ES2225271T3 - Reconstruccion de proteinas de membrana purificadas en liposomas preformados. - Google Patents
Reconstruccion de proteinas de membrana purificadas en liposomas preformados.Info
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Abstract
Un procedimiento para fabricar liposomas que tengan proteínas de membrana incorporadas en ellos, el procedimiento comprende: a) proporcionar la proteína de membrana en solución; b) proporcionar una solución de liposomas preformados, en la que los liposomas se forman combinando una mezcla de fosfolípidos con una solución de al menos un tipo de ácido graso insaturado; c) incubar la mezcla
Description
Reconstrucción de proteínas de membrana
purificadas en liposomas preformados.
La presente invención se refiere a procedimientos
para incorporar proteínas de membrana en liposomas preformados.
Además se refiere a procedimientos para fabricar un reactivo de
tiempo de protrombina (PT) usando factor tisular humano
reconstituido natural o recombinante (TFr). De forma más particular,
la invención se refiere a la reconstitución del factor tisular (TF)
en liposomas de fosfolípidos para producir un reactivo PT basado en
el factor tisular.
Las proteínas de membrana son críticas para la
función celular, e incluyen receptores, bombas de iones, proteínas
para el transporte de electrones, transductores de señal y
reguladores del medio intracelular. El aislamiento y reconstitución
de estas proteínas en membranas se ha estudiado bien y está bien
documentado.
Los liposomas son una categoría general de
vesículas que comprende una o más bicapas de lípidos que rodean un
espacio acuoso. Los liposomas incluyen vesículas unilamelares
compuestas de una única membrana de bicapa lípida, y vesículas
multilamelares (MLV) compuestas de varias membranas concéntricas (o
bicapas lípidas). Los liposomas se preparan habitualmente a partir
de fosfolípidos. Debido a las características únicas de estas
vesículas, los liposomas se han usado ampliamente como un modelo de
membrana para investigar las propiedades de las biomembranas y para
estudiar las funciones de las proteínas de membrana.
Existen esencialmente cuatro mecanismos
actualmente conocidos para incorporar, es decir, reconstituir,
proteínas en los liposomas. Ver Rigaud, J-L., y
col., "Liposomes as Tools for the Reconstitution of Biological
Systems", p.
71 - 88, en Liposomes as Tools en Basic Research and Industry, ed., Philippot, J. R. y Schubert, F. CRC Press, Boca Raton, Fl (1995). Un procedimiento implica el uso de un solvente orgánico. Sin embargo, dichos procedimientos a menudo dan como resultado la desnaturalización de las proteínas. Un segundo procedimiento usa medios mecánicos para producir vesículas grandes y unilamelares a partir de MLV por hinchado de las películas secas de fosfolípidos en exceso de tampón. Entre dichos medios mecánicos se incluye la sonicación de los MLV, forzar las vesículas multilamelares a través de una prensa French o ciclos de congelación - descongelación o deshidratación - rehidratación. Entre los inconvenientes de la sonicación se encuentran la variabilidad e inactivación de ciertas proteínas por sonicación, así como la producción de liposomas pequeños. Un tercer proceso implica la incorporación directa de proteínas en liposomas unilamelares pequeños preformados, denominada también incorporación espontánea. Dichos procedimientos se catalizan normalmente con concentraciones bajas de colato y de lisolecitina. Entre los problemas de estos procedimientos se incluye la amplia distribución por tamaños de los proteoliposomas, la distribución heterogénea de proteína entre los liposomas, y la presencia de impurezas de no fosfolípidos, que se requiere para una incorporación efectiva de proteína, lo que afectaría al rendimiento de dichos liposomas. El cuarto procedimiento, y el más usado, para incorporar proteínas en liposomas implica el uso de detergentes. En dicho procedimiento, las proteínas y los fosfolípidos se cosolubilizan en un detergente para formar micelas. A continuación, se elimina el detergente, dando como resultado la formación espontánea de vesículas bicapa con la proteína incorporada en ellas. El detergente se incorpora al interior del liposoma, así como la proteína, y por tanto, estos procedimientos requieren la eliminación del detergente mediante procedimientos tales como diálisis, cromatografía de exclusión de gel o adsorción sobre resinas hidrófobas. Los procedimientos que usan detergente son muy lentos, puesto que la eliminación del detergente debe ser tan completa como sea posible, y también porque un cambio de fase que tiene lugar durante el proceso ralentiza todavía más la eliminación del detergente. También es difícil eliminar completamente el detergente. Otra desventaja es que no se puede controlar la orientación de proteína que se incorpora en los liposomas usando los procedimientos con detergente.
71 - 88, en Liposomes as Tools en Basic Research and Industry, ed., Philippot, J. R. y Schubert, F. CRC Press, Boca Raton, Fl (1995). Un procedimiento implica el uso de un solvente orgánico. Sin embargo, dichos procedimientos a menudo dan como resultado la desnaturalización de las proteínas. Un segundo procedimiento usa medios mecánicos para producir vesículas grandes y unilamelares a partir de MLV por hinchado de las películas secas de fosfolípidos en exceso de tampón. Entre dichos medios mecánicos se incluye la sonicación de los MLV, forzar las vesículas multilamelares a través de una prensa French o ciclos de congelación - descongelación o deshidratación - rehidratación. Entre los inconvenientes de la sonicación se encuentran la variabilidad e inactivación de ciertas proteínas por sonicación, así como la producción de liposomas pequeños. Un tercer proceso implica la incorporación directa de proteínas en liposomas unilamelares pequeños preformados, denominada también incorporación espontánea. Dichos procedimientos se catalizan normalmente con concentraciones bajas de colato y de lisolecitina. Entre los problemas de estos procedimientos se incluye la amplia distribución por tamaños de los proteoliposomas, la distribución heterogénea de proteína entre los liposomas, y la presencia de impurezas de no fosfolípidos, que se requiere para una incorporación efectiva de proteína, lo que afectaría al rendimiento de dichos liposomas. El cuarto procedimiento, y el más usado, para incorporar proteínas en liposomas implica el uso de detergentes. En dicho procedimiento, las proteínas y los fosfolípidos se cosolubilizan en un detergente para formar micelas. A continuación, se elimina el detergente, dando como resultado la formación espontánea de vesículas bicapa con la proteína incorporada en ellas. El detergente se incorpora al interior del liposoma, así como la proteína, y por tanto, estos procedimientos requieren la eliminación del detergente mediante procedimientos tales como diálisis, cromatografía de exclusión de gel o adsorción sobre resinas hidrófobas. Los procedimientos que usan detergente son muy lentos, puesto que la eliminación del detergente debe ser tan completa como sea posible, y también porque un cambio de fase que tiene lugar durante el proceso ralentiza todavía más la eliminación del detergente. También es difícil eliminar completamente el detergente. Otra desventaja es que no se puede controlar la orientación de proteína que se incorpora en los liposomas usando los procedimientos con detergente.
Los liposomas tienen varias propiedades que los
hacen útiles en distintas aplicaciones. La característica más
importante es el tamaño uniforme que se puede controlar y las
características superficiales que pueden controlar el destino
biológico de los liposomas. Estas propiedades convierten los
liposomas en vehículos preferidos para los sistemas de liberación
de fármacos y la base para reactivos para ensayos. Por ejemplo, se
han usado liposomas que contienen el factor tisular como reactivos
en ensayos del tiempo de protrombina (PT) para ensayar la
coagulación de la sangre. En estos casos, el fosfolípido
constituyente del liposoma se usa como un sustituto de los
fosfolípidos de las plaquetas, que son esenciales para la
hemostasis normal en vivo. Por ejemplo, Dade Behring Inc. produce
en la actualidad INNOVIN® para uso en determinaciones de PT y
análisis temporales de protrombina. Este producto se prepara a
partir de factor tisular humano purificado producido en E.
