JP5074496B2

JP5074496B2 - 血液凝固試験に関する標準／参照／対照

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Publication number: JP5074496B2
Application number: JP2009522941A
Authority: JP
Inventors: ホー，ティモシー; コール，ジェイムズ; エブラヒム，アリレーザ
Original assignee: バイオ−ラッドラボラトリーズ，インコーポレイティド
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2007-07-24
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2027-07-24
Also published as: CN101535814A; CN101535814B; AU2007281898B2; US20080032405A1; DE602007006023D1; EP2047280B1; AU2007281898A1; ATE465416T1; JP2009545751A; CA2659622C; WO2008019221A1; EP2047280A1; US7588942B2; CA2659622A1

Description

本発明は、ヒトの血液を試験するための材料及び試薬の分野に属する。

血液凝固速度を測定するための試験は、出血異常を診断し、血液凝固形成を予防するための治療又は薬剤を受けている患者の血液凝固挙動を観察するのに有用である。血液凝固は、正常な血液の可溶性成分であるフィブリノーゲンに対するトロンビンの作用によって、一連の血液凝固因子を伴う一連の反応によって引き起こされる。トロンビンそれ自体は、２つの主要な経路、外因性経路及び内因性経路によってプロトロンビンから形成され、異なる凝固試験はこれらの経路の１つ又は両方の実行可能性を測定する。外因性経路の実行可能性は、プロトロンビン時間（ＰＴ）として当該技術分野において知られている測定によって測定され、一方、内因性経路の実行可能性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）として当該技術分野において知られている測定によって測定される。それらの有する方法論によって、ＰＴ及びＡＰＴＴの両方は、各々、生じる血液凝固に必要とされる時間長の指標として利用される。

プロトロンビン時間（ＰＴ）試験は、プロトロンビン、そうでなければ第ＩＩ因子として知られている、並びに他の４つの凝固因子−第Ｉ、Ｖ、ＶＩＩ、及びＸ因子の存在及び活性の指標を提供する。１以上のこれらの因子のレベル又は活性が異常に低い場合、又はその活性が対象の血液において異常な物質によってブロックされる場合、ＰＴ値（秒で表される）は高い。あるケースでは、これは、疾患状態の指標となり、一方、他のケースでは、高い値は、治療の成功の指標となる。例えば、ある種の医療状態は、血液凝固の形成を意図的に阻止するか又は遅らせる、ヘパリン及びワルファリンなどの薬剤の投与によって治療される。例えば、ワルファリンを受けている対象についてのＰＴ値は、健常な対象で得られた結果の約１．５〜２．５倍である。このような投薬を受けていない健常な対象のＰＴ値は、約１０〜約１３秒の範囲内である。

活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）試験は、通常、対象が正常な血液凝固挙動を有することを確かめるために、外科処置前に行われる。ＰＴと同様に、ＡＰＴＴもまた、ヘパリンなどの血液の抗凝固薬の投与を、典型的には、最適用量が達成されるまで、２時間毎に試験を行い、薬物の投薬量を修正することによって観察するために使用される。正常な凝固挙動を有する対象については、ＡＴＰＰ値は、約２５〜約３９秒の範囲内にある。

