KR20200099483A

KR20200099483A - 지혈효소(hemostatic enzyme) 및 카르복시메틸 키토산을 포함하는 혈액응고 검사용 조성물 및 그의 용도

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Publication number: KR20200099483A
Application number: KR1020200016467A
Authority: KR
Inventors: 고은혜; 우용제; 김종탁; 서문영; 조길상; 김경수
Original assignee: 주식회사 앤씨비아이티
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2020-08-24
Also published as: KR102154079B1; EP3926343A4; EP3926343A1

Abstract

본 발명은 혈액응고 검사용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지혈효소(hemostatic enzyme) 및 카르복시메틸 키토산을 포함하는 혈액응고 검사용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 혈액응고 검사용 조성물은 지혈효소의 활성 및 응괴 강도를 향상시켜 피브린 형성속도를 증가시켜 높은 민감도와 빠른 속도로 혈액응고 검사를 수행할 수 있어 유용하다.

Description

지혈효소(hemostatic enzyme) 및 카르복시메틸 키토산을 포함하는 혈액응고 검사용 조성물 및 그의 용도{Composition for Blood Coagulation Test Comprising Hemostatic Enzyme and Carboxymethyl Chitosan and Uses Thereof}

본 발명은 혈액응고 검사용 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지혈효소(hemostatic enzyme) 및 카르복시메틸 키토산을 포함하는 혈액응고 검사용 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

피브리노겐과 트롬빈은 혈관 손상 후의 지혈에 관여하고 혈괴 형성에 필수적인 중요한 단백질들이다. 피브리노겐과 트롬빈은 전형적인 응괴(clot) 형성 반응을 개시하지 않고서 분말 형태 또는 비수성 현탁액에서 배합될 수 있기 때문에, 단백질이 용해될 수 있는 수성 매질 또는 다른 액체 환경속에서 이들 단백질을 수화하기 전까지는 피브린 응괴의 형성을 방지할 수 있다. 이들 단백질의 분말 형태의 혼합물은 국소적 지혈, 조직 복구, 약물 전달 등을 포함하는 다양한 잠재적 생의학 용도를 갖는다. 또한, 이들 단백질의 혼합물은 분말 형태로 캐리어(carrier) 또는 기질, 또는 다른 의료 장치 위에 로딩(loading)되어 예컨대 지혈 장치로서 사용될 수 있는 제품을 형성할 수 있다.

피브리노겐은 가장 흔하게는 응괴 형성의 속도를 기준으로 피브리노겐 기능성을 측정하는, 클라우스(Clauss)가 창시한 방법에 의해 측정된다. 전형적인 클라우스 분석법에서는 미지량의 용해성 피브리노겐을 함유하는 시료를 과량의 트롬빈과 함께 배합한다. 이러한 피브리노겐과 트롬빈의 비율에서는 피브리노겐이 속도 제한 반응물이고 응괴 형성 속도는 피브리노겐 농도의 함수가 된다. 빠른 응괴 형성 시간은 피브리노겐의 농도가 높음을 나타낼 것이다. 반대로, 긴 응괴 형성 시간은 기능성 피브리노겐의 농도가 낮음을 나타낼 것이다. 기능성 피브리노겐의 양은 시료의 응괴 형성 시간을 표준 곡선의 작성을 위한 일련의 표준물들의 응괴 형성 시간과 비교함으로써 정량할 수 있다. 시료 중의 피브리노겐의 농도는 표준물들의 응괴 형성 시간으로부터 얻은 방정식을 토대로 하여 수학적으로 측정할 수 있다.

Instrument Lab. 社의 Fibrinogen C 시약은 상기 원리의 피브리노겐의 농도를 검출할 수 있는 진단시약이지만 민감도가 낮은 문제점이 있다.