Coli combinado con fosfolípidos sintéticos (tromboplastina),
calcio, tampones y estabilizantes.
La coagulación de la sangre se produce mediante
dos rutas, la ruta intrínseca y la ruta extrínseca. En la ruta
intrínseca (endógena o dependiente del contacto extraño), la cadena
de acontecimientos que lleva a la coagulación se pone en movimiento
meramente por exposición del plasma a superficies no endoteliales,
tales como vidrio in vitro o fibras de colágeno en las
membranas basales en vivo. Por el contrario, la ruta extrínseca
(exógena o dependiente del tejido) se inicia cuando, como resultado
de una lesión externa de la pared del vaso sanguíneo, el líquido
tisular se mezcla con los componentes del plasma sanguíneo.
Se ha observado que los tejidos de los
vertebrados, cuando se añaden a plasma citrado y se recalcifican,
aceleran considerablemente el tiempo de coagulación. Este
constituyente del tejido que se ha observado que activa las
cascadas de proteasa en la coagulación por la ruta extrínseca se
denomina habitualmente tromboplastina, o factor tisular (TF).
El factor tisular es una glicoproteína asociada a
la membrana que funciona formando un complejo con los factores VII
y VIIa de coagulación de la sangre. La complejación de estos
factores mejora en gran medida la actividad proteolítica de los
factores VII y VIIa. La actividad funcional del factor tisular tiene
una dependencia absoluta de la presencia de fosfolípidos; Bach,
Ronald R., Initiation of Coagulation by Tissue Factor, CRC
Critical Reviews en Biochemistry, 1998; 23 (4): pp.
339-368. El factor complejo VII / VIIa / factor
tisular activa una serie de enzimas específicos que comprende las
rutas extrínsecas y habituales de las cascadas de coagulación que
en ultimo extremo llevan a la formación de trombina, fibrina,
activación de plaquetas y, finalmente, formación de la costra;
Nemerson, Yale, Tissue Factor and Hemostasis, Blood 1988;
71:pp. 1-8.
Las pruebas de detección para los trastornos de
la coagulación se diseñan para detectar una anormalidad
significativa en uno o más de los factores de coagulación, y para
localizar esta anormalidad en las diferentes etapas de la ruta de
coagulación. Entre las pruebas de detección que se usan
habitualmente con este objetivo se incluyen el tiempo de activación
parcial de tromboplastina (APPT) y el tiempo de protrombina (PT).
Los ensayos de diagnóstico tales como el ensayo PT utilizan esta
serie de acontecimientos enzimáticos in vitro en condiciones
controladas para diagnosticar disfunciones en el sistema de
coagulación sanguínea de los pacientes. En el ensayo PT, el tiempo
que se tarda para formar la costra es el tiempo de protrombina, o
"valor PT".
El ensayo PT se lleva a cabo añadiendo
tromboplastina tisular con calcio al plasma. Esto inicia la
coagulación por activación del Factor VII, que a su vez activa el
Factor X que, en presencia del Factor V, lleva a la conversión de
protrombina en trombina. La trombina así producida convierte el
fibrinógeno en fibrina. De esta forma, el PT evita la ruta de
coagulación intrínseca, y es normal en pacientes con deficiencias
de los Factores XII, XI, IX y VIII. PT es anormal en pacientes con
deficiencias de los Factores VII, X, V, protrombina o fibrinógeno.
La tromboplasmina tisular es un extracto de fosfolípido (a partir
de cerebro o pulmón de conejo y cerebro o placenta humana) al que se
ha añadido calcio. Se proporciona de manera corriente en forma
liofilizada, y debe reconstituirse con agua destilada.
El ensayo del tiempo de protrombina (PT) es el
ensayo que se realiza de forma más habitual en el laboratorio de
coagulación.
Los reactivos del ensayo PT son particularmente
útiles en los ensayos de diagnóstico rápido para detectar
deficiencias, simples o combinadas, del sistema de coagulación
extrínseca, indicativas de trastornos de la coagulación
hereditarios y adquiridos, enfermedad del hígado o deficiencia de
vitamina K. Los reactivos para ensayo PT también se utilizan en
ensayos de monitorización en terapia oral con anticoagulantes, y en
ensayos de factores específicos de coagulación.
El factor tisular es un ejemplo de una proteína
de membrana. Las proteínas de membrana (por ejemplo, receptores)
están compuestos por una o más regiones transmembrana junto con
regiones intracelulares y extracelulares. La actividad de dichas
proteínas se mide frecuentemente a continuación de la integración de
la proteína purificada en una membrana artificial. El factor
tisular es un receptor del factor VII del sistema de coagulación de
la sangre, y está compuesto de apoproteína y lípidos (Pitlick, F.
A. Y Nemerson, Y., Binding of the protein component of tissue
factor to phospholipids. Biochemistry (1970) 9 (26):
5105-13. La apoproteína es un polipéptido
glicosilado de 263 aminoácidos. Cerca del extremo carboxi -
terminal posee una secuencia hidrófoba de 23 aminoácidos mediante
los que se ancla en la membrana. La fracción intracelular está
compuesta por 21 aminoácidos (Fisher, K. L. y col., Cloning and
expression of human tissue factor cDNA. Thromb. Research (1987) 48:
89-99); Morrisey, J. H. y col., Molecular cloning
de la cDNA for the tissue factor, the cellular receptor for the
initiation de la coagulation protease cascade. Cell (1987) 50:
29-35). En vivo, el factor tisular está presente
como una proteína de membrana integral de las células que no están
en contacto directo con la sangre. Su función biológica como
receptor de la superficie celular comprende en enlace y la
activación del factor VII de la coagulación del plasma cuando entra
en contacto con la sangre o plasma. Este complejo posee actividad
serina proteasa, y es capaz de activar los factores IX y X, y por
tanto, de poner en marcha la coagulación.
Fickenscher, K. y Zender, N. F. (Patente de los
Estados Unidos nº 5.599.909) describen un procedimiento de
relipidización de factor tisular aislado que no usa detergentes, y
que se consigue acidificando y/o calentando una mezcla proteína /
lípido. Este procedimiento implica mezclar proteínas y fosfolípidos
a un pH suficientemente bajo. En este procedimiento, los
fosfolípidos no se disuelven con ayuda de un detergente, sino que
en su lugar, se emulsifican en una solución acuosa. Enseñan que los
intervalos de pH adecuados están comprendidos entre pH 1 y pH 5, de
forma preferible entre pH 2 y pH 4, de forma particularmente
preferible a un pH aproximado de 3. La relipidización puede
llevarse a cabo usando una proteína de membrana que se haya
disuelto, o una que esté enlazada a una columna de afinidad (por
ejemplo una columna de inmunoadsorción que contiene un anticuerpo
policlonal o monoclonal). Una emulsión acuosa de fosfolípidos se
mezcla inicialmente con tampón a pH ácido. Se añade a continuación a
esta emulsión acidificada proteína de membrana purificada, y se
mezcla. Tras un tiempo de incubación entre 1 y 10 minutos, el pH de
la mezcla puede ajustarse al valor deseado inmediatamente después de
mezclar la muestra de proteína para conseguir homogeneidad. Someter
estas proteínas a un pH bajo puede ocasionar la desnaturalización
de la proteína y afectar a la eliminación de los grupos
ácido-lábiles, tales como algunos enlaces
glicosídicos. La pérdida de dichos grupos de las proteínas puede
afectar a los emplazamientos específicos de ligadura presentes en
estas proteínas.
