CN112368580A - 含有脂质体的液态凝血功能检测试剂 - Google Patents

含有脂质体的液态凝血功能检测试剂 Download PDF

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CN112368580A CN201980045593.4A CN201980045593A CN112368580A CN 112368580 A CN112368580 A CN 112368580A CN 201980045593 A CN201980045593 A CN 201980045593A CN 112368580 A CN112368580 A CN 112368580A
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors

Abstract

本发明提供一种生产批次间的差异小的含有脂质体的液态凝血功能检测试剂。所述试剂的该脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％。

Description

含有脂质体的液态凝血功能检测试剂
技术领域
本发明涉及一种含有脂质体的液态凝血功能检测试剂。
背景技术
在临床检查中，用于检查由凝血因子的活性引起的病理的凝血功能的检查为常规进行的检查。其中，利用含有作为由磷脂构成的双层膜的脂质体的检查方法。可列举出活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测定、凝血酶原时间(PT)测定、使用了APTT测定或PT测定的凝血因子定量检查、复合因子(複合因子)测定、抗凝剂的定量检查等。
脂质体为来自于生物体的由磷脂构成的双层膜。脂质体被应用于药物制剂、化妆品材料、体外诊断试剂材料、药物传递系统等。
血液凝固反应通过多个凝血因子的级联反应来实现，但其大部分反应在磷脂的膜表面上进行。在磷脂的亲水基团部分与凝血因子结合方面，磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰甘油(PG)等的负电荷是重要的。另一方面，已知起因于磷脂的脂肪酸侧链的磷脂膜的流动性也会对凝固反应产生较大影响。还已知含有增强流动性的不饱和脂肪酸的脂质体的活性高。
生理性止血，包括因暴露于受伤部位的组织因子(TF)与活化的因子Ⅶ的结合而启动的外源性凝血途径、和不依赖于TF而启动的内源性凝血途径，出血或病理性血栓的形成被认为是由外源性凝血途径引起的。APTT在试管内重现该反应，向待测血浆中添加试剂，测定由各凝血因子的活化所产生的凝血酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白的时间。APTT检测内源性(因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅴ、Ⅱ，纤维蛋白原)异常。也应用于作为APTT异常时的精确检测的内源性凝血因子活性定量、获得性血友病以及狼疮抗凝物的检测、作为鉴别检查的凝血纠正试验、或者肝素给药的监测。
作为APTT所需的性能，可列举出对凝血因子或肝素等抗凝剂的高敏感性，但由于APTT为需要以凝固时间的绝对值进行诊断的项目，因此与通常的制作校准曲线得出诊断用数值的项目相比，容易产生生产批次间的差异，因此作为临床上非常希望的性能，特别需要其试剂的生产批次间的差异小。
关于APTT的生产批次间的差异，此前也实施了各种研究。现有的APTT试剂中，提取大豆等天然来源的磷脂并利用该磷脂制成APTT试剂，通过将磷脂从天然来源转化为合成品，能够得到均匀的磷脂，有助于减小生产批次间的差异(非专利文献1)。然而，生产批次间的差异并没有完全消除，可以说对于应对临床需求而言，仍然存在改进的余地。
例如，专利文献1中记载了用0.6μm的聚碳酸酯制薄膜进行过滤从而使脂质体的粒径均一化，由此得到含有脂质体的溶液。这是在将组织因子重构为合成脂质体之前的操作，并且是进行冷冻干燥之前的操作，因此难以认可最终产品能够表现出用聚碳酸酯膜过滤而使粒径均一化的效果。此外，专利文献1中示出的效果是针对抑制冷冻干燥前后的凝血酶原时间的测定值的变动(差)的，并未控制每个生产批次的凝固时间的绝对值。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2017-181265号公报