한편, 뱀독이 사람을 포함한 포유류의 혈액 응고계 및 혈전 용해계에 미치는 영향은 오래 전부터 많이 연구되어 왔으며, 다수의 유효 성분들이 분리되고 그 활성이 규명되었다. 뱀독을 구성하는 여러 가지 성분들은 피브린 응고(fibrin clotting) 또는 혈소판 응집 등에 직간접적으로 영향을 주어 응고 촉진제(pro-coagulant)로서 혹은 항응고제(anticoagulant)로서의 기능들을 가지고 있음이 알려져 있다(Meaume, J. Toxicon, 4:2558(1966); Matsuiet al., Biochim. Biophys. Acta., 1477: 146-156(2000)). 이들 중 일부 성분들은 혈전증의 진단 및 치료에 광범위하게 사용되고 있다. 그 중 피브리노-펩타이드를 절단하여 피르리노겐을 피브린으로 전환시키는 트롬빈유사 효소(thrombin-like enzyme)들이 현재까지 20여종 이상 보고 되었고 일부는 cDNA 서열까지 규명되었다.

트롬빈 유사 효소의 작용은 포유류 본래의 혈액 응고 단백질인 트롬빈과 달리 초기에는 피브리노겐 분자의 피브리노펩타이드 A를 가수분해하여 des-A-피브린이라는 불안정한 피브린 응괴(fibrin clot)를 형성하지만, 시간이 지나면서 이 불안정한 피브린 응괴는 생체내의 혈전용해계(fibrinolysis system)가 작동되면서 빠르게 분해되어 결과적으로 혈중의 피브리노겐 농도를 감소시킨다(Pirkle, H., and Stocker, K. Thromb. Haemost. 65:444-450(1991); Marsh, N.A., Blood Coagul. Fibrinolysis, 5:339-410(1994)).

실제 임상에서는 이러한 양면적인 효소 특성을 이용하여 지혈제로도 사용하기도하고 혈전의 예방 및 치료제로도 응용하고 있다. 또한, 이 효소는 혈액 내의 다른 응고 인자 등에는 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 혈소판의 활성화에도 영향을 미치지 않는 장점이 있어, 수술 1-2 시간 전에 소량(2 NIH unit/60 kg)을 근육 및 정맥 주사하면 효과적인 지혈 활성을 나타낸다. 반면에 효소의 투여량과 투여 시간을 조절함에 따라 혈중 내 피브리노겐 농도를 혈전 용해 효소를 사용할 때 생길 수 있는 출혈과 같은 부작용이 없이 낮출 수 있고, 이과정에서 형성된 des-A-피브린과 FDP(fibrinogen degradation products)의 방출로 혈관 내피 세포를 자극하여 플라스미노겐 활성자의 생성을 유도하며, 트롬빈의 활성을 억제하여 혈전증의 예방과 치료에도 사용되고 있다(Schumacher et al., Thromb. Res. 81:187-194(1996); 및 Bell W. R. Jr., Drugs, 54:18-30(1997)).

임상에 실제로 사용되고 있는 트롬빈 유사 효소들은 모두 뱀독에서 분리 정제한 천연형의 단백질들로서 가장 대표적인 것이 중남미 독사인 Bothrops atrox moojeni의 독으로부터 분리한 배트록소빈이다. 스위스 Pentapharm 사에서 독점 판매하고 있으며, reptilase(지혈용), defibrase(혈전 용해용), reptilase-reagent (진단 시약용) 등의 상품명으로도 시판되고 있다. 또한 중남미 독사인 Bothrops jararaca의 독에서 정제한 botropase(지혈용,이탈리아 Ravizza 사), Malayan pit viper와 Calloselasma rhodostoma의 독에서 분리한 ancrod(미국 Knoll Pharmacetical 사) 등도 판매되고 있다.

또한 최근에는 수술시의 출혈방지 및 봉합목적의 자가 피브린 접합제(autologous fibrin sealant)에 배트록소빈을 이용한 Vivostat System(덴마크, Vivosolution사) 등이 각광을 받고 있다.

