WO2005112948A1 - 創傷の治療又は処置のための薬剤 - Google Patents

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Saburo Minami
Yoshiharu Okamoto
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Tottori University
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Definitions

  • the present invention relates to an agent for treating or treating a wound. See N acetyl
  • the present invention relates to an agent for promoting the proliferation of epidermal keratinocytes containing darcosamine, and an agent for promoting regeneration and protection of epithelium containing the agent for promoting epidermal keratinocytes.
  • the wound healing process is mainly classified into four stages: a coagulation hemostasis stage, an inflammatory stage, a proliferative stage, and a remodeling stage (re-epithelialization stage).
  • the rapid progression of these stages and the smooth transition to the next stage are important for the wound site to heal quickly and with less scarring.
  • the prolonged inflammatory phase or the formation of excessive granulation tissue during the proliferative phase results in delayed wound healing, pain and scarring.
  • chitin and chitosan are used as therapeutic agents suitable for wounds.
  • mechanism of healing promotion by chitin or chitosan has not been elucidated, its efficient use has been established!
  • Chitin and various chitin derivatives are known to have some effect on cells involved in each stage of the hemostatic, inflammatory, and proliferative phases.
  • Howling et al. Have mentioned only a few of the studies on epithelium formation, the final stage of the wound healing process. Howling, G ⁇ , Dettmar.PW, Goddard.PA, Hampson.FC, Dornish.M., And Wood, EJ 2001.
  • the effect of chitin and chitosan on the proliferation of human skin fibroblasts and keratinocytes in vitro. Biomaterials. 22: 2959-2966 describes that chitin does not act on basal cells forming the epidermis, and that chitosan suppresses the proliferation ability of epidermal keratinocytes.
  • the present invention clarifies the epithelial regeneration effect of various chitin derivatives and makes it effective in clinical practice.
  • An object of the present invention is to provide a drug such as an epithelial regeneration promoter that can be used.
  • an agent for promoting proliferation of epidermal keratinocytes comprising N-acetyl-D-darcosamine. Further, there are provided an epithelial regeneration promoter, an epithelium protective agent and a wound treatment containing the growth promoter.
  • FIG. 1 is a diagram showing cell culture time and absorbance after addition of WST-8.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between absorbance and the number of living cells.
  • FIG. 3 is a view showing the number of cell proliferation 24 hours after addition of a chitin-based sample.
  • FIG. 4 is a diagram showing the number of cell proliferation 24 hours after addition of a chitosan-based sample.
  • FIG. 5 is a graph showing the number of cell proliferation for 48 hours after addition of a chitin-based sample.
  • FIG. 6 is a graph showing the number of cell proliferation for 48 hours after addition of a chitosan-based sample.
  • Fig. 7 is a view showing a change in left wound area of a dog.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in the area of wound on the right thigh of a dog.
  • FIG. 9 is a photograph of a skin-deficient mouse.
  • FIG. 10A is a photograph of a mouse 8 days after application of chitin gel.
  • FIG. 10B is a photograph of a mouse 8 days after application of chitin gel and GlcNAc.
  • FIG. 10C is a photograph of a mouse 8 days after application of GlcNAc.
  • FIG. 10D is a photograph of a mouse 8 days after the application of physiological saline.
  • FIG. 11 is a photograph of a mouse 16 days after application of each sample.
  • FIG. 12 is a photograph of the skin tissue of a mouse to which physiological saline was applied.
  • FIG. 13 is a photograph of skin tissue of a mouse to which chitin gel has been applied.
  • FIG. 14 is a photograph of skin tissue of a mouse to which chitin gel + GlcNAc has been applied.
  • FIG. 15 is a photograph of skin tissue of a mouse to which GlcNAc has been applied.
  • the present inventors investigated the direct effects on the proliferation ability of epidermal keratinocytes and the effects of their concentrations using chitin, chitosan, and various chitin derivatives such as oligosaccharides and monosaccharides. .
  • N-acetyl-D-darcosamine which is a chitin monomer, had a clear growth effect of epidermal keratinocytes. It was also found that it had an effect of promoting skin regeneration in animal wounds.
  • N-Acetyl-D-darcosamine has been reported to be used as a sweetener to date, but is not known to have any biological regeneration effect. It is what is reported.
  • a wound generally means a force applied to the outside of the body as well as a wound applied by a blade or the like.
  • skin damage due to burns and frostbite is included.
  • N-acetyl-D-darcosamine showed a clear proliferation effect of epidermal keratinocytes in in vitro experiments.
  • Example 2 when applied to dogs having a major skin defect, an ideal skin regeneration effect was observed.
  • the dog had a third degree of burns.
  • a third-degree burn is a burn that usually requires skin grafting because of the lack of skin tissue.
  • Treatment with N-acetyl-D-darcosamine while stimulating resulted in rapid skin regeneration. Therefore, it was shown that N-acetyl-D-darcosamine has an effect of promoting regeneration of epithelium, particularly skin.
  • Example 3 when mice with artificially created wounds were treated with N-acetyl-D-darcosamine, the skin was promptly regenerated.
  • the wound of this mouse was obtained by completely removing the epithelium and dermis, and also partially removing the subcutaneous tissue. Therefore, it was shown that N-acetyl-D-darcosamine has an effect of promoting the regeneration of tissues above the subcutaneous tissues. Therefore, it was shown that N-acetyl-D-darcosamine had an effect of promoting epithelial regeneration, and in particular, an effect of regenerating the dermis and epidermis.
  • N-acetyl-D-darcosamines due to the effects of these N-acetyl-D-darcosamines, it is also possible to provide an epithelial protective agent and a skin protective agent containing N-acetyl-D-darcosamine.
  • the present invention provides an agent for promoting the growth of epidermal keratinocytes, comprising N-acetyl-D-darcosamine.
  • the growth promoter may further include chitin.
  • an epithelial regeneration promoter comprising the above-mentioned growth promoter.
  • an epithelial protective agent and a skin protective agent containing the above-mentioned growth promoting agent An agent is provided.
  • a wound therapeutic agent containing the growth promoting agent can be provided.
