CN102526795A - 壳聚糖基止血海绵及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基止血海绵，其由具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基和止血剂制成的多孔状海绵。本发明提供的壳聚糖基止血海绵，其制备方法是：用壳聚糖或羧甲基壳聚糖固定凝血酶，并加入其他止血剂、冻干保护剂、交联剂制成多孔状止血海绵，其中壳聚糖或羧甲基壳聚糖与凝血酶的重量比例为100∶0.1～20，然后经预冻、真空冷冻干燥、倒模、切割、封装，灭菌即得。本发明通过壳聚糖或羧甲基壳聚糖对凝血酶进行固定化，提高了凝血酶的稳定性和凝血活性，制得的壳聚糖基止血海绵的性质更加稳定，凝血愈创效果显著增强，可广泛用于创伤或手术止血。

Description

壳聚糖基止血海绵及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，特别是一种具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基止血海绵及其制备方法，并将其用于创伤或手术止血。

背景技术

止血是紧急医疗救治的一个重要步骤，病人手术治疗、日常生活中出现突发性创伤时，均需进行快速止血，在恶劣的战争环境和复杂突发事件中的战、创伤急救治疗时，实现快速有效的止血尤为重要。

壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化后制得的天然聚阳离子多糖，羧甲基壳聚糖是甲壳素经化学改性后得到的水溶性衍生物。壳聚糖、羧甲基壳聚糖均具有凝血、抑菌、促进创伤愈合、抑制瘢痕形成等多种作用，是一类生物相容性好、易生物降解、无免疫原性、无刺激性的多功能高分子生物材料，近年来在快速止血领域的应用日益广泛。

凝血酶属于丝氨酸蛋白水解酶类，是凝血过程中的重要酶。在血液凝固过程中，凝血酶的作用是催化血液中纤维蛋白原的裂解反应，使之成为纤维蛋白，加速血液凝固。同时，凝血酶激活凝血因子XIII，使纤维蛋白交联成网状结构，网络血液中的红细胞成为血凝块，阻止血液的进一步流失，完成凝血过程。凝血酶还具有促进损伤上皮细胞生长，促进伤口愈合的作用，因此，凝血酶被公认为是一种速效局部止血药，其止血作用在国内外临床治疗上已经得到广泛的应用。

单一壳聚糖基制备的止血海绵的止血效果不理想，愈创能力较弱，难以满足战创伤止血和临床快速止血的要求，如中国专利CN 101327344A。单一将凝血酶作为止血剂时，由于凝血酶的本质是蛋白质，稳定性较差，易变性失活，创伤紧急救治条件和野战环境常较为恶劣，难以提供理想的储存和酶催化环境，导致其止血应用范围受到极大限制。中国专利CN101053669A将水溶性壳聚糖衍生物的钠盐或钾盐溶解于水后，加入凝血酶，制成均匀胶体溶液，经真空冷冻干燥得到止血愈创海绵，增强了凝血效果。但它仍然存在凝血酶稳定性差，易失活的缺点，限制了该止血海绵的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基止血海绵，提高凝血酶的稳定性，拓展凝血酶在止血领域中的应用。还提供一种通过复合应用止血材料制备壳聚糖基止血海绵的方法。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的是一种具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基止血海绵，该海绵是由具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基和止血剂制成的多孔状海绵。

所述的壳聚糖基为壳聚糖、羧甲基壳聚糖中的一种，其分子结构如下：

式中：R₁为H、CH₂COOH，R₂为H、COCH₃、CH₂COOH，n＝55～5500。

所述的壳聚糖为脱乙酰度40％～60％的甲壳素，黏均分子量为(0.1～10.0)×10⁵。所述的羧甲基壳聚糖为O-羧甲基壳聚糖，其分子结构中R₁＝CH₂COOH，R₂＝H，或N-羧甲基壳聚糖，其分子结构中R₁＝H，R₂＝CH₂COOH，或N，O-羧甲基壳聚糖，其分子结构中R₁＝CH₂COOH，R₂＝CH₂COOH，该羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为40％～80％，黏均分子量为(0.1～8.0)×10⁵，羧甲基的取代度为0.2～0.8。

所述的止血剂为凝血酶、氯化钙、海藻酸钙、动物源胶原蛋白、类人胶原蛋白、止血中药中的一种，或多种。

所述的凝血酶为牛血或猪血中提取的凝血酶原，经激活而得的无菌冻干制品，将该凝血酶无菌冻干制品溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到浓度为0.001％～5％的凝血酶溶液。壳聚糖基与凝血酶的重量比例为100∶0.1～20。

