NL8403425A - Stromavrije hemoglobine-oplossing, werkwijze voor de bereiding daarvan en toepassing daarvan. - Google Patents

Description

-1-- * s

Stramavrije hemoglobine-oplossing, werkwijze voor de bereiding daarvan en toepassing daarvan.

Deze uitvinding, die gedaan is door Drs. R. Sprokholt en Dr. A.H.J. Maas, betreft een stabiele, stromavrije hemoglobine-oplossing, een werkwijze voor de bereiding daarvan en toepassing van die oplossing als standaard 5 bij het ijken en de kwaliteitsbewaking van bloedgasmeet- apparaten, en meters van hemoglobine-derivaten (Hb-derivaten).

Stromavrije hemoglobine-oplossingen en een werkwijze voor de bereiding daarvan zijn bekend, onder meer uit het Amerikaanse octrooischrift 4.401.652. Zulke oplossingen 10 zijn bruikbaar als bloedvervangingsmiddelen bij acuut gebrek aan bloed, maar dienen vooral als standaard bij het ijken en de kwaliteitsbewaking van bepalingen van pH, pCC>2, pC>2 en Hb-derivaten in bloed.

Bepalingen van pH, pC02 en pC>2 en van hemo-15 globine-derivaten in bloed worden tegenwoordig zeer veel gedaan in klinische en andere laboratoria. De drie eerstgenoemde bepalingen gebeuren in het algemeen met behulp van specifieke elektroden en zijn altijd relatief, d.w.z. dat het onbekende monster met een békende oplossing vergeleken wordt..De gehal-20 ten aan hemoglobine (Hb) en Hb-derivaten worden in het algemeen, op analoge wijze, spectrofotometrisch bepaald. De kwaliteit van het vergelijkingspreparaat is dus van doorslaggevend belang.

Dit ijken of kalibreren op standaard-oplos-25 singen en de kwaliteitsbewaking daarvan behoren dagelijks te gebeuren (en in de Verenigde Staten van Noord Amerika zijn al stemmen opgegaan om dat wettelijk verplicht te stellen) en bij •s 7 Λ Λ * - » - - _ .. . * i V 9 * ,· * f t - 2 - voorkeur ijkt men op drie oplossingen, één met de relevante parameters op of omstreeks de normale waarde van gezonde personen, één met die parameters in de buurt van de laagste in de praktijk voorkomende waarde, en één met die parameters in de 5 buurt van de hoogste in de praktijk voorkomende waarde. (Met een verhoogde, resp. verlaagde zuurgraad gaan een verhoogde, resp. verlaagde pCC^ en pC>2 gepaard) . Wenselijk zijn ijk- en controle-preparaten met pH van resp. 7,2, 7,4 en 7,6 met pC>2 van resp. ca 130, 100 en 70 mmHg en pC02 van resp. ca 60, 10 40 en 20 mmHg.

Hoewel het in principe algemeen bekend is meetapparatuur te controleren door er een bekend preparaat in te brengen geeft dat met bloed grote problemen. Bloed is onderhevig aan metabolisme waardoor de pH, pCC^, p02 en de 15 fracties van de Hb-derivaten veranderen. Daarenboven kan er gemakkelijk gasuitwisseling optreden met de omgeving, daar de partiële spanningen van koolzuur en zuurstof sterk afwijken van die in het bloed. Men moet dus dagelijks een nieuw standaardpreparaat uit een gesloten verpakking halen. Na equilibreren 20 of tonometreren hiervan met een gekozen gasmengsel (meestal zijn dat drie verschillende mengsels) worden de gewenste waarden verkregen. Voor hen die met tonometrie bekend zijn is dit een duidelijke zaak. En de houdbaarheid van dat standaardpreparaat moet aan zeer hoge eisen voldoen. De pH moet binnen 25 0,01 van de opgegeven waarde liggen, en de pCC^ en binnen 1 mmHg van de daarvoor opgegeven waarden. En dat moet gedurende de gegarandeerde bewaartijd (tot aan de expiratiedatum toe) blijven gelden.