한국특허 제10-1901150호에서는 당쇄화(glycosylation)된 재조합 배트록소빈으로 이루어진 재조합 배트록소빈 혼합 조성물 및 이를 포함하는 지혈용 조성물에 대해 개시하고 있으나, 재조합 배트록소빈을 이용하여 혈액응고 검사에 사용하는 방법은 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고, 높은 민감도를 가지는 혈액응고 검사용 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 지혈효소(hemostatic enzyme)와 카르복시메틸 키토산을 포함하는 조성물을 이용하여 피브리노겐의 농도를 측정할 경우, 높은 민감도와 정확도로 피브리노겐의 농도를 검출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 혈액응고 검사용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 피브리노겐 농도 측정방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 조성물을 이용한 항응고 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지혈효소(hemostatic enzyme) 및 카르복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan, CMCS)을 포함하는 혈액응고 검사용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, a) 상기 조성물을 혈청 함유 샘플에 첨가하여 응괴(clot) 형성 속도를 측정하는 단계; 및 b) 응괴 형성 속도로부터 피브리노겐 농도를 도출하는 단계를 포함하는 피브리노겐 농도 측정 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, a) 피브리노겐을 포함하는 혈청 함유 샘플에 지혈호소 및 카르복시메틸 키토산을 첨가하는 단계; b) 상기 혼합물에 후보물질을 첨가하는 단계; c) 응괴(clot) 형성시간을 측정하는 단계; 및 d) 응괴 형성시간이 후보물질을 첨가하지 않은 대조군에 비하여 증가하는 후보물질을 항응고 물질로 선별하는 단계 포함하는 항응고 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 혈액응고 검사용 조성물은 지혈효소(hemostatic enzyme)의 활성 및 응괴 강도를 향상시켜 피브린 형성속도를 증가시켜 높은 민감도와 빠른 속도로 혈액응고 검사를 수행할 수 있어 유용하다.

도 1은 지혈효소(hemostatic enzyme)와 카르복시메틸 키토산의 조합에 따른 시너지효과를 확인한 그래프로, (A)는 혈장에서 응괴(clot)시간을 비교한 그래프 이고, (B)는 피브리노겐에서 응괴(clot) 시간을 비교한 그래프이며, (C)는 rTLH 농도별 응괴(clot)시간을 나타낸 그래프이고, (D)는 CMCS 농도별 응괴(clot)시간을 나타낸 그래프이다.
도 2는 다양한 종류의 지혈효소(재조합 지혈효소(rTLH), 천연형 배트록소빈(nBat), 트롬빈(Thrombin), 보트로파제(Botropase), 앵크로드(Ancrod), 수링(Suling)의 혈장응괴시간(A) 및 피브리노겐(B) 시간을 측정한 결과로서, 효소 단독 및 카르복시메틸 키토산을 포함하는 효소 조성물을 비교한 결과이다.
도 3은 카르복시메틸 키토산의 유무에 따라 재조합 지혈효소에 의해 피브리노겐 알파 사슬(α-chain)이 잘리는 시간을 확인한 결과이다.
도 4는 합성기질을 이용하여 카르복시메틸 키토산에 따른 재조합 지혈효소(rTLH)의 활성을 측정한 결과로서, (A)는 재조합 지혈효소의 활성정도를 나타낸 그래프이고, (B)는 정량적으로 측정한 수치를 정리한 표이다.
도 5는 재조합 지혈효소의 응괴(clot) 형성 강도를 카르복시메틸 키토산의 농도에 따라 측정한 결과로서, (A)는 응괴 형성정도를 나타낸 그래프이며, (B)는 정량적 수치를 나타낸 표이다
도 6은 본 발명에 따른 재조합 지혈효소 및 카르복시메틸 키토산을 이용하여 피브리노겐 농도를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 재조합 지혈효소 및 카르복시메틸 키토산 함유 조성물에 염화칼슘을 추가하여 피브리노겐 농도를 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 재조합 지혈효소 및 카르복시메틸 키토산 함유 조성물에 염화칼슘을 추가하여 혈청 내 낮은 농도의 피브리노겐을 검출한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 재조합 지혈효소 및 카르복시메틸 키토산 함유 조성물을 이용하여 피브리노겐을 측정할 때, 결과값에 영향을 줄 수 있는 간섭 인자인 헤모글로빈, 빌리루빈, 헤파린 등을 함량별로 플라즈마에 첨가하여 피브리노겐 농도를 검출한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 재조합 지혈효소 및 카르복시메틸 키토산 함유 조성물로 측정한 피브리노겐 측정값이 국제표준물질의 결과값과 일치하는지 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는, 지혈효소(hemostatic enzyme)와 카르복시메틸 키토산을 함유한 조성물을 이용하여 혈액응고 검사를 수행할 경우, 높은 민감도와 빠른 속도로 혈액응고 검사를 수행할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는, 카르복시메틸 키토산이 지혈효소(hemostatic enzyme)의 효소활성과 응괴 강도(clot strength)를 향상 시킨다는 것을 확인하고(도 1 내지 도 5), 트롬빈유사효소(TLE; Thrombin-like Enzyme) 및 카르복시메틸 키토산을 포함하는 조성물을 이용하여 피브리노겐 농도를 측정할 경우, 상용 제품보다 낮은 농도의 피브리노겐을 검출할 수 있다는 것을 확인하였다(도 6 내지 도 8).