Fickenscher, K. y Zender, N. F. (Patente de los
Estados Unidos nº 5.599.909) también enseñan un segundo
procedimiento para integrar proteínas de membrana en una membrana
lípida. Este método usa el procedimiento de calentar una proteína
en presencia de fosfolípidos. Al igual que en el procedimiento que
implica la acidificación, los lípidos no se disuelven con ayuda de
detergentes, sino en su lagar calentando la mezcla a entre 80 a
95ºC durante 1 a 10 minutos. A continuación, la mezcla se enfría
hasta temperatura ambiente entre 1 y 10 minutos, y se añade tampón
a continuación. Tras la relipidización, la proteína de membrana se
incorpora en una membrana lípida en forma activa. Se pueden añadir
los reactivos adecuados, y los liposomas se someten a procesado
posterior. Si la apoproteína del factor tisular se relipidiza usando
uno de los procedimientos de acuerdo con la invención, su uso como
agente terapéutico o agente de diagnóstico resulta posible. En el
segundo caso, el factor tisular relipidizado puede procesarse para
producir un reactivo para la determinación del tiempo de
protrombina con el fin de examinar la coagulación de la sangre en
el plasma. Sin embargo, calentar a estas temperaturas puede dar como
resultado el desplegado irreversible de la proteína,
desnaturalización y precipitación.
Tal como se ha mencionado anteriormente, INNOVIN®
es un ejemplo de un producto comercial en el que una proteína de
membrana se ha incorporado a liposomas. Puesto que INNOVIN® se
fabrica a partir de factor tisular humano recombinante y
fosfolípido sintético, no contiene ningún otro de los factores de
coagulación, tales como protrombina, Factor VIII y Factor X. Además,
INNOVIN® procede de una fuente pura, a diferencia de otros
reactivos PT comercialmente disponibles que contienen factor
tisular bruto extraído de fuentes naturales tales como cerebro de
conejo, mezclas cerebro / pulmón de conejo, placenta humana o
cerebro de buey. Cada una de estas fuentes tiene limitaciones. Por
ejemplo, la tromboplastina del cerebro de conejo muestra
variabilidad estacional, variabilidad entre lotes, y es dependiente
de fuentes fiables de materia prima. El factor tisular humano puede
ser una fuente de VIH u otras enfermedades virales humanas, y
también y es dependiente de fuentes fiables. El cerebro de buey
proporciona valores PT normales que son mucho más largos que los
que se obtienen con factor tisular procedente de otras fuentes
habituales. Los valores de PT más largos conducen a un rendimiento
menor en el laboratorio clínico. De manera adicional, estos tiempos
más largos pueden reflejar diferencias en la capacidad del factor
tisular de buey para enlazarse con el factor humano VII. Más aún,
las preparaciones de factor tisular bruto procedentes de fuentes
naturales contienen otros factores de coagulación como
contaminantes. La contaminación con factores de coagulación da como
resultado curvas en el ensayo del factor de coagulación que son
menos sensibles a los plasmas deficientes en factores de
coagulación. Por tanto, es deseable usar una fuente de factor
tisular que no presente estos inconvenientes, y tenga una
variabilidad entre lotes mejorada, a fin de crear un reactivo PT más
reproducible.
INNOVIN® es altamente sensible a las deficientes
de factor y a las muestras de plasma tratadas con anticoagulantes
orales. La sensibilidad de INNOVIN® es similar a la tromboplastina
de referencia del cerebro humano de la OMS. INNOVIN® también es
insensible a los niveles terapéuticos de heparina. Esta combinación
de propiedades hace que INNOVIN® sea muy útil para monitorizar la
terapia con anticoagulantes orales. Puesto que INNOVIN® es tan
sensible, permite la diferenciación de plasmas anormales, incluso
en intervalos patológicos suaves. Este reactivo del factor tisular
y los procedimientos para preparar el mismo se describen en Hawkins
P. L. y col. (patente nº WO 93/07492 y de los Estados Unidos
5.625.036). El reactivo se fabrica por lo general a partir de la
combinación de factor tisular purificado en un detergente tal como
octilglucósido, con fosfolípidos naturales o sintéticos, que también
se solubilizan en una solución de detergente. Los detergentes se
eliminan a continuación mediante diafiltración o diálisis para
formar micelas lipídicas que contienen factor tisular. Sería útil
disponer de un procedimiento de preparación de un reactivo de
factor tisular, tal como INNOVIN®, sin la necesidad de usar
diálisis o diafiltración para eliminar el detergente.
La presente invención se refiere a procedimientos
para reconstituir proteínas de membrana purificadas en liposomas
preformados, en presencia de al menos un tipo de ácido graso. En
una forma de realización preferida, la presente invención se
refiere a procedimientos que no usan detergente.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para fabricar liposomas que tengan proteínas de
membrana incorporadas en ellos, el procedimiento comprende:
proporcionar la proteína de membrana en solución; proporcionar una
solución de liposomas preformados; e incubar la mezcla en
condiciones fisiológicas de temperatura y pH. Antes de la etapa de
proporcionar una solución de liposomas preformados, los liposomas
se forman combinando una mezcla de fosfolípidos con una solución de
al menos un tipo de ácido graso saturado. El ácido graso comprende
un ácido graso insaturado que tenga entre aproximadamente 16 y
aproximadamente 20 átomos de carbono. De manera preferible, el ácido
graso comprende ácido oleico. En procedimientos preferidos, el
ácido oleico se presenta en una cantidad de aproximadamente 10 a
aproximadamente 35 por ciento en peso, de forma preferible entre
aproximadamente 15 a aproximadamente 30 por ciento en peso, y de
forma más preferible aproximadamente 16 por ciento en peso.
En el procedimiento de la presente invención, la
proteína de membrana se solubiliza. De forma preferible, la
proteína se solubiliza en una solución de sal. En una forma
preferida de realización, la proteína se solubiliza en Hepes 50 mM,
NaCl 150 mM, pH 7,40, que contenga 40-50% de
trifluoroetanol, 60% de alcohol, o 20-40% de DMSO,
o mediante intercambio con en Hepes 50 mM, NaCl 0,5 mM, pH 7,40. De
forma preferible, la proteína se solubiliza por intercambio de una
solución de detergente de la proteína con un tampón que contiene
sal, tal como Hepes 50 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,40.
Los liposomas preformados para uso en los
procedimientos de la presente invención comprenden fosfolípidos
tanto naturales como sintéticos. La mezcla de fosfolípidos
comprende una mezcla de fosfolípidos que contenga ácidos grasos
saturados o insaturados, mono o disustituidos, y una combinación de
los anteriores adecuados para lo mismo. Estos fosfolípidos se
seleccionan entre dioleilfosfatidil colina, dioleilfosfatidil
serina, dioleilfosfatidil etanolamina, dioleilfosfatidil glicerol,
ácido dioleilfosfatídico, palmitoiloleilfosfatidil colina,
palmitoiloleilfosfatidil serina, palmitoiloleilfosfatidil
etanolamina, palmitoiloleilfosfatidil glicerol, ácido
palmitoiloleilfosfatídico, palmitelaidoiloleilfosfatidil colina,
palmitelaidoiloleilfosfatidil serina, palmitelaidoiloleilfosfatidil
etanolamina, palmitelaidoiloleilfosfatidil glicerol, ácido
palmitelaidoiloleilfosfatídico; miristoleoiloleilfosfatidil colina,
miristoleoiloleilfosfatidil serina, miristoleoiloleilfosfatidil
etanolamina, miristoleoiloleilfosfatidil glicerol, ácido
miristoleoiloleilfosfatídico, dilinoleoiloleilfosfatidil colina,
dilinoleoiloleilfosfatidil serina, dilinoleoiloleilfosfatidil
etanolamina, dilinoleoiloleilfosfatidil glicerol, ácido
dilinoleoiloleilfosfatídico, palmiticlinoleoilfosfatidil colina,
palmiticlinoleoilfosfatidil serina, palmiticlinoleoilfosfatidil
etanolamina, palmiticlinoleoilfosfatidil glicerol, ácido
palmiticlinoleoilfosfatídico. Estos fosfolípidos pueden también ser
derivados monoacilados de fosfatidil colina (lisofosfatidil colina),
fosfatidil serina (lisofosfatidil serina), fosfatidil etanolamina
(lisofosfatidil etanolamina), fosfatidil glicerol (lisofosfatidil
glicerol) y ácido fosfatídico (ácido lisofosfatídico). La cadena de
monoacilo en estos derivados de lisofosfatidilo puede ser
palmitoílo, oleoílo, palmitoleoílo, linoleoílo, miristoílo, o
miristoleoílo. De forma preferible, la mezcla de fosfolípidos
comprende dioleilfosfatidil colina y dioleoilfosfatidil serina en
una relación de aproximadamente 4 a aproximadamente 1. En los
procedimientos preferidos, la dioleoilfosftidil colina y
dioleilfosfatidil serina están en una relación en entre
aproximadamente 7 a aproximadamente 3. En procedimientos preferidos,
los fosfolípidos son sintéticos.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el
procedimiento de la presente invención implica la etapa de incubar
la mezcla de proteína de membrana y liposomas entre 25º y 45ºC,
pero de manera preferible aproximadamente a 37ºC. De forma
preferible, la mezcla se calienta aproximadamente 30 minutos hasta
al menos una hora, preferiblemente aproximadamente una hora.