  • the regeneration promoter, protective agent, and therapeutic agent described above may contain a pharmaceutically acceptable carrier and other components.
  • These drug forms may be prepared as a solution, gel, or cream and applied to the wound site. Alternatively, it may be prepared as an injection and injected into the body or locally.
  • the above agents may be used for purposes other than wound treatment.
  • wound treatment for example
  • a protective agent may be contained in cosmetics or the like to give a skin protection or restoration effect.
  • the drug according to the present invention described above can be used for treating any animal such as a human, a domestic animal, and a pet.
  • Human epidermal keratinocytes were cultured in the presence of chitin, chitosan, and their derivatives, and the change in cell proliferation ability was measured.
  • NHEK neonatal foreskin epidermal keratinocytes
  • the medium for measuring the proliferation effect of NHEK is a PSA solution containing penicillin, streptomycin, and amphotericin B in 500 ml of a base medium for human epidermal keratinocytes HuMedia-KB2 (Kurabo Biomedical, Osaka). 1 ml of Kurabo Industries Biomedical, Osaka) and 10% fetal serum (GIBCO, USA) were added together to make 10%.
  • HuMedia-KG2 a growth medium for human epidermal keratinocytes HuMedia-KG2 (Kurabo Biomedical, Osaka) was used.
  • HuMedia-KG2 was added to HuMedia-KB2, a basal medium, as micro-growth factors, insulin from Kurabo Biomedical (final concentration 10 ⁇ g / ml), human recombinant epidermal growth factor (hEGF) (final concentration 0.1 ng).
  • Hyd mouth cortisone 0.5 ⁇ g / ml
  • gentamicin final concentration 50 ⁇ g / ml
  • amphotericin B final concentration 50 ng / ml
  • BPE Pituitary pituitary extract
  • trypsin Kerabo Biomedical, Osaka
  • HEPES Kelparin-phosphate
  • trypsin neutralizing solution Kerabo Biomedical, Osaka
  • Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Tokyo) was used as a reagent for measuring cell proliferation.
  • Chitin is ⁇ -chitin with a molecular weight of about 300,000 and a DAC degree of 8%.
  • N-Acetyl-D-darcosamine powder (Seikagaku Corporation, Tokyo) was dissolved in physiological saline to a concentration of 10 mg / ml, and then passed through a 0.22 ⁇ m Millipore filter (Nippon Millipore Limited, Tokyo). A solution sterilized by filtration was used as a stock solution. This stock solution was diluted to 1000, 100, 10, 1 / z g / ml with sterile physiological saline before use.
  • Chitosan had a molecular weight of about 80,000 and a DAC degree of 82%.
  • a 1 to 6-mer chitosan oligosaccharide mixed powder (Yaitsu Fisheries Chemical Industry Co., Ltd., Shizuoka) was dissolved in physiological saline to a concentration of 10 mg / ml, and a 0.22 m Millipore filter (Nippon Millipore) was dissolved. (Mitted, Tokyo) was used as a stock solution.
  • This stock solution with sterile saline (Yaitsu Fisheries Chemical Industry Co., Ltd., Shizuoka) was dissolved in physiological saline to a concentration of 10 mg / ml, and a 0.22 m Millipore filter (Nippon Millipore) was dissolved. (Mitted, Tokyo) was used as a stock solution. This stock solution with sterile saline
  • D Dalcosamine powder (Koyo Chemical, Tokyo) was dissolved in physiological saline to a concentration of 10 mg / ml, and sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m Millipore filter (Nippon Millipore Limited, Tokyo) to obtain a stock solution. .
  • This stock solution was diluted with physiological saline to 1000, 100, 10, 1 ⁇ g / ml and used.
  • the culture medium is aspirated at the stage where the cells have grown to subconfluence (60-80% of the flask bottom area), the inside of the container is washed using HEPES, and 2 ml of trypsin is added. Then, the cells were detached from the bottom of the container. The detached cells were collected by HEPES, placed in a neutralizing solution to stop the trypsin reaction, and then precipitated by centrifugation (1100 rpm, 5 minutes), and the supernatant was discarded.
  • the collected cells are resuspended in a growth medium, the number of viable cells is counted by a trypan blue elimination test, and the cells are transferred to another culture flask so that the number of viable cells is 2,500 cells / cm3 with respect to the flask bottom area. Transplanted.
  • each chitin-based sample and each chitosan-based sample adjusted to each concentration were added to each well of the multiplate by 101.
  • the final concentration of each sample The degrees are 100, 10, 1, 0.1 ⁇ g / ml, respectively. 37 ° C, 5% CO, in a humid environment
  • a calibration curve was created by the following method. First, prepare a cell suspension adjusted to have a cell count power per well of S30,000, 15,000, 7,500, and 3,750 cells, inoculate each well of a 96-well multiplate, and grow for 12 hours. went. After the culture, cell counting kit-8 was added, and the absorbance was measured 4 hours later.
  • the time required for the coloration of the cell number measurement reagent WST-8 is 1 to 4 hours, but the optimal time varies depending on the type of cell and the environment. Therefore, changes in absorbance with the standing time after addition of the cell number measurement reagent WST-8 were examined using a control. The results are shown in Table 1 and FIG. As is clear from FIG. 1, the color intensity increased and the absorbance increased over time.
  • the value obtained by subtracting 3,000 cells, which was the number of cells at the time of seeding, from the number of cells obtained using this calibration curve was defined as the number of proliferating cells (cells / well).
  • Table 3 and FIG. 3 show the results obtained by adding the chitin-based sample and performing main culture for 24 hours.
  • Chitin 0.1 ⁇ g / ml, NACOS 100 ⁇ g / ml, and GlcNAc 1, 10, 100 ⁇ g / ml each showed a significant growth stimulating activity compared to the control (p ⁇ 0.05).
  • Table 4 and FIG. 4 show the results obtained by adding the chitosan-based sample and performing main culture for 24 hours.
  • Chitosan 10, 100 ⁇ g / ml and COS g / ml each showed a significant growth inhibitory effect compared to the control (p ⁇ 0.05).
  • Table 5 and FIG. 5 show the results of adding the chitin sample and performing main culture for 48 hours.