따라서, 본 발명은 일관점에서,

지혈효소(hemostatic enzyme) 및 카르복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan, CMCS)을 포함하는 혈액응고 검사용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 지혈효소(hemostatic enzyme)는 지혈효과를 나타내는 효소이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 천영형 또는 재조합 트롬빈 유사효소(Thrombin like enzyme, TLE) 또는 천연형 또는 재조합 지혈효소(rTLH; recombinant Thrombin-like Hemocoagulase)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 트롬빈, 재조합 배트록소빈, 천연형 배트록소빈(nBat), 트롬빈(Thrombin), 보트로파제(Botropase), 앵크로드(Ancrod) 및 수링(Suling)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "재조합 배트록소빈"은 천연형 배트록소빈의 cDNA 서열을 변형시켜 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)에서 제조한 배트록소빈을 의미하며, 이의 제조방법은 공개특허 WO2009/084841에 상세히 개시되어 있으며, 상기 공개특허 문헌은 본 발명에 참조로서 삽입된다.

본 발명에서 용어 "BU"는 배트록소빈 단위(Batroxobin unit)을 의미하며, 2 BU는 혈장을 19 ± 0.2 초에 굳히는 양을 의미한다. BU는 천연형 배트록소빈(NIBSC)의 역가 스탠다드 그래프를 통하여 역가 계산이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 혈액응고 검사는 혈액응고 반응과 관련된 검사이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 트롬빈 시간 (Thrombin time, TT) 측정, 렙틸레이즈 시간 (Reptilase time) 측정 및 피브리노겐(fibrinogen) 농도 측정으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 트롬빈 시간은 표준화된 양의 트롬빈을 혈장에 첨가한 후 응괴가 형성될 때까지의 시간을 측정하는 방법이며, 이때의 트롬빈을 본 발명의 조성물로 대체할 수 있다. 본 발명의 조성물을 사용하면 헤파린, 아스피린 등과 같은 항응고제의 영향을 받지 않는다.

본 발명에서 렙틸레이즈 시간은 배트록소빈을 혈장에 첨가한 후 응괴가 형성될 때까지의 시간을 측정하는 방법으로 이때의 배트록소빈을 본 발명의 조성물로 대체할 수 있으며, 항응고제의 영향을 받지 않는다.

본 발명에서 피브리노겐 농도는 클라우스 방법(clauss method)를 이용하여 수득하는 것을 특징으로 할 수 있다.

클라우스 방법은 과량의 트롬빈(35-200U/ml)을 희석한 샘플 혈장에 투입하여 응괴 형성시간을 측정하여 표준 곡선과 비교하여 피브리노겐 농도를 결정하는 방법이다.

표준 곡선은 피브리노겐 농도를 알고 있는 표준 혈장을 희석하여 제작한 샘플로 응괴 형성시간을 측정하여 농도와 시간의 상관관계를 나타내는 그래프로서 g/l 형식으로 구성된다.