Bloed, dat niet houdbaar en ook niet homogeen 30 is, is als ijk- en controle-vloeistof ongeschikt, Hemoglobine-oplossingen, die men verkrijgt door hemolyse van rode bloedlichaampjes (erythrocyten) en afcentrifugeren van de brokstukken en ander onopgelost materiaal (het stroma) voldoen beter. Bereidingswijzen van stromavrije hemoglobine-oplossin-35 gen zijn beschreven in het Oost-Duitse octrooischrift 150.543 en het bovengenoemde Amerikaanse octrooischrift 4.401.652.

0 A 0 '' Λ 9 >». * - * .«a.· - * * - 3 -

Hoewel zulke preparaten homogeen en daardoor reeds veel beter zijn zijn ook deze niet stabiel. Zelfs als door asepsis bac-teriële infectie buitengesloten wordt loopt het actieve hemoglobine-gehalte vrij snel terug, voornamelijk doordat 5 hemoglobine in (inactief) methemoglobine overgaat (een oxyda-tie van Fe(II) tot Fe(III).) Deaffiniteit van methomoglobine voor zuurstof is nagenoeg nul.

Daarom behelpt men zich voor de ijking en kwaliteitsbewaking van bloedgasmeetapparatuur en meters van Hb-10 derivaten veelal met waterige bufferoplossingen of emulsies van fluorkoolwaterstoffen welke bovendien een buffer bevatten en daarnaast zoveel bicarbonaat dat bij de heersende pH ook de juiste pCC^ heerst; deze kunnen omkeerbaar aanzienlijke hoeveelheden zuurstof opnemen. Voor de bepaling van het Hb-15 gehalte is er een goede, op HiCN gebaseerde ijkvloeistof beschikbaar, doch voor de kwaliteitsbewaking van de bepalingsmethode ontbreekt deze.

Emulsies van fluorkoolwaterstoffen ter vervanging van bloed, voor het ijken en het bewaken van de kwali-20 teit van bloedmeetapparatuur zijn o.m. beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 4.299.728 en 4.369.127. Geschikte fluorkoolwaterstoffen zijn perfluormethylcyclohexaan, per-fluordimethyldecalien en mengsels daarvan en het perfluortri-butylamine. Onder andere is het verloop van de pC^ met de opge-25 nomen hoeveelheid zuurstof heel anders dan met hemoglobine.

Zoals bekend vertoont de grafiek van de C^-spanning tegen de opgenomen hoeveelheid zuurstof een S-vorm, met een hemoglobine-oplossing, maar is lineair met andere zuurstof-buffers zoals de fluorkoolwaterstoffen. Met hemö-30 globine is de helling veel steiler dan met andere bekende stoffen, wat aan conformatie-veranderingen bij zuurstofopname toe te schrijven is.

Het heeft niet aan pogingen ontbroken hemo-globine-oplossingen stabiel te maken. Hemoglobine blijkt van 35 nature geassocieerd te zijn met 2,3-difosfoglyceraat (DPG) dat een zekere stabiliserende invloed op hemoglobine heeft.

ί ϊ - 4 -

Maar deze combinatie dissocieert erg gemakkelijk en zijn stabiliteit is voor de praktijk onvoldoende. In het Duitse Auslegeschrift 2.617.822 is voorgesteld hiervoor per liter 6-8 % hemoglobine-oplossing, 1,1 g pyridoxalfosfaat te ge-5 bruiken, dat echter (ten gevolge van de aldehyd-groep) covalent met het hemoglobine blijkt te binden en dat tot een combinatie leidt waarvan een gedeelte een bepaalde affiniteit voor zuurstof heeft en het andere gedeelte een andere, lagere affiniteit. Men heeft in zo'n preparaat dus als hetware twee 10 soorten hemoglobine, en het verloop van de opgenomen hoeveel heid zuurstof met de pC>2 is daardoor aanzienlijk vlakker, wat voor een ijkstof en preparaat voor kwaliteitsbewaking ongunstig is.

Een ander hemoglobine-preparaat bestaat uit 15 enerzijds gevriesdroogd hemoglobine en anderzijds een buffer- oplossing met alle overige noodzakelijke bestanddelen, die vlak voor gebruik met elkaar gemengd moeten worden. Zo'n preparaat lijdt aan het gebruikelijke nadeel dat het oplossen zeer volledig moet verlopen, anders houdt men twijfel.