様々な分析機器及び試薬は、現在、商業的な供給者からＰＴ及びＡＰＴＴ測定の両方についての臨床検査に利用可能である。このような供給者の１つは、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａＳｔａｇｏ，Ｉｎｃ．（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）であり、その製品には、ＡＰＴＴ試験用のＳＴＡ−ＰＰＴ［Ａ］（登録商標）試薬、及びＰＴ試験用のＳＴＡ（登録商標）−ＮｅｏｐｌａｓｔｉｎｅＣＩＰｌｕｓ試薬が含まれる。ＳＴＡ−ＰＰＴ［Ａ］（登録商標）試薬は、標準化された量セファリン（血小板代用物として使用される）及び微粒子活性化因子の存在下で、血漿のカルシウム再沈着を伴う試験において使用される。ＳＴＡ−ＮｅｏｐｌａｓｔｉｎｅＣＩＰｌｕｓ試薬は、カルシウムトロンボプラスチンと併用して使用される。更なる供給者は、ＨｅｍｏＳｅｎｓｅ，Ｉｎｃ．（ＳａｎＪｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）であり、そのＩＮＲａｔｉｏ（登録商標）Ｍｅｔｅｒは、ＰＴ、及び集団についての平均の正常ＰＴに対する患者ＰＴの比率であるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＮｏｒｍａｌｉｚｅｄＲａｔｉｏ（ＩＮＲ）を測定する試験装置である。ＩＮＲａｔｉｏ（登録商標）Ｍｅｔｅｒは、組換えヒトトロンボプラスチン試薬の使用によって、手掌での採血からの新鮮な毛細管血の１滴からこれらの値を得て、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換に基づいて試料の電気抵抗の変化を測定する。別の試験デバイスは、ｉ−ＳＴＡＴＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＥａｓｔＷｉｎｄｓｏｒ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）によって販売されているｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）分析機器である。このｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）機器は、トロンビンが正常に切断されてフィブリン凝固を形成し得るフィブリノーゲン上の部位に似ている連結を含む人工的なトロンビン基質を含むハンドヘルドのデバイスである。血液試料中のトロンビンは、基質の切断を引き起し、電流により検出される電気活性化合物の結果として生じる放出を引き起こす。ｉ−ＳＴＡＴ分析機器はまた、凝固カスケードの完全な活性化に要する時間である、活性化された凝固時間（ＡＣＴ）を測定するために用いることができる。ＡＣＴ測定は、動脈及び静脈血試料の分析を通じて、中程度及び高レベルのヘパリンの観察に有用である。完全な活性化は、活性化されたトロンビンの存在下でフィブリノーゲンからフィブリンの変換の結果として、広域又は局在化した凝固が形成される場合に指示される。

血液試料代用物として利用される組成物は、標準、参照、及び対照としてこれらの種々の試験と併用して日常的に使用される。これらの組成物は、機器又はデバイスの正確さ及び精度を観察し、この機器又はデバイスとともに使用される任意の試薬の条件を観察し、患者試料と他の患者試料又は固定値とを比較する点で有用である。また、試料代用物は、特定のデバイス、機器、又は手法に新規ユーザーを導入する場合にトレーニング目的で用いられる。試料代用物（本明細書では便宜上、対照と称する）を調合する目的は、直面する可能性がある分析の不一致の全てに対して、実際の患者試料と同程度に感受性のある組成物、このアッセイの医療上の決定の範囲内にある値を読む組成物を達成することである。また、最適な組成物は、調製又は再構成後の数時間又は数日間安定であるものである。他の望ましい特徴は、低コスト、製造の容易さ、１ロットから次のロットへの再現性である。

現在利用可能である１つの対照は、ＳｔａｇｏＳＴＡ−ＣｏａｇＣｏｎｔｒｏｌ（カタログＮｏ．００６７９、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａＳｔａｇｏ）であり、ポジティブレベル及びネガティブレベルを表すための、ぞれぞれ、クエン酸処理された正常及び以上なヒト血漿を含む二層の凍結乾燥した対照である。名称をＬＹＰＨＯＣＨＥＫ（登録商標）ＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＣｏｎｔｒｏｌとして販売されている三層の対照は、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ）（カタログＮｏ．７４４、７４５、及び７４６）から利用可能であり、処理されたヒトの血漿及び防腐剤から調製される。ＳｔａｇｏＳＴＡ−ＣｏａｇＣｏｎｔｒｏｌ及びＬＹＰＨＯＣＨＥＫ（登録商標）ＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎＣｏｎｔｒｏｌは赤血球材料を含まないので、これらの対照のいずれも全血凝固対照とならない。これは、任意の全血凝固試験に対する最適な対照材料、特にポイント・オブ・ケア試験用に設計されたものが、試験されるべき実際の試料に構造において類似しているものであり、赤血球及び赤血球成分を欠損することによって、血漿に基づく対照が、全血から誘導された試料に存在する主要なクラスの成分を欠損しているので不利である。安定な全血凝固対照のための製剤は、Ｓｐｅｃｋ，Ｒ．Ｅ．ら．（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、米国特許第５，９３９，３２５号（１９９９年８月１７日に発行）によって開示されている。Ｓｐｅｃｋ対照には、より不安定な霊長類由来の因子の経時的な活性のいずれかの喪失を補うために、霊長類由来の凝固因子と組み合わせて、非霊長類由来の凝固因子が含まれる。