본 발명의 혈액응고 검사는 표준 곡선을 생성하여 직접 비교 분석할 수 있으나, 바람직하게는 자동화 기기를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 자동화 기기는 혈액응고 검사를 수행할 수 있는 기기이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 ACL Family, ACL Futura, ACL Advance, ACL TOP Family, ACL10000 (Instrument Lab.), Thrombotimer(Behnk Electronik), Sysmex CA1500, CA660, CA620, CS5100, CS2500, CS1600(Simens), STA-R evolution, STA-R Max, STA Compact Max 및 STA Satellite (Stago)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 지혈효소는 0.1~100BU/ml의 농도로 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.5-90, 0.5-80, 1-70, 2-60, 2.5-50 BU/ml의 농도로 포함할 수 있으며 가장 바람직하게는 50BU/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 카르복시메틸 키토산은 0.1~100mg/ml의 농도로 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.5-30, 0.5-20, 0.5-15, 0.5-12, 0.5-10, 0.8-30, 0.8-20, 0.8-15mg/ml의 농도로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 1mg/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 염화칼슘(CaCl₂)을 추가로 포함할 수 있고, 그 농도는 0 ~ 100mM, 바람직하게는 0.5-30, 0.5-20, 0.5-15, 0.5-12, 0.5-10, 0.8-30, 0.8-20, 0.8-15, 0.8-12mM의 농도로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 10mM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 1 ~ 100mM의 버퍼를 추가로 포함할 수 있고, 상기 버퍼는 2-(N-모폴리노)에탄설포닉 산)(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES), 말레이트(Maleate), 시트레이트(Citrate), 비스-트리스(BIS-Tris), 포스페이트(Phosphate), N-(2-아세트아미도)이미노다이아세틱 산)(N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid, ADA), 카르보네이트(Carbonate), 파이프라진-N,N'-비스(2-에탄설포닉 산)(piperazine-N,N′acid), PIPES), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설포닉 산(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid, ACES), 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰 산(3-Morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid, MOPSO), 이미다졸(Imidazole), 비스-트리스-프로판(BIS-Tris-Propane), N N-비스 2-하이드록시에틸-2-아미노에탄설폰 산(N N-bis 2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid, BES), 3-(N-모르피노)프로판설포닉 산(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설포닉 산(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid, TES), 4-(2-하이드록시에틸)-1-파이퍼아진에탄설포닉 산(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES), 3-비스(2-하이드록시에틸) 아미노-2-하이드록시프로판-1-설포닉 산(3-Bis(2-hydroxyethyl) amino-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid ,DIPSO), 3-[트리스-(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시프로판 설포닉 산(3-[Tris-(Hydroxymethyl)Methylamino]-2-Hydroxypropane Sulphonic Acid, TAPSO), 트라이에탄올아민(triethanolamine, TEA), N-(2-하이드록시에틸)-파이퍼아진-N'-2-하이드록시프로판 설포닉 산(N-(2-Hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-hydroxypropanesulfonic acid, HEPPSO), 파이퍼아진-1,4-비스(2-하이드록시-3-프로판설포닉 산(Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid), POPSO), 트라이신(Tricine), 글라이실글리신(Glycylglycine), 트리스(Tris), 3-[4-(2-하이드록시에틸)파이퍼아진-1-일]프로판-1-설포닉 산(3-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]propane-1-sulfonic acid, HEPPS, EPPS). 바이신(Bicine), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설포닉 산(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid, TAPS), 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(2-Amino-2-methyl-1,3-propanediol, AMPD), N-(1,1-다이메틸-2-하이록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설포닉 산(N-(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)-3-amino-2-hydroxypropanesulfonic acid, AMPSO), 타우린(Taurine) 및 보릭산(Boric acid)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 3-(N-모르피노)프로판설포닉 산(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, MOPS)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 0.1 ~ 10mg/ml 안정화제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 안정화제는 슈가 알콜, 말토즈, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신, 젤라틴(gelatin), PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, a) 상기 조성물을 혈청 함유 샘플에 첨가하여 응괴(clot) 형성 속도를 측정하는 단계; 및

b) 응괴 형성 속도로부터 피브리노겐 농도를 도출하는 단계.

