KR20210028668A - 리포좀을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약 - Google Patents

Abstract

제조 로트 차이가 작은 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약을 제공한다. 상기 시약은 상기 리포솜의 351nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이 상기 리포솜 전체 누적 적산값의 0 % 이상 35 % 미만이다.

Description

리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약

본 발명은 리포솜(リポソ-ム, Liposome)을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약에 관한 것이다.

임상 검사 중에서, 혈액응고인자의 활성에 기인하는 병태를 검사하는 혈액응고능력의 검사는 일반적으로 행해지고 있는 검사이다. 그들 중에서, 인지질로 이루어진 이중층막인 리포솜을 함유하는 검사 방법이 이용되고 있다. 활성화부분 트롬보플라스틴(トロンボプラスチン) 시간(APTT) 측정, 프로트롬빈(プロトロンビン)시간 (PT) 측정, 이들을 이용한 응고인자 정량검사, 복합인자 측정, 응고억제제(凝固阻害劑)의 정량검사 등을 들 수 있다.

리포솜은 생체 유래의 인지질로 구성된 이중층막이다. 리포솜은 의약품용 제제(製劑), 화장품 재료, 체외 진단약 재료, 약물 전달 시스템 등에 응용되고 있다.

혈액응고반응은 복수의 응고인자의 케스케이드에 의해 달성되는데, 그 반응의 대부분이 인지질의 막 표면 상에서 진행한다. 인지질의 친수기 부분은 응고인자와 결합하는데 포스파티딜세린(ホスファチジルセリン, PS) 또는 포스파티딜글리세로오스(ホスファチジルグリセロ-ス, PG)와 같은 음성 전하가 중요하다. 한편, 인지질의 지방산 측쇄에 기인하는 인지질 막의 유동성도 응고 반응에 크게 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 유동성을 크게 하는 불포화 지방산을 함유하는 리포솜 쪽이, 활성이 높은 것으로 알려져 있다.

생리적 지혈은, 상해 부위에 누출된 조직인자(TF)와 활성화 제VII인자의 결합에 의해서 개시되는 외인계와, TF비의존적으로 개시되는 내인계 응고계가 있으며, 출혈이나 병적 혈전 형성은 외인계에 의한 것으로 생각되고 있다. APTT는 이 반응을 시험관 내에서 재현하는 것이며, 피검 혈장에 시약을 첨가하고 각 응고인자의 활성화에 의해 생산한 트롬빈이 피브리노겐을 피브린으로 전화(轉化)할 때까지의 시간을 측정한다. APTT는 내인계 (제XII, XI, IX, VIII, X, V, II인자, 피브리노겐) 이상(異常)을 검출한다. APTT 이상시의 정밀 검사인 내인계 응고인자 활성 정량(定量), 후천성 혈우병 및 루프스안티코어그랜트(ル-プスアンチコアグラント)의 검색, 감별검사인 크로스믹싱(クロスミキシング)시험, 또는 헤파린 투여의 모니터링에도 이용된다.

APTT에 요구되는 성능으로서, 혈액응고인자, 헤파린 등의 항응고약에 대해서 감수성이 높은 것을 들 수 있으나, APTT는 응고시간의 절대값으로 진단하는 것이 필요한 항목이기 때문에, 일반적인 검량선을 작성하여 진단용의 값을 구하는 항목에 비해서, 제조 로트(製造 ロット) 간 차이가 나타나기 쉽기 때문에, 특히 시약의 제조 로트 간 차이가 작은 시약이, 임상에 매우 선호되는 성능이다.

APTT의 제조 로트 간 차이에 대해서는 지금까지도 다양한 검토가 실시되고 있다. 기존의 APTT 시약에서는, 대두 등 천연 유래 인지질을 추출하고, 이를 이용하여 APTT 시약을 조제하여 왔지만, 인지질을 천연유래로부터 합성품으로 함으로써, 균일한 인지질을 얻을 수 있어서, 제조 로트 간 차이의 감소에 기여하고 있다 (비허문헌 1). 그러나 제조 로트 간 차이가 완전히 없어진 것은 아니고, 임상상의 요구에 부응하기 위해서는, 아직도 개선의 여지가 있다고 할 수 있다.

예를 들어, 특허문헌 1에는, 0.6μm의 폴리카보네이트로 만들어진 멤브레인으로 여과하여 리포솜의 입자 지름을 균일화시키고, 리포솜 함유액을 얻는 것을 기술한다. 이것은, 조직인자의 합성 리포솜으로의 재구성을 실시하기 전의 작업이며, 또한 동결 건조하기 전의 조작이기 때문에, 최종 제품에 대해 폴리카보네이트 막으로 여과하여 입자 지름을 균일화시킨 효과가 나타나고 있다고 생각하기 어렵다. 또한 특허문헌 1에 나타난 효과는, 동결 건조 전후의 프로트롬빈 시간의 측정값의 변동(차이)을 억제하는 것에 대한 것이어서, 제조 로트 마다 응고 시간의 절대값은 제어되지 않는다.