ここでは、凝固アッセイ用の安定な全血系の対照が、全血から単離され、血小板、白血球、及び残りの血漿を取り除くために洗浄された赤血球を溶解し、この溶解物と、ヒト起源の血小板不含の緩衝化された血漿及び抗菌剤とを含むことによって調製され得る。得られる組成物は凍結乾燥され、生理食塩水で再構成される場合、再構成された対照は、開封されたバイアルと密封したバイアルの保存状態において、数時間、多くの場合においては数日間、その凝固活性を保持する。所定の対照の凝固活性は、凝固因子を枯渇している血漿、又は天然に存在しているレベルでの凝固因子を含む血漿と選択された比率でこのような血漿の組合せの使用を含む種々の手段によって、あるいは赤血球溶解物と血漿との比率を変更することによって、所望のレベルに調整可能である。

本発明に従って対照の調製に使用される赤血球は、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ヤギ、又はヒツジなどの様々な起源であり得るが、好ましくは、霊長類起源、最も好ましくはヒト起源である。赤血球は、遠心分離などの従来法によって全血から回収し得て、この回収した赤血球は、等張に緩衝化された洗浄溶液中で洗浄することによって、白血球、血小板（血小板膜成分を含む）、及び残りの血漿を含まない状態にすることができる。一度分離されると、赤血球は、従来の溶解技術によって溶解される。溶解は、赤血球の凍結、その後の解凍によって達成され得るが、この手段は必ずしも必要ではなく、好ましい方法は、凍結及び解凍以外の方法である。このような方法には、超音波処理、浸透圧衝撃、及び細胞膜を溶解する化学的処理が含まれる。浸透圧衝撃は、細胞膜が破裂され得るのに十分な時間、脱イオン水などの低張液に赤血球を懸濁させることによって達成される。化学的処理は、典型的には、膜の破裂を引き起こす洗剤又は界面活性剤に赤血球を曝露することからなる。溶解に適した洗剤及び界面活性剤の例には、ＮＰ−４０及び他のノニルフェノールエトキシレート類（ＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）、アルキルアリールポリエーテルアルコール類、例えばＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ＢＲＩＪ５８（ポリオキシエチレンセチルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（スルホベタイン型両性イオン界面活性剤）、及びドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。洗剤又は界面活性剤が使用される場合、適切な濃度は、当業者に容易に明確となる。例えば、ＮＰ−４０についての適切な濃度範囲は、約０．１重量％〜約３．０重量％である。一度溶解が起こると、溶解物から、ろ過又は遠心分離などの従来技術によって細胞残屑及び任意の他の固形物が取り除かれる。

本発明のある種の態様では、溶解物は、組成物に対する更なる対照、最終対照組成物の挙動のために、選択されたヘモグロビン濃度に調整される。ある場合には、調整は、ヘモグロビン濃度の減少を伴い、他の場合には、調整は、ヘモグロビン濃度の増加を伴う。濃度の減少は、緩衝化された生理食塩水を用いた希釈によって達成可能であり、濃度の増加は、ろ過又は透析によって達成可能である。大部分の場合、標的ヘモグロビン濃度は、約１ｇ／ｄＬ〜約２５ｇ／ｄＬ、好ましくは１ｇ／ｄＬ〜約１５ｇ／ｄＬ、最も好ましくは約１０ｇ／ｄＬ〜約１５ｇ／ｄＬの範囲である。

本発明の実施に使用される血漿は、ヒト起源であり、凝固因子を枯渇したか又は欠損した血漿が望まれる場合、このような血漿は、従来技術によって正常血漿から調製され得る。このような技術の１つは、ジエチルアミノエチル陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換である。他の適したイオン交換樹脂は、当業者に明確となる。凝固因子の枯渇の程度は、血漿のＰＴ値に関して表現することができる。このようにして、正常血漿は、約１３〜１８秒の範囲にあるＰＴ値を有し、凝固因子のレベルが減少した血漿は、約２００秒以上のＰＴ値を有する場合がある。