를 포함하는 피브리노겐 농도 측정 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 혈청 함유 샘플은 혈액일 수 있으며, 바람직하게는 혈액에서 분리된 혈청인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서, a) 피브리노겐을 포함하는 혈청 함유 샘플에 지혈효소 및 카르복시메틸 키토산을 첨가하는 단계;

b) 상기 혼합물에 후보물질을 첨가하는 단계;

c) 응괴(clot) 형성시간을 측정하는 단계; 및

d) 응괴 형성시간이 후보물질을 첨가하지 않은 대조군에 비하여 증가하는 후보물질을 항응고 물질로 선별하는 단계를 포함하는 항응고 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 후보 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, DNA, RNA, 펩티드, 효소, 리간드, 세포 추출물 또는 포유동물의 분비물인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 단백질, 비펩티드성 화합물, 발효 생산물, 식물 추출액 또는 혈장 등이 있고, 상기 화합물은 신규 화합물 또는 널리 알려진 화합물일 수 있으며 바람직하게는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다.

이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시료는 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재조합 배트록소빈 발현벡터 구축분리 정제

대한민국 특허 제10-1801150호에 개시된 방법으로 재조합 배트록소빈 발현벡터를 구축하여 분리 정제한 다음, 냉장고(2-8℃)에 보관하여 추후 분석에 활용하였다.

실시예 2: 재조합 배트록소빈과 카르복시메틸 키토산의 시너지 효과 확인

2-1. 혈장응괴시간 확인

Human plasma (Innovative Reserch, 미국)를 구입하여 1ml씩 분주하여 얼려놓았다. 측정 시 37도에서 빠르게 녹여 사용하였다.

분석용 시료는 rTLH 및 천연형 배트록소빈(hyphen, 미국), 트롬빈(Sigma, 미국), 보트로파제(Ravizza, 이탈리아), ancrod(Knoll Pharmacetical, 미국), Suling(Konruns, 중국)을 각 10 BU/ml (천연형 배트록소빈 기준)이 되도록 saline으로 희석한 후 10 mM Tris-HCl, pH 6.8 또는 CMCS 및 CS (chitosan)과 희석하여 5 BU/ml 농도로 만들었다.

각 시료와 혈장은 37℃에서 10분동안 예열 후 Thrombotimer로 혈장 300 ul에 시료 100 ul를 넣어 응고까지 걸리는 시간을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 카르복시메틸 키토산 함유 rTLH의 혈장응괴시간이 키토산 함유 rTLH 또는 rTLH만 포함한 조성물보다 더 빠른 것을 확인할 수 있었다.

2-2 피브리노겐 시간 확인

피브리노겐(Sigma, 미국)을 구입하여 2 mg/ml의 농도로 녹였다.

분석용 시약은 상기 혈장응괴시간 확인 조성물과 동일하게 만들었다.

시료와 피브리노겐은 ACL10000의 FIB-C protocol에 맞춰 기계에 장착한 후 프로그램에 따라 측정을 하였다.

그 결과 도 1 및 2에 개시된 바와 같이, rTLH+CMCS 조성물의 피브리노겐 시간이 rTLH only 또는 rTLH+CS(키토산) 보다 빠른 것을 확인하였다.

2-3 피브리노겐 α-chain 절단 시간 확인

Human fibrinogen을 2mg/mL 농도로 녹여 buffer 또는 CMCS를 넣고 잘 섞어준 후 rTLH를 넣고 반응을 시켰다. 반응시간은 10-30초가지 시켰으며 반응이 끝나면 즉시 5X SDS-PAGE sample buffer를 넣고 100℃에서 5분간 끓여 반응을 멈추었다. 샘플들은 12% SDS-PAGE gel에 loading하여 2시간 전기영동 하였고, gel은 coomassie blue로 염색하였다.

그 결과 도 3에 개시된 바와 같이, CMCS를 첨가하지 않은 경우에는 30초에 fibrinogen α-chain이 완전히 절단되었으며, CMCS를 첨가한 경우에는 10초에 fibrinogen α-chain이 완전히 절단되는 것을 확인하였다.

2-4. 효소활성 확인

트롬빈 기질인 S-2238(hyphen, 미국)을 구입하여 20mM 농도로 녹였다. rTLH 활성 측정시 최종 농도를 25, 50, 100, 200, 400uM로 측정하였고 희석을 위해 100mM Tris-Hcl, pH6.8을 첨가하였다.

분석용 시료는 rTLH를 10BU/ml 농도로 만들어 10mM Tris-HCl, pH 6.8 또는 CMCS와 혼합하였다.

