ES2198727T3 - Tecnicas de diagnostico que utilizan el receptor soluble de proteina c/proteina c activada de celulas endoteliales. - Google Patents

Abstract

Se ha aislado plasma EPCR caracterizado y mostrado para bloquear la activación de proteina C celular y de actividad del anticoagulante APC. El plasma EPCR parece ser de aproximadamente 43.000 daltons y circula a aproximadamente 100 ng/ml (98,4 ñ 27,8 ng/ml, n = 22). El plasma EPCR unido a la proteína C activada, con una afinidad similar a la del EPCR soluble recombinante (Kdapp aproximadamente 30 nM), e inhibe tanto a la proteína C de activación sobre una línea de células endoteliales como a la actividad del anticoagulante APC, en un ensayo de coagulación de factor Xa de una etapa. El plasma soluble EPCR parece atenuar el aumento de EPCR unido a la membrana de activación de proteína C y la función anticoagulante de proteína C activada. El EPCR soluble se ha detectado también en orina. Los niveles de EPCR soluble pueden aumentar en enfermedad inflamatoria asociada con herida vascular, y parece estar relacionada con estados de inflamación y enfermedad asociados con coagulación anormal.

Description

Técnicas de diagnóstico que utilizan el receptor soluble de proteína C/proteína C activada de células endoteliales.

Antecedentes de la invención

La presente invención está de manera general en el área de los ensayos que implican la detección y/o medida del receptor de proteína C/proteína C activada de células endoteliales o formas solubles del mismo derivadas por proteolisis o por ayuste alternativo.

La activación de la proteína C para dar su proteasa de serina activa, proteína C activada (PCA), inicia una serie de acontecimientos que juegan un papel fundamental en la regulación de la coagulación sanguínea. La importancia clínica de la ruta de la proteína C es puesta de manifiesto por la multitud de disfunciones en esta ruta que tienen como resultado trombosis (Esmon y Schwarz, 1995, Trends Cardiovasc. Med. 5:141-148; Reitsma y col., 1995, Thromb. Haemost. 73:876-879). Los pacientes deficientes en proteína C presentan normalmente complicaciones trombóticas en la infancia que ponen en peligro su vida (Seligsohn y col., 1984, N. Engl. J. Med. 310:559-562; Esmon, 1992, Trends Cardiovasc. Med. 2:214-220) que son corregidas mediante la administración de proteína C (Dreyfus y col., 1991, N. Engl. J. Med. 325:1565-1568).

La proteína C y la PCA han sido también implicadas en la regulación de la respuesta de un huésped a la inflamación. La proteína C activada (PCA) puede prevenir los efectos letales de E. coli en modelos de sepsis por gram negativos en babuinos (Taylor y col., 1987, J. Clin. Invest. 79; Patente de EE.UU. Nº 5.009.889 para Taylor y Esmon) y resultados clínicos preliminares sugieren que la proteína C es eficaz para tratar ciertas formas de choque séptico humano (Gerson y col., 1993, Pediatrics 91:418-422). La inhibición de la proteína S, un componente importante de la ruta de la proteína C, exacerba la respuesta de primates a niveles subletales de E. Coli y aumenta la aparición de TNF en la circulación (Taylor y col., 1991, Blood 78:357-363). Estos resultados sugieren que la proteína C puede controlar la coagulación e influir sobre la inflamación.

La proteína C es activada cuando la trombina, el enzima terminal del sistema de coagulación, se une a una proteína de la superficie de las células endoteliales, la trombomodulina (Esmon, 1989, J. Biol. Chem. 264:4743-4746; Dittman y Majerus, 1990, Blood 75:329-336; Dittman, 1991, Trends Cardiovasc. Med. 1:331-336). En cultivo celular, la transcripción de trombomodulina es bloqueada por la exposición de las células endoteliales al factor de necrosis tumoral (TNF) (Conway y Rosenberg, 1988, Mol. Cell. Biol. 8:5588-5592) y la actividad trombomodulina y el antígeno son internalizados posteriormente y degradados (Lentz y col., 1991, Blood 77:543-550; Moore y col., 1989, Blood 73:159-165). La C4bBP, una proteína reguladora del sistema del complemento, se une a la proteína S para formar un complejo que es funcionalmente inactivo para apoyar la actividad anticoagulante de la PCA in vitro (Dahlbäck, 1986, J. Biol. Chem. 261:12022-12027) e in vivo (Taylor y col., 1991). La C4bBP se comporta como un reactivo de fase aguda (Dahlbäck, 1991, Thromb. Haemostas. 66:49-61). Por tanto, las proteínas de esta ruta parece que no sólo regulan la inflamación, sino que también interaccionan con componentes que regulan la inflamación, y ellas mismas están sometidas a regulación a la baja por mediadores inflamatorios.

Las células endoteliales juegan un papel crítico en la ruta de la proteína C en cuanto a que expresan dos de los receptores conocidos responsables de la activación eficaz de la proteína C, la trombomodulina y el receptor endotelial de proteína C/PCA (EPCR) (Fukudome y Esmon, 1994, J. Biol. Chem. 269:26486-26491; Stearns-Kurosawa y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93:10212-10216). La trombomodulina (CD141) es un cofactor transmembranal que se une a la trombina circulante con una elevada afinidad y el complejo enzima-cofactor resultante se requiere para obtener tasas de activación de proteína C fisiológicamente relevantes (Esmon y Owen, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 78:2249-2252; Dittman, W.A., 1991, Trends Cardiovasc. Med. 1:331-336).

El EPCR es un receptor identificado recientemente con homología significativa a la familia de CD1/MHC de clase 1 (Fukudome y Esmon, 1994; Fukudome y col., 1996, J. Biol. Chem. 271:17491-17498; Regan y col., 1996, J. Biol. Chem. 271:17499-17503). El clonaje y la función biológica del receptor de la proteína C de células endoteliales fueron descritos en la PCT/US95/09636 por Oklahoma Medical Research Foundation, titulada ``Cloning and Regulation of an Endothelial Cell Protein C/Activated Protein C Receptor''. Se pronosticó que la proteína constaba de 238 aminoácidos, incluyendo una secuencia señal de 15 aminoácidos en el extremo N y una región transmembranal de 23 aminoácidos que caracteriza al receptor como una proteína transmembranal de tipo 1.

El EPCR se une a la proteína C y a la PCA con una afinidad similar (Kd_{ap}\sim30 nM) (Fukudome y col., 1996) en presencia de calcio y facilita la activación de la proteína C presentando el sustrato proteína C al complejo de activación trombina-trombomodulina en la superficie celular (Stearns-Kurosawa y col., 1996). Ambos receptores de células endoteliales son proteínas transmembranales de tipo 1 en las que el ligando se une a un dominio extracelular y ambos tienen una cola citoplásmica intracelular corta (Fukudome y col., 1996; Jackman y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:6425-6429; Wen y col., 1987, Biochemistry 26:4350-4357; Suzuki y col., 1987, EMBO J. 6:1891-1897). Además, su expresión en la superficie celular in vitro es regulada a la baja de manera similar por el factor de necrosis tumoral \alpha (Fukudome y Esmon, 1994). Sin embargo, las características de las formas solubles de trombomodulina y EPCR difieren en varios aspectos. La trombomodulina soluble recombinante tiene una actividad como cofactor reducida con relación a la forma de membrana (Galvin y col., 1987, J. Biol. Chem. 262:2199-2205; Parkinson y col., 1990, J. Biol. Chem. 265:12602-12610). Con ambos componentes purificados y con células, los cambios del sustrato de la trombina inducidos específicamente por la trombomodulina son el resultado de la competición por un dominio de unión compartido en la trombina así como de alteraciones conformacionales en la cavidad del sitio activo (Ye y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:23016-23021; Lu y col., 1989, J. Biol. Chem. 264:12956-12962; Ye y col., 1992, J. Biol. Chem. 267:11023-11028; Hofsteenge y col., 1986, Biochem. J. 237:243-251; Mathews, 1994, Biochemistry 33:13547-13552; Esmon y col., 1982, J. Biol. Chem. 257:7944-7947; Sadler y col., 1993, Haemostasis 23:183-193). La trombomodulina soluble acelera también la inactivación de la trombina por una variedad de inhibidores (Bourin y Lindahl, 1993, Biochem. J. 289:313-330; Rezaie, 1995, J. Biol. Chem. 270:25336-25339). El plasma y la orina contienen ambos trombomodulina detectable (Takano y col., 1990, Blood 76:2024-2029; Ishii y Majerus, 1985, J. Clin. Invest. 76:2178-2181) y como el gen de la trombomodulina no contiene intrones (Jackman y col., 1987), estas formas solubles son debidas a proteolisis del dominio extracelular en la superficie de la célula.

Los productos solubles de la degradación de la trombomodulina en plasma son un marcador conocido del daño de células epiteliales en una variedad de estados de enfermedad (Takano y col., 1990; Tanaka y col., 1991, Clin. Chem. 37:269-272; Takahashi y col., 1991, Am. J. Hematol. 38:174-177; Asakura y col., 1991, Am. J. Hematol. 38:281-287; Wada y col., 1992, Am. J. Hematol. 39:20-24; Takahashi y col., 1992, Am. J. Hematol. 41:32-39; Ohdama y col., 1994, Chest 106:666-671) y están compuestos por una mezcla de fragmentos que se unen a trombina con afinidades reducidas variables, así como por fragmentos que no se unen (Takano y col., 1990).

En contraste, el EPCR soluble recombinante (rsEPCR), truncado justo antes del dominio transmembranal, se une a la proteína C y a la PCA con una afinidad similar a la observada para el EPCR intacto expresado en la superficie celular (Fukudome y col., 1996). La actividad anticoagulante de PCA es inhibida eficazmente cuando se une al rsEPCR (Regan y col., 1996), debido presumiblemente a que el rsEPCR y el factor Va comparten ambos determinantes de unión en una hendidura reminiscente del exositio de unión de aniones I en la trombina ocupados por trombomodulina (Mather y col., 1996, EMBO J. 15:6822-6831). Sin embargo, el rsEPCR no parece influir sobre la proteolisis por PCA de sustratos sintéticos pequeños, ni sobre la inactivación de la PCA por \alpha1-antitripsina o por un inhibidor de la proteína C (Regan y col., 1996). A diferencia del EPCR unido a la membrana que incrementa la activación de la proteína C (Stearns-Kurosawa y col., 1996), el rsEPCR tiene poco efecto sobre la activación de la proteína C por el complejo trombina-trombomodulina soluble (Regan y col., 1996), sugiriendo que cualquier forma soluble del EPCR podría inhibir la activación de la proteína C compitiendo con el EPCR asociado a la membrana por la proteína C.