本発明の実施に使用される血漿は、血小板不含であり、最終の組成物は、血小板の膜成分を欠いている。用語「血小板不含」及び「欠いている」とは、本明細書中で使用するとき、これらの材料を完全に欠いている血漿及び組成物、並びにごく少量の血小板物質を含むものを含み、ここで、この量は、非常に少ないため、このような材料の存在の効果は、仮にそれらが完全に存在しないものと同程度である。血小板不含の血漿は、適切なろ過、当業者に知られているろ過手段を用いることによって容易に得られる。さらに、溶解前の赤血球は、血小板物質を除くために、十分な回数、洗浄され得て、赤血球が遠心分離によって白血球から分離される場合、淡黄色の被覆が、血小板物質除去の更なる確実性のために再懸濁及び溶解前に、パックされた赤血球から除去することができる。赤血球の場合、赤血球が白血球、血小板、及び残った血漿を含まないという制限は、同じように解釈されることが意図される。

本発明の対照のｐＨは、好ましくは、血漿へのバッファーの添加によって、約６．５〜約７．５の範囲で維持される。この範囲に調整することができる従来の緩衝剤を使用することができる。例としては、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、カコジル酸塩、コハク酸塩、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）、クエン酸塩、マレイン酸塩、ヒスチジン、ｂｉｓ−ｔｒｉｓ（２−ｂｉｓ（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、リン酸塩、エタノールアミン、ＡＤＡ（Ｎ−（カルバモイルメチル）イミノジ酢酸）、カルボン酸塩、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、イミダゾール、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（２−ヒドロキシエチル）タウリン）、ＭＯＰＳ（３−モルホリノパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ−ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、トリエタノールアミン、ピロリン酸塩、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、及びＰＯＰＳＯ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））が挙げられる。

本発明の組成物の抗菌成分として、種々の従来の抗菌剤を使用することができる。例としては、シプロフロキサシン、アンホテリシンＢ、アミカシン、クロラムフェニコール、アジ化ナトリウム、及び安息香酸ナトリウムが挙げられる。抗菌剤の最適な量は、抗菌作用を有するが、そうでなければ、組成物の成分の活性と干渉しない任意の量である。大部分の場合、最良の結果は、約３ｍｇ／ｍＬ（ｍｇ抗菌剤／１リットルの全組成物）〜約１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／Ｌの範囲にある量で達成される。一般に、適切な量は、抗菌剤により変化し、任意の特定の抗菌剤に対しては、これらの試薬及びそれらの使用に精通している当業者に明確となる。

種々の凝固試験において特別な値を生じる組成物は、溶解物と血漿の比率を変更させるか、特に種々の凝固因子のレベルの観点で血漿の組成を変更させるか、又はその両方によって達成される。血漿における凝固因子のレベルは、所望の濃度を生じる比率で、天然に存在しているレベルの凝固因子を含む血漿と、凝固因子が欠いているか又は枯渇している血漿とを組み合わせることによって、任意の所望のレベルに調整することができる。多くの場合、特定の凝固試験において凝固速度の範囲を測定するための２以上の組成物のセットを調製することが有用である。２個の組成物のセットを調製する場合、１つは、好ましくは、所定の試験のために正常な範囲内であり、他方は、異常にもゆっくりとした凝固速度を表す上昇した範囲にある。プロトロンビン時間凝固試験のための対照として調製される組成物に対しては、例えば、１つの組成物は、好ましくは、約９秒〜約１８秒の範囲にある凝固時間を呈し、別の組成物は、好ましくは、２４秒を超える凝固時間を呈する。活性化部分トロンボプラスチン時間凝固試験のための対照として調製される組成物については、１つの組成物は、好ましくは、約２０秒から約４０秒の範囲にある凝固時間を呈し、別の組成物は、好ましくは、６０秒を超える凝固時間を呈する。一般に、プロトロンビン時間凝固試験のための対照としての使用のための組成物は、好ましくは、約９秒〜約１００秒のプロトロンビン時間試験値を呈し、活性化部分トロンボプラスチン時間凝固試験のための対照としての使用のための組成物は、好ましくは、約２５秒〜約１２０秒のプロトロンビン時間凝固試験値を呈する。

