JP3553616B2 - 可溶性内皮細胞プロテインｃ／活性化プロテインｃレセプターを使用する診断アッセイ - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、一般に、内皮細胞プロテインC/活性化プロテインＣレセプターまたはタンパク質分解もしくは選択的スプライシングのいずれかによって誘導されるその可溶性形態の検出および／または測定を含むアッセイの領域にある。
合衆国政府は、Charles T.Esmonに対する国立衛生研究所助成金PO1HL 54804により、本発明に一定の権利を有する。
プロテインＣのその活性セリンプロテアーゼに対する活性化、活性化プロテインＣ（APC）は、血液凝固の調節に重要な役割を果たす一連の事象を開始する。プロテインＣ経路の臨床的重要性は、血栓症を生じる、この経路における多くの機能不全によって示される（EsmonおよびSchwarz,1995,Trends Cardiovasc.Med.5:141−148;Reitsmaら,1995,Thromb.Haemost.73:876−879）。プロテインＣが欠損した患者は、通常、幼児期に生命を危うくする血栓症合併症を示す（Seligsohnら,1984,N.Engl.J.Med.310,559−562;Esmon,1992,Trends Cardiovasc.Med.2,214−220）。これは、プロテインＣ投与によって補正される（Dreyfusら,1991,N.Engl.J.Med.325,1565−1568）。
プロテインＣおよびAPCはまた、炎症に対する宿主応答の調節に関連している。活性化プロテインＣ（APC）は、グラム陰性敗血症のヒヒモデルにおいてE.coliの致死的効果を予防し得（Taylorら,1987,J.Clin.Invest.79;TaylorおよびEsmonに対する米国特許第5,009,889号）、そして予備的な臨床結果は、プロテインＣが、ヒト敗血症ショックのある形態を処置することに効果的であることを示唆する（Gersonら,1993,Pediatrics 91,418−422）。プロテインＣ経路の重要な成分であるプロテインＳの阻害は、E.coliの致死量未満のレベルに対する霊長類の応答を悪化させ、そして循環中へのTNFの出現を増大する（Taylorら,1991,Blood 78,357−363）。これらの結果は、プロテインＣが、凝固の制御および炎症への影響の両方をなし得ることを示唆する。
プロテインＣは、凝固系の最終酵素であるトロンビンが、内皮細胞表面タンパク質であるトロンボモジュリンに結合する場合に、活性化される（Esmon,1989,J.Biol.Chem.264,4743−4746;DittmanおよびMajerus,1990,Blood 75,329−336;Dittman,1991,Trends Cardiovasc.Med.1,331−336）。細胞培養において、トロンボモジュリン転写は、腫瘍壊死因子（TNF）への内皮細胞の曝露によってブロックされ（ConwayおよびRosenberg,1988,Mol.Cell.Biol.8,5588−5592）、そしてトロンボモジュリン活性および抗原は、その後インターナライズされそして分解される（Lentzら,1991,Blood 77,543−550、Mooreら,1989,Blood 73,159−165）。補体系の調節タンパク質であるC4bBPは、プロテインＳと結合して、インビトロ（Dahlback,1986,J.Biol.Chem.261,12022−12027）およびインビボ（Taylorら,1991）でAPC抗凝固活性を支持することを機能的に不活性である複合体を形成する。C4bBPは、急性期反応物質として行動する（Dahlback,1991,Thromb.Haemostas.66,49−61）。したがって、この経路のタンパク質は、炎症を調節するようにみえるだけでなく、これらは炎症を調節する成分と相互作用し、そしてこれら自体は、炎症メディエータによってダウンレギュレーションを受ける。
内皮細胞は、効率的なプロテインＣ活性化を担う公知の２つのレセプター、トロンボモジュリンおよび内皮プロテインC/APCレセプター（EPCR）を発現する点で、プロテインＣ経路において重要な役割を果たす（FukudomeおよびEsmon,1994,J.Biol.Chem.269:26486−26491;Stearns−Kurosawaら,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）93:10212−10216）。トロンボモジュリン（CD141）は、高親和性を有する循環トロンビンと結合する膜貫通補因子であり、そして得られる酵素−補因子複合体は、生理学的に関連するプロテインＣ活性化速度に必要とされる（EsmonおよびOwen,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）78:2249−2252;Dittman,W.A.1991,Trends Cardiovasc.Med.1:331−336）。
EPCRは、CD1/MHCクラス１ファミリーとの著しい相同性を有する最近同定されたレセプターである（FukudomeおよびEsmon,1994;Fukudomeら、1996,J.Biol.Chem.271:17491−17498;Reganら,1996,J.Biol.Chem.271:17499−17503）。プロテインＣに対する内皮細胞レセプターのクローニングおよび生物学的役割は、Oklahoma Medical Research Foundationによって「Cloning and Regulation of an Endothelial Cell Protein C/Activated Protein Ｃ Receptor」と題するPCT/US95/09636に記載された。このタンパク質は、238アミノ酸からなると予測され、このアミノ酸は、Ｎ末端に15アミノ酸のシグナル配列、およびタイプ１膜貫通タンパク質としてこのレセプターを特徴づける23アミノ酸の膜貫通領域を含む。
EPCRは、カルシウムの存在下で類似の親和性（Kdapp約30nM）でプロテインＣおよびAPCの両方と結合し（Fukudomeら,1996）、そして細胞表面上で、トロンビン−トロンボモジュリン活性化複合体に対してプロテインＣ基質を提示することにより、プロテインＣ活性化を容易にする（Stearns−Kurosawaら,1996）。内皮細胞レセプターは両方とも、タイプ１膜貫通タンパク質であり、ここでリガンドは、細胞外ドメインに結合し、そして両方とも、短い細胞内細胞質テイルを有する（Fukudomeら,1996;Jackmanら,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）84:6425−6429;Wenら,1987,Biochemistory 26:4350−4357;Suzukiら,1987,EMBO J.6:1891−1897）。さらに、それらのインビトロ細胞表面発現は、腫瘍壊死因子−αによって同様にダウンレギュレートされる（FukudomeおよびEsmon 1994）。しかし、トロンボモジュリンおよびEPCRの可溶性形態の特徴は、いくつかの点で異なる。組換え可溶性トロンボモジュリンは、膜形態に対して減少した補因子活性を有する（Galvinら,1987,J.Biol.Chem.262:2199−2205;Parkinsonら,1990,J.Biol.Chem.265:12602−12610）。精製した成分および細胞の両方で、トロンボモジュリンによって特異的に誘導されるトロンビンの基質の変化は、トロンビンにおける共有される結合ドメインについての競合、ならびに活性部位ポケットにおけるコンホメーション変化から生ずる（Yeら,1991,J.Biol.Chem.266:23016−23021;Luら,1989,J.Biol.Chem.264:12956−12962;Yeら,1992,J.Biol.Chem.267:11023−11028;Hofsteengeら,1986,Biochem.J.237:243−251;Mathews,1994,Biochemistry 33:13547−13552;Esmonら,1982,J.Biol.Chem.257:7944−7947;Sedlerら,1993,Haemostasis 23:183−193）。可溶性トロンボモジュリンもまた、種々のインヒビターによるトロンビンの不活化を加速する（BourinおよびLindahl,1993,Biochem.J.289:313−330;Rezaie,1995,J.Biol.Chem.270;25336−25339）。血漿および尿の両方が、検出可能なトロンボモジュリンを含み（Takanoら,1990,Blood,76:2024−2029;IshiiおよびMajerus,1985,J.Clin.Invest.76:2178−2181）、そしてトロンボモジュリン遺伝子がイントロンを含まないので（Jackmanら,1987）、これらの可溶性形態は、細胞表面での細胞外ドメインのタンパク質分解による。
血漿中のトロンボモジュリンの可溶性分解産物は、種々の疾患状態での内皮細胞損傷の公知のマーカーであり（Takanoら,1990;Tanakaら,1991,Clin.Chem.37:269−272;Takahashiら,1991,Am.J.Hematol.38:174−177;Asakuraら,1991,Am.J.Hematol.38:281−287;Wadaら,1992,Am.J.Hematol.39:20−24;Takahashiら,1992,Am.J.Hematol.41:32−39;Ohdamaら,1994,Chest 106:666−671）、そして種々の減少した親和性を有するトロンビン結合フラグメント、ならびに非結合フラグメントの混合物から構成される（Takanoら,1990）。
対照的に、膜貫通ドメインの直前で短縮された組換え可溶性EPCR（rsEPCR）は、インタクトな細胞表面発現EPCRについて観察される親和性と同様な親和性でプロテインＣおよびAPCの両方と結合する（Fukudomeら,1996）。おそらくrsEPCRおよび第V a因子の両方が、トロンボモジュリンによって占有されるトロンビン中のアニオン結合外部位（exosite）を暗示する溝に結合決定基を共有するので（Matherら,1996,EMBO J.15:6822−6831）、APC抗凝固活性は、rsEPCRと結合した場合、効果的に阻害される（Reganら,1996）。しかし、rsEPCRは、APCによる小さい合成基質のタンパク質分解にも、α１−アンチトリプシンまたはプロテインＣインヒビターによるAPCの不活化にも影響を及ぼさないようである（Reganら,1996）。プロテインＣ活性化を増強する膜結合EPCR（Stearns−Kurosawら,1996）とは異なり、rsEPCRは、可溶性トロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化に対してほとんど効果を有さない（Reganら,1996）。このことは、EPCRの任意の可溶性形態が、プロテインＣについて膜結合EPCRと競合することによってプロテインＣ活性化を阻害し得ることを示唆する。
免疫組織化学は、EPCRが、主として大きな血管に由来する内皮細胞の表面上に存在し、そしてほとんどの毛細血管内皮細胞上にはないか、または低レベルでしか存在しないことを示す。
したがって、本発明の目的は、天然に存在する可溶性EPCRについて治療的および診断的使用を同定することである。
本発明のさらなる目的は、天然に存在する可溶性EPCRを特徴づけることである。
発明の要旨
血漿EPCRは、単離され、特徴づけられ、そして細胞性プロテインＣ活性化およびAPC抗凝固活性をブロックすることが示されている。血漿EPCRは、約43,000ダルトンであるようであり、そして約100ng/mlで循環する（98.4±27.8ng/ml、ｎ＝22）。血漿EPCRを、イオン交換、イムノアフィニティー、およびプロテインＣアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトのクエン酸処理血漿から精製した。フローサイトメトリー実験は、血漿EPCRが、膜貫通および細胞質ドメインを含まないEPCRとして定義される組換え短縮型EPCRから予め決定された親和性（Kdapp約30nM）と同様の親和性で、活性化プロテインＣと結合することを示した。さらに、血漿EPCRは、内皮細胞株におけるプロテインＣ活性化および１段階第X a因子凝血アッセイにおけるAPC抗凝固活性の両方を阻害した。可溶性EPCRはまた、ヒト尿において検出されている。EPCRをコードする遺伝子のクローニングは、少なくともヒトEPCRが選択的にスプライスされ得、選択的にスプライスされた形態（sEPCR）に特有のインサートを含む短縮型可溶性EPCRを生じることを示す。これらの結果は、血漿EPCRが、細胞表面でのタンパク質分解または選択的スプライシングのいずれかによって誘導され得ることを示す。
血漿EPCRの局所濃度が、特に疾患状態において、十分に高い場合、そのデータは、短縮型可溶性血漿EPCRが、プロテインＣ活性化の膜結合EPCR増大および活性化プロテインＣの抗凝固機能を減弱させ得ることを示す。自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、SLE）および敗血症（炎症および凝固異常の両方を含む障害）の患者からのEPCRのレベルと正常EPCRを比較する実施例によって示されるように、可溶性EPCRのレベルは、炎症および異常凝固に関連する疾患状態と相関するようである。凝固、炎症、および大血管疾患を含む疾患状態を示す、可溶性EPCRの測定に基づくアッセイが記載される。単離精製された可溶性EPCR、組換え短縮型可溶性EPCR、および可溶性EPCRに対する抗体を含む、アッセイ試薬が記載される。
【図面の簡単な説明】
図１は、膜結合レセプターをタンパク質分解して細胞外ドメインを遊離しそして膜アンカーを残すこと、およびmRNAの選択的スプライシングによって、EPCRに適用されるような可溶性レセプターを産生するための２つの既知のメカニズムの概略図であり、膜結合EPCR（mEPCR）およびタンパク質分解血漿EPCR（pEPCR）に特有の配列、ならびに可溶性EPCR（sEPCR）に特有の配列を示す。
図２は、mEPCRおよびsEPCRを比較する概略図であり、ヌクレオチドインサートおよびsEPCRに特有のコードされたアミノ酸配列を示す。
図３は、選択的スプライシングによってヒト、ウシ、マウス、およびヒヒのEPCRに挿入された配列を示す。
図4aは、可溶性血漿EPCRがヒトプロテインＣおよびAPCに結合することを示すグラフである。EA.hy926細胞を、氷上で30分間０〜500nMrsEPCR（●）または血漿EPCR（○）の存在下で、60nM fl−APCと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、そして細胞結合した蛍光を、記載のようにフローサイトメトリーによって決定した。fl−APCを添加しない場合での固有の細胞蛍光を、矢印で示す。プロットした平均細胞蛍光（MCF）は、２連のMCF測定の平均を表す。
図4bおよび4cは、可溶性血漿EPCRおよびrsEPCRが、細胞表面上でプロテインＣ活性化を阻害することを示すグラフである。図4bでは、EA.hy926細胞単層を、0.1μＭプロテインＣ単独（□）、または１μＭ rsEPCR（●）、または２μg/ml 1494mAb（○）と共に、室温にて15分間プレインキュベートした。プロテインＣ活性化を、トロンビン（2nM最終）の添加によって開始し、そして反応を、所定の時間で停止した。活性化プロテインＣを、アミド分解アッセイで決定し、そして活性速度をmOD/分で各時点についてプロットした。トロンビンを添加しないコントロールウェルを含ませた（■）。各データ点は、３連のウェル測定の平均を表す。図4cでは、EA.hy926細胞単層を、0.1μＭのプロテインＣおよび示された濃度の血漿EPCR（○）またはrsEPCR（●）と共に、室温にて15分間プレインキュベートした。トロンビン（最終2nM）を添加し、そして活性化を室温にて60分間行った。上清を、アンチトロンビンおよびヘパリンの混合物に添加し、そして活性化プロテインＣ活性（mOD/分）を、アミド分解アッセイで決定した。各データ点は、３連のウェル測定の平均を表す。
図4dは、可溶性血漿EPCRがAPC抗凝固活性を阻害することを示すグラフである。APC（25nM）の抗凝固活性を、460nMの血漿EPCRまたはrsEPCRの存在下で、１段階X a凝血アッセイを用いて決定した。この効果は、いずれかの可溶性EPCRを、EPCRへのAPCの結合をブロックする、42μg/mlの1496mAbと共に、５分間プレインキュベートした場合には逆転した。データは、４〜６測定の平均±S.D.を表す。
図５は、狼瘡患者において、可溶性血漿TMのレベルを可溶性血漿PCRと比較するグラフであり、TM値とEPCR値との間に相関はないが、狼瘡患者の大多数が、可溶性血漿EPCRの非常に上昇したレベルを示すことを証明する。
図６は、sTM（正常）、sTM（敗血症）、sEPCR（正常）、およびsEPCR（敗血症）についての可溶性レセプター濃度（ng/ml）のグラフである。sTMとsEPCRとの間に相関はない（r2＝0.034）。
発明の詳細な説明
定義
内皮プロテインＣレセプター、EPCR。
可溶性、溶液中にあり、そして細胞表面に結合していない。
短縮型、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含まない；タンパク質分解または選択的スプライシングのいずれかの結果であり得る。
可溶性EPCRの検出および特徴付け；生理学的役割およびマーカーとしての有用性
EPCRの機能のこれまでの研究は、膜形態のEPCRに結合するプロテインＣが、細胞表面上のトロンビン−トロンボモジュリン複合体によりプロテインＣ活性化の促進を生じる（Stearns−Kurosawaら,1996）が、可溶性組換えEPCRはAPC抗凝固活性を阻害する（Reganら,1996）ことを見出した。これらの観察は、血漿中の可溶性トロンボモジュリン分解産物が、種々の疾患状態における内皮損傷のマーカーであるという知識と共に、可溶性循環形態のEPCRが存在するかどうか、そして存在するのであれば、プロテインＣ経路においてどういう役割を有するかという疑問に至った。
実施例は、可溶性形態のEPCRが血漿中で循環し、そして尿中に存在することを示す。健常ドナー集団において、血漿EPCRレベルは、約100ng/mlであり、そして約43,000ダルトンの単一抗原種であるようであった。血漿からの可溶性EPCRのその後の精製および機能的研究は、血漿EPCRが、インタクトな膜結合EPCRと同様な親和性で、プロテインＣおよびAPCの両方と結合し得ることを決定した。内皮細胞株を使用するインビトロ研究は、血漿EPCRが、生理学的濃度に近い濃度のプロテインＣおよびトロンビンで、プロテインＣを阻害することを示した。さらに、血漿への精製血漿EPCRの直接添加は、rsEPCRに対するモノクローナル抗体で逆転されるAPC抗凝固活性の阻害を生じた。
この精製血漿タンパク質のEPCRとの同定は、rsEPCRの特性との比較に基づいた。これらのタンパク質は両方とも、同じ群のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と反応し、同じアミノ末端配列を有し、Ca2+依存的様式で固定されたプロテインＣに結合し、そして類似の用量応答曲線でプロテインＣ活性化およびAPC抗凝固活性をブロックした。さらに、rsEPCRおよび血漿EPCRに対するプロテインＣおよびAPCの親和性は共に、インタクトな膜結合EPCRの親和性に類似する。これらの特性は、EPCRに特有であるようである。
これまでの研究は、内皮細胞で発現した膜結合EPCRが、３〜５倍の間のファクターでプロテインＣ活性化を増大することを示したが、実施例は、血漿から精製された可溶性形態のEPCRが、内皮細胞でのプロテインＣ活性化およびAPC抗凝固活性を阻害することを示す。これは、EPCRが、いくつかの方法で、プロテインＣ経路を調節し得ることを予測する。第１に、より大きな血管（ここでは、トロンボモジュリン濃度が微小循環に対して低い）において、EPCR発現は、応答して増加する（Laszikら、Circulation 1997）。免疫組織化学は、ほとんどの器官において、EPCR発現は、大血管で最も高密度であり、そして血管サイズが減少するにつれて次第に減少し、最も豊富な内皮細胞タイプである毛細管内皮ではほとんどまたは全く発現しない。EPCR発現は、循環からプロテインＣ基質を捕獲し、そして活性化のためにトロンビン−トロンボモジュリン複合体に提示することにおいて、重要な役割を果たし得る。このことは、EA.hy926内皮細胞株およびヒト臍静脈内皮細胞の両方ともが、トロンボモジュリンより、少なくとも６倍多い表面発現EPCR抗原を有するというインビトロ観察によって支持される。トロンボモジュリン濃度が高くそしてEPCRが低い微小循環では、プロテインＣ活性化にほとんど影響がないと予測される。最後に、循環可溶性EPCRは、APCの生成およびAPCが第V a因子を不活化する能力を減少させ得る。