非专利文献
非专利文献1：奥田昌弘、菊川纪弘、上村八旬《合成リン脂質を用いた新しいAPTT試薬の開発》、日本検査血液学会雑誌、2002年02月28日、第3卷、第1号、p.124-131、別刷
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明是鉴于上述问题而完成的，本发明提供一种生产批次间的差异小、含有脂质体的液态凝血功能检测试剂。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人对上述技术问题反复进行了认真研究，结果发现了，与以往预期的相反，批次间的变异系数因脂质体的粒径而发生较大变化这一意外的结果。本发明在该发现的基础上，通过以使脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％的方式控制该脂质体的粒径，从而成功地制造生产批次间的差异小、含有脂质体的液态凝血功能检测试剂。
即，本发明涉及下述内容。
[1]一种液态凝血功能检测用试剂，其为含有脂质体的液态凝血功能检测用试剂，其中，该脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％。
[2]根据[1]所述的试剂，其中，所述试剂为活化部分促凝血酶原激酶时间、凝血酶原时间检测试剂、复合因子检测试剂、特定因子活性检测试剂、或凝血因子抑制剂检测试剂。
[3]一种含有脂质体的液态凝血功能检测用试剂的制造方法，其包含：
(工序A)：混合磷脂的工序；(工序B)：通过将混合后的磷脂分散于水溶液中从而形成脂质体的工序；以及(工序C)：使用脂质体粒径调节手段，由该脂质体制备均一的脂质体的工序，所述均一的脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％。
[4]一种减小液态凝血功能检测用试剂的生产批次间的差异的方法，其为减小含有脂质体的液态凝血功能检测用试剂的生产批次间的差异的方法，其中，该脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％。
发明效果
根据本发明，在含有磷脂且磷脂形成脂质体的凝血功能检测试剂中，通过减小生产批次间的差异，从而获得能够进行高精度的凝血功能检测的显著效果。
附图说明
图1为示出脂质体1(实施例2)和脂质体2(比较例1)的粒度分布的图表。
图2为示出图1所示的脂质体1(实施例2)的累积散射强度分布的图表。
图3为示出图1所示的脂质体2(比较例1)的累积散射强度分布的图表。
图4为示出使用APTT试剂《实施例2》和APTT试剂《比较例1》进行ATPP测定而计算出的各批次的变异系数(CV值)的结果的图表。
图5为示出脂质体3(实施例5)和脂质体4(比较例2)的粒度分布的图表。
图6为示出图5所示的脂质体3(实施例5)的累积散射强度分布的图表。
图7为示出图5所示的脂质体4(比较例2)的累积散射强度分布的图表。
图8为示出使用APTT试剂《实施例5》和APTT试剂《比较例2》进行ATPP测定而计算出的各批次的变异系数(CV值)的结果的图表。
图9为示出脂质体5(比较例3)的粒度分布的图表。
图10为示出图9所示的脂质体5(比较例3)的累积散射强度分布的图表。
具体实施方式
(脂质体)
对于本发明中可使用的脂质体，除了将该脂质体的粒径制备成351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％之外，能够通过公知的方法进行制备。
作为脂质体的制作方法，例如包含：
工序A：混合磷脂的工序；
工序B：通过将混合后的磷脂分散于水溶液中从而形成脂质体的工序；
工序C：使用脂质体粒径调节手段，由分散有该脂质体的磷脂混合液制备均一的脂质体的工序。
作为工序A，例如能够混合磷脂进行制作，优选混合磷脂后添加脂溶性抗氧化剂、或在脂溶性抗氧化剂的存在下混合磷脂进行制作(添加有脂溶性抗氧化剂的磷脂混合物)。磷脂可以是天然来源磷脂，也可以是合成磷脂。本领域技术人员可以从公知的磷脂中适当选择并使用，除了植物或动物来源的磷脂外，还可以使用从合成的磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及磷脂酰甘油等中适当选择并组合而成的磷脂。此外，这些磷脂适宜在脂肪酸侧链上含有不饱和脂肪酸。该磷脂混合物能够通过公知的方法而制作。