保存及び搬送の目的のために、本発明の組成物は、好都合には凍結乾燥され、一度で使用可能な状態になり、適切な再構成液体に溶解することによって再構成される。凍結乾燥状態では、組成物は、好ましくは、密封され、冷蔵環境において維持される。再構成は、好ましくは、脱イオン水又は蒸留水に溶解させることによって達成される。ある種の場合には、特に、ポイント・オブ・ケア分析器、例えば、ｉ−ＳＴＡＴ分析器に対しては、最良の結果は、再構成液が塩化カルシウム水溶液である場合に得られる。このような溶液では、好ましいＣａＣｌ₂濃度は、約８ｍＭ〜約１６ｍＭの範囲のものである。

下記の実施例は、例示のみを目的として提供される。

実施例１
Ａ．溶血血液の調製
ヒトのパックされた赤血球（ＲＢＣ）は、ヒトの全血を１５分間、３０００ＲＰＭで２〜８℃で遠心分離することによって得られた。遠心分離後、予め全血に添加されていた凝固剤とともに残りの血漿を吸引除去し、パックされた細胞上の淡黄色のコートを除去した。次に、等量の等張な生理食塩水に再度懸濁し、次いで、１５分間、３０００ＰＲＭで２〜８℃で行った。遠心分離後、懸濁液体を吸引除去し、細胞は、ＲＢＣカウントが４〜１０⁶ＲＢＣ／μＬになるように等張な生理食塩水に再度懸濁させた。

得られたＲＢＣ懸濁液（１００ｍＬ）は、ＢｒａｎｓｏｎＳｏｎｉｆｉｅｒ１５０ＵｌｔｒａｓｏｎｉｃＣｅｌｌＤｉｓｒｕｐｔｏｒａｎｄＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（ＢｒａｎｓｏｎＵｌｔｒａｓｏｎｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄａｎｂｕｒｙ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）を用いて、２０ワットで１分間、超音波処理された。超音波処理後、１０，０００ＲＰＭで３０分間、２〜８℃で遠心分離することによって細胞破片を除去した。次に、１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するダイア−フィルトレーション（ｄｉａ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）装置を用いて、ヘモグロビン濃度が１５ｇ／ｄＬになるまで溶血血液を濃縮した。

Ｂ．凝固因子欠損血漿の調製
正常な血小板不含のヒト血漿ユニットは、３０〜３５℃に設定された水浴において解凍された。解凍後、このユニットを溜めて、１１．９ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び３０ｍｇ／ｍＬのシプロフロキサシンをこの溜めた血漿に添加した。得られた合わせたものを３０分間混合し、ｐＨを６．８に調整した。次の、混合物は、１０００ｍＬの混合物に１１１ｍＬのジエチルアミノエチル陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ，ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を添加することによって、該樹脂と接触させて、凝固因子の混合物を枯渇させた。その後、混合は、２〜８℃で継続し、２００秒を上回るＰＴ値が得られるまで、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａＳｔａｇｏＣｏｍｐａｃｔｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｚｅｒを用いてＰＴについて１５分毎に試料を試験した。血漿及び陰イオン交換樹脂の懸濁液を０．８μｍの非ガラス性フィルターを通過させ、樹脂を取り除いた。

Ｃ．正常血漿の調製
正常な血小板不含のヒト血漿ユニットは、３０〜３５℃に設定された水浴において解凍された。解凍後、このユニットを溜めて、１１．９ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び３０ｍｇ／ｍＬのシプロフロキサシンをこの溜めた血漿に添加した。添加物を３０分間添加した後、溜めた血漿のｐＨを６．８に調整した。次に、得られた混合物を０．８μｍの非ガラス性フィルターを通過させてろ過した。

