースのフィブリノゲン濃度測定試薬の干渉性能試験
異常血液及び抗凝固剤を含む血液において測定値の干渉があるかどうか確認するために、干渉性能を確認した。キャリブレーション血漿（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｐｌａｓｍａ）をＡＣＬ ＴＯＰ３００装備のＦＩＢ－Ｃプロトコルに合わせて機械に装着した後、プログラムによって測定して検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）を作った。干渉物質としては、ヘモグロビン、ビリルビン、ヘパリンを使用して、各試薬を高濃度で溶かし、血漿に濃度に合わせて添加して測定した。
その結果、図９に示すように、ヘモグロビンは５００ｍｇ／ｄＬ、ビリルビンは４０ｍｇ／ｄＬまで、測定結果値に影響がなかった。特に、抗凝固剤であるヘパリンは、１０Ｕ／ｍＬ濃度まで測定値に影響がないことを確認し、干渉限界が１Ｕ／ｍＬである最も優れた商用フィブリノゲン検出試薬に比べて干渉がないことが確認できた。
実施例５：組換えバトロキソビン及びカルボキシメチルキトサン混合物ベースのフィブリノゲン濃度測定試薬の正確度確認試験
製造された試薬を用いてフィブリノゲンの濃度試験測定値と真値との一致度を確認する試験であり、公認された参考値を有する国際標準物質を使用する。標準物質は、ＮＩＢＳＣの３ｒｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｐｌａｓｍａ（０９／２６４）を使用した。標準物質と試薬をＡＣＬ ＴＯＰ装備のプロトコルに合わせて装着した後、プログラムによって測定した。
その結果、図１０に示すように、前記組成物を用いて測定した結果値は、国際標準物質の結果値と比較して±３％以内の差を示したが、これは、最も優れた商用フィブリノゲン検出試薬の正確度測定結果値が±１５％以内であることに比べて、著しく優れていることが確認できた。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されると言えよう。
本発明に係る血液凝固検査用組成物は、止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）の活性及び凝塊強度を向上させてフィブリン形成速度を増加させるので、高い敏感度かつ速い速度で血液凝固検査を行うことができ、有用である。

Claims (12)

  1. 止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）及びカルボキシメチルキトサン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ，ＣＭＣＳ）を含む、血液凝固検査用組成物。
  2. 前記血液凝固検査は、トロンビン時間（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｔｉｍｅ，ＴＴ）測定、レプチラーゼ時間（Ｒｅｐｔｉｌａｓｅ ｔｉｍｅ）測定及びフィブリノゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）濃度測定よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固検査用組成物。
  3. 前記止血酵素（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）は、トロンビン、組換えバトロキソビン、天然型バトロキソビン、ボトロパーゼ（Ｂｏｔｒｏｐａｓｅ）、アンクロド（ａｎｃｒｏｄ）及びスリング（Ｓｕｌｉｎｇ）よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固検査用組成物。
  4. 前記止血酵素は、０．１～１００ＢＵ／ｍｌ濃度で含むことを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固検査用組成物。
  5. 前記カルボキシメチルキトサンは、０．１～１００ｍｇ／ｍｌ濃度で含むことを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固検査用組成物。
  6. ０～１００ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固検査用組成物。
  7. １～１００ｍＭのバッファーをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固検査用組成物。
  8. 前記バッファーは、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＥＳ）、マレイン酸塩（Ｍａｌｅａｔｅ）、クエン酸塩（Ｃｉｔｒａｔｅ）、ビス－トリス（ＢＩＳ－Ｔｒｉｓ）、リン酸塩（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ＡＤＡ）、炭酸塩（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ，Ｎ’－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＣＥＳ）、３－モルフォリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（３－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＯＰＳＯ）、イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、ビス－トリス－プロパン（ＢＩＳ－Ｔｒｉｓ－Ｐｒｏｐａｎｅ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ，Ｎ－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＢＥＳ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＭＯＰＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル]－２－アミノエタンスルホン酸（Ｎ－［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＴＥＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＥＰＥＳ）、３－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸（３－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＤＩＰＳＯ）、３－［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（３－［Ｔｒｉｓ－（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）Ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］－２－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ Ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄ，ＴＡＰＳＯ）、トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＴＥＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（Ｎ－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ'－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＥＰＰＳＯ）、ピペラジンー－１，４－ビス（２－ヒドロキシ－３－プロパンスルホン酸（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙ－３ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ＰＯＰＳＯ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、グリシルグリシン（Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）、トリス（Ｔｒｉｓ）、３－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］プロパン－１－スルホン酸（３－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＨＥＰＰＳ，ＥＰＰＳ）、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸（Ｎ－［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＴＡＰＳ）、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（２－Ａｍｉｎｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ，ＡＭＰＤ）、Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（Ｎ－（１，１－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－３－ａｍｉｎｏ－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＡＭＰＳＯ）、タウリン（Ｔａｕｒｉｎｅ）及びホウ酸（Ｂｏｒｉｃ ａｃｉｄ）よりなる群から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項７に記載の血液凝固検査用組成物。
  9. ０．１～１０ｍｇ／ｍｌの安定化剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固検査用組成物。
  10. 前記安定化剤は、糖アルコール、マルトース、ソルビトール、マンノース、グルコース、トレハロース、アルブミン、リシン、グリシン、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、ＰＥＧ及びＴｗｅｅｎ ８０から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項９に記載の血液凝固検査用組成物。
  11. 下記の段階を含むフィブリノゲン濃度測定方法：
    ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物を血清含有サンプルに添加し、凝塊（ｃｌｏｔ）形成速度を測定する段階；及び
    ｂ）凝塊形成速度からフィブリノゲン濃度を導出する段階。
  12. 下記の段階を含む抗凝固物質のスクリーニング方法：
    ａ）フィブリノゲンを含む血清含有サンプルに止血酵素及びカルボキメチルキトサンを添加する段階；
    ｂ）前記混合物に候補物質を添加する段階；
    ｃ）凝塊（ｃｌｏｔ）形成時間を測定する段階；及び
    ｄ）凝塊形成時間が候補物質を添加していない対照群に比べて増加する候補物質を抗凝固物質として選別する段階。
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