CN104027834A - 一种凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵的制备方法，步骤包括制备壳聚糖多孔海绵；利用层层自组装法在壳聚糖海绵上组装凝血酶/鞣酸多层膜；将组装好的复合海绵静置过夜脱水，冷冻干燥。本发明通过调节凝血酶/鞣酸双分子层的层数，可以实现凝血酶载药量的调控，即止血效果的可调控。制得的凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵与自由态凝血酶相比，凝血酶的存储稳定性大大提高，具有止血速度快、效果好的优点，有望应用于战伤和院前急救止血。

Description

一种凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵的制备方法

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖基止血敷料的制备方法，具体说是一种凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵的制备方法。

背景技术

失控性大出血是导致军事伤亡和平民死亡的重要原因。一种理想的急救止血敷料需满足如下要求：止血效果好、价格不高、稳定性好、柔软易形变、无不良反应等等。现有的止血敷料的种类很多，如沸石粉、纤维蛋白敷料、壳聚糖绷带等。其中壳聚糖由于其优异的生物相容性、止血性、抑菌性，被认为是最有前景的止血敷料之一。现有的壳聚糖基止血敷料以壳聚糖的酸盐（醋酸盐或者乳酸盐等）为主，已经被商业化并应用于军事战争。但这类酸盐在人体内可能引起炎症反应，因此研制一种新型壳聚糖基止血敷料充满前景与挑战。

纯壳聚糖多孔海绵的止血性能十分有限，对于广泛出血创面的止血效果不很理想，常采用复合其他止血剂如凝血因子、氯化钙等方法提高止血性能。其中凝血酶是一种很常用的局部速效止血药，已经FDA认证，可以在临床上直接使用。通过将凝血酶与壳聚糖海绵进行复合，可以制备出新型止血材料。但由于凝血酶是一种蛋白质基止血因子，存储稳定性较差，需冻干后在低温下保存，这大大制约了凝血酶在急救敷料上的应用。

壳聚糖作为一种常用的固定化酶介质，被证实可以提高酶的热稳定性。通过将凝血酶复合在壳聚糖海绵上有望提高凝血酶的稳定性。壳聚糖通常是以微球的形式进行酶固定化，多孔海绵的固定化作用有限。因此需要通过物理或化学作用对凝血酶进行固定以通过稳定化作用。

凝血酶和鞣酸被证实在生理pH下存在氢键相互作用，通过将凝血酶/鞣酸层层自组装多层膜复合在壳聚糖多孔海绵中有望制得一种止血效率高、生物安全性好、易存储的止血敷料。

发明内容

本发明的目的是利用凝血酶和鞣酸在生理pH下的氢键作用，为提高壳聚糖海绵的止血性和凝血酶的存储稳定性，而提供一种凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵的制备方法。

本发明的凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵的制备方法，其特征在于步骤如下：

1）将壳聚糖粉末溶于乙酸中，配制质量浓度为1~5%的壳聚糖溶液，抽滤后加入过量氢氧化钠水溶液至凝胶完全沉淀，搅拌得凝胶颗粒悬浮液，用三蒸水冲洗至中性，加入丙三醇溶液增塑，然后离心，注入模具中，静置脱泡，冰冻后再冷冻干燥，得到壳聚糖多孔海绵；

2）将冷冻干燥的壳聚糖海绵用紫外照射的方式灭菌；

3）将树枝状聚磷酰亚胺（BPEI）溶解在磷酸缓冲液（PBS ）中，配置质量浓度为1~3mg/mL的BPEI溶液，称为A液；将鞣酸溶解在PBS中，配置质量浓度为1~3mg/mL的鞣酸溶液，称为B液；将凝血酶溶解在PBS中，配置质量浓度为1~3mg/mL的凝血酶溶液，称为C液；

4）将步骤2)的壳聚糖海绵浸泡入A液中至少20min，取出，用PBS反复冲洗后放置在筛网上静置至少10min；

5）将步骤4)处理得到的壳聚糖海绵放入B液中浸泡至少15min，取出，用PBS反复冲洗后放置在筛网上静置至少10min；

6）将步骤5)处理得到的壳聚糖海绵放入C液中浸泡至少15min，取出，用PBS反复冲洗后放置在筛网上静置至少10min，得到一个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵；