Ｄ．生成物の調製
異なる比率のろ過した溶血血液、因子枯渇血漿、及び正常な血漿を混和して、ＰＴ及びＡＰＴＴに従って、種々の凝固時間で様々な組成物を調製した。各組成物を混和し、その後、３４時間以内に−４０℃〜３０℃の温度で緩やかな上昇を伴い、４２時間からなる凍結乾燥サイクルを用いて凍結乾燥させた。次に、バイアルをキャップし、ラベルして、２〜８℃で保存した。

その後、凍結乾燥させた組成物は、凍結乾燥前に１．００ｍＬの組成物から得られる固体の体積に対して、水１ｍＬを用いて、脱イオン水に再構成された。４つの組成物の最初のシリーズ、ＳｔａｇｏＳＴＡＣｏｍｐａｃｔＡｎａｌｙｚｅｒ上のＰＴ及びＡＰＴＴのそれらの測定した値を下記の表Ｉに列挙する。

次に、組成物１及び２は、ｉ−ＳＴＡＴＡｎａｌｙｚｅｒによりＰＴ、ＡＣＴ（活性化凝固時間）、及びＩＮＲ（ＰＴと平均正常ＰＴ比）について試験され、結果を下記の表ＩＩに列挙した。

表Ｉ及びＩＩに示される結果は、対照の応答レベルが種々の試験プロトコールについて様々な方法で設定することができる。

Ｅ．安定性試験結果
再構成していない組成物の密封したバイアル安定性試験は、製品の保存期間を予測するために、加速安定性モデルを用いて行われた。手法は、所定期間、推奨される保存温度の２〜８℃とは対照的に、高温（２５℃）での製品の保存バイアルからなっていた。次に、バイアルからの試料を再構成し、ＰＴ及びＡＰＴＴについて検査し、分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）又は分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）について調べた。保存温度が２〜８℃に外挿された場合、結果は、製品が、その温度範囲の閉じたバイアル中で保存されれば、少なくとも１年間は安定であることを示した。

開封されたバイアル安定性は、実際の使用条件をシミュレーションすることによって測定された。これは、２〜８℃の冷蔵庫内で再構成された形態の組成物１及び２を含むバイアルを設置し、８時間毎に冷蔵庫からバイアルを取り出し、１５分間室温でバイアルを平衡化して、バイアルを開封し、バイアルの内容物をサンプリングする前に１５分間、実験室環境に晒し、バイアルを閉じ、このバイアルを冷蔵庫に戻すことによって行う。バイアルからの試料は、ＳｔａｇｏＳＴＡＣｏｍｐａｃｔＡｎａｌｙｚｅｒによりＰＴ及びＡＰＴＴについて検査され、結果をそれぞれ表ＩＩＩ及びＩＶに列挙する。結果は、再構成され、開封され、及び２〜８℃で保存された場合、少なくとも８時間、製品は安定であることを示している。

表ＩＩＩ及びＩＶは、両方の組成物が２４時間を超えて正常な使用条件で再構成された形態で安定であることを示している。

前述される記載は、主に例示を目的として提供される。本明細書には言及されていないが、それにもかかわらずに当業者には明確である、本発明の基本概念を利用する更なる変更及び修飾は、添付の特許請求の範囲に表されているように、なおもその範囲内にある。