例如，可列举出将磷脂溶解于氯仿等有机溶剂中，并向其中添加0.01～5.0％的丁基羟基甲苯、α-生育酚等脂溶性抗氧化剂，然后去除有机溶剂，从而形成混合的磷脂薄膜。
作为工序B，可列举出向所述磷脂薄膜中加入水溶液使其分散而形成脂质体的方法。例如，作为水溶液，可列举出缓冲液(HEPES、TRIS、PBS等)，也可以适宜地含有蛋白质等高分子。
作为工序C，可列举出适当地选择公知的脂质体粒径调节手段，制备本发明中可使用的均一的脂质体。作为脂质体粒径调节手段，只要能够形成本发明中可使用的脂质体的粒径，则可使用任意的手段，例如可列举出过滤器的渗透处理、超声波处理等。对于材料、膜孔的大小、强度、时间、容量等，本领域技术人员可根据目标粒径适当选择并实施。
作为过滤器的渗透处理，可列举出使用聚碳酸酯膜、醋酸纤维素膜等的渗透处理。作为超声波处理，可列举出使用探头式超声波发生器、水浴式超声波发生器等的超声波处理。由于过滤器处理能够简便地进行制备，因而优选。
对于本发明中可使用的脂质体的粒径，该脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％，优选为0％以上且小于30％，更优选为0％以上且小于25％，进一步优选为0％以上且小于20％，特别优选为0％以上且小于15％。
此外，最小粒径只要为脂质体可作为支架而发挥功能的尺寸，则没有特别限制，本领域技术人员可以适当选择并制备。另外，优选53nm至该最小粒径值的累积累计值为该整体的累积累计值的0％以上且小于54％，优选为0％以上且小于50％，更优选为0％以上且小于40％，进一步优选为0％以上且小于30％，特别优选为0％以上且小于20％。
此外，优选最大粒径为650nm以下，更优选最大粒径为600nm以下，进一步优选最大粒径为50nm～600nm，更进一步优选最大粒径为100～400nm。可列举出：最小粒径为0nm以上，优选最小粒径为10nm以上，更优选最小粒径为20nm以上50nm以下，进一步优选为30nm以上且小于66nm。
作为本发明中可实施的凝血功能检测试剂的制造方法，除了将脂质体的粒径制备为351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％之外，可以按照公知的凝血功能检测试剂的制造方法进行实施。如后述的实施例所示，通过将脂质体的粒径制备为351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％，能够减小生产批次间的差异，故而优选。
另外，脂质体的粒径，可以以单独脂质体的粒径进行测定，也可以以添加有其他添加物的状态下的脂质体的粒径进行测定。作为添加物的例子，可列举出APTT中的活化剂。
(组织因子)
对于本发明中可使用的组织因子，本领域技术人员可以从公知的组织因子中适当选择并使用。可使用天然型组织因子或重组组织因子中的任意一种，但适宜为重组组织因子。作为重组组织因子，可以使用由感染了病毒的昆虫细胞、基因重组大肠杆菌或酵母等宿主产生的组织因子，所述病毒整合有人或动物的组织因子的基因序列。重组组织因子可以通过公知的方法进行制作，例如由于在宿主内表达的组织因子为跨膜蛋白，不溶于单纯的水溶剂，因此可以用含有表面活化剂的缓冲液破坏表达的细胞并进行提取，从而进行分离，进一步通过色谱法等操作纯化经分离的组织因子。
(脂质化促凝血酶原激酶)
本发明中可使用的脂质化促凝血酶原激酶，例如由组织因子溶液和含有脂质体且添加有脂溶性抗氧化剂的磷脂混合物构成(添加有脂溶性抗氧化剂的脂质化促凝血酶原激酶)。该脂质化促凝血酶原激酶可以由本领域技术人员从公知的脂质化促凝血酶原激酶的制作方法中适当选择并使用，例如可列举出以摩尔比计约为1:1000～1:500000的比例混合组织因子溶液和含有脂质体且添加有脂溶性抗氧化剂的磷脂混合物，形成均一的溶液。该组织因子溶液为含有足以溶解组织因子和含有脂质体且添加有脂溶性抗氧化剂的磷脂混合物的表面活化剂的缓冲液，其中，也可以含有血清白蛋白、球蛋白等作为保护蛋白。通过将组织因子溶液和含有脂质体且添加有脂溶性抗氧化剂的磷脂混合物充分混合并溶解后，去除表面活化剂，从而形成由磷脂得到的脂质体，同时组织因子的跨膜区嵌入磷脂膜中，结果制备成添加有脂溶性抗氧化剂的脂质化促凝血酶原激酶。表面活化剂的去除方法适宜使用公知的透析法或利用吸附树脂的方法。