[특허문헌 １] 특개 2017-181265 공보　

[비특허 문헌 1] 오전창홍(奧田昌弘), 국천기홍(菊川紀弘), 상촌팔심(上村八尋),「합성 인지질을 이용한 신규 APTT시약의 개발」, 일본검사혈액학회잡지, 2002년 02월 28일, 제 3권, 제 1호, p. 124-131, 별쇄

본 발명은 이러한 문제를 감안하여 이루어진 것이며, 제조 로트간 차이가 작은, 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 상기와 같은 과제를 감안하여 예의 검토를 거듭한 결과, 종래의 예상과 반대로 리포솜의 입경에 의존하여, 로트(ロット) 간의 변동 계수가 크게 변화한다고 하는 의외의 결과를 발견했다. 본 발명은 이 발견을 바탕으로 리포솜의 입경을 상기 리포솜의 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체 누적 적산값의 0 % 이상 35 % 미만으로 제어함으로써, 제조 로트 차이가 작은, 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약의 제조에 성공했다.

즉, 본 발명은,

[1] 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정용 시약에 있어서, 상기 리포솜의 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체의 누적 적산값의 0 ％이상 35 ％미만인, 액상 혈액응고능력 측정용 시약,

[2] 상기 시약이, 활성화부분 트롬보플라스틴시간, 프로트롬빈시간 측정시약, 복합인자 측정시약, 특정인자활성 측정시약, 또는 혈액응고인자억제제 측정시약인, [1]의 시약,

[3] (공정 A)：인지질을 혼합하는 공정; (공정 B): 혼합된 인지질을 수용액에 분산함에 의해 리포솜을 형성하는하는 공정； 및（공정 C): 상기 리포솜으로부터, 리포솜 입경조정수단을 이용하여, 리포솜의 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체의 누적 적산값의 0 ％ 이상 35 ％ 미만인, 균일한 리포솜을 조제하는 공정을 포함하는, 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약의 제조 방법,

[4] 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약의 제조 로트 간 차이의 저감 방법에 있어서, 상기 리포솜의 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체의 누적 적산값의 0 ％ 이상 35 ％ 미만인, 액상 혈액응고능력측정용 시약의 제조 로트 간 차이의 저감 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라, 인지질을 함유하고 그리고 인지질이 리포솜을 형성하는 혈액응고능력 측정시약에서, 제조 로트 간 차이가 감소함에 의해 정밀도가 높은 혈액응고능력 측정이 가능해진다고 하는 현저한 효과가 있다.

도 １은 리포솜1(실시예 ２)과 리포솜2(비교예 1)의 입도 분포를 보여주는 그래프이다.
도 ２는 도 1에 나타난 리포솜1(실시예 ２)의 누적 산란강도 분포를 나타내는 그래프이다.
도 ３은 도 1에 나타난 리포솜2(비교예 １)의 누적 산란강도 분포를 보여주는그래프이다.
도 ４는 APTT시약《실시예 ２》과 APTT시약《비교예 1》을 이용한 ATPP측정을 행하여, 각 로트에서의 변동 계수(CV값)를 산출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 ５는 리포솜3(실시예 ５)과 리포솜4 (비교예 ２)의 입도 분포를 보여주는 그래프이다.
도 ６은 도 ５에 나타난 리포솜3(실시예 ５)의 누적 산란강도 분포를 보여주는그래프이다.
도 ７은 도 5에 나타난 리포솜4(비교예 ２)의 누적 산란강도 분포를 보여주는그래프이다.
도 ８은 APTT시약《실시예 ５》과 APTT시약《비교예 ２》을 이용한 ATPP 측정을 행하여, 각 로트의 변동 계수(CV값)를 산출한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 ９는 리포솜5(비교예 ３)의 입도 분포를 보여주는 그래프이다.
도 10은 도 9에 나타난 리포솜5(비교예 3)의 누적 산란강도 분포를 보여주는 그래프이다.

(리포솜）

본 발명에서 사용가능한 리포솜은, 상기 리포솜의 입경을 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체의 누적 적산값의 0 % 이상 35 ％ 미만으로 조제하는 것 이외는, 공지의 방법에 따라서 조제할 수 있다.

리포솜의 제작 방법으로서는, 예들 들면,

공정 A：인지질을 혼합하는 공정,

공정 B：혼합된 인지질 혼합액을 수용액에 분산함에 의해서 리포솜을 형성하는 공정,

공정 C：상기 리포솜을 분산시킨 인지질 혼합액으로부터, 리포솜 입경조정 형성수단을 이용하여, 균일한 리포솜을 조제하는 공정을 포함한다.

공정 A로서는, 예를 들어, 인지질을 혼합하여 제작할 수 있고, 바람직하게는, 인지질을 혼합하고 지용성 항산화제를 첨가하거나, 지용성 항산화제 존재하에서 인지질을 혼합하여 제작할 수 있다(지용성 항산화제 첨가 인지질 혼합물). 인지질은 천연 유래 인지질여도 좋고 합성 인지질여도 좋다. 당업자라면 공지된 인지질에서 적절히 선택하여 사용할 수 있지만, 식물 또는 동물 유래의 인지질 외에, 합성 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨(ホスファチジルイノシト-ル) 및 포스파티딜글리세롤 등 중에서 적절히 선택 조합한 것도 사용할 수 있다. 또한 이러한 인지질의 지방산 측쇄는 불포화 지방산을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 인지질 혼합물은 공지의 방법으로 제작할 수 있다.