健常個体において、可溶性EPCRレベルは、約2.5nMであり、この濃度は、Kdapp（約30nM）および循環における80nMのプロテインＣ濃度の両方よりも十分に低い。可溶性血漿EPCRの効果（APC抗凝固活性およびプロテインＣ活性化の阻害）の両方ともが、正常血漿に存在する濃度よりかなり高い濃度を必要とする。このことが、血漿EPCRの生理学的役割の疑問を、不確定のままにしている。40nMを越える可溶性EPCRレベルを有する患者が、実施例３（狼瘡）に記載のように同定された。したがって、内皮細胞表面に近い局所濃度が、全身濃度を超えるならば、可溶性EPCR濃度は、APCの生成および活性の両方を減弱するレベルに達し、血栓症の危険性に寄与する。
可溶性形態のレセプターは、膜結合レセプターのタンパク質分解的切断、または選択的スプライシングメカニズムによって産生され得る。膜表面でのタンパク質分解は、可溶性トロンボモジュリン、ならびにTNF、IL−１、IL−２、Ｍ−CSF、PDGF、およびNGFのレセプターを遊離する（Heaneyら,1996,Blood 87:847−857）。可溶性レセプターは、膜レセプターのアンタゴニストとして使用すること、リガンドを安定化すること、リガンドを媒介されたシグナリングを開始すること、膜形態のダウンモジュレーション、およびレセプターインヒビターへ結合してレセプター−リガンド活性を間接的に容易にすることを含む、多くの可能性のある機能を有する。後者のメカニズムは、両方のIL−１レセプターの可溶性イソ形態が、タンパク質分解的切断によって生成され、そしてIL−１αおよびIL−１βへの応答性を厳格に調節する、IL−１レセプター系によって使用される（Arendら,1994,J.Immunol.153:4766−4774）。以下に議論するように、膜貫通ドメインの直前で短縮された可溶性タンパク質をコードするEPCRゲノム構造は、選択的スプライシング部位を含む（FukudomeおよびEsmon,1995,J.Biol.Chem.270:5571−5577）。可溶性IL−６レセプターは、タンパク質分解メカニズムおよび選択的スプライシングメカニズムの両方によって生成されるようである（Mullbergら,1994,J.Immunol.152:4958−4968;Lustら,1992,Cytokine 4:96−100;Horiuchiら,1994,Eur.J.Immunol.24:1945−1948）。この切断部位はまた、MorrisseyおよびEsmonへの米国特許第5,298,599号（その教示は本明細書に援用される）に記載のように、短縮型EPCR、続いて直ぐペプチド配列（抗体はこの配列に対して特異的に指向する）をコードする発現ベクターを構築することによって、大量の可溶性EPCRを回収することにおいて有用であり得る。次いで、エピトープは、患者への投与の前または後に、タンパク質分解によって切断される。Hoppらへの米国特許第4,782,137号もまた参照。
免疫組織化学研究は、EPCRが、主として大血管の内皮に位置し、そして毛細血管ではかろうじて検出可能であることを示した。したがって、膜結合EPCRに由来する血漿EPCRは、大血管疾患プロセスのマーカーとして用い得る。血漿EPCRは、血漿トロンボモジュリンレベルとの有用な比較として用い得る。血漿トロンボモジュリンレベルは、種々の疾患状態において調整されることが示されているが、大血管および小血管の両方の疾患プロセスを反映し、ほとんどの内皮が微小血管性であるのでおそらく小血管の寄与に支配される。
EPCRのヌクレオチドおよび予測タンパク質構造分析
EPCRのcDNAは、238アミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコードすると予測され、これは、Ｎ末端に15アミノ酸のシグナル配列を含む（vonHeijne,（1986）Nucleic Acids Res.14,4683−4690）。したがって、成熟タンパク質は、223アミノ酸を含むと予測される。組換えタンパク質の直接配列決定は、成熟タンパク質がSer18で始まることを示した。配列番号２は、EPCRの予測アミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸１〜15（MLTTLLPILLLSGWA）は、von Heijne（von Heijne,1986）の方法によって決定される推定シグナル配列である。配列番号２のアミノ酸211〜236（LVLGVLVGGFIIAGVAVGIFLCTGGR）は、推定膜貫通ドメインである。可能性のあるＮ−グリコシル化部位は、配列番号２のアミノ酸47〜49、64〜66、136〜138、および172〜174に存在する。細胞外システイン残基は、配列番号２のアミノ酸17（血漿EPCRでは除去されている）、114、118、および186に存在する。23アミノ酸からなる可能性のある膜貫通領域（Engelmanら，（1986）Annu.Rev.Biophys.Chem.15,321−53）を、Ｃ末端で同定した（配列番号２のアミノ酸211で始まる）。
このタンパク質はタイプ１膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインは、４つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位および３つのCys残基を含む。グリコシル化は、Ｎ−グリカナーゼ消化によって示されるように、活性に必須ではない。細胞質領域は、３アミノ酸のみを含み、そしてCysで終結し、パルミトイル化されている。末端システインが適切にパルミトイル化されてない場合、タンパク質は分泌され得る。EPCRの配列を変化させて、このシステインを別のアミノ酸と置換することにより、膜結合する代わりに分泌される、本質的に完全長のEPCRを作成する手段が提供される。
本明細書で使用される場合、レセプターをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列、およびストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする、その保存的置換、付加、または欠失を有する配列を含む。本明細書で使用される場合、レセプターを構成するアミノ酸配列は、配列番号２に示される配列、および機能的に等価な生物学的活性を有するレセプターを形成する、その保存的置換、付加、または欠失を有する配列を含む。何が、保存的置換、付加、または欠失を構成し、そしてどれが、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して機能的に等価なレセプター分子をコードまたは形成すると容易に確認され得るかは、当業者に周知である。これは、さらに、図３を参照することによって例示され、以下に議論される。
選択的スプライシング
レセプターは、特異的リガンドに結合して生理学的応答を生じることを担う細胞の、外部に曝された部分を有する、細胞膜に繋がれたタンパク質として最も頻繁に思い描かれる。多くの場合、もはや細胞に制限されないという事実にもかかわらず、頻繁にそのリガンドを確かに結合し得る、可溶性形態のレセプターが存在する。可溶性レセプターイソ形態へのリガンド結合はまた、多くの形態をとる応答を生じ得、これには、膜結合レセプター相互作用のアップモジュレーションまたはダウンモジュレーション、あるいは正常には応答性ではない細胞へリガンドを輸送することによって応答を伝達させることを含む（Heaney,MLおよびDW Golde.Soluble cytokine receptors.Blood 87:847−857,1996）。
可溶性レセプターを産生するための２つの公知のメカニズムが存在する：膜結合レセプターをタンパク質分解して、細胞外ドメインを遊離し、そして膜アンカーを残すことによるもの、およびmRNAの選択的スプライシングによるもの（図１）。後者のメカニズムは多くの形態を取り得るが、リーディングフレームがエキソン−イントロン境界により連続し、そして膜貫通アンカーをコードする配列に達する前に停止コドンで終結する場合、最も単純である。これは、膜形態に類似するが、重要な差異を有するタンパク質を生成する。これは、可溶性タンパク質として、作製され、そして分泌され、そして特有のカルボキシル末端テイルを有する。このテイルを、膜結合レセプターの形成において無視されるイントロンmRNA配列の一部を読むことによって形成した。選択的スプライシングによる可溶性レセプターの生成はまた、共に同じmRNAテンプレートを起源にするという事実にもかかわらず、膜結合レセプターとは独立して調整され得る（Heaneyら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2365−2369,1995）。
可溶性レセプターが選択的スプライシングメカニズムによって生成されることを証明するためには、ゲノム配列および関連領域のイントロン−エキソン境界を知らなければならない。生理学的応答と可溶性レセプターを関連付けて、プロテインＣ遺伝子およびプロテインＳ遺伝子の発現の間にかなり頻繁に含まれることが見られる異常なmRNAスプライシングと区別することもまた役立つ（Bergら,Blood Coag Fibrinol.7:625−631,1996）。
以下の研究および結果の詳細は、実施例に記載される。ヒト血漿は、約100ng/mlの可溶性EPCRを含む（表１）。これを、２つのモノクローナル抗体（1494mAbおよび1495mAb）および標準的技法を使用する酵素結合イムノアッセイ（ELISA）によって測定した。著しく上昇した可溶性EPCRレベルを、全身性エリテマトーデスおよび敗血症の患者で見いだした。これらのレベルは、ほとんど例外なく、大血管の表面上のみに存在する膜結合レセプターについてかなり高いようであった。これを真相正しく認識するために、トロンボモジュリン（TM）は、すべての内皮、ならびにいくつかの非血管細胞上で発現されるが、正常可溶性TMレベルは、わずかに約10〜40ng/mlである（Takanoら,Blood 76:2024−2029,1990）。可溶性TMレベルは、狼瘡の患者で上昇していたが、敗血症では上昇していなかった。重要なことには、これらの患者群において、血漿EPCRとTMレベルとの間に相関がなかったことである（それぞれ、r2＝0.028および0.034）。
TMゲノム構造は、イントロンを含まず（Jackmanら,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）84:6425−6429,1987）、そのため可溶性TMイソ形態を生成するための唯一の方法は、膜結合レセプターのタンパク質分解による。好中球エラスターゼおよびカテプシンＧによる内皮TMのタンパク質分解は、インビトロで示されており、これは、種々の疾患状態で見出される上昇した可溶性TMレベルが、内皮表面で、活性化された炎症性細胞の産物によって媒介されるタンパク質分解から生じることを示唆する（Boehmeら,Immunology 87:134−140,1996、およびAbeら,J.Lab.Clin.Med.123:874−881,1994）。
血漿EPCRおよびTMレベルと高い血漿EPCR濃度との間の相関の欠如は、血漿EPCRがタンパク質分解および選択的スプライシングの両方のメカニズムを起源にするという概念に一致する。ヒトEPCRのゲノム構造は、イントロンによって分解される、４つのエキソンを含む。この配列を概観することにより、7527位にTAA停止コドンを含むエキソンIII−イントロンIII境界（5'GTで）の後のインフレームリーディング配列が明らかになる。この停止コドンは、膜貫通ドメインをコードするエキソンIVの上流にあるので、予測されるタンパク質は、特有な48残基のカルボキシル末端テイル（イントロン配列によってコードされる）を含み、そして膜貫通アンカーを含まない。
図１は、短縮型EPCRが誘導され得る２つの可能性のある方法の図である：膜貫通ドメインの直前でのタンパク質分解によるか、または選択的スプライシングによる。図２に示されるように、選択的スプライシングは、選択的にスプライスされた短縮型EPCR中にあるペプチド配列が含まれることを生じる。図３に示されるように、この配列は、種間で高度に保存されるが、わずかな差が存在し、ヒトおよびウシのEPCRについては48残基、マウスEPCRについては51残基、そしてヒヒEPCRについては22残基の新しいカルボキシル末端テイルを生じる。
レセプタータンパク質の発現についての患者サンプルのスクリーニング
患者サンプルは、EPCR、EPCR中の選択的にスプライスされたインサートに存在する特有のインサートのいずれかに対する抗体、またはコンホメーションの差に起因してEPCRまたはsEPCRのいずれかに対してより大きな親和性で結合する抗体を使用して、sEPCRまたはEPCRの存在および量について、スクリーニングされ得る。サンプルはまた、存在するタンパク質を特異的に定量するための他の標準的技法を使用して、スクリーニングされ得る。
診断的または治療的使用のための抗体の生成
EPCR、および特に、可溶性EPCR（「sEPCR」）、および組換え可溶性EPCR（「rsEPCR」）に対する抗体が生成され得、これらは、レセプタータンパク質の検出、特徴付け、または単離に有用であり、そしてほとんどの場合、リガンド結合の阻害によって、レセプタータンパク質活性を調節するために有用である。抗体は、免疫原として、ヒトまたは動物の精製または組換えレセプタータンパク質もしくはそのフラグメントを使用して、標準的技法によって生成される。
EPCRに対するモノクローナル抗体を、Esmonら,1993,Methods Enzymol.222:359−385によって他のタンパク質について記載されたように得た。1494、1495、および1496mAbと呼ばれる抗体は、組換え可溶性EPCRおよび細胞表面発現EPCRに結合するIgG1κ抗体である。1494および1496mAbは、EPCRへのプロテインＣおよびAPCの結合をブロックし、そして細胞性EPCRがトロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化を容易にする能力を阻害する。1495mAbは、EPCRへのリガンド結合をブロックせず、細胞表面プロテインＣを変化させず、そして1494または1486mAbのエピトープとは異なる結合エピトープを有する。抗体は、標準的技法、例えば、放射標識、酵素標識、フルオレセインのような蛍光標識、金粒子、染料、および抗体の検出のための他の手段を使用して標識され得る。例えば、抗体は、標準的な手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化され得る。抗体は、イムノアッセイにおける使用のための固体支持体、例えば、AffiGel−10TM、ニトロセルロース、またはマイクロタイターウェル、あるいは溶液相イムノアッセイにおける使用のための固体支持体に固定され得る。
好ましい実施態様では、EPCRは、50マイクロリットルの、15mM Na2CO3、35mM NaHCO3（pH9.6）中４マイクログラム/mlの1495mAbで４℃にて一晩コーティングしたマイクロタイタープレート（MaxisorpTM、NUNC NS,Roskilde,Denmark）を使用して測定される。室温で、次いでプレートを20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.05％Tween 20（pH7.5）（アッセイ緩衝液）で３回洗浄し、そして0.1％（wt/vol）ゼラチンを含むアッセイ緩衝液で少なくとも１時間ブロックする。次いで、ウェルを洗浄し、50マイクロリットルサンプルを３連のウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートする。ウェルを吸引し、アッセイ緩衝液で３回洗浄し、そして50マイクロリットル、２マイクログラム/mlのビオチン−1494mAbを添加する。プレートを１時間インキュベートし、３回洗浄し、そして50マイクロリットルの、0.25マイクログラム/mlのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（GIBCO BRL）を添加し、そしてさらに１時間インキュベートする。ウェルを５回洗浄し、そしてELISA増幅キット（GIBCO BRL）の基質および増幅試薬を、製造業者の指示に従って15分間隔で連続して添加する。発色を0.3M H2SO4で停止し、そして終点吸光度を、Vmaxマイクロプレートリーダーにて490mmで読み取る。３連のウェルでの標準は、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、および1mM EDTA、0.1％ゼラチン（pH7.5）中の1.5〜100ng rsEPCR/mlである。標準曲線は、1.5〜12.5ng/mlで直線であり、そしてサンプルを、直線範囲に入るように同じ緩衝液で希釈する。研究は、１〜２パーセントの間で、血漿が、アッセイの直線性にも標準曲線の感度にも影響を及ぼさないことを示す。健常ボランティアからの血漿サンプルを、1mM EDTAを含むアッセイ緩衝液で最終的に２％血漿まで希釈した。そしてEPCR抗原レベルを、同じプレート上で決定された標準曲線を参照して、３連ウェルの平均から算出する。
障害
可溶性EPCRについてのアッセイは、本明細書で議論されるような凝固および炎症状態および障害、例えば、狼瘡のような自己免疫疾患、移植モニタリング、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、心肺バイパス、不安定性アンギナ、再狭窄、血管形成（すなわち、血管疾患）、腎臓または肝臓疾患の検出および分析に有用である。例えば、EPCRは、大血管についてのマーカー、したがって大血管に対する損傷についてのマーカーである。可溶性EPCRの量の増加は、大血管傷害を示し、EPCRのタンパク質分解またはsEPCR合成の刺激のいずれかを生じる。EPCR対トロンボモジュリンの比はまた、血液または尿のいずれかのサンプルに基づいて決定され得、これは微小血管対血管の相対的な程度を示す。サイトカイン、白血球活性化マーカー、および補体因子または活性化マーカーに対するEPCRの相対量もまた、疾患状態を示すために使用され得る。
EPCRは内皮細胞上に存在するので、内皮細胞損傷のマーカーとして有用である。これは、薬物の効果（毒性および効力の両方）の指標として使用され得る。例えば、狼瘡患者では、炎症性／凝固媒介性大血管傷害を効果的に最小にする薬物は、EPCRレベルの減少を生じる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解される。
実施例1:ヒト血漿における機能的内皮プロテインＣレセプターの同定
以下の略号を使用する:rsEPCR、膜貫通ドメインおよびサイトゾルテイルの代わりに挿入されたHPC4エピトープを有する組換え可溶性EPCR;mAb、モノクローナル抗体;SDS−PAGE、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。
方法
材料。以下の試薬を示された供給業者から購入した：
ブタ腸粘膜ヘパリン、ジイソプロピルフルオロリン酸、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ウシ血清アルブミン、Sigma（St.Lois,MO）;Spectrozyme PCa、American Diagnostica（Greenwich,CT）;ELISA増幅キット、GibcoBRL（Gaithersburg,MD）;AffiGel−10、BioRad（Hercules,CA）；ハンクス平衡化塩溶液、３−（Ｎ−モルホリン）プロパン硫酸（MOPS）、Fisher Scientific（Fair Lawn,NJ）。すべての他の試薬は、市販の最高品質なものであった。
タンパク質。ヒトプロテインＣ（Esmonら,1993,Methods Enzymol.222:359−385）、ウシトロンビン（Owenら,1974,J.BIol.Chem.249:594−605）、およびウシアンチトロンビン（Esmon 1977「Factors regulating the inhibition of thrombin by antithrombin III.In Chemistry and Biology of Thrombin」R.L.Lundblad,J.W.Fenton,II,およびK.G.Mann編Ann Arbor Science,Ann Arbor.403−411）を、記載のように精製した。組換え可溶性EPCR、rsEPCRは、膜貫通ドメインの直前の残基210で短縮されたEPCRの細胞外ドメイン、続くHPC4モノクローナル抗体におけるカルシウム依存的イムノアフィニティー精製を可能にする12残基配列からなる（Takahashiら,1992;Stearnsら,1988,J.Biol.Chem.263:826−832）。rsEPCRの構築、精製、およびプロテインC/APC結合特性（Fukudomeら,1996）。ヤギ免疫前血清およびrsEPCRに対するヤギポリクローナル抗血清を調製し、そしてIgGを精製した（Fukudomeら,1996）。ヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体を、標準的手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。