(液态凝血功能检测试剂及检测方法)
作为本发明中可使用的液态凝血功能检测试剂，可以为将含有脂质体的凝血功能检测试剂制成液态试剂而成的试剂，例如可列举出活化部分促凝血酶原激酶时间检测试剂、凝血酶原时间检测试剂、复合因子检测试剂、特定因子活性检测试剂、或凝血因子抑制剂检测试剂。本领域技术人员可以使用公知的信息，适当制造该试剂并进行使用。
此外，作为本发明的液态凝血功能检测试剂及检测方法的实施方式，可以为单试剂型或双试剂型等由多个试剂构成的制剂。具体而言，在提供活化部分促凝血酶原激酶时间检测试剂的情况下，不仅可以提供将作为试剂的反应主要成分的脂质体及胶体二氧化硅或以鞣花酸为代表的活化剂以及作为凝血因子Ⅳ的钙离子混合而成的单试剂型的制剂，还可以提供脂质体及活化剂与钙化合物的水溶液分离的双试剂型的制剂作为具有更长期的贮藏稳定性的制剂。
或者，以液态试剂提供PT检测试剂的情况下，例如不仅可以提供将作为试剂的反应主要成分的脂质化促凝血酶原激酶(凝血因子Ⅲ)及作为凝血因子Ⅳ的钙离子混合而成的单试剂型的制剂，还可以提供脂质化促凝血酶原激酶与钙化合物的水溶液分离的双试剂型的制剂作为具有更长期的贮藏稳定性的制剂。
作为本发明的液态凝血功能检测试剂及检测方法的第一实施方式，可列举出用作活化部分促凝血酶原激酶时间检测试剂。具体而言，所述活化部分促凝血酶原激酶时间检测试剂，可以通过在脂质体及胶体二氧化硅或以鞣花酸为代表的活化剂中添加可表达凝血活性的浓度的钙离子而提供。在该试剂中，可以添加防腐剂、pH缓冲剂、用于避免会对PT测定造成影响的抗凝物质的影响的添加剂等。
作为本发明的液态凝血功能检测试剂及检测方法的第二实施方式，可列举出用作PT检测试剂。具体而言，所述PT检测试剂，可以通过在脂质化促凝血酶原激酶中添加可表达凝血活性的浓度的钙离子而提供。在该试剂中，可以添加防腐剂、pH缓冲剂、用于避免会对PT测定造成影响的抗凝物质的影响的添加剂等。
作为本发明的液态凝血功能检测试剂及检测方法的第三实施方式，可列举出用作复合因子检测试剂，所述复合因子检测试剂以与所述PT检测试剂相同的方式构成，并与去除了凝血因子(因子Ⅱ、因子Ⅴ、因子Ⅶ及因子Ⅹ)内的因子Ⅴ的血浆(缺乏血浆：即，作为凝血因子含有因子Ⅱ、因子Ⅶ及因子Ⅹ)混合，检测因子Ⅱ、因子Ⅶ及因子Ⅹ的活性。
第三液态凝血功能检测试剂，可以由分别准备有所述PT检测试剂和所述缺乏血浆的双试剂型而构成，也可以由将所述PT检测试剂与所述缺乏血浆进行混合而准备的单试剂型而构成。作为双试剂型的实例，可以列举出第一试剂为PT检测试剂、第二试剂为缺乏血浆，使标本与第一试剂反应，接着与缺乏血浆反应而进行测定。作为单试剂型的实例，可以列举出构成混合了PT检测试剂与缺乏血浆的试剂，使其与标本反应而进行测定。本领域技术人员可以适当选择或采用任意的试剂构成而实施。
作为本发明的液态凝血功能检测试剂及检测方法的第四实施方式，可列举出用作特定因子活性检测试剂，所述特定因子活性检测试剂以与所述PT检测试剂相同的方式构成，并与缺乏凝血因子(因子Ⅱ、因子Ⅴ、因子Ⅶ及因子X)内的任一因子的因子缺乏血浆组合，检测特定因子活性。例如，将因子Ⅶ缺乏血浆(即作为凝血因子含有因子Ⅱ、因子Ⅴ及因子X)与PT检测试剂组合，能够测定被检标本的因子Ⅶ的活性。此外，将因子Ⅱ缺乏血浆(即作为凝血因子含有因子Ⅴ、因子Ⅶ及因子X)与PT检测试剂组合，能够测定被检标本的因子Ⅱ的活性。此外，将因子X缺乏血浆(即作为凝血因子含有因子Ⅱ、因子Ⅴ及因子Ⅶ)与PT检测试剂组合，能够测定被检标本的因子X的活性。
第四液态凝血功能检测试剂，可以由分别准备有所述PT检测试剂和所述缺乏血浆的双试剂型而构成，也可以由将所述PT检测试剂与所述缺乏血浆进行混合而准备的单试剂型而构成。作为双试剂型的实例，可以列举出第一试剂为缺乏血浆、第二试剂为PT检测试剂，使标本与第一试剂反应，接着与缺乏血浆反应而进行测定。作为单试剂型的实例，可以列举出构成混合了PT检测试剂与缺乏血浆的试剂，使其与标本反应而进行测定。本领域技术人员可以适当选择或采用任意的试剂构成而实施。