5BU/ml 또는 5BU/ml+10mg/ml CMCS로 만들어진 시료는 96웰 플레이트에 각 20 ul 넣고 농도별 트롬빈 기질을 180 ul씩 넣은 후 ELISA를 사용하여 37℃에서 20 분간 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 CMCS가 rTLH의 효소활성을 증가시키는 것을 확인하였다.

2-5 응괴 강도(clot strength) 확인

Rat whole blood를 구입하여 사용하였다.

분석용 시료는 rTLH를 5 BU/ml 농도로 만들었다.

Rat whole blood 300 ul에 CMCS를 농도별 (0.1, 0.25, 0.5 mg/ml) 20 ul를 넣어 섞어준 후 rTLH 20 ul, CaCl2 20 ul, blood 300 ul의 비율로 ROTEM을 사용하여 1시간동안 측정하였다.

그 결과 도 4에 개시된 바와 같이 CMCS의 농도에 의존하여 응괴 강도가 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 3: 재조합 배트록소빈과 카르복시메틸 키토산 혼합물 기반 피브리노겐 농도 측정

실시예 1에서 제조한 재조합 베트록소빈을 2.5BU/ml 또는 5BU/ml을 포함하고, 카르복시메틸 키토산을 10mg/ml 포함하는 시약을 이용하여 농도별 피브리노겐 검출을 ACL 10000 FIB_C protocol을 이용하여 시도하였다.

그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 0.3mg/ml의 피브리노겐이 검출 가능한 것을 확인하였다.

또한 상기 조건에 10mM 염화칼슘(CaCl₂)을 추가하여 수행한 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 0.2mg/ml의 피브리노겐을 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

뿐만 아니라, 상기 조성물을 이용하여 혈청 내 피브리노겐 농도 0.15mg/ml의 농도까지 검출할 수 있음을 확인하였으며(도 7), 이는 가장 뛰어난 상용 피브리노겐 검출 시약의 검출한계가 0.35mg/ml인데 비하여 월등히 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 재조합 배트록소빈과 카르복시메틸 키토산 혼합물 기반 피브리노겐 농도 측정시약의 간섭 성능 시험

이상혈액 및 항응고제포함 혈액에서의 측정값의 간섭이 있는지 확인하기 위하여 간섭 성능을 확인하였다. Calibration plasma를 ACL TOP 300 장비의 FIB-C protocol에 맞춰 기계에 장착한 후 프로그램에 따라 측정하여 calibration curve를 만들었다. 간섭물질로는 hemoglobin, bilirubin, heparin을 사용하였으며 각 시약을 고농도로 녹이고 plasma에 농도에 맞게 첨가하여 측정했다.

그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 hemoglobin은 500mg/dL, bilirubin은 40mg/dL까지 측정결과값에 영향이 없었다. 특히, 항응고제인 heparin은 10U/mL 농도까지 측정값에 영향이 없음을 확인하여 간섭한계가 1U/mL인 가장 뛰어난 상용 피브리노겐 검출시약보다 간섭이 없음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 재조합 배트록소빈과 카르복시메틸 키토산 혼합물 기반 피브리노겐 농도 측정시약의 정확도 확인 시험

제조된 시약을 이용하여 피브리겐 농도 시험 측정치와 참값 사이의 일치도를 확인하는 시험으로 공인된 참고값을 가지는 국제 표준물질을 사용한다. 표준물질은 NIBSC의 3^rd international standard for fibrinogen plasma (09/264)를 사용하였다. 표준물질과 시약을 ACL TOP 장비의 프로토콜에 맞춰 장착한 후 프로그램에 따라 측정하였다.

