ES2204924T3 - Procedimiento para la reactivacion mediante congelacion de proteinas de membrana purificadas. - Google Patents
Procedimiento para la reactivacion mediante congelacion de proteinas de membrana purificadas.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCESO PARA LA REACTIVACION DE PROTEINAS DE MEMBRANA PURIFICADAS, DONDE SE CONGELA UNA MEZCLA A BASE DE PROTEINAS DE MEMBRANA, UN FOSFOLIPIDO Y UN DETERGENTE Y SE RECONSTITUYE DE NUEVO.
Description
Procedimiento para la reactivación mediante
congelación de proteínas de membrana purificadas.
La invención se refiere a un procedimiento para
la reactivación de proteínas de membrana purificadas para dar
proteínas activas.
Las proteínas de membrana, por ejemplo,
receptores, están compuestas por uno o múltiples dominios
trans-membranosos, así como por dominios intra y
extracelulares. La actividad de estas proteínas se mide, con
frecuencia, tras la integración de la proteína purificada en una
membrana artificial.
Como ejemplo se puede citar el factor tisular
(tromboplastina tisular). Este receptor para el Factor VII está
compuesto por apoproteína y lípidos. La apoproteína es un
polipéptido glicosilado de 263 aminoácidos. Próxima al extremo
carboxi-terminal, posee una secuencia hidrófoba de
23 aminoácidos, con la que está unida a la membrana. La fracción
intracelular se compone de 21 aminoácidos. In vivo, el
factor tisular se presenta como una proteína de membrana integral
de células que no se encuentran en contacto directo con la sangre.
Su función fisiológica consiste en fijar y activar, como receptor
de la superficie celular en contacto con sangre o plasma, el factor
de coagulación plasmático VII. Este complejo posee actividad
serin-proteasa y, por su parte, es capaz de activar
los Factores IX y X y desencadenar la coagulación.
En el aislamiento del factor tisular se pueden
distinguir dos métodos. En uno de ellos, el factor tisular activo se
purifica parcialmente, incorporando tejidos adecuados y aislando la
correspondiente fracción de membrana. Este método se utiliza, en
primer lugar, en la preparación de reactivos aplicables en
diagnósticos para la comprobación de la coagulación sanguínea en
plasma. Dado que la proteína de membrana se aísla en su totalidad
(es decir, incluidas las moléculas lipídicas), no es necesaria la
reactivación de la apoproteína.
En el otro procedimiento, se obtiene la
apoproteína aislada. Puesto que prácticamente carece de actividad,
debe ser reactivada. Para ello, se le debe integrar nuevamente en
una membrana lipídica. Este procedimiento es imprescindible para
proteínas obtenidas de forma recombinante, puesto que los
organismos microbiológicos utilizados para la producción no son
capaces, normalmente, de proporcionar una proteína de membrana
suficientemente activa. Estas consideraciones son aplicables,
básicamente, también a proteínas preparadas por síntesis parcial o
total in vitro.
Para la reincorporación de proteínas de membrana
purificadas en una membrana lipídica se conoce una serie de
procedimientos. Habitualmente, con este fin, se llevan a solución
acuosa fosfolípidos con un detergente, por ejemplo,
Triton-X 100. Ésta se mezcla, inicialmente, con la
proteína de membrana. A continuación, se separa el detergente, por
ejemplo, mediante diálisis. Al mezclar la apoproteína con la
solución de fosfolípidos, o en la separación del detergente, se
produce la incorporación de la proteína en la vesícula de membrana
que se está formando. El detergente preferido es desoxicolato, dado
que se puede separar por diálisis. En principio, sin embargo, se
pueden utilizar otros detergentes, siempre que se les pueda
separar, una vez más, de la mezcla.
Brotherus et al. (Biochimica et Biophysica Acta,
731 (1983) 290-303) describen la incorporación, en
una vesícula de fosfolípido, de una ATP-asa
(Na^{+}+K^{+}) aislada de la membrana celular mediante un
detergente, en la que la enzima, junto con la
fosfatidil-colina, se congela de forma
ultra-rápida en nitrógeno líquido, se trata, tras
la incorporación, con ultrasonidos a temperatura ambiente y se
sustituye el medio que rodea la vesícula fosfolipídica.
