JPH06502649A - 組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織因子に基づ（プロトロンビン時間試薬関連出願の川魚 本出願は、１９９０年１１月１３日に出願され、「組織因子に基づくプロトロン ビン時間試薬」に対する、普通に譲渡された特許出願アメリカ合衆国シリーズＮ ｏ、０７／６１２．１１８の一部継続出願である。その出願の開示を参考文献と してここに引用する。

本発明は精製、再構築された、自然のまたはりコンビナンドヒト組織因子（ｒＴ Ｆ）を使用しているプロトロンビン時間（ＰＴ）試薬に関する。さらに詳しくは 本発明は組織因子（ＴＦ）のリン脂質小胞またはミセル中への再構築に関し、組 織因子に基づ＜ＰＴ試薬を製造するものである。このような試薬は、経口の抗凝 固治療および凝固の外因系経路における欠失の特別のモニターニングを可能とす る。

関連技術の記述および本発明への導入 一般に、リポソームは水性スペースを包囲する１種またはそれ以上の脂質２重層 からなる小胞の一般的カテゴリーである。このカテゴリーの範躊には、単一メン プランあるいは脂質２重層からなる単層構造の小胞、および多くの同心のメンプ ラン（または脂質２重層）からなる多層構造の小胞がある。リポソームは通常リ ン脂質から調製される。スゾカ、エフ、（Ｓｚｏｋａ、　Ｆ、）およびＩくバ／ Ｓジョボウロス、ディ、（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｄ、）、＾ｎｎ、 Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇ、、塾４６７−５０８（１９８０）。

ミセルはリポソームと異なる。洗剤等の親水性および疎水性の両特性を有する分 子が水性媒体中におかれるとミセルが形成する。分子の疎水性部分が集合して水 性媒体を排除する。その最も簡単な状態においては、ミセルは球状であろう；し かしながらそれらは種々の形および大きさの集合体（２重層）を形成し得る。

水性内部というよりは疎水性内部を有−するという点でミセルはリポソームと異 なる。例えば、洗剤分子の親水性頭部は水中の外側の方にミセルの顔を構成し、 一方線水性尾部はともに集まって疎水性構造のようになる。デイヴイス、ビー、 ディー（Ｄａｖｉｓ、　Ｂ、Ｄ、）およびドウルベッコ、アール　（Ｄｕｌｂｅ ｃｃｏ、　Ｒ，）、「殺菌および消毒（Ｓｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉ ｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、第１２７０頁、 ハーバ−＆　ロー　（Ｂａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ）出版（Ｄａｖｉｓ、　Ｂ、　 Ｄ、ら１９８０年）、マーシー、エッチ、アール、（Ｍａｈｌｅｒ、　［１，Ｒ ，）およびヨーデス、イー、エッチ、　（（：ｏｒｄｅｓ、Ｅ。

＋１．）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２班、Ｈａｒｐｅｒ 　＆　Ｒｏｗ出版、第７１２−７１４頁（１９７１年）。

リポソームはドラッグデリバリ−システムとして使用されている。この研究法は リポソームは、内部水性スペースを包む比較的不浸透の脂質２重層を有している という事実を利用しており、それによりこのスペース内に種々のドラ・ソゲを完 全にカプセル化する方法を提供する。５ｚｏｋａ、　ｍｌ、第４６８頁。このタ イプのデリバリ−システムの重要な見地は、活性な成分ドラッグは、それがター プ・ントに到達するまでリポソームの外側の水性媒体に対して利用できないとい うことであろう。ジャノフ（Ｊａｎｏｆｆ）ら、合衆国特許シリーズＮ　ｏ、　 ４．８８０．６３５（１９８９）。

を椎動物の組織は、クエン酸塩化された血漿に添加されカルシウム再添加される （ｒｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ）と、血餅形成時間が非常に加速されるということが 観察された。

凝固プロテアーゼカスケードを活性化することが観察されたこの組織成分は通常 トロンボプラスチンあるいは組織因子（ＴＦ）と呼ばれている。

１９３５年に、トロンボプラスチン（プロ凝固（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）組 織因子）の使用が、一つの段階のＰＴ試験に最初に記載された（クイック（Ｑｕ ｉｃｋ）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｔ　１０９：　７３−７４．１９３５）。この試験は哺乳動物組織から誘 導されたトロンボプラスチンおよびプールされたヒト血漿の希釈液で調製された 標準曲線を採用した。この試験は現代では簡単になすことができ、自動化も可能 である。

プロトロンビン時間（ＰＴ）試験は、凝固実験室における最も一般的に行われる アッセイである。この試験の変形は多くの用途がある（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ） ら、「止血と血栓症、基本的原理と臨床（ｌｌｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔ ｈｒｏ＋ａｂｏｓｉｓ、　Ｂａ５ｉｃＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎ ｉｃａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、コールマン（ＣｏｌｅｌＩｌａｎ）ら、編集Ｊ 、　Ｂ、　Ｌｉｐ垂■■ ｃｏｔｔ社、フィラデルフィア、１０４８−１０６０頁、１９８７）。一つの用 途は、凝固の外因系経路における欠失を評価することである（第ＶＩ１．Ｘ、Ｖ 因子およびプロトロンビン）。第２番目の用途は、再発性静脈血栓症や癌等の疾 患のために長期間経口抗凝固治療を受けている患者をモニターすることである（ ヒルシュ、ジエ−（Ｂｉｒｓｈ、　Ｊ）、血栓症と止血セミナー（Ｓｅｍｉｎａ ｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ抗凝固治療の治療上の範囲は流血と 血栓の併発を防止することに基づいている。

経口抗凝固治療をモニターするとき、ＰＴ試験による色々な他の条件に対しても 同様なように、２の因子によるプロトロンビン時間の伸びは、長期治療に最も望 ましい（オーレイリー（０’　Ｒｅ１ｌｌｙ）、止血と血栓症、基本的原理と臨 床、コールマンら、編集Ｊ、　Ｂ、　Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ社、フィラデルフィ ア、１３６７−１３７２頁、１９８７）。この伸び因子はプロトロンビン比（Ｐ Ｒ）として定義され、患者の血漿のＰＴを正常個体の血漿のプールのＰＴで割る ことにより計算される。より高いＰＲはより敏感なＰＴ試薬を意味する。抗凝固 治療をモニターするためのより敏感な試薬の利点は抗凝固ドラッグのより低い服 用量の使用である。このより低い服用量はまた、流血の合併症を最小にしながら 、血栓塞栓症に対する適当な保護となる。

ＰＴを決定するいくつかの試薬が商業的に入手可能である。これらはトロンポレ ル（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ）　Ｓ　（カーティスマセソンサイエンティフィック （ＣｕｒｔｉｓＭａｔｈｅｓｏｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ヨーバリ、ンダ （Ｙｏｒｂａ　Ｌｉｎｄａ）、　ＣＡ）およびシンブラスチン（ＳｉＩｌｐｌａ ｓｔｉｎ）　（オーガノンテクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ）社、シ ャーロソテ（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ）、ＮＣ）を含む。これらの試薬は、Ｔｈｒｏ ｍｂｏｒｅｌ　ＳがＳｉｍｐｌａｓｔｉｎより長い時間を示し、同じ患者の血漿 に対して非常に異なったＰＴを出す。それ故、ＰＴを、３ｉｍｐｌａｓｔｉｎに 代えてＴｈｒｏｍｂｏｒｅｌ　Ｓを使用してモニターするとき、抗凝固ドラッグ のより低い服用量が、伸びたＰＴ時間（高いＰＲ）を維持するのに要求される。

要求は、より敏感な組織因子に基づ＜ＰＴ試薬が抗凝固治療や他の条件をモニタ ーするのに存在する。本発明はまさにこのような非常に望ましいＰＲを有する敏 感な試薬を提供する。