예를 들어, 인지질을 클로로포름 등의 유기 용매에 용해시킨 것에, 부틸히드록시톨루엔, α-토코페롤 등의 지용성 항산화제를 0.01 ~ 5.0 % 추가한 것을 조제한 후, 유기 용매를 제거하여 혼합된 인지질 박막을 형성하는 것을 들 수 있다.

공정 B로서는, 상기 인지질 박막에 수용액을 가하여 분산시켜서 리포솜을 형성하는 방법을 들 수 있다. 예들 들면, 수용액으로서는, 완충액(HEPES, TRIS, PBS등)을 들 수 있고, 적절하게, 단백질 등 고분자를 포함해도 좋다.

공정 C로서는, 공지의 리포솜 입경조정 수단을 적절히 선택하여, 본 발명에서 사용할 수 있는 균일한 리포솜을 조제하는 것을 들 수 있다. 리포솜 입경조정 수단으로서는, 본 발명에서 사용할 수 있는 리포솜의 입경으로 할 수 있으면 어떤 수단을 사용해도 좋지만, 예를 들어 필터의 투과 처리, 초음파 처리 등을 들 수 있다. 소재, 막 눈금(膜目)의 크기, 강도, 시간, 공간 등 원하는 입자 크기에 맞게 당업자라면 적절히 선택하여 실시할 수 있다.

필터의 투과 처리로는, 폴리카보네이트 막, 셀룰로오스아세테이트 막 등을 사용하는 것을 들 수 있다. 초음파 처리로는 프로브형 초음파 발생 장치 및 버스형 초음파 발생 장치 등을 사용하는 것을 들 수 있다. 필터 처리 쪽이, 간편하게 준비할 수 있기 때문에 바람직하다.

본 발명에서 사용가능한 리포솜의 입경(粒經)은, 상기 리포솜의 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체의 누적 적산값의 0 % 이상 35 % 미만, 바람직하게는 0 % 이상 30 % 미만, 더욱 바람직하게는 0 % 이상 25 % 미만, 더욱더 바람직하게는 0 % 이상 20 % 미만, 특히 바람직하게는 0 % 이상 15 % 미만을 들 수 있다.

또한, 최소 입경은, 발판으로서 리포솜이 기능하는 크기이면 제한이 없으나, 당업자라면 적절히 선택하여 조제할 수 있다. 또한, 바람직하게는 53 nm로부터 상기 최소 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 전체 누적 적산값의 0 % 이상 54 % 미만, 바람직하게는 0 % 이상 50 % 미만, 더욱 바람직하게는 0 % 이상 40 % 미만, 더욱 바람직하게는 0 % 이상 30 % 미만, 특히 바람직하게는 0 % 이상 20 % 미만을 들 수 있다.

또한, 바람직하게는 최대 입경이 650 nm 이하이고, 보다 바람직하게는 최대 입경이 600 nm 이하이며, 더욱 바람직하게는 최대 입경이 50 nm ~ 600 nm, 더욱 바람직하게는 최대 입경이 100 ~ 400 nm를 들 수 있다. 최소 입경이 0 nm 이상이며, 바람직하게는 최소 입경이 10 nm 이상, 보다 바람직하게는 최소 입경이 20 nm 이상 50 nm 이하, 더욱 바람직하게는 30 nm 이상 66 nm 미만을 들 수 있다.

본 발명에서 실시가능한 혈액응고능력 측정시약의 제조 방법으로는, 리포솜의 입자 크기를 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이 상기 리포솜 전체 누적 적산값의 0 % 이상 35 % 미만으로 조제하는 것을 제외하고는 공지의 혈액응고능력 측정시약의 제조 방법에 따라 실시할 수 있다. 후술하는 실시예에 나타난 바와 같이, 리포솜의 입자 크기를 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이 상기 리포솜 전체 누적 적산값의 0 % 이상 35 % 미만으로 조제하여 제조 로트 간 차이를 줄일 수 있기 때문에 바람직하다.

또한, 리포솜의 입경은, 리포솜만의 입경으로 측정되어도 좋고, 다른 첨가제가 부가된 상태에서의 리포솜의 입경으로 측정되어도 좋다. 첨가제의 예로서, APTT에서의 활성화제를 들 수 있다.

(조직인자）

본 발명에서 사용가능한 조직인자는, 당업자라면 공지의 조직인자에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 천연형 조직인자 혹은 재조합 조직인자의 어떤 것도 적용되지만, 재조합 조직인자가 바람직하다. 재조합 조직인자로는, 인간 또는 동물의 조직인자의 유전자 배열을 통합한 바이러스를 감염시킨 곤충 세포, 유전자 재조합 대장균 또는 효모 등의 숙주에 의해 생산시킨 것을 사용할 수 있다. 재조합 조직인자는 공지의 방법에 따라 제작할 수 있는데, 예를 들면, 숙주 내에 발현된 조직인자는 막 관통형 단백질에서 간단한 수용매에는 불용성이기 때문에, 계면활성제를 포함한 완충액에서 발현 세포를 파괴 추출하여 분리하고, 또한, 분리된 조직인자는 크로마토그래피 등의 조작에 의해 정제할 수 있다.