A continuación, la mezcla se diluye con el tampón
apropiado, por ejemplo, tampón basado en Hepes, pH 7,4, que
contienen sal, BSA, cloruro de calcio, dextrano, glicina y
conservante.
Los procedimientos de la presente invención se
relacionan además con el procedimiento para fabricar un reactivo que
comprende factor tisular reconstituido en liposomas preformados. El
procedimiento de la presente invención para fabricar un reactivo de
factor tisular comprende: proporcionar factor tisular en solución;
proporcionar una solución de liposomas preformados que comprenda
una mezcla de fosfolípidos y al menos un tipo de ácido graso
insaturado; e incubar la mezcla bajo la temperatura fisiológica de
37ºC. La mezcla de fosfolípidos comprende de forma preferible una
mezcla de fosfolípidos que se seleccionan entre dioleilfosfatidil
colina, dioleilfosfatidil serina, dioleilfosfatidil etanolamina,
dioleilfosfatidil glicerol, ácido dioleoilfosfatídico, y el ácido
graso comprende de forma preferible ácido oleico.
Los procedimientos de la presente invención
proporcionan un procedimiento para combinar proteínas de membrana,
por ejemplo, factor tisular, con liposomas preformados que es más
eficiente y reproducible que los que se han usado hasta ahora. La
presente invención también se refiere a reactivos PT con un alto
grado de sensibilidad y reproducibilidad para determinar valores de
PT. El reactivo PT de la presente invención es sensible a la
función global del sistema de coagulación. Los procedimientos de la
presente invención proporcionan un reactivo PT con un tiempo de
coagulación bien definido para muestras de plasma normal y que
prolonga el tiempo de coagulación de las muestras de plasma
anormal. Los procedimientos de la presente invención también
proporcionan un reactivo PT con una variabilidad mínima entre lotes
y una estabilidad y transparencia óptica mejoradas.
La presente invención se refiere a procedimientos
para reconstituir proteínas de membrana purificadas en liposomas
preformados Los actuales procedimientos permiten dicha
reconstitución sin el uso de detergente, según se requiere en los
procedimientos conocidos hasta ahora. El término !1Y!detergente' se
refiere a compuestos anfipáticos, por ejemplo, hidrocarburos de
cadena larga que finalizan en un extremo con un grupo polar, a
menudo cargado. Estos compuestos incluyen moléculas cuyo grupo
polar cargado es altamente soluble en agua aunque el hidrocarburo
no penetre fácilmente en el entorno acuoso. Los detergentes, tal
como se usan en la presente invención, incluyen aquellos sin carga
alguna, por ejemplo,
n-octil-\beta-D-glucopiranosa
(octilglucósido), detergentes aniónicos, que transportan una carga
negativa, por ejemplo, dodecil sulfato, y detergentes catiónicos,
que transportan una carga positiva, por ejemplo, bromuro de
hexadeciltrimetilamonio.
En una forma de realización de la presente
invención, la proteína que se incorpora en los liposomas es un
factor tisular purificado. La proteína es activa como se demuestra
porque muestra una actividad coagulante que es comparable ala del
factor tisular en liposomas obtenidos por los procedimientos
anteriormente conocidos, por ejemplo, mediante el uso de
detergente.
Como se ha discutido brevemente con anterioridad,
los procedimientos conocidos anteriores para reconstituir TF en la
mezcla de fosfolípidos incluyen calentar una mezcla de proteína y
fosfolípidos a pH bajo (Patente de los Estados Unidos nº
5.599.909). Sin embargo, la desventaja de este procedimiento es que
un calentamiento a pH bajo puede causar la agregación y
desnaturalización irreversible de los liposomas y la
desnaturalización irreversible de las proteínas. Otro procedimiento
popular implica el uso y eliminación de detergente. Las desventajas
de este procedimiento, sin embargo, incluyen el hecho que es un
proceso muy lento y que tiene lugar un cambio de fase durante el
proceso que ralentiza la eliminación del detergente todavía más. El
detergente puede incorporarse al liposoma, además de la proteína, lo
que puede llevar a liposomas frágiles y con poca impermeabilidad.
El detergente es difícil de eliminar completamente y finalmente, no
se puede controlar la orientación de la proteína incorporada a los
liposomas.
Los procedimientos de la presente invención
permiten la reconstitución de proteínas de membrana purificadas en
liposomas preformados sin la necesidad de usar detergente en la
etapa de reconstitución.
Como se ha descrito brevemente con anterioridad,
los procedimientos actuales para fabricar liposomas que tengan
proteínas de membrana incorporadas en ellos comprende las etapas de
proporcionar la proteína de membrana en solución; proporcionar una
solución de liposomas preformados; e incubar la mezcla en
condiciones fisiológicas. Los liposomas preformados se fabrican
mediante un procedimiento que comprende combinar una mezcla de
fosfolípidos con una solución de al menos un tipo de ácido graso
insaturado.