本発明の要約 本発明は、脂質２重層と会合した組織因子を有するリポソーム組成物からなる組 織因子試薬に関し、該脂質２重層はリン脂質の混合物からなり、また本発明はこ のような組成物を調製する方法に関する。提供されたリポソーム中におけるリン 脂質の脂質２重層の比は、得られる組織因子試薬の最高の凝固活性を考慮に入れ るものであり、外因系凝固性因子に対する試薬の有利な感度を評価する。

他の因子の中で、脂質２重層と会合している組織因子を有するリポソームからな る本発明の組織因子試薬は活性なプロ凝固性（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）複合 体であり、プロ酵素、第ＶＩＩ因子の、活性な凝固プロテアーゼ、第Ｖｌｌａ因 子への効率的変換ができる複合体であるということが見いだされたとうい驚くべ き発見に本発明は基づいている。組織因子単独溶液も、リポソームの脂質２重層 を単独で作り出すリン脂質混合物のどちらも、プロトロンビン時間試薬として活 性でないので、この発見は驚（べきものである。わたしはまた、さらにグリシン からなる本発明の組成物は、正常ヒト血漿に対するプロトロンビン時間を、疑ヒ ト血漿に対してデザインされた商業的コントロールのそれに等しくすることによ り、ＰＴ評価における実質的に改良された性能を示すといことを発見した。

従って、一つの好ましい見地に従うと、本発明は、プロトロンビン時間を決定す るのに有用なリポソーム組成物からなる組織因子試薬に向けられ、該リポソーム 組成物はリポソーム（またはリン脂質小胞）の脂質２重層と会合した組織因子か らなり、好ましくは低温保存剤（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）とグリシ ンの両方を含有する緩衝液である。もう一つの見地においては、本発明はこれら の組成物の調製に向けられる。

本発明の好ましい見地においては、リポソームを調製する方法は、比較的高い臨 海ミセル濃度を有する洗剤を利用し、高度に精製されたリン脂質を溶解する。

特に好ましい洗剤は、両性イオン洗剤、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチ ルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄ ｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｎｎｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕ ｌｆｏｎａｔｅ）　（ＣＨＡ　Ｐ　Ｓ　）である。組織因子も洗剤に溶解され、 キャリア蛋白が添加され、そして洗剤が除去される。洗剤は従来の方法、例えば 透析、樹脂処理または無洗剤溶液への希釈等の方法で便利に除去され得る。周囲 溶液の洗剤濃度が低くなるに従って、脂質２重層と会合しその中に挿入された組 織因子を有するリポソームが自発的に形成してなる。

」 ｒＢＨＴＪはブチレート化（ｂｕｔｙｒａｔｅｄ）ヒドロキシトルエンをいう。

ｒＣＨＡＰＳは」は３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ〕− １−プロパンスルフォネートをいう。

ｒＭＯＰｓＪは３−（Ｎ−モルフォリノ）−プロパンスルフォン酸をいう。

ｒＯＴＧＪはオクチルベーターＤ−チオグルコピラノシドをいう。

「リン脂質」は、グリセロール（最も普通）またはスフィンゴシンのいずれかか ら誘導された有機分子をいう。グリセロールから誘導されたリン脂質（またはホ スホグリセリド）は、グリセロールバックボーン、グリセロールの第１と第２の 炭素にエステル化した２つの脂肪酸の鎖および第３の炭素にエステル化したリン 酸からなる。

所望により、リン酸に対してアルコール部がエステル化される。

ｒＰｃＪはホスファチジルコリンをいい、コリンから誘導されたアルコール部分 を有する無電荷ホスホグリセリドがリン酸に対してエステル化されている。

ｒＰＥＪはホスファチジルエタノールアミンをいい、エタノールアミンから誘導 されたアルコール部分を有する正に荷電したホスホグリセリドがリン酸に対して エステル力化されている。

ｒＰＧＪはホスファチジルグリセコールをいい、グリセロールから誘導されたア ルコール部分を有する負に荷電したホスホグリセリドがリン酸に対してエステル 化されている。

ｒＰＳＪはホスファチジルセリンをいい、セリンから誘導されたアルコール部分 を有する負に荷電したホスホグリセリドがリン酸に対してエステル化されている 。

「プロトロンビン時間」はＰＴと略され、トロンボプラスチンあるいはプロトロ ンビン時間試薬の添加と、血小板欠乏の、クエン酸塩化された血漿中に血餅が出 現する間の時間間隔をいう。

「プロトロンビン比」はＰＲと略され、個体の血漿（正常でも、異常でもよい） のプロトロンビン時間を正常の個体の血漿のプールのプロトロンビン時間で割っ たものをいう。

ｒｒＴＦＪはリコンビナント組織因子をいう。

ｒＴＢＳＪは１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭトリス（ｐＨ７゜５ ）をいう。

図面の簡単な説明 図１は、因子活性パーセントの関数として、ＰＴ試薬、ｒＴＦ　ＰＴ試薬および トロンポレルＳのプロトロンビン比を示す。

図２は、経口抗凝固治療を受けている患者からの血漿に対するＰＴ試薬の相対的 感度を示す。

本発明の詳細な説明 本発明は、組織因子が脂質２重層を通して挿入されたような、リポソームの脂質 ２重層と会合した組織因子を有するリポソームからなる組織因子試薬を提供する 。

リポソームの脂質２重層はリン脂質、好ましくはホスホグリセリドからなる。

また、もう一つの本発明の見地によると、組織因子がミセル中に挿入されている ような、リン脂質ミセルと会合した組織因子を有するリン脂質ミセル組成物から なる組織因子試薬が提供される。

本発明の組織因子試薬は、リン指貫混合物１ｍｇ当たり、天然またはりコンビナ ンド組織因子約０．１μｇないし３μｇからなる。リン脂質混合物に対する組織 因子の比は、得られる組織因子試薬の感度を決定し得る。それ故、リン脂質混合 物１ｍｇ当たり、組織因子約１ないし２μｇの比での使用が、約１．０の国際感 度指数（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ　 ）（”ＩＳＩ”）を有する組織因子試薬に適当である。リン脂質混合物１ｍｇ当 たり、組織因子約０．２５ないし約０，５μｇの比での使用が、約１６ないし約 ２０のＩＳＩを有する組織因子試薬の調製に適当である。さらにグリシン約０５ ないし約１．５％（Ｗ／Ｖ）からなる組織因子試薬が好ましい。組織因子試薬を 凍結乾燥して貯蔵し後に再構成できることを望む場合、該試薬は好ましくは低温 保存剤、好ましくは炭水化物保存剤、最も好ましくはトレハロースを含有する。

Ａ　好ましいリン脂質混合物 本発明のリポソーム組成物における使用に適当なリン脂質は、１２ないし２０の 炭素原子を有する脂肪酸を含有するものを含む、該脂肪酸は飽和、不飽和いずれ であってもよい。本発明の使用に好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン（ ＰＣ）　、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）　、ホスファチジルグリセ ロール（ＰＧ）およびホスファチジルセリン（Ｐ　Ｓ）を含む。これらのリン脂 質はいかなる天然源から生じたものでもよく、そのようなリン脂質は異なる脂肪 酸を有する分子からなっていてもよい。異なる出所からのリン脂質からなるリン 脂質混合物を使用してもよい。例えば、ＰＣ，ＰＧおよびＰＥは卵黄から得ても よい：ＰＳは動物の脳またはを髄から得てもよい。これらのリン脂質は同様に合 成したものでもよい。

それぞれのＰＬの種々の比を有するリン脂質（ＰＬ）混合物を使用してもよい。

適当なＰＬ混合物は（ａ）約２０ないし約９５モルパーセントＰＣ：（ｂ）約２ ５ないし約５０モルパーセントＰＥ：　（ｃ）約２．５ないし約５０モルパーセ ントＰＳ：および（ｄ）約Ｏないし約４０モルパーセントＰＧからなる。好まし いものは約５ないし１５モルパーセントＰＥ、約３ないし約２０モルパーセント ＰＳ１約１０ないし約２５モルパーセントＰＧ：および残りがＰＣで、好ましく は約５０ないし約９０モルパーセントＰＣからなるＰＬ混合物である。特に好ま しいものは、約８ないし約１２モルパーセントＰＥ、約３ないし約１０モルパー セントＰＳ１約１４ないし約２０モルパーセントＰＧおよび約５８ないし約７５ モルパーセントＰＣからなるＰＬ混合物である。