(리포화트롬보플라스틴(リポ化トロンボプラスチン))

본 발명에서 사용가능한 리포화트롬보플라스틴은, 예를 들면, 조직인자 용액과 리포솜을 함유하는 지용성 항산화제 첨가 인지질 혼합물로 구성된다（지용성 항산화제 첨가 리포화트롬보플라스틴). 상기 리포화트롬보플라스틴은, 당업자라면 공지의 리포화트롬보플라스틴의 제작법으로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, "조직인자 용액"과 "리포솜을 함유하는 지용성 항산화제 첨가 인지질 혼합물"을 몰비로 약 1:1000 ~ 1:500000의 비율로 혼합하여, 균일한 용액으로 하는 것을 들 수 있다. 상기 조직인자 용액은, 조직인자와 리포솜을 함유하는 지용성 항산화제 첨가 인지질 혼합물을 용해시키기에 충분한 계면활성제를 포함하는 완충액이며, 그 중에 보호 단백질로서, 혈청 알부민, 글로불린 등을 포함시킬 수도 있다. 조직인자 용액과 리포솜을 함유하는 지용성 항산화제 첨가 인지질 혼합물을 충분히 혼합 용해한 후, 계면활성제를 제거함으로써 인지질에 의한 리포솜이 형성하는 동시에 조직인자의 막 관통 부분이 인지질 막에 취입되는 결과, 지용성 항산화제 첨가 리포화트롬보플라스틴이 조제된다. 계면활성제의 제거 방법은 공지의 투석법이나 흡착 수지를 이용하는 방법이 적용될 수 있다.

（액상 혈액응고능력 측정시약 및 측정방법）

본 발명에서 사용 가능한 액상 혈액응고능력 측정시약으로서는, 리포솜을 함유하는 혈액응고능력 측정시약을 액상시약으로서 조제한 것이면 어떤 것도 좋으며, 예를 들면, 활성화부분 트롬보플라스틴시간 측정시약, 프로트롬빈시간 측정시약, 복합인자 측정시약, 특정인자활성 측정시약, 또는 혈액응고인자억제제 측정시약을 들 수 있다. 당업자라면, 공지의 정보를 사용하여, 적절하게 해당 시약을 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 액상 혈액응고능력 측정시약 및 측정방법의 실시 형태로서는, １시약계, 또는 ２시약계 등의 복수의 시약으로 이루어진 제제(製劑)도 좋다. 구체적으로는, 활성화부분 트롬보플라스틴시간 측정시약으로서 제공하는 경우에는, 시약의 반응 주성분인 리포솜 및 콜로이달실리카나 에라진(エラジン)산으로 대표되는 활성화제 및 응고 제IV 인자인 칼슘 이온을 혼합한 1시약계의 제제로서 제공할수 있을 뿐만 아니라, 보다 장기의 저장 안정성을 갖는 제제로서, 리포솜 및 활성화제와 칼슘 화합물의 수용액을 분리시킨 2시약계의 제제로서도 제공할 수도 있다.

또는, PT 측정시약을 액상시약으로 제공하는 경우에는, 예를 들어, 시약의 반응 주성분인 리포화트롬보플라스틴 (응고 제III 인자) 및 응고 제IV 인자인 칼슘 이온을 혼합한 1시약계의 제제로서 제공할뿐만 아니라, 보다 장기의 저장 안정성을 갖는 제제로서, 리포화트롬보플라스틴과 칼슘 화합물의 수용액을 분리시킨 2시약계의 제제로서도 제공할 수 도 있다.

본 발명의 액상 혈액응고능력 측정시약 및 측정방법의 제1 실시 형태로는, 활성화부분 트롬보플라스틴시간 측정시약으로 이용하는 것을 들 수 있다. 구체적으로는, 상기 활성화부분 트롬보플라스틴시간 측정시약은 리포솜 및 콜로이달실리카와 에라진산으로 대표되는 활성제에, 혈액응고 활성을 발현할 수 있는 농도의 칼슘 이온을 첨가함으로써 제공된다. 그 시약에는 방부제, pH 완충제, PT 측정에 영향을 미치는 항응고 작용 물질의 영향을 회피하기 위한 첨가제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 액상 혈액응고능력 측정시약 및 측정방법의 제2 실시 형태로서는, PT 측정시약으로 이용하는 것을 들 수 있다. 구체적으로는, 상기 PT 측정시약은 리포화트롬보플라스틴에 혈액응고활성을 발현할 수 있는 농도의 칼슘 이온을 첨가함으로써 제공된다. 그 시약에는 방부제, pH 완충제, PT 측정에 영향을 미치는 항응고 작용물질의 영향을 회피하기 위한 첨가제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 액상 혈액응고능력 측정시약 및 측정방법의 제 3 실시형태로서는, 상기 PT 측정시약과 동일하게 구성하고, 응고인자 (제II 인자, 제V 인자, 제VII 인자 및 제X 인자) 중, 제V 인자를 제외한 혈장(결핍 혈장: 즉, 응고 인자로서는, 제II 인자, 제VII 인자 및 제X 인자를 함유)과 혼합하여, 제II 인자, 제VII 인자 및 제X 인자의 활성을 검사하는 복합인자 측정시약으로도 사용하는 것을 들 수 있다.