  • GlcNAc 1, 10, 100 ⁇ g / ml each showed a significant growth stimulating effect as compared to the control (P 0.05).
  • Table 6 and FIG. 6 show the results of adding the chitosan-based sample and performing main culture for 48 hours. At all concentrations of chitosan (0.1, 1, 10, 100 g / ml), a significant growth-inhibitory effect was shown as compared to the control (P ⁇ 0.05). On the other hand, GlcN showed a significant growth stimulating effect at 1 mg / ml (p ⁇ 0.05).
  • GlcNAc and GlcN showed a significant cell proliferation ability stimulating effect as compared with the control.
  • GlcNAc exhibited excellent epidermal keratinocyte proliferation ability and had a skin epithelium regeneration effect Is recognized.
  • Chitosan also showed a significant cell growth inhibitory effect compared to the control.
  • both chitin-based and chitosan-based samples showed a tendency for the cell growth stimulating effect to increase as the molecular weight force S became smaller.
  • the chitin-based sample and the chitosan-based sample had stronger strength. A tendency to show cell growth stimulating effect was observed
  • GlcNAc was used clinically and its effect was verified.
  • GlcNAc was sprayed together with chitin on dogs whose whole body was burned by the fire.
  • the subject was a 2-year-old female miniature Dattashund, weighing 3.8 kg, with a third-degree burn on the left flank, a third-degree burn on the right thigh, and a second-degree burn on all paws. And 90% of the face had a third-degree burn.
  • the drugs used were chitin powder (Sun Five Co., Ltd.), GlcNAc (Seikagaku Corporation), Kite Fine (Meiji Seika Co., Ltd.), and chitin cream (Chitosan Co., Ltd.). (stock)
  • the second hospital day removes the facial-auricular necrosis skin was coated chitin, Isodine, antibiotics, GlcNAc solvent solution (10 mg / cm 2).
  • the third-degree burn of the left abdomen was about 5.4cm x 11.3cm, but reduced to about 5cm x 9.0cm on the sixth day, and granulation was observed.
  • the entire wound was reduced to about 4 cm x 6 cm, and granulation hyperplasia and skin epithelial neogenesis were observed.
  • the entire wound shrank further to about 2.3 cm X 6 cm.
  • the entire wound was further reduced, scars were observed, and further hair growth was observed.
  • the above-mentioned left abdominal wound area was 75%, 25%, and 10% on the 8th, 18th, and 26th days, respectively, when the area on the first day was 100. (Figure 7).
  • the third degree burn wound on the right thigh showed necrosis of the surrounding tissue and was approximately 3.3cm x 9.85cm.
  • wound shrinkage, granulation hyperplasia, and skin epithelial neogenesis were observed.
  • the entire wound shrank to about 2.3 cm X 6.0 cm.
  • the entire wound was reduced to approximately 0.5 cm X 9.4 cm, scar formation was observed, and hair growth was observed.
  • the wound area of the right thigh is 90%, 65%, and 30% on the 8th, 18th, and 26th days, respectively, assuming that the area on the first day is 100. ( Figure 8).
  • chitin and chitosan be administered in the early stage of the wound and not newly administered in the late stage of the wound.
  • GlcNAc By administering GlcNAc during the epithelialization phase, it is possible to enhance the proliferation of epidermal keratinocytes and promote skin regeneration, thereby suppressing scar formation and quickly Skin regeneration treatment is possible.
  • mice Eight BALB / c, female, 8-week-old mice weighing 20 to 25 g were used. A one-week acclimatization period was allowed for the experiment.
  • N-Acetyl-D-darcosamine (GlcNAc) powder (Seikagaku Corporation, Tokyo) was dissolved in physiological saline to a concentration of 10 mg / ml, and sterilized by filtration through a 0.22 m Millipore filter. The solution was diluted to 10 ⁇ g / ml with sterile physiological saline before use.
  • Gelled chitin (Chitosanco Co., Ltd., Tokyo). Hereinafter, it is referred to as "chitin gel”.
  • V Physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokushima) was used as a control.
  • Staining method The skin defect repair site was sampled and fixed with a 10% neutral buffered formalin aqueous solution (formaldehyde solution). After the repair site was cut out so as to have a vertical section, it was embedded in paraffin as usual and sliced into 5 m sections using a microtome. Hematoxylin and eosin were stained by double staining.
  • GlcNAc also showed a skin regeneration effect in mice, and the effect was better than that of saline or chitin gel. Histologically, it was confirmed that GlcNAc caused more complete tissue regeneration. Since epithelialization was promoted by mixing GlcNAc with chitin gel, it was considered that GlcNAc-added chitin gel would be effective for the treatment of deep and wounds.