リン脂質は種々の比で使用してもよいが、我々はそれぞれのリン脂質のある量を 有するリン脂質の混合物が、有利な活性と活性安定性を有する組織因子試薬の結 果になるということを見いだした。それぞれのリン脂質を広範囲の比で使用して もよいが、我々は有利な活性と得られる組織因子試薬の安定性にとって、全リン 脂質組成物中にある量のＰＳが存在しなければならないといことを見いだした。

ある量まで好ましく存在するＰＳの量はＰＬ混合物の残りの成分および全ＰＬ混 合物の一部としてのそれらの相対的量により決定される。例えば、もう一つの負 に帯電したリン脂質、ＰＧを多（使用すると（約１０％以上のオーダーで）、Ｐ Ｓの使用はより低い濃度、約３％のオーダーでよい。しかしながら、ＰＳ濃度が 低いＰＬ混合物を使用する場合、少なくとも約５％ＰＥ、好ましくは少なくとも 約１０％を含むことが有益である。

リン脂質は適当な比で組み合わせて、本発明の組織因子試薬の調製に使用される ＰＬ混合物を得る。一つの好ましい具体例は、ＰＬａ合物は６７　：１６　：　 １０ニアのモル比でＰＣ，ＰＧＳＰＥおよびＰＳからなるものである。他の好ま しい具体例は、ＰＬｆｉ合物は７．５　：　Ｏ：　１　：　１（１）モル比でＰ ｃ、ＰＧ、ＰＥお、及びＰＳからなるものである。

Ｂ９組織因子 天然の組織因子であれリコンビナント組織因子であれ本発明の組織因子試薬に使 用してもよい。色々な種からの天然あるいはりコンビナンド組織因子を使用して もよい。

天然の組織因子は従来の方法により単離しつる。例えば、ブロウズ、ジェーアー ル、ジー、ジェ＋、（Ｂｒｏｚｅ、　Ｊｒ、、　ＧＪ、）ら、ジ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｌｌ、　２６０（２０）：１０９１７−１０９２０（１９８５）　；および モリッセイ、ジェー、ニー７チ、　（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、　Ｊ、Ｈ，）らＴｈ ｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５０：　４８１−４９３　（１９８８） を参照せよ。

リコンビナント組織因子は当該分野に公知の方法および発現システムを使用する りコンビナンド技術で調製してもよい。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、　Ｊ、ｔ ｌ、ら、Ｃｅ１ｌ　５０：　１２９−１３５　（１９ｇ？）＋サマーズ、エム、 ディ＋、　（Ｓｕｍｍｅｒｓ、　１１．Ｄ、）、「バクロビールスベクターおよ び昆虫細胞培養手順の方法マニュアル（Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　１ｌｅｔｈｏ ｄｓ　ｆｏｒＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ 　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＰｒｏｃｅｄｕｒｅＪ、テキサス農業試験場（Ｔ ｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｉｔｉｏ ｎ）、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　１５５５　（１９８７）■Q照 せよ。

組織因子は、他の蛋白のコンタミから特定の蛋白を分離するように設計されてい るイムノアフィニティークロマトグラフィーまたは他のクロマトグラフの方法で 精製してもよい。

Ｃ３好ましい低温保存剤 低温保存剤は、デリケートな物質を含有する液体を凍結したり脱水したりすると き、それらの本来の姿を保存することに関係する。凍結およびその後の凍結乾燥 時にリポソームの完全な形の低温保存剤としての炭水化物の使用が報告されて後 の使用のため保存の前に、組織因子試薬を凍結乾燥するとき、低温保存剤として の炭水化物または炭水化物類を含ましめ、凍結乾燥およびその後の水分補給の間 、得られるリポソーム組成物中のリポソームの本来の姿を保護することが好まし い。適当な炭水化物低温保存剤は、トレハロース、マルトース、ラクトース、グ ルコースおよびマニトールを含む。本発明の好ましい見地によると、トレハロー スは本発明の組織因子試薬の調製（凍結乾燥前）に使用される緩衝水溶液に、好 ましくは約５０ｍＭないし約２５０ｍＭの範囲の濃度で含まれる。

Ｄ、グリシン 本発明の特に好ましい見地によると、これらの組織因子試薬の添加成分としてグ リシンを含有させる。これら組織因子試薬にグリシンを含有させると、擬ヒト血 漿に対してデザインされた商業的コントロールのそれらと実質的に等しい試薬に なり、正常ヒト血漿用のプロトロンビン時間を与えるＰＴアッセイにおいて、実 質的に改良された性能を示す。それ故、これらの好ましい組織因子試薬はさらに 約０．５パーセントないし約１．５パーセント（Ｗ：Ｖ）グリシン、より好まし くは約０．　６ないし約１．２パーセントグリシンからなる。

２、組織因子試薬の調製 リン脂質、それは有機溶媒製造業者から入手してもよく、適当な割合で一緒に混 合され、特定の組成物として得る。次に、酸化防止剤を添加して、リン脂質の脂 肪酸部分のアルキル鎖の過酸化を減少させ、そして有機溶媒を、存在すれば、蒸 発により除去する。一つの適当な酸化防止剤はブチレート化ヒドロキシトルエン である。好ましくは酸化防止剤的０．１％（重量）を使用する。

次に、乾燥された（蒸発された）リン脂質混合物は洗剤水溶液で再溶解させる。

適当な洗剤は比較的高い臨海ミセル濃度（ＣＭＣ）を有するものを含むものであ る。つｔ　７　ツク（ＷｏｍａＣｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＾ｅｔａ、７３３：　２１０　（１９８３）。このような洗剤は約２ｍＭより大 きいＣＭＣを有する洗剤を含むものである。好ましいものは約２ないし２５ｍＭ の間のＣＭＣを有する洗剤である。このような好ましい洗剤は、３−［（３−コ ラミドプロピル）−シメチルアンモニオコー１−プロパンスルフォネート（ＣＨ ＡＰＳ）およびアルキルグルコピラノシド、例えばオクチルベーターＤ−グルコ ピラノシド、オクチルベーターローチオグルコピラノシド等を含むものである。

所望により、洗剤溶液は他の成分を含んでいてもよい。このような成分はＨＥＰ ＥＳ、トリス、リン酸塩等の緩衝塩；ＮａＣｌ、ＫＣＩ等種々の他の塩ニドレバ ローズ、マルトース、グルコース等の炭水化物低温保存剤：およびグリシンを含 む。本発明の好ましい具体例によると、洗剤溶液は２０ｍＭトリス、ｐＨ７，５ ，１５０ｍＭＮａＣ］、（ＴＢＳ）含有１００ｍＭのＣＨＡＰＳ。

１５０ｍＭトレハローズおよび０．　８％グリシンからなる。好ましい具体例に よるとリン脂質はこの溶液に再溶解されて、最終温度約２０ｍｇ／ｍｌとなる。

組織因子およびキャリア蛋白は再溶解したリン脂質と化合し、得られる混合物の 容積は、上記したような、好ましくは低温保存剤（最も好ましくはトレハロース ）およびグリシンを含有するが洗剤は全（含有しない緩衝液で調整される。上記 したように本発明の組織因子試薬の調製に使用される組織因子は天然あるいはり コンビナンドによるものいずれのものでもよい。本発明の一つの好ましい具体例 によると、リコンビナント組織因子（ｒＴＦ）を使用する。組織因子、続いて、 ウシのガンマグロブ１ル等のキャリア蛋白を添加し、モし七十分な緩衝液を添加 し、最終濃度として組織因子を１０μｇ／ｍ＋、ウシガンマグロブリンを１ｍｇ ／ｍｌ、リン脂質を４ｍｇ／ｍｌおよび洗剤を２０ｍＭに調整する。適当な緩衝 液は１５０ｍＭトレハローズおよび０．８％グリシンを含有するＴＢＳを含む。