モノクローナル抗体。rsEPCRに対するモノクローナル抗体（mAb）を、他のタンパク質について記載されたように得た（Esmonら,1993）。1494、1495、および1496mAbは、rsEPCRおよび細胞表面発現EPCRに結合するIgG1κ抗体である。1494および1496mAbは、EPCRへのプロテインＣおよびAPCの結合をブロックし、そして細胞性EPCRがトロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化を容易にする能力を阻害する（Stearns−Kurosawaら,1996）。1495mAbは、EPCRへのリガンド結合をブロックせず、細胞表面プロテインＣ活性化を変化させず、そして1494または1496mAbのエピトープとは異なる結合エピトープを有する。1494および1495mAbを、標準的手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。1494mAbを、血漿EPCRのイムノアフィニティー精製のために、製造業者の指示に従って、AffiGel−10にカップリングした。抗EPCR mAbのスクリーニングを、Stearns−Kurosawaら（1996）;Fukudomeら（1996）に記載の方法を使用して行った。
凝血アッセイ。１段階第X a因子凝血アッセイにおけるAPC（25nM）抗凝固活性に対するrsEPCRまたは精製血漿EPCRの効果を、83μg/mlの1496mAb（APC−EPCR相互作用をブロックする抗体）の存在または非存在下で行った（Reganら,1996）。可溶性EPCRおよび1496mAbを、アッセイ前15分間プレインキュベートした。
細胞培養。すべてのヒト細胞株を、以前に記載されたように維持した（Fukudomeら,1996）。EA.hy926細胞（形質転換されたヒト内皮細胞株;Edgellら,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）80:3734−3737）は、Cora−Jean Edgell（University of North Carolina at Chapel Hill）が好意により提供した。
フローサイトメトリー分析。蛍光プローブとして用いるために、APCを、記載されるように（FukudomeおよびEsmon、1994;Bock,P.E.1988.Biochemistry 27:6633−6639）、フルオレセインで活性部位（fl−APC）において標識した。EA.hy926細胞へのAPC結合に対するrsEPCRまたは血漿EPCRの効果を、フローサイトメトリーによって研究した（Fukudomeら,1996）。手短には、収集された細胞を、漸増する濃度のいずれかの可溶性EPCR調製物の非存在下または存在下において、60nMのfl−APCとともに、氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、そして細胞に結合した蛍光を、フローサイトメトリーによって１サンプルごとに10,000事象を計数して測定した。全てのアッセイを、１％のウシ血清アルブミン、3mM CaCl2、0.6mM MgCl2、および0.02％アジ化ナトリウムを補充したハンクス平衡化塩溶液において行った。
細胞表面プロテインＣ活性化。EA.hy926細胞を96ウェル組織培養ディッシュにおいて培養した（Stearns−Kurosawaら、1996）。コンフルエントな単層を、１％（w/v）のウシ血清アルブミン、3mM CaCl2、0.6mM MgCl2、および0.02％アジ化ナトリウムを補充したハンクス平衡化塩溶液を用いて、３回洗浄した。全てのアッセイを、室温において、同一の緩衝液中で、60μｌの最終容量にて行った。そして、全てのタンパク質濃度は、アッセイにおける最終濃度を示す。プロテインＣ（0.1μＭ）を、示された濃度のrsEPCR、血漿EPCR、または1494mAbの非存在下または存在下で添加し、細胞とともに15分間プレインキュベートした。トロンビンを混合液に添加して（2nM）、活性化反応を開始した。示された時間に、50μｌのアリコートを取り出し、そして96ウェルマイクロタイタープレート中の10μｌのアンチトロンビン（0.7μＭ最終）およびヘパリン（5U/ml最終）に添加した。APCアミド分解活性をSpectrozyme PCa基質（0.2mM）の添加によって測定し、405nmでの吸光度の変化速度（mOD/分）をVmaxキネティックマイクロプレートリーダー（Molecular Devices,Menlo Park,CA）で測定した。すべてのアッセイ点は、３連ウェルにおいて行われ、そして十分に活性化されたプロテインＣ対mOD/分の標準曲線を参照することにより決定される場合、プロテインＣ基質の10％未満が活性化された。
血漿および血清の収集。健常な成人ボランティア（女性12人および男性10人）から、3.8％緩衝化クエン酸溶液中かまたは抗凝固剤を含まないチューブ中に、静脈穿刺によって全血を収集した（Vacutainer tube;Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）。年齢、食餌、または他の変数に関するドナーのスクリーニングは試みなかった。全てのボランティアに研究についての情報を開示し、彼らから書面による同意を得た。血液を、1160×ｇで10分間遠心分離した。血漿および血清を等分し、アッセイまで−80℃で冷凍保存した。
血漿EPCRの定量のためのELISA。血漿におけるEPCR抗原の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイを開発した。マイクロタイタープレート（Maxisorp;Nunc,Roskilde,Denmark）を、50μｌの、15mM Na2CO3、35mM NaHCO3（pH9.6）中４μg/mlの1495mAbを用いて、４℃にて一晩コートした。以下の工程を室温で行った。ウェルを、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.05％Tween20（pH7.5）（アッセイ緩衝液）で３回洗浄し、0.1％（w/v）ゼラチンを含有するアッセイ緩衝液で少なくとも１時間ブロックした。ウェルを洗浄し、50μｌのサンプルを３連のウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートした。ウェルを吸引して、アッセイ緩衝液で３回洗浄し、50μｌの２μg/mlビオチン−1494mAbを添加した。プレートを１時間インキュベートし、３回洗浄し、50μｌの0.25μg/mlストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（GibcoBRL）を添加し、さらに１時間インキュベートした。ウェルを５回洗浄し、ELISA増幅キット（GibcoBRL）の基質および増幅試薬を、製造業者の指示に従い、15分の間隔で連続的に添加した。発色を0.3M H2SO4を用いて停止し、490nmの終点吸光度をVmaxマイクロプレートリーダーで読み取った。各プレートは、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％ゼラチン（pH7.5）中1.5〜100ng/mlのrsEPCRの標準を３連のウェルに含んだ。標準曲線は、1.5〜12.5ng/mlで直線であり（ｒ＝0.99）、そして血漿サンプルを直線範囲に入るように同じ緩衝液で希釈した。予備的な実験により、最終濃度１〜２％のヒト血漿は、標準曲線の直線性にも感度にも影響しないことを実証した。健常ボランティア由来の血漿サンプルを、1mMEDTAを含有するアッセイ緩衝液で、最終的に２％血漿に希釈し、そしてEPCR抗原レベルを、同一プレート上で決定された標準曲線を参照して、３連ウェルの平均から算出した。
コーティング抗体と検出抗体を逆にし（1494mAbをコーティングに；ビオチン−1495mAbを検出に）、そして抗体結合を、Blue Phos基質（KPL Laboratories;Gaithersburg,MD）で検出する、別のアッセイを開発した。この方法を使用して、敗血症患者における血漿EPCRをアッセイした。このアッセイは、おそらく親和性の差異のために、より高感度であったが、両アッセイとも、定性的には、同様の結果を与えた。
ウエスタンブロット。血漿または血清サンプルのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を、10％アクリルアミドゲルを、Laemmli緩衝液系（Nature 227:680−685）と共に用いて、非還元条件下で標準的な手順を用いて行った。ゲルをポリビニリデン膜（PVDF;Millipore,Bedford,MA）に転写し、膜をブロックし、次に免疫前ヤギIgG（50μg/ml）か、またはヤギ抗rsEPCRポリクローナルIgG（50μg/ml）のいずれかと30分間インキュベートした。洗浄後、膜を1:20,000希釈のマウス抗ヤギIgG−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Pierce,Rockford,IL）と30分間インキュベートした。膜を洗浄し、結合した抗体−酵素結合体を増強化学発光基質（Pierce）で製造業者の指示に従って検出した。
免疫吸着。健常ボランティアからの血清またはクエン酸処理血漿サンプル（400μｌ）を、AffiGel−10に結合させた50μｌの1495mAb（5mg IgG/ml樹脂）とともに、混合しながら４℃にて一晩インキュベートした。サンプルを遠心分離し、上清を除去し、そして樹脂を1mlの20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.5）で３回洗浄した。最終20mM ジチオスレイトールを含有するSDS−PAGEサンプル緩衝液を、洗浄した樹脂に添加し、サンプルを３分間沸騰し、そしてSDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングのために処理した。膜を４μg/mlのビオチン化ヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体でプローブし、そして結合抗体をストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Pierce）および増強化学発光検出系で検出した。予備的実験により、室温にて１〜４時間の、100μｌのTris不活化AffiGel−10樹脂でのサンプルの事前吸着、続く1495mAb−AffiGel−10での一晩の免疫吸着が、同一のウエスタンブロットの結果を与えることが決定された。
血漿EPCRの精製。血漿EPCRを、イオン交換クロマトグラフィー、抗rsEPCR mAbイムノアフィニティークロマトグラフィー、およびプロテインＣ親和性カラムでのクロマトグラフィーの組み合わせを用いて、ヒトクエン酸処理血漿（Oklahoma Blood Institute）から精製した。わずかに異なる方法で２つの調製を行った。
第１の調製において、血漿（1L）を等量の20mM Tris−HCl（pH7.5）、10mMベンズアミド、400単位のヘパリンナトリウムで希釈し、そして1gの膨潤前のQAE樹脂でバッチ吸着した。沈澱後、樹脂をプロテインＣの精製のために処理した（Esmonら、1993）。固体硫酸アンモニウムを上清に４℃にて40％飽和まで添加し、遠心分離し、そしてさらなる硫酸アンモニウムをその上清に70％飽和に達するまで添加した。遠心分離後、柔らかなペレットを透析バッグに入れ、12Lの20mM Tris−HCl、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.4）に対し一晩透析した。透析物を、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.4）で平衡化した。1496mAb−AffiGel−10イムノアフィニティーカラム（6ml樹脂;5mg IgG/ml樹脂）にかけた。カラムを、12mlを超える同じ緩衝液で洗浄し、20mM Tris−HCl（pH7.4）中の50％（v/v）エチレングリコールで溶出した（Jun Xu、未発表の観察）。溶出物からのピーク画分をプールし（0.37の全OD280）、濃縮し（Centriprep30、Millipore）、そして緩衝液を20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、3mM CaCl2、0.6mMMgCl2、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.4）に交換した。この物質をプロテインＣアフィニティーカラムにかけた。このカラムは、同じ緩衝液においてHPC4−AffiGel−10カラム（5mg IgG/ml樹脂;0.9×8cm）に精製プロテインＣ（3mg）をかけることにより事前に調製した。HPC4mAbは、カルシウム依存的様式でプロテインＣ活性化領域に結合し（Esmonら、1993;Stearnsら、1988）、その後のプロテインＣへのEPCRの結合を妨げない。血漿EPCRを含有するサンプルをカラムにかけた後、カラムを約12mlの緩衝液で洗浄し、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、5mM EDTA、10mM MOPS、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.5）で溶出した。画分を、280nmでの吸光度について、そして上記のELISAを用いてEPCR抗原についてモニターした。プロテインＣおよび血漿EPCRの両方を含有する溶出物を、FPLC（Pharmacia−LKB、Uppsala、Sweden）MonoQカラムにかけ、カラムを20mM Tris−HCl（pH7.5）中の0.1〜1M NaClの直線勾配で展開した。約半分の血漿EPCRは、MonoQカラムに結合せず、半分は、約0.2M NaClに溶出し、そしてプロテインＣは、約0.5M NaClに溶出した。血漿EPCRの両方のイオン種は、還元条件下または非還元条件下での銀染色、クマシーBB染色、またはPVDF膜への転写後の金染色（Pierce）を用いるSDS−PAGE、およびビオチン−ポリクローナル抗rsEPCR抗体プローブでのウエスタンブロットで、同一のようであった。
血漿EPCRの第２の調製は、4Lの血漿を用いて開始し、機能研究に十分なタンパク質を精製した。この場合、1496−AffiGel−10樹脂（20mlの5mg IgG/ml樹脂）を、10mMベンズアミジン、1mMジイソプロピルフルオロホスフェートおよび0.5単位/mlのヘパリンナトリウム（最終濃度）と共に、クエン酸処理血漿に、直接添加した。血漿を、穏やかに混合しながら、４℃にて一晩バッチ吸着した。樹脂の沈澱後、上清をプロテインＣ精製のために処理した（Esmonら、1993）。樹脂を2.5×30cmのカラムに充填し、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.4）で、十分に洗浄し、そして20mM Tris−HCl（pH7.4）中50％のエチレングリコールで溶出した。溶出物をプールし、濃縮し（5.5の全OD280）、MonoQカラムにかけ、２つのイオン種（素通り、および0.2M NaCl溶出ピーク）を、1496−AffiGel−10樹脂（1.5×11cm）に再びかけた。カラムを前のとおりに、50％エチレングリコールで溶出した。溶出物（0.71 OD）を濃縮し、緩衝液を、Cetriprep30を含む。20mM Tris−HCl、0.1MNaCl、3mM CaCl2、0.6mM MgCl2、0.02％アジ化ナトリウムに交換した。次に、この物質をアフィニティーカラムにかけた。ここで、プロテインＣ（2.9mg）を、同じ緩衝液中で、HPC2−AffiGel−10カラム（0.6×17cm）に最初にかけた。HPC2mAbは、プロテインＣのセリンプロテアーゼドメインに結合し、EPCR結合を妨げない（Fukudomeら、1996）。結合したEPCRを、5mM EDTAを含有する緩衝液で溶出した。混入している血清アミロイドＰ（プロテインＣサンプル由来）を、FPLC MonoQカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって除去した。サンプルを0.2M NaCl中でカラムにかけ、その結果、血漿EPCRは結合せず、そして0.4〜0.5M NaClにおいて溶出する混入物から分離された。得られる精製血漿EPCR（0.193 OD280）は、銀染色を用いるSDS−PAGE、およびポリクローナル抗体rsEPCRを用いるウエスタンブロットにより、均質のようであった。この物質を機能研究およびアミノ末端配列分析に使用した。
タンパク質配列決定。可溶性血漿EPCRのアミノ末端配列分析を、Molecular Biology Research Facility、W.K.Warren Medical Research Institute（Oklahoma City）のKenneth Jackson博士の研究室において行った。アミノ酸を標準の１文字コードによって表す。
結果
第１のアプローチとして、３人の健常ボランティア由来の血漿および血清サンプルを希釈し（４％v/v）、非還元条件下で10％SDS−PAGEゲルで泳動し、そしてrsEPCRに対して惹起したヤギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットのために処理した。健常ボランティア由来の血漿および血清サンプル（４％v/v）を非還元条件下の10％ゲルでのSDS−PAGEのために処理し、膜に転写し、そして膜をヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体でプローブした。結果をrsEPCR（0.2ng）と比較した。結合した抗体を、マウス抗ヤギIgGおよび増強化学発光検出系で検出した。２人の健常ボランティア由来の血漿サンプルを1495 AffiGel−10樹脂で免疫吸着した。洗浄した樹脂を溶出させ、そして還元条件下でのSDS−PAGEのために処理した。ウエスタンブロッティングを、ビオチン−ヤギ抗rsEPCRをプローブとして使用して行った。
血漿EPCRの純度を、銀染色したSDS−PAGE 10％ゲル、およびビオチン−ヤギ抗rsEPCRでプローブした膜のウエスタンブロットから決定した（還元および非還元）。膜をポリクローナル抗体でプローブした後、血清および血漿サンプルの両方で、約43,000Daの単一のバンドが現れる。検出されたタンパク質のサイズは、rsEPCRよりわずかに大きいようである。検出された他のバンドは、免疫前IgGおよびより長い暴露時間でのプロービングより判断すると、IgGのバックグラウンド結合であった。AffiGel−10樹脂と結合した抗EPCR 1495mAbと共に血漿サンプルを一晩インキュベートすること、続く洗浄および還元条件下での結合抗原の溶出は、ビオチン−ヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体でのウエスタンブロットにより検出される単一バンドを生じた。
mAb 1495をコーティング抗体として使用するELISAによる、健常ボランティア由来の血漿における可溶性EPCR抗原の測定は、女性（ｎ＝12）では91.1＋／−24.5ng/mlの抗原レベル、そして男性（ｎ＝10）では107.2＋／−30.2ng/mlの抗原レベルを見出した。ともに計算する場合、平均血漿EPCR抗原レベルは、98.4＋／−27.8ng/mlであった。男性の値は、トロンボモジュリンと同様に（Quehenbergerら、Thromb.Haemost.76:792−734）、女性の値よりわずかに高いようであるが、研究した集団は、統計学的分析にはあまりに限定されており、そしてこの研究は、性別、年齢、食餌または他の変数に起因する差異を評価するためには設計されていなかった。
血漿EPCRは、約100ng/mlの単一種であるようであるので、血漿EPCRは、循環EPCRが、プロテインＣおよびAPCに結合し得るか否かを決定するために重要になった。可溶性EPCRを、イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムでの沈降、および実験手順において記載されるような抗EPCR 1496mAb−AffiGel−10カラムクロマトグラフィーによる免疫吸着の組み合わせによって、ヒト血漿から精製した。
3mM CaCl2、0.6mM MgCl2を含む緩衝液中で抗プロテインCHPC4mAb−AffiGel−10カラムにプロテインＣ（3mg）を適用することによって調製したプロテインＣアフィニティーカラムに、この血漿EPCR（約110μｇ）を適用した。カラムを洗浄し、そして血漿EPCRを画分19に適用した。カラムを洗浄し、そして画分35で開始する5mM EDTAを含む緩衝液で溶出した。それらの画分について、280nmでの吸光度およびEPCR抗原を決定した。EPCR抗原を、ELISAによって決定した。