Fukudome y Esmon (1995) J. Biol. Chem. 270:5571-5577 refieren el clonaje y la expresión molecular de EPCR murino y bovino.

La inmunohistoquímica indica que el EPCR está presente primariamente en la superficie de células endoteliales de vasos grandes y está ausente o presente a bajos niveles en la mayoría de las células endoteliales de los capilares.

Es por tanto un objeto de la presente invención identificar utilizaciones terapéuticas y diagnósticas del EPCR soluble que existe de forma natural.

Es un objeto adicional de la presente invención caracterizar el EPCR soluble que existe de forma natural.

Resumen de la invención

El EPCR plasmático ha sido aislado y caracterizado y se ha demostrado que bloquea la activación de la proteína C celular y la actividad anticoagulante de la PCA. El EPCR plasmático parece tener 43.000 daltons aproximadamente y circula a 100 ng/ml aproximadamente (98,4 \pm 27,8 ng/ml, n = 22). El EPCR plasmático fue purificado de plasma citratado humano utilizando cromatografía de intercambio iónico, de inmunoafinidad y de afinidad con proteína C. Experimentos de citometría de flujo demostraron que el EPCR plasmático se unía a la proteína C activada con una afinidad similar a la determinada previamente a partir de EPCR truncado recombinante (Kd_{ap} 30 nM aproximadamente), definido como EPCR que no incluye los dominios transmembranal y citoplásmico. Además, el EPCR plasmático inhibía la activación de la proteína C en una línea de células endoteliales y la actividad anticoagulante de la PCA en un ensayo de coagulación con el factor Xa de una etapa. Se ha detectado también EPCR soluble en orina humana. El clonaje del gen que codifica EPCR demuestra que al menos el EPCR humano puede ser ayustado de manera alternativa, produciendo un EPCR soluble truncado que incluye un inserto exclusivo de la forma ayustada alternativamente (sEPCR). Estos resultados indican que el EPCR plasmático puede provenir de proteolisis en la superficie celular o de ayuste alternativo.

Si las concentraciones locales de EPCR plasmático son suficientemente elevadas, particularmente en estados de enfermedad, el dato indica que el EPCR plasmático soluble truncado podría atenuar el aumento de activación de la proteína C por el EPCR unido a la membrana y la función anticoagulante de la proteína C activada. Según queda demostrado por los ejemplos que comparan EPCR plasmático normal con los niveles de EPCR de pacientes con una enfermedad autoinmune (lupus eritematoso sistémico, LES) y sepsis (un trastorno que implica inflamación y anormalidades de la coagulación), los niveles de EPCR soluble parecen correlacionarse con la inflamación y con los estados de enfermedad asociados con la coagulación anormal. Se describen ensayos basados en la medida de EPCR soluble que son indicativos de condiciones de enfermedad que implican a la coagulación, inflamación y enfermedad de los vasos grandes. Se describen reactivos de ensayo, incluyendo EPCR soluble aislado y purificado, EPCR soluble truncado recombinante y anticuerpos hacia los EPCRs solubles.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de los dos mecanismos conocidos para la producción de un receptor soluble aplicados al EPCR, por proteolisis del receptor unido a la membrana para liberar un dominio extracelular y dejar el anclaje a la membrana, y por ayuste alternativo del ARNm, mostrando las secuencias exclusivas del EPCR unido a la membrana (mEPCR) y del EPCR plasmático sometido a proteolisis (pEPCR), y la secuencia exclusiva del EPCR soluble (sEPCR).

La Figura 2 es una representación esquemática que compara mEPCR y sEPCR, mostrando el inserto de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada exclusiva del sEPCR.

La Figura 3 muestra la secuencia insertada en el EPCR humano, bovino, murino y de babuino por el ayuste alternativo.

La Figura 4a es una gráfica que muestra que el EPCR plasmático soluble se une a la proteína C y a la PCA humanas. Células EA.hy926 fueron incubadas con fl-PCA 60 nM en presencia de rsEPCR 0 - 500 nM (\medbullet) o de EPCR plasmático (\medcirc) durante 30 minutos sobre hielo. Las células fueron lavadas y se determinó la fluorescencia unida a las células mediante citometría de flujo según está descrito. La fluorescencia intrínseca de las células en ausencia de fl-PCA añadida está indicada por la flecha. La fluorescencia celular media (FCM) representada gráficamente representa la media de determinaciones duplicadas de FCM.

Las Figuras 4b y 4c son gráficas que muestran que el EPCR plasmático soluble y el rsEPCR inhiben la activación de la proteína C en la superficie celular. En la Figura 4b, monocapas de células EA.hy926 fueron preincubadas durante 15 minutos a temperatura ambiente con proteína C 0,1 \muM sola (\Box) o con rsEPCR 1 \muM (\medbullet), o con 2 \mug/ml del mAb 1494 (\medcirc). La activación de la proteína C fue iniciada por la adición de trombina (2 nM final) y las reacciones fueron paradas a los tiempos indicados. La proteína C activada fue determinada con un ensayo amidolítico y se representan gráficamente para cada punto de tiempo las tasas de actividad en mDO/minuto. Se incluyeron pocillos control sin trombina añadida (\blacksquare). Cada punto de datos representa la media de las determinaciones de pocillos triplicados. En la Figura 4c, monocapas de células EA.hy926 fueron preincubadas durante 15 minutos a temperatura ambiente con proteína C 0,1 \muM y las concentraciones indicadas de EPCR plasmático (\medcirc) o rsEPCR (\medbullet). Se añadió trombina (2 nM final) y la activación procedió durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes fueron añadidos a una mezcla de antitrombina y heparina y se determinó la actividad de proteína C activada (mDO/minuto) con un ensayo amidolítico. Cada punto de datos representa la media de las determinaciones de pocillos triplicados.

La Figura 4d es una gráfica que muestra que el EPCR plasmático soluble inhibe la actividad anticoagulante de la PCA. La actividad anticoagulante de la PCA (25 nM) fue determinada con un ensayo de coagulación con Xa de una etapa en presencia de EPCR plasmático o rsEPCR 460 nM. El efecto fue revertido cuando se preincubó EPCR soluble durante 5 minutos con 42 \mug/ml del mAb 1496 que bloquea la unión de PCA a EPCR. Los datos representan la media de 4-6 determinaciones \pm D.E.

La Figura 5 es una gráfica que compara los niveles de TM plasmática soluble con los de EPCR plasmático soluble en pacientes con lupus, demostrando que no existe correlación entre los valores de TM y EPCR, pero que la mayoría de los pacientes con lupus presentan niveles extremadamente elevados de EPCR plasmático soluble.

La Figura 6 es una gráfica de la concentración (ng/ml) del receptor soluble para sTM (normal), sTM (sepsis), sEPCR (normal) y sEPCR (sepsis). No hay correlación en sTM y sEPCR, r^{2} = 0,034.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Receptor Endotelial de Proteína C, EPCR.

Soluble, en solución y no unido a la superficie celular.

Truncado, sin incluir el dominio transmembranal ni el dominio citoplásmico; puede ser el resultado de proteolisis o de ayuste alternativo.

Detección y caracterización del EPCR soluble; papel fisiológico y utilidad como marcador

Investigaciones previas sobre la función del EPCR encontraron que la unión de proteína C a la forma de EPCR unido a la membrana tenía como resultado la facilitación de la activación de la proteína C por el complejo trombina-trombomodulina en la superficie celular (Stearns-Kurusawa y col., 1996), pero que el EPCR recombinante soluble inhibía la actividad anticoagulante de la PCA (Regan y col., 1996). Estas observaciones, junto con el conocimiento de que los productos de la degradación de trombomodulina soluble en plasma son un marcador de daño endotelial en varios estados de enfermedad, condujeron a cuestionarse si existía(n) una(s) forma(s) circulante(s) soluble(s) del EPCR y, si era así, qué papel podría(n) tener en la ruta de la proteína C.

Los ejemplos demuestran que una forma soluble del EPCR circula en el plasma y está presente en la orina. En una población de donantes sanos, el nivel de EPCR plasmático era de 100 ng/ml aproximadamente y parecía ser una especie antigénica única de 43.000 daltons aproximadamente. La purificación posterior del EPCR soluble del plasma y estudios funcionales determinaron que era capaz de unirse a la proteína C y a la PCA con una afinidad similar a la del EPCR unido a la membrana intacto. Los estudios in vitro utilizando una línea celular endotelial demostraron que el EPCR plasmático inhibía la activación de la proteína C a concentraciones casi fisiológicas de proteína C y trombina. Además, la adición directa de EPCR plasmático purificado a plasma tuvo como resultado la inhibición de la actividad anticoagulante de la PCA que fue revertida con anticuerpos monoclonales hacia el rsEPCR.

La identificación de la proteína plasmática purificada como EPCR se basó en la comparación con las propiedades del rsEPCR. Estas proteínas reaccionaban ambas con la misma batería de anticuerpos monoclonales y policlonales, tenían la misma secuencia aminoterminal, se unían a proteína C inmovilizada de una manera dependiente de Ca^{2+}, y bloqueaban la activación de la proteína C y la actividad anticoagulante de la PCA con curvas dosis-respuesta similares. Además, las afinidades de la proteína C y de la PCA por rsEPCR y por el EPCR plasmático son similares a la afinidad del EPCR intacto unido a la membrana. Estas propiedades parecen ser exclusivas del EPCR.

Estudios previos demostraron que el EPCR unido a la membrana expresado en células endoteliales aumenta la activación de la proteína C en un factor de entre tres y cinco veces, mientras que los ejemplos demuestran que la forma soluble de EPCR purificada de plasma inhibe la activación de la proteína C en células endoteliales y la actividad anticoagulante de la PCA. Esto pronostica que el EPCR podría modular la ruta de la proteína C de varias maneras. En primer lugar, en los vasos más grandes en los que la concentración de trombomodulina es baja respecto a la microcirculación, la expresión de EPCR está incrementada proporcionalmente (Laszik y col., Circulation, 1997). La inmunohistoquímica muestra que en la mayoría de los órganos, la expresión del EPCR es muy intensa en los vasos grandes y disminuye progresivamente al disminuir el tamaño de los vasos, con poca o ninguna expresión en el tipo de células endoteliales más abundante, el endotelio de los capilares. La expresión del EPCR puede jugar un papel crítico en la captura del sustrato proteína C de la circulación y en la presentación del mismo al complejo trombina-trombomodulina para su activación. Esto está apoyado por observaciones in vitro de que la línea celular endotelial EA.hy926 y las células endoteliales de la vena umbilical humana tienen ambas al menos seis veces más antígeno EPCR expresado en la superficie que trombomodulina. En la microcirculación en la que la concentración de trombomodulina es elevada y la de EPCR es baja, se podría pronosticar una baja influencia sobre la activación de la proteína C. Finalmente, el EPCR soluble circulante podría reducir la producción de PCA y la capacidad de la PCA para inactivar el Factor Va.