Los fosfolípidos que se usan para formar los
liposomas preformados en los procedimientos de la presente invención
comprenden fosfolípidos tanto naturales como sintéticos. Los
fosfolípidos se seleccionan entre los fosfolípidos que contienen
ácidos grasos saturados o insaturados mono o disustituidos, y
combinaciones de los anteriores adecuadas para lo mismo. Estos
fosfolípidos son dioleoilfosfatidil colina, dioleoilfosfatidil
serina, dioleoilfosfatidil etanolamina, dioleoilfosfatidilglicerol,
ácido dioleoilfosfatídico, palmitoiloleoilfosfatidil colina,
palmitoiloleoilfosfatidil serina, palmitoiloleoilfosfatidil
etanolamina, palmitoiloleoilfofatidilglicerol, ácido
palmitoiloleoilfosfatídico, palmitelaidoiloleoilfosfatidil colina,
palmitelaidoiloleoilfosfatidil serina,
palmitelaidoiloleoilfosfatidil etanolamina,
palmitelaidoiloleoilfosfatidil glicerol, ácido
palmitelaidoiloleoilfosfatídico, miristoleoiloleoilfosfatidil
colina, miristoleoiloleoilfosfatidil serina,
miristoleoiloleoilfosfatidil etanoamina,
miristoleoiloleoilfosfatidil glicerol, ácido
miristoleoiloleoilfosfatídico, dilinoleoilfosfatidil colina,
dilinoleoilfosfatidil serina, dilinoleoilfosfatidil etanolamina,
dilinoleoilfosfatidil glicerol, ácido dilinoleoilfosfatídico,
palmiticlinoleoilfosfatidil colina, palmiticlinoleoilfosfatidil
serina, palmiticlinoleoilfosfatidil etanolamina,
palmiticlinoleoilfosfatidil glicerol, ácido
palmiticlinoleoilfosfatídico. Estos fosfolípidos pueden ser también
los derivados monoacilados de fosfatidil colina (lisofosfatidil
colina), fosfatidil serina (lisofosfatidil serina), fosfatidil
etanolamina (lisofosfatidil etanolamina), fosfatidil glicerol
(lisofosfatidil glicerol) y ácido fosfatídico (ácido
lisofosfatídico). La cadena de monoacilo en estos derivados de
lisofosfatidilo puede ser palmitoílo, oleoílo, palmitoleoílo,
linoleoílo miristoílo o miristoleoílo. De forma preferible, la
mezcla de fosfolípidos comprende dioleilfosfatidil colina y
dioleilfosfatidil serina en una relación de aproximadamente 5 a
aproximadamente 1. En los procedimientos preferidos, la
dioleilfosfatidil colina y la dioleilfosfatidil serina están en una
relación de aproximadamente 7 a aproximadamente 3. En los
procedimientos preferidos, los fosfolípidos son sintéticos. Los
fosfolípidos sintéticos están fácilmente disponibles de forma
comercial en varias fuentes, tales como AVANTI Polar Lipids
(Albaster, AL); Sigma Chemical Company (St. Louis, MO).
Entre los fosfolípidos existentes en la
naturaleza que se usan en el reactivo PT que contiene FT
recombinante se incluyen fosfatidil serina natural (PS) en un
intervalo comprendido entre aproximadamente 25 a 35% de los
fosfolípidos totales, siendo lo más preferido aproximadamente 30%, y
fosfatidil colina natural (PC) en un intervalo comprendido entre
aproximadamente 65 a 75% de los fosfolípidos totales, siendo lo más
preferido aproximadamente 70%. La fosfatidil colina usada es neutra
en carga, mientras que la fosfatidil serina está negativamente
cargada. En la forma preferida de realización, la mezcla de lípidos
tiene al menos un componente con carga negativa neta. En otras
formas de realización de esta invención es posible usar
combinaciones de otros lípidos. Una fuente preferida de PS natural
es a partir de cerebro bovino, y una fuente preferida de PC natural
es a partir de yema de huevo.
También pueden usarse en la presente invención
los fosfolípidos sintéticos, y se prefiere. Estos compuestos
sintéticos pueden ser variados, y pueden presentar variaciones en
sus cadenas secundarias de ácido graso que no se encuentran en los
fosfolípidos de origen natural. Las variaciones en cadenas
secundarias que dan como resultado una mejora en el reactivo PT se
han listado anteriormente. Los compuestos preferidos tienen cadenas
secundarias de ácido graso insaturado con longitudes de cadena C14,
C16, C18 o C20, en cualquiera o ambos PS o PC. Entre las
composiciones preferidas se incluyen, pero no se limitan a las que
contienen dioleoílo (18:1)-PS; palmitoílo
(16:0)-oleoílo (18:1)-PS,
dimiristoílo (14:0)-PS, dipalmitoleoílo
(16:1)-PC, dipalmitoílo (16:0)-PC,
dioleoílo (18:1)-PC, palmitoílo
(16:0)-oleoílo (18:1)-PC, y
miristoílo (14:0)-oleoílo (18:1)-PC
como constituyentes.
La actividad óptima del reactivo PT se consigue
cuando la relación entre el factor tisular : fosfolípido sintético
es de aproximadamente 1:2.000 hasta 1:20.000, siendo el intervalo
preferido de aproximadamente 1:10.000. Esto conduce a una
concentración final de aproximadamente 50-300 \muM
de fosfolípidos totales. De esta forma, tanto las relaciones PS:PC
como TFr a fosfolípido total son esenciales para alcanzar y
mantener una actividad funcional óptima.
Como se ha mencionado anteriormente, los
procedimientos de la presente invención usan liposomas preformados
fabricados a partir de fosfolípidos y ácidos grasos. De forma
preferible, el ácido graso comprende un ácido graso insaturado
alifático que tiene entre aproximadamente 16 a aproximadamente 20
átomos de carbono. En una forma de realización preferida, el ácido
graso comprende ácido oleico. En los procedimientos preferidos, el
ácido oleico se presenta en una cantidad que oscila entre
aproximadamente 15 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de
forma preferible aproximadamente el 16 por ciento en peso, del
fosfolípido.
En el procedimiento de la presente invención, la
proteína de membrana se solubiliza. De forma preferible, la
proteína se solubiliza en una solución de sal. En una forma de
realización preferida, la proteína se solubiliza en Hepes 50 mM -
NaCl 150 mM, pH 7,40 que contiene trifluoroetanol al
40-50% o alcohol al 60%, o por intercambio con
Hepes 50 mM - NaCl 0,5 mM, pH 7,40. De forma preferible, la
preparación de proteína pura solubilizada en presencia de un
detergente, tal como octil glucósido al 2%, se solubiliza por
intercambio de una solución de detergente de la proteína con un
tampón de pH fisiológico tal como Hepes 50 mM que contiene NaCl 0,5
mM a pH 7,40.
La presente invención puede usarse para
reconstituir otras proteínas de membrana en liposomas preformados.
Las proteínas útiles en los procedimientos de la presente invención
tienen una estructura y propiedades biológicas similares a las del
factor tisular. Las proteínas pueden obtenerse a partir de fuentes
naturales, o producirse de manera sintética mediante técnicas de
ingeniería genética. De manera preferible, las proteínas se
purifican hasta la homogeneidad hasta una única especie uniforme
que se controla mediante procedimientos analíticos tales como HPLC,
actividad bioquímica, composición de aminoácidos, y modelo
electroforético. En algunas formas de realización, las proteínas se
obtienen de forma preferible a partir de procedimientos de
recombinación. Dichos procedimientos de recombinación se conocen en
la técnica. El uso de proteína recombinante elimina la presencia de
contaminantes, como otras proteínas, que serían normalmente
esenciales para sostener funciones fisiológicas de las especies
específicas.
En formas de realización preferidas de la
presente invención, la proteína de membrana es el factor tisular. De
forma preferible, el factor tisular que se usa en los
procedimientos actuales es un factor tisular recombinante como
describen Hawkins P. L. y col (Patente de los Estados Unidos nº
5.625.136). Como se describe anteriormente, el uso de factor
tisular recombinante, en oposición a factor tisular crudo
procedente de fuentes naturales tales como cerebro de conejo,
mezclas de cerebro / pulmón de conejo, placenta humana o cerebro de
buey, elimina problemas asociados con dichas fuentes. El factor
tisular se clonó en E. Coli con procedimientos similares a
los que describen Fisher K. L., et al., Cloning and
expression of human tissue factor cDNA. Thromb. Res. (1987) 48:
89-99 y Morrissey J. H., et al., Molecular
cloning of the cDNA for tissue factor, the cellular receptor for
the initiation de la coagulation protease cascade, Cell (1987) 50:
129-135.