20 Bovendien is droog hemoglobine (anders dan hemoglobine in oplossing) extreem gevoelig voor oxydatie tot methemoglobine, zoals beschreven door DeVenuto c.s. in Suurg. Gynec. Obst.

148 (1979) 69-75 en Labrude c.s. in J. Pharm. Pharmacol. 33_ (1981) 115-117.

25. Nu is gevonden dat al deze bezwaren over wonnen worden en men een stabiel en onder alle omstandigheden goed bruikbaar preparaat heeft als men hemoglobine (Hb) met inositolhexafosfaat (IHP) beschermt. Derhalve bevat een stroma-vrije hemoglobine-oplossing volgens de uitvinding inositol-30 hexafosfaat in een zodanige hoeveelheid dat de molverhouding IHP/Hb tussen 0,1:1 en 1,0:1 ligt.

Gebleken is dat in een dergelijke oplossing direct na aanmaken minder dan 2 % van het totaal aan hemoglobine methemoglobine is, en na een jaar bewaren bij 4°C of 35 lager minder dan 7 %. De p50 (dat is de zuurstofspanning bij 50 % belading van het totale hemoglobine met zuurstof) loopt ? $ *; c l $ • "* - 5 - iets terug doordat methemoglobine een extreem lage p50 heeft.

Als 5 % van het hemoglobine in methemoglobine veranderd is loopt de p50 met 0,5 mmHg (67 Pa) terug. In ieder geval loopt de p50 van het preparaat bij bewaren in de ijskast in 6 maan-5 den niet meer dan 2 mmHg (267 Pa) terug.

Een combinatie van hemoglobine met inositol-hexafosfaat was, voor zover bekend alleen eerder genoemd in een artikel van P.M. Breepoel c.s. in Pflügers Archiv 389 (1981) 227-235, waarin aangetoond wordt dat IHP evenals 10 DPG en ATP (adenosïnetrifosfaat) de zuurstofaffiniteit van runder-hemoglobine verlaagt. Het verschil was echter niet groot, en de houdbaarheid van dergelijke combinaties was niet onderzocht. De molverhouding IHP/Hb van de in dit artikel beschreven oplossing was 2:1.

15 Verder is gevonden dat de toch reeds geringe omzetting van hemoglobine in methemoglobine nog verder vertraagd kan worden door gebruik te maken van het enzym methemoglbine-reductase, dat van nature in erythrocyten voorkomt en daardoor ook in de hemoglobine-oplossing volgens de 20 uitvinding. Dit enzym doet de "onomkeerbare" overgang hemoglobine methemoglobine te niet. Daarvoor is nodig de aanwezigheid van NADH (gereduceerde vorm van nicotine-adenine-dinucleotide), waarvan zo veel aanwezig moet zijn dat de mol-verhouding NADH/Hb tussen 0,25:1 en 1,50:1 ligt, het beste is 25 een molverhouding NADH/Hb van ongeveer 0,5:1. In plaats van NADH mag ook NADPH (de gereduceerde vorm van nicotine-adenine-dinucleotide-fosfaat) aanwezig zijn.

De hemoglobine-concentratie van het preparaat ligt in het algemeen tussen 3 mmol/1 en 15 mmol/1; bij voor-30 keur is deze ongeveer 8 mraol/1.

De gehalten aan natrium, kalium, chloride en eventuele andere ionen liggen in het fysiologische gebied.

Het bicarbonaat-gehalte wordt bepaald door de gewenste pH en de gewenste pCC^· 35 De zuurstof-buffercapaciteit van dit prepa raat is gelijk aan die van bloed, en de p5Q reageert op n 7 ƒ n *« ··«.*- » i if1 « - 6 - een eventueel verloop van de pH ook op ongeveer dezelfde wijze als die van bloed.

De p50 is ook gevoelig voor het IHP-gehalte. Hiermee kan men de p50 op normaal instellen bij die zuur-base-5 toestanden die karakteristiek zijn voor acidose, normale toestand en alkalose. Het verdient ook de voorkeur, zoals hierboven al aangegeven is, de ijk- en controle-vloeistoffen volgens de uitvinding in series van drie te leveren, één met pH, pCC>2 en PO2 op of omstreeks de normale waarde van gezonde personen, 10 één met die parameters in de buurt van de laagste in de praktijk voorkomende waarde, en één met die parameters in de buurt van de hoogste in de praktijk voorkomende waarde.