En un individuo sano, los niveles de EPCR soluble son de 2,5 nM aproximadamente, una concentración muy por debajo de la Kd_{ap} (30 nM aproximadamente) y de la concentración de proteína C (80 nM) en la circulación. Los dos efectos del EPCR plasmático soluble (inhibición de la actividad anticoagulante de la PCA y de la activación de la proteína C) requerían concentraciones considerablemente más elevadas que las que están presentes en el plasma normal, dejando poco clara la cuestión del papel fisiológico del EPCR plasmático. Se han identificado pacientes con niveles de EPCR soluble que superan los 40 nM, según se describe en el Ejemplo 3 (lupus). Por tanto, si la concentración local cerca de la superficie de las células endoteliales supera a la concentración sistémica, la concentración de EPCR soluble alcanzaría niveles que atenuarían la generación y la actividad de la PCA, contribuyendo al riesgo trombótico.

Puede producirse una forma soluble de un receptor mediante el corte proteolítico del receptor unido a la membrana o mediante mecanismos de ayuste alternativo. La proteolisis en la superficie de la membrana libera trombomodulina soluble y receptores de TNF, IL-1, IL-2, M-CSF, PDGF y NGF (Heaney y col., 1996, Blood 87:847-857). Los receptores solubles tienen una multitud de funciones potenciales, incluyendo su actuación como antagonistas del receptor de membrana, la estabilización del ligando, el inicio de la producción de señales mediadas por el ligando, la modulación a la baja de la forma de membrana y la unión a inhibidores del receptor para facilitar indirectamente la actividad receptor-ligando. Este último mecanismo es utilizado por el sistema de receptores de la IL-1 en el que las isoformas solubles de ambos receptores de IL-1 se generan por corte proteolítico y regulan estrechamente la sensibilidad a IL-1\alpha y a IL-1\beta (Arend y col., 1994, J. Immunol. 153:4766-4774). La estructura genómica del EPCR contiene un sitio de ayuste alternativo que codificaría una proteína soluble truncada justo antes del dominio transmembranal (Fukudome y Esmon, 1995, J. Biol. Chem. 270:5571-5577), según se discute más adelante. Los receptores solubles de IL-6 parecen generarse por mecanismos proteolíticos y de ayuste alternativo (Mullberg y col., 1994, J. Immunol. 152:4958-4968; Lust y col., 1992, Cytokine 4:96-100; Horiuchi y col., 1994, Eur. J. Immunol. 24:1945-1948). Este sitio de corte puede ser también útil para recuperar grandes cantidades de EPCR soluble mediante la construcción de un vector de expresión que codifique el EPCR truncado seguido inmediatamente por una secuencia peptídica hacia la cual está dirigido específicamente un anticuerpo, según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.298.599 para Morrissey y Esmon, cuyas descripciones se incorporan a la presente. El epítopo será cortado posteriormente por proteolisis, antes o después de la administración a un paciente. Ver también la Patente de EE.UU. Nº 4.782.137 para Hopp y col.

Estudios inmunohistoquímicos han indicado que el EPCR está situado primariamente en el endotelio de los vasos grandes y es apenas detectable en los capilares. El EPCR plasmático derivado del EPCR unido a la membrana puede servir, por tanto, como un marcador de procesos de enfermedad de los vasos grandes. El EPCR plasmático puede servir como una comparación útil con los niveles de trombomodulina plasmática que se ha demostrado que están modulados en una variedad de estados de enfermedad, pero que reflejarían procesos de enfermedad de los vasos grandes y pequeños, pero que estarían dominados probablemente por contribuciones de los vasos pequeños, ya que la mayoría del endotelio es microvascular.

Análisis de nucleótidos y de la estructura proteica pronosticada del EPCR

Se ha pronosticado que el ADNc del EPCR codifica una proteína de 238 aminoácidos (Secuencia ID Nº 2), que incluye una secuencia señal de 15 aminoácidos (von Heijne, 1986, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690) en el extremo N-terminal. Por tanto, se pronostica que la proteína madura contiene 223 aminoácidos. La secuenciación directa de la proteína recombinante mostró que la proteína madura comenzaba en Ser18. La Secuencia ID Nº 2 es la secuencia de aminoácidos pronosticada del EPCR. Los aminoácidos 1-15 de la Secuencia ID Nº 2 (MLTTLLPILLLSGWA) son la supuesta secuencia señal determinada por el método de von Heijne (von Heijne, 1986). Los aminoácidos 211-236 de la Secuencia ID Nº 2 (LVLGVLVGGFIIAGVAVGIFLCTGGR) constituyen el supuesto dominio transmembranal. Están presentes sitios potenciales de N-glicosilación en los aminoácidos 47-49, 64-66, 136-138 y 172-174 de la Secuencia ID Nº 2. Están presentes residuos de cisteína extracelulares en los aminoácidos 17 (eliminado en el EPCR plasmático), 114, 118 y 186 de la Secuencia ID Nº 2. Se identificó una región transmembranal potencial (Engelman y col., 1986, Annu. Rev. Biophys. Chem. 15:321-53) que constaba de 23 aminoácidos en el extremo C-terminal (comenzando en el aminoácido 211 de la Secuencia ID Nº 2).

La proteína es una proteína transmembranal de tipo 1. El dominio extracelular contiene cuatro sitios potenciales de N-glicosilación y tres residuos de Cys. La glicosilación no es esencial para la actividad, según se demostró por la digestión con N-glicanasa. La región citoplásmica contiene solamente tres aminoácidos y termina con una Cys, que está palmitoilada. Si la cisteína terminal no está palmitoilada apropiadamente, la proteína puede ser secretada. La alteración de la secuencia del EPCR con el fin de sustituir esta cisteína por otro aminoácido proporciona de este modo un medio para producir un EPCR esencialmente de longitud completa, que es secretado en lugar de estar unido a la membrana.

Según se utilizan en la presente, las secuencias de nucleótidos que codifican el receptor incluyen la secuencia mostrada en la Secuencia ID Nº 1, y secuencias que tienen sustituciones, adiciones o deleciones conservadoras de la misma que hibridan con la Secuencia ID Nº 1 bajo condiciones rigurosas. Según se utilizan en la presente, las secuencias de aminoácidos que constituyen el receptor incluyen la secuencia mostrada en la Secuencia ID Nº 2 y secuencias que tienen sustituciones, adiciones o deleciones conservadoras de la misma que forman un receptor que tiene una actividad biológica funcionalmente equivalente. Es bien conocido por los expertos en la técnica lo que constituyen las sustituciones, adiciones o deleciones conservadoras, y que pueden ser determinadas fácilmente como codificadoras, o formadoras, de una molécula de receptor funcionalmente equivalente utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. Esto está ilustrado adicionalmente por referencia a la Figura 3, discutida más adelante.

Ayuste alternativo

Los receptores son visualizados muy a menudo como proteínas ancladas en una membrana celular con la porción expuesta al exterior de una célula responsable de la unión a un ligando específico para generar una respuesta fisiológica. En muchos casos existe una forma soluble del receptor que es frecuentemente bastante capaz de unirse a su ligando, a pesar del hecho de que ya no está restringido a una célula. La unión del ligando a la isoforma soluble del receptor puede generar también una respuesta que toma muchas formas, incluyendo la modulación al alza o a la baja de las interacciones del receptor unido a la membrana, o la propagación de una respuesta mediante el transporte del ligando a una célula que normalmente no es sensible (Heaney, ML y DW Golde, Soluble cytokine receptors, Blood 87:847-857, 1996).

Existen dos mecanismos conocidos para producir un receptor soluble: mediante proteolisis del receptor unido a la membrana para liberar un dominio extracelular y dejar el anclaje a la membrana, y mediante ayuste alternativo del ARNm (Figura 1). Este último mecanismo puede tomar varias formas, pero la más sencilla es cuando el marco de lectura continúa a través de un límite exón-intrón y termina con un codon de parada antes de alcanzar la secuencia que codifica el anclaje transmembranal. Esto crea una proteína que es similar a la forma de membrana pero con diferencias importantes. Es producida, y secretada, como una proteína soluble y tendrá una cola carboxilo-terminal exclusiva. Esta cola es formada por la lectura de una porción de la secuencia de ARNm del intrón que es ignorada en la formación del receptor unido a la membrana. La producción de un receptor soluble mediante ayuste alternativo puede ser también modulada independientemente del receptor unido a la membrana, a pesar del hecho de que ambos se originan del mismo molde de ARNm (Heaney y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2365-2369, 1995).

Para demostrar que se ha generado un receptor soluble por mecanismos de ayuste alternativo, se debe conocer la secuencia genómica y los límites intrón-exón de la región relevante. Es también de ayuda relacionar el receptor soluble con una respuesta fisiológica con el fin de distinguirlo de un ayuste aberrante del ARNm, encontrado bastante frecuentemente durante la expresión de los genes de la proteína C y de la proteína S (Berg y col., Blood Coag Fibrinol. 7:625-631, 1996).

Los detalles de los estudios y resultados siguientes están descritos en los ejemplos. El plasma humano contiene 100 ng/ml aproximadamente de EPCR soluble (Tabla 1). Éste fue medido mediante un inmunoensayo con enzima unido (ELISA) utilizando dos anticuerpos monoclonales (el mAb 1494 y el mAb 1495) y técnicas estándar. Se encontraron niveles de EPCR soluble significativamente elevados en pacientes con lupus eritematoso sistémico y sepsis. Estos niveles parecían bastante elevados para un receptor unido a la membrana que está presente, con unas cuantas excepciones, solamente en la superficie de los vasos sanguíneos grandes. Para ver esto en perspectiva, la trombomodulina (TM) se expresa en todo el endotelio, así como en algunas células no vasculares, aunque los niveles normales de TM soluble son solamente de 10-40 ng/ml (Takano y col., Blood 76, 2024-2029, 1990). Los niveles de TM soluble estaban elevados en los pacientes con lupus, pero no con sepsis. Significativamente, no había correlación entre los niveles plasmáticos de EPCR y TM en estos grupos de pacientes (r^{2} = 0,028 y 0,034, respectivamente).