結果として得られる透明な、無色の溶液はポルテックス処理（ｖｏｒｔｅｘｉｎ ｇ）または音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｎｇ）を必要とせず共可溶化を確実にす る。

リン脂賀−組織因子混合物中の洗剤は多くの方法で除去でき、脂質２重層を通っ て挿入し会合した組織因子を有する安定なリポソーム組成物となる。洗剤除去の 適当な方法は透析、タンジェンンヤル・フローディアフィルトレーション（ｔａ ｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｄｉａｆｉｔｒａｔｉｏｎ）、十字流中空繊維フ ィルトレージョン（ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ　ｈｏｌｌｏｗ　ｆｉｂｅｒ　ｆｉｌｔ ｒａｔｉｏｎ）、疎水性クロ７トグラフイー樹脂での処理、および単純な希釈を 含む。

リン脂質−組織因子混合物からの洗剤除去の一つの好ましい方法は、１５０ｍＭ トレハローズ、０．８％グリシンおよび０．０５％ＮａＮ５を含有するＴＢＳ等 の緩衝溶液に対し透析メンプラン管中で室温で少なくとも３０時間の透析を利用 し、洗剤を除去する。もう一つの好ましい洗剤除去の方法は、樹脂処理を利用す る。適当な樹脂は、アンバーライト（Ａ＋＋ｂｅｒｌｉｔｅ）　ＸＡＤ−２（ｏ −ムアンドハース（Ｒｏｈａ＋　ａｎｄ　Ｈａａｓ）社、フィラデルフィア、ペ ンシルバニア）またはバイオ−ビーズ（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ）　５Ｍ−２（バイ オラッド（ＢｉｏＲａｄ）、リッチモンド、カリフォルニア）等の疎水性クロマ トグラフィー樹脂を含む。リン脂質−組織因子溶液との直接接触により、あるい は透析メンプランにより分離することにより、樹脂を使用し、洗剤を除去しても よい。リン脂質−組織因子溶液から洗剤を除去する速度は、溶液中の洗剤および クロマトグラフィー樹脂ビーズの重量比に比例する。

次に、洗剤除去段階で生じるリポソーム溶液を５ｍＭＣｄＣ１ｔにする。一つの 好ましい見地によると、完全に活性な組織因子を含有するリポソーム溶液を、使 用前に５０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，７５ｍＭトレハローズ、０．８％グリシン および１０ないし１５ｍＭＣａＣ］ｘの濃度に希釈する。また、希釈した試薬は 、プロトロンビン時間試薬のような性能特性の長期保護のために凍結乾燥し、そ の後使用前に水中での懸濁により再構成してもよい。

もう一つの好ましい洗剤除去の方法は、透析あるいは樹脂処理の使用をさけるも のであるが、活性ＴＦ試薬の調製を提供するものである。この方法によれば、Ｔ Ｆを含有する洗剤溶解リン脂質を洗剤を含まない緩衝液中に希釈し、ＣｄＣ１□ で完全に活性化されつる状態のＴＦを含有する混合ミセルを製造する。本発明の この見地によると、リン脂質は、洗剤、好ましくはアルキルグルコピラノシドを 含有する緩衝液中に２０ｍｇ／ｍｌに溶解される。適当な緩衝−洗剤溶液は、５ ０ｍＭオクチルベーターＤ−チオグルコピラノシド（ＯＴＧ）および１５０ｍＭ ＮａＣ１を含有する２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ６）からなる。次にキャリア 蛋白、ＴＦ、およびＣｄＣｌ□を添加し、混合物をさらに１５０ｍＭＮａＣ１を 含有する２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ６）等の洗剤を含まない緩衝液で希釈し 、ＴＦ　１０μｇ／ｍｌ、キャリア蛋白（ウシガンマグロブリン）１ｍｇ／ｍｌ 、ＣｄＣｌ２５ｍＭ、リン脂質４ｍｇ／ｍｌ、およびＯＴＧ　１０ｍＭの最終濃 縮物を得る。試薬は上記したように貯蔵のために凍結乾燥してもよ（、また使用 前に上記したように希釈してもよい。

本発明のもう一つの見地によると、この試薬は、リヒテンベルグ、ディー。

（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ、　Ｄ）およびバレンホルッ、ワイ、　（Ｂａｒｅｎ ｈｏｌｔｚ、　Ｙ、）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＢｉｏｅｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａ ｌｙｓｉｓ、　３３：　３３７−４６２　（１９８８）に記載されているように 有機溶媒の除去、洗剤除去、およびサイズ変形による等の機械的な手段に基づく 方法によりリン脂質から小胞および洗剤−リン脂質混合ミセルの調製のための方 法で調製してもよく、その開示を参照文献としてここに引用する。

本発明の理解を助けるために、以下の実施例が含まれ、一連の実験結果を記述す る。本発明に関連する以下の実施例は例示的なものであり、当然に本発明を特に 制限するものとして解釈されるべきものではない。また、本発明のこのうなバリ エーションは、今や公知でありまたは後で進展されたものであっても、いわゆる 当業者の範囲内になるであろうものは、後記で請求される本発明の範囲内に入る ものと考えられるべきものである。

寒應男 抗リコンビナント組織因子アフィニティーゲルの調製モーリッセイ（Ｍｏｒｒｉ ｓｓｅｙ、Ｊ、Ｈ，）ら、トロンポンス・リサーチ（Ｔｈｒｏａ＋ｂｏｓｉｓｒ ｅｓｅａｒｃｈ）第５２巻第２４７〜２６１頁の方法により作成したＴＦに対す るモノクローナル抗体ＴＦ８−５Ｇ９をニシントン博士（Ｄｒ、　Ｔ、Ｓ、　Ｅ ｄｇｉｎｔｏｎ）より得た。ＴＦ８−５Ｇ９の腹水を、バーロウら（Ｉｌａｒｌ ｏｗ、Ｅ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、　Ｄ、　）の「抗体；実験室マニュアル」第３０ ４〜３０５頁、コールド・スプリング・ノ＼−ノく−・ラボラトリ−（１９８８ 年）に記載の手法を用いて、ＤＥＡＥクロマトグラフ法にてＩｇＧに精製した。

アフィゲル１０　（Ａｆｆｉｇｅｌ　ＩＯ！バイオラッド・ラボラトリーズ、す ・ツチモンド、カリフォルニア）へ、製造元より推奨された方法にてこの精製し た抗体を共有付着させることによってイムノアフィニティー樹脂を作成した、す なわち、２０ｈｇのＤＥＡＥ精製ずみモノクローナル抗体を領ＩＭのＭＯＰＳ　 （ｐＨ７，５）中へ透析し、１０ｍｇ／ｍｌの溶液とした。２０ｍ１のこの抗体 溶液をその後２０ｍ１のアフィゲル１０に添加した。この混合物を一晩の間２な いし８℃で反転させながらインキュベートした。１６から２４時間後、２０ｍ１ の０．１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８）を添加し、全ての未反応基を結合させて このがツブリング反応を終了させた。樹脂を排出させ、０．１ＭのＭＯＰＳ　（ ｐＨ７，５）で洗浄して得たイムノアフィニティー樹脂を２〜８℃で保存した。

９５％以上のカップリング効率が認められた。

リコンビナント組織因子（ｒＴＦ）は以下の方法を用いて細胞溶解物を精製して 得た。ｒＴＦを産生ずる細胞をＴＢＳで洗浄し、０．２５％のトリトンＸ１０Ｑ 　（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００）、１０　μｇ／ｍｌのダイズトリブシンインヒビ ターおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＴＢＳに２　Ｘ　１０’／ｍｌとなるよ う再懸濁した。４℃で３０分間混合した後、細胞のデブリスを４℃、約５０００ ｘｇで２０分間遠心分離して除いた。