所述的动物源胶原蛋白是从动物的皮肤、软骨、肌膜或韧带组织中提取出的胶原蛋白，并制备成1％～5％的水溶液。

所述的类人胶原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后，经过特定序列重复和修饰，转化于大肠杆菌中，并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得，并制备成1％～5％的水溶液。所述特定序列是指对其α1肽链的Gly-X-Y进行改进，摒弃容易引起免疫反应的色氨酸等氨基酸残基。

所述的动物源胶原蛋白或类人胶原蛋白与壳聚糖基的重量比例是1～40∶1。

所述的止血中药为下述物质的一种，或多种；所述物质为三七，白芨，青黛，紫珠粉末，或其流浸膏，或其浸膏。

所述的止血中药与壳聚糖基的重量比例是0.1～10∶1。

本发明通过壳聚糖基交联反应对凝血酶进行固定化，制得壳聚糖基固定化凝血酶。所用的交联剂为甲醛、甲基乙二醛、戊二醛、水溶性钙盐、水溶性铝盐、水溶性铁盐中的一种，或两种。壳聚糖基与交联剂的重量比例为100∶0.01～2。

本发明提供的上述壳聚糖基止血海绵，其制备方法如下：

(1)以壳聚糖基为原料，配制质量浓度为0.5％～5％的壳聚糖基水溶液；

(2)将止血剂加至壳聚糖基溶液中，搅拌均匀；

(3)在上述步骤(2)混合液中，按与该溶液的重量比0.1～10∶100加入冻干保护剂，搅拌均匀；

(4)在上述步骤(3)混合液中加入交联剂，搅拌均匀；

(5)将上述混合液注入不同规格的模具中，放置0.5～6小时，待形成透明凝胶后，于-40～-10℃预冻成型，再于-40～0℃真空冷冻干燥24～48小时；

(6)取上述冷冻干燥制得的海绵，密封，⁶⁰Co灭菌，即得壳聚糖基止血海绵。

上述制备方法中，所述的冻干保护剂为丙三醇、1.3-丁二醇、二甲亚砜、葡聚糖、甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、山梨醇、木糖醇中的一种，或两种。

上述制备方法中，所用的模具可以根据临床需求制成任意形状，对海绵的理化性能、止血效果和生物相容性不造成影响。

本发明与现有技术相比，主要有以下显著的效果：

其一，以壳聚糖或羧甲基壳聚糖为载体对凝血酶进行固定化，增强了凝血酶的稳定性，保持了凝血酶在使用过程中的凝血活性。

其二，制得的含有凝血酶的壳聚糖基止血海绵的性质更加稳定，凝血愈创效果显著增强。还通过与氯化钙、海藻酸钙、动物源胶原蛋白、类人胶原蛋白、止血中药等其他止血剂的联合应用，进一步增强了该止血海绵的凝血愈创效果。

其三，所提供的具有凝血酶固定化用的壳聚糖基止血海绵外观饱满、蓬松，柔软、易变形，生物相容性好，凝血愈创效果佳，储存、运输、使用、携行便捷，在手术、外伤的止血愈创等医疗领域具有更为广泛的应用前景。

具体实施方式

本发明以壳聚糖和羧甲基壳聚糖作为载体对凝血酶进行固定化，制备具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基止血海绵，加强止血愈创效果。该海绵是由具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基和止血剂制成的多孔状海绵。

下面结合实施例对本发明方法作进一步说明，但不限定本发明。

实施例1：

将壳聚糖溶于蒸馏水中，得到质量浓度为0.5％的壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为0.0015％的凝血酶溶液，然后将二者按体积比3∶1混合，制得壳聚糖与凝血酶的重量比例为100∶0.1的混合溶液400mL。在搅拌的条件下，加入5g丙三醇和10g甘露醇，并逐滴加入质量浓度5％的氯化钙溶液0.5mL，混合均匀，然后倾入适当形状的模具中，放置2小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-40℃真空冷冻干燥36小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例2：

将壳聚糖溶于蒸馏水中，得到质量浓度为2％的壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为0.06％的凝血酶溶液，将氯化钙用蒸馏水溶解，得到质量浓度为3％的氯化钙溶液，然后将三者按体积比3∶1∶0.1混合，制得壳聚糖、凝血酶、Ca²⁺的重量比例为100∶1∶1.8的混合溶液410mL。在搅拌的条件下，加入4g丙三醇和20g甘露醇，混合均匀。再于搅拌状态下，逐滴加入体积浓度1％戊二醛溶液2.5mL进行交联，然后倾入适当形状的模具中，放置2小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-40℃真空冷冻干燥36小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例3：