TABLA 1 Niveles plasmáticos de receptores solubles

	EPCR plasmático	TM plasmática
	ng/ml	ng/ml
Voluntarios normales,	133,4 \pm 53,4	35,5 \pm 20,4
n = 20
Lupus eritematoso	262,1 \pm 154,5*	104,7 \pm 77,5*
sistémico, n = 40	(P = 0,0004)	(P = 0,0008)
Sepsis, n = 24	224,9 \pm 74,5*	39,9 \pm 73,1
	(P = 0,00009)
*Diferencia significativa entre las medias con relación a los normales; test t de Student no pareado.

La estructura genómica de la TM no contiene intrones (Jackman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:6425-6429, 1987), por lo que la única manera de crear una isoforma soluble de la TM es mediante proteolisis del receptor unido a la membrana. Se ha demostrado in vitro la proteolisis de la TM endotelial por la elastasa de neutrófilos y por la catepsina G, sugiriendo que los niveles elevados de TM soluble encontrados en una variedad de estados de enfermedad son el resultado de la proteolisis mediada por los productos de las células inflamatorias activadas en la superficie endotelial (Boehme y col., Immunology 87:134-140, 1996 y Abe y col., J. Lab. Clin. Med. 123:874-881, 1994).

La falta de correlación entre los niveles plasmáticos de EPCR y TM y la elevada concentración de EPCR plasmático, es consistente con el concepto de que el EPCR plasmático se origina a partir de mecanismos proteolíticos y de ayuste alternativo. La estructura genómica del EPCR humano contiene cuatro exones, separados por intrones. La revisión de esta secuencia revela una secuencia de lectura en marco después del límite exón III - intrón III (en GT 5') que incluye un codon de parada TAA en la posición 7527. Como este codon de parada está corriente arriba del exón IV que codifica el dominio transmembranal, la proteína pronosticada contendría una cola exclusiva carboxilo-terminal de 48 residuos (codificada por la secuencia del intrón) y no contendría un anclaje transmembranal.

La Figura 1 es un diagrama de dos maneras potenciales de las que puede derivar el EPCR truncado: por proteolisis inmediatamente antes del dominio transmembranal o por ayuste alternativo. Según está mostrado por la Figura 2, el ayuste alternativo tiene como resultado la inclusión de una secuencia peptídica en el EPCR truncado ayustado alternativamente. Según está mostrado por la Figura 3, esta secuencia está altamente conservada entre las especies, aunque existen ligeras diferencias, teniendo como resultado una nueva cola carboxilo-terminal de 48 residuos para el EPCR humano y bovino, de 51 residuos para el EPCR murino y de 22 residuos para el EPCR de babuino.

Selección de muestras de pacientes por la expresión de proteínas receptoras

Muestras de pacientes pueden ser sometidas a selección por la presencia de, y por la cantidad de, sEPCR o EPCR, utilizando anticuerpos hacia EPCR, el único inserto presente en el inserto de EPCR ayustado alternativamente, o bien utilizando anticuerpos que se unan con mayor afinidad a EPCR o a sEPCR debido a diferencias conformacionales. Las muestras pueden ser también sometidas a selección utilizando otras técnicas estándar para cuantificar específicamente las proteínas que estén presentes.

Producción de anticuerpos para uso diagnóstico o terapéutico

Pueden generarse anticuerpos hacia el EPCR y, en particular, hacia el EPCR soluble (``sEPCR''), y hacia el EPCR soluble recombinante (``rsEPCR'') que sean útiles para la detección, caracterización o aislamiento de las proteínas receptoras, así como para modificar la actividad de las proteínas receptoras a través de, en la mayoría de los casos, la inhibición de la unión del ligando. Los anticuerpos son producidos mediante técnicas estándar utilizando como inmunógeno proteínas receptoras humanas o animales purificadas o recombinantes, o fragmentos de las mismas.

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales hacia EPCR según está descrito para otras proteínas por Esmon y col., 1993, Methods Enzymol. 222, 359-385. Los anticuerpos referidos como mAbs 1494, 1495 y 1496 son anticuerpos IgG1\kappa que se unen al EPCR soluble recombinante y al EPCR expresado en la superficie celular. Los mAbs 1494 y 1496 bloquean la unión de la proteína C y de la PCA al EPCR, e inhiben la capacidad del EPCR celular para facilitar la activación de la proteína C por el complejo trombina-trombomodulina. El mAb 1495 no bloquea la unión del ligando al EPCR, no altera la activación de la proteína C en la superficie celular y tiene un epítopo de unión distinto del de los mAbs 1494 ó 1496. Los anticuerpos pueden ser marcados utilizando técnicas estándar tales como radiomarcaje, marcaje enzimático, marcas fluorescentes tales como fluoresceína, partículas de oro, colorantes y otros medios para la detección de anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser biotinilados con el éster biotinamidocaproato N-hidroxisuccinimida utilizando procedimientos estándar. El anticuerpo puede ser inmovilizado en un soporte sólido para ser utilizado en inmunoensayos, por ejemplo en AffiGel-10™, nitrocelulosa o en pocillos de microvaloración, o puede ser utilizado en inmunoensayos en fase de solución.

En una realización preferida, el EPCR es medido utilizando placas de microvaloración (Maxisorp™, NUNC NS, Roskilde, Dinamarca) revestidas con 50 microlitros de 4 microgramos/ml del mAb 1495 en Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 35 mM, pH 9,6, a 4ºC durante una noche. A temperatura ambiente, las placas son lavadas posteriormente tres veces con Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, Tween 20 0,05%, pH 7,5 (tampón de ensayo) y bloqueadas con tampón de ensayo conteniendo un 0,1% (peso/volumen) de gelatina durante al menos una hora. Los pocillos son lavados posteriormente, se añaden muestras de 50 microlitros en pocillos triplicados y se incuban las placas durante una hora. Los pocillos son aspirados, lavados tres veces con tampón de ensayo y se añaden 50 microlitros de biotina-mAb 1494 2 microgramos/ml. Las placas son incubadas durante 1 hora, lavadas tres veces y se añaden 50 microlitros del conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina 0,25 microgramos/ml (GIBCO BRL) y se incuban durante una hora adicional. Los pocillos son lavados cinco veces y se añaden secuencialmente a intervalos de 15 minutos el sustrato y los reactivos amplificadores de un kit de amplificación mediante ELISA (GIBCO BRL) de acuerdo con las direcciones del fabricante. El desarrollo de color es parado con H_{2}SO_{4} 0,3 M y se lee la absorbancia de punto final a 490 nm en un lector de microplacas Vmax. Los estándares en pocillos triplicados son desde 1,5 a 100 ng de rsEPCR/ml en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M y EDTA 1 mM, gelatina 0,1%, pH 7,5. La curva estándar es lineal desde 1,5 a 12,5 ng/ml, y las muestras son diluidas con el mismo tampón con el fin de que entren dentro del rango lineal. Los estudios muestran que entre un uno y un dos por ciento de plasma no afecta a la linealidad del ensayo ni a la sensibilidad de la curva estándar. Muestras de plasma de voluntarios sanos fueron diluidas con tampón de ensayo que contenía EDTA 1 mM hasta un contenido final de plasma del 2%, y se calcularon los niveles del antígeno EPCR a partir de la media de pocillos triplicados por referencia a la curva estándar determinada en la misma placa.

Trastornos

El ensayo para determinar EPCR soluble es útil en la detección y en el análisis de estados y enfermedades de la coagulación e inflamatorias según se discute en la presente, tales como enfermedades autoinmunes como el lupus, en la monitorización de trasplantes, sepsis, choque, pre-eclampsia, diabetes, ``bypass'' cardiopulmonar, angina inestable, restenosis, angioplastia (esto es, enfermedad vascular), enfermedad renal o hepática. Por ejemplo, el EPCR es un marcador de los vasos sanguíneos grandes y, por tanto, de daño en los vasos sanguíneos grandes. Un incremento de la cantidad de EPCR soluble es indicativo de una lesión en un vaso grande, que tiene como resultado la proteolisis del EPCR o la estimulación de la síntesis de sEPCR. Puede determinarse también la relación de EPCR respecto a trombomodulina, sobre la base de muestras de sangre u orina, que es indicativa del grado relativo de daño microvascular frente al de vasos grandes. Pueden utilizarse también las cantidades relativas de EPCR respecto a citoquinas, marcadores de activación de leucocitos y factores del complemento o marcadores de activación, para indicar el estado de enfermedad.

Como el EPCR está presente en las células endoteliales, es útil como marcador de daño de células endoteliales. Puede ser utilizado como indicador del efecto de un fármaco, tanto de su toxicidad como de su eficacia. Por ejemplo, en pacientes con lupus, los fármacos que minimicen eficazmente el daño a los vasos grandes mediado por inflamación/coagulación, tendrían como resultado una disminución de los niveles de EPCR.

La presente invención será comprendida adicionalmente por referencia a los ejemplos no limitantes siguientes.

Ejemplo 1 Identificación del receptor endotelial funcional de la proteína C en plasma humano

Se utilizan las abreviaturas siguientes: rsEPCR, EPCR soluble recombinante con el epítopo HPC4 insertado en lugar del dominio transmembranal y la cola citosólica; mAb, anticuerpo monoclonal; SDS-PAGE, electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio poliacrilamida.

Métodos Materiales

Los reactivos siguientes fueron adquiridos a los proveedores indicados:

Heparina de mucosa intestinal porcina, fluorofosfato de diisopropilo, éster biotinamidocaproato N-hidroxisuccinimida, seroalbúmina bovina, Sigma (St. Louis, MO); Espectrozima PCa, American Diagnostica (Greenwich, CT); kit de amplificación por ELISA, Gibco BRL (Gaithersburg, MD); AffiGel-10, BioRad (Hercules, CA); solución de sales equilibrada de Hank, ácido 3-(N-morfolina)propano sulfónico (MOPS), Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Todos los demás reactivos fueron de la mejor calidad comercialmente disponible.