La forma preferida de realización de la presente
invención usa proteínas purificadas bien definidas, por ejemplo
TFr, en combinación con liposomas formados a partir de fosfolípidos
purificados bien definidos y un ácido graso. Pueden usarse
moléculas recombinantes tanto de longitud completa como truncada,
que se preparan siguiendo los procedimientos conocidos en la
técnica, por ejemplo, los procedimientos de Nemerson and Pabrosky
(Spicer E. K., et al. Isolation of cDNA clones coding for
human tissue factor: primary structure de la proteína and cDNA,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 5148-52;
Pabrosky, L., et al. Purification of recombinant human
tissue factor. Biochemistry (1989) 28: 8072-77;
Fisher K. L., et al. Cloning and expression of human tissue
factor cDNA. Thromb. Research (1987) 48: 89-99.). La
presente invención también incluye proteínas, por ejemplo, TFr, con
adiciones, deleciones, y sustituciones de aminoácidos que no
disminuyan la actividad funcional del reactivo. En una forma de
realización preferida, la modificación preferida de TFr se trunca
en, o aproximadamente en, el residuo del aminoácido 243. Las
concentraciones preferidas de TFr en el reactivo PT están
comprendidas entre aproximadamente 20 hasta 400 ng/ml, y las más
preferibles entre aproximadamente 100 a 350 ng/ml. Los reactivos PT
fabricados a partir de estas materias primas son ópticamente
transparentes sin los precipitados finos que aparecen en los
reactivos PT basados en extractos puros de materiales de fuente
natural. Puesto que las materias primas están muy purificadas, los
análisis químicos proporcionan una medida significativa de su
rendimiento esperado. Los análisis químicos en combinación con los
ensayos funcionales, proporcionan consistencia entre lotes, una
consideración clínica importante.
Los reactivos PT fabricados a partir de factor
tisular recombinante o natural purificado en combinación con
fosfolípidos naturales y fosfolípidos fotosintéticos con y sin
variación en las cadenas secundarias ofrecen una mejora en la
calidad y sensibilidad del reactivo PT. Los fosfolípidos sintéticos
proporcionan la ventaja de un producto final más reproducible y
ofrecen la ventaja de una actividad funcional mejor controlada del
reactivo PT cuando se varían las cadenas secundarias.
La elección de los tampones y estabilizantes
varía ampliamente, y también puede ayudar a la estabilidad del
reactivo PT. Las formas de realización más preferidas pueden
incluir el ion calcio en un intervalo de concentración entre 9 y 15
mM, NaCl en el intervalo de concentración entre aproximadamente 0 y
10%, con el intervalo más preferido entre aproximadamente 6 a 9%,
dextrano en el intervalo de aproximadamente 0 a 5%, una proteína
como gamma globulina bovina o albúmina de suero bovino en un
intervalo de concentraciones de aproximadamente 0 - 5%; y un tampón
apropiado. Para el reactivo PT se prefieren tampones como ácido
N-2-
hidroxietilpiperazina-N'-2-aminoetano
sulfónico (HEPES), ácido 3-[N-ris
{hidroximetil}metilamino]-2-hidroxi-propano
sulfónico (TAPSO), ácido 3-(N- morfolino) propano sulfónico (MOPS),
ácido N-tris-(hidroximetil)
metil-2- aminoetanosulfónico (TES), ácido
3-[N-bis(hidroxietil)-amino]
2-hidroxipropano sulfónico (DIPSO),
piperazina-N,N'-bis (ácido
2-hidroxipropano-sulfónico) (POPSO),
N-hidroxietilpiperazina-N'-2-hidroxipropano
sulfónico (HEPPSO) y tris-(hidroximetil) aminometano (TRIS). Los
tampones más preferidos son HEPES o TAPSO, en un intervalo de
concentraciones de aproximadamente 20 a 80 mM.
En la forma de realización preferida de esta
invención, el factor tisular humano recombinante de partida se hace
crecer in vitro en E. Coli, se extrae con una
solución de detergente, y a continuación se purifica usando
procedimientos de cromatografía de afinidad sobre anticuerpos
monoclonales inmovilizados frente a factor tisular humano. Bach,
Ronald R., Initiation of Coagulation by Tissue Factor, CRC
Critical Reviews en Biochemistry, 1988; 23 (4):pp.
339-368.
En los procedimientos de la presente invención,
la proteína de membrana solubilizada se mezcla con los liposomas
preformados y se incuban en condiciones fisiológicas. La incubación
tiene lugar, de forma preferible, en o cerca de la temperatura de
transición de los liposomas, por ejemplo, entre
25-37ºC. En una forma de realización preferida, que
usa una mezcla de dioleilfosfatidil colina y dioleilfosfatidil
serina (en una relación de entre aproximadamente 7 a
aproximadamente 3) y ácido oleico, la mezcla se incuba a
aproximadamente 37ºC. La temperatura apropiada puede seleccionarse
fácilmente por alguien normalmente versado en la técnica basado en
las enseñanzas que se contienen en el presente documento. De forma
preferible la mezcla se incuba aproximadamente entre 30 minutos y
una hora, de forma preferible aproximadamente una hora.
De forma preferible, los liposomas usados tienen
un tamaño comprendido entre 75 y 150 nm, de forma más preferible
aproximadamente 100 nm. Se prefiere que los liposomas tengan un
tamaño generalmente uniforme. Esta uniformidad puede obtenerse
mediante los procedimientos conocidos en la técnica. La Tabla 1
muestra el efecto del tamaño del liposoma sobre el tiempo de
coagulación. Los liposomas más pequeños y más grandes, por ejemplo,
50 nm y 400 nm muestran un tiempo de coagulación más largo, En esta
tabla, los liposomas se fabricaron a partir de una mezcla de
proteína 3,15 nM / mezcla de fosfolípidos 75 \muM y se
dimensionaron por extrusión a través de una membrana del tamaño
adecuado (Avestin, Inc., Ottawa, Canadá).
| Tamaño de los liposomas preformados | Tiempo de coagulación (segundos) |
| 50 nm | 34,3 |
| 100 nm | 28,7 |
| 400 nm | 54,4 |
Los procedimientos de la presente invención se
refieren además a los procedimientos para fabricar reactivos para
ensayos que comprendan proteínas útiles para dichos ensayos
reconstituidas en liposomas preformados. Por ejemplo, los liposomas
reconstituidos pueden usarse para liberación de fármacos
independiente del receptor o dependiente del receptor, por ejemplo,
liberación de hormonas del crecimiento independiente del receptor.
Estos liposomas pueden usarse también como vehículos de antígenos
para la producción de anticuerpos, agentes de transferencia de
genes, en fabricación de vacunas para atrapar proteínas virales, y
para estudiar isoformas de enzimas, incluyendo enzimas libres y
ligadas a la membrana con funciones fisiológicas muy diferentes. Los
liposomas pueden también usarse para estudiar reacciones
catalizadas por enzimas, especialmente si el producto actúa como un
inhibidor muy potente de la enzima.
En una forma de realización preferida, los
procedimientos de la presente invención además se refieren al
procedimiento de fabricar un reactivo que comprende factor tisular
reconstituido en liposomas preformados. El procedimiento de la
presente invención para fabricar un reactivo con factor tisular
comprende: proporcionar factor tisular en solución; proporcionar una
solución de liposomas preformados; e incubar la mezcla en
condiciones fisiológicas. La etapa de proporcionar una solución de
liposomas preformados comprende además la formación de liposomas
combinando una mezcla de fosfolípidos con una solución de al menos
un tipo de ácido graso insaturado. La mezcla de fosfolípidos
comprende de forma preferible una mezcla de fosfolípidos que se
selecciona entre dioleilfosfatidil colina, dioleilfosfatidil serina,
y dioleilfosfatidil etanolamina. De forma preferible, los liposomas
se forman a partir de una mezcla de dioleilfosfatidil colina y
dioleilfosfatidil serina y ácido oleico. De forma preferible, la
dioleilfosfatidil colina y la dioleilfosfatidil serina están
presentes en una relación de 7:3 y el ácido oleico está presente en
un 16% (p/p). El liposoma preparado a partir de una solución de
fosfolípido / solución de ácido oleico se combina con una solución
del factor tisular, se solubiliza en una solución de sal, y se
incuba a 37ºC. De forma preferible, la mezcla se incuba
aproximadamente una hora.