将壳聚糖溶于蒸馏水中，得到质量浓度为2％的壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为0.06％的凝血酶溶液；将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解，得到质量浓度为2％的类人胶原蛋白溶液，然后将三者按体积比3∶1∶60混合，制得壳聚糖、凝血酶、类人胶原蛋白的重量比例为1∶0.01∶20的混合溶液640mL。在搅拌的条件下，加入3.2g丙三醇和32g甘露醇，混合均匀。再于搅拌状态下，逐滴加入体积浓度0.1％戊二醛溶液2.5mL进行交联，然后倾入适当形状的模具中，放置3小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-20℃真空冷冻干燥36小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例4：

将壳聚糖溶于蒸馏水中，得到质量浓度为2％的壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为0.06％的凝血酶溶液；将三七粉末采用超声波提取法提取浓缩成流浸膏，然后将三者按体积比3∶1∶0.1混合，制得壳聚糖、凝血酶、三七的重量比例为1∶0.01∶1.7的混合溶液410mL。在搅拌的条件下，加入2g丙三醇和20g甘露醇，混合均匀。再于搅拌状态下，逐滴加入体积浓度1％戊二醛溶液2.5mL进行交联，然后倾入适当形状的模具中，放置3小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-40℃真空冷冻干燥36小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例5：

将壳聚糖溶于蒸馏水中，得到质量浓度为5％的壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为2.25％的凝血酶溶液；将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解，得到质量浓度为2％的类人胶原蛋白溶液；将三七粉末采用超声波提取法提取浓缩成流浸膏，然后将四者按体积比3∶1∶60∶0.1混合，制得壳聚糖、凝血酶、类人胶原蛋白、三七的重量比例为1∶0.15∶8∶0.67的混合溶液641mL。在搅拌的条件下，加入6.4g丙三醇和32g甘露醇，混合均匀。再于搅拌状态下，逐滴加入体积浓度0.1％戊二醛溶液6.5mL进行交联，然后倾入适当形状的模具中，放置4小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-20℃真空冷冻干燥36小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例6：

将羧甲基壳聚糖用蒸馏水溶解，得到质量浓度为0.5％的羧甲基壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为0.0015％的凝血酶溶液，然后将二者按体积比3∶1混合，制得羧甲基壳聚糖与凝血酶的重量比例为100∶0.1的混合溶液400mL。在搅拌的条件下，加入2g丙三醇和12g甘露醇，并逐滴加入质量浓度5％的氯化钙溶液0.5mL，混合均匀，然后倾入适当形状的模具中，放置2小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-40℃真空冷冻干燥48小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例7：

将羧甲基壳聚糖用蒸馏水溶解，得到质量浓度为2％的羧甲基壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为0.06％的凝血酶溶液，将氯化钙用蒸馏水溶解，得到质量浓度为3％的氯化钙溶液，然后将三者按体积比3∶1∶0.1混合，制得羧甲基壳聚糖、凝血酶、Ca²⁺的重量比例为100∶1∶1.8的混合溶液410mL。在搅拌的条件下，加入4g丙三醇和20g甘露醇，混合均匀。再于搅拌状态下，逐滴加入体积浓度1％戊二醛溶液2.5mL进行交联，然后倾入适当形状的模具中，放置2.5小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-40℃真空冷冻干燥48小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例8：

将羧甲基壳聚糖用蒸馏水溶解，得到质量浓度为2％的羧甲基壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为0.06％的凝血酶溶液；将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解，得到质量浓度为2％的类人胶原蛋白溶液，然后将三者按体积比3∶1∶60混合，制得羧甲基壳聚糖、凝血酶、类人胶原蛋白的重量比例为1∶0.01∶20的混合溶液640mL。在搅拌的条件下，加入6.4g丙三醇和32g甘露醇，混合均匀。再于搅拌状态下，逐滴加入体积浓度0.1％戊二醛溶液2.5mL进行交联，然后倾入适当形状的模具中，放置3小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-20℃真空冷冻干燥48小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例9：

将羧甲基壳聚糖用蒸馏水溶解，得到质量浓度为2％的羧甲基壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为0.06％的凝血酶溶液；将三七粉末采用超声波提取法提取浓缩成流浸膏，然后将三者按体积比3∶1∶0.1混合，制得羧甲基壳聚糖、凝血酶、三七的重量比例为1∶0.01∶1.7的混合溶液410mL。在搅拌的条件下，加入2g丙三醇和20g甘露醇，混合均匀。再于搅拌状态下，逐滴加入体积浓度1％戊二醛溶液2.5mL进行交联，然后倾入适当形状的模具中，放置2小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-40℃真空冷冻干燥48小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例10：