Proteínas

La proteína C humana (Esmon y col., 1993, Methods Enzymol. 222:359-385), la trombina bovina (Owen y col., 1974, J. Biol. Chem. 249:594-605) y la antitrombina bovina (Esmon, 1977, ``Factors regulating the inhibition of thrombin by antithrombin III. In Chemistry and Biology of Thrombin''. R.L. Lundblad, J.W. Fenton, II y K.G. Mann, editores. Ann. Arbor. Science, Ann. Arbor., 403-411) fueron purificadas según está descrito. El EPCR soluble recombinante, rsEPCR, consta del dominio extracelular del EPCR truncado en el residuo 210 justo antes del dominio transmembranal, seguido por una secuencia de 12 residuos que permite la purificación por inmunoafinidad dependiente de calcio sobre el anticuerpo monoclonal HPC4 (Takahashi y col., 1992; Stearns y col., 1988, J. Biol. Chem. 263:826-832). La construcción, purificación y las características de unión del rsEPCR a proteína C/PCA (Fukudome y col., 1996). Se preparó suero preinmune y antisuero policlonal de cabra hacia rsEPCR y se purificó la IgG (Fukudome y col., 1996). El anticuerpo policlonal anti-rsEPCR de cabra fue biotinilado con el éster biotinamidocaproato N-hidroxisuccinimida utilizando procedimientos estándar.

Anticuerpos monoclonales

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales (mAb) contra el rsEPCR según está descrito para otras proteínas (Esmon y col., 1993). Los mAbs 1494, 1495 y 1496 son anticuerpos IgG1\kappa que se unen al rsEPCR y al EPCR expresado en la superficie celular. Los mAbs 1494 y 1496 bloquean la unión de la proteína C y de la PCA al EPCR e inhiben la capacidad del EPCR celular para facilitar la activación de la proteína C por el complejo trombina-trombomodulina (Stearns-Kurosawa y col., 1996). El mAb 1495 no bloquea la unión del ligando al EPCR, no altera la activación de la proteína C en la superficie celular y tiene un epítopo de unión distinto del de los mAbs 1494 ó 1496. Los mAbs 1494 y 1495 fueron biotinilados con el éster biotinamidocaproato N-hidroxisuccinimida utilizando procedimientos estándar. El mAb 1494 fue acoplado a AffiGel-10, de acuerdo con las direcciones del fabricante, para purificar mediante inmunoafinidad el EPCR plasmático. La selección de los mAbs anti-EPCR fue realizada utilizando los métodos descritos por Stearns-Kurosawa y col. (1996); Fukudome y col. (1996).

Ensayo de coagulación

El efecto del rsEPCR o del EPCR plasmático purificado sobre la actividad anticoagulante de la PCA (25 nM) en un ensayo de coagulación con factor Xa de una etapa fue realizado (Regan y col., 1996) en presencia o ausencia de 83 \mug/ml del mAb 1496, un anticuerpo que bloquea la interacción PCA-EPCR (Stearns-Kurosawa y col., 1996). Los EPCRs solubles y el mAb 1496 fueron preincubados durante 15 minutos antes del ensayo.

Cultivo celular

Todas las líneas celulares humanas fueron mantenidas según se describió previamente (Fukudome y col., 1996). Las células EA.hy926, una línea de células endoteliales humanas transformadas (Edgell y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:3734-3737), fueron proporcionadas amablemente por Cora-Jean Edgell (University of North Carolina en Chapel Hill).

Análisis por citometría de flujo

Con el fin de que sirviera como sonda fluorescente, la PCA fue marcada con fluoresceína en el sitio activo (fl-PCA) según está descrito (Fukudome y Esmon, 1994; Bock, P.E., 1988, Biochemistry 27:6633-6639). El efecto del rsEPCR o del EPCR plasmático sobre la unión de PCA a células EA.hy926 fue estudiado mediante citometría de flujo (Fukudome y col., 1996). Brevemente, las células recogidas fueron incubadas durante 30 minutos sobre hielo con fl-PCA 60 nM en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de una preparación de EPCR soluble, se lavaron y se determinó la fluorescencia unida a las células mediante citometría de flujo con 10.000 acontecimientos contados por muestra. Todos los ensayos fueron realizados en solución de sales equilibrada de Hank suplementada con un 1% de seroalbúmina bovina, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 0,6 mM y un 0,02% de azida de sodio.

Activación de la proteína C en la superficie celular

Células EA.hy926 fueron cultivadas en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Stearns-Kurosawa y col., 1996). Las monocapas confluentes fueron lavadas tres veces con solución de sales equilibrada de Hank suplementada con un 1% (p/v) de seroalbúmina bovina, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 0,6 mM y un 0,02% de azida de sodio. Todos los ensayos fueron realizados a temperatura ambiente en el mismo tampón en un volumen final de 60 \mul, y todas las concentraciones de proteína representan la concentración final en el ensayo. Se añadió proteína C (0,1 \muM) en ausencia o presencia de rsEPCR, EPCR plasmático o del mAb 1494 a las concentraciones indicadas y se preincubó con las células durante 15 minutos. Se añadió trombina a las mezclas (2 nM) para iniciar las reacciones de activación. Al tiempo indicado, se retiraron alícuotas de 50 \mul y se añadieron a 10 \mul de antitrombina (0,7 \muM final) y heparina (5 U/ml final) en una placa de microvaloración de 96 pocillos. La actividad amidolítica de la PCA fue determinada por la adición del sustrato Espectrozima PCa (0,2 mM) y se midió la velocidad de cambio de la absorbancia a 405 nm (mDO/minuto) en un lector de microplacas cinético Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Todos los puntos del ensayo se realizaron en pocillos triplicados y se activó menos de un 10% del sustrato proteína C según se determinó mediante referencia a una curva estándar de proteína C totalmente activada frente a mDO/minuto.

Recogida de plasma y suero

Se recogió sangre completa de voluntarios adultos normales (12 mujeres y 10 hombres) mediante punción venosa en una solución tamponada de citrato al 3,8% o en tubos sin anticoagulante (tubos Vacutainer; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). No se intentó una selección de los donantes con respecto a la edad, a la dieta u a otras variables. Todos los voluntarios fueron informados del estudio y dieron su consentimiento escrito. La sangre fue centrifugada a 1160 x g durante 10 minutos. El plasma y el suero fueron alicuotados y almacenados congelados a -80ºC hasta el ensayo.

ELISA para cuantificar el EPCR plasmático

Se desarrolló un ensayo sobre inmunoabsorbente con enzima unido para detectar el antígeno EPCR en plasma. Placas de microvaloración (Maxisorp; Nunc, Rockilde, Dinamarca) fueron revestidas con 50 \mul del mAb 1495 4 \mug/ml en Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 35 mM, pH 9,6 a 4ºC durante una noche. Las etapas siguientes fueron realizadas a temperatura ambiente. Los pocillos fueron lavados tres veces con Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, Tween 20 0,05%, pH 7,5 (tampón de ensayo) y bloqueados con tampón de ensayo que contenía un 0,1% (p/v) de gelatina durante al menos una hora. Los pocillos fueron lavados, se añadieron muestras de 50 \mul en pocillos triplicados y las placas fueron incubadas durante una hora. Los pocillos fueron aspirados, lavados tres veces con tampón de ensayo y se añadieron 50 \mul de biotina-mAb 1494 2 \mug/ml. Las placas fueron incubadas durante una hora, se lavaron tres veces y se añadieron 50 \mul del conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina 0,25 \mug/ml (Gibco BRL) y se incubaron durante una hora adicional. Los pocillos fueron lavados cinco veces y se añadieron el sustrato y los reactivos amplificadores de un kit de amplificación por ELISA (Gibco BRL) secuencialmente a intervalos de 15 minutos de acuerdo con las direcciones del fabricante. La producción de color fue parada con H_{2}SO_{4} 0,3 M y se leyó la absorbancia de punto final a 490 nm en un lector de microplacas Vmax. Cada placa contenía estándares en pocillos triplicados de 1,5 - 100 ng/ml de rsEPCR en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM, gelatina 0,1%, pH 7,5. La curva estándar era lineal (r = 0,99) desde 1,5 a 12,5 ng/ml y las muestras de plasma fueron diluidas con el mismo tampón para que entraran dentro del rango lineal. Experimentos preliminares determinaron que una concentración final de plasma del 1-2% no afectaba a la linealidad ni a la sensibilidad de la curva estándar. Muestras de plasma de voluntarios sanos fueron diluidas con tampón de ensayo que contenía EDTA 1 mM hasta una concentración final de plasma del 2% y se calcularon los niveles de antígeno EPCR a partir de la media de pocillos triplicados por referencia a una curva estándar determinada en la misma placa.

Se desarrolló un ensayo alternativo en el que se invirtieron el anticuerpo de revestimiento y el anticuerpo de detección (revestimiento mAb 1494; detección biotina-mAb 1495) y la unión del anticuerpo se detectó con el sustrato Blue Phos (KPL Laboratories; Gaithersburg, MD). Este método fue utilizado para analizar EPCR plasmático en pacientes con sepsis. Este ensayo era más sensible, probablemente debido a diferencias de afinidad, pero ambos ensayos dieron resultados cualitativamente similares.

Transferencia Western

Se realizó una electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) de las muestras de plasma o suero con geles de acrilamida al 10% con el sistema de tampones de Laemmli (Nature 227, 680-685) bajo condiciones no reductoras utilizando procedimientos estándar. Los geles fueron transferidos a membranas de polivinilidina (PVDF; Millipore, Bedford, MA), las membranas fueron bloqueadas e incubadas posteriormente durante 30 minutos con IgG de cabra preinmune (50 \mug/ml) o con IgG policlonal de cabra anti-rsEPCR (50 \mug/ml). Después de lavar, las membranas fueron incubadas con el conjugado anti-IgG de cabra producido en ratón-peroxidasa de rábano picante (Pierce, Rockford, IL) a una dilución 1:20.000 durante 30 minutos. Las membranas fueron lavadas y se detectó el conjugado anticuerpo unido-enzima con un sustrato quimioluminiscente intensificado (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Inmunoadsorción

Muestras de suero o plasma citratado (400 \mul) de voluntarios sanos fueron incubadas con 50 \mul de mAb 1495 conjugado a AffiGel-10 (5 mg de IgG/ml de resina) durante una noche a 4ºC con mezclado. Las muestras fueron centrifugadas, se retiró el sobrenadante y la resina fue lavada tres veces con 1 ml de Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, azida de sodio 0,02%, pH 7,5. Se añadió a la resina lavada tampón de muestra para SDS-PAGE que contenía una concentración final de ditiotreitol de 20 mM, las muestras fueron llevadas a ebullición durante tres minutos y procesadas para SDS-PAGE y transferencia Western. Las membranas fueron sondadas con anticuerpo policlonal anti-rsEPCR de cabra biotinilado a 4 \mug/ml y el anticuerpo unido fue detectado con un conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Pierce) y un sistema de detección quimioluminiscente intensificado. Experimentos preliminares determinaron que la preadsorción de las muestras con 100 \mul de resina AffiGel-10 inactivada con Tris durante 1-4 horas a temperatura ambiente, seguido por inmunoadsorción durante una noche con mAb 1495-AffiGel-10, daba resultados de transferencia Western idénticos.