適用した血漿EPCR抗原の98％以上が、プロテインＣアフィニティーカラムに結合した。吸光度プロフィールは、この抗体へのプロテインＣ結合のカルシウム依存性と一致して、抗体カラムからのEPCRおよびプロテインＣの同時溶出を示す（Stearnsら、1988）。
機能研究および構造研究のために十分なタンパク質を精製するために、類似しているがわずかに改変した手順を用いて、4Lの血漿からEPCRを精製した。プロテインＣ−抗体アフィニティーカラムからの溶出後、タンパク質を夾雑する残渣を、FPLC Mono Ｑカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって取り出した。得られた血漿EPCRの調製物は、銀染色を用いるSDS−PAGE 10％ゲルで均質のようであり、そして同一の結果が、ビオチン−ヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体でプローブしたウェスタンブロットに関して、還元条件下および非還元条件下の両方で得られた。精製されたタンパク質のアミノ末端配列分析は、唯一の配列Ｓ−Ｑ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｄ（この配列は、組換え可溶性EPCRのアミノ末端配列に同一である：配列番号２）を生じた。これは、天然の供給源からのEPCRの最初のアミノ末端配列決定である。
血漿EPCRの、APCに結合する能力を、競合研究によって評価した。この競合研究において、血漿EPCRを、APCについて細胞性EPCRと競合させ、そして細胞性EPCRに結合し得る得られた遊離のAPCを、フローサイトメトリーによって評価した（図4a）。活性部位においてフルオレセインで標識したAPC（fl−APC）を、血漿EPCRまたはrsEPCRのいずれかの、存在下または非存在下で、EA.hy926細胞とともにインキュベートした。細胞へのAPC結合の阻害についてのEPCR濃度依存性は、EPCRの両方の可溶性形態について類似であった。この観察は、APCに結合することについての血漿EPCRの親和力が、rsEPCR−APC結合相互作用について以前に決定された親和力（Kdapp約30nM）に類似することを示す。
rsEPCRは、可溶性系においてプロテインＣ活性化に対してほとんど効果を有さないが（Reganら、1996）、膜結合EPCRは、細胞表面上での活性化を促進する、非常に強力な能力を有する（Stearns−Kurosawaら、1996）。プロテインＣおよびAPCに結合し得るEPCRの循環形態の存在を示す最新のデータは、血漿EPCRが、プロテインＣの細胞表面活性化を変更する能力を有することを示唆した。EA.hy926細胞上でのほぼ生理学的レベルのプロテインＣ（0.1μＭ）のトロンビン依存性活性化は、過剰なrsEPCRによって、図4bによって示されるように、ほぼ、EPCR−プロテインＣ結合相互作用をブロックする抗rsEPCR 1494mAbを用いて観察されたプロテインＣのレベルにまで阻害された。以前の研究は、rsEPCRが小さな合成基質を使用するAPCアミド分解活性（amidolyticactivity）に対する効果を有さないことを実証した（Reganら、1996）。血漿EPCRは、図4cに示されるように、rsEPCRと比較してEA.hy926細胞上の細胞表面プロテインＣ活性化を阻害する能力においてわずかにより有効であった。
１段X a因子凝固アッセイにおいて、精製された血漿および可溶性組換えEPCRは、同様に凝固時間のAPC延長を阻害した（図4d）。rsEPCRによるAPC抗凝固活性の阻害が、以前に観察されている（Reganら、1996）。予測されるように、1496mAbは、APC−血漿EPCR結合相互作用をブロックすることによって、この効果を逆転した。
実施例2:尿における可溶性EPCRの検出
可溶性EPCRが尿中に存在するかどうかという疑問を検討するために、４つの尿サンプル（朝一番の排尿）を回収し、そしてウェスタンブロッティングおよびELISAによって可溶性EPCRの存在について分析した。
希釈していない小児の尿サンプルを、４％の正常な血漿および組換え可溶性EPCR（1ng）と比較した。サンプルを、ビオチン−ヤギ−抗rsEPCRおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ検出系とともにインキュベートした。
ウェスタンブロットは、ａ）可溶性EPCRが尿中に存在すること、およびｂ）可溶性EPCR抗原が、血漿中で観察されるサイズと類似のサイズで存在することを示す。明らかな分解は観察されない。ELISAによって定量される、４つのサンプル中の可溶性EPCRの量は、40.3、6.1、35.6、および90.1ng/mlであった。
実施例3:狼瘡患者由来の血漿EPCRの測定
正常なヒト血漿EPCR濃度は、上記のように約100ng/ml（98.4±27.8ng/ml;2.5nM）である。エリテマトーデスに罹患した患者由来のサンプルのパネル（ｎ＝54）をアッセイし、そして可溶性EPCRレベルが、検出不能レベルから1,700ng/ml以上までの範囲であることを見出した。15人の患者は、200ng/ml以上の可溶性EPCRレベルを有した。
以前の研究は、内皮損傷に起因する、狼瘡患者における上昇した可溶性血漿TMレベルを示し、そして最新の狼瘡患者サンプルを、参照として血漿TMについてアッセイした。それらの可溶性TMレベルが、図５によって示されるように、それらの可溶性EPCRレベルと完全に相関を有さないことが見出された。このことは、可溶性血漿EPCRの供給源が、単に、ランダムに損傷を受けた内皮由来ではないことを示唆する重要な観察である。TMとは対照的に、ヒトおよび霊長類における膜結合EPCR発現は大きな脈管の内皮に主に制限され、毛細管はほとんどEPCRを発現しない。EPCRの特有の局在化は、大きな脈管の血栓症を予防するために、局所的にプロテインＣ活性化を増大すると予測される。大きな脈管への膜結合EPCRの主な局在化は、可溶性血漿EPCR濃度によって予測され得る大きな脈管における標的化された血栓症の危険を示す。
実施例4:敗血症性ショック患者における血漿可溶性EPCR
敗血症（accp/sccm consensus conference,chest 1992;101:1644−1655）は、以下の臨床的発現のうちの１つより多くを含むが、それらに限定されない。感染に対する全身性炎症応答として定義される：
１）38℃以上または36℃未満の体温；
２）１分あたり90拍以上の心拍数；
３）以下によって示される頻呼吸：
ａ）１分あたり20呼吸以上の呼吸率；
ｂ）32mmHg未満のPaCO2の過度呼吸；
４）12,000/mm3以上もしくは4,000/mm3未満のWBCカウント、または10％以上の未熟好中球（バンド）の存在。
サンプルを、器官機能不全、低灌流（hypoperfusion）、または低血圧と関連する敗血症によって規定されるような、重篤な敗血症を伴うか、または伴わない、手術後の合併症を有する患者から得た。灌流異常は、乳酸アシドーシス、尿量過少、または精神状態における急性変化を含み得る。敗血症性ショックは、十分な流体（fluid）蘇生、および心臓性ショックの非存在にもかかわらず、24時間以上の間、血管作用薬を必要とする低血圧を伴う敗血症をいう。
本研究において含まれるすべての患者は、以下の診断基準を満たした：
ａ）呼吸の指示（24時間以上の制御された換気）およびまたは血流力学的支持（５マイクログラム/Kg/分以上の強心薬、ドパミン、もしくはドブタミン、および／または血管作用性アミン、エピネフリン、もしくはノルエピネフリンの要求）を必要とする、敗血症および／または手術後の合併症に起因する、集中治療室への入室；
ｂ）18歳〜75歳の間の年齢；
ｃ）70％未満の抗トロンビン活性（局所にて試験される）。
患者が、多くの外傷、肝硬変、または急性肝不全、末期ガン、免疫不全、白血病、妊娠、またはヘパリン治療を有する場合、その患者を除外した。
患者の血液サンプルを、時間０（集中治療室ICUへの入室）の時点および抗トロンビンII（AT III）または偽薬での処置後２日目および６日目に採取した。血漿可溶性EPCRおよび可溶性トロンボモジュリン（TM）を、時間０のサンプルに関してのみアッセイした。
sEPCR:
正常:133.4±53.4ng/ml（平均±標準偏差）
敗血症:224.9±74.5ng/ml
平均間の有意な差あり、Ｐ＝0.00009
sTM:
正常:35.5±20.4ng/ml（平均±標準偏差）
敗血症:39.9±73.1ng/ml
平均間の有意な差なし、Ｐ＝0.81
血漿中のsEPCRレベルとsTMレベルとの相関関係なし、r2＝0.34。
これらの結果を、図６にグラフで示す。狼瘡患者と同様に、敗血症に罹患した患者は、可溶性TMレベルと相関せず、血漿EPCRレベルにおいて非常に顕著な上昇を示す。
可溶性血漿EPCRが、プロテインＣ活性化および活性化したプロテインＣ抗凝固活性の両方を阻害するという観察によって、これらの患者における上昇した血漿EPCRレベルが、さらなる血栓の危険性を引き起こし、そして脈管損傷／応答の証拠を表すことが示される。これらが示す状態の例は、内皮細胞刺激、アテローム発生、白血球接着、およびプラークの破裂に関連する障害を含む。
実施例5:ヒヒ組織およびヒト組織におけるEPCRの選択的スプライシング形態の同定
可溶性EPCRイソ型が、選択的スプライシング機構によって生成され得るか否かを決定するための最初のアプローチとして、RNAを、ヒト組織およびヒヒ組織から単離し、そして逆転写酵素−PCR（RT−PCR）を遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。ヒヒEPCRゲノム配列は公知ではないが、ヒヒとヒトとは進化のスケールにおいて密接に関連しているという論理に基づいて、ヒト配列に基づくプライマーを使用した。
一般にRT−PCR手順において、総RNAをホモジナイズした組織から単離する。RNAを、特定のアンチセンスプライマー、ヌクレオチド、および逆転写酵素と混合する。混合において、RNAは、逆転写酵素についての鋳型として作用し、第１鎖cDNAを作製する。次いで、この新しいcDNA鋳型を、特定のプライマーおよびTaqポリメラーゼを用いて従来のPCRによって増幅する。EPCRの膜形態（424bp）および推定の選択的スプライシング産物（674bp）の両方を増幅するプライマーを選択した。EPCRの両方の形態に対応する産物を、種々のヒヒ組織（図４）ならびにヒトの肺および胎盤から増幅した。逆転写酵素を含まないコントロール、および組織との反応における1,885bpのバンドの欠失によって判断されるように、ゲノムDNAに関する可能性のある夾雑は存在しないようであった。
ヒヒゲノムDNA配列が、選択的スプライシングのための適切なエキソン−イントロン境界およびイントロン−インフレームルーディング配列を有することを確認するために、ヒヒ腎臓ゲノムDNA由来のイントロン配列を、従来のPCRによって増幅した。ゲノム構造は種間で保持されるという前提を立て、そしてイントロンIIIに隣接するプライマー（ヒト配列）を使用した。これは、選択的スプライシング配列を含むと考えられるイントロン（ヒト配列）である。ヒヒ腎臓組織をホモジナイズし、そしてDNAを抽出した。DNAを、特定のプライマーと混合し、そして産物をPCRによって増幅した。DNA産物を精製し、そしてアガロースゲルで電気泳動した。
手順の詳細：
A.EPCR ELISA:被覆する抗体は、EPCRのリガンド結合ドメインに結合する1494mAbである。検出する抗体は、ビオチン化1495mAbであり、これはプロテインC/APC結合をブロックせず、そして1494mAbと交差反応しない。検出系は、ストレプトアジビン−アルカリホスファターゼおよびBluePhos基質（KPL製）である。
B.組織のRT−PCR:組織（50〜100mg）をTrizol（Gibco BRL）中にホモジナイズした。RNAを含む上層を、クロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、洗浄し、そしてDEPC−水中に溶解した。RNA（１〜５μｇ）を、適切な緩衝液中で、製造業者の指示書に従って、ヌクレオチド、CREAアンチセンスプライマー、および逆転写酵素と混合した（第１鎖cDNA合成のためのSuperscriptTM Preamplification system,Gibco BRL）。cDNA産物を、CRESおよびCREAプライマーを用いて、従来のPCRによって、30サイクル増幅した。cDNA産物を、標準的な手順を用いて、クロロホルム抽出およびアルコール沈殿によって精製し、水中に溶解し、そして２％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルを、Vistra Green（Amersham）で染色し、そしてリン光画像機（phosphoimager）（StormTM scanner,Molecular Dynamics,Inc.）で画像化した。
C.ヒヒゲノムDNAのPCR:ヒヒ腎臓DNA（82mg）を、Trizol試薬中にホモジナイズした。DNAを含む下層を、抽出し、沈殿させ、そして滅菌水中に溶解した。DNAを、緩衝液、ヌクレオチド、ならびにHRT−１およびHRT−２プライマーとの混合液中で、従来のPCRによって、30サイクル増幅した。増幅したDNAを、標準的な手順を用いて、抽出し、沈殿させ、滅菌水中に溶解し、そして２％アガロースゲルで電気泳動した。単一のバンド（465bp）を、エチジウムブロミドで可視化し、切り出し、そしてPCR産物を、製造業者の指示書（Qiagen）に従ってスピンカラムで精製した。PCR産物を、同じプライマーを用いて配列決定した。
D.プライマー配列：
ヒヒ組織に関する結果：
ゲルから切り出され、精製され、そして配列決定された腎臓ゲノムDNAから増幅された単一のバンドが存在した。その配列は、ヒト配列に対して92％同一であり、そしてエキソン−イントロン境界は保存された。このイントロン配列における高レベルの類似性は重要である。なぜなら、イントロン配列は、代表的には種間において十分には保存されないからである。終止コドンを有するイントロン内のインフレームリーディング配列もまた存在し、このことは、ヒヒの選択的にスプライシングした可溶性タンパク質中の特有の22残基のカルボキシル末端テイルを予測する。
推定の可溶性EPCRイソ型が、特有のカルボキシル末端テイルを有するという観察は、イソ型特異的抗体を使用するイソ型間の区別のための構造的差異を提供する。実用モデルとしては、タンパク質分解された可溶性EPCRの血漿レベルが内皮損傷を報告する一方で、選択的スプライシングを受けた可溶性EPCRのレベルが刺激に対する内皮応答を報告するというものである。可溶性EPCRイソ型の相対的血漿レベルが、特定の病理学における大きな脈管の内皮機能不全および損傷に関する情報を提供することが期待される。
ヒト組織に関する結果：
ヒト組織（胎盤、肺、および舌）由来のRT−PCR産物を、EPCRに特異的なCRES/CREAプライマーを用いて電気泳動した。手順は、ヒヒ組織について使用された手順と同じであった。EPCRの膜イソ型（mEPCR）および選択的スプライシングを受けた可溶性EPCRイソ型（sEPCR）に対応する産物を観察した。産物は、ヒヒ組織を用いて観察された産物と本質的に同じようである。唯一の差異は、胎盤組織がさらなる産物を有するようであることである。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション
（ii）発明の名称：可溶性内皮細胞プロテインC/活性化プロテインＣレセプターを使用する診断アッセイ
（iii）配列数:8
（iv）連絡住所：
（Ａ）住所：パトレア エル．パブスト
（Ｂ）番地：ウエスト ピーチツリー ストリート 1201
ワン アトランティック センター 2800
（Ｃ）市：アトランタ
（Ｄ）州：ジョージア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:30309−3450
（ｖ）コンピューター読み出し形態：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用
（Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース＃1.0,バージョン＃1.25
（viii）代理人／事務所情報：
（Ａ）名称：パブスト，パトレア エル．
（Ｂ）登録番号:31,284
（Ｃ）照会／記録番号:OMRF168
（ix）通信情報：
（Ａ）電話：（404）873−8794
（Ｂ）テレファックス：（404）873−8795
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1032塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..1302
（Ｃ）他の情報:/記＝「ヌクレオチド25〜738は、配列番号２の内皮細胞タンパク質レセプターをコードする。」
（xi）配列：配列番号1:
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:238アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..365
（Ｃ）他の情報:/記：「配列番号１のヌクレオチド１〜1302によりコードされる内皮細胞タンパク質レセプター」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:modified−site
（Ｂ）存在位置:1..15
（Ｃ）他の情報:/記：「アミノ酸１〜15は推定のシグナル配列を表わす」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Domain
（Ｂ）存在位置:211..236
（Ｃ）他の情報:/記：「アミノ酸211〜236は推定の膜貫通ドメインを表わす」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Active−site
（Ｂ）存在位置:47..174
（Ｃ）他の情報:/記：「アミノ酸47〜49、64〜66、136〜138、および172〜174は、可能性のあるＮ−グリコシル化部位を表わす」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Active−site
（Ｂ）存在位置:Cys 17
（Ｃ）他の情報:/記：アミノ酸切断部位の直前
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Active−site
（Ｂ）存在位置:Gly 201
（Ｃ）他の情報:/記：選択的にスプライシングされたEPCR中のペプチドインサート
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:17..186
（Ｃ）他の情報:/記：「アミノ酸17、114、118、および186は、細胞外システイン残基を表わす」
（xi）配列：配列番号2:
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:48アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（xi）配列：配列番号3:
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:148塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列：配列番号4:
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..24
（Ｃ）他の情報:/記：「エキソンIIの末端付近の5'センスプライマー」
（xi）配列：配列番号5:
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..24
（Ｄ）他の情報:/記：「エキソンIV内の3'アンチセンスプライマー」
（xi）配列：配列番号6:
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..22
（Ｄ）他の情報:/記：「エキソンIIIの末端付近の5'センスプライマー」
（xi）配列：配列番号7:
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..29
（Ｄ）他の情報:/記：「エキソンIVの3'アンチセンスプライマー」
（xi）配列：配列番号8:
本発明は、一般に、内皮細胞プロテインC/活性化プロテインＣレセプターまたはタンパク質分解もしくは選択的スプライシングのいずれかによって誘導されるその可溶性形態の検出および／または測定を含むアッセイの領域にある。
合衆国政府は、Charles T.Esmonに対する国立衛生研究所助成金PO1HL 54804により、本発明に一定の権利を有する。
