CN115212344B - 一种自膨胀止血气凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种自膨胀止血气凝胶及其制备方法，其制备方法为：将碳酸钙粉末分散于磷酸盐缓冲溶液中，加入凝血酶在4℃孵育1‑3h后，离心洗去未装载的凝血酶，沉淀物冷冻干燥得到载药碳酸钙；将载药碳酸钙与质子化氨甲环酸粉末进行混合得到碳酸钙混合粉末；将气凝胶支架径向的一端浸入明胶溶液中，浸入深度为气凝胶支架高度的1/5～4/5，自然降温后取出，并将另一端真空负压加载碳酸钙混合粉末；最后压缩得到自膨胀止血气凝胶。本发明利用气体膨胀产生脉冲式喷射作用，实现向伤口深处隐蔽出血点和微型沟壑出血点递送药物，并利用气体喷射所引发的对流作用促进药物在伤口内部扩散，增加药物与凝血物质的接触面积，加速血栓形成。

Description

一种自膨胀止血气凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药材料技术领域，具体涉及一种自膨胀止血气凝胶及其制备方法。

背景技术

由各种暴力因素(包括地震灾害、交通事故和战争等)所引起的难以控制的伤口出血仍然是一个巨大的挑战。据统计，难以控制的大出血所造成的死亡占全世界意外事故死亡人数30％，被认为是导致严重疾病和死亡的首要原因。虽然各种止血材料(包括纤维蛋白胶、壳聚糖海绵、水凝胶粘合剂和止血粉)已被广泛开发，但它们往往只能加速伤口表面浮血的凝固，而无法接触伤口深处的出血点，更无法克服复杂伤口的恶劣环境(包括不规则形状、高速的血流、隐蔽的出血点和无法按压等)。因此，针对复杂伤口，迫切需要开发一种更为高效的止血材料。

利用注射或者其它药物递送手段将止血剂逆着血流输送至伤口深处，从源头阻断出血，促进出血点栓塞，是目前治疗复杂伤口极其重要的策略。例如，专利号CN111135339A、CN112891613A的专利中利用具有定向驱动机制(如磁场驱动或气体推进)的微型马达主动向深部出血部位输送止血剂，促使药物在不规则的复杂伤中进一步扩散，实现药物的“逆流而上”，以增加止血药物和出血的接触面积。然而，该策略中所使用的磁场力或者气体推进力持续能力较差，尤其是在大型动物动脉出血伤口模型中药物递送效果不佳。此外，还有很多公开的气凝胶止血材料的专利报道，可注射的形状记忆气凝胶实现对复杂伤口进行封堵止血。在止血过程中，该气凝胶通过注射装置直接推入血腔，其通过吸收血液而在血腔内部迅速膨胀，以适应伤口形状，从伤口内部封堵伤口。与传统止血材料借助外界力量按压伤口表面的方式不同，该形状记忆气凝胶通过膨胀作用而对内部伤口施加压力，具有更强的伤口形状适应能力，因此其比传统海绵止血材料具有更高的止血效率。然而，体积膨胀海绵因为其固定的几何形状，很难填充复杂伤口内的隐蔽的出血点和微型的沟壑，这种不充分的的填充可能导致止血失败。

庞巴迪甲虫，是鞘翅目昆虫的一种，其在受到威胁时，可以从腹部尖端迅速喷射出高温有毒的喷雾。其喷射机制是基于腹腔内过氧化氢和过氧化物酶之间的化学反应，通过生成大量O₂将有毒产物从腹部喷嘴中排出，这种基于化学反应的生物“脉冲喷射”可以实现几厘米的喷射，大约是其身体长度的四倍，可以实现大范围的防御。为了解决上述障碍，本发明利用庞巴迪甲虫的生物“脉冲喷射”为启发研发一种与喷射系统兼容的新型体积膨胀止血气凝胶。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种与喷射系统兼容的新型自膨胀止血气凝胶及其制备方法，利用气体膨胀产生脉冲式喷射作用，实现向伤口深处隐蔽出血点和微型沟壑出血点递送药物，并利用气体喷射所引发的对流作用促进药物在伤口内部扩散，增加药物与凝血物质的接触面积，加速血栓形成。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

本发明第一个目的在于提供一种自膨胀止血气凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将丝素纳米短纤维与壳聚糖溶液混合，并加入戊二醛，充分搅拌后冷冻干燥得到气凝胶支架；