Purificación del EPCR plasmático

El EPCR plasmático fue purificado a partir de plasma citratado humano (Oklahoma Blood Institute), utilizando una combinación de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de inmunoafinidad con mAb anti-rsEPCR y cromatografía en columnas de afinidad con proteína C. Se realizaron dos preparaciones de maneras ligeramente diferentes.

En la primera preparación, el plasma (1 l) fue diluido con un volumen igual de Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, benzamidina 10 mM, 400 unidades de heparina sódica y adsorbido por lotes durante 1 hora con 1 g de resina QAE pre-hinchada. Después de sedimentar, la resina fue procesada para purificar proteína C (Esmon y col., 1993). Se añadió sulfato de amonio sólido al sobrenadante a 4ºC hasta un 40% de saturación, se centrifugó y se añadió sulfato de amonio adicional al sobrenadante hasta alcanzar un 70% de saturación. Después de centrifugar, la pella blanda fue colocada en bolsas de diálisis y dializada durante una noche frente a 12 l de Tris-HCl 20 mM, azida de sodio 0,02%, pH 7,4. El dializado fue aplicado a una columna de inmunoafinidad mAb 1496-AffiGel-10 (6 ml de resina; 5 mg de IgG/ml de resina) equilibrada en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, azida de sodio 0,02%, pH 7,4. La columna fue lavada con más de 12 ml del mismo tampón y eluida con etilén glicol al 50% (v/v) en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 (Jun Xu, observaciones no publicadas). Las fracciones de la elución correspondientes a los picos fueron agrupadas (DO_{280} total 0,37), concentradas (Centripep 30, Millipore) y se cambió el tampón a Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 0,6 mM, azida de sodio 0,02%, pH 7,4. Este material fue aplicado a una columna de afinidad de proteína C que había sido preparada previamente aplicando la proteína C purificada (3 mg) a una columna de HPC4-AffiGel-10 (5 mg de IgG/ml de resina; 0,9 x 8 cm) en el mismo tampón. El mAb HPC4 se une a la región de activación de la proteína C de manera dependiente de calcio (Esmon y col., 1993; Stearns y col., 1988) y no interfiere con la unión posterior del EPCR a la proteína C. Después de aplicar la muestra conteniendo EPCR plasmático, la columna fue lavada con 12 ml aproximadamente de tampón y eluida con Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 5 mM, MOPS 10 mM, azida de sodio 0,02%, pH 7,5. Las fracciones fueron monitorizadas para determinar su absorbancia a 260 nm y para determinar el antígeno EPCR utilizando el ELISA anteriormente descrito. El eluato que contenía proteína C y EPCR plasmático fue aplicado a una columna Mono Q de FPLC (Pharmacia-LKB, Uppsala, Suecia) y la columna fue procesada con un gradiente lineal de NaCl 0,1-1 M en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. La mitad aproximadamente del EPCR plasmático no se unía a la columna Mono Q, la mitad eluía a NaCl 0,2 M aproximadamente y la proteína C eluía a NaCl 0,5 M aproximadamente. Ambas especies iónicas de EPCR plasmático aparecían idénticas en los geles de SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras con tinción de plata, con tinción BB de Coomassie o con tinción de oro (Pierce) después de la transferencia a membranas de PVDF y en las transferencias Western con la sonda de anticuerpo policlonal anti-rsEPCR-biotina.

La segunda preparación de EPCR plasmático fue realizada partiendo de 4 l de plasma con el fin de purificar suficiente proteína para los estudios funcionales. En este caso, la resina 1496-AffiGel-10 (20 ml de 5 mg de IgG/ml de resina) fue añadida directamente al plasma citratado, junto con concentraciones finales de 10 mM de benzamidina, 1 mM de fluorofosfato de diisopropilo y 0,5 unidades/ml de heparina sódica. El plasma fue adsorbido por lotes durante una noche a 4ºC con mezclado suave. Una vez que sedimentó la resina, el sobrenadante fue procesado para purificar la proteína C (Esmon y col., 1993). La resina fue empaquetada en una columna de 2,5 x 30 cm, lavada extensamente con Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, azida de sodio 0,02%, pH 7,4 y eluida con etilén glicol al 50% en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4. El eluato fue agrupado y concentrado (DO_{280} total 5,5), aplicado a una columna Mono Q y las dos especies iónicas (el avance y el pico de eluato a NaCl 0,2 M) fueron aplicadas de nuevo a la resina de 1496-AffiGel-10 (1,5 x 11 cm). La columna fue eluida con etilén glicol al 50% igual que anteriormente. El eluato (DOs 0,71) fue concentrado y el tampón cambiado a Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 0,6 mM, azida de sodio 0,02% con Centriprep 30. Este material fue luego aplicado a una columna de afinidad en la que se había aplicado inicialmente proteína C (2,9 mg) en el mismo tampón a una columna de HPC2-AffiGel-10 (0,6 x 17 cm). El mAb HPC2 se une al dominio proteasa de serina de la proteína C y no interfiere con la unión del EPCR (Fukudome y col., 1996). El EPCR unido fue eluido con tampón que contenía EDTA 5 mM. El amiloide P sérico contaminante (procedente de la muestra de proteína C) fue eliminado mediante cromatografía de intercambio iónico en la columna Mono Q de FPLC. La muestra fue aplicada en NaCl 0,2 M, de tal manera que el EPCR plasmático no se unía, y fue separada de los contaminantes que eluían a NaCl 0,4-0,5 M. El EPCR plasmático purificado resultante (DO_{280} 0,193) aparecía homogéneo por SDS-PAGE con tinción con plata y por transferencia Western con anti-rsEPCR policlonal. Este material fue utilizado para los estudios funcionales y para el análisis de la secuencia aminoterminal.

Secuenciación de la proteína

El análisis de la secuencia aminoterminal del EPCR plasmático soluble fue realizado en el laboratorio del Dr. Kenneth Jackson en la Molecular Biology Research Facility, W.K. Warren Medical Research Institute, Oklahoma City. Los aminoácidos están designados por el código estándar de una letra.

Resultados

Como una primera aproximación, muestras de plasma y suero de tres voluntarios sanos fueron diluidas (4% v/v), procesadas en geles de SDS-PAGE al 10% bajo condiciones no reductoras y procesadas para transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal de cabra producido contra el rsEPCR. Muestras de plasma y suero (4% v/v) procedentes de voluntarios sanos fueron procesadas para SDS-PAGE en geles al 10% bajo condiciones no reductoras, transferidas a membranas y las membranas sondadas con anticuerpo policlonal anti-rsEPCR de cabra. Los resultados fueron comparados con rsEPCR (0,2 ng). El anticuerpo unido fue detectado con anti-IgG de cabra producido en ratón y un sistema de detección de quimioluminiscencia intensificada. Las muestras de plasma de dos voluntarios sanos fueron inmunoadsorbidas con una resina de 1495-AffiGel-10. La resina lavada fue eluida y procesada para SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Se realizó una transferencia Western utilizando como sonda anti-rsEPCR de cabra-biotina.

La pureza del EPCR plasmático fue determinada a partir de geles al 10% de SDS-PAGE teñidos con plata y de transferencias Western de membranas sondadas con anti-rsEPCR de cabra-biotina (reducido y no reducido). Una única banda de 43.000 Da aproximadamente aparece en las muestras de suero y plasma después de que la membrana haya sido sondada con el anticuerpo policlonal. El tamaño de la proteína detectada parece ligeramente mayor que el del rsEPCR. Las otras bandas detectadas eran la unión de fondo de la IgG según se estimó sondando con IgG preinmune y con tiempos de exposición mayores. La incubación durante una noche de las muestras de plasma con el mAb 1495 anti-EPCR acoplado a la resina AffiGel-10, seguido por lavado y elución del antígeno unido bajo condiciones reductoras, tuvo como resultado una única banda detectada por transferencia Western con el anticuerpo policlonal anti-rsEPCR de cabra-biotina.

La determinación del antígeno EPCR soluble en el plasma de voluntarios sanos por ELISA utilizando el mAb 1495 como anticuerpo de revestimiento, encontró niveles de antígeno de 91,1 +/- 24,5 ng/ml en mujeres (n=12) y de 107,2 +/- 30,2 ng/ml en hombres (n=10). Cuando se calcularon juntos, los niveles medios de antígeno EPCR plasmático fueron de 98,4 +/- 27,8 ng/ml. El valor de los hombres parecía ser ligeramente superior al de las mujeres, de manera similar al de la trombomodulina (Quehenberger y col., Thromb. Haemost. 76:729-734), aunque la población estudiada era demasiado limitada para un análisis estadístico y este estudio no estaba diseñado para determinar diferencias debidas al género, edad, dieta u otras variables.

Como parecía que el EPCR plasmático era una única especie a 100 ng/ml aproximadamente, era importante determinar si el EPCR circulante podía unirse a la proteína C y a la PCA. Se purificó EPCR soluble de plasma humano mediante una combinación de cromatografía de intercambio iónico, precipitación con sulfato de amonio e inmunoadsorción por cromatografía en una columna de mAb 1496 anti-EPCR-AffiGel-10 según se describió en Procedimientos Experimentales.

Este EPCR plasmático (110 \mug aproximadamente) fue aplicado a una columna de afinidad de proteína C preparada aplicando proteína C (3 mg) a una columna de mAb HPC4 anti- proteína C-AffiGel-10 en tampón conteniendo CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 0,6 mM. La columna fue lavada y el EPCR plasmático fue aplicado a la fracción 19. La columna fue lavada y eluida con tampón que contenía EDTA 5 mM comenzando en la fracción 35. Se determinó la absorbancia a 280 nm y el antígeno EPCR de las fracciones. El antígeno EPCR fue determinado mediante ELISA.

Más de un 98% del antígeno EPCR plasmático aplicado se unía a la columna de afinidad de proteína C. El perfil de absorbancia indica la coelución de EPCR y proteína C de la columna de anticuerpo, consistente con la dependencia de calcio de la unión de la proteína C a este anticuerpo (Stearns y col., 1988).