Si se desea, la solución resultante de liposomas
reconstituidos se diluye a continuación con un tampón adecuado. Un
ejemplo de un tampón útil incluye tampón basado en Hepes, pH 7,4,
que contienen sal, BSA, cloruro de calcio, dextrano, glicina, y
conservante. Alguien que sea normalmente versado en la técnica puede
determinar fácilmente un tampón apropiado. Los tampones preferidos
tienen un pKa en el intervalo fisiológico.
Los procedimientos de la presente invención
proporcionan un procedimiento para combinar proteínas de membrana,
por ejemplo, factor tisular, con liposomas preformados que es más
eficiente y reproducible que los procedimientos usados en la
actualidad. La presente invención también se refiere a un reactivo
PT que tiene un elevado grado de sensibilidad y reproducibilidad
para determinar los valores PT. El reactivo PT de la presente
invención es sensible a las funciones globales del sistema de
coagulación. Los procedimientos de la presente invención
proporcionan un reactivo PT con un tiempo de coagulación bien
definido para las muestras de plasma normales y que alarga los
tiempos de coagulación de muestras de plasma anormales. Los
procedimientos de la presente invención también proporcionan un
reactivo PT con una mínima variabilidad entre lotes y una
estabilidad y transparencia óptica mejoradas.
Los reactivos PT de la presente invención son muy
estables. Una vez que se forman los liposomas reconstituidos, son
estables en solución especialmente si la solución se mantiene por
debajo de la temperatura de transición de los liposomas. Por
ejemplo, si la temperatura de transición de los liposomas es de
aproximadamente 37ºC, entonces la solución de liposomas
reconstituidos se mantiene de forma preferible a aproximadamente
4ºC a aproximadamente 25ºC.
El reactivo PT de la presente invención puede
usarse en cualquier ensayo PT en laboratorios, en laboratorios de
salas de urgencias médicas, y en el hogar. El tipo de instrumentos
sobre los que estos reactivos se pueden usar se ejemplifican
mediante las series 700, 800, 1000, 1400 y 1600 de Medial
Laboratory Automation (MLA), y las series CA540, CA1000 y CA6000 de
Sysmax, las series de instrumentos BFA, BCT y BCS de Dade Behring,
el instrumento MDA 40 de Organon Technics, las series de
instrumentos ACL 100, ACL 1000 y ACL 3000 de Instrumentation
Laboratories, las series BM/Stago STA Series, y Coaguteck de
Boehringer Mannheim/Roche. Esta lista de instrumentos es únicamente
para información y no se pretende que sea exclusiva. Todos los
demás instrumentos que utilicen principios de funcionamiento
similar a aquellos que se han descrito aquí pueden también usarse
con estos reactivos. De forma preferible, el reactivo PT actual se
usa en ensayos realizados con los instrumentos MLA ELECTRA
900C^{TM} o 1000C^{TM} (Medical Laboratory Automation, Inc.,
Pleasantville, NY). El MLA ELECTRA 900C^{TM} es un sistema
computerizado de coagulación diseñado para facilidad de uso y amplia
capacidad de ensayo a la vez que se proporcionan resultados precisos
y consistentes. El MLA ELECTRA 900C^{TM} usa detección fotométrica
para llevar a cabo procedimientos de coagulación y cromogénicos. Las
cubetas que contienen muestras se hacen pasar de manera automática
ante detectores fotométricos para determinar los resultados del
ensayo.
Los reactivos PT de la presente invención
muestran tiempos de coagulación normales cuando se ensayan sobre
MLA ELECTRA 900C^{TM}. Por ejemplo, cuando se usan con plasma
congelado normal, y plasma Coumadine, el reactivo PT fabricado de
acuerdo con los procedimientos de la presente invención mostró
tiempos de coagulación de 12,5 y 39,4 segundos, respectivamente. Un
control (TFS-62) que comprendía un lote
manufacturado de TF procedente de Dade Behring, preparado mediante
el procedimiento de detergente, mostró tiempos de coagulación de
12,4 y 40,4 segundos, respectivamente, cuando se usó con plasma
normal congelado y plasma Coumadine.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar la presente invención y no se pretende de forma alguna que
limiten el alcance de la invención.
Se purificó factor tisular recombinante (TFr)
presente en pasta de E. Coli por paso a través de una
columna de inmunoafinidad. La columna de inmunoafinidad (1,6 x 30
cm) se preparó enlazando de forma covalente anticuerpo monoclonal
anti TFr a Agarosa activada, se equilibró con Tris 20 mM, NaCl 150
nM, octilglucósido 0,5%, pH 7,40. Se cargó sobre la columna de
afinidad una solución de 15 ml de TFr (que contenía 0,66 mg/ml de
proteína en el tampón de equilibrado de la columna), tras
purificación inicial sobre Q-Sepharose. La proteína
adsorbida en la columna se eluyó en primer lugar con ácido acético
0,1 M - NaCl 150 mM, octilglucósido 0,1%, pH 4,0, y después
sucesivamente con ácido acético 0,1 M - NaCl 150 mM, tampón de pH
3,0 conteniendo octilglucósido 0,1 y 2%. Las fracciones de
proteínas eluídas en el tampón de pH 3 se ajustaron a pH 7,30 por
adición de Tris 0,5 M. Estas fracciones contienen 2,3 y 5,9 mg de
proteína, respectivamente. Se encontró que ambas fracciones que
contenían proteínas contenían proteínas idénticas, según ensayos
sobre un gel SDS-PAGE. Estas fracciones se
combinaron y mezclaron con octilglucósido sólido para conseguir una
concentración final de detergente del 2%. Se encontró que la
solución de proteína eluída que contenía la apoproteína TFr (82% de
recuperación) era de una única clase, según ensayo mediante
SDS-PAGE. Se determinó la concentración de proteína
usando un coeficiente de extinción de 1,6 mg ml^{-1}
cm^{-1}.
Una solución transparente de proteína (0,2 ml) en
tampón que contenía octilglucósido al 2% se precipitó con 1,0 ml de
acetona fría, y el precipitado se suspendió en 0,4 ml de
trifluoroetanol y se diluyó con 0,4 ml de Hepes 40
mM - NaCl 160 mM pH 7,40. Se obtuvieron soluciones transparentes cuando la solución de la proteína solubilizada con detergente se diafiltró en un sistema de ultrafiltración Amicon (YM-10) usando Hepes 50 mM - NaCl 0,5 M pH 7,40, Hepes 50 mM pH 7,40 conteniendo DMSO al 20%, DMSO al 40% o alcohol al 60%.
mM - NaCl 160 mM pH 7,40. Se obtuvieron soluciones transparentes cuando la solución de la proteína solubilizada con detergente se diafiltró en un sistema de ultrafiltración Amicon (YM-10) usando Hepes 50 mM - NaCl 0,5 M pH 7,40, Hepes 50 mM pH 7,40 conteniendo DMSO al 20%, DMSO al 40% o alcohol al 60%.
Una solución de dioleilfosfatidil colina en
cloroformo (DOPC; 66 mg, 2,64 ml de 25 mg/ml) y dioleilfosfatidil
serina (DOPS; 28,8 mg, 2,88 ml de 10 mg/ml) se evaporó en corriente
de nitrógeno. La película seca de fosfolípidos se disolvió en 2 ml
de hexano, y el solvente orgánico se eliminó de nuevo en corriente
de nitrógeno. La película seca de fosfolípidos se suspendió en 3,16
ml de Hepes 40 mM - NaCl 160 mM pH 7,40. La suspensión de
fosfolípidos se sonicó durante un minuto en un baño tipo cup horn
(1), seguido de extrusión a través de una membrana de 100 nm
(Avestin, Inc., Ottawa, Canada). Este procedimiento dio como
resultado una suspensión lechosa transparente.