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Abstract

　本発明は、各種キチン誘導体の表皮再生効果を明らかにし、臨床において有効に使用できる創傷の治療又は処置のための薬剤を提供することを目的とする。 　本発明によって、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンが表皮角化細胞の増殖を促進させる効果を有することが明らかになった。従って、本発明によれば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを含む表皮角化細胞の増殖促進剤が提供される。また、本発明の他の態様に従えば、該増殖促進剤を含む上皮、皮膚又は真皮の再生促進剤及び保護剤が提供される。さらに、創傷の治療薬が提供される。

Description

明 細 書
創傷の治療又は処置のための薬剤
技術分野
[0001] 本発明は、創傷の治療又は処置のための薬剤に関する。詳細には、 N ァセチル
D ダルコサミンを含む表皮角化細胞の増殖促進剤、並びに、該増殖促進剤を含 む上皮の再生促進剤及び保護剤に関する。
背景技術
[0002] 創傷治癒過程は、主に凝固止血期、炎症期、増殖期、再構築期 (再上皮形成期） の 4ステージに分類される。創傷部位を早く且つ瘢痕の少ない状態に治癒させるた めには、これらのステージの速やかな進行と次のステージへの円滑な移行が重要で ある。たとえば炎症期がいつまでも長引いたり、増殖期に過剰の肉芽組織が形成さ れたりすることにより、創傷治癒の遅延や疼痛、瘢痕形成が生じる。
[0003] 一般に、キチンやキトサンは創傷に適した治療薬として使用されている。しかし、キ チンやキトサンによる治癒促進メカニズムが解明されていないために、その効率的な 使用法が未だに確立されて!、な!、。
[0004] キチンおよび各種キチン誘導体は、止血期、炎症期、増殖期の各ステージに関わ る細胞に対して、なんらかの影響を及ぼすことが知られている。しかし、創傷治癒過 程の最終ステージである上皮形成に関しては、 Howlingらが研究の一部でわずかに 触れたのみである。 Howling,G丄， Dettmar.P.W., Goddard.P.A., Hampson.F.C, Dornish.M., and Wood, E.J. 2001. The effect of chitin and chitosan on the proliferation of human skin fibroblasts and keratinocytes in vitro. Biomaterials. 22： 2959-2966には、キチンは表皮を形成する基底細胞に作用せず、また、キトサンは表 皮角化細胞の増殖能を抑制すると記載されている。
[0005] さらにキチンやキトサンは生分解を受けるため、様々な段階の分解産物も創傷治癒 に関連すると考えられる力 この点に関しては特に言及されていない。
発明の開示
[0006] 本発明は、各種キチン誘導体の上皮再生効果を明らかにし、臨床において有効に 使用できる上皮再生促進剤等の薬剤を提供することを目的とする。
[0007] 本発明によれば、 N-ァセチル -D-ダルコサミンを含む表皮角化細胞の増殖促進剤 が提供される。さらに、該増殖促進剤を含む上皮再生促進剤、上皮保護剤及び創傷 治療薬が提供される。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]図 1は、 WST— 8添加後の細胞培養時間と吸光度を表す図である。
[図 2]図 2は、吸光度と生細胞数の関係図である。
[図 3]図 3は、キチン系サンプル添加後 24時間の細胞増殖数を示す図である。
[図 4]図 4は、キトサン系サンプル添加後 24時間の細胞増殖数を示す図である。
[図 5]図 5は、キチン系サンプル添加後 48時間の細胞増殖数を示す図である。
[図 6]図 6は、キトサン系サンプル添加後 48時間の細胞増殖数を示す図である。
[図 7]図 7は、ィヌの左側創傷面積の推移を示す図である。
[図 8]図 8は、ィヌの右側大腿部創傷面積の推移を示す図である。
[図 9]図 9は、皮膚欠損マウスの写真である。
[図 10A]図 10Aは、キチンゲルを塗布して 8日後のマウスの写真である。
[図 10B]図 10Bは、キチンゲル +GlcNAcを塗布して 8日後のマウスの写真である。
[図 10C]図 10Cは、 GlcNAcを塗布して 8日後のマウスの写真である。
[図 10D]図 10Dは、生理食塩水を塗布して 8日後のマウスの写真である。
[図 11]図 11は、各サンプルを塗布して 16日後のマウスの写真である。
[図 12]図 12は、生理食塩水を塗布したマウスの皮膚組織の写真である。
[図 13]図 13は、キチンゲルを塗布したマウスの皮膚組織の写真である。
[図 14]図 14は、キチンゲル + GlcNAcを塗布したマウスの皮膚組織の写真である。
[図 15]図 15は、 GlcNAcを塗布したマウスの皮膚組織の写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明者らは、キチンおよびキトサン、並びにそれらのオリゴ糖ゃ単糖等の各種キ チン誘導体を用い、表皮角化細胞の増殖能に対する直接的作用、およびその濃度 による影響を調査した。また、皮膚に創傷を負った動物において、それらが皮膚再生 に与える影響を調査した。 [0010] その結果、キチンモノマーである N-ァセチル -D-ダルコサミンに明瞭な表皮角化細 胞の増殖効果が認められた。また、動物の創傷における皮膚再生を促進させる効果 があることが分かった。 N-ァセチル- D -ダルコサミンは現在までに甘味料としての応 用が報告されているが、生体再生効果があることは全く知られておらず、このような作 用は本発明者らによって初めて報告されるものである。
[0011] なお、一般的に創傷とは、身体の外側力も刃物などによって加えられた傷を意味す る力 本明細書においては、火傷、凍傷による皮膚の損傷を含める。
[0012] 以下の実施例 1に示したように、 N-ァセチル -D-ダルコサミンは、インビトロ実験に おいて明瞭な表皮角化細胞の増殖効果を示した。