プロテインＣのその活性セリンプロテアーゼに対する活性化、活性化プロテインＣ（APC）は、血液凝固の調節に重要な役割を果たす一連の事象を開始する。プロテインＣ経路の臨床的重要性は、血栓症を生じる、この経路における多くの機能不全によって示される（EsmonおよびSchwarz,1995,Trends Cardiovasc.Med.5:141−148;Reitsmaら,1995,Thromb.Haemost.73:876−879）。プロテインＣが欠損した患者は、通常、幼児期に生命を危うくする血栓症合併症を示す（Seligsohnら,1984,N.Engl.J.Med.310,559−562;Esmon,1992,Trends Cardiovasc.Med.2,214−220）。これは、プロテインＣ投与によって補正される（Dreyfusら,1991,N.Engl.J.Med.325,1565−1568）。
プロテインＣおよびAPCはまた、炎症に対する宿主応答の調節に関連している。活性化プロテインＣ（APC）は、グラム陰性敗血症のヒヒモデルにおいてE.coliの致死的効果を予防し得（Taylorら,1987,J.Clin.Invest.79;TaylorおよびEsmonに対する米国特許第5,009,889号）、そして予備的な臨床結果は、プロテインＣが、ヒト敗血症ショックのある形態を処置することに効果的であることを示唆する（Gersonら,1993,Pediatrics 91,418−422）。プロテインＣ経路の重要な成分であるプロテインＳの阻害は、E.coliの致死量未満のレベルに対する霊長類の応答を悪化させ、そして循環中へのTNFの出現を増大する（Taylorら,1991,Blood 78,357−363）。これらの結果は、プロテインＣが、凝固の制御および炎症への影響の両方をなし得ることを示唆する。
プロテインＣは、凝固系の最終酵素であるトロンビンが、内皮細胞表面タンパク質であるトロンボモジュリンに結合する場合に、活性化される（Esmon,1989,J.Biol.Chem.264,4743−4746;DittmanおよびMajerus,1990,Blood 75,329−336;Dittman,1991,Trends Cardiovasc.Med.1,331−336）。細胞培養において、トロンボモジュリン転写は、腫瘍壊死因子（TNF）への内皮細胞の曝露によってブロックされ（ConwayおよびRosenberg,1988,Mol.Cell.Biol.8,5588−5592）、そしてトロンボモジュリン活性および抗原は、その後インターナライズされそして分解される（Lentzら,1991,Blood 77,543−550、Mooreら,1989,Blood 73,159−165）。補体系の調節タンパク質であるC4bBPは、プロテインＳと結合して、インビトロ（Dahlback,1986,J.Biol.Chem.261,12022−12027）およびインビボ（Taylorら,1991）でAPC抗凝固活性を支持することを機能的に不活性である複合体を形成する。C4bBPは、急性期反応物質として行動する（Dahlback,1991,Thromb.Haemostas.66,49−61）。したがって、この経路のタンパク質は、炎症を調節するようにみえるだけでなく、これらは炎症を調節する成分と相互作用し、そしてこれら自体は、炎症メディエータによってダウンレギュレーションを受ける。
内皮細胞は、効率的なプロテインＣ活性化を担う公知の２つのレセプター、トロンボモジュリンおよび内皮プロテインC/APCレセプター（EPCR）を発現する点で、プロテインＣ経路において重要な役割を果たす（FukudomeおよびEsmon,1994,J.Biol.Chem.269:26486−26491;Stearns−Kurosawaら,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）93:10212−10216）。トロンボモジュリン（CD141）は、高親和性を有する循環トロンビンと結合する膜貫通補因子であり、そして得られる酵素−補因子複合体は、生理学的に関連するプロテインＣ活性化速度に必要とされる（EsmonおよびOwen,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）78:2249−2252;Dittman,W.A.1991,Trends Cardiovasc.Med.1:331−336）。
EPCRは、CD1/MHCクラス１ファミリーとの著しい相同性を有する最近同定されたレセプターである（FukudomeおよびEsmon,1994;Fukudomeら、1996,J.Biol.Chem.271:17491−17498;Reganら,1996,J.Biol.Chem.271:17499−17503）。プロテインＣに対する内皮細胞レセプターのクローニングおよび生物学的役割は、Oklahoma Medical Research Foundationによって「Cloning and Regulation of an Endothelial Cell Protein C/Activated Protein Ｃ Receptor」と題するPCT/US95/09636に記載された。このタンパク質は、238アミノ酸からなると予測され、このアミノ酸は、Ｎ末端に15アミノ酸のシグナル配列、およびタイプ１膜貫通タンパク質としてこのレセプターを特徴づける23アミノ酸の膜貫通領域を含む。
EPCRは、カルシウムの存在下で類似の親和性（Kdapp約30nM）でプロテインＣおよびAPCの両方と結合し（Fukudomeら,1996）、そして細胞表面上で、トロンビン−トロンボモジュリン活性化複合体に対してプロテインＣ基質を提示することにより、プロテインＣ活性化を容易にする（Stearns−Kurosawaら,1996）。内皮細胞レセプターは両方とも、タイプ１膜貫通タンパク質であり、ここでリガンドは、細胞外ドメインに結合し、そして両方とも、短い細胞内細胞質テイルを有する（Fukudomeら,1996;Jackmanら,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）84:6425−6429;Wenら,1987,Biochemistory 26:4350−4357;Suzukiら,1987,EMBO J.6:1891−1897）。さらに、それらのインビトロ細胞表面発現は、腫瘍壊死因子−αによって同様にダウンレギュレートされる（FukudomeおよびEsmon 1994）。しかし、トロンボモジュリンおよびEPCRの可溶性形態の特徴は、いくつかの点で異なる。組換え可溶性トロンボモジュリンは、膜形態に対して減少した補因子活性を有する（Galvinら,1987,J.Biol.Chem.262:2199−2205;Parkinsonら,1990,J.Biol.Chem.265:12602−12610）。精製した成分および細胞の両方で、トロンボモジュリンによって特異的に誘導されるトロンビンの基質の変化は、トロンビンにおける共有される結合ドメインについての競合、ならびに活性部位ポケットにおけるコンホメーション変化から生ずる（Yeら,1991,J.Biol.Chem.266:23016−23021;Luら,1989,J.Biol.Chem.264:12956−12962;Yeら,1992,J.Biol.Chem.267:11023−11028;Hofsteengeら,1986,Biochem.J.237:243−251;Mathews,1994,Biochemistry 33:13547−13552;Esmonら,1982,J.Biol.Chem.257:7944−7947;Sedlerら,1993,Haemostasis 23:183−193）。可溶性トロンボモジュリンもまた、種々のインヒビターによるトロンビンの不活化を加速する（BourinおよびLindahl,1993,Biochem.J.289:313−330;Rezaie,1995,J.Biol.Chem.270;25336−25339）。血漿および尿の両方が、検出可能なトロンボモジュリンを含み（Takanoら,1990,Blood,76:2024−2029;IshiiおよびMajerus,1985,J.Clin.Invest.76:2178−2181）、そしてトロンボモジュリン遺伝子がイントロンを含まないので（Jackmanら,1987）、これらの可溶性形態は、細胞表面での細胞外ドメインのタンパク質分解による。
血漿中のトロンボモジュリンの可溶性分解産物は、種々の疾患状態での内皮細胞損傷の公知のマーカーであり（Takanoら,1990;Tanakaら,1991,Clin.Chem.37:269−272;Takahashiら,1991,Am.J.Hematol.38:174−177;Asakuraら,1991,Am.J.Hematol.38:281−287;Wadaら,1992,Am.J.Hematol.39:20−24;Takahashiら,1992,Am.J.Hematol.41:32−39;Ohdamaら,1994,Chest 106:666−671）、そして種々の減少した親和性を有するトロンビン結合フラグメント、ならびに非結合フラグメントの混合物から構成される（Takanoら,1990）。
対照的に、膜貫通ドメインの直前で短縮された組換え可溶性EPCR（rsEPCR）は、インタクトな細胞表面発現EPCRについて観察される親和性と同様な親和性でプロテインＣおよびAPCの両方と結合する（Fukudomeら,1996）。おそらくrsEPCRおよび第V a因子の両方が、トロンボモジュリンによって占有されるトロンビン中のアニオン結合外部位（exosite）を暗示する溝に結合決定基を共有するので（Matherら,1996,EMBO J.15:6822−6831）、APC抗凝固活性は、rsEPCRと結合した場合、効果的に阻害される（Reganら,1996）。しかし、rsEPCRは、APCによる小さい合成基質のタンパク質分解にも、α１−アンチトリプシンまたはプロテインＣインヒビターによるAPCの不活化にも影響を及ぼさないようである（Reganら,1996）。プロテインＣ活性化を増強する膜結合EPCR（Stearns−Kurosawら,1996）とは異なり、rsEPCRは、可溶性トロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化に対してほとんど効果を有さない（Reganら,1996）。このことは、EPCRの任意の可溶性形態が、プロテインＣについて膜結合EPCRと競合することによってプロテインＣ活性化を阻害し得ることを示唆する。
免疫組織化学は、EPCRが、主として大きな血管に由来する内皮細胞の表面上に存在し、そしてほとんどの毛細血管内皮細胞上にはないか、または低レベルでしか存在しないことを示す。
したがって、本発明の目的は、天然に存在する可溶性EPCRについて治療的および診断的使用を同定することである。
本発明のさらなる目的は、天然に存在する可溶性EPCRを特徴づけることである。
発明の要旨
血漿EPCRは、単離され、特徴づけられ、そして細胞性プロテインＣ活性化およびAPC抗凝固活性をブロックすることが示されている。血漿EPCRは、約43,000ダルトンであるようであり、そして約100ng/mlで循環する（98.4±27.8ng/ml、ｎ＝22）。血漿EPCRを、イオン交換、イムノアフィニティー、およびプロテインＣアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒトのクエン酸処理血漿から精製した。フローサイトメトリー実験は、血漿EPCRが、膜貫通および細胞質ドメインを含まないEPCRとして定義される組換え短縮型EPCRから予め決定された親和性（Kdapp約30nM）と同様の親和性で、活性化プロテインＣと結合することを示した。さらに、血漿EPCRは、内皮細胞株におけるプロテインＣ活性化および１段階第X a因子凝血アッセイにおけるAPC抗凝固活性の両方を阻害した。可溶性EPCRはまた、ヒト尿において検出されている。EPCRをコードする遺伝子のクローニングは、少なくともヒトEPCRが選択的にスプライスされ得、選択的にスプライスされた形態（sEPCR）に特有のインサートを含む短縮型可溶性EPCRを生じることを示す。これらの結果は、血漿EPCRが、細胞表面でのタンパク質分解または選択的スプライシングのいずれかによって誘導され得ることを示す。
血漿EPCRの局所濃度が、特に疾患状態において、十分に高い場合、そのデータは、短縮型可溶性血漿EPCRが、プロテインＣ活性化の膜結合EPCR増大および活性化プロテインＣの抗凝固機能を減弱させ得ることを示す。自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、SLE）および敗血症（炎症および凝固異常の両方を含む障害）の患者からのEPCRのレベルと正常EPCRを比較する実施例によって示されるように、可溶性EPCRのレベルは、炎症および異常凝固に関連する疾患状態と相関するようである。凝固、炎症、および大血管疾患を含む疾患状態を示す、可溶性EPCRの測定に基づくアッセイが記載される。単離精製された可溶性EPCR、組換え短縮型可溶性EPCR、および可溶性EPCRに対する抗体を含む、アッセイ試薬が記載される。
【図面の簡単な説明】
図１は、膜結合レセプターをタンパク質分解して細胞外ドメインを遊離しそして膜アンカーを残すこと、およびmRNAの選択的スプライシングによって、EPCRに適用されるような可溶性レセプターを産生するための２つの既知のメカニズムの概略図であり、膜結合EPCR（mEPCR）およびタンパク質分解血漿EPCR（pEPCR）に特有の配列、ならびに可溶性EPCR（sEPCR）に特有の配列を示す。
図２は、mEPCRおよびsEPCRを比較する概略図であり、ヌクレオチドインサートおよびsEPCRに特有のコードされたアミノ酸配列を示す。
図３は、選択的スプライシングによってヒト、ウシ、マウス、およびヒヒのEPCRに挿入された配列を示す。
図4aは、可溶性血漿EPCRがヒトプロテインＣおよびAPCに結合することを示すグラフである。EA.hy926細胞を、氷上で30分間０〜500nMrsEPCR（●）または血漿EPCR（○）の存在下で、60nM fl−APCと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、そして細胞結合した蛍光を、記載のようにフローサイトメトリーによって決定した。fl−APCを添加しない場合での固有の細胞蛍光を、矢印で示す。プロットした平均細胞蛍光（MCF）は、２連のMCF測定の平均を表す。
図4bおよび4cは、可溶性血漿EPCRおよびrsEPCRが、細胞表面上でプロテインＣ活性化を阻害することを示すグラフである。図4bでは、EA.hy926細胞単層を、0.1μＭプロテインＣ単独（□）、または１μＭ rsEPCR（●）、または２μg/ml 1494mAb（○）と共に、室温にて15分間プレインキュベートした。プロテインＣ活性化を、トロンビン（2nM最終）の添加によって開始し、そして反応を、所定の時間で停止した。活性化プロテインＣを、アミド分解アッセイで決定し、そして活性速度をmOD/分で各時点についてプロットした。トロンビンを添加しないコントロールウェルを含ませた（■）。各データ点は、３連のウェル測定の平均を表す。図4cでは、EA.hy926細胞単層を、0.1μＭのプロテインＣおよび示された濃度の血漿EPCR（○）またはrsEPCR（●）と共に、室温にて15分間プレインキュベートした。トロンビン（最終2nM）を添加し、そして活性化を室温にて60分間行った。上清を、アンチトロンビンおよびヘパリンの混合物に添加し、そして活性化プロテインＣ活性（mOD/分）を、アミド分解アッセイで決定した。各データ点は、３連のウェル測定の平均を表す。
図4dは、可溶性血漿EPCRがAPC抗凝固活性を阻害することを示すグラフである。APC（25nM）の抗凝固活性を、460nMの血漿EPCRまたはrsEPCRの存在下で、１段階X a凝血アッセイを用いて決定した。この効果は、いずれかの可溶性EPCRを、EPCRへのAPCの結合をブロックする、42μg/mlの1496mAbと共に、５分間プレインキュベートした場合には逆転した。データは、４〜６測定の平均±S.D.を表す。
図５は、狼瘡患者において、可溶性血漿TMのレベルを可溶性血漿PCRと比較するグラフであり、TM値とEPCR値との間に相関はないが、狼瘡患者の大多数が、可溶性血漿EPCRの非常に上昇したレベルを示すことを証明する。
図６は、sTM（正常）、sTM（敗血症）、sEPCR（正常）、およびsEPCR（敗血症）についての可溶性レセプター濃度（ng/ml）のグラフである。sTMとsEPCRとの間に相関はない（r2＝0.034）。
発明の詳細な説明
定義
内皮プロテインＣレセプター、EPCR。
可溶性、溶液中にあり、そして細胞表面に結合していない。
短縮型、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含まない；タンパク質分解または選択的スプライシングのいずれかの結果であり得る。
可溶性EPCRの検出および特徴付け；生理学的役割およびマーカーとしての有用性
EPCRの機能のこれまでの研究は、膜形態のEPCRに結合するプロテインＣが、細胞表面上のトロンビン−トロンボモジュリン複合体によりプロテインＣ活性化の促進を生じる（Stearns−Kurosawaら,1996）が、可溶性組換えEPCRはAPC抗凝固活性を阻害する（Reganら,1996）ことを見出した。これらの観察は、血漿中の可溶性トロンボモジュリン分解産物が、種々の疾患状態における内皮損傷のマーカーであるという知識と共に、可溶性循環形態のEPCRが存在するかどうか、そして存在するのであれば、プロテインＣ経路においてどういう役割を有するかという疑問に至った。
実施例は、可溶性形態のEPCRが血漿中で循環し、そして尿中に存在することを示す。健常ドナー集団において、血漿EPCRレベルは、約100ng/mlであり、そして約43,000ダルトンの単一抗原種であるようであった。血漿からの可溶性EPCRのその後の精製および機能的研究は、血漿EPCRが、インタクトな膜結合EPCRと同様な親和性で、プロテインＣおよびAPCの両方と結合し得ることを決定した。内皮細胞株を使用するインビトロ研究は、血漿EPCRが、生理学的濃度に近い濃度のプロテインＣおよびトロンビンで、プロテインＣを阻害することを示した。さらに、血漿への精製血漿EPCRの直接添加は、rsEPCRに対するモノクローナル抗体で逆転されるAPC抗凝固活性の阻害を生じた。
この精製血漿タンパク質のEPCRとの同定は、rsEPCRの特性との比較に基づいた。これらのタンパク質は両方とも、同じ群のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と反応し、同じアミノ末端配列を有し、Ca2+依存的様式で固定されたプロテインＣに結合し、そして類似の用量応答曲線でプロテインＣ活性化およびAPC抗凝固活性をブロックした。さらに、rsEPCRおよび血漿EPCRに対するプロテインＣおよびAPCの親和性は共に、インタクトな膜結合EPCRの親和性に類似する。これらの特性は、EPCRに特有であるようである。
これまでの研究は、内皮細胞で発現した膜結合EPCRが、３〜５倍の間のファクターでプロテインＣ活性化を増大することを示したが、実施例は、血漿から精製された可溶性形態のEPCRが、内皮細胞でのプロテインＣ活性化およびAPC抗凝固活性を阻害することを示す。これは、EPCRが、いくつかの方法で、プロテインＣ経路を調節し得ることを予測する。第１に、より大きな血管（ここでは、トロンボモジュリン濃度が微小循環に対して低い）において、EPCR発現は、応答して増加する（Laszikら、Circulation 1997）。免疫組織化学は、ほとんどの器官において、EPCR発現は、大血管で最も高密度であり、そして血管サイズが減少するにつれて次第に減少し、最も豊富な内皮細胞タイプである毛細管内皮ではほとんどまたは全く発現しない。EPCR発現は、循環からプロテインＣ基質を捕獲し、そして活性化のためにトロンビン−トロンボモジュリン複合体に提示することにおいて、重要な役割を果たし得る。このことは、EA.hy926内皮細胞株およびヒト臍静脈内皮細胞の両方ともが、トロンボモジュリンより、少なくとも６倍多い表面発現EPCR抗原を有するというインビトロ観察によって支持される。トロンボモジュリン濃度が高くそしてEPCRが低い微小循環では、プロテインＣ活性化にほとんど影響がないと予測される。最後に、循環可溶性EPCRは、APCの生成およびAPCが第V a因子を不活化する能力を減少させ得る。
健常個体において、可溶性EPCRレベルは、約2.5nMであり、この濃度は、Kdapp（約30nM）および循環における80nMのプロテインＣ濃度の両方よりも十分に低い。可溶性血漿EPCRの効果（APC抗凝固活性およびプロテインＣ活性化の阻害）の両方ともが、正常血漿に存在する濃度よりかなり高い濃度を必要とする。このことが、血漿EPCRの生理学的役割の疑問を、不確定のままにしている。40nMを越える可溶性EPCRレベルを有する患者が、実施例３（狼瘡）に記載のように同定された。したがって、内皮細胞表面に近い局所濃度が、全身濃度を超えるならば、可溶性EPCR濃度は、APCの生成および活性の両方を減弱するレベルに達し、血栓症の危険性に寄与する。