제3의 액상 혈액응고능력 측정시약은, 상기 PT 측정시약과 상기 결핍 혈장을 따로 마련한 2시약계로서 구성할 수 있으며, 상기 PT 측정시약과 상기 결핍 혈장을 혼합하여 마련한 1시약계로 구성할 수도 있다. 2시약계의 예로는, 제1 시약을 PT 측정시약, 제2 시약을 결핍 혈장으로 하여, 검체를 제1 시약과 반응시키고, 다음 결핍 혈장과 반응시켜 측정하는 것을 들 수 있다. 1시약계의 예로는, PT 측정시약과 결핍 혈장을 혼합한 시약을 구성하고, 시료를 반응시켜 측정하는 것을 들 수 있다. 당업자라면 어느 시약 구성을 취하거나 적절히 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 액상 혈액응고능력 측정시약 및 측정방법의 제4 실시 형태로는, 상기 PT 측정시약과 동일하게 구성하고, 응고인자 (제II 인자, 제V 인자, 제VII 인자 및 제X 인자) 중 어느 하나의 인자를 결핍시킨 인자 결핍 혈장과 함께, 특정 인자 활성을 검사하는 특정인자활성 측정시약으로도 사용하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 제VII 인자의 결핍 혈장 (즉, 응고 인자로서는, 제II 인자, 제V 인자 및 제X 인자를 함유)과 PT 측정시약을 결합하여, 피험검체의 제VII 인자의 활성을 측정할 수 있다. 또한 제II 인자의 결핍 혈장 (즉, 응고 인자로는 제V 인자, 제VII 인자 및 제X 인자를 함유)과 PT 측정시약을 결합하여, 피험검체의 제II 인자의 활성을 측정할 수 있다. 또한 제X 인자의 결핍 혈장 (즉, 응고 인자로는 제II 인자, 제V 인자 및 제VII 인자를 함유)과 PT 측정시약을 결합하여 피험검체의 제X 인자의 활성을 측정할 수 있다.

제4의 액상 혈액응고능력 측정시약은, 상기 PT 측정시약과 상기 결핍 혈장을 따로 마련한 2시약계로로 구성할 수 있으며, 상기 PT 측정시약과 상기 결핍 혈장을 혼합하여 마련한 1시약계로 구성할 수도 있다. 2시약계의 예로는, 제1 시약을 결핍 혈장, 제2 시약을 PT 측정시약으로 하고, 검체를 제1 시약과 반응시키고, 다음 결핍 혈장과 반응시켜 측정하는 것을 들 수 있다. 1시약계의 예로는, PT 측정시약과 결핍 혈장을 혼합한 시약을 구성하고, 검체를 반응시켜 측정하는 것을 들 수 있다. 당업자라면 어느 시약 구성을 취하거나 적절히 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 액상 혈액응고능력 측정시약 및 측정방법의 제5 실시 형태로는, 대상이 되는 검체가 다른 것 이외는 제3 실시 형태와 동일하게 실시할 수 있다. 상기 PT 측정시약과 동일하게 구성하고, 혈장 중의 혈액응고인자 억제제의 존재를 검사하는 혈액응고인자 억제제 측정시약으로도 사용하는 것을 들 수 있다.

제5의 액상 혈액응고능력 측정시약은 상기 PT 측정시약과 상기 결핍 혈장을 따로 마련한 2시약계로 구성할 수 있으며, 상기 PT 측정시약과 상기 결핍 혈장을 혼합하여 마련한 1시약계로 구성할 수도 있다. 2시약계의 예로는, 제1 시약을 PT 측정시약, 제2 시약을 결핍 혈장으로 하여, 검체를 제1 시약과 반응시키고, 다음 결핍 혈장과 반응시켜 측정하는 것을 들 수 있다. 1시약계의 예로는, PT 측정시약과 결핍 혈장을 혼합한 시약을 구성하고, 검체를 반응시켜 측정하는 것을 들 수 있다. 당업자라면 어느 시약 구성을 취하거나 적절히 선택하여 실시할 수 있다.

상기의 각 인자의 활성은, 피브린형성(응고)이 관찰될 때까지의 시간(응고시간)을 평가하고, 표준 혈장에 대한 시간(%)을 평가하는 것으로 검사할 수 있다. 당업자라면, 목적에 따라 적절히 평가 방법을 선택하여 실시할 수 있다.

(피험검체）

본 발명에 사용 가능한 피험검체로는, 공지의 정보에 따라서, 예를 들어, 혈액, 혈액에서 얻은 혈장 등을 들 수 있다. 예를 들어, 피험자의 혈액에서 얻은 혈장, 대조 혈장, 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 대조 혈장으로는, 정상 혈장, 정밀 관리용 혈장(精度管理用血漿) 등을 사용할 수 있다. 정상 혈장은 정상인의 혈액에서 얻은 혈장이어도 좋고, 시판의 정상 혈장이어도 좋다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

≪실시예 １：인지질 혼합물의 조제１≫

디올레일포스파티딜콜린(ジオレイルホスファチジルコリン), 디올레일포스파티딜에탄올아민(ジオレイルホスファチジルエタノ-ルアミン) 및 디올레일포스파티딜세린(ジオレイルホスファチジルセリン)（모두 니치유(日油)로부터 구입)을 중량비로 4:3:3으로 되도록 혼합하고, 클로로포름에 용해하여 인지질 용액으로 하였다. 다음으로, 지용성 항산화제 부틸히드록시톨루엔（BHT:WAKO로부터 구입)을 인지질에 대하여 중량비로 0.05 %로 되도록 추가하고, 그 용액을 증발기에서 용매를 제거하고 건고(乾固)하여, 지용성 항산화제 첨가 인지질 혼합물로 했다.