[0013] さらに、実施例 2に記載したように、皮膚の大欠損を起こしたィヌに施用したところ、 理想的な皮膚再生効果が認められた。このィヌは、第 III度の熱傷を負っていた。第 III 度の熱傷は、皮膚組織が欠損しているため、通常であれば皮膚移植が必要な程度 の熱傷である。し力しながら、 N—ァセチル— D—ダルコサミンを処置したことにより、 速やかに皮膚が再生した。従って、 N—ァセチルー D—ダルコサミンは、上皮、特に 皮膚の再生を促進する効果を有することが示された。
[0014] さらに、実施例 3に記載したように、人工的に創傷を作製したマウスに N—ァセチル —D—ダルコサミンを処置したところ、速やかに皮膚が再生した。このマウスの創傷は 、上皮、真皮を完全に切除し、さらに皮下組織も一部を切除したものである。従って、 N—ァセチル -D-ダルコサミンは、皮下組織以上の組織の再生を促進する効果を 有することが示された。よって、 N—ァセチルー D—ダルコサミンは、上皮の再生促進 効果を有し、特に、真皮及び表皮を再生する効果を有することが示された。
[0015] さらに、これらの N—ァセチルー D—ダルコサミンが有する効果から、 N—ァセチル —D—ダルコサミンを含む上皮保護剤、皮膚保護剤を提供することもできる。
[0016] 以上のことから、本発明は、 N-ァセチル -D -ダルコサミンを含む表皮角化細胞の増 殖促進剤を提供する。該増殖促進剤は、さらにキチンを含んでもよい。
[0017] 本発明の他の態様から、前記増殖促進剤を含む上皮再生促進剤、皮膚再生促進 剤、及び真皮再生促進剤が提供される。
[0018] さらに、本発明の他の態様から、前記増殖促進剤を含む上皮保護剤及び皮膚保護 剤が提供される。
[0019] また、さらに他の態様から、前記増殖促進剤を含む創傷治療薬を提供することがで きる。
[0020] 以上に示した再生促進剤、保護剤、治療薬は、薬剤的に許容される担体、および 他の成分を含んでもよい。これらの薬剤の形態は、溶液、ゲル状、或いはクリーム状 に調製されて、創傷部位に塗布されてもよい。また或いは、注射剤として調製されて 体内や局所に注入されてもょ ヽ。
[0021] さらに、上記の薬剤は、創傷の治療以外の目的のために使用されてもよい。例えば
、化粧品等に保護剤を含有させ、肌の保護や修復効果を与えてもよい。
[0022] 以上に記載した本発明による薬剤は、例えばヒト、家畜、ペット等の任意の動物に 処置することができる。
実施例
[0023] [実施例 1]
キチンおよびキトサン、並びにそれらの誘導体の存在下でヒト表皮角化細胞を培養 し、細胞の増殖能の変化を測定した。
[0024] く材料〉
ヒト表皮細胞として、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞 (NHEK(F)) (クラボウバイオ メデイカノレ、大阪)を用いた。
[0025] NHEK(F)増殖効果測定用培地は、ヒト表皮角化細胞用基礎培地 HuMedia-KB2 (ク ラボウバイオメディカル、大阪） 500 mlにペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリ シン Bを含有する PSA溶液 (クラボウバイオメディカル、大阪） 1 ml、およびゥシ胎児血 清（GIBCO,USA)を 10 %になるように添カ卩して用いた。
[0026] NHEK(F)増殖用培地は、ヒト表皮角化細胞用増殖培地 HuMedia-KG2 (クラボウバ ィオメディカル、大阪）を用いた。 HuMedia- KG2は、基礎培地である HuMedia- KB2 に、微量増殖因子として、クラボウバイオメディカル社製のインスリン (最終濃度 10 μ g/ml)、ヒト組み換え型上皮成長因子 (hEGF) (最終濃度 0.1 ng/ml)、ハイド口コーチゾ ン (0.5 μ g /ml),抗菌剤としてゲンタマイシン (最終濃度 50 μ g/ml)およびアンフォテ リシン B (最終濃度 50 ng/ml)、ゥシ脳下垂体抽出液 (BPE) (最終濃度 0.4 %V/V)を添 加したものである。
[0027] その他の細胞継代用試薬に、トリプシン (クラボウノィオメディカル、大阪）、 HEPES ( クラボウバイオメディカル、大阪）、及びトリプシン中和液 (クラボウバイオメディカル、 大阪)を用いた。
[0028] 細胞増殖測定用試薬に Cell Counting Kit - 8 (同仁化学、東京）を使用した。
[0029] キチン系サンプルには、以下の 3種を用いた。
a)キチン
無菌的に作製されたキチン懸濁液 Lot No.F9L01Z (原液： 20mg/ml) (サンファイブ（ 株）、鳥取)を、滅菌生理食塩水（大塚製薬、東京)を 1000, 100, 10, 1 /z g/mlに希釈 して使用した。キチンは α -キチンで、分子量約 30万、 DAC度は 8 %であった。
[0030] b)キチンオリゴマー（NACOS)
1〜6量体のキチンオリゴ糖混合粉末 (焼津水産化学工業 (株)、静岡)を 10 mg/ml になるように生理食塩水に溶解した後、 0.22 mのミリポアフィルター（日本ミリポアリ ミテッド、東京)で濾過滅菌したものを原液とした。この原液を滅菌生理食塩水で 1000, 100, 10, 1 /z g/mlに希釈して使用した。
[0031] c)キチンモノマー（N-ァセチル- D -ダルコサミン、 GlcNAc)
N-ァセチル -D-ダルコサミン粉末 (生化学工業 (株）、東京）を 10 mg/mlになるように 生理食塩水に溶解した後、 0.22 μ mのミリポアフィルター（日本ミリポアリミテッド、東 京）で濾過滅菌したものを原液とした。この原液を滅菌生理食塩水で 1000, 100, 10, 1 /z g/mlに希釈して使用した。
[0032] キトサン系サンプルには、以下の 3種を用いた。
a)キトサン
無菌的に作製されたキトサン懸濁液 Lot No.G9L02(原液: 20mg/ml) (サンファイブ（ 株）、鳥取）を、滅菌生理食塩水で 1000, 100, 10, 1 /z g/mlに希釈して使用した。キト サンは分子量約 8万、 DAC度は 82 %であった。
[0033] b)キトサンオリゴマー（COS)
1〜6量体のキトサンオリゴ糖混合粉末 (焼津水産化学工業 (株)、静岡)を 10 mg/ml になるように生理食塩水に溶解した後、 0.22 mのミリポアフィルター（日本ミリポアリ ミテッド、東京)で濾過滅菌したものを原液とした。この原液を滅菌生理食塩水で
1000, 100, 10, 1 /z g/mlに希釈して使用した。