De uitvinding betreft ook een werkwijze voor het bereiden van een stromavrije hemoglobine-oplossing. Daar-15 bij worden de erythrocyten voor de hemolyse door herhaaldelijk uitwassen met een isotone of zwak hypertone NaCl-oplossing gezuiverd, en bij voorkeur ook vooraf van leukocy-ten gezuiverd door een suspensie daarvan door een kolom met een geschikt adsorbens te leiden (bijvoorbeeld "Erypur" van 20 de firma Organon). Dit was onder andere uit het reeds genoemde Amerikaanse octrooischrift 4.401.652 bekend.

Dan gebeurt de lysis door de gereinigde ery-trocyten in minimaal twee volumina maar bij voorkeur in vier volumina met een sterk hypotone oplossing bij voorkeur steriel 25 gedestilleerd of gedemineraliseerd water te brengen, dat uit voorzorg in het algemeen ook wat bactericide bevat. De lysis kan desgewenst door ultrasone trillingen versneld worden, maar nodig is dat niet. Het lysaat wordt bij voorkeur gecentrifugeerd, waardoor het stroma (brokstukken van de erythrocyten-30 celwanden en andere vaste deeltjes) verwijderd wordt. De bovenstaande vloeistof wordt voorzichtig met een hevel van het sediment afgezogen. Dit lysaat wordt desgewenst geconcentreerd, hetgeen bijvoorbeeld door indampen kan gebeuren maar bij voorkeur door ultrafiltratie, bijvoorbeeld met bundels van holle 35 vezels.

'f' +

Aan deze oplossing worden de ionen Na , K , ïï ^ Π ? ί 7 - 7 - 2+ 2+ * -

Ca / Wg / HCO^ en Cl als zouten toegevoegd, in zodanxge hoeveelheden dat de eindoplossing de gewenste concentraties aan natrium, kalium, calcium, magnesium en chloride heeft.

Door vooraf zorgvuldig de hoeveelheid bicarbonaat te berekenen 5 komt de pH dan op de gewenste waarde. Het zal dan veelal nodig zijn de oplossing nog eenmaal te centrifugeren om een echt helder eindpreparaat te krijgen. Tenslotte worden door begas-sing met een mengsel van stikstof, koolzuur en zuurstof de pCC>2 en pi^ op de juiste waarden ingesteld.

10 De werkwijze van de uitvinding wordt nu hier door gekenmerkt dat men na de lysis zoveel inositolhexafosfaat toevoegt dat de molverhouding IHP/Hb tussen 0,1:1 en 1,0:1 komt te liggen.

De opbrengst aan hemoglobine kan wel 90-95 % 15 bedragen.

Gebleken is dat men bij deze bereiding het beste samen met het IHP ook NADH toevoegt, het beste tot een zodanige concentratie dat de molverhouding NADH/Hb ongeveer 0,5:1 wordt.

20 Bovendien is gebleken dat men de toch reeds goede stabiliteit van het preparaat nog verder kan opvoeren, zodanig dat men zelfs na 1 jaar bij 4°C of lager er absoluut geen neerslag in vindt, als men de hemoglobine-oplossing aan een dubbele pH-verschuiving onderwerpt en men de daarbij 25 optredende neerslagen afscheidt voordat men de oplossing op de gewenste eindgehalten aan Hb, IHP, NADH en andere bestanddelen brengt en men de gewenste 0^ en CO^-spanningen instelt. Volgens de uitvinding voegt men aan het lysaat zoveel IHP toe dat de molverhouding IHP/Hb ongeveer 0,5:1 be-30 draagt, brengt men dan met verdund NaOH de pH tussen 8,0 en 8,1, verwijdert men het neerslag door centrifugeren, stelt men de pH met verdund HC1 nu tussen 6,9 en 7,0 in, verwijdert men het neerslag door centrifugeren, en stelt men tenslotte na het toevoegen van natrium, kalium, calcium, magnesium, 35 bicarbonaat en chloride tot de gewenste waarden de pH, pCC>2 en pC>2 op de gewenste waarden in.