≪실시예 ２：리포솜１의 조제≫

실시예１에서 얻은 인지질 화합물에, 완충액（10 mmol/L　HEPES, 20 mmol／L　염화나트륨　pH 7.5）를 첨가하고 교반하여, 인지질 혼합물을 완충액 중에서 분산시켰다.

분산액을 공경(孔徑) 200 nm의 폴리카보네이트 막을 10회 통과시켜 입자를 모아 정돈했다. 이 용액을 완충액 (10 mmol/L HEPES, 20 mmol/L 염화나트륨, 1 % 폴리에틸렌글리콜 pH7.5)으로 50배 희석하여 리포솜1을 제조하였다. 같은 조작을 3회 반복하여, 3로트(ロット)를 얻었다.

《비교예 １：리포솜２의 조제》

실시예１에서 얻은 인지질 혼합물에, 완충액（10 mmol/L　HEPES, 20 mmol/L　염화나트륨　pH7.5)을 첨가하고 교반하여, 인지질 혼합물을 완충액 중에 분산시켰다.

이 용액을 완충액(10 mmol/L HEPES, 20 mmol/L 염화나트륨, 1 % 폴리에틸렌글리콜 pH7.5)으로 50배 희석하여 리포솜２를 조제했다. 동일한 조작을 3회 반복하여, 3로트를 얻었다.

≪실시예 ３：리포솜의 유용성 검토１》

《입도 분포 측정１》

실시예 2 및 비교예 1에서 얻은 리포솜１과 리포솜２의 입도 분포를, 동적광산란법（오츠카 전자(大塚電子)　PHOTAL ELSZ)을 이용하여 측정했다. 결과를 도 1에 나타냈다. 리포솜１은, 187 nm에 피크를 가지며, 81 nm 이상 658 nm 이하의 리포솜으로 구성되어 있는 반면, 리포솜 2는 6580 nm에 피크를 가지며, 152 nm 이상이고 적어도 10000 nm까지의 리포솜으로 구성되어 있는 것으로 나타났다.

또한, 도 2에 리포솜 1 및 도 3에 리포솜 2의 누적 산란강도 분포를 나타냈다.

《APTT시약의 조제１》

리포솜１ 및 리포솜２에, 인지질 농도가 100 mg/mL, 콜로이달실리카가 0.05 %로 되도록 처방하고, 각각을 APTT시약 《실시예 ２》, APTT시약 《비교예 １》로 하였다.

《응고시간측정１》

APTT시약 《실시예 ２》, APTT시약 《비교예 １》을 사용하여 측정을 실시했다. 정상영역 컨트롤 혈장으로 사이트롤(サイトロ-ル) 레벨1 (SYSMEX 사) : 정상1을, 이상영역 컨트롤 혈장으로, 사이트롤 레벨2 : 이상1, 및 사이트롤 레벨3 : 이상2 (모두 SYSMEX 사)의 총 3 종류를 사용했다.

측정은 전체 임상 검사 시스템 STACIA (주식회사 LSI 메디엔스)를 사용하였다. 측정 파라미터는 검체: 50 μL, APTT시약: 50 μL, 20 mmol/L 염화칼슘 수용액 : 50 μL로 하고, 측정 파장은 660 nm로했다. 측정은 다중도 = 5에서 실시하고, 그 평균값을 APTT으로 채택하고 각 로트의 변동 계수(CV값)를 산출했다.

도 ４에 결과를 나타냈다. APTT시약《비교예２》는, APTT《비교예１》에 비해서 정상영역 및 이상영역의 어느 것이라도 3로트 간의 변동 계수가 작은 것으로 나타났다. 이 결과로부터, 입경이 큰 리포솜이 포함된 APTT 시약에서는 제조 로트 차이가 크다고 할 수 있다.

또한, 리포솜 2는 351 nm으로부터 상기 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 전체의 누적 적산값의 85 %이며, 리포솜 1의 경우에는 351 nm로부터 상기 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 전체의 누적 적산값의 15 %였다. 따라서 리포솜의 입경은, 351 nm으로부터 상기 최대 입경값까지의 누적 적산값이 상기 전체의 누적 적산값의 15 % 이상 85 % 미만이 좋은 것으로 나타났다.