La presente invención tenía la misión de poner a
disposición un procedimiento simplificado, con ayuda del cual poder
integrar en la vesícula lipídica y, por lo tanto, reactivar
proteínas de membrana con una cantidad mínima de etapas y de la
forma más rápida posible.
Sorprendentemente, se ha encontrado que esta
relipidización se puede alcanzar mediante la simple congelación de
una mezcla de fosfolípidos, detergente y proteína de membrana. No
resulta imprescindible la ulterior separación del detergente de la
mezcla de reacción.
Básicamente, el procedimiento según la invención
se puede utilizar también sobre mezclas de proteínas
purificadas.
Se ha encontrado que se puede lograr la
relipidización congelando una mezcla líquida, preferentemente
concentrada, y preferentemente acuosa de fosfolípido, detergente y
proteína de membrana. La congelación se puede llevar a cabo a
temperaturas de 0ºC hasta -200ºC, preferentemente, a aproximadamente
-70ºC. La velocidad de la congelación no es crítica. El tiempo
durante el que la mezcla permanece en estado congelado puede variar
entre 1 hora y 1 año; de manera más preferida, la mezcla se congela
durante aproximadamente 16 horas. Es conveniente congelar de forma
homogénea toda la mezcla. La descongelación se produce a 0ºC hasta
100ºC, de forma más preferida a aproximadamente 37ºC.
Como fosfolípido se puede utilizar un material de
origen vegetal o animal, conocido por el especialista en la técnica,
en forma de mezcla natural de componentes conocidos. Asimismo, se
pueden usar fosfolípidos puros o sus mezclas, conocidos por el
especialista.
De manera más preferida, en el procedimiento
según la invención se trabaja con mezclas de fosfolípidos vegetales.
La concentración en lípidos asciende en la mezcla a congelar,
preferentemente, a entre 0 y 500 mg/ml.
La proteína de membrana puede ser de origen
humano, vegetal, animal, microbiano o recombinante. También es
posible la activación de mutantes inactivos de proteínas de origen
natural.
Se prefiere, en este último caso, una proteína
humana y, eventualmente, recombinante.
Se prefiere el uso de una proteína de membrana
disuelta en una concentración de 0 hasta 50 mg/ml.
Como detergente se pueden utilizar detergentes no
iónicos, aniónicos o catiónicos, tanto en forma pura como en
mezcla. La concentración se encuentra entre 0% y 50%. En el
procedimiento según la invención, se trabaja, preferentemente, con
el detergente no iónico Triton-X 100, en una
concentración de 2%.
De manera preferida, se emulsiona, en primer
lugar, el fosfolípido en agua o en un líquido acuoso, en una
concentración de 0% hasta 50%. El detergente se disuelve en agua o
en un líquido acuoso en una concentración de 0% hasta 50%. A
continuación, se mezclan el fosfolípido, el detergente y la proteína
de membrana en una relación cuantitativa adecuada. La mezcla se
congela a 0ºC hasta -200ºC. Una vez que toda la mezcla esté
congelada, se conserva a esta temperatura durante un período desde
1 hora hasta 1 año, preferentemente, durante 16 horas.
Seguidamente, se descongela a una temperatura entre 0ºC y 100ºC,
preferentemente, a 37ºC. El exceso de detergente se puede separar
por diálisis contra un tampón o, mediante la adición de una gran
cantidad de tampón, diluirlo de manera que no interfiera en las
siguientes reacciones.
Preferentemente, se congela en presencia de agua.
No obstante, parece posible también congelar una mezcla líquida de
los componentes sin presencia de agua. Asimismo, la proteína de
membrana puede estar unida, durante la congelación con el lípido y
el detergente, a una matriz sólida.
Tras la relipidización, la proteína de membrana
queda incorporada en forma activa en una membrana lipídica. Se le
puede dotar y completar con aditivos para usos ulteriores.
Si, por ejemplo, se relipidiza apoproteína de
factor tisular en el procedimiento según la invención, resulta
posible su uso como agente terapéutico o agente de diagnóstico. En
el segundo caso, el factor tisular relipidizado se puede seguir
procesando, en especial, para dar un reactivo para la determinación
del tiempo de protrombina, con el fin de determinar la coagulación
sanguínea en plasma.
Con respecto a los procedimientos conocidos y
descritos para la relipidización de proteínas de membrana, el
procedimiento según la invención muestra la ventaja de una
realización más sencilla. En particular, se puede prescindir de la
etapa de procesamiento, costosa en términos tanto de trabajo como
desde el punto de vista económico, de la diálisis contra un tampón
exento de detergente.