作为本发明的液态凝血功能检测试剂及检测方法的第五实施方式，除了作为对象的标本不同之外，可以以与第三实施方式相同的方式实施。可列举出还可用作凝血因子抑制剂检测试剂，所述凝血因子抑制剂检测试剂以与所述PT检测试剂相同的方式构成，检查血浆中凝血因子抑制剂的存在。
第五液态凝血功能检测试剂，可以由分别准备有所述PT检测试剂和所述缺乏血浆的双试剂型而构成，也可以由将所述PT检测试剂与所述缺乏血浆进行混合而准备的单试剂型构成。作为双试剂型的实例，可以列举出第一试剂为PT检测试剂、第二试剂为缺乏血浆，使标本与第一试剂反应，接着与缺乏血浆反应而进行测定。作为单试剂型的实例，可以列举出构成混合了PT检测试剂与缺乏血浆的试剂，使其与标本反应而进行测定。本领域技术人员可以适当选择或采用任意的试剂构成而实施。
所述各因子的活性，可以通过评价观察到形成纤维蛋白(凝固)的时间(凝固时间)或评价相对于标准血浆的时间(％)而检查。本领域技术人员可以根据目的适当选择评价方法而实施。
(被检标本)
作为本发明中可使用的被检标本，根据公知信息，例如可列举出血液、由血液得到的血浆等。例如，可以使用由被检测者的血液得到的血浆、对照血浆、它们的混合物等。作为对照血浆，可以使用正常血浆、精度管理用血浆等。正常血浆可以是由健康者的血液得到的血浆、也可以是市售的正常血浆。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些并不限定本发明的范围。
《实施例1：磷脂混合物的制备1》
以重量比4:3:3的方式混合二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺以及二油酰磷脂酰丝氨酸(均从NOF CORPORATION购入)，并溶解于氯仿中从而形成磷脂溶液。接着，以重量比相对于磷脂为0.05％的方式加入脂溶性抗氧化剂丁基羟基甲苯(BHT：从WAKO购入)，将该溶液用蒸发器去除溶剂并干燥，得到添加有脂溶性抗氧化剂的磷脂混合物。
《实施例2：脂质体1的制备》
向实施例1中得到的磷脂混合物中加入缓冲液(10mmol/L HEPES、20mmol/L氯化钠pH7.5)并搅拌，使磷脂混合物分散于缓冲液中。
将分散液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜10次，以统一粒径。用缓冲液(10mmol/LHEPES、20mmol/L氯化钠、1％聚乙二醇pH7.5)将该溶液稀释至50倍从而制备脂质体1。进行三次同样的操作，得到三个批次。
《比较例1：脂质体2的制备》
向实施例1中得到的磷脂混合物中加入缓冲液(10mmol/L HEPES、20mmol/L氯化钠pH7.5)并搅拌，使磷脂混合物分散于缓冲液中。
用缓冲液(10mmol/L HEPES、20mmol/L氯化钠、1％聚乙二醇pH7.5)将该溶液稀释至50倍从而制备脂质体2。进行三次同样的操作，得到三个批次。
《实施例3：脂质体的有用性研究1》
《粒度分布测定1》
使用动态光散射法(OTSUKA ELECTRONICS CO.,LTD PHOTAL ELSZ)测定实施例2及比较例1中得到的脂质体1和脂质体2的粒度分布。将结果示于图1中。可知脂质体1在187nm处有峰，由81nm以上658nm以下的脂质体构成，与之相比，脂质体2在6580nm处有峰，由152nm以上至至少10000nm的脂质体构成。
此外，图2中示出了脂质体1的累积散射强度分布，以及图3中示出了脂质体2的累积散射强度分布。
《APTT试剂的制备1》
使脂质体1及脂质体2中磷脂浓度为100mg/mL、胶体二氧化硅为0.05％的方式进行配方，分别得到APTT试剂《实施例2》、APTT试剂《比较例1》。
《凝固时间测定1》
使用APTT试剂《实施例2》、APTT试剂《比较例1》进行测定。作为正常范围定值质控血浆，使用Ci-Trol 1(Sysmex Corporation)为正常1，作为病理范围定值质控血浆，使用Ci-Trol2为病理1、以及使用Ci-Trol3为病理2(均为Sysmex Corporation)，共计3种。
测定中使用临床检查系统STACIA(LSI Medience Corporation)。