《실시예 ４：인지질 혼합물의 조제２》

디올레일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜에탄올아민 및 디올레일포스파티딜세린（모두 니치유(日油)로부터 구입)을 중량비로 6:2:2으로 되도록 혼합하고, 클로로포름에 용해하여 인지질 용액으로 하였다. 그리고, 지용성 항산화제 부틸히드록시톨루엔(BHT:WAKO로부터 구입)을 인지질에 대하여 중량비로 0.05 %로 되도록 추가하고, 그 용액을 증발기에서 용매를 제거하고 건고(乾固)하여, 지용성 항산화제 첨가 인지질 혼합물로 했다.

≪실시예５：리포솜３의 조제》

실시예 ４에서 얻은 인지질 혼합물２에, 완충액(10 mmol/L HEPES, 20 mmol/L 염화나트륨　pH 7.5)을 첨가하고 교반하여, 인지질 혼합물을 완충액 중에서 분산시켰다.

분산액을 공경(孔徑) 200 nm의 폴리카보네이트 막을 10회 통과시켜 입자를 모아 정돈했다. 이 용액을 완충액 (10 mmol/L HEPES, 20 mmol/L 염화나트륨, １％　폴리에틸렌글리콜　pH 7.5)로 50배로 희석하여 리포솜３을 조제했다. 같은 조작을 3회 반복하여, 3로트(ロット)를 얻었다.

《비교예 ２：리포솜４의 조제》

실시예 ４에서 얻은 인지질 혼합물２에, 완충액 (10 mmol/L HEPES, 20 mmol/L 염화나트륨 pH 7.5)을 첨가하고 교반하여, 인지질 혼합물을 완충액 중에서 분산시켰다.

분산액을 공경(孔徑) 200 nm의 셀룰로오스아세테이트 막을 ??과시켰다. 이 용액을 완충액 (10 mmol/L HEPES, 20 mmol/L 염화나트륨, １％　폴리에틸렌글리콜　pH 7.5)로 50배 희석하여 리포솜４를 조제했다. 같은 조작을 3회 반복하여, 3로트(ロット)를 얻었다.

《실시예 ６：리포솜의 유용성 검토２》

《입도 분포 측정２》

리포솜３과 리포솜４의 입도 분포를, 동적관산란법(오츠카 전자(大塚電子)PHOTAL ELSZ)을 이용하여 측정했다. 결과를 도 5에 나타냈다. 리포솜３은, 187 nm에 피크를 가졌다. 한편 리포솜４에서는, 351 nm에 피크를 가졌다.

또한, 도６에 리포솜３ 및 도 7에 리포솜４의 누적 산란강도 분포를 나타냈다. 누적 산란강도 분포에서, 리포솜３에서는 전체 리포솜이 66 nm 이상 432 nm 이하인 것에 대하여, 리포솜４에서는 전체 리포솜이 66 nm 이상 1232 nm 이하였다.

《APTT시약의 조제２》

리포솜３ 및 리포솜４에, 인지질 농도가 100 mg/mL, 콜로이달실리카가 0.05 ％로 되도록 각각을 처방하여, APTT시약 《실시예 ５》, APTT시약 《비교예 2》로 하였다.

《응고시간측정２》

APTT시약《실시예 ５》, APTT시약《비교예 ２》을 이용하여, 정상영역２, 및 이상영역3, 이상영역４의 APTT측정을 실시했다. 정상영역 콘트롤 혈장으로서, 노멀 컨트롤 (아이엘(アイエル) 사), 이상영역 컨트롤 혈장으로서, 로우 어브노멀 컨트롤 및 하이 어브노멀 컨트롤 (아이엘 사)의 총 3 종류의 컨트롤 혈장 APTT 측정을 실시했다.

측정은 전체 임상 검사 시스템 STACIA (주식회사 LSI 메디엔스)를 사용하였다. 측정 파라미터는, 검체 : 50 μL, APTT 시약: 50 μL, 20 mmol/L 염화칼슘수용액 : 50 μL로서, 측정 파장은 660 nm로 했다. 측정은 다중도 = 3으로 실시했고, 그 평균값을 APTT으로 채택하고 각 로트의 변동 계수(CV값)를 산출했다.

도 ８에 결과를 나타냈다. APTT 《실시예 ５》는, APTT시약 《비교예 ２》에 비해서 정상영역 및 이상영역의 어느 것이어도 3로트 간의 변동계수가 작은 것으로 나타났다. 이 결과로부터, 입경이 큰 리포솜이 포함된 APTT 시약은 제조 로트 차이가 크다고 할 수 있다.

또한, 리포솜４는 상기 피크값 351 nm로부터 상기 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 전체의 누적 적산값의 35 %이며, 리포솜３의 경우에는 351 nm로부터 상기 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 전체의 누적 적산값의 0 %이었다. 따라서 351 nm로부터 상기 최대 입경값가지의 누적 적산값이, 상기 전체의 누적 적산값의 0 ％ 이상 35 ％ 미만이 좋은 것으로 나타났다.

리포솜은, 각 응고인자의 반응장을 제공하고 있으나, 반응 자체에 관여하는 것은 아니기 때문에 어느 정도의 크기를 가진 리포솜이면 그 크기에 관계없이 일정한 반응을 나타내는 것으로 생각됐다. 그러나 리포솜의 크기(입경)에 의존하여 로트 간의 변동 계수가 크게 변화하는 것은 놀라운 결과였다.