Con el fin de purificar proteína suficiente para los estudios funcionales y estructurales, se purificó EPCR a partir de 4 l de plasma utilizando un procedimiento similar, pero modificado ligeramente. Después de la elución de una columna de afinidad de proteína C-anticuerpo, las proteínas contaminantes residuales fueron eliminadas por cromatografía de intercambio iónico en una columna Mono Q de FPLC. La preparación resultante de EPCR plasmático aparecía homogénea en geles de SDS-PAGE al 10% con tinción de plata y se obtuvieron resultados idénticos con transferencias Western sondadas con anticuerpo policlonal anti-rsEPCR de cabra-biotina bajo condiciones reductoras y no reductoras. El análisis de la secuencia aminoterminal de la proteína purificada produjo solamente una secuencia, S-Q-D-A-S-D, que es idéntica a la secuencia aminoterminal del EPCR soluble recombinante (Secuencia ID Nº 2). Ésta es la primera determinación de la secuencia aminoterminal de EPCR procedente de una fuente natural.

La capacidad del EPCR plasmático para unirse a la PCA fue determinada mediante estudios de competición en los cuales se permitió competir al EPCR plasmático con EPCR celular por la PCA, y la PCA libre resultante que podía unirse al EPCR celular fue determinada por citometría de flujo (Figura 4a). PCA marcada con fluoresceína en el sitio activo (fl-PCA) fue incubada con células EA.hy926 en presencia o ausencia de EPCR plasmático o de rsEPCR. La dependencia de la concentración de EPCR para inhibir la unión de PCA a las células era similar para ambas formas solubles del EPCR. Esta observación indica que la afinidad del EPCR plasmático para unirse a la PCA es similar a la determinada previamente para la interacción de unión rsEPCR-PCA (Kd_{ap} 30 nM aproximadamente).

Aunque el rsEPCR tiene poco efecto sobre la activación de la proteína C en un sistema soluble (Regan y col., 1996), el EPCR unido a la membrana tiene una capacidad muy potente para facilitar la activación en la superficie celular (Stearns-Kurosawa y col., 1996). Los datos actuales que demuestran la existencia de una forma circulante de EPCR capaz de unirse a la proteína C y a la PCA, sugieren que el EPCR plasmático tiene potencial para alterar la activación de la proteína C en la superficie celular. La activación dependiente de trombina de un nivel aproximadamente fisiológico de proteína C (0,1 \muM) en células EA.hy926 fue inhibida por un exceso de rsEPCR casi hasta el nivel observado con el mAb 1494 anti-rsEPCR que bloquea la interacción de unión EPCR-proteína C, según está mostrado en la Figura 4b. Estudios previos han demostrado que el rsEPCR no tiene efecto sobre la actividad amidolítica de la PCA utilizando sustratos sintéticos pequeños (Regan y col., 1996). El EPCR plasmático era ligeramente más eficaz en su capacidad para inhibir la activación de la proteína C en la superficie celular de células EA.hy926 con relación al rsEPCR, según está mostrado en la Figura 4c.

En un ensayo de coagulación con factor Xa de una etapa, el EPCR plasmático purificado y el EPCR recombinante soluble inhibían la prolongación de los tiempos de coagulación inducida por PCA de manera similar (Figura 4d). La inhibición de la actividad anticoagulante de la PCA por rsEPCR había sido observada previamente (Regan y col., 1996). Según se esperaba, el mAb 1496 revertía este efecto bloqueando la interacción de unión PCA-EPCR plasmático.

Ejemplo 2 Detección de EPCR soluble en orina

Para responder a la pregunta de si está presente EPCR soluble en orina, se recogieron cuatro muestras de orina (primera emisión de la mañana) y se analizaron para determinar la presencia de EPCR soluble mediante transferencia Western y ELISA.

Muestras de orina pediátrica sin diluir fueron comparadas con un plasma normal al 4% y con EPCR soluble recombinante (1 ng). Las muestras fueron incubadas con anti-rsEPCR de cabra-biotina y un sistema de detección estreptavidina-fosfatasa alcalina.

La transferencia Western indica que (a) EPCR soluble está presente en orina y que (b) el antígeno EPCR soluble está presente en un nivel similar al observado en plasma. No se observa una degradación obvia.

La cantidad de EPCR soluble en las cuatro muestras, según se cuantificó por ELISA, fue de 40,3, 6,1, 35,6 y 90,1 ng/ml.

Ejemplo 3 Medida de EPCR Plasmático de pacientes con lupus

La concentración de EPCR plasmático en humanos normales es de 100 ng/ml aproximadamente (98,4 \pm 27,8 ng/ml; 2,5 nM), según se discutió anteriormente. Se analizó un panel de muestras de pacientes con lupus eritematoso (n = 54) y se encontró que los niveles de EPCR soluble variaban desde niveles no detectables hasta niveles mayores de 1.700 ng/ml. Quince pacientes tenían niveles de EPCR soluble mayores de 200 ng/ml.

Estudios previos han demostrado niveles de TM plasmática soluble elevados en pacientes con lupus debido al daño endotelial, y las presentes muestras de pacientes con lupus fueron analizadas para determinar TM plasmática como referencia. Se encontró que sus niveles de TM soluble no tenían absolutamente ninguna correlación con sus niveles de EPCR soluble, según está mostrado por la Figura 5. Ésta es una observación importante que sugiere que la fuente de EPCR plasmático soluble no procede simplemente de un endotelio dañado aleatoriamente. En contraste con la TM, la expresión de EPCR unido a la membrana en humanos y primates está restringida primariamente al endotelio de los vasos grandes, expresando los capilares poco EPCR. Se espera que la localización distintiva del EPCR aumente la activación de proteína C localmente para impedir la trombosis en los vasos grandes. La localización primaria del EPCR unido a la membrana en los vasos grandes, señala un riesgo trombótico dirigido en los vasos grandes que puede ser pronosticado por las concentraciones de EPCR plasmático soluble.

Ejemplo 4 EPCR soluble plasmático en pacientes con choque séptico

Se define sepsis (conferencia de consenso accp/sccm, Chest, 1992, 101:1644-1655) como la respuesta inflamatoria sistémica a una infección, incluyendo, pero no limitándose a, más de una de las manifestaciones clínicas siguientes:

1)

temperatura corporal mayor de 38ºC o menor de 36ºC;

2)

ritmo cardíaco mayor de 90 latidos por minuto;

3)

taquipnea manifestada por:

a) frecuencia respiratoria mayor de 20 respiraciones por minuto;

b) hiperventilación como de una PaCO_{2} menor de 32 mm Hg;

4)

recuento de glóbulos blancos sanguíneos mayor de 12.000/mm^{3} o menor de 4.000/mm^{3}, o la presencia de más de un 10% de neutrófilos inmaduros (bandas).

Las muestras fueron obtenidas de pacientes con complicaciones post-quirúrgicas con o sin sepsis grave, definidas por sepsis asociada con disfunción orgánica, hipofusión o hipotensión. Las anormalidades de perfusión pueden incluir acidosis láctica, oliguria o alteraciones agudas del estado mental. El choque séptico se refiere a sepsis con hipotensión que requiere fármacos vasoactivos durante más de 24 horas a pesar de la reanimación con los fluidos adecuados y la ausencia de choque cardiogénico.

Todos los pacientes incluidos en el estudio cumplían los criterios siguientes:

a)

admisión en la unidad de cuidados intensivos debido a sepsis y/o complicaciones post-quirúrgicas que requerían una ayuda respiratoria (ventilación controlada durante más de 24 horas) y/o hemodinámica (requerimiento de fármacos inotrópicos, dopamina o dobutamina a una dosis de más de, o igual a, 5 microgramos/kg/minuto y/o aminas vasoactivas, epinefrina o norepinefrina);

b)

edad entre 18 y 75 años;

c)

actividad antitrombina menor del 70% (analizada localmente).

Los pacientes eran excluidos si tenían politrauma, cirrosis hepática o insuficiencia hepática aguda, cáncer en fase terminal, inmunodeficiencia, leucemia, embarazo o terapia con heparina.

Se tomaron muestras de sangre de los pacientes a tiempo 0 (ingreso en la Unidad de Cuidados Intensivos, UCI) y a los dos días y a los seis días después del tratamiento con anti-trombina II (ATIII) o placebo. El EPCR soluble plasmático y la trombomodulina (TM) soluble fueron analizados solamente en las muestras de tiempo 0.

sEPCR:

normal: 133,4 \pm 53,4 ng/ml (media \pm DE)

sepsis: 224,9 \pm 74,5 ng/ml

Diferencia significativa entre las medias, P=0,00009

sTM:

normal: 35,5 \pm 20,4 ng/ml (media \pm DE)

sepsis: 39,9 \pm 73,1 ng/ml

Sin diferencia significativa entre las medias, P=0,81

No hay correlación entre los niveles en plasma de sEPCR y sTM, r^{2} = 0,34.

Estos resultados están mostrados gráficamente en la Figura 6. Igual que en los pacientes con lupus, los pacientes con sepsis muestran elevaciones muy significativas de los niveles de EPCR plasmático, no correlacionados con los niveles de TM soluble.

La observación de que el EPCR plasmático soluble inhibe la activación de la proteína C y la actividad anticoagulante de la proteína C activada, indica que los niveles elevados de EPCR plasmático en estos pacientes representa un riesgo trombótico adicional y señala la evidencia de una lesión/respuesta vascular. Ejemplos de condiciones que son indicativas incluyen trastornos asociados con la estimulación de células endoteliales, aterogénesis, adhesión de leucocitos y ruptura de la placa.

Ejemplo 5 Identificación de formas de EPCR ayustadas de manera alternativa en tejidos de babuino y humanos

Como una aproximación inicial para determinar si una isoforma de EPCR soluble podría ser generada por un mecanismo de ayuste alternativo, se aisló ARN de tejidos humanos y de babuino y se realizó una PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) con cebadores específicos de genes. Aunque no se conoce la secuencia genómica del EPCR de babuino, se utilizaron cebadores basados en la secuencia humana sobre la base del razonamiento de que los babuinos y los humanos están estrechamente relacionados en la escala evolutiva.

En el procedimiento de RT-PCR, el ARN total es generalmente aislado a partir de tejido homogeneizado. El ARN es mezclado con un cebador antisentido específico, nucleótidos y el enzima transcriptasa inversa. En la mezcla, el ARN sirve como molde para que la transcriptasa inversa cree una primera hebra de ADNc. Este nuevo molde de ADNc es luego amplificado mediante PCR convencional utilizando cebadores específicos y polimerasa Taq. Se eligieron cebadores que amplificarían la forma de membrana del EPCR (424 pb) y el producto ayustado alternativamente pronosticado (674 pb). Los productos correspondientes a ambas formas del EPCR fueron amplificados a partir de una variedad de tejidos de babuino (Figura 4) y de pulmón y placenta humanos. Era poco probable la posible contaminación con ADN genómico según se estimó por los controles sin transcriptasa inversa y la ausencia de una banda de 1.885 pb en las reacciones con los tejidos.