将碳酸钙粉末分散于磷酸盐缓冲溶液中，装载凝血酶得到载药碳酸钙，将载药碳酸钙与质子化氨甲环酸粉末进行混合得到碳酸钙混合粉末；

将气凝胶支架径向的一端浸入明胶溶液中，并将另一端真空负压加载碳酸钙混合粉末；最后压缩得到自膨胀止血气凝胶。

通过真空负压加载法使载药碳酸钙微球和质子化氨甲环酸吸附至气凝胶支架管道内部，可促使气凝胶在接触血液后可迅速喷射气体，加速药物的释放和递送，增强药物与血液的接触面积，有利于血栓形成。

进一步的，所述气凝胶支架的制备方法为：将丝素蛋白溶液用静电纺丝制备成丝素纳米短纤维，将丝素纳米短纤维制成悬浮液后加入质量分数为0.5～10％的壳聚糖溶液，混合使得到的丝素纳米纤维浓度为10～400mg/mL，加入戊二醛，充分搅拌后冷冻干燥得到气凝胶支架。

进一步的，所述丝素蛋白溶液的制备方法为：将剪碎的蚕茧壳加入碳酸钠溶液中，加热至沸腾，脱胶后得到丝素蛋白，将烘干后的丝素蛋白加入溴化锂溶液中溶解透析，冷冻干燥后，用六氟异丙醇重新溶解得到丝素蛋白溶液。

进一步的，静电纺丝时丝素蛋白的质量浓度为3-5％。

进一步的，静电纺丝的条件为：纺丝速度为0.01-0.5ml/min，纺丝时间为12-48h。

进一步的，所述壳聚糖溶液为将壳聚糖溶解在醋酸溶液中得到，壳聚糖的浓度为0.5-10％。

进一步的，静电纺丝得到的丝素纳米短纤维分散在去离子水中剪切，形成丝素纳米短纤维悬浮液。优选的，剪切转速为6000-10000rpm，剪切时间为10-20min。

进一步的，所述载药碳酸钙的制备方法为：按照10-30U/g加入凝血酶，在4℃孵育1-3h后，离心洗去未装载的凝血酶，沉淀物冷冻干燥得到载药碳酸钙。

进一步的，质子化氨甲环酸粉末的制备方法为：将氨甲环酸溶解于去离子水中后，用浓盐酸调节溶液的pH值至3.5～4，冷冻干燥得到质子化氨甲环酸粉末。

进一步的，所述载药碳酸钙与质子化氨甲环酸粉末的摩尔比为1:1～1:4。

进一步的，气凝胶支架制备的冷冻干燥条件为：调整温度为-80-190℃，待完全结冰后干燥48h，并将冷冻后的气凝胶置于真空干燥箱中在60℃真空干燥2-6h。本发明基于定向低温冷冻方法制备的自膨胀气凝胶，其在纵截面上呈现上下贯通且平行管道结构，横截面则呈现均匀排列的蜂窝状多孔结构，管道直径约为15-30μm。纳米短纤维分布在管道之间的缝隙中，大部分垂直于管壁。相互交织的纳米短纤维有利于提升与血液的接触面积，增强隔离效果。

进一步的，气凝胶支架在明胶溶液中浸入深度为气凝胶支架高度的1/5～4/5，自然降温后取出。

进一步的，所述明胶溶液的浓度为4％w/v，使用时明胶溶液温度保持在25～45℃。优选的，使用时明胶溶液温度保持在38～42℃。

进一步的，所述碳酸钙混合粉末的负载量为0.1-1.0g/cm³。

本发明第二个目的在于提供一种根据上述方法制备得到的自膨胀止血气凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

本发明基于庞巴迪甲虫喷射毒气的行为，提出一种主动喷射药物的自膨胀止血气凝胶，将内部相互交织的纳米短纤维、形状记忆性能和气体喷射性能协同组合，使得气凝胶在治疗各种复杂伤口方面显示巨大的临床应用潜力，实现高效止血。

1、压缩后的气凝胶注入出血腔后，其可以通过平行排列的微通道结构快速吸收血液，触发其快速恢复初始形状，进而对伤口壁产生压力，形成具有抗压能力的物理屏障来封堵伤口；通过改变压缩气凝胶的尺寸，可以使其不受伤口形状的限制，可适用于各种类型的伤口。