可溶性形態のレセプターは、膜結合レセプターのタンパク質分解的切断、または選択的スプライシングメカニズムによって産生され得る。膜表面でのタンパク質分解は、可溶性トロンボモジュリン、ならびにTNF、IL−１、IL−２、Ｍ−CSF、PDGF、およびNGFのレセプターを遊離する（Heaneyら,1996,Blood 87:847−857）。可溶性レセプターは、膜レセプターのアンタゴニストとして使用すること、リガンドを安定化すること、リガンドを媒介されたシグナリングを開始すること、膜形態のダウンモジュレーション、およびレセプターインヒビターへ結合してレセプター−リガンド活性を間接的に容易にすることを含む、多くの可能性のある機能を有する。後者のメカニズムは、両方のIL−１レセプターの可溶性イソ形態が、タンパク質分解的切断によって生成され、そしてIL−１αおよびIL−１βへの応答性を厳格に調節する、IL−１レセプター系によって使用される（Arendら,1994,J.Immunol.153:4766−4774）。以下に議論するように、膜貫通ドメインの直前で短縮された可溶性タンパク質をコードするEPCRゲノム構造は、選択的スプライシング部位を含む（FukudomeおよびEsmon,1995,J.Biol.Chem.270:5571−5577）。可溶性IL−６レセプターは、タンパク質分解メカニズムおよび選択的スプライシングメカニズムの両方によって生成されるようである（Mullbergら,1994,J.Immunol.152:4958−4968;Lustら,1992,Cytokine 4:96−100;Horiuchiら,1994,Eur.J.Immunol.24:1945−1948）。この切断部位はまた、MorrisseyおよびEsmonへの米国特許第5,298,599号（その教示は本明細書に援用される）に記載のように、短縮型EPCR、続いて直ぐペプチド配列（抗体はこの配列に対して特異的に指向する）をコードする発現ベクターを構築することによって、大量の可溶性EPCRを回収することにおいて有用であり得る。次いで、エピトープは、患者への投与の前または後に、タンパク質分解によって切断される。Hoppらへの米国特許第4,782,137号もまた参照。
免疫組織化学研究は、EPCRが、主として大血管の内皮に位置し、そして毛細血管ではかろうじて検出可能であることを示した。したがって、膜結合EPCRに由来する血漿EPCRは、大血管疾患プロセスのマーカーとして用い得る。血漿EPCRは、血漿トロンボモジュリンレベルとの有用な比較として用い得る。血漿トロンボモジュリンレベルは、種々の疾患状態において調整されることが示されているが、大血管および小血管の両方の疾患プロセスを反映し、ほとんどの内皮が微小血管性であるのでおそらく小血管の寄与に支配される。
EPCRのヌクレオチドおよび予測タンパク質構造分析
EPCRのcDNAは、238アミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコードすると予測され、これは、Ｎ末端に15アミノ酸のシグナル配列を含む（vonHeijne,（1986）Nucleic Acids Res.14,4683−4690）。したがって、成熟タンパク質は、223アミノ酸を含むと予測される。組換えタンパク質の直接配列決定は、成熟タンパク質がSer18で始まることを示した。配列番号２は、EPCRの予測アミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸１〜15（MLTTLLPILLLSGWA）は、von Heijne（von Heijne,1986）の方法によって決定される推定シグナル配列である。配列番号２のアミノ酸211〜236（LVLGVLVGGFIIAGVAVGIFLCTGGR）は、推定膜貫通ドメインである。可能性のあるＮ−グリコシル化部位は、配列番号２のアミノ酸47〜49、64〜66、136〜138、および172〜174に存在する。細胞外システイン残基は、配列番号２のアミノ酸17（血漿EPCRでは除去されている）、114、118、および186に存在する。23アミノ酸からなる可能性のある膜貫通領域（Engelmanら，（1986）Annu.Rev.Biophys.Chem.15,321−53）を、Ｃ末端で同定した（配列番号２のアミノ酸211で始まる）。
このタンパク質はタイプ１膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインは、４つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位および３つのCys残基を含む。グリコシル化は、Ｎ−グリカナーゼ消化によって示されるように、活性に必須ではない。細胞質領域は、３アミノ酸のみを含み、そしてCysで終結し、パルミトイル化されている。末端システインが適切にパルミトイル化されてない場合、タンパク質は分泌され得る。EPCRの配列を変化させて、このシステインを別のアミノ酸と置換することにより、膜結合する代わりに分泌される、本質的に完全長のEPCRを作成する手段が提供される。
本明細書で使用される場合、レセプターをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示される配列、およびストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする、その保存的置換、付加、または欠失を有する配列を含む。本明細書で使用される場合、レセプターを構成するアミノ酸配列は、配列番号２に示される配列、および機能的に等価な生物学的活性を有するレセプターを形成する、その保存的置換、付加、または欠失を有する配列を含む。何が、保存的置換、付加、または欠失を構成し、そしてどれが、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して機能的に等価なレセプター分子をコードまたは形成すると容易に確認され得るかは、当業者に周知である。これは、さらに、図３を参照することによって例示され、以下に議論される。
選択的スプライシング
レセプターは、特異的リガンドに結合して生理学的応答を生じることを担う細胞の、外部に曝された部分を有する、細胞膜に繋がれたタンパク質として最も頻繁に思い描かれる。多くの場合、もはや細胞に制限されないという事実にもかかわらず、頻繁にそのリガンドを確かに結合し得る、可溶性形態のレセプターが存在する。可溶性レセプターイソ形態へのリガンド結合はまた、多くの形態をとる応答を生じ得、これには、膜結合レセプター相互作用のアップモジュレーションまたはダウンモジュレーション、あるいは正常には応答性ではない細胞へリガンドを輸送することによって応答を伝達させることを含む（Heaney,MLおよびDW Golde.Soluble cytokine receptors.Blood 87:847−857,1996）。
可溶性レセプターを産生するための２つの公知のメカニズムが存在する：膜結合レセプターをタンパク質分解して、細胞外ドメインを遊離し、そして膜アンカーを残すことによるもの、およびmRNAの選択的スプライシングによるもの（図１）。後者のメカニズムは多くの形態を取り得るが、リーディングフレームがエキソン−イントロン境界により連続し、そして膜貫通アンカーをコードする配列に達する前に停止コドンで終結する場合、最も単純である。これは、膜形態に類似するが、重要な差異を有するタンパク質を生成する。これは、可溶性タンパク質として、作製され、そして分泌され、そして特有のカルボキシル末端テイルを有する。このテイルを、膜結合レセプターの形成において無視されるイントロンmRNA配列の一部を読むことによって形成した。選択的スプライシングによる可溶性レセプターの生成はまた、共に同じmRNAテンプレートを起源にするという事実にもかかわらず、膜結合レセプターとは独立して調整され得る（Heaneyら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2365−2369,1995）。
可溶性レセプターが選択的スプライシングメカニズムによって生成されることを証明するためには、ゲノム配列および関連領域のイントロン−エキソン境界を知らなければならない。生理学的応答と可溶性レセプターを関連付けて、プロテインＣ遺伝子およびプロテインＳ遺伝子の発現の間にかなり頻繁に含まれることが見られる異常なmRNAスプライシングと区別することもまた役立つ（Bergら,Blood Coag Fibrinol.7:625−631,1996）。
以下の研究および結果の詳細は、実施例に記載される。ヒト血漿は、約100ng/mlの可溶性EPCRを含む（表１）。これを、２つのモノクローナル抗体（1494mAbおよび1495mAb）および標準的技法を使用する酵素結合イムノアッセイ（ELISA）によって測定した。著しく上昇した可溶性EPCRレベルを、全身性エリテマトーデスおよび敗血症の患者で見いだした。これらのレベルは、ほとんど例外なく、大血管の表面上のみに存在する膜結合レセプターについてかなり高いようであった。これを真相正しく認識するために、トロンボモジュリン（TM）は、すべての内皮、ならびにいくつかの非血管細胞上で発現されるが、正常可溶性TMレベルは、わずかに約10〜40ng/mlである（Takanoら,Blood 76:2024−2029,1990）。可溶性TMレベルは、狼瘡の患者で上昇していたが、敗血症では上昇していなかった。重要なことには、これらの患者群において、血漿EPCRとTMレベルとの間に相関がなかったことである（それぞれ、r2＝0.028および0.034）。
血漿EPCRおよびTMレベルと高い血漿EPCR濃度との間の相関の欠如は、血漿EPCRがタンパク質分解および選択的スプライシングの両方のメカニズムを起源にするという概念に一致する。ヒトEPCRのゲノム構造は、イントロンによって分解される、４つのエキソンを含む。この配列を概観することにより、7527位にTAA停止コドンを含むエキソンIII−イントロンIII境界（5'GTで）の後のインフレームリーディング配列が明らかになる。この停止コドンは、膜貫通ドメインをコードするエキソンIVの上流にあるので、予測されるタンパク質は、特有な48残基のカルボキシル末端テイル（イントロン配列によってコードされる）を含み、そして膜貫通アンカーを含まない。
図１は、短縮型EPCRが誘導され得る２つの可能性のある方法の図である：膜貫通ドメインの直前でのタンパク質分解によるか、または選択的スプライシングによる。図２に示されるように、選択的スプライシングは、選択的にスプライスされた短縮型EPCR中にあるペプチド配列が含まれることを生じる。図３に示されるように、この配列は、種間で高度に保存されるが、わずかな差が存在し、ヒトおよびウシのEPCRについては48残基、マウスEPCRについては51残基、そしてヒヒEPCRについては22残基の新しいカルボキシル末端テイルを生じる。
レセプタータンパク質の発現についての患者サンプルのスクリーニング
患者サンプルは、EPCR、EPCR中の選択的にスプライスされたインサートに存在する特有のインサートのいずれかに対する抗体、またはコンホメーションの差に起因してEPCRまたはsEPCRのいずれかに対してより大きな親和性で結合する抗体を使用して、sEPCRまたはEPCRの存在および量について、スクリーニングされ得る。サンプルはまた、存在するタンパク質を特異的に定量するための他の標準的技法を使用して、スクリーニングされ得る。
診断的または治療的使用のための抗体の生成
EPCR、および特に、可溶性EPCR（「sEPCR」）、および組換え可溶性EPCR（「rsEPCR」）に対する抗体が生成され得、これらは、レセプタータンパク質の検出、特徴付け、または単離に有用であり、そしてほとんどの場合、リガンド結合の阻害によって、レセプタータンパク質活性を調節するために有用である。抗体は、免疫原として、ヒトまたは動物の精製または組換えレセプタータンパク質もしくはそのフラグメントを使用して、標準的技法によって生成される。
EPCRに対するモノクローナル抗体を、Esmonら,1993,Methods Enzymol.222:359−385によって他のタンパク質について記載されたように得た。1494、1495、および1496mAbと呼ばれる抗体は、組換え可溶性EPCRおよび細胞表面発現EPCRに結合するIgG1κ抗体である。1494および1496mAbは、EPCRへのプロテインＣおよびAPCの結合をブロックし、そして細胞性EPCRがトロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化を容易にする能力を阻害する。1495mAbは、EPCRへのリガンド結合をブロックせず、細胞表面プロテインＣを変化させず、そして1494または1486mAbのエピトープとは異なる結合エピトープを有する。抗体は、標準的技法、例えば、放射標識、酵素標識、フルオレセインのような蛍光標識、金粒子、染料、および抗体の検出のための他の手段を使用して標識され得る。例えば、抗体は、標準的な手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化され得る。抗体は、イムノアッセイにおける使用のための固体支持体、例えば、AffiGel−10TM、ニトロセルロース、またはマイクロタイターウェル、あるいは溶液相イムノアッセイにおける使用のための固体支持体に固定され得る。
好ましい実施態様では、EPCRは、50マイクロリットルの、15mM Na2CO3、35mM NaHCO3（pH9.6）中４マイクログラム/mlの1495mAbで４℃にて一晩コーティングしたマイクロタイタープレート（MaxisorpTM、NUNC NS,Roskilde,Denmark）を使用して測定される。室温で、次いでプレートを20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.05％Tween 20（pH7.5）（アッセイ緩衝液）で３回洗浄し、そして0.1％（wt/vol）ゼラチンを含むアッセイ緩衝液で少なくとも１時間ブロックする。次いで、ウェルを洗浄し、50マイクロリットルサンプルを３連のウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートする。ウェルを吸引し、アッセイ緩衝液で３回洗浄し、そして50マイクロリットル、２マイクログラム/mlのビオチン−1494mAbを添加する。プレートを１時間インキュベートし、３回洗浄し、そして50マイクロリットルの、0.25マイクログラム/mlのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（GIBCO BRL）を添加し、そしてさらに１時間インキュベートする。ウェルを５回洗浄し、そしてELISA増幅キット（GIBCO BRL）の基質および増幅試薬を、製造業者の指示に従って15分間隔で連続して添加する。発色を0.3M H2SO4で停止し、そして終点吸光度を、Vmaxマイクロプレートリーダーにて490mmで読み取る。３連のウェルでの標準は、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、および1mM EDTA、0.1％ゼラチン（pH7.5）中の1.5〜100ng rsEPCR/mlである。標準曲線は、1.5〜12.5ng/mlで直線であり、そしてサンプルを、直線範囲に入るように同じ緩衝液で希釈する。研究は、１〜２パーセントの間で、血漿が、アッセイの直線性にも標準曲線の感度にも影響を及ぼさないことを示す。健常ボランティアからの血漿サンプルを、1mM EDTAを含むアッセイ緩衝液で最終的に２％血漿まで希釈した。そしてEPCR抗原レベルを、同じプレート上で決定された標準曲線を参照して、３連ウェルの平均から算出する。
障害
可溶性EPCRについてのアッセイは、本明細書で議論されるような凝固および炎症状態および障害、例えば、狼瘡のような自己免疫疾患、移植モニタリング、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、心肺バイパス、不安定性アンギナ、再狭窄、血管形成（すなわち、血管疾患）、腎臓または肝臓疾患の検出および分析に有用である。例えば、EPCRは、大血管についてのマーカー、したがって大血管に対する損傷についてのマーカーである。可溶性EPCRの量の増加は、大血管傷害を示し、EPCRのタンパク質分解またはsEPCR合成の刺激のいずれかを生じる。EPCR対トロンボモジュリンの比はまた、血液または尿のいずれかのサンプルに基づいて決定され得、これは微小血管対血管の相対的な程度を示す。サイトカイン、白血球活性化マーカー、および補体因子または活性化マーカーに対するEPCRの相対量もまた、疾患状態を示すために使用され得る。
EPCRは内皮細胞上に存在するので、内皮細胞損傷のマーカーとして有用である。これは、薬物の効果（毒性および効力の両方）の指標として使用され得る。例えば、狼瘡患者では、炎症性／凝固媒介性大血管傷害を効果的に最小にする薬物は、EPCRレベルの減少を生じる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解される。
実施例1:ヒト血漿における機能的内皮プロテインＣレセプターの同定
以下の略号を使用する:rsEPCR、膜貫通ドメインおよびサイトゾルテイルの代わりに挿入されたHPC4エピトープを有する組換え可溶性EPCR;mAb、モノクローナル抗体;SDS−PAGE、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動。
方法
材料。以下の試薬を示された供給業者から購入した：
ブタ腸粘膜ヘパリン、ジイソプロピルフルオロリン酸、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ウシ血清アルブミン、Sigma（St.Lois,MO）;Spectrozyme PCa、American Diagnostica（Greenwich,CT）;ELISA増幅キット、GibcoBRL（Gaithersburg,MD）;AffiGel−10、BioRad（Hercules,CA）；ハンクス平衡化塩溶液、３−（Ｎ−モルホリン）プロパン硫酸（MOPS）、Fisher Scientific（Fair Lawn,NJ）。すべての他の試薬は、市販の最高品質なものであった。
タンパク質。ヒトプロテインＣ（Esmonら,1993,Methods Enzymol.222:359−385）、ウシトロンビン（Owenら,1974,J.BIol.Chem.249:594−605）、およびウシアンチトロンビン（Esmon 1977「Factors regulating the inhibition of thrombin by antithrombin III.In Chemistry and Biology of Thrombin」R.L.Lundblad,J.W.Fenton,II,およびK.G.Mann編Ann Arbor Science,Ann Arbor.403−411）を、記載のように精製した。組換え可溶性EPCR、rsEPCRは、膜貫通ドメインの直前の残基210で短縮されたEPCRの細胞外ドメイン、続くHPC4モノクローナル抗体におけるカルシウム依存的イムノアフィニティー精製を可能にする12残基配列からなる（Takahashiら,1992;Stearnsら,1988,J.Biol.Chem.263:826−832）。rsEPCRの構築、精製、およびプロテインC/APC結合特性（Fukudomeら,1996）。ヤギ免疫前血清およびrsEPCRに対するヤギポリクローナル抗血清を調製し、そしてIgGを精製した（Fukudomeら,1996）。ヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体を、標準的手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。
モノクローナル抗体。rsEPCRに対するモノクローナル抗体（mAb）を、他のタンパク質について記載されたように得た（Esmonら,1993）。1494、1495、および1496mAbは、rsEPCRおよび細胞表面発現EPCRに結合するIgG1κ抗体である。1494および1496mAbは、EPCRへのプロテインＣおよびAPCの結合をブロックし、そして細胞性EPCRがトロンビン−トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣ活性化を容易にする能力を阻害する（Stearns−Kurosawaら,1996）。1495mAbは、EPCRへのリガンド結合をブロックせず、細胞表面プロテインＣ活性化を変化させず、そして1494または1496mAbのエピトープとは異なる結合エピトープを有する。1494および1495mAbを、標準的手順を使用して、ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでビオチン化した。1494mAbを、血漿EPCRのイムノアフィニティー精製のために、製造業者の指示に従って、AffiGel−10にカップリングした。抗EPCR mAbのスクリーニングを、Stearns−Kurosawaら（1996）;Fukudomeら（1996）に記載の方法を使用して行った。