•«s jT y o ..* - 8 -

Tenslotte betreft de uitvinding ook de toepassing van dit stabiele preparaat. In de eerste plaats kan men het gebruiken bij het bepalen van pH, pCC^, pC^ en/of hemoglobine-gehalte in bloed, waarbij men deze bepaling nu 5 ijkt op een oplossing zoals hierboven beschreven. Zoals reeds gezegd brengt dit de voordelen mee dat men ook na langdurig bewaren een absoluut betrouwbaar preparaat heeft dat zonder meer gebruikt kan worden en ook vrij van troebeling is.

Maar ook kan men zo'n hemoglobine-oplossing 10 gebruiken als bloedvervangingsmiddel, met het voordeel dat het geen immunogeniteit vertoont (door de afwezigheid van de erythrocyten-celwanden). Daar staat dan tegenover dat het zeer snel uitgescheiden wordt doordat de nieren het hier niet in bloedlichaampjes opgesloten hemoglobine helemaal niet 15 tegenhouden. Het komt dus vooral in aanmerking voor infusie bij acute noodgevallen.

Verder kan het ook als standaard voor de (spectrofotometrische) bepaling van hemoglobine en Hb-derivaten dienen.

20 De uitvinding wordt nu toegelicht door de volgende voorbeelden.

Voorbeeld I

Alle handelingen werden verricht onder steriele condities (laminair Airflow Cabinet, class 100; steriele op-25 lossingen, etc.).

1) Menselijk bloed werd in ACD-oplossing opgevangen, porties van 420 ml in flessen van 500 ml met daarin reeds 80 ml ACD-oplossing, In totaal 6 liter.

2) Deze flessen werden in centrifugebekers ge-30 plaatst en 30 minuten op 3000 g gecentrifugeerd. De bovenstaande vloeistof werd via hevels afgezogen. Per fles hield men 200-250 ml aan cellen over.

3) De bloedcellen werden in 0,9 % NaCl-oplossing gesuspendeerd, eindvolume 500 ml per fles.

35 4) De bloedcel-suspensies werden geleid door een kolom "leucofilter" (Erypur van de firma Organon), waarmee

9 A Λ - A V

V* V “.· ^ • Λ- « - 9 - de witte bloedcellen en een groot deel van de bloedplaatjes verwijderd worden.

5) De blaedcel-suspensies werden 30 minuten op 3000 g centrifugeerd. De bovenstaande vloeistoffen werden 5 met een hevel afgezogen.

6) Overeenkomstig (3) werd weer met 0,9 % NaCl-oplossing tot 500 ml per fles aangevuld.

7) Overeenkomstig (5) werd weer 30 minuten op 3000 g gecentrifugeerd, de bovenstaande vloeistoffen werden 10 weggedaan.

8) Per fles had men nu ca 200 ml aan rode bloedcellen.

9) Alle porties rode bloedcellen werden bij elkaar gedaan en door elkaar geroerd, en vervolgens over 15 flessen van 3 liter verdeeld, zodat elke fles 0,6 liter aan bloedcellen bevatte. Nu werd in elke fles 2,4 liter steriel gedestilleerd water gébracht en gemengd. Bovendien werd per liter 1 g neomycinesulfaat (opgelost in ca 2 ml water) toegevoegd (tegen bacteriegroei). Deze mengsels werden overnacht in 20 een ijskast bij +4°c bewaard.

10) De gekoelde hemoglobine-oplossing werd bij kamer-temperatuur verdeeld over centrifugeflessen van polycarbonaat (steriel, met speciale afsluitstop). Hierin werden ze 30 minuten bij 0-10°C op 27.000 g gecentrifugeerd in een Sorvall 25 RC-5 centrifuge met GSA-rotor.

11) De bovenstaande vloeistoffen werden steriel afgezogen en in flessen van 3 liter opgevangen.

12) Hieraan werden CaCl2 en NaCl toegevoegd tot concentraties van resp. 0,02 M en 0,13 M, en vervolgens werd 30 aan 3 liter 8 ml 0,25 M natrium-inositolhexafosfaat-oplossing toegevoegd, waarvan de pH met verdund HCl op 8,0 gebracht was, waardoor IHP/Hb nu 0,5:1 was. Nu werd 1 M NaOH toegevoegd tot een pH van 8,05. Er ontstond een neerslag (Ca-IHP, membraan-eiwitten).