上清の溶解物をＴＢＳで２．５倍に希釈し、トリトンの濃度を０，１％に減らし 、その後ＴＦに対するモノクローナル抗体が共有的にカップリングしているイム ノアフィニティー樹脂（実施例１で作製したもの）を通した。この樹脂ベッドを ベッド体積の２から３倍量ＴＢＳ＋０．１％のトリトンＸ１００．２から３倍量 の２０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）、０．５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％トリトンＸ１ ００、および最後に２から３倍量の０．５Ｍ　ＮａＣ１，０，１％トリトンＸ１ ００で洗浄した。結合したタンパクを樹脂より、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２， ５，０，１％トリトンＸ１００で溶離させた。緩衝液をグリシンに変えた後に集 めたフラクションを適当な量のＩＭのトリス（ｐＨ８）で中和した。ｒＴＦはカ ラム流出物のｐＨが変化した点のすぐ近辺のフラクションに認められた。

ｒＴＦを含有するフラクションをプールし、２０ｍＭ）リス（ｐＨ８）、０．１ ％トリトンＸ１００中で透析し、その後このｒＴＦをベッド体積の小さいＤＥＡ Ｅトリスアクリルカラム（ＩＢＦバイオツテクエックス、コロンビア、メリーラ ンド）へ結合させた。この樹脂ベッドを、少なくともその１０倍量のＣＨＡＰＳ ｌｏｍＭを含有する２０ｍＭトリス（ｐＨ８）で洗浄し、トリトンＸ１００をＣ ＨＡＰＳと交換した。ｒＴＦは２０ｍＭ）リスｐＨ８，１０ｍＭＣＨＡＰＳ中の ０．５Ｍ　ＮａＣ１により一段階で溶離させられる。

ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホ スファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）はクロ ロホルム溶液としてアバンティ・ポーラ−・リビッズ（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａ ｒ　Ｌｉｐｉｄｓ）（アラバスタ−、アラバマ）またはカルバイオケム・コーポ レイション（ＣａｒｂｉｏｃｈｅｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　（う・ジヨウ、 カリフォルニア）より、密封ガラスアンプル入りの製品を購入し、窒素雰囲気下 −２０℃で保存した。ＣＨＡＰＳ、他の洗剤およびウシガンマグロブリンはカル バイオケム社より購入した。トリス塩基およびグリシンはバイオラッド・ラボラ ドリース（リッチモンド、カリフォルニア）より購入した。他の化学試薬および 生化学試薬はシグマ社（セントルイス、ミズーリ）から購入した。

リン脂質は再溶解するため以下の方法で処理した。ＰＣＳＰＥ、ＰＳおよびＰＧ を室温まで暖め、特定のモル比にて適当な管またはフラスコ内で化合させた。

抗酸化剤であるブチレート化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）をクロロホルムへ溶 解させ、このリン脂質の混合物中へ重量比０．１　（ＢＨＴ・全リン脂質）で添 加した。有機溶剤は乾燥窒素気流下もしくはロータリーエバポレーター内で減圧 下で蒸発させて除いた。残存する有機溶剤は、さらに１時間、室温にて真空ポン プを用い１０μｍまたはそれ以下の圧力における吸引によって除いた。リン脂質 混合物は１００ｍＭのＣＨＡＰＳを含有する２０ｍＭトリスｐＨ７，５，１５０ ｍＭＮａＣ１（ＴＢＳ）に２０ｍｇ／ｍｌとなるように再溶解した。

実施例３に記載したごと（、リン脂質は特定のＰＣＳＰＥ、ＰＳおよびＰＧのモ ル比で化合させ、その後再溶解させた。再溶解させたリン脂質はイムノアフィニ ティー精製ずみｒＴＦおよびウシガンマグロブリンと化合させた。さらに１５０ ｍＭのトレハローズを含有するＴＢＳを添加し、最終濃度をそれぞれ全リン脂質 が４ｍｇ／ｍ１ＳｒＴＦがＩｇ／ｍｉ、ウシガンマグロブリンが１ｍｇ／ｍｌお よびＣＨＡＰＳ２０ｍＭとした。この無色透明の溶液を透析メンプランチューブ （スペクトラポアー”　（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒｅ”）（スペクトラム・メディ カル・インダストリース製、分子量のカットオフ１２０００ないし１４０００） 内に投入し、少なくとも室温で３０時間、１５０ｍＭのトレハローズと０．０５ ％のＮａＮ、を含有するＴＢＳで透析した。透析終了後、透析物の体積を測定し 、必要であれば透析用緩衝液にてもとの体積にあわせた。ＣｄＣ１ｚを最終濃度 が５ｍＭとなるように添加し、この溶液を３７度で２時間インキュベートした。

溶液はドライアイス上で凍結させ、その後−４０℃ではじまり室温で終わる４８ 時間にわたるサイクルを用いて好脂性とした。リポソームはその後０．１Ｍ）リ ス、ｐＨ７，５，１５０ｍＭトレハローズにて作業の濃度に再構築しておよそｒ ＴＦＩないし２μｇ／ｍｌ、リン脂質およそ４００ないし８００μｇ／ｍｌおよ びウシガンマグロブリン５０ないし１００μｇ／ｍｌを含有する溶液を得た。

上記のように調製したｒＴＰ　ＰＴ試薬はトロンボスクリーン・コントロール血 漿（カーチン・マセソンφサイエンティフィック（Ｃｕｒｔｉｎ　Ｍａｔｈｅｓ ｏｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ヨーバ・リンダ、カリフォルニア）および正常ヒト 血漿プールのプロトロンビン時間の測定に用いた。すなわち１００μｍの血漿お よび１００μｍの希釈したリポソームを凝固計のサンプル用ウェル内に投入する 。装置が２０ｍＭの（ａｃ１４を１００μｍ添加し、自動的にプロトロンビン時 間を測定する。

結果を表１に示した。

表１　様々なリン脂質比率を用い、透析により調製したＰＴ試薬のプロトロンビ ン時間 （ＰＣ：ＰＥ：ＰＳ：ＰＧ）′″　ＮＨＰｂ　レベルエ°　レベルＩＩ　レベル ｌｌ１１：１：１：０　１３．５　１３．８　２５，９　４９．０１：１：Ｏ： ０　６０．０　１６４．ｊ　１０ｇ、１　２４６．１１：０：１：０　１２．６ 　１４，７　３０，４　５２．７３：１：１：０　１３．４　１９．５　５３， ４　６９．９３：１：Ｏ：０　７７．５　２２９．４　−’　２３１．１３：０ ：１：０　１７．３　２７，５　７０．１　９８．２５：１：１：０　１１．１ 　１３．１　３５，２　６５．４５二Ｏ：１：０１０．７１３，５３４．８６６ ．１１〇二ｌ：１：Ｏｔ２．４　１６．４　４８．４　８９．２１０：Ｏ：１： ０　１４．９　２１．０　６２．７　１１２．６２０：１：１：０　１８．４　 ２７，５　８２．９　１４７．６７．５：１：０．５：１　１０．２　１８．６ 　４８．８　８２．７８．５：０：０．５：１　１３．６　２７．９　７ｇ、２ 　１３１．８８：１：０．２５：１　１３．８　２７．２　７６．１　１２８． １９：Ｏ：０．２５：１　１７．５　３５．７　１０３．４　１８７．６７：１ ：０．２５：２　１０．７　１８．４　５４．５′９８．０８：０：０．２５＋ ２　１３．７　２６．１　７６．８　１１８．８７：１：０．１：２　１２．６ 　２３．０　７０．２　１１９．８ａ　リン脂質比率はそれぞれホスファチジル コリン対ホスファチジルエタノールアミン対ホスファチジルセリン対ホスファチ ジルグリセロールのモル比を示す。