凝血アッセイ。１段階第X a因子凝血アッセイにおけるAPC（25nM）抗凝固活性に対するrsEPCRまたは精製血漿EPCRの効果を、83μg/mlの1496mAb（APC−EPCR相互作用をブロックする抗体）の存在または非存在下で行った（Reganら,1996）。可溶性EPCRおよび1496mAbを、アッセイ前15分間プレインキュベートした。
細胞培養。すべてのヒト細胞株を、以前に記載されたように維持した（Fukudomeら,1996）。EA.hy926細胞（形質転換されたヒト内皮細胞株;Edgellら,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）80:3734−3737）は、Cora−Jean Edgell（University of North Carolina at Chapel Hill）が好意により提供した。
フローサイトメトリー分析。蛍光プローブとして用いるために、APCを、記載されるように（FukudomeおよびEsmon、1994;Bock,P.E.1988.Biochemistry 27:6633−6639）、フルオレセインで活性部位（fl−APC）において標識した。EA.hy926細胞へのAPC結合に対するrsEPCRまたは血漿EPCRの効果を、フローサイトメトリーによって研究した（Fukudomeら,1996）。手短には、収集された細胞を、漸増する濃度のいずれかの可溶性EPCR調製物の非存在下または存在下において、60nMのfl−APCとともに、氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、そして細胞に結合した蛍光を、フローサイトメトリーによって１サンプルごとに10,000事象を計数して測定した。全てのアッセイを、１％のウシ血清アルブミン、3mM CaCl2、0.6mM MgCl2、および0.02％アジ化ナトリウムを補充したハンクス平衡化塩溶液において行った。
細胞表面プロテインＣ活性化。EA.hy926細胞を96ウェル組織培養ディッシュにおいて培養した（Stearns−Kurosawaら、1996）。コンフルエントな単層を、１％（w/v）のウシ血清アルブミン、3mM CaCl2、0.6mM MgCl2、および0.02％アジ化ナトリウムを補充したハンクス平衡化塩溶液を用いて、３回洗浄した。全てのアッセイを、室温において、同一の緩衝液中で、60μｌの最終容量にて行った。そして、全てのタンパク質濃度は、アッセイにおける最終濃度を示す。プロテインＣ（0.1μＭ）を、示された濃度のrsEPCR、血漿EPCR、または1494mAbの非存在下または存在下で添加し、細胞とともに15分間プレインキュベートした。トロンビンを混合液に添加して（2nM）、活性化反応を開始した。示された時間に、50μｌのアリコートを取り出し、そして96ウェルマイクロタイタープレート中の10μｌのアンチトロンビン（0.7μＭ最終）およびヘパリン（5U/ml最終）に添加した。APCアミド分解活性をSpectrozyme PCa基質（0.2mM）の添加によって測定し、405nmでの吸光度の変化速度（mOD/分）をVmaxキネティックマイクロプレートリーダー（Molecular Devices,Menlo Park,CA）で測定した。すべてのアッセイ点は、３連ウェルにおいて行われ、そして十分に活性化されたプロテインＣ対mOD/分の標準曲線を参照することにより決定される場合、プロテインＣ基質の10％未満が活性化された。
血漿および血清の収集。健常な成人ボランティア（女性12人および男性10人）から、3.8％緩衝化クエン酸溶液中かまたは抗凝固剤を含まないチューブ中に、静脈穿刺によって全血を収集した（Vacutainer tube;Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）。年齢、食餌、または他の変数に関するドナーのスクリーニングは試みなかった。全てのボランティアに研究についての情報を開示し、彼らから書面による同意を得た。血液を、1160×ｇで10分間遠心分離した。血漿および血清を等分し、アッセイまで−80℃で冷凍保存した。
血漿EPCRの定量のためのELISA。血漿におけるEPCR抗原の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイを開発した。マイクロタイタープレート（Maxisorp;Nunc,Roskilde,Denmark）を、50μｌの、15mM Na2CO3、35mM NaHCO3（pH9.6）中４μg/mlの1495mAbを用いて、４℃にて一晩コートした。以下の工程を室温で行った。ウェルを、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.05％Tween20（pH7.5）（アッセイ緩衝液）で３回洗浄し、0.1％（w/v）ゼラチンを含有するアッセイ緩衝液で少なくとも１時間ブロックした。ウェルを洗浄し、50μｌのサンプルを３連のウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートした。ウェルを吸引して、アッセイ緩衝液で３回洗浄し、50μｌの２μg/mlビオチン−1494mAbを添加した。プレートを１時間インキュベートし、３回洗浄し、50μｌの0.25μg/mlストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（GibcoBRL）を添加し、さらに１時間インキュベートした。ウェルを５回洗浄し、ELISA増幅キット（GibcoBRL）の基質および増幅試薬を、製造業者の指示に従い、15分の間隔で連続的に添加した。発色を0.3M H2SO4を用いて停止し、490nmの終点吸光度をVmaxマイクロプレートリーダーで読み取った。各プレートは、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％ゼラチン（pH7.5）中1.5〜100ng/mlのrsEPCRの標準を３連のウェルに含んだ。標準曲線は、1.5〜12.5ng/mlで直線であり（ｒ＝0.99）、そして血漿サンプルを直線範囲に入るように同じ緩衝液で希釈した。予備的な実験により、最終濃度１〜２％のヒト血漿は、標準曲線の直線性にも感度にも影響しないことを実証した。健常ボランティア由来の血漿サンプルを、1mMEDTAを含有するアッセイ緩衝液で、最終的に２％血漿に希釈し、そしてEPCR抗原レベルを、同一プレート上で決定された標準曲線を参照して、３連ウェルの平均から算出した。
コーティング抗体と検出抗体を逆にし（1494mAbをコーティングに；ビオチン−1495mAbを検出に）、そして抗体結合を、Blue Phos基質（KPL Laboratories;Gaithersburg,MD）で検出する、別のアッセイを開発した。この方法を使用して、敗血症患者における血漿EPCRをアッセイした。このアッセイは、おそらく親和性の差異のために、より高感度であったが、両アッセイとも、定性的には、同様の結果を与えた。
ウエスタンブロット。血漿または血清サンプルのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を、10％アクリルアミドゲルを、Laemmli緩衝液系（Nature 227:680−685）と共に用いて、非還元条件下で標準的な手順を用いて行った。ゲルをポリビニリデン膜（PVDF;Millipore,Bedford,MA）に転写し、膜をブロックし、次に免疫前ヤギIgG（50μg/ml）か、またはヤギ抗rsEPCRポリクローナルIgG（50μg/ml）のいずれかと30分間インキュベートした。洗浄後、膜を1:20,000希釈のマウス抗ヤギIgG−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Pierce,Rockford,IL）と30分間インキュベートした。膜を洗浄し、結合した抗体−酵素結合体を増強化学発光基質（Pierce）で製造業者の指示に従って検出した。
免疫吸着。健常ボランティアからの血清またはクエン酸処理血漿サンプル（400μｌ）を、AffiGel−10に結合させた50μｌの1495mAb（5mg IgG/ml樹脂）とともに、混合しながら４℃にて一晩インキュベートした。サンプルを遠心分離し、上清を除去し、そして樹脂を1mlの20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.5）で３回洗浄した。最終20mM ジチオスレイトールを含有するSDS−PAGEサンプル緩衝液を、洗浄した樹脂に添加し、サンプルを３分間沸騰し、そしてSDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングのために処理した。膜を４μg/mlのビオチン化ヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体でプローブし、そして結合抗体をストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体（Pierce）および増強化学発光検出系で検出した。予備的実験により、室温にて１〜４時間の、100μｌのTris不活化AffiGel−10樹脂でのサンプルの事前吸着、続く1495mAb−AffiGel−10での一晩の免疫吸着が、同一のウエスタンブロットの結果を与えることが決定された。
血漿EPCRの精製。血漿EPCRを、イオン交換クロマトグラフィー、抗rsEPCR mAbイムノアフィニティークロマトグラフィー、およびプロテインＣ親和性カラムでのクロマトグラフィーの組み合わせを用いて、ヒトクエン酸処理血漿（Oklahoma Blood Institute）から精製した。わずかに異なる方法で２つの調製を行った。
第１の調製において、血漿（1L）を等量の20mM Tris−HCl（pH7.5）、10mMベンズアミド、400単位のヘパリンナトリウムで希釈し、そして1gの膨潤前のQAE樹脂でバッチ吸着した。沈澱後、樹脂をプロテインＣの精製のために処理した（Esmonら、1993）。固体硫酸アンモニウムを上清に４℃にて40％飽和まで添加し、遠心分離し、そしてさらなる硫酸アンモニウムをその上清に70％飽和に達するまで添加した。遠心分離後、柔らかなペレットを透析バッグに入れ、12Lの20mM Tris−HCl、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.4）に対し一晩透析した。透析物を、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.4）で平衡化した。1496mAb−AffiGel−10イムノアフィニティーカラム（6ml樹脂;5mg IgG/ml樹脂）にかけた。カラムを、12mlを超える同じ緩衝液で洗浄し、20mM Tris−HCl（pH7.4）中の50％（v/v）エチレングリコールで溶出した（Jun Xu、未発表の観察）。溶出物からのピーク画分をプールし（0.37の全OD280）、濃縮し（Centriprep30、Millipore）、そして緩衝液を20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、3mM CaCl2、0.6mMMgCl2、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.4）に交換した。この物質をプロテインＣアフィニティーカラムにかけた。このカラムは、同じ緩衝液においてHPC4−AffiGel−10カラム（5mg IgG/ml樹脂;0.9×8cm）に精製プロテインＣ（3mg）をかけることにより事前に調製した。HPC4mAbは、カルシウム依存的様式でプロテインＣ活性化領域に結合し（Esmonら、1993;Stearnsら、1988）、その後のプロテインＣへのEPCRの結合を妨げない。血漿EPCRを含有するサンプルをカラムにかけた後、カラムを約12mlの緩衝液で洗浄し、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、5mM EDTA、10mM MOPS、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.5）で溶出した。画分を、280nmでの吸光度について、そして上記のELISAを用いてEPCR抗原についてモニターした。プロテインＣおよび血漿EPCRの両方を含有する溶出物を、FPLC（Pharmacia−LKB、Uppsala、Sweden）MonoQカラムにかけ、カラムを20mM Tris−HCl（pH7.5）中の0.1〜1M NaClの直線勾配で展開した。約半分の血漿EPCRは、MonoQカラムに結合せず、半分は、約0.2M NaClに溶出し、そしてプロテインＣは、約0.5M NaClに溶出した。血漿EPCRの両方のイオン種は、還元条件下または非還元条件下での銀染色、クマシーBB染色、またはPVDF膜への転写後の金染色（Pierce）を用いるSDS−PAGE、およびビオチン−ポリクローナル抗rsEPCR抗体プローブでのウエスタンブロットで、同一のようであった。
血漿EPCRの第２の調製は、4Lの血漿を用いて開始し、機能研究に十分なタンパク質を精製した。この場合、1496−AffiGel−10樹脂（20mlの5mg IgG/ml樹脂）を、10mMベンズアミジン、1mMジイソプロピルフルオロホスフェートおよび0.5単位/mlのヘパリンナトリウム（最終濃度）と共に、クエン酸処理血漿に、直接添加した。血漿を、穏やかに混合しながら、４℃にて一晩バッチ吸着した。樹脂の沈澱後、上清をプロテインＣ精製のために処理した（Esmonら、1993）。樹脂を2.5×30cmのカラムに充填し、20mM Tris−HCl、0.1M NaCl、0.02％アジ化ナトリウム（pH7.4）で、十分に洗浄し、そして20mM Tris−HCl（pH7.4）中50％のエチレングリコールで溶出した。溶出物をプールし、濃縮し（5.5の全OD280）、MonoQカラムにかけ、２つのイオン種（素通り、および0.2M NaCl溶出ピーク）を、1496−AffiGel−10樹脂（1.5×11cm）に再びかけた。カラムを前のとおりに、50％エチレングリコールで溶出した。溶出物（0.71 OD）を濃縮し、緩衝液を、Cetriprep30を含む。20mM Tris−HCl、0.1MNaCl、3mM CaCl2、0.6mM MgCl2、0.02％アジ化ナトリウムに交換した。次に、この物質をアフィニティーカラムにかけた。ここで、プロテインＣ（2.9mg）を、同じ緩衝液中で、HPC2−AffiGel−10カラム（0.6×17cm）に最初にかけた。HPC2mAbは、プロテインＣのセリンプロテアーゼドメインに結合し、EPCR結合を妨げない（Fukudomeら、1996）。結合したEPCRを、5mM EDTAを含有する緩衝液で溶出した。混入している血清アミロイドＰ（プロテインＣサンプル由来）を、FPLC MonoQカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって除去した。サンプルを0.2M NaCl中でカラムにかけ、その結果、血漿EPCRは結合せず、そして0.4〜0.5M NaClにおいて溶出する混入物から分離された。得られる精製血漿EPCR（0.193 OD280）は、銀染色を用いるSDS−PAGE、およびポリクローナル抗体rsEPCRを用いるウエスタンブロットにより、均質のようであった。この物質を機能研究およびアミノ末端配列分析に使用した。
タンパク質配列決定。可溶性血漿EPCRのアミノ末端配列分析を、Molecular Biology Research Facility、W.K.Warren Medical Research Institute（Oklahoma City）のKenneth Jackson博士の研究室において行った。アミノ酸を標準の１文字コードによって表す。
結果
第１のアプローチとして、３人の健常ボランティア由来の血漿および血清サンプルを希釈し（４％v/v）、非還元条件下で10％SDS−PAGEゲルで泳動し、そしてrsEPCRに対して惹起したヤギポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロットのために処理した。健常ボランティア由来の血漿および血清サンプル（４％v/v）を非還元条件下の10％ゲルでのSDS−PAGEのために処理し、膜に転写し、そして膜をヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体でプローブした。結果をrsEPCR（0.2ng）と比較した。結合した抗体を、マウス抗ヤギIgGおよび増強化学発光検出系で検出した。２人の健常ボランティア由来の血漿サンプルを1495 AffiGel−10樹脂で免疫吸着した。洗浄した樹脂を溶出させ、そして還元条件下でのSDS−PAGEのために処理した。ウエスタンブロッティングを、ビオチン−ヤギ抗rsEPCRをプローブとして使用して行った。
血漿EPCRの純度を、銀染色したSDS−PAGE 10％ゲル、およびビオチン−ヤギ抗rsEPCRでプローブした膜のウエスタンブロットから決定した（還元および非還元）。膜をポリクローナル抗体でプローブした後、血清および血漿サンプルの両方で、約43,000Daの単一のバンドが現れる。検出されたタンパク質のサイズは、rsEPCRよりわずかに大きいようである。検出された他のバンドは、免疫前IgGおよびより長い暴露時間でのプロービングより判断すると、IgGのバックグラウンド結合であった。AffiGel−10樹脂と結合した抗EPCR 1495mAbと共に血漿サンプルを一晩インキュベートすること、続く洗浄および還元条件下での結合抗原の溶出は、ビオチン−ヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体でのウエスタンブロットにより検出される単一バンドを生じた。
mAb 1495をコーティング抗体として使用するELISAによる、健常ボランティア由来の血漿における可溶性EPCR抗原の測定は、女性（ｎ＝12）では91.1＋／−24.5ng/mlの抗原レベル、そして男性（ｎ＝10）では107.2＋／−30.2ng/mlの抗原レベルを見出した。ともに計算する場合、平均血漿EPCR抗原レベルは、98.4＋／−27.8ng/mlであった。男性の値は、トロンボモジュリンと同様に（Quehenbergerら、Thromb.Haemost.76:792−734）、女性の値よりわずかに高いようであるが、研究した集団は、統計学的分析にはあまりに限定されており、そしてこの研究は、性別、年齢、食餌または他の変数に起因する差異を評価するためには設計されていなかった。
血漿EPCRは、約100ng/mlの単一種であるようであるので、血漿EPCRは、循環EPCRが、プロテインＣおよびAPCに結合し得るか否かを決定するために重要になった。可溶性EPCRを、イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウムでの沈降、および実験手順において記載されるような抗EPCR 1496mAb−AffiGel−10カラムクロマトグラフィーによる免疫吸着の組み合わせによって、ヒト血漿から精製した。
3mM CaCl2、0.6mM MgCl2を含む緩衝液中で抗プロテインCHPC4mAb−AffiGel−10カラムにプロテインＣ（3mg）を適用することによって調製したプロテインＣアフィニティーカラムに、この血漿EPCR（約110μｇ）を適用した。カラムを洗浄し、そして血漿EPCRを画分19に適用した。カラムを洗浄し、そして画分35で開始する5mM EDTAを含む緩衝液で溶出した。それらの画分について、280nmでの吸光度およびEPCR抗原を決定した。EPCR抗原を、ELISAによって決定した。
適用した血漿EPCR抗原の98％以上が、プロテインＣアフィニティーカラムに結合した。吸光度プロフィールは、この抗体へのプロテインＣ結合のカルシウム依存性と一致して、抗体カラムからのEPCRおよびプロテインＣの同時溶出を示す（Stearnsら、1988）。
機能研究および構造研究のために十分なタンパク質を精製するために、類似しているがわずかに改変した手順を用いて、4Lの血漿からEPCRを精製した。プロテインＣ−抗体アフィニティーカラムからの溶出後、タンパク質を夾雑する残渣を、FPLC Mono Ｑカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによって取り出した。得られた血漿EPCRの調製物は、銀染色を用いるSDS−PAGE 10％ゲルで均質のようであり、そして同一の結果が、ビオチン−ヤギ抗rsEPCRポリクローナル抗体でプローブしたウェスタンブロットに関して、還元条件下および非還元条件下の両方で得られた。精製されたタンパク質のアミノ末端配列分析は、唯一の配列Ｓ−Ｑ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｄ（この配列は、組換え可溶性EPCRのアミノ末端配列に同一である：配列番号２）を生じた。これは、天然の供給源からのEPCRの最初のアミノ末端配列決定である。