上述步骤3)至步骤6)中所述的PBS 的pH值均为7.3；

7）重复步骤5）和步骤6）n次，得到n个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵，再将其放置在筛网上过夜，在 -20℃预冷冻至少6个小时，再冷冻干燥，得到凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵。

本发明的优点在于：

1）利用层层自组装技术制备出一种负载大量凝血酶的多层膜，将其复合到壳聚糖海绵上使海绵的止血性能大大提高，弥补了纯壳聚糖止血效果有限的缺陷。

2）通过调节层层自组装的层数，可实现凝血酶载药量的调控，即海绵止血性能的可调控性。

3）凝血酶与鞣酸的氢键结合和壳聚糖多孔海绵的固定化作用，使凝血酶的存储稳定性大大提高。室温下的存储半衰期较自由凝血酶延长了8.5倍。有望突破凝血酶的应用局限，应用于战伤和院前急救止血。

4）本发明中用到的所有材料（壳聚糖、凝血酶、鞣酸）均已通过美国FDA认证，因此该止血材料具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1为测试样品的全血凝固测试结果图。图中测试样品A为纯壳聚糖海绵，测试样品B为实施例1，测试样品C为实施例2，测试样品D为实施例3。

具体实施方式

以下结合实例进一步说明本发明。

以下实施例中所述的磷酸缓冲液（PBS ）的pH值均为7.3。

实施例1：

1）将壳聚糖粉末溶于乙酸中，配制质量浓度为1%的壳聚糖溶液，抽滤后加入过量氢氧化钠水溶液至凝胶完全沉淀，搅拌得凝胶颗粒悬浮液，用三蒸水冲洗至中性，加入丙三醇溶液增塑，然后离心，注入模具中，静置脱泡，冰冻后再冷冻干燥，得到壳聚糖多孔海绵；

2）将冷冻干燥得到的壳聚糖海绵采用紫外照射的方式灭菌；

3）将BPEI溶解在磷酸缓冲液PBS中，配置质量浓度为1mg/mL的BPEI溶液，称为A液；将鞣酸溶解在PBS中，配置质量浓度为1mg/mL的鞣酸溶液，称为B液；将凝血酶溶解在PBS中，配置质量浓度为1mg/mL的凝血酶溶液，称为C液。

4）将步骤2)的壳聚糖海绵浸泡入A液中20min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置10min；

5）将步骤4)处理得到的壳聚糖海绵放入B液中浸泡15min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置10min；

6）将步骤5)处理得到的壳聚糖海绵放入C液中浸泡15min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置10min；得到一个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵；

7）重复步骤5）和步骤6）5次，得到5个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵，再将其放置在筛网上过夜，放入冰箱 -20℃预冷冻6个小时，再冷冻干燥，得到凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵。

本例制得的复合壳聚糖止血海绵中的凝血酶室温下的存储半衰期较自由态凝血酶延长了8.5倍。

全血凝固测试方法是取0.1g测试样品与0.2ml全血混合，利用紫外测试混合前后未凝固的血红蛋白含量，由此计算出被凝固的血红蛋白率即全血凝固率。

由图1可知，本例制得的复合壳聚糖海绵的全血凝固率是未复合壳聚糖海绵的1.9倍。

实施例2：

1）将壳聚糖粉末溶于乙酸中，配制质量浓度为3%的壳聚糖溶液，抽滤后加入过量氢氧化钠水溶液至凝胶完全沉淀，搅拌得凝胶颗粒悬浮液，用三蒸水冲洗至中性，加入丙三醇溶液增塑，然后离心，注入模具中，静置脱泡，冰冻后再冷冻干燥，得到壳聚糖多孔海绵；

2）将冷冻干燥得到的壳聚糖海绵采用紫外照射的方式灭菌；

3）将BPEI溶解在PBS中，配置质量浓度为2mg/mL的BPEI溶液，称为A液；将鞣酸溶解在PBS中，配置质量浓度为2mg/mL的鞣酸溶液，称为B液；将凝血酶溶解在PBS中，配置质量浓度为2mg/mL的凝血酶溶液，称为C液。

4）将步骤2)的壳聚糖海绵浸泡入A液中30min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置15min；