测定参数设为，标本：50μL、APTT试剂：50μL、20mmol/L氯化钙水溶液：50μL，测定波长设为660nm。以多重度＝5进行测定，采用其平均值为APTT，计算各批次的变异系数(CV值)。
图4中示出了结果。可知与APTT试剂《比较例1》相比，APTT试剂《实施例2》的正常范围以及病理范围的任意三个批次的变异系数均较小。由该结果能够说明含有粒径大的脂质体的APTT试剂的生产批次间的差异大。
另外，脂质体2的351nm至该最大粒径值的累积累计值为该整体的累积累计值的85％，脂质体1的情况下，351nm至该最大粒径值的累积累计值为该整体的累积累计值的15％。因此，可知脂质体的粒径的351nm至该最大粒径值的累积累计值良好，为该整体的累积累计值的15％以上且小于85％。
《实施例4：磷脂混合物的制备2》
以重量比6:2:2的方式混合二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺以及二油酰磷脂酰丝氨酸(均从NOF CORPORATION购入)，并溶解于氯仿中从而形成磷脂溶液。然后，以重量比相对于磷脂为0.05％的方式加入脂溶性抗氧化剂丁基羟基甲苯(BHT：从WAKO购入)，将该溶液用蒸发器去除溶剂并干燥，得到添加有脂溶性抗氧化剂的磷脂混合物2。
《实施例5：脂质体3的制备》
向实施例4中得到的磷脂混合物2中加入缓冲液(10mmol/L HEPES、20mmol/L氯化钠pH7.5)并搅拌，使磷脂混合物分散于缓冲液中。
将分散液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜10次，以统一粒径。用缓冲液(10mmol/LHEPES、20mmol/L氯化钠、1％聚乙二醇pH7.5)将该溶液稀释至50倍从而制备脂质体3。进行三次同样的操作，得到三个批次。
《比较例2：脂质体4的制备》
向实施例4中得到的磷脂混合物2中加入缓冲液(10mmol/L HEPES、20mmol/L氯化钠pH7.5)并搅拌，使磷脂混合物分散于缓冲液中。
将分散液通过孔径为200nm的醋酸纤维素膜。用缓冲液(10mmol/L HEPES、20mmol/L氯化钠、1％聚乙二醇pH7.5)将该溶液稀释至50倍从而制备脂质体4。进行三次同样的操作，得到三个批次。
《实施例6：脂质体的有用性研究2》
《粒度分布测定2》
使用动态光散射法(OTSUKA ELECTRONICS CO.,LTD PHOTAL ELSZ)测定脂质体3和脂质体4的粒度分布。将结果示于图5中。脂质体3在187nm处有峰，另一方面，脂质体4在351nm处有峰。
此外，图6中示出了脂质体3的累积散射强度分布，以及图7中示出了脂质体4的累积散射强度分布。关于累积散射强度分布，脂质体3的所有脂质体为66nm以上432nm以下，与之相比，脂质体4的所有脂质体为66nm以上1232nm以下。
《APTT试剂的制备2》
分别使脂质体3及脂质体4中磷脂浓度为100mg/mL、胶体二氧化硅为0.05％的方式进行配方，得到APTT试剂《实施例5》、APTT试剂《比较例2》。
《凝固时间测定2》
使用APTT试剂《实施例5》、APTT试剂《比较例2》，进行正常范围2及病理范围3、病理范围4的APTT测定。作为正常范围定值质控血浆，使用Normal Control(IL公司)，作为病理范围定值质控血浆，使用Low Abnormal Control及High Abnormal Control(IL公司)共三种质控血浆进行APTT测定。
测定中使用临床检查系统STACIA(LSI Medience Corporation)。
测定参数设为，标本：50μL、APTT试剂：50μL、20mmol/L氯化钙水溶液：50μL，测定波长设为660nm。以多重度＝3进行测定，采用其平均值为APTT，计算各批次的变异系数(CV值)。
图8中示出了结果。可知与APTT试剂《比较例2》相比，APTT试剂《实施例5》的正常范围以及病理范围的任意三个批次的变异系数均较小。由该结果能够说明含有粒径大的脂质体的APTT试剂的生产批次间的差异大。
另外，脂质体4的该峰值351nm至该最大粒径值的累积累计值为该整体的累积累计值的35％，脂质体3的情况下，351nm至该最大粒径值的累积累计值为该整体的累积累计值的0％。因此，可知351nm至该最大粒径值的累积累计值良好，为该整体的累积累计值的0％以上且小于35％。