Claims

血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の組成物であって、該組成物は、
血漿、白血球、並びに血小板及び血小板の膜成分を含まない、赤血球を溶解することによって得られる赤血球溶解物；
約６．５〜約７．５のｐＨに緩衝化されたヒト起源の血小板不含の血漿であって、（ｉ）凝固因子が枯渇した血漿、（ｉｉ）天然に存在しているレベルの凝固因子を含む血漿、又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組合せのいずれかである前記血漿；及び
抗菌剤
を含み、血小板の膜成分を欠いている前記組成物。
赤血球が、ヒト起源である、請求項１に記載の組成物。
赤血球溶解物が、約１ｇ／ｄＬ〜約２５ｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
各々が請求項１に従う第１組成物及び第２組成物のセットであって、ここで、赤血球溶解物及び血小板不含の血漿は、プロトロンビン時間凝固試験によって、該第１組成物が約９〜約１８秒の範囲の凝固時間を示し、該第２組成物が約２４秒以上の凝固時間を示すように選択された溶解物：血漿の比率であり、該第１組成物の該溶解物：血漿の比率が、該第２組成物の該溶解物：血漿の比率とは異なっている前記セット。
各々が請求項１に従う第１組成物及び第２組成物のセットであって、ここで、該血小板不含の血漿は、天然に存在しているレベルの凝固因子を含む血漿に対して、選択された比率の凝固因子を枯渇している血漿からなり、プロトロンビン時間凝固試験によって、該第１組成物が約９〜約１８秒の範囲の凝固時間を示し、該第２組成物が約２４秒以上の凝固時間を示すように、該第１組成物の該比率が第２組成物の該比率とは異なっている前記セット。
各々が請求項１に従う第１組成物及び第２組成物のセットであって、ここで、赤血球溶解物及び血小板不含の血漿は、活性化部分トロンボプラスチン時間凝固試験によって、該第１組成物が約２５〜約４０秒の範囲の凝固時間を示し、該第２組成物が約６０秒以上の凝固時間を示すように選択された溶解物：血漿の比率であり、該第１組成物の該溶解物：血漿の比率が該第２組成物の該溶解物：血漿の比率とは異なっている前記セット。
各々が請求項１に従う第１組成物及び第２組成物のセットであって、ここで、該血小板不含の血漿は、天然に存在しているレベルの凝固因子を含む血漿に対して、選択された比率の凝固因子を枯渇している血漿からなり、活性化部分トロンボプラスチン時間凝固試験によって、該第１組成物が約２５〜約４０秒の範囲の凝固時間を示し、該第２組成物が約６０秒以上の凝固時間を示すように、該第１組成物の該比率が第２組成物の該比率とは異なっている前記セット。
血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の組成物を製造する方法であって、該方法は、
（Ａ）血漿、白血球、並びに血小板及び血小板の膜成分を含まない、赤血球を溶解して溶解物を形成し；
（Ｂ）該溶解物と、
（ａ）約６．５〜約７．５のｐＨに緩衝化されたヒト起源の血小板不含の血漿であって、（ｉ）凝固因子が枯渇した血漿、（ｉｉ）天然に存在しているレベルの凝固因子を含む血漿、又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組合せのいずれかである前記血漿、及び
（ｂ）抗菌剤
と組み合わせる
ことを含む前記方法。
該（Ａ）の溶解が、該赤血球の凍結及び解凍以外の方法によって実行される、請求項８に記載の方法。
該（Ａ）の溶解が、超音波処理、浸透圧衝撃又は化学的溶解剤で該赤血球を処理することによって実行される、請求項８に記載の方法。
該赤血球が、ヒト起源である、請求項８に記載の方法。
工程（Ｂ）の生成物を凍結乾燥させることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
（Ａ’）該溶解物を生理食塩水で希釈するか又は該溶解物を濃縮することによって、工程（Ｂ）の前に、そこに含まれるヘモグロビン濃度を達成するために該溶解物を処理することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
工程（Ｂ）の前の該溶解物が、約１ｇ／ｄＬ〜約２５ｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度を有する、請求項８に記載の方法。
血液凝固速度測定とともに、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の第１組成物及び第２組成物を製造する方法であって、該方法は、請求項８に記載の方法によって第１組成物及び第２組成物を形成することを含み、ここで、工程（Ｂ）は、選択された溶解物：血漿の比率で、該溶解物と該ヒト起源の血小板不含の血漿とを組み合わせることを含み、該第１組成物及び第２組成物は、プロトロンビン時間凝固試験によって、該第１組成物が約９〜約１８秒の範囲の凝固時間を示し、該第２組成物が約２４秒以上の凝固時間を示すように、該選択された溶解物：血漿の比率において異なっている前記プロセス。