ｂ　正常ヒトプール（Ｎｏｒ＋ｎａｌ　ｈｕｍａｎ　ｐｏｏｌ：Ｎｔ［Ｐ）は正 常な１０個体の血漿をプールしたものからなり、小分けして急冷して凍結したも のである。

ＣレベルＩ、　ＩＩおよびＩＩＩはトロンボスクリーン・コントロール血漿（カ ルチン・メートリン・サイエンティフィック、カリフォルニア州ヨーバ・リング ）であって３段階の異なったレベルもしくは強さの経口抗凝固治療中の患者の血 漿に似せてデザインしたものである。

ｄ　３００秒以上であった。

このデータは（１）ｒＴＦ　ｐ”ｒ試薬においては、ｒＴＦによる凝結機構を開 始させるためには広範囲のモル比のリン脂質が許容できること、（２）この試薬 はｒＴＦ誘導性の凝固活性のために、リン脂質組成物としてＰＳまたはＰＧのよ うな全体で負電荷を有するものを必要とすることおよび、（３）ＰＳの濃度が実 質的に少ない場合には、この試薬はＰＥおよびＰＧを共に必要とする、というこ とを示す。

表■において使用されたコントロール血漿は経口抗凝固治療中の患者から得られ るものに似せたものである。これらを用いて得られたプロトロンビン時間は、い ずれかの凝固因子が欠損していることは示しさないが、いくつかの因子の活性が 低下していることを示している。

ｒＴＦ　ＰＴ試薬が外因系凝固経路（第Ｖ、　ＶＩＩ、Ｘ因子）に含まれるいく つかの因子のレベルの減少に対していかに反応するかをＦｉｇｕｒｅ　ｌに示し た。プロトロンビン（ＰＴ）時間は以下のようにして測定した。正常ヒト血漿プ ールを１２．１：４．１：１０，１：２０および１：４０に０．１５Ｍ　ＮａＣ １で希釈し、それぞれ５０．２５．１０．５および２．５％の因子活性の試料を 得た。凝固因子欠損血漿サンプル（トロンボスクリーン、カルチン・メートリン ・サイエンティフィック・インコーホレイテッド）は製造元の示唆のごと（再度 水和して、希釈せずに用いた。ここで用いたｒＴＰ　ＰＴ試薬はリン脂質比率が １０：１：１（それぞれＰＣ：　ＰＥ　：　ＰＳ）で１０ｍＭのＣａ　Ｃ１，を 含有するものである。トロンボレルＳ　（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ　Ｓ）バーヒン グ・ダイアグノスティックス（ＢｅｒｈｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、サマ ービル、ニュー・シャーシー）を再水和し製造元の推奨するように取り扱った。

１００μｍの希釈した正常ヒト血漿（ＮＨＰ）および１００μｍの凝固因子欠損 血漿を凝固計のサンプルウェルへ投入した。ＰＴ試薬（２００μｍ）がこの装置 によって添加され、ＰＴは自動的に測定される。プロトロンビン比率（ＰＲ）を 凝固因子が欠乏した血漿のＰＴを希釈していないＮＨＰで得られたＰＴで除して 得、ＮＨＰによって供給される因子のパーセントに対してプロットした。

Ｆｉｇｕｒｅ　ｌのデータはｒＴＦ　ＰＴ試薬を用いると試験した全ての血漿希 釈標品において高いＰＲ値となった。同じ希釈値の正常血漿プールを用いて他の ＰＴ試薬より高いＰＲを示すＰＴ試薬はより感度が高いものである。それゆえ、 このｒＴＦ　ＰＴ試薬はトロンポレルＳに比べて試験した特定の凝固因子の欠乏 に対する感度が高いということになる。

リン脂質を以下の方法で再溶解した。ＰＣ，ＰＥおよびＰＳは室温まで加熱し、 適当な管またはフラスコ中でＰＣＳＰＥおよびＰＳモル比がそれぞれ７．５：１ ：１となるように化合させた。抗酸化剤のブチレート化ヒドロキシトルエン（Ｂ ＨＴ）をクロロホルムに溶解させ、上記リン脂質混合物に重量比が０．１％（Ｂ ＨＴ：全リン脂質）となるように添加した。有機溶剤は乾燥窒素気流下もしくは ロータリーエバポレーターにて減圧下で蒸発させて除いた。残存する有機溶剤は 、さらに１時間室温にて真空ポンプを用い１０μｍまたはそれ以下の圧力におけ る吸引によって除いた。

リン脂質混合物は５０ｍＭのオクチルベーターローチオグルコピラノシド（ＯＴ Ｇ）を含有する２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ６）、１５０ｍＭ　ＮａＣ１中に 最終濃度が４ｍｇ／ｍｌとなるように再溶解させた。実施例２で得たｒＴＦとウ シガンマグロブリンとを再溶解リン脂質と混合した。十分量の２０ｍＭＨＥＰＥ Ｓ（ｐＨ６）、１５０ｍＭ　ＮａＣ１を添加し、最終濃度がそれぞれｒＴＦ　１ ０ｇｇ／ｍｌ、ウシガンマグロブリン１ｍｇ／ｍｌ、リン脂質４ｍｇ／ｍｌおよ びＯＴＧが１０ｍＭとなるようにした。ＣｄＣｌ２を最終濃度が５ｍＭとなるよ うに添加してｒＴＦを活性化させた。ｒＴＦ、ＯＴＧおよびリン脂質ならなる得 られた混合ミセルを２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ６）、１５０ｍＭ　ＮａＣ１ で希釈し、ｒＴＦをおよそ０５ないし１μｇ／ｍ１　、リン脂質をおよそ５００ ないし７００μｇ／ｍｌおよびウシガンマグロブリンをおよそ２５ないし５０ｇ ｇ／ｍｌ含有する溶液を得、ｒＴＰ　ＰＴ試薬とした。

本実施例の試薬をトロンボスクリーンコントロール血漿および正常ヒト血漿プー ルのプロトロンビン時間を測定するのに用いた。この血漿のコントールは異なる レベルの血液凝固第１Ｉ、Ｖ、ＶＩＩおよびＸ因子の活性を有する擬血漿として 製造されたものである。コントールＩは正常活性レベル付近を含有する、コント ールＩＩには中間レベルであり、コントールＩＩＩは最低レベルを含有する。プ ロトロンビン時間はコントール■で一番短く、コントールＩＩＩで最も長いこと が予測される。表ＩＩに結果を示す表ＩＩ　透析操作をせずに調製したコルパス のｒＴＰ　ＰＴ試薬を用いたコントロール血漿のプロトロンビン時間１正常ヒト 血漿プール　１２．５ トロンボスクリーン・コントロール血漿ニレベルＩＩＩ　８１．１ 表１のフットノートに記載したものである。

このｒＴＦ　ＰＴ試薬の感度をさらに、経口抗凝固治療中の患者の血漿を用いて 他の市販のプロトロンビン時間（ＰＴ）試薬と比較した。市販の試薬はトロンポ レルＳ（バーヒング・ダイアグノスティックス、サマービル、ニューシャーシー ）、シンプラスチン（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ）　（オーガノン・テクニカ社、シ ャーロッテ、ノース・カロライナ）である。血漿サンプルは正常個体より得たも のおよび経口抗凝固治療中の患者から得たものであり、地方病院で凍結されたも のを得た。

各血漿サンプルに対するプロトロンビン時間を各３つのＰＴ試薬を用いて調べた 。すなわち、１００μｍの血漿と１００μｍのｒＴＰ　ＰＴ試薬とを凝固計のサ ンプルウェルに投入した。この装置は２０ｍＭｃ′）ＣａＣ１□を１００μｌ添 加し、プロトロンビン時間を自動的に測定する。トロンポレルＳおよびシンプラ スチンでは、１００μｌの血漿をサンプルウェルに投入し、この装置が２００μ ｌのＰＴ試薬を添加する。ｒＴＦ　ＰＴ試薬およびシンプラスチンを用いて得た 各患者のプロトロンビン時間の対数変換値を、トロンポレルＳを用いて測定した 同じものに対してプロットした。Ｆｉｇｕｒｅ２に示したデータより、ｒＴＦ　 ＰＴとトロンボレルＳは領８１の傾きを示した。傾きが１０であれば２つのＰＴ 試薬が同じ能力を有することを意味する。すなわち、ｒＴＰ　ＰＴ試薬の感度は トロンボレルＳに比べておよそ２０％高い。しかしながら、シンプラスチンとト ロンボレルＳとを比較したグラフの傾きは１．６２であり、シンプラスチンはト ロンボレルＳよりかなり感度が低いことを示す。上記のデータは表ＩＩから結論 付けられる、ｒＴＰＰＴ試薬は凝固因子活性の減少に対して感受性であり、この 感度は実際の患者の血漿および患者の血漿に似せたちのどちらででも示されると いうことを確認する。