5）将步骤4)处理得到的壳聚糖海绵放入B液中浸泡20min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置15min；

6）将步骤5)处理得到的壳聚糖海绵放入C液中浸泡20min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置15min；得到一个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵；

7）重复步骤5）和步骤6）10次，得到10个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵，再将其放置在筛网上过夜，放入冰箱-20℃预冷冻6个小时，再冷冻干燥，得到凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵。

本例制得的复合壳聚糖止血海绵中的凝血酶室温下的存储半衰期较自由态凝血酶延长了9.3倍。

由图1可知，本例制得的复合壳聚糖海绵的全血凝固率是未复合壳聚糖海绵的2.7倍。

实施例3：

1）将壳聚糖粉末溶于乙酸中，配制质量浓度为5%的壳聚糖溶液，抽滤后加入过量氢氧化钠水溶液至凝胶完全沉淀，搅拌得凝胶颗粒悬浮液，用三蒸水冲洗至中性，加入丙三醇溶液增塑，然后离心，注入模具中，静置脱泡，冰冻后再冷冻干燥，得到壳聚糖多孔海绵；

2）将冷冻干燥得到的壳聚糖海绵采用紫外照射的方式灭菌；

3）将BPEI溶解在PBS中，配置质量浓度为3mg/mL的BPEI溶液，称为A液；将鞣酸溶解在PBS中，配置质量浓度为3mg/mL的鞣酸溶液，称为B液；将凝血酶溶解在PBS中，配置质量浓度为3mg/mL的凝血酶溶液，称为C液。

4）将步骤2)的壳聚糖海绵浸泡入A液中35min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置20min；

5）将步骤4)处理得到的壳聚糖海绵放入B液中浸泡25min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置20min；

6）将步骤5处理得到的壳聚糖海绵放入C液中浸泡25min，取出，用PBS冲洗5次，放置在筛网上静置20min；得到一个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵；

7）重复步骤5）和步骤6）15次，得到15个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵，再将其放置在筛网上过夜，放入冰箱-20℃预冷冻6个小时，再冷冻干燥，得到凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵。

本例制得的复合壳聚糖止血海绵中的凝血酶室温下的存储半衰期较自由态凝血酶延长了10.8倍。

由图1可知，本例制得的复合壳聚糖海绵的全血凝固率是未复合壳聚糖海绵的3倍。

Claims (1)

1.一种凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵的制备方法，其特征在于步骤如下：

1）将壳聚糖粉末溶于乙酸中，配制质量浓度为1~5%的壳聚糖溶液，抽滤后加入过量氢氧化钠水溶液至凝胶完全沉淀，搅拌得凝胶颗粒悬浮液，用三蒸水冲洗至中性，加入丙三醇溶液增塑，然后离心，注入模具中，静置脱泡，冰冻后再冷冻干燥，得到壳聚糖多孔海绵；

2）将冷冻干燥的壳聚糖海绵用紫外照射的方式灭菌；

3）将BPEI溶解在PBS 中，配置质量浓度为1~3mg/mL的BPEI溶液，称为A液；将鞣酸溶解在PBS中，配置质量浓度为1~3mg/mL的鞣酸溶液，称为B液；将凝血酶溶解在PBS中，配置质量浓度为1~3mg/mL的凝血酶溶液，称为C液；

4）将步骤2)的壳聚糖海绵浸泡入A液中至少20min，取出，用PBS反复冲洗后放置在筛网上静置至少10min；

5）将步骤4)处理得到的壳聚糖海绵放入B液中浸泡至少15min，取出，用PBS反复冲洗后放置在筛网上静置至少10min；

6）将步骤5)处理得到的壳聚糖海绵放入C液中浸泡至少15min，取出，用PBS反复冲洗后放置在筛网上静置至少10min，得到一个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵；

上述步骤3)至步骤6)中所述的PBS 的pH值均为7.3；

7）重复步骤5）和步骤6）n次，得到n个凝血酶/鞣酸双分子层的壳聚糖海绵，再将其放置在筛网上过夜，在 -20℃预冷冻至少6个小时，再冷冻干燥，得到凝血酶/鞣酸多层膜复合壳聚糖止血海绵。