2、血液触发质子化氨甲环酸和载药碳酸钙之间的发生气体反应，并在气凝胶的平行微通道中聚集，产生强大且持续的脉冲式喷射，加速止血药物在血腔中的渗透和扩散，促进出血腔内纤维蛋白的形成。

3、微管道内相互交织的纳米短纤维大大提升了材料与血液接触的比表面积，加速红细胞和活化血小板的聚集，起到加固血栓的作用。

4、使用丝素和壳聚糖天然有机高分子作为合成原料，对人体组织亲和，不产生毒性，体内可降解。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。

附图说明

图1是为本发明自膨胀止血气凝胶的仿生原理图及其制备流程图；

图2为本发明自膨胀止血气凝胶的微观结构图；

图3为本发明自膨胀止血气凝胶水触发后产生持续脉冲式气体喷射的图像；

图4为本发明自膨胀止血气凝胶水或者血液触发后形状恢复的图像；

图5为本发明自膨胀止血气凝胶对于红细胞和血小板的粘附电镜图像；

图6为本发明自膨胀止血气凝胶在猪股动脉大出血模型中的止血图像；

图7为本发明自膨胀止血气凝胶的止血原理图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

另外，除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备均可通过市场购买获得或现有方法制备得到。

实施例1：气凝胶支架的制备

将剪碎的蚕茧壳加入碳酸钠溶液中，加热至沸腾，脱胶后得到丝素蛋白，将烘干后的丝素蛋白加入溴化锂溶液中溶解透析，-80℃条件下冷冻干燥后得到丝素蛋白海绵，将得到的丝素蛋白海绵用六氟异丙醇重新溶解得到丝素蛋白溶液。

将制备好的丝素蛋白溶液装载在注射器中，丝素蛋白的质量浓度为3-5％，利用静电纺丝机制备纳米纤维膜。纺丝过程中，选用纺丝针头的内径为0.51mm，纺丝液推进速度为0.01ml/min，温度设定为25±3℃、相对湿度设定为55±3％，通过锡箔纸收集纳米纤维，接收距离为15cm。纺丝时间为24h，获得纳米纤维膜。将形成的纳米纤维膜从锡箔纸中分离出来，剪成方形丝素碎片，称取丝素碎片分散在叔丁醇中，利用高速乳化机对上述分散液进行高速剪切处理，获得纳米纤维浆。其中，剪切转速为8000rpm，剪切时间为10min。随后，将获得纳米纤维浆置入80℃通风条件下烘干获得丝素纳米短纤维。静电纺丝的条件为：纺丝速度为0.01-0.05ml/min，剪切转速为6000-10000rpm，剪切时间为10-20min。

称取高粘度的壳聚糖(粘度>400mPa.s)溶解在100mL醋酸溶液中(1％)，并在60℃下搅拌溶解30min，形成质量分数为4％的壳聚糖溶液。将丝素纳米短纤维分散在10mL去离子水中(浓度为0.15g/ml)，使用高速剪切机剪切5min，转速为6000rpm，重新形成丝素纳米短纤维悬浮液。将丝素纳米短纤维悬浮液加入已经配制好的壳聚糖溶液中，调整丝素纳米纤维浓度分别为20mg/mL，并加入10μL戊二醛，充分搅拌30-60min后，将混合溶液倒入50×50×5mm的方形塑料模具中。随后将上述溶液放置在与液氮相连的低温铜板上，调整铜板温度为190℃，待样品完全结冰后，置于真空冷冻干燥箱中干燥48h，并将冷冻干燥后的气凝胶置于60℃的真空干燥箱中6h，以加速壳聚糖、丝素纳米纤维和戊二醛之间的交联，制备具有平行排列管道结构的气凝胶支架。

实施例2：碳酸钙混合粉末的制备

采用共沉淀法，将250ml Na₂CO₃溶液(0.33M)快速加入等体积的0.33M的CaCl₂溶液中，匀速搅拌(250rpm)60s，自然沉降10min，将获得沉淀用乙醇洗涤三次，并在70℃下干燥2h，获得碳酸钙粉末。称取1g碳酸钙重新分散于50ml标准磷酸盐缓冲溶液中，随后按照20U/g加入凝血酶，并在4℃孵育2h，通过离心洗去未装载的凝血酶，离心速度设置为800rpm，离心时间为5min，将沉淀物放入-80℃预冻6h，进一步通过冷冻干燥获得载药碳酸钙。