35 Het IHP-Na-zout was gekocht bij de firma

Sigma Chemicals te St. Louis, Mo, 63178, USA.

\ r' * ** ' ^ v* .y - 10 - 13) In een Sorvall-centrifuge werd 20 minuten op 27.000 g gecentrifugeerd.

14) De bovenstaande hemoglobine-oplossingen werden voorzichtig afgezogen en met elkaar gecombineerd.

5 15) Met 1 M HCl werd de pH op 7,0 gebracht. Er ont stond weer een neerslag (eiwit).

16) Er werd weer 20 minuten op 27.000 g gecentrifugeerd .

17) De bovenstaande hemoglobine-oplossingen werden 10 afgezogen en met elkaar gecombineerd.

18) Ter voorbereiding van het concentreren werd de oplossing nu gefiltreerd door voorfilters en ultrafilters met poriën van 0,8 ^im.

19) De oplossing werd door ultrafiltratie met be- 15 hulp van bundels holle vezels geconcentreerd (apparaat Amicon DC-2 met patronen HlPlO-8). Dit werd voortgezet tot een hemo- -2 globine-concentratie van 10 M.

20) Nu werd in totaal ongeveer 7 g NADH in water toegevoegd, zodat de molverhouding NADH/Hb nu 0,5:1 was.

20 21) Nu werden Hb, pH, pCO^, Na, K, Cl en vrij-ge- ioniseerd calcium gemeten en werden volgens de Astrup-techniek de pH, pCC>2 en het bicarbonaatgehalte bepaald.

22) De verkregen vloeistof werd in drie ongeveer gelijke delen gesplitst. Uit de uitkomsten van de bepalingen· 25 (21) werd berekend hoeveel er van de diverse ionen toegevoegd moest worden om een samenstelling te krijgen die zo dicht mogelijk bij die van bloedplasma komt.

23) Nu werden NaCl, KCl, CaCl2 en NaHCO^ toegevoegd, zodat in elke portie het verband tussen pH en pCC>2 bekend was.

30 (pBar = 760 mmHg) pH pC02 = 101,3 kPa) 7,20 60 mmHg (8,00 kPa) 7,40 40 mmHg (5,33 kPa) 7,60 20 mmHg (2,67 kPa) 24) Aan elke portie werd nu zoveel IHP toegevoegd 35 dat voor elke pH/pCC>2-combinatie de p50 ca 26,5 mmHg (3,53 kPa) was. (Hiertoe drie verschillende hoeveelheden IHP toe- 0 ·* w 4 rz. 3 - 11 - voegen en bij constante pCO^ de p02 waarden meten, waarna men

door intrapolatie de gewenste IHP-concentratie vindt; p09 is XHP

een functie van —— } .

Hb 25) Nu werd nog eens in een Sorvall centrifuge 5 20 minuten op 27.000 g gecentrifugeerd.

26) De bovenstaande hemoglobine-oplossing werd afgezogen en door filtreren door een ultrafilter met poriën van 0,22 steriel gemaakt.

27) Het produkt werd steriel over flesjes met 10 rubberstoppen verdeeld.

Het produkt bevatte 8,0.10 3 M Hb, waarvan minder dan 2 % methemoglobine (na 1 jaar in de koelkast minder dan 7 %). De hemoglobine-opbrengst was in dit geval ca 15 60 %.

Het bevatte 0,21 M Na1, 0,011 MK'en 0,16 M Cl'. Het bevatte uiterst weinig gevormde deeltjes, die in ieder geval kleiner dan 0,22 ^un waren. Na 251-voudige verdunning met HiCN-reagens werd gemeten: 20 E75o“nm<0'0002 E540/E504 1 ‘>59·

Het verband tussen p50 en pH was zoals uit de literatuur bekend is, en de temperatuurcoëfficiënten voor pH, pCC>2 en 25 PO2 waren ongeveer die van bloed.

Voorbeeld II

1) Koeienbloed werd met heparine-oplossing on-stolbaar gemaakt (550 ml bloed + 3 ml oplossing).

2) t/m 11) Overeenkomstig voorbeeld X.