Se incubó una solución de la apoproteína TFr
(20-100 \mul) con 500 \mul de la suspensión de
fosfolípido durante una horra a 37ºC, o toda la noche a 4ºC. Para
ensayo en MLA, la mezcla proteína - fosfolípido se diluyó en un
tampón que contenía Hepes 40 mM - NaCl 160 mM BSA 0,2% - dextrano
0,2% - glicina 4,5%, CaCl_{2} 11 mM, pH 7,40.
La mezcla final que contenía liposomas
reconstituidos con factor tisular fue ensayada en el MLA ELECTRA
900C^{TM}.
Se preparó el factor tisular como se ha descrito
anteriormente.
Una solución de dioleilfosfatidil colina en
cloroformo (DOPC; 11 mg, 0,55 ml de 20 mg/ml) y dioleilfosfatidil
serina (DOPS; 4,8 mg; 0,19 ml de 25 mg/ml) se mezcló por separado
con 0; 0,01; 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,32 ó 0,64 ml de una solución
de ácido oleico en cloroformo (20 mg/ml).
La mezcla de fosfolípidos que contenía de 0 a
44,7% de ácido oleico (p/p) se evaporó en corriente de nitrógeno.
La película seca de fosfolípidos se disolvió en 0,1 ml de hexano, y
el solvente orgánico se eliminó de nuevo en corriente de
nitrógeno.
La película seca de fosfolípidos se suspendió en
0,526 ml de Hepes 40 mM – NaCl 160 mM pH 7,40. La suspensión de
fosfolípidos se sonicó durante un minuto en un baño tipo cup horn,
seguido de extrusión a través de una membrana de 100 nm (Avestin,
Inc., Ottawa, Canada). Este procedimiento dio como resultado una
suspensión lechosa transparente.
Se incubó una solución de la apoproteína TFr (7,5
\mul; 0,69 mg/ml) en Hepes 50 mM - NaCl 0,5 M pH 7,40. con 100
\mul de cada una de las suspensiones de fosfolípido durante dos
horas a 37ºC. Para ensayo en MLA 900, la mezcla proteína -
fosfolípido se diluyó en un tampón que contenía Hepes 40 mM - NaCl
160 mM, BSA 0,2% - dextrano
0,2% - glicina 4,5% CaCl_{2} 11 mM, pH 7,40.
0,2% - glicina 4,5% CaCl_{2} 11 mM, pH 7,40.
La mezcla final que contenía liposomas
reconstituidos con factor tisular fue ensayada en el MLA ELECTRA
900C^{TM}.
Cuando la mezcla final que contenía liposomas
reconstituidos con factor tisular se ensayó en un MLA ELECTRA
900C^{TM}, la solución mostró tiempos de coagulación de 12,5 y
39,4 segundos, cuando se usó con plasma normal congelado y plasma
Coumadine, respectivamente. Para este experimento, los liposomas
contenían 58; 25 y 17% (p/p) de DOPC, DOPS, y ácido oleico,
respectivamente. Bajo condiciones idénticas un control (lote de
fabricación TFS-625 de TF preparado mediante el
procedimiento del detergente), mostró un tiempo de coagulación de
12,4 y 40,4 segundos, respectivamente.
Los mejores tiempos de coagulación se obtuvieron
usando NaCl para solubilizar el factor tisular. La Tabla 2 muestra
que los tiempos de coagulación son mayores cuando el factor tisular
se solubiliza en DMSO, TFE o alcohol. Los datos muestran que los
solventes orgánicos son menos útiles que el NaCl como agente
solubilizante.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las Tablas 3a y 3b muestran que los tiempos de
coagulación más rápidos se obtienen cuando los fosfolípidos usados
son DOPC y DOPS en una relación 7:3, y está presente ácido oleico
en un intervalo que incluye aproximadamente 16 a 30 por ciento en
peso. El tiempo de coagulación para una muestra de un paciente
normal usando este tipo de reactivos e instrumentos se encuentra
entre 13-17 segundos.
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Los experimentos muestran que incrementar el
contenido de proteína no incrementa el tiempo de coagulación. La
Tabla 4 muestra que incluso cuando se dobla la cantidad de proteína
reconstituida, o incluso se cuadriplica, el tiempo de coagulación
no varía de forma significativa.
La Tabla 4 también muestra que los aditivos tales
como el colesterol y el ácido palmítico incrementan los tiempos de
coagulación.
Las Tablas 5 y 6 muestran que añadir otros
fosfolípidos, u otros tipos de ácidos grasos da como resultado
tiempos de coagulación mayores.
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Claims (22)
1. Un procedimiento para fabricar liposomas que
tengan proteínas de membrana incorporadas en ellos, el
procedimiento comprende:
- a)
- proporcionar la proteína de membrana en solución;
- b)
- proporcionar una solución de liposomas preformados, en la que los liposomas se forman combinando una mezcla de fosfolípidos con una solución de al menos un tipo de ácido graso insaturado;
- c)
- incubar la mezcla
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que el ácido graso comprende un ácido graso
insaturado que tiene entre aproximadamente 16 y aproximadamente 20
átomos de carbono.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2 en el que el ácido graso comprende ácido
oleico.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que la etapa de proporcionar la proteína de
membrana en solución comprende además solubilizar la proteína de
membrana en una solución de sal.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que la mezcla de fosfolípidos comprende
dioleilfosfatidil colina y dioleilfosfatidil serina.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5 en el que la dioleilfosfatidil colina y
dioleilfosfatidil serina están en una relación entre
aproximadamente 4 y aproximadamente 1.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5 en el que la dioleilfosfatidil colina y
dioleilfosfatidil serina están en una relación entre
aproximadamente 7 y aproximadamente 3.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que los fosfolípidos son sintéticos.
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que la mezcla se incuba entre
aproximadamente 25ºC y aproximadamente 45ºC.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 en el que el ácido oleico está presente en una
cantidad comprendida entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30
por ciento en peso.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10 en el que el ácido oleico está presente en una
cantidad de aproximadamente el 16 por ciento en peso.
12. Un procedimiento para fabricar un reactivo de
factor tisular que comprende:
- a)
- proporcionar el factor tisular en solución;
- b)
- proporcionar una solución de liposomas preformados, en la que los liposomas se forman combinando una mezcla de fosfolípidos con una solución de al menos un tipo de ácido graso insaturado; y
- c)
- incubar la mezcla
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 en el que el ácido graso comprende un ácido graso
insaturado que tiene entre aproximadamente 16 y aproximadamente 20
átomos de carbono.
14. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13 en el que el ácido graso comprende ácido
oleico.
15. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 en el que la etapa de proporcionar el factor
tisular en solución comprende además solubilizar el factor tisular
en una solución de sal.
16. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 en el que la mezcla de fosfolípidos comprende
dioleilfosfatidil colina y dioleilfosfatidil serina.
17. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16 en el que la dioleilfosfatidil colina y
dioleilfosfatidil serina están en una relación de entre
aproximadamente 4 y aproximadamente 1.
18. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16 en el que la dioleilfosfatidil colina y
dioleilfosfatidil serina están en una relación de entre
aproximadamente 7 y aproximadamente 3.
19. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 en el que los fosfolípidos son sintéticos.
20. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 en el que la mezcla se incuba entre
aproximadamente 25ºC y aproximadamente 45ºC.
21. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14 en el que el ácido oleico está presente en una
cantidad comprendida entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30
por ciento en peso.
22. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 21 en el que el ácido oleico está presente en una
cantidad de aproximadamente el 16 por ciento en peso.
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