将羧甲基壳聚糖用蒸馏水溶解，得到质量浓度为5％的羧甲基壳聚糖水溶液；将凝血酶溶于pH为7.0的0.1mol·L^-1磷酸盐缓冲液，得到质量浓度为2.25％的凝血酶溶液；将类人胶原蛋白用蒸馏水溶解，得到质量浓度为2％的类人胶原蛋白溶液；将三七粉末采用超声波提取法提取浓缩成流浸膏，然后将四者按体积比3∶1∶60∶0.1混合，制得羧甲基壳聚糖、凝血酶、类人胶原蛋白、三七的重量比例为1∶0.15∶8∶0.67的混合溶液641mL。在搅拌的条件下，加入6.4g丙三醇和32g甘露醇，混合均匀。再于搅拌状态下，逐滴加入体积浓度0.1％戊二醛溶液6.5mL进行交联，然后倾入适当形状的模具中，放置3小时，待形成透明凝胶后，-20℃冷冻24小时，再于-20℃真空冷冻干燥48小时，倒模、切割、封装，⁶⁰Co照射灭菌后即得成品。

实施例11：实施例1-10制备的壳聚糖基止血海绵的止血性能和愈创效果评价试验

试验前在无菌条件下，分别将各止血材料剪成2cm×2cm的片状，备用。以日本大耳兔和SD大鼠为试验动物，制作兔耳出血模型和大鼠股动脉出血模型，分别评价自制壳聚糖基止血海绵(实施例1～10制备)、市售可吸收明胶海绵(南京金陵药业有限公司生产)、纱布的止血作用。以日本大耳兔为试验动物，制作兔背部皮肤创面愈合模型，分别比较自制壳聚糖基止血海绵(实施例1～10制备)、市售可吸收明胶海绵(南京金陵药业有限公司生产)、纱布的愈创作用。

实验方法1(兔耳出血实验)：

(1)选用体重为2.5±0.5kg的日本大耳兔60只，雌雄各半，随机分为12组，每组5只。12个组分别为自制壳聚糖基止血海绵组(实施例1～10制备)、市售可吸收明胶海绵组(阳性对照)、纱布组(阴性对照)；

(2)兔子耳部脱毛后，实施腹腔注射10％水合氯醛麻醉；

(3)用手术刀片在耳外侧中央处(至少包括1条动脉和1条静脉)做1.5cm×1cm大小创面，其中动、静脉被横断，但耳朵不切透，待血液充满创面后立即施以止血材料，直至完全止血，记录止血时间，结果见表1。

实验方法2(大鼠股动脉出血实验)：

(1)选用体重为150±30g的SD大鼠120只，雌雄各半，随机分为12组，每组10只。12个组分别为自制壳聚糖基止血海绵组(实施例1～10制备)、市售可吸收明胶海绵组(阳性对照)、纱布组(阴性对照)；

(2)大鼠腿部脱毛后，实施腹腔注射10％水合氯醛麻醉；

(3)用手术刀解剖分离股动脉，剪断股动脉，立即于出血部位施以止血材料，直至完全止血，记录止血时间，结果见表1。

实验方法3(兔背部皮肤创面愈合实验)：

(1)选用体重为2.5±0.5kg的日本大耳兔60只，雌雄各半，随机分为12组，每组5只。12个组分别为自制壳聚糖基止血海绵组(实施例1～10制备)、市售可吸收明胶海绵组(阳性对照)、纱布组(阴性对照)；

(2)实施腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，于兔背部脊柱线两侧各剪去1个直径为1cm的全厚层皮肤；

(3)将止血材料分别用于两侧伤口处，用石蜡脱脂纱布覆盖，再用绷带包扎。于第7天和第14天分别观察各组材料处理后兔背部皮肤创面的愈合情况，结果见表2。

通过表1结果可知，在建立的两种出血模型中，壳聚糖基止血海绵与市售吸收性明胶海绵比较，止血时间均显著缩短(P＜0.05)，止血效果更佳。通过表2结果可知，壳聚糖基止血海绵吸收体液溶解后，具有显著的促进创面愈合效果。

上述实施例所制的壳聚糖基止血海绵具有良好的韧性，疏松多孔，色泽为类白色，止血时间短，可应用于出血量较大的伤口，且与皮肤表面的黏合性好，止血效果显著，同时这种壳聚糖基止血海绵还具有显著的促进创面愈合效果，在战伤、创伤急救止血，围手术期止血，或创面愈合等医疗领域中应用前景广阔。