称取0.5mol氨甲环酸，溶解于500ml的去离子水溶液中，使用浓盐酸调节溶液的pH为4.0，将上述溶液置于-80℃冰箱预冻12h，并进步通过冷冻干燥或者质子化氨甲环酸粉末。

将载药碳酸钙和质子化氨甲环酸按照摩尔比1:1进行混合，使用研钵在4℃条件对上述粉末进行充分的研磨和混合，得到碳酸钙混合粉末。

实施例3：自膨胀止血气凝胶制备

将实施例1制得的气凝胶支架径向的一端浸入38～42℃4％w/v的明胶溶液中，浸入深度为1mm，待自然降温后取出，使用棉签清除多余的明胶。将气凝胶支架的另一端采用真空负压加载方法，将实施例2得到的碳酸钙混合粉末进行吸附，使其进入气凝胶支架的平行管道结构中，碳酸钙混合粉末的负载量为0.1-0.2g/cm³。随后使用万能试验机(压缩力为1000N)将吸附后的气凝胶支架压缩至固定形状，得到自膨胀止血气凝胶。具体的制备流程参见附图1。

实验例1：

对本发明实施例制备得到的自膨胀止血气凝胶进行扫描电镜观察。结果如2所示，可以看出气凝胶在纵向呈现上下贯通且平行的管道结构，横截面则呈现均匀排列的蜂窝状多孔结构。此外，丝素纳米短纤维分布在管道之间的缝隙中，大部分垂直于管壁且相互交织，有利于提升其接触面积，增强对红细胞、血小板等凝血成分的浓缩。此外，载药碳酸钙和质子化氨甲环酸均匀的分散在平行管道结构中。

实验例2：

将本发明自膨胀止血其能叫用水接触，从而触发止血气凝胶止血过程，参见附图3所示，用水触发止血气凝胶后，采用高速摄像机对本发明气凝胶的止血过程进行了拍摄，从而了解本发明自膨胀止血气凝胶的止血过程。图3B为一次完整的喷射过程，虚线为粒子喷射的运动轨迹。在166.7ms内，单个微粒被喷射的距离约为1.98mm。图3C为气凝胶在液体中持续喷射5s的过程，通过Potoshop统计集束微球喷射轨迹，统计其喷射的平均速度为0.023m/s，喷射次数约为30次。图3D显示荧光显微镜观察管道结构中气泡聚集和喷射的过程，接触液体后的气凝胶迅速膨胀，同时在管道内部产生大量的气泡，并逐渐从顶部弹出，且整个气泡产生的过程可以持续60s以上。由此可以看出，本发明止血气凝胶气体释放速度快，气泡持续时间长，有利于药物的快速持续释放。图3A中显示了水触发气凝胶产生脉冲式喷射气体的原理示意图，即在接触水后，载药碳酸钙微球和质子化氨甲环酸之间发生反应释放出大量的气体，并从气凝胶通道开口侧排出，气体的持续产生诱导药物的扩散。

实验例3：

自膨胀止血气凝胶通过吸收血液膨胀从伤口内部施加压力，形成物理屏障，与气体喷射药物协同完成止血。附图4对气凝胶在血液和水条件下膨胀能力进行测试，在接触水和血液时，气凝胶在5s内就可以由3mm膨胀至8mm以上，10s内就会完全恢复形状，填充能力强，且从图中可以看出，气凝胶吸取血液后柔韧度好，可以根据伤口形状变化，形成记忆性气凝胶。气凝胶的一端持续的产生气泡，显著促进药物在伤口内部持续的扩散，有利于促进药物到达膨胀气凝胶无法触及的缝隙，实验中未被气凝胶吸附到的血液也实现了快速凝固，较静止状态下的血液凝固速度快。一方面气泡的产生带动药物向四周扩散，同时气体喷射所产生的涡流也加速了周围液体的对流，进一步促进了药物和液体之间的混合。

实验例4：

为了说明管道内纳米纤维对止血的作用，本发明通过扫描电镜观察自膨胀气凝胶对红细胞和血小板的粘附能力，如图5所示，红细胞和血小板粘附在管道壁表面或分布在纳米纤维网络中，与无丝素纳米纤维加入的对照组相比较，本发明所提及的自膨胀气凝胶对红细胞和血小板粘附具有更高的效率。这也证明了相互交织的纳米纤维可以通过隔离和促进血小板活化来加速红细胞和血小板的聚集。