[0034] c)キトサンモノマー（D -ダルコサミン、 GlcN)
Dダルコサミン粉末（甲陽ケミカル、東京）を 10 mg/mlになるように生理食塩水に溶 解した後、 0.22 μ mのミリポアフィルター（日本ミリポアリミテッド、東京)で濾過滅菌し たものを原液とした。この原液を生理食塩水で 1000, 100, 10, 1 μ g/mlに希釈して使 用した。
[0035] コントロールとして、滅菌生理食塩水 (大塚製薬、東京)を使用した。
[0036] <方法 >
(1)正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞の培養、および細胞懸濁液の作製 細胞は、増殖用培地および培養用フラスコ（Lot No.055522) (Nalge Nunc International, Denmark)を用いて、 37 °C、 5 % CO、湿潤環境下で培養し、 4次培養
2
まで継代したものを実験に用いた。
[0037] 継代時は、細胞がサブコンフルェント（フラスコ底面積の 60〜80 %)まで増殖した段 階で培地を吸引したのち、 HEPESを用いて容器内を洗浄し、トリプシンを 2 ml添加し て細胞を容器底面より剥離した。剥離した細胞を HEPESで回収し、中和液内に入れ てトリプシンの反応を停止させた後、遠心分離 (1100 rpm , 5分)により沈殿させ、上清 は廃棄した。回収した細胞を増殖用培地に再浮遊させ、トリパンブルー排出試験によ り生細胞数を計数した後、フラスコ底面積に対して生細胞が 2,500 cells/cm3となるよ うに別の培養用フラスコに移植した。
[0038] 測定には、遠心分離後、測定用培地で再浮遊させ、 30,000細胞/ mlに調整した細 胞懸濁液を用いた。
[0039] (2)細胞増殖測定アツセィ
まず、 96ウェルマルチプレート（住友ベークライト、東京）の各ゥヱルに、（1)で調整 した細胞懸濁液を 100 μ 1ずつ、 3,000細胞 Ζゥエルで播種した。播種細胞を安定さ せるため、 37°C、 5% CO、湿潤環境下において、 12時間の前培養を行った。
2
[0040] 次に、マルチプレートの各ゥエルに、各濃度に調整したキチン系の各サンプル及び キトサン系の各サンプルを 10 1ずつ添カ卩した。この操作による各サンプルの最終濃 度はそれぞれ、 100, 10, 1, 0.1 μ g/mlである。 37 °C、 5% CO、湿潤環境下において
2
、 24時間もしくは 48時間の本培養を行った。
[0041] 本培養中に増殖した細胞数を計測するため、マルチプレートの各ゥ ルに細胞数 測定用試薬（cell counting kit)WST- 8を 10 μ 1ずつ添カ卩して、 37°C、 5% CO、湿潤
2 環境下に 1〜4時間静置し呈色させた。呈色後、イージー 'リーダー（EASY READER) EAR340AT (Medi-Con Corporation、大阪）を用いて吸光度を計測した。計測データ の数値処理および統計は、表計算ソフト (マイクロソフト 'エタセル xp (登録商標））を 使用した。
[0042] (3)吸光度と細胞数との関連
吸光度と細胞数との関連を明らかにするために、検量線を以下の方法で作成した。 まず、 1ゥエルあたりの細胞数力 S30,000, 15,000, 7,500, 3,750 cellになるように調整 した細胞懸濁液を作製し、 96ウェルマルチプレートの各ゥヱルに播種して 12時間の培 養を行った。培養後 cell counting kit-8を添加し、 4時間後吸光度を測定した。
[0043] [表皮角化細胞増殖アツセィにおける基礎的検討]
細胞数測定用試薬 WST-8の呈色に要する時間の決定：
細胞数測定用試薬 WST-8の呈色に要する時間は 1〜4時間とされて 、るが、細胞 の種類や環境によってその最適時間は異なる。そこで、コントロールを用いて細胞数 測定用試薬 WST-8添加後の静置時間による吸光度の変化を調べた。その結果を表 1及び図 1に示す。図 1より明らかなように、時間の経過に伴って呈色は強さを増し、 吸光度は上昇した。
WST-8添加後の培養時間による変化
Figure imgf000009_0001
[0044] この成績から、細胞数測定用試薬 WST-8添加後の静置時間は 4時間とした。 吸光度と細胞数との関連：
細胞数と吸光度は比例的な相関関係を示し（図 2、表 2)、このグラフより検量線 n = 17808a— 900.12 ( R2 = 0.9848 )
{ n： 1ゥ ルあたりの細胞数， a：吸光度 }
が得られた。この検量線を用いて求めた細胞数から、播種時の細胞数である 3,000 細胞を引いたものを、増殖細胞数（cells/well)とした。
[表 2]
表 2 各ゥエルの吸光度と生細胞数の関係
Figure imgf000010_0001
<結果 >
ヒト表皮角化細胞増殖アツセィ：
キチン系サンプルを添カ卩し、 24時間本培養を行った結果を表 3及び図 3に示す。キ チン 0.1 μ g/ml、 NACOS 100 μ g/ml、 GlcNAc 1, 10, 100 μ g/mlでそれぞれコント口 ールと比べて有意な増殖刺激活効果を示した (pく 0.05)。
[表 3]
キチン系サンプル添加後 24時間の細胞増殖数
Figure imgf000010_0002
※数値は全て、平均細胞増殖数 (細胞 ウエル）土標準偏差
キトサン系サンプルを添カ卩し、 24時間本培養を行った結果を表 4及び図 4に示す。 キトサン 10,および 100 μ g/ml, COS g/mlでそれぞれコントロールと比較して有意 な増殖抑制効果を示した (p〈0.05)。また、 GlcN 1, 10, 100 g/mlでコントロールに比 較して有意な増殖刺激効果を示した (P〈0.05)。
[表 4]
表 4 キトサン系サンプル添加後 24時間の細胞増殖数
Figure imgf000011_0001
※数値は全て、平均細胞増殖数 (細胞/ゥ Xル）土標準偏差
キチン系サンプルを添加し、 48時間本培養を行った結果を表 5及び図 5に示す。 GlcNAc 1, 10, 100 μ g/mlでそれぞれコントロールと比較して有意な増殖刺激効果 を示した (Pく 0.05)。
[表 5]
表 5 キチン系サンプル添加後 48時間の細胞増殖数
Figure imgf000011_0002
※数値は全て、平均細胞増殖数 (細胞 ゥエル）土標準偏差