附表

表1.不同止血材料的止血效果

表2.不同止血材料的愈创情况

Claims (9)

1.一种壳聚糖基止血海绵，其特征是一种具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基止血海绵，该海绵是由具有凝血酶固定化作用的壳聚糖基和止血剂制成的多孔状海绵。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖基止血海绵，其特征在于：所述的壳聚糖基为壳聚糖、羧甲基壳聚糖中的一种，其分子结构为： 

式中：R₁为H、CH₂COOH，R₂为H、COCH₃、CH₂COOH，n=55～5500；

所述的壳聚糖为脱乙酰度40 %～60 %的甲壳素，黏均分子量为（0.1～10.0）×10⁵；

所述的羧甲基壳聚糖为O-羧甲基壳聚糖，其分子结构中R₁＝CH₂COOH，R₂＝H；或N-羧甲基壳聚糖，其分子结构中R₁＝H，R₂＝CH₂COOH；或N, O-羧甲基壳聚糖，其分子结构中R₁＝CH₂COOH，R₂＝CH₂COOH；该羧甲基壳聚糖的脱乙酰度为40 %～80 %，黏均分子量为（0.1～8.0）×10⁵，羧甲基的取代度为0.2～0.8。

3.根据权利要求1所述的壳聚糖基止血海绵，其特征在于：所述的止血剂为凝血酶、氯化钙、海藻酸钙、动物源胶原蛋白、类人胶原蛋白、止血中药中的一种，或多种。

4.根据权利要求3所述的壳聚糖基止血海绵，其特征是：

所述的凝血酶为牛血或猪血中提取的凝血酶原，经激活而得的无菌冻干制品；

所述的动物源胶原蛋白是从动物的皮肤、软骨、肌膜或韧带组织中提取出的胶原蛋白；

所述的类人胶原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后，经过特定序列重复和修饰，转化于大肠杆菌中，并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得，所述特定序列是指对其α1肽链的Gly-X-Y进行改进，摒弃容易引起免疫反应的色氨酸等氨基酸残基；

所述的止血中药为下述物质的一种，或多种；所述物质为三七，白芨，青黛，紫珠粉末，或其流浸膏，或其浸膏。

5.一种壳聚糖基止血海绵的制备方法，其特征是采用包括以下步骤的方法制备权利要求1至4中任一权利要求所述的壳聚糖基止血海绵：

（1）以壳聚糖基为原料，配制质量浓度为0.5 %～5 %的壳聚糖基水溶液；

（2）将止血剂加至壳聚糖基溶液中，搅拌均匀；

（3）在步骤（2）搅拌均匀后的溶液中，按与该溶液的重量比0.1～10∶100加入冻干保护剂，搅拌均匀；

（4）在步骤（3）搅拌均匀后的溶液中加入交联剂，交联剂与该溶液中壳聚糖基的重量比例为0.01～2∶100，经搅拌均匀得到混合液；

（5）将上述混合液注入不同规格的模具中，放置0.5～6小时，待形成透明凝胶后，于－40～－10 ℃预冻成型，再于－40～0 ℃真空冷冻干燥24～48小时，得到冷冻干燥制得的海绵；

（6）取上述冷冻干燥制得的海绵，密封，⁶⁰Co灭菌；

经过上述步骤，得到所述壳聚糖基止血海绵。

6.根据权利要求5所述的壳聚糖基止血海绵制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的止血剂采用凝血酶时，其与壳聚糖基的重量比例是0.1～20∶100；所述的止血剂采用动物源胶原蛋白或类人胶原蛋白时，其与壳聚糖基的重量比例是1～40∶1；所述的止血剂采用氯化钙或海藻酸钙时，其中Ca²⁺与壳聚糖基的重量比例是0.01～2∶100；所述的止血剂采用止血中药时，其与壳聚糖基的重量比例是0.1～10∶1。

7.根据权利要求5所述的壳聚糖基止血海绵制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的冻干保护剂为丙三醇、1.3-丁二醇、二甲亚砜、葡聚糖、甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、山梨醇、木糖醇中的一种，或两种。

8.根据权利要求5所述的壳聚糖基止血海绵制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的交联剂为甲醛、甲基乙二醛、戊二醛、水溶性钙盐、水溶性铝盐、水溶性铁盐中的一种，或两种。

9.权利要求1至4中任一权利要求所述壳聚糖基止血海绵，其用于战伤、创伤急救止血，围手术期止血，或创面愈合医疗领域。