实验例5：

分别取本发明膨胀止血气凝胶与市售止血材料CeloxTM，选用大型猪(>50kg)来构建股动脉出血模型，形成形状、大小、深度一致的模拟伤口，采用注射使止血材料进入伤口内部，并迅速按压实施止血，如图6所示，在止血过程中，通过注射进入伤口内部，能够快速吸收伤口内部血液，并恢复其原来的形状以产生按压力来抵挡高速流出血流，本发明止血气凝胶在3min就完成了止血。同时进行了多次对比试验，本发明自膨胀气凝胶均能够在3.5±0.41min内完成止血，这远远优于商业对照CeloxTM的止血效果(>10min)。

综合上述实验结果，参见附图7，本发明自膨胀止血气凝胶的止血原理：

1、模仿庞巴迪甲虫防御行为：本发明自膨胀止血气凝胶在接触水或者血液后，通过平行排列的微通道结构快速吸收血液，触发微通道内碳酸钙与质子化氨甲环酸之间发生剧烈的气体反应，并在气凝胶内部的平行微通道中积聚，产生强大而连续的脉冲式的气体喷射行为，诱发剧烈的涡流场，进一步加速药物在伤口内扩散和渗透，增强药物与出血点的接触面积，加速血栓形成。

2、气凝胶膨胀形成物理封堵：基于内部的平行微通道，该气凝胶可快速吸收血液，触发其快速膨胀，并通过对伤口壁施压，实现从伤口内部挤压和封堵伤口，以增强气凝胶抵挡血流的冲击力，加固血栓。

3、微管道内相互交织的纳米短纤维可以聚集凝血因子，加速红细胞和活化血小板的聚集。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (8)

1.一种自膨胀止血气凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将丝素纳米短纤维与壳聚糖溶液混合，并加入戊二醛，充分搅拌后冷冻干燥得到具有平行排列管道结构的气凝胶支架；

将碳酸钙粉末分散于磷酸盐缓冲溶液中，装载凝血酶得到载药碳酸钙，将载药碳酸钙与质子化氨甲环酸粉末进行混合得到碳酸钙混合粉末；

将气凝胶支架径向的一端浸入38~42℃4%w/v明胶溶液中，并将另一端真空负压加载碳酸钙混合粉末，所述碳酸钙混合粉末的负载量为0.1-1.0 g/cm³；最后压缩得到自膨胀止血气凝胶；所述气凝胶支架在明胶溶液中浸入深度为气凝胶支架高度的1/5~4/5，自然降温后取出。

2.如权利要求1所述一种自膨胀止血气凝胶的制备方法，其特征在于：所述气凝胶支架的制备方法为，将丝素蛋白溶液用静电纺丝制备成丝素纳米短纤维，将丝素纳米短纤维制成悬浮液后加入质量分数为0.5~10%的壳聚糖溶液，混合使得到的丝素纳米纤维浓度为10~400mg/mL，加入戊二醛，充分搅拌后冷冻干燥得到气凝胶支架。

3.如权利要求2所述一种自膨胀止血气凝胶的制备方法，其特征在于，静电纺丝的条件为：纺丝速度为0.01-0.5 ml/min，纺丝时间为12-48 h。

4.如权利要求1所述一种自膨胀止血气凝胶的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖溶液为将壳聚糖溶解在醋酸溶液中得到，壳聚糖的浓度为0.5-10%。

5.如权利要求2所述一种自膨胀止血气凝胶的制备方法，其特征在于：静电纺丝得到的丝素纳米短纤维分散在去离子水中剪切，形成丝素纳米短纤维悬浮液。

6.如权利要求1所述一种自膨胀止血气凝胶的制备方法，其特征在于：所述载药碳酸钙与质子化氨甲环酸粉末的摩尔比为1:1~1:4。

7.如权利要求1所述一种自膨胀止血气凝胶的制备方法，其特征在于：气凝胶支架制备的冷冻干燥条件为：调整温度为-80-190℃，待完全结冰后干燥48h，并将冷冻后的气凝胶置于真空干燥箱中在60℃真空干燥2-6 h。

8.一种根据权利要求1-7中任一项制备方法得到的自膨胀止血气凝胶。