脂质体为各凝血因子提供反应场所，但由于其并未参与反应本身，因此认为无论其大小如何，只要为具有一定程度大小的脂质体，则可显示一定的反应性。但是，令人惊讶的结果是批次间的变异系数因脂质体的大小(粒径)而发生较大变化。
《比较例3：脂质体5的制备》
向实施例4中得到的磷脂混合物中加入10mmol/L HEPES、pH7.5的缓冲液并搅拌，使磷脂混合物分散于缓冲液中，通过探头式超声波照射(Branson Ultrasonics,EmersonJapan,Ltd.SONIFER 450)对所得到的溶液照射超声波。
然后，用缓冲液B稀释至50倍，得到脂质体5。
《粒度分布测定3》
使用动态光散射法(OTSUKA ELECTRONICS CO.,LTD PHOTAL ELSZ)测定脂质体5的粒度分布。将结果示于图9中。脂质体5由19nm以上187nm以下的脂质体构成，在53nm处有峰。
此外，图10中示出了脂质体5的累积散射强度分布。所有脂质体中有96％为123nm以下。
《APTT试剂的制备3》
分别使脂质体5中磷脂浓度为100mg/mL、胶体二氧化硅为0.05％的方式进行配方，形成APTT试剂《比较例3》。
《凝固时间测定3》
使用APTT试剂《比较例3》，进行正常范围2及病理范围3、病理范围4的APTT测定。作为正常范围定值质控血浆，使用Normal Control(IL公司)，作为病理范围定值质控血浆，使用Low Abnormal Control及High Abnormal Control(IL公司)共计三种质控血浆进行APTT测定。
测定中使用临床检查系统STACIA(LSI Medience Corporation)。
测定参数设为，标本：50μL、APTT试剂：50μL、20mmol/L氯化钙水溶液：50μL，测定波长设为660nm。以多重度＝3进行测定，采用其平均值为APTT，测定中使用了临床检查系统STACIA(LSI Medience Corporation)。
表1中示出了凝固时间。通常APTT试剂的正常范围显示25秒至35秒的凝固时间，但比较例3中正常范围定值质控为40秒以上，可知超出了APTT试剂的正常范围。由以上结果可知，并不优选可用作APTT试剂的脂质体过小。此外，脂质体粒径的峰值的最小值可以说在54nm以上。
另外，脂质体5的该峰值53nm至该最小粒径值的累积累计值为该整体的累积累计值的54％。因此，可知53nm至该最小粒径值的累积累计值良好，为该整体的累积累计值的0％以上且小于54％。
此外，作为过小而不优选的原因，主要考虑以下因素。例如可列举出，由于脂质体的粒径小，脂质体无法提供充分的空间作为各凝血因子的反应场所，因此凝固时间延长。或者，由于以同一脂质浓度进行测定，因此在脂质体粒径小的情况下，脂质体的粒子数增多，因此凝血因子聚集到一个脂质体的概率降低，凝固时间延长等。
[表1]
Figure BDA0002885961660000151
秒

Claims (4)

1.一种液态凝血功能检测用试剂，其为含有脂质体的液态凝血功能检测用试剂，其中，所述脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％。
2.根据权利要求1所述的试剂，其中，所述试剂为活化部分促凝血酶原激酶时间、凝血酶原时间检测试剂、复合因子检测试剂、特定因子活性检测试剂、或凝血因子抑制剂检测试剂。
3.一种含有脂质体的液态凝血功能检测试剂的制造方法，其包含：
工序A：混合磷脂的工序；
工序B：通过将混合后的磷脂分散于水溶液中从而形成脂质体的工序；以及
工序C：使用脂质体粒径调节手段，由该脂质体制备均一的脂质体的工序，所述均一的脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％。
4.一种减小液态凝血功能检测试剂的生产批次间的差异的方法，其为减小含有脂质体的液态凝血功能检测试剂的生产批次间的差异的方法，其中，所述脂质体的351nm至最大粒径值的累积累计值为该脂质体整体的累积累计值的0％以上且小于35％。
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