実施例６ ｒＴＦ　プロトロンビン時間試薬のディアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔ ｒａｔｉｏｎ）による調製 リン脂質は７．５＋１：１　（ＰＣ：ＰＥ：ＰＳ）のモル比で化合させ、乾燥さ せて有機溶剤を除き、その後実施例３に記載したごとく再溶解させた。１００ｍ ＭのＣＨＡＰＳを含有するＴＢＳＩ：１５ｍｇ／ｍｌで再溶解したリン脂質をイ ムノアフィニティーで精製したｒＴＦ　（実施例２で得たもの）およびウシガン マグロブリンと化合させた。１５０ｍＭのトレハロースを含有するＴＢＳをさら に添加して最終濃度がリン脂質４ｍｇ／ｍＬ　ｒＴＦが１０μｇ／ｍｌ、ウシガ ンマグロブリンが１ｍｇ／ｍｌおよびＣＨＡＰＳが２０ｍＭとなるようにした。

洗剤（ＣＨＡＰＳ）を、ピロスタート（Ｐｙｒｏｓｔａｒｔ）またはウルトラス タート（υ１ｔｒａｓｔａｒｔ）フィルターユニット（サートリアス社（Ｓａｒ ｔｏｒｉｕｓ　Ｃｏｒｐ、　）ボヘミア、ニューヨーク）を用い、透析用緩衝液 として１５０ｍＭのトレハロースを含有するＴＢＳを用いてタンジエン／ナル・ フロー・ディアフィルトレーション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｄｉａ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって除いた。およそ９５から１００％のＣＨＡＰＳ が、１０倍量の透析用緩衝液をこの装置に通すことによって除かれた。

ディアフィルトレーションの後、透析物の体積を測定し、（必要であれば）１５ ０ｍＭのトレハロースを含有するＴＢＳで最初の体積にｍ節し、０．０５％のＮ ａＮ５・ＣｄＣＬを最終濃度が５ｍＭとなるように添加しこの溶液を３７℃で２ 時間インキュベートした。

溶液をドライアイス上で凍結し、その後−４０℃ではじまり室温で終了する４８ 時間にわたるサイクルによって好脂肪化してもよい。得られた試薬は０．１Ｍト リス、ｐＨ７，５，１５０ｍＭトレハローズを添加して作動濃度にし、ｒＴＦを およそ１ないし２μｇ／　ｍ　１、リン脂質をおよそ４００ないし８００μｇ／ ｍｌおよび、ウシガンマグロブリンを５０ないし１００μｇ／ｍｌ含有する溶液 を得た。

この試薬は表ＩＩで観察されたものと同様の性能を示した。

リン脂質はモル比６７：１６：１０ニア　（ＰＣ：ＰＧ＋ＰＥ：ＰＳ）で化合さ せ、乾燥させて有機溶剤を除き、その後実施例３に記載されたごとく再溶解した 。

１００ｍＭのＣＨＡＰＳと０．　８％のグリシンを含有するＴＢＳＩ：１５ｍｇ ／ｍｌに再溶解させたリン脂質を、イムノアフィニティーで精製したｒＴＦ（実 施例２より）およびウシガンマグロブリンと化合させた。さらに１５０ｍＭのト レハロースと０．８％のグリシンを含有するＴＢＳをさらに添加し、リン脂質３ ｍｇ／ｍｌ、ｒＴＦ４．５μｇ／ｍｌ、ウシガンマグロブリン１ｍｇ／ｍｌおよ びＣＨＡＰＳ　２０ｍＭの最終濃度を得た。

アンバーライトＸＡＤ−２（＾ａ＋ｂｅｒｌｉｔｅ　ＸＡＤ−２Ｘｏ−ムアンド Ｈハース社フィラデルフィア、ペンシルバニア）またはバイオ−ビーズＳ　Ｍ　 −２（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ　５Ｍ−２）（バイオラッド、リッチモンド、カリフ ォルニア）のような疎水性クロマトグラフィー用樹脂を洗ｉ＄１７（Ｃ）（ＡＰ Ｓ）を除くのに、リン脂質溶液に直接接触させて、または透析メンプランにより リン脂質より分離させたものに接触させて用いた。

除去速度は溶液中の溶液中の洗剤とクロマトグラフ樹脂ビーズとの洗剤との重量 比に比例する。実際、除去速度は添加した樹脂の量および添加速度の両方に比例 する。全洗剤を除去するのに必要とされる量は樹脂の容量（製造元より与えられ た）および除去する全洗剤の体積から計算される。さらに、洗剤を９９．９％除 去するのは、この量の樹脂が添加される速度に依存して３０℃において、１時間 以内または２４時間以内のどちであってもよい。ＣｄＣ１！を最終濃度が５ｍＭ となるように添加し、この溶液を３７℃で２時間インキュベートした。リポソー ムは５０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，７５ｍＭトレハローズ、１５ｍＭ　ＣａＣ１ ４，ｏ、８％グリシン、１％マルトース、０．０５％ＮａＮ、で作動濃度に希釈 し、ｒＴＦをおよそ０．０４ないし０．２０　μｇ／ｍｌ、リン脂質をおよそ４ ０から１５０　μｇ／ｍｌおよびウシガンマグロブリンを５０ないし１００μｇ ／ｍｌ含有する溶液を得た。

溶液はドライアイス上で凍結させ、その後−４０℃ではじまり室温で終了する４ ８時間にわたるサイクルを用いて好脂化した。好脂化した試薬を使用前に蒸留水 で再構成した。

ｒＴＰ　ＰＴ試薬の性能を測定し、その結果を以下の表ＩＩＩに示した。すなわ ち、１００μｌの正常ヒト血漿プールまたはオルソ・コントロール血漿（Ｏｒｔ ｈ。

ｃｏｎｔｒｏｌ　ｐｌａｓｍａ）を凝固計のサンプル用ウェル内へ投入した。こ の装置は１００μｌのｒＴＰ　ＰＴを添加してプロトロンビン時間を測定する。

表ＩＩＩ：　ＸＡＤ−２操作により調製したコルバスのｒＴＦ　ＰＴ試薬を用い たコントロール血漿のプロトロンビン時間血漿サンプル　平均ＰＴ待時間秒） 正常ヒト血漿プール　１２．１ オルン・コントロール血漿・ レベル１１１８ レベルＨ３５，７ レベルＩＩＩ　６３．１ ａ正常ヒトブール（ＮＨＰ）は正常な１０個体から得た血漿プールであり、小分 けして急速凍結したものである。レベル■、ｎおよびＩＩＩはオルソ診断系のコ ントロール用血漿（ラリタン、ニューシャーシー）であり、３つの異なったレベ ルまたは強度の経口抗凝固治療中の患者のものに似せた血漿である。

このデータはｒＴＰ　ＰＴ試薬が本発明の目的とする能力を有することを示す。

第一に異なったコントロールのプロトロンビン時間が様々な程度の抗凝固治療中 患者からの血漿に似せるようにデザインされたこれらのコントロールに対してそ の予測される変化を反映している。第２に正常ヒト血漿のプロトロンビン時間が レベル■のコントロールと合致する。後者の効果はグリシンを試薬中に含むこと に起因する。表Ｉと表Ｉｎのデータを比較せよ。