キトサン系サンプルを添加し、 48時間本培養を行った結果を表 6及び図 6に示す。 キトサンの全濃度（0.1, 1， 10， 100 g/ml)においてコントロールと比較して有意な増 殖抑制効果が示された (Pく 0.05)。一方、 GlcNは 1 M g/mlで有意な増殖刺激効果を 示した (p<0.05)。
[表 6] 表 6 キ卜サン系サンプル添加後 48時間の細胞増殖数
Figure imgf000012_0001
※数値は全て、平均細胞増殖数 (細胞 Zゥエル） ±標準偏差
[0050] 上記の試験から、 GlcNAc及び GlcNにコントロールと比べて有意な細胞増殖能刺激 作用が認められ、特に GlcNAcは優れた表皮角化細胞の増殖能を示し、皮膚上皮の 再生効果を有することが認められる。またキトサンにはコントロールと比べて有意な細 胞増殖抑制作用が認められた。
[0051] また、キチン系及びキトサン系サンプルは共に、分子量力 S小さくなるにつれて細胞 増殖刺激作用が増強する傾向を示した力 キチン系サンプルとキトサン系サンプル では、キチン系サンプルの方がより強 、細胞増殖刺激作用を示す傾向が認められた
[0052] 以上の結果から、キチンは分解を受ければ受けるほど表皮形成が促進されるが、 一方で生体内分解が比較的緩やかなキトサンは、肉芽増生が著しいものの表皮形 成は抑制されることが理解される。この現象は、臨床的に観察される創傷治癒反応と 全く一致するものである。
[0053] [実施例 2]
GlcNAcを臨床的に使用し、その効果を検証した。
[0054] 火災によって全身に火傷を負ったィヌに対して、キチンと共に GlcNAcを散布した。
被験体は、ミニチュア'ダッタスフントの 2歳の雌、体重 3.8kgで、左側腹部に第 III度 の熱傷創、右側大腿部に第 III度熱傷創、全ての肉球に第 II度熱傷創、及び顔面の 9 0%に第 III度熱傷創を負っていた。
[0055] 熱傷の一般的な治療は、第 II度熱傷では水泡の中に溜まった液体を清潔な針で穴 を開けて抜き、感染を防ぐため抗生物質入りの油性軟膏が塗布される。第 III度熱傷 では、皮膚組織欠損のため原則として皮膚移植が必要であり、感染防止のため強力 な抗菌剤が塗布される。
[0056] 本実施例にお!、て使用した薬剤は、キチン粉末 (サンファイブ (株)）、 GlcNAc (生 化学工業 (株)）、カイトファイン (明治製菓 (株)）、キチンクリーム (キトサンコーヮ (株）
)、及び抗生物質である。
[0057] 第 1病日（初診時）は、熱傷創壊死片を除去し、キチン粉末（10 mg/cm2)、カイトファ イン（100 μ g/cm2)、抗生物質（100 mg/ml)を熱傷部位に散布した。鼻鏡には抗生 物質軟膏を塗布した。
[0058] 第 2病日は、顔面 ·耳介壊死皮膚を除去し、キチン、イソジン、抗生物質、 GlcNAc溶 液（10 mg/cm2)を塗布した。
[0059] 第 3病日以降は、キチン、イソジン、キチンクリーム（1 mg/cm2) (第 19病日以降）、 GlcNAc溶液を塗布した。
[0060] 左側腹部第 III度の熱傷創は、約 5.4cm X 11.3cmであったが、第 6病日には約 5c m X 9.0cmに縮小し、肉芽形成が観察された。第 8病日には、創全体が約 4cmX 6c mに縮小し、肉芽増生と皮膚上皮新生が認められた。第 18病日には、創全体がさら に約 2.3cm X 6cmまで縮小した。第 26病日には、創全体がさらに縮小し、瘢痕か観 察され、さらに発毛が認められた。以上の左側腹部創傷面積は、第 1病日における面 積を 100としたとき、第 8病日、第 18病日、及び第 26病日においてそれぞれ 75%、 25%、および 10%であった（図 7)。
[0061] 右側大腿部第 III度熱傷創は、周辺組織の壊死が見られ、約 3.3cm X 9.85cmであ つた。第 8病日には創の縮小、肉芽増生、皮膚上皮新生が観察された。第 15病日に は、創全体が約 2.3cm X 6.0cmまで縮小した。第 26病日には、創全体が約 0.5cm X 9.4cmに縮小し、瘢痕形成が見られ、発毛が認められた。以上の右側大腿部の創 傷面積は、第 1病日における面積を 100としたとき、第 8病日、第 18病日、及び第 26 病日においてそれぞれ 90%、 65%、及び 30%であった（図 8)。
[0062] 肉球は四足全て第 II度熱傷であつたが、第 18病日には、パット部分の表皮が形成 し、治癒した。
[0063] 顔面は約 90%に第 III度の熱傷創を負っていた。第 6病日には、創全体が縮小し、 キチン痂皮下に皮膚上皮新生が認められた。第 8病日には、顔面の引きつれがやや 見られたが、上眼瞼上皮が形成した。キチンの自然落下が観察された。第 18病日に は、肉芽増生と皮膚上皮新生が見られ、発毛が認められた。第 26病日には、肉芽増 生と皮膚上皮新生が認められ、発毛がさらに観察された。頭部に一部瘢痕が形成さ れた。
[0064] 全体的に、瘢痕収縮が引き起こされず正常な皮膚が再生し、特に顔面の皮膚は完 全な皮膚再生と発毛が認められた。このことから、上記のようなキチン及び GlcNAcを 組み合わせた治療によって、速や力な皮膚再生効果が得られることが示された。従つ て、 GlcNAcを処置することによって、重度の皮膚損傷であっても、皮膚を移植するこ となく治療することが可能となる。
[0065] 通常、瘢痕は創傷面の化膿や線維芽細胞の過度の増殖、ある!、は性急な創傷治 療による不十分な肉芽造成段階での表皮の再生などによって生じる。そこで、創傷 治癒過程の初期から中期において、キトサンを投与し、表皮角化細胞の増殖を抑制 して無駄な角化物が産生されるのを防ぐことによって、瘢痕防止効果が得られるもの と推測される。
[0066] 従って、キチン及びキトサンを創傷初期に投与し、創傷後期には新たに投与しない ことが好ましい。そして、上皮形成期において GlcNAcを投与することによって、表皮 角化細胞の増殖を増強させ、皮膚再生を促進させることが可能であり、これによつて 、瘢痕形成を抑制し、且つ速や力な皮膚再生治療が可能である。
[0067] [実施例 3]
マウスを用いて新鮮皮膚欠損創を作製し、 GlcNAcの皮膚再生促進効果を検討した 。コントロールとして、ゲル状キチン (キトサンコーヮ (株)）及び生理食塩水を用いた。
[0068] <実験材料および方法 >
実験材料