Para confirmar que la secuencia de ADN genómico de babuino tenía el límite exón-intrón apropiado y la secuencia de lectura en marco en el intrón para ayuste alternativo, la secuencia intrónica del ADN genómico de riñón de babuino fue amplificada por PCR convencional. Se asumió que la estructura genómica estaba conservada entre las especies y se utilizaron cebadores (secuencia humana) que flanqueaban el intrón III. Éste es el intrón (secuencia humana) que se cree que contiene la secuencia ayustada alternativamente. Se homogeneizó tejido de riñón de babuino y se extrajo el ADN. El ADN fue mezclado con los cebadores específicos y se amplificó un producto por PCR. El producto de ADN fue purificado y sometido a electroforesis en un gel de agarosa.

Detalles del procedimiento A. ELISA del EPCR

El anticuerpo de revestimiento es el mAb 1494 que se une al dominio de unión al ligando del EPCR. El anticuerpo de detección es el mAb 1495 biotinilado, que no bloquea la unión de la proteína C/PCA, y no reacciona de manera cruzada con el mAb 1494. El sistema de detección es estreptavidina-fosfatasa alcalina y el sustrato BluePhos (de KPL).

B. RT-PCR de los tejidos

Los tejidos (50-100 mg) fueron homogeneizados en Trizol (Gibco BRL). La fase superior que contenía ARN fue extraída con cloroformo, precipitada con isopropanol, lavada y solubilizada en DEPC-agua. El ARN (1-5 \mug) fue mezclado con nucleótidos, el cebador antisentido CREA y transcriptasa inversa en el tampón apropiado de acuerdo con las direcciones del fabricante (Sistema de Preamplificación Superscript™ para la síntesis de la primera hebra de ADNc, Gibco BRL). El producto ADNc fue amplificado mediante PCR convencional utilizando los cebadores CRES y CREA durante 30 ciclos. Los productos ADNc fueron purificados mediante extracción con cloroformo y precipitación con alcohol, solubilizados en agua y sometidos a electroforesis en un gel de agarosa al 2% utilizando procedimientos estándar. Los geles fueron teñidos con Verde Vistra (Amersham) y se tomaron imágenes en un ``Phosphoimager'' (escáner Storm™, Molecular Dynamics, Inc.).

C. PCR de ADN genómico de babuino

ADN de riñón de babuino (82 mg) fue homogeneizado en el reactivo Trizol. La fase inferior que contenía el ADN fue extraída, precipitada y solubilizada en agua estéril. El ADN fue amplificado por PCR convencional en una mezcla con tampón, nucleótidos y los cebadores HRT-1 y HRT-2 durante 30 ciclos. El ADN amplificado fue extraído, precipitado, solubilizado en agua estéril y sometido a electroforesis en un gel de agarosa al 2% utilizando procedimientos estándar. La única banda (465 pb) fue visualizada con bromuro de etidio, cortada y el producto de PCR purificado en una columna de centrifugación de acuerdo con las direcciones del fabricante (Qiagen). El producto de PCR fue secuenciado utilizando los mismos cebadores.

D. Secuencias de los cebadores

CRES: 5'-TCGTGCGCCTGGTGCACCAGGAGC-3'

(cebador sentido 5' cerca del extremo del exón II)

CREA: 5'-CGCCGTCCACCTGTGCACAGGAAG-3'

(cebador antisentido 3' en el exón IV)

HRT-1: 5'-AGCAGCTCAATGCCTACAACCG-3'

(cebador sentido 5' cerca del extremo del exón III)

HRT-2: 5'-CCGTAGAAGGACACGTGTCCACCTGCCGC-3'

(cebador antisentido 3' en el exón IV)

Resultados con los tejidos de babuino

Había una única banda amplificada procedente del ADN genómico de riñón que fue cortada del gel, purificada y secuenciada. La secuencia era un 92% idéntica a la secuencia humana y se conservaban los límites exón-intrón. El elevado nivel de similitud en esta secuencia intrónica es notable, ya que las secuencias intrónicas no están típicamente bien conservadas entre especies. Había también una secuencia de lectura en marco dentro del intrón que contenía un codon de parada, pronosticando una cola exclusiva carboxilo-terminal de 22 residuos en la proteína soluble ayustada alternativamente de babuino.

La observación de que las isoformas de EPCR soluble pronosticadas tendrán colas carboxilo-terminales exclusivas, proporciona una diferencia estructural para distinguir entre las isoformas utilizando anticuerpos específicos de isoforma. El modelo de trabajo es que los niveles plasmáticos de EPCR soluble proteolizado informarán de un daño endotelial, mientras que los niveles de EPCR soluble ayustado alternativamente informarán de una respuesta endotelial a estímulos. Se anticipa que los niveles plasmáticos relativos de las isoformas de EPCR soluble proporcionarán información sobre la disfunción y el daño endotelial de vasos grandes en patologías específicas.

Resultados con los tejidos humanos

Los productos de la RT-PCR de tejidos humanos: placenta, pulmón y lengua, fueron sometidos a electroforesis utilizando los cebadores CRES/CREA específicos para el EPCR. Los procedimientos fueron los mismos que los utilizados para los tejidos de babuino. Se observaron los productos correspondientes a la isoforma de membrana del EPCR (mEPCR) y a la isoforma de EPCR soluble (sEPCR) ayustada alternativamente. Los productos parecían esencialmente los mismos que los observados utilizando los tejidos de babuino. La única diferencia es que el tejido placentario parece tener productos adicionales.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES: Oklahoma Medical Research Foundation

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ENSAYOS DE DIAGNÓSTICO QUE UTILIZAN EL RECEPTOR SOLUBLE DE PROTEÍNA C/PROTEÍNA C ACTIVADA DE CÉLULAS ENDOTELIALES.

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Patrea L. Pabst

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(B)

CALLE: 2800 One Atlantic Center

1201 West Peachtree Street

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(C)

CIUDAD: Atlanta

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(D)

ESTADO: Georgia

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

ZIP: 30309-3450

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Pabst, Patrea L.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.284

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: OMRF168

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(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: (404) 873-8794

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(B)

TELEFAX: (404) 873-8795

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1302 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iv)

ANTISENTIDO: NO

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: características_varias

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1302

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(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los nucleótidos 25 a 738 codifican el Receptor de Proteína de Células Endoteliales de la Secuencia ID Nº 2.''

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 238 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: características_varias

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..365

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Receptor de Proteína de Células Endoteliales codificado por los nucleótidos 1 a 1302 de la Secuencia ID Nº 1.''

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..15

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los aminoácidos 1-15 representan una supuesta secuencia señal.''

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Dominio

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 211..236

\vskip0.333000\baselineskip

(D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los aminoácidos 211-236 representan un supuesto dominio transmembranal.''

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio activo

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 47..174

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los aminoácidos 47-49, 64-66, 136-138 y 172-174 representan sitios potenciales de N-glicosilación.''

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio activo

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: Cys 17

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= precede inmediatamente al sitio de corte del aminoácido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio activo

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: Gly 201

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= insertos peptídicos en el EPCR ayustado alternativamente

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 17..186

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Los aminoácidos 17, 114, 118 y 186 representan residuos de cisteína extracelulares.''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

2

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 148 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: características_varias

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..24

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cebador sentido 5' próximo al extremo del exón II.''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCGTGCGCCT GGTGCACCAG GAGC

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: características_varias

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..24

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cebador antisentido 3' en el exón IV.''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGCCGTCCAC CTGTGCACAG GAAG

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: características_varias

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..22

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cebador sentido 5' próximo al extremo del exón III.''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGCAGCTCAA TGCCTACAAC CG

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: características_varias

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..29

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= ``Cebador antisentido 3' en el exón IV.''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCGTAGAAGG ACACGTGTCC ACCTGCCGC

\hfill

29

Claims (15)

1. Un ensayo para determinar el receptor endotelial soluble de la proteína C que comprende la medida de la cantidad de receptor endotelial soluble de la proteína C en una muestra obtenida de un paciente a analizar.

2. El ensayo de la reivindicación 1 en el que la muestra es seleccionada del grupo que consta de orina, plasma, suero, muestras de tejido y fluido intersticial.

3. El ensayo de la reivindicación 1 que comprende además la etapa de correlacionar la cantidad de receptor de proteína C endotelial soluble con estándares de calibración.

4. El ensayo de la reivindicación 1, en el que el paciente tiene un trastorno o enfermedad seleccionados del grupo que consta de estados y trastornos de coagulación e inflamatorios, trastornos o enfermedades que implican un daño al endotelio y una enfermedad de los vasos sanguíneos grandes.

5. El ensayo de la reivindicación 4, en el que el trastorno o enfermedad es seleccionado del grupo que consta de enfermedades autoinmunes, trasplantes, sepsis, choque, pre-eclampsia, diabetes, enfermedad vascular, enfermedad renal y enfermedad hepática.

6. El ensayo de la reivindicación 5, en el que la enfermedad vascular es seleccionada del grupo que consta de ``by-pass'' cardiopulmonar, angina inestable, restenosis y angioplastia.

7. El ensayo de la reivindicación 1 para detectar un daño en los vasos sanguíneos grandes.

8. Un kit para la detección y medida del receptor endotelial de la proteína C que contiene

un anticuerpo inmunorreactivo con el receptor endotelial de la proteína C,

reactivos para detectar una reacción entre el anticuerpo y el receptor endotelial de la proteína C en una muestra de un paciente y

estándares para correlacionar el nivel de reacción con niveles normales y anormales de receptor endotelial de la proteína C.

9. El kit de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo tiene mayor afinidad por el receptor endotelial de la proteína C que incluye el dominio transmembranal que por el receptor endotelial de la proteína C que no incluye el dominio transmembranal.

10. El kit de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo es inmunorreactivo con el inserto de un receptor endotelial de la proteína C ayustado alternativamente.

11. El kit de la reivindicación 8, en el que los anticuerpos bloquean la unión del receptor endotelial de la proteína C y la proteína C activada o la proteína C.

12. Un receptor endotelial de la proteína C modificado que se une a la proteína C, en el cual el residuo de cisteína carboxilo-terminal está sustituido por otro aminoácido o no está palmitoilado.

13. Un receptor endotelial de la proteína C modificado que se une a la proteína C, que no está glicosilado.

14. Un receptor endotelial de la proteína C que no incluye un dominio transmembranal codificado por un ácido nucleico ayustado alternativamente que codifica el receptor endotelial de la proteína C.

15. Un receptor endotelial soluble de la proteína C aislado que existe de forma natural.