ｒＴＦ　ＰＴ試薬対トロンボレル５ ｒＴＦ　ＰＴ試薬対トロンポレル５ ＦＩＧ、　２ａ １．０　１．５　２．０　２．５ ｒＴＦ　ＰＴ試薬による プロトロンビン時間（Ｌｏｇ） １．０　＋、５　２．０　２．５ ノンプラスチンによる プロトロンビン時間（Ｌｏｇ） 国際調査餠失 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＰＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＦＩ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）以下のリン脂質を含有するリン脂質混合物：（ｉ）約２０から約９５ モルパーセントのホスファチジルコリン；（ｉｉ）約２．５から約５０モルパー セントのホスファチジルエタノールアミン；（ｉｉｉ）約２．５から約５０モル パーセントのホスファチジルセリン；および（ｉｖ）約０から４０モルパーセン トのホスファチジルグリセロールおよび（ｂ）リン脂質混合物１ｍｇにつき約０ ．１μｇから約３μｇの組織因子を含有するリポソ−ム組成物を含有する組織因 子に基づくプロトロンビン時間試薬。 ２．約０．５パーセントから約１．５パーセントのグリシンをさらに含有する第 １項記載のプロトロンビン時間試薬。 ３．トレハロース、マルトース、ラクトース、グルコースおよびマニトールから なる群から選択される炭水化物低温保存剤をさらに含有する第１項記載のプロト ロンビン時間試薬。 ４．炭水化物低温保存剤が約５０ｍＭから２５０ｍＭのトレハロースである第３ 項記載のプロトロンビン時間試薬。 ５．リン脂質混合物が、約５から約１５モルパーセントのホスファチジルエタノ ールアミン；約５から約２０モルパーセントのホスファチジルセリン、約１０か ら２５モルパーセントのホスファチジルグリセロールおよびその残りのホスファ チジルコリンを含有する第１項記載のプロトロンビン時間試薬。 ６．リン脂質混合物が、約８から約１２モルパーセントのホスファチジルエタノ ールアミン、約３から約１０モルパーセントのホスファチジルセリン、約１４か ら約２０モルパーセントのホスフアチジルグリセロールおよび約５８から約７５ モルパーセントのホスファチジルコリンを含有する第１項記載のプロトロンビン 時間試薬。 ７．リン脂質混合物が、約１２モルパーセントのホスファチジルエタノールアミ ン、約３から約１０モルパーセントのホスファチジルセリン、約１４から約２０ モルパーセントのホスファチジルグリセロールおよび約５８から約７５モルパー セントのホスファチジルコリンを含有する第１項記載のプロトロンビン時間試薬 。 ８．組織因子がリコンビナント組織因子である第７項記載のプロトロンビン時間 試薬。 ９．約０．６から約１．２パーセント（ｗ／ｖ）のグリシンを含有する第４項記 載のプロトロンビン時間試薬。 １０．以下のステップ：（ａ）リン脂質混合物、組織因子およびキャリアータン パクを洗剤で共溶解する； （ｂ）洗剤を除く；そして （ｃ）カルシウム塩を添加する を有するリン脂質小胞の脂質二重層と会合した活性組織因子を含有するプロトロ ンビン時間試薬の調製方法。 １１．リン脂質混合物が約２０から約９５モルパーセントのホスファチジルコリ ン、約２．５から約５０モルパーセントのホスファチジルエタノールアミン、約 ２．５から約５０モルパーセントのホスファチジルセリンおよび約０から約４０ モルパーセントのホスファチジルグリセロールを含有する第１０項記載の方法。 １２．ステップ（ａ）において約０．５から約１．５モルパーセントのグリシン をさらに共溶解性とする、第１０項記載の方法。 １３．組織因子がリコンビナント組織因子である第１２項記載の方法。 １４．洗剤がチャプス（ＣＨＡＰＳ）、オクチルベーターＤ−グルコピラノシド およびオクチルベーターＤ−チオグルコピラノシドからなる群から選択される第 １１項記載の方法。 １５．洗剤が透析、タンジェンシャル・フロー・ディアフィルトレーション（ｔ ａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）およびクロマト グラフ法からなる群から選択される手法により除かれる第１１項記載の方法。 １６．（ａ）以下のリン脂質を含有するリン脂質混合物；（ｉ）約２０から約９ ５モルパーセントのホスファチジルコリン；（ｉｉ）約２．５から約５０モルパ ーセントのホスファチジルエタノールアミン；（ｉｉｉ）約２．５から約５０モ ルパーセントのホスファチジルセリン：および（ｉｖ）約０から４０モルパーセ ントのホスファチジルグリセロール；（ｂ）リン脂質混合物１ｍｇにつき約０． １μｇから約３μｇの組織因子；および（ｃ）洗剤 を含有するリン脂質ミセルを含有する組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬 。 １７．約０．５から１．５パーセントのグリシンをさらに含有する第１６項記載 のプロトロンビン時間試薬。 １８．トレハロース、マルトース、ラクトース、グルコースおよびマニトールか らなる群から選択される炭水化物低温保存剤をさらに含有する第１６項または１ ７項記載のプロトロンビン時間試薬。 １９．炭水化物低温保存剤が約５０ｍＭから２５０ｍＭのトレハロースである第 １８項記載のプロトロンビン時間試薬。 ２０．リン脂質混合物が、約５から約１５モルパーセントのホスファチジルエタ ノールアミン；約５から約２０モルパーセントのホスファチジルセリン、約１０ から２５モルパーセントのホスファチジルグリセロールおよびその残りのホスフ ァチジルコリンを含有する第１９項記載のプロトロンビン時間試薬。 ２１．リン脂質混合物が、約８から約１２モルパーセントのホスファチジルエタ ノールアミン、約３から約１０モルパーセントのホスファチジルセリン、約１４ から約２０モルパーセントのホスファチジルグリセロールおよび約５８から約７ ５モルパーセントのホスファチジルコリンを含有する第１項記載のプロトロンビ ン時間試薬。 ２２．リン脂質混合物が、約１２モルパーセントのホスファチジルエタノールア ミン、約３から約１０モルパーセントのホスファチジルセリン、約１４から約２ ０モルパーセントのホスファチジルグリセロールおよび約５８から約７５モルパ ーセントのホスファチジルコリンを含有する第１６項または１７項記載のプロト ロンビン時間試薬。 ２３．組織因子がリコンビナントの組織因子である第２２項記載のプロトロンビ ン時間試薬。 ２４．約０．６から約１．２パーセント（ｗ／ｖ）のグリシンを含有する第１９ 項記載のプロトロンビン時間試薬。 ２５．洗剤がアルキルグルコピラノシドである第１６項または１７項記載のプロ トロンビン時間試薬。 ２６．以下のステップ：（ａ）リン脂質混合物、組織因子およびキャリアータン パクを洗剤で共溶解する； （ｂ）洗剤を除く；そして （ｃ）カルシウム塩を添加する を有するリン脂質ミセルと会合した活性組織因子を含有するプロトロンビン時間 試薬の調製方法。 ２７．洗剤が、オクチルベーターＤ−グルコピラノシドおよびオクチルベーター Ｄ−チオグルコピラノシドからなる群から選択される第２６項記載の方法。 ２８．リン脂質混合物が約２０から約９５モルパーセントのホスファチジルコリ ン、約２．５から約５０モルパーセントのホスファチジルエタノールアミン、約 ２．５から約５０モルパーセントのホスファチジルセリンおよび約０から約４０ モルパーセントのホスファチジルグリセロールを含有する第２７項記載の方法。 ２９．ステップ（ａ）において約０．５から約１．５モルパーセントのグリシン をさらに共溶解性とする、第２８項記載の方法。 ３０．洗剤がアルキルグルコピラノシドを含有する第２７項または第２９項記載 の方法。 ３１．洗剤がオクチルベーターＤ−グルコピラノシドおよびオクチルベーターＤ −チオグルコピラノシドからなる群から選択される第３０項記載の方法。