血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の第１組成物及び第２組成物を製造する方法であって、該方法は、請求項８に記載の方法によって第１組成物及び第２組成物を形成することを含み、ここで、工程（Ｂ）の該ヒト起源の血小板不含の血漿は、天然に存在しているレベルの凝固因子を含む血漿に対して、選択された比率の凝固因子を枯渇している血漿からなり、該第１組成物及び第２組成物は、プロトロンビン時間凝固試験によって、該第１組成物が約９〜約１８秒の範囲の凝固時間を示し、該第２組成物が約２４秒以上の凝固時間を示すように該選択された比率において異なっている前記プロセス。
血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の第１組成物及び第２組成物を製造する方法であって、該方法は、請求項８に記載の方法によって第１組成物及び第２組成物を形成することを含み、ここで、工程（Ｂ）は、選択された溶解物：血漿比率で、該溶解物と該ヒト起源の血小板不含の血漿とを組み合わせることを含み、該第１組成物及び第２組成物は、活性化部分トロンボプラスチン時間凝固試験によって、該第１組成物が約２５〜約４０秒の範囲の凝固時間を示し、該第２組成物が約６０秒以上の凝固時間を示すように該選択された溶解物：血漿の比率において異なっている前記プロセス。
血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の第１組成物及び第２組成物を製造する方法であって、該方法は、請求項８に記載の方法によって第１組成物及び第２組成物を形成することを含み、ここで、工程（Ｂ）の該ヒト起源の血小板不含の血漿は、天然に存在しているレベルの凝固因子を含む血漿に対して、選択された比率の凝固因子を枯渇している血漿からなり、該第１組成物及び第２組成物は、活性化部分トロンボプラスチン時間凝固試験によって、該第１組成物が約２５〜約４０秒の範囲の凝固時間を示し、該第２組成物が約６０秒以上の凝固時間を示すように、該選択された比率において異なっている前記プロセス。
血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の複数の組成物を製造する方法であって、該方法は、請求項８に記載の方法によって複数の組成物を形成することを含み、ここで、工程（Ｂ）は、選択された溶解物：血漿比率で、該溶解物と該ヒト起源の血小板不含の血漿とを組み合わせることを含み、該複数の組成物は、プロトロンビン時間凝固試験によって、該組成物の１つが約９〜約１８秒の範囲の凝固時間を示し、該組成物の他方が前記範囲を超える凝固時間を示すように該選択された溶解物：血漿の比率において異なっている前記プロセス。
血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の複数の組成物を製造する方法であって、該方法は、請求項８に記載の方法によって複数の組成物を形成することを含み、ここで、工程（Ｂ）は、選択された溶解物：血漿比率で、該溶解物と該ヒト起源の血小板不含の血漿とを組み合わせることを含み、該複数の組成物は、活性化部分トロンボプラスチン時間凝固試験によって、該組成物の１つが約２５〜約４０秒の範囲の凝固時間を示し、該組成物の他方が前記範囲を超える凝固時間を示すように該選択された溶解物：血漿の比率において異なっている前記プロセス。
血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の複数の組成物を製造する方法であって、該方法は、請求項８に記載の方法によって複数の組成物を形成することを含み、ここで、工程（Ｂ）は、選択された溶解物：血漿比率で、該溶解物と該ヒト起源の血小板不含の血漿とを組み合わせることを含み、該複数の組成物は、プロトロンビン時間凝固試験によって、該組成物の１つが約９〜約１８秒の範囲の凝固時間を示し、該組成物の他方が前記範囲を超える凝固時間を示すように、天然に存在しているレベルで凝固因子を含む血漿に対する、凝固因子を枯渇している血漿の該選択された比率において異なっている前記プロセス。
血液凝固速度測定とともに使用するための、実質的に経時的に変化しない既知の凝固挙動の複数の組成物を製造する方法であって、該方法は、請求項８に記載の方法によって複数の組成物を形成することを含み、ここで、工程（Ｂ）は、選択された溶解物：血漿比率で、該溶解物と該ヒト起源の血小板不含の血漿とを組み合わせることを含み、該複数の組成物は、活性化部分トロンボプラスチン時間凝固試験によって、該組成物の１つが約２５〜約４０秒の範囲の凝固時間を示し、該組成物の他方が前記範囲を超える凝固時間を示すように、天然に存在しているレベルで凝固因子を含む血漿に対して、凝固因子を枯渇している血漿の該選択された比率において異なっている前記プロセス。