(i)マウス： BALB/c、メス、 8週齢、体重 20〜25gのものを 8頭用いた。実験に際しては 1週間の馴化期間を置いた。
[0069] (ii) N-ァセチル -D -ダルコサミン (GlcNAc)粉末（生化学工業 (株）、東京）を 10mg/ml になるよう生理食塩水に溶解した後、 0.22 mのミリポアフィルターで濾過滅菌したも のを滅菌生理食塩水で 10 μ g/mlに希釈して使用した。 [0070] (iii)ゲル状キチン (キトサンコーヮ (株）、東京)。以下、「キチンゲル」と称す。
[0071] (iv)キチンゲルに GlcNAcを 10 /z g/gになるように調合して使用した。以下「キチンゲ ル +GlcNAc」と称す。
[0072] (V)コントロールとして生理食塩水 (大塚製薬 (株)、徳島)を使用した。
[0073] 実験方法
(i)皮膚欠損モデルの作製：ペントバルビタール（商品名：ネンブタール注射薬）を 10 倍に生理食塩水で希釈後、マウスの腹腔内に 0.005ml/gを投与した。十分な麻酔効 果が得られた事を確認した後、マウス背側皮毛をバリカンで刈り、皮膚をアルコール 消毒した後、 5mmのデルマパンチを用いて直径 5mmの円型の皮膚欠損部位を作製 した（図 9)。これら 8頭のマウスを 2頭ずつ「キチンゲル群」、「キチンゲル +GlcNAc群 」、「GlcNAc群」、「生理食塩水群」とし、各々を毎日 1回塗布した。
[0074] (ii)「キチンゲル群」、「キチンゲル +GlcNAc群」には各々を 0.1g/head、「GlcNAc群」 、「生理食塩水群」には各々を lml/headとなるように、 7日間、皮膚欠損部位に直接塗 した。
[0075] (iii) 8日目以降は、各々を塗布する直前に、形成された痂皮を除去し、上記と同様に 塗布をさらに 8日間行った。
[0076] 肉眼的観察
8日目、 16日目にそれぞれの皮膚損傷修復部位の大きさをノギスを用いて計測した
[0077] 組織学的観察
染色方法：皮膚欠損修復部位を採材し、 10%中性緩衝ホルマリン水溶液 (ホルムァ ルデヒド液)で固定した。修復部位が縦断面になるように切り出しを行った後、定法通 りパラフィン包埋し、ミクロトームによって 5 mに薄切りした。へマトキシリン'ェォジン 重染色によって染色した。
[0078] <結果及び考察 >
肉眼的観察所見
7日目までは創の上力も薬物を滴下、あるいは塗布した。 2〜3日目において、創は 痂皮に覆われて硬化したため、各群とも創の縮小は認められなかった。 8日目から毎 日痂皮を剥離し、薬物の投与を持続した（図 10A〜D)。その結果「キチンゲル群」は 表皮形成が有意に抑制された（図 11)。これは不溶性キチンのゲルが明らかに表皮 形成を物理的に障害したためと考えられる。一方「キチンゲル +GlcNAc群」では、良 好な皮膚形成が生じ、 GlcNAcの皮膚再生効果が認められた。しかし、皮下組織には 過剰な肉芽形成が見られ、キチンゲルによる肉芽形成が、新鮮創では治癒を遅延す る結果になることが示唆された。「GlcNAc群」においては、過剰な肉芽を作ることなく 完全な表皮化が認められ、最も良好な治癒が認められた。「生理食塩水群」において は、過剰な肉芽の形成は見られな力つたものの、表皮形成は完了しな力つた。
[0079] 組織学的観察所見
「生理食塩水群」では、上皮は創の中央部に向かって薄くなつており、中央部では 欠損し、皮膚の連続性は完成していない。炎症の程度は軽度であるが、皮膚構造の 完成度は低い（図 12)。「キチンゲル群」では、表皮の再生は肉芽形成によって阻止 されており、激しい炎症が持続している（図 13)。「キチンゲル +GlcNAc群」では、皮 膚の再生は完了しているが、再生毛包の周囲の炎症細胞浸潤が明瞭に認められた 。再生皮下組織はいまだ肉芽の形態を保ち、完成していない（図 14)。「GlcNAc群」 では、皮膚再生は完了しており、角化の程度も他の群と比較して最も進んでいる。皮 下組織も中央部に僅かの肉芽組織を残す程度で、再生した組織も完成している（図 15)。
[0080] 以上の結果から、 GlcNAcはマウスにおいても皮膚再生効果が認められ、その効果 は生理食塩水、キチンゲルよりも良好であった。組織学的にも GlcNAcはより完全な組 織再生を引き起こすことが確認された。また、キチンゲルに GlcNAcを混合することで 上皮化が促進されたため、深 、創の治療に関しては GlcNAc添加キチンゲルが有効 になると考えられた。
産業上の利用可能性
[0081] 本発明によれば、ィヌ等のペット、家畜、ヒトを含む動物の創傷の治療又は処置に 有効な薬剤を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[I] N-ァセチル -D-ダルコサミン (GlcNAc)を含むことを特徴とする、表皮角化細胞の 増殖促進剤。
[2] さらにキチンを含むことを特徴とする、請求項 1に記載の表皮角化細胞の増殖促進 剤。
[3] 請求項 1又は 2に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする上皮再生促進剤。
[4] 請求項 1又は 2に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする皮膚再生促進剤。
[5] 請求項 1又は 2に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする真皮再生促進剤。
[6] 請求項 1又は 2に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする上皮保護剤。
[7] 請求項 1又は 2に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする皮膚保護剤。
[8] 請求項 1又は 2に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする創傷治療薬。
[9] 表皮角化細胞の増殖剤としての、 N—ァセチルー D—ダルコサミンの使用。
[10] 前記 N—ァセチルー D—ダルコサミンの使用は、上皮再生促進剤、上皮保護剤及 び創傷治療薬の何れかの製造のためのものである、請求項 9に記載の使用。
[II] D—ダルコサミン (GlcN)を含む、表皮角化細胞の増殖促進剤。
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