30 12) Aan de hemoglobine-oplossing werden CaCl2 en NaCl toegevoegd tot concentraties van resp. 0,02 M en 0,13 M, en vervolgens in totaal ca 3,5 ml 0,25 M Na-IHP waarvan de pH met verdund HCl eerst op 8,0 gebracht was. De pH van dit mengsel was 7,4.

35 13) Een klein beetje troebeling werd weggenomen door 20 minuten centrifugeren op 27.000 g.

a & - 1 - ··> « *ƒ « - > -fc - 12 - 14 t/m 24) waren overeenkomstig (17) t/ra (27) van voorbeeld I.

De eigenschappen van dit preparaat waren in hoofdzaak gelijk aan die van het preparaat van voor-5 beeld I. Alleen had het na een half jaar bewaren in de koelkast een heel lichte troebeling.

Voorbeeld III

1) Koeienbloed werd met heparine-oplossing onstolbaar gemaakt (550 ml bloed + 3 ml oplos- 10 sing).

2) t/m 27) Overeenkomstig voorbeeld I.

De eigenschappen van dit preparaat waren in hoofdzaak gelijk aan die van het preparaat van 15 voorbeeld I, ook hierin dat het zelfs na een half jaar bewaren geen spoor van troebeling vertoonde.

S 4 0- 3 ά ? 5

Claims (11)

1. Stromavrije hemoglobine-oplossing, met het kenmerk, dat die inositolhexafosfaat bevat, in een zodanige 5 hoeveelheid dat de molverhouding IHP/Hb tussen 0,1:1 en 1,0:1 ligt.

2. Stromavrije hemoglobine-oplossing volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat die bovendien methemoglobine-reductase κι gereduceerd NAD (NADH) bevat.

3. Stromavrije hemoglobine-oplossing volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat die bovendien cytochroom b5 bevat.

4. Stromavrije hemoglobine-oplossing volgens een der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat die tussen 3 15 en 15 mmol/1 Hb bevat en een pH tussen 6,9 en 8,1 heeft.

5. Stromavrije hemoglobine-oplossing volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat die na 1 jaar op of beneden 4°C bewaard te zijn nog geen neerslag bevat.

6. Stromavrij hemoglobine-preparaat volgens een 20 der voorafgaande conclusies dat uit drie oplossingen bestaat, met pH van ongeveer 7,2, ongeveer 7,4 en ongeveer 7,6.

7. Werkwijze voor de bereiding van een stromavrije hemoglobine-oplossing, waarbij men voorgezuiverde erythrocyten met gedestilleerd of gedeioniseerd water doet 25 lyseren en men in het lysaat de gehalten aan Ca 7 Na', K', HCO^ en Cl' op de met bloedplasma overeenkomende waarden instelt, en door begassen de pCO^ en pC^ op de gewenste waarden instelt en het eindpreparaat door filtreren steriliseert, met het kenmerk, dat men bovendien zoveel inositolhexafosfaat toevoegt 30 dat de molverhouding IHP/Hb tussen 0,1:1 en 1,0:1 ligt.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat men bovendien NADH toevoegt.

9. Werkwijze volgens conclusie 7 of conclusie 8, met het kenmerk, dat men aan het lysaat zoveel IHP toevoegt 35 dat de molverhouding IHP/Hb ongeveer 0,5:1 bedraagt, men dan met verdund NaOH de pH tussen 8,0 en 8,1 instelt, het Λ /. ~ ~ ' Λ - ‘T -* : *, :-· .·* ' ·. J V - ·% -»*- neerslag door centrifugeren verwijdert, met verdund HCl de pH tussen 6,9 en 7,0 instelt, het neerslag door centrifugeren verwijdert, en men tenslotte na het toevoegen van Ga7 K*, Na', HCQ^ en Cl' tot de gewenste gehalten de pH en pC02 en pC>2 5 op de gewenste waarden instelt. _

10. Werkwijze voor het bepalen van pH, pCO^, pO^ en/of Hb in bloed, met het kenmerk, dat men deze bepaling ijkt op een oplossing verkregen onder toepassing van * een werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 6.

11. Toepassing van een preparaat verkregen onder toepassing van een werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 6 als vervangingsmiddel van bloed. p ά π 3 & 9 R •S’ 5 **** ii Λ·*ι Λ. ί