血漿EPCRの、APCに結合する能力を、競合研究によって評価した。この競合研究において、血漿EPCRを、APCについて細胞性EPCRと競合させ、そして細胞性EPCRに結合し得る得られた遊離のAPCを、フローサイトメトリーによって評価した（図4a）。活性部位においてフルオレセインで標識したAPC（fl−APC）を、血漿EPCRまたはrsEPCRのいずれかの、存在下または非存在下で、EA.hy926細胞とともにインキュベートした。細胞へのAPC結合の阻害についてのEPCR濃度依存性は、EPCRの両方の可溶性形態について類似であった。この観察は、APCに結合することについての血漿EPCRの親和力が、rsEPCR−APC結合相互作用について以前に決定された親和力（Kdapp約30nM）に類似することを示す。
rsEPCRは、可溶性系においてプロテインＣ活性化に対してほとんど効果を有さないが（Reganら、1996）、膜結合EPCRは、細胞表面上での活性化を促進する、非常に強力な能力を有する（Stearns−Kurosawaら、1996）。プロテインＣおよびAPCに結合し得るEPCRの循環形態の存在を示す最新のデータは、血漿EPCRが、プロテインＣの細胞表面活性化を変更する能力を有することを示唆した。EA.hy926細胞上でのほぼ生理学的レベルのプロテインＣ（0.1μＭ）のトロンビン依存性活性化は、過剰なrsEPCRによって、図4bによって示されるように、ほぼ、EPCR−プロテインＣ結合相互作用をブロックする抗rsEPCR 1494mAbを用いて観察されたプロテインＣのレベルにまで阻害された。以前の研究は、rsEPCRが小さな合成基質を使用するAPCアミド分解活性（amidolyticactivity）に対する効果を有さないことを実証した（Reganら、1996）。血漿EPCRは、図4cに示されるように、rsEPCRと比較してEA.hy926細胞上の細胞表面プロテインＣ活性化を阻害する能力においてわずかにより有効であった。
１段X a因子凝固アッセイにおいて、精製された血漿および可溶性組換えEPCRは、同様に凝固時間のAPC延長を阻害した（図4d）。rsEPCRによるAPC抗凝固活性の阻害が、以前に観察されている（Reganら、1996）。予測されるように、1496mAbは、APC−血漿EPCR結合相互作用をブロックすることによって、この効果を逆転した。
実施例2:尿における可溶性EPCRの検出
可溶性EPCRが尿中に存在するかどうかという疑問を検討するために、４つの尿サンプル（朝一番の排尿）を回収し、そしてウェスタンブロッティングおよびELISAによって可溶性EPCRの存在について分析した。
希釈していない小児の尿サンプルを、４％の正常な血漿および組換え可溶性EPCR（1ng）と比較した。サンプルを、ビオチン−ヤギ−抗rsEPCRおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ検出系とともにインキュベートした。
ウェスタンブロットは、ａ）可溶性EPCRが尿中に存在すること、およびｂ）可溶性EPCR抗原が、血漿中で観察されるサイズと類似のサイズで存在することを示す。明らかな分解は観察されない。ELISAによって定量される、４つのサンプル中の可溶性EPCRの量は、40.3、6.1、35.6、および90.1ng/mlであった。
実施例3:狼瘡患者由来の血漿EPCRの測定
正常なヒト血漿EPCR濃度は、上記のように約100ng/ml（98.4±27.8ng/ml;2.5nM）である。エリテマトーデスに罹患した患者由来のサンプルのパネル（ｎ＝54）をアッセイし、そして可溶性EPCRレベルが、検出不能レベルから1,700ng/ml以上までの範囲であることを見出した。15人の患者は、200ng/ml以上の可溶性EPCRレベルを有した。
以前の研究は、内皮損傷に起因する、狼瘡患者における上昇した可溶性血漿TMレベルを示し、そして最新の狼瘡患者サンプルを、参照として血漿TMについてアッセイした。それらの可溶性TMレベルが、図５によって示されるように、それらの可溶性EPCRレベルと完全に相関を有さないことが見出された。このことは、可溶性血漿EPCRの供給源が、単に、ランダムに損傷を受けた内皮由来ではないことを示唆する重要な観察である。TMとは対照的に、ヒトおよび霊長類における膜結合EPCR発現は大きな脈管の内皮に主に制限され、毛細管はほとんどEPCRを発現しない。EPCRの特有の局在化は、大きな脈管の血栓症を予防するために、局所的にプロテインＣ活性化を増大すると予測される。大きな脈管への膜結合EPCRの主な局在化は、可溶性血漿EPCR濃度によって予測され得る大きな脈管における標的化された血栓症の危険を示す。
実施例4:敗血症性ショック患者における血漿可溶性EPCR
敗血症（accp/sccm consensus conference,chest 1992;101:1644−1655）は、以下の臨床的発現のうちの１つより多くを含むが、それらに限定されない。感染に対する全身性炎症応答として定義される：
１）38℃以上または36℃未満の体温；
２）１分あたり90拍以上の心拍数；
３）以下によって示される頻呼吸：
ａ）１分あたり20呼吸以上の呼吸率；
ｂ）32mmHg未満のPaCO2の過度呼吸；
４）12,000/mm3以上もしくは4,000/mm3未満のWBCカウント、または10％以上の未熟好中球（バンド）の存在。
サンプルを、器官機能不全、低灌流（hypoperfusion）、または低血圧と関連する敗血症によって規定されるような、重篤な敗血症を伴うか、または伴わない、手術後の合併症を有する患者から得た。灌流異常は、乳酸アシドーシス、尿量過少、または精神状態における急性変化を含み得る。敗血症性ショックは、十分な流体（fluid）蘇生、および心臓性ショックの非存在にもかかわらず、24時間以上の間、血管作用薬を必要とする低血圧を伴う敗血症をいう。
本研究において含まれるすべての患者は、以下の診断基準を満たした：
ａ）呼吸の指示（24時間以上の制御された換気）およびまたは血流力学的支持（５マイクログラム/Kg/分以上の強心薬、ドパミン、もしくはドブタミン、および／または血管作用性アミン、エピネフリン、もしくはノルエピネフリンの要求）を必要とする、敗血症および／または手術後の合併症に起因する、集中治療室への入室；
ｂ）18歳〜75歳の間の年齢；
ｃ）70％未満の抗トロンビン活性（局所にて試験される）。
患者が、多くの外傷、肝硬変、または急性肝不全、末期ガン、免疫不全、白血病、妊娠、またはヘパリン治療を有する場合、その患者を除外した。
患者の血液サンプルを、時間０（集中治療室ICUへの入室）の時点および抗トロンビンII（AT III）または偽薬での処置後２日目および６日目に採取した。血漿可溶性EPCRおよび可溶性トロンボモジュリン（TM）を、時間０のサンプルに関してのみアッセイした。
sEPCR:
正常:133.4±53.4ng/ml（平均±標準偏差）
敗血症:224.9±74.5ng/ml
平均間の有意な差あり、Ｐ＝0.00009
sTM:
正常:35.5±20.4ng/ml（平均±標準偏差）
敗血症:39.9±73.1ng/ml
平均間の有意な差なし、Ｐ＝0.81
血漿中のsEPCRレベルとsTMレベルとの相関関係なし、r2＝0.34。
これらの結果を、図６にグラフで示す。狼瘡患者と同様に、敗血症に罹患した患者は、可溶性TMレベルと相関せず、血漿EPCRレベルにおいて非常に顕著な上昇を示す。
可溶性血漿EPCRが、プロテインＣ活性化および活性化したプロテインＣ抗凝固活性の両方を阻害するという観察によって、これらの患者における上昇した血漿EPCRレベルが、さらなる血栓の危険性を引き起こし、そして脈管損傷／応答の証拠を表すことが示される。これらが示す状態の例は、内皮細胞刺激、アテローム発生、白血球接着、およびプラークの破裂に関連する障害を含む。
実施例5:ヒヒ組織およびヒト組織におけるEPCRの選択的スプライシング形態の同定
可溶性EPCRイソ型が、選択的スプライシング機構によって生成され得るか否かを決定するための最初のアプローチとして、RNAを、ヒト組織およびヒヒ組織から単離し、そして逆転写酵素−PCR（RT−PCR）を遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。ヒヒEPCRゲノム配列は公知ではないが、ヒヒとヒトとは進化のスケールにおいて密接に関連しているという論理に基づいて、ヒト配列に基づくプライマーを使用した。
一般にRT−PCR手順において、総RNAをホモジナイズした組織から単離する。RNAを、特定のアンチセンスプライマー、ヌクレオチド、および逆転写酵素と混合する。混合において、RNAは、逆転写酵素についての鋳型として作用し、第１鎖cDNAを作製する。次いで、この新しいcDNA鋳型を、特定のプライマーおよびTaqポリメラーゼを用いて従来のPCRによって増幅する。EPCRの膜形態（424bp）および推定の選択的スプライシング産物（674bp）の両方を増幅するプライマーを選択した。EPCRの両方の形態に対応する産物を、種々のヒヒ組織（図４）ならびにヒトの肺および胎盤から増幅した。逆転写酵素を含まないコントロール、および組織との反応における1,885bpのバンドの欠失によって判断されるように、ゲノムDNAに関する可能性のある夾雑は存在しないようであった。
ヒヒゲノムDNA配列が、選択的スプライシングのための適切なエキソン−イントロン境界およびイントロン−インフレームルーディング配列を有することを確認するために、ヒヒ腎臓ゲノムDNA由来のイントロン配列を、従来のPCRによって増幅した。ゲノム構造は種間で保持されるという前提を立て、そしてイントロンIIIに隣接するプライマー（ヒト配列）を使用した。これは、選択的スプライシング配列を含むと考えられるイントロン（ヒト配列）である。ヒヒ腎臓組織をホモジナイズし、そしてDNAを抽出した。DNAを、特定のプライマーと混合し、そして産物をPCRによって増幅した。DNA産物を精製し、そしてアガロースゲルで電気泳動した。
手順の詳細：
A.EPCR ELISA:被覆する抗体は、EPCRのリガンド結合ドメインに結合する1494mAbである。検出する抗体は、ビオチン化1495mAbであり、これはプロテインC/APC結合をブロックせず、そして1494mAbと交差反応しない。検出系は、ストレプトアジビン−アルカリホスファターゼおよびBluePhos基質（KPL製）である。
B.組織のRT−PCR:組織（50〜100mg）をTrizol（Gibco BRL）中にホモジナイズした。RNAを含む上層を、クロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、洗浄し、そしてDEPC−水中に溶解した。RNA（１〜５μｇ）を、適切な緩衝液中で、製造業者の指示書に従って、ヌクレオチド、CREAアンチセンスプライマー、および逆転写酵素と混合した（第１鎖cDNA合成のためのSuperscriptTM Preamplification system,Gibco BRL）。cDNA産物を、CRESおよびCREAプライマーを用いて、従来のPCRによって、30サイクル増幅した。cDNA産物を、標準的な手順を用いて、クロロホルム抽出およびアルコール沈殿によって精製し、水中に溶解し、そして２％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルを、Vistra Green（Amersham）で染色し、そしてリン光画像機（phosphoimager）（StormTM scanner,Molecular Dynamics,Inc.）で画像化した。
C.ヒヒゲノムDNAのPCR:ヒヒ腎臓DNA（82mg）を、Trizol試薬中にホモジナイズした。DNAを含む下層を、抽出し、沈殿させ、そして滅菌水中に溶解した。DNAを、緩衝液、ヌクレオチド、ならびにHRT−１およびHRT−２プライマーとの混合液中で、従来のPCRによって、30サイクル増幅した。増幅したDNAを、標準的な手順を用いて、抽出し、沈殿させ、滅菌水中に溶解し、そして２％アガロースゲルで電気泳動した。単一のバンド（465bp）を、エチジウムブロミドで可視化し、切り出し、そしてPCR産物を、製造業者の指示書（Qiagen）に従ってスピンカラムで精製した。PCR産物を、同じプライマーを用いて配列決定した。
D.プライマー配列：
ゲルから切り出され、精製され、そして配列決定された腎臓ゲノムDNAから増幅された単一のバンドが存在した。その配列は、ヒト配列に対して92％同一であり、そしてエキソン−イントロン境界は保存された。このイントロン配列における高レベルの類似性は重要である。なぜなら、イントロン配列は、代表的には種間において十分には保存されないからである。終止コドンを有するイントロン内のインフレームリーディング配列もまた存在し、このことは、ヒヒの選択的にスプライシングした可溶性タンパク質中の特有の22残基のカルボキシル末端テイルを予測する。
推定の可溶性EPCRイソ型が、特有のカルボキシル末端テイルを有するという観察は、イソ型特異的抗体を使用するイソ型間の区別のための構造的差異を提供する。実用モデルとしては、タンパク質分解された可溶性EPCRの血漿レベルが内皮損傷を報告する一方で、選択的スプライシングを受けた可溶性EPCRのレベルが刺激に対する内皮応答を報告するというものである。可溶性EPCRイソ型の相対的血漿レベルが、特定の病理学における大きな脈管の内皮機能不全および損傷に関する情報を提供することが期待される。
ヒト組織に関する結果：
ヒト組織（胎盤、肺、および舌）由来のRT−PCR産物を、EPCRに特異的なCRES/CREAプライマーを用いて電気泳動した。手順は、ヒヒ組織について使用された手順と同じであった。EPCRの膜イソ型（mEPCR）および選択的スプライシングを受けた可溶性EPCRイソ型（sEPCR）に対応する産物を観察した。産物は、ヒヒ組織を用いて観察された産物と本質的に同じようである。唯一の差異は、胎盤組織がさらなる産物を有するようであることである。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション
（ii）発明の名称：可溶性内皮細胞プロテインC/活性化プロテインＣレセプターを使用する診断アッセイ
（iii）配列数:8
（iv）連絡住所：
（Ａ）住所：パトレア エル．パブスト
（Ｂ）番地：ウエスト ピーチツリー ストリート 1201
ワン アトランティック センター 2800
（Ｃ）市：アトランタ
（Ｄ）州：ジョージア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号:30309−3450
（ｖ）コンピューター読み出し形態：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用
（Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース＃1.0,バージョン＃1.25
（viii）代理人／事務所情報：
（Ａ）名称：パブスト，パトレア エル．
（Ｂ）登録番号:31,284
（Ｃ）照会／記録番号:OMRF168
（ix）通信情報：
（Ａ）電話：（404）873−8794
（Ｂ）テレファックス：（404）873−8795
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1032塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..1302
（Ｃ）他の情報:/記＝「ヌクレオチド25〜738は、配列番号２の内皮細胞タンパク質レセプターをコードする。」
（xi）配列：配列番号1:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:238アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..365
（Ｃ）他の情報:/記：「配列番号１のヌクレオチド１〜1302によりコードされる内皮細胞タンパク質レセプター」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:modified−site
（Ｂ）存在位置:1..15
（Ｃ）他の情報:/記：「アミノ酸１〜15は推定のシグナル配列を表わす」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Domain
（Ｂ）存在位置:211..236
（Ｃ）他の情報:/記：「アミノ酸211〜236は推定の膜貫通ドメインを表わす」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Active−site
（Ｂ）存在位置:47..174
（Ｃ）他の情報:/記：「アミノ酸47〜49、64〜66、136〜138、および172〜174は、可能性のあるＮ−グリコシル化部位を表わす」
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Active−site
（Ｂ）存在位置:Cys 17
（Ｃ）他の情報:/記：アミノ酸切断部位の直前
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Active−site
（Ｂ）存在位置:Gly 201
（Ｃ）他の情報:/記：選択的にスプライシングされたEPCR中のペプチドインサート
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:17..186
（Ｃ）他の情報:/記：「アミノ酸17、114、118、および186は、細胞外システイン残基を表わす」
（xi）配列：配列番号2:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:48アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（xi）配列：配列番号3:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:148塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（xi）配列：配列番号4:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..24
（Ｃ）他の情報:/記：「エキソンIIの末端付近の5'センスプライマー」
（xi）配列：配列番号5:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:24塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..24
（Ｄ）他の情報:/記：「エキソンIV内の3'アンチセンスプライマー」
（xi）配列：配列番号6:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:22塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..22
（Ｄ）他の情報:/記：「エキソンIIIの末端付近の5'センスプライマー」
（xi）配列：配列番号7:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル配列:NO
（iv）アンチセンス:NO
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表わす記号:misc_feature
（Ｂ）存在位置:1..29
（Ｄ）他の情報:/記：「エキソンIVの3'アンチセンスプライマー」
（xi）配列：配列番号8:
Claims (10)
- テストされる患者由来のサンプル中に天然に存在する可溶性内皮プロテインＣレセプターを検出するためのアッセイであって、
該テストされる患者由来のサンプルを提供する工程；および
該サンプル中に天然に存在する可溶性内皮プロテインＣレセプターの量を測定する工程、
を包含する、アッセイ。 - 前記サンプルが、尿、血漿、血清、組織サンプル、および間質液からなる群より選択される、請求項１に記載のアッセイ。
- 可溶性内皮プロテインＣレセプターの量を較正標準と相関させる工程をさらに包含する、請求項１に記載のアッセイ。
- 前記患者が、凝固および炎症の状態ならびに障害、内皮に対する損傷に関連する障害または疾患、ならびに大血管疾患からなる群より選択される障害または疾患を有する、請求項１に記載のアッセイ。
- 前記障害または疾患が、自己免疫疾患、移植、敗血症、ショック、子癇前症、糖尿病、血管疾患、腎臓疾患、および肝臓疾患からなる群より選択される、請求項４に記載のアッセイ。
- 前記血管疾患が、心肺バイパス、不安定性アンギナ、再狭窄、および血管形成からなる群より選択される、請求項５に記載のアッセイ。
- 大血管に対する損傷を検出するための、請求項１に記載のアッセイ。
- テストされる患者由来のサンプル中に天然に存在する可溶性内皮プロテインＣレセプターを検出するためのキットであって、該キットは、該サンプル中の天然に存在する可溶性内皮プロテインＣレセプターの量を測定するための手段を備える、キット。
- 膜貫通ドメインを含まない内皮プロテインＣレセプターに対する親和性より、膜貫通ドメインを含む内皮プロテインＣレセプターに対する方が、親和性がより高い、モノクローナル抗体。
- 選択的にスプライスされた内皮プロテインＣレセプターにおけるインサートと免疫反応性である、モノクローナル抗体。
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