그 결과, 도 10에 개시된 바와 같이 상기 조성물을 이용하여 측정한 결과값이 국제 표준물질의 결과값과 비교하여 ±3% 이내의 차이를 보였으며, 이는 가장 뛰어난 상용 피브리노겐 검출 시약의 정확도 측정 결과값이 ±15% 이내인데 비하여 월등히 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

지혈효소(hemostatic enzyme) 및 카르복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan, CMCS)을 포함하는 혈액응고 검사용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혈액응고 검사는 트롬빈 시간 (Thrombin time, TT) 측정, 렙틸레이즈 시간(Reptilase time) 측정 및 피브리노겐(fibrinogen) 농도 측정으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지혈효소(hemostatic enzyme)는 트롬빈, 재조합 배트록소빈, 천연형 배트록소빈, 보트로파제(Botropase), 앵크로드(ancrod) 및 수링(Suling)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지혈효소는 0.1~100BU/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 카르복시메틸 키토산은 0.1~100mg/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
제1항에 있어서, 0 ~ 100mM 염화칼슘(CaCl2)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
제1항에 있어서, 1 ~ 100mM의 버퍼를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 버퍼는 2-(N-모폴리노)에탄설포닉 산)(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES), 말레이트(Maleate), 시트레이트(Citrate), 비스-트리스(BIS-Tris), 포스페이트(Phosphate), N-(2-아세트아미도)이미노다이아세틱 산)(N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid, ADA), 카르보네이트(Carbonate), 파이프라진-N,N'-비스(2-에탄설포닉 산)(piperazine-N,N′acid), PIPES), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설포닉 산(N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid, ACES), 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰 산(3-Morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid, MOPSO), 이미다졸(Imidazole), 비스-트리스-프로판(BIS-Tris-Propane), N N-비스 2-하이드록시에틸-2-아미노에탄설폰 산(N N-bis 2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid, BES), 3-(N-모르피노)프로판설포닉 산(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄설포닉 산(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid, TES), 4-(2-하이드록시에틸)-1-파이퍼아진에탄설포닉 산(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES), 3-비스(2-하이드록시에틸) 아미노-2-하이드록시프로판-1-설포닉 산(3-Bis(2-hydroxyethyl) amino-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid ,DIPSO), 3-[트리스-(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시프로판 설포닉 산(3-[Tris-(Hydroxymethyl)Methylamino]-2-Hydroxypropane Sulphonic Acid, TAPSO), 트라이에탄올아민(triethanolamine, TEA), N-(2-하이드록시에틸)-파이퍼아진-N'-2-하이드록시프로판 설포닉 산(N-(2-Hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-hydroxypropanesulfonic acid, HEPPSO), 파이퍼아진-1,4-비스(2-하이드록시-3-프로판설포닉 산(Piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propanesulfonic acid), POPSO), 트라이신(Tricine), 글라이실글리신(Glycylglycine), 트리스(Tris), 3-[4-(2-하이드록시에틸)파이퍼아진-1-일]프로판-1-설포닉 산(3-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]propane-1-sulfonic acid, HEPPS, EPPS). 바이신(Bicine), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설포닉 산(N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid, TAPS), 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(2-Amino-2-methyl-1,3-propanediol, AMPD), N-(1,1-다이메틸-2-하이록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설포닉 산(N-(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)-3-amino-2-hydroxypropanesulfonic acid, AMPSO), 타우린(Taurine) 및 보릭산(Boric acid)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
제1항에 있어서, 0.1 ~ 10mg/ml 안정화제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 안정화제는 슈가 알콜, 말토즈, 소르비톨, 만노스, 글루코스, 트레할로스, 알부민, 리신, 글리신, 젤라틴(gelatin), PEG 및 Tween 80 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈액응고 검사용 조성물.
다음의 단계를 포함하는 피브리노겐 농도 측정 방법:
a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 혈청 함유 샘플에 첨가하여 응괴(clot) 형성 속도를 측정하는 단계; 및
b) 응괴 형성 속도로부터 피브리노겐 농도를 도출하는 단계.
다음의 단계를 포함하는 항응고 물질의 스크리닝 방법:
a) 피브리노겐을 포함하는 혈청 함유 샘플에 지혈효소 및 카르복시메틸 키토산을 첨가하는 단계;
b) 상기 혼합물에 후보물질을 첨가하는 단계;
c) 응괴(clot) 형성시간을 측정하는 단계; 및
d) 응괴 형성시간이 후보물질을 첨가하지 않은 대조군에 비하여 증가하는 후보물질을 항응고 물질로 선별하는 단계.