《비교예 ３：리포솜５의 조제》

실시예 ４에서 얻은 인지질 혼합물에, 10 mmol/L HEPES pH 7.5의 완충액을 첨가하고 교반하여, 인지질 혼합물을 완충액 중에 분산시켜 얻은 용액을, 프로브형 초음파 조사 (BRANSON 사 SONIFER450)로 초음파를 조사했다.

그 후, 완충액B로 50배 희석하여 리포솜5를 얻었다.

《입도 분석 측정３》

리포솜5의 입도 분포를, 동적산란법（오츠카 전자(大塚電子)　PHOTAL ELSZ)을 이용하여 측정했다. 결과를 도 9에 나타냈다. 리포솜5은, 19 nm 이상 187 nm 이하의 리포솜으로부터 구성되고, 53 nm에 피크를 가지는 것으로 나타났다.

또한, 도10에 리포솜5의 누적 산란 강도 분포를 나타냈다. 전체 리포솜 중 96 %가 123nm 이하였다.

≪APTT시약의 조제３》

리포솜５에, 인지질 농도가 100 mg/mL, 콜로이달실리카가 0.0 5%로 되도록 각각을 처방하여, APTT시약《비교예 ３》로 하였다.

《응고시간 측정３》

APTT시약《비교예 ３》을 이용하여, 정상영역２, 및 이상영역３, 이상영역４의 APTT측정을 실시했다. 정상영역 콘트롤 혈장으로서, 노멀 컨트롤 (아이엘(アイエル) 사), 이상영역 컨트롤 혈장으로서, 로우 어브노멀 컨트롤 및 하이 어브노멀 컨트롤 (아이엘 사)의 총 3 종류의 컨트롤 혈장의 APTT 측정을 실시했다.

측정은 전체 임상 검사 시스템 STACIA (주식회사 LSI 메디엔스)를 사용하였다. 측정 파라미터는, 검체 : 50μL, APTT 시약: 50μL, 20 mmol/L 염화칼슘 수용액 : 50 μL로서, 측정 파장은 660 nm로 했다. 측정은 다중도 = 3으로 실시했고, 그 평균값을 APTT으로 채택하고, 측정은 전체 임상 검사 시스템 STACIA (주식회사 LSI 메디엔스)를 사용하였다.

표 1에 응고 시간을 나타냈다. 일반적으로 APTT 시약에서는, 정상영역이 25 초에서 35 초의 응고 시간을 나타내지만, 비교예 3에서는 정상영역 컨트롤이 40 초 이상과 APTT 시약의 정상영역을 초과해버린 것으로 나타났다. 이상의 결과로부터, APTT 시약으로 사용할 수 있는 리포솜은, 너무 작은 것은 바람직하지 않은 것으로 나타났다. 또한 리포솜의 입경의 피크 값의 최소값은 54 nm 이상인 것으로 말할 수 있다.

또한, 리포솜5는 상기 피크값 53 nm로부터 상기 최소 입경값까지의 누적 적산값이 상기 전체의 누적 적산값의 54 %였다. 따라서, 53 nm으로부터 상기 최소 입경값까지의 누적 적산값이 상기 전체의 누적 적산값의 0 % 이상 54 % 미만이 좋은 것으로 나타났다.

또한 너무 작은 것이 바람직하지 않은 원인으로는, 다음과 같은 요인을 생각할 수 있다. 예를 들어, 리포솜의 입경이 작기 때문에, 리포솜이 각 응고 인자의 반응장으로 충분한 장소를 제공할 수 없기 때문에, 응고 시간이 연장한다. 또는 동일한 지질 농도로 측정하고 있기 때문에, 리포솜의 입경이 작은 경우, 리포솜의 입자 수는 많아진다. 따라서 응고 인자가 하나의 리포솜에 집적할 확률이 떨어지기 때문에 응고 시간이 연장하는 것 등을 들 수 있다.

Claims (4)

1. 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력측정용 시약에 있어서,
   상기 리포솜의 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체의 누적 적산값의 0 ％ 이상 35 ％ 미만인, 액상 혈액응고능력 측정용 시약.
2. 제1항에 있어서, 상기 시약이 활성화부분 트롬보플라스틴시간, 프로트롬빈시간 측정시약, 혼합인자 측정시약, 특정인자활성 측정시약, 또는 혈액응고인자억제제 측정시약인, 액상 혈액응고능력 측정용 시약.
3. 공정 A： 인지질을 혼합하는 공정,
   공정 B： 혼합된 인지질을 수용약에 분산시킴으로써 리포솜을 형성하는 공정, 및
   공정 C： 상기 리포솜으로부터, 리포솜 입경조정수단을 이용하여, 리포솜의 351 nm로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체의 누적 적산값의 0 ％ 이상 35 ％ 미만인, 균일한 리포솜을 조제하는 공정,
   을 포함하는, 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약의 제조방법.
4. 리포솜을 함유하는 액상 혈액응고능력 측정시약의 제조 로트 간 차이 저감방법에 있어서,
   상기 리포솜의 351 nm으로부터 최대 입경값까지의 누적 적산값이, 상기 리포솜 전체의 누적 적산값의 0 ％ 이상 35 ％ 미만인, 액상 액응고능력 측정용 시약의 제조 로트 차이의 저감방법.

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