Por medio del ejemplo de la apoproteína del
factor tisular, se explicará la invención de manera más
detallada.
Se mezclaron:
| 30 ml | suspensión de fosfolípido en agua destilada (Phospholipon 25P, Cía. Nattermann) al 10% |
| 5 ml | apoproteína de tromboplastina tisular humana purificada 1 mg/ml |
| 4 ml | Triton-X 100 al 20% |
| 1 ml | agua destilada |
Después de agitar durante 1 hora, la mezcla se
congeló durante 16 horas a -70ºC. Después de este tiempo, la mezcla
se descongeló a 37ºC y se diluyó con 20 l de:
| Ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-eta-nosulfónico) pH 7,5 | 50 mM |
| Cloruro de calcio | 13 mM |
La determinación del tiempo de protrombina tuvo
lugar en un dispositivo de coagulometría según Schnitger y Gross
(0,1 ml de mezcla de plasma normal humano + 0,2 ml de factor
tisular relipidizado) y dio un tiempo de coagulación de 10,8 s.
Los reactivos se prepararon básicamente de la
forma descrita en el Ejemplo 1. La mezcla de proteína de membrana,
detergente y lípido se congeló a -20ºC y a -60ºC y se diluyó,
seguidamente, con tampón.
Como controles negativos, se congelaron y
descongelaron de la misma forma mezclas de lípido y proteína o
lípido y detergente. A continuación, se agregaron los componentes
ausentes y tampón.
En un dispositivo de coagulometría según
Schnitger y Gross se obtuvieron, con una mezcla de plasma normal
humano los siguientes tempos de coagulación:
Se diluyó una mezcla de plasma normal humano con
el plasma deficitario en Factor VII (Behringwerke AG, Marburgo,
Alemania). Se establecieron concentraciones de Factor VII entre 100%
y 1% (referido a la mezcla de plasma normal humano).
Los tiempos de protrombina de las muestras se
determinaron, a continuación, en un dispositivo de coagulometría
según Schnitger y Gross. Los tiempos medidos se establecieron en
relación con el tiempo de protrombina de la mezcla de plasma
normal. La Fig. 1 muestra los tiempos de protrombina relativos
[relación de protrombina PR = (PT)/(PT_{100% \ de \ Factor \
VII})] en función de la concentración en Factor VII de la muestra.
Se utilizaron dos reactivos de factor tisular:
- a
- Factor tisular nativo, aislado de la placenta humana (®Thromborel S, Behringwerke AG)
- b
- Reactivo preparado a partir de apoproteína de factor tisular recombinante, de acuerdo con el procedimiento según la invención (según el Ejemplo 1).
El intervalo normal de la concentración en Factor
VII en la población humana (percentil 95) queda comprendido por
relaciones de protrombina de 1,00 \pm 0,20. Los plasmas que tienen
una relación fuera de este intervalo se consideran patológicos. La
concentración de Factor VII correspondiente a este límite de
sensibilidad es muy similar para los dos reactivos analizados.
En el intervalo inferior a 10% de Factor VII, el
reactivo basado en la apoproteína de factor tisular recombinante es
claramente más sensible.
Claims (10)
1. Procedimiento para la reactivación de la
apoproteína del factor tisular, caracterizado porque la
apoproteína del factor tisular se congela en presencia de un lípido
y un detergente, y se vuelve a descongelar, y la mezcla de
reacción, sin necesidad de separar ulteriormente el detergente, se
diluye con tampón y, eventualmente, se dota o completa con aditivos
para usos posteriores como agente terapéutico o de diagnóstico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza un lípido puro, una mezcla
de lípidos puros o una mezcla de lípidos naturales.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el detergente se utiliza en una
concentración de hasta 50%.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza un detergente no iónico.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se congela a una temperatura de 0ºC
hasta -200ºC.
6. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza apoproteína de factor tisular
disuelta.
7. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la concentración de la apoproteína del
factor tisular asciende a hasta 50 mg/ml.
8. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la concentración en lípidos asciende a
hasta 500 mg/ml.
9. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la apoproteína de factor tisular es de
origen humano, animal o recombinante.
10. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la apoproteína del factor tisular es un
mutante de la apoproteína de factor tisular.
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