CN102144974A - 一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的脂质体制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域,具体地说是涉及一种抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶抗凝溶栓双功能融合蛋白(HV12p-rPA)的脂质体制剂及制备方法。由本研究室构建的抗凝溶栓双功能融合蛋白(HV12p-rPA),经结构鉴定、表达、层析复性及纯化和体外体内药效学实验,已证明具有抗凝和溶栓的双功效。本研究以其为原料药,制备其脂质体制剂,采用优化的薄膜分散-探头超声法制备脂质体,其特征是以磷脂与胆固醇比、蛋白药浓度、缓冲液体积、水浴超声时间为影响因素筛选最适合提高HV12p-rPA脂质体包封率的处方,并且以探头超声进一步减小均一其粒径,制得粒径在140~145nm可以用于静脉注射的HV12p-rPA脂质体。该方法制得的HV12p-rPA脂质体包封率达90%以上,且体外溶栓活性和体外抗凝活性分别为23810IU·mg-1、414ATU·mg-1。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域,具体地说是涉及新型抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶抗凝溶栓双功能融合蛋白(HV12p-rPA)的脂质体制剂及制备方法。
背景技术
瑞替普酶 (Reteplase,r-PA) 是人组织纤溶酶原激活剂 (t-PA) 的异构体,是已被用于临床的第三代溶栓药物。水蛭素(Hirudin) C末端的12 肽 (53~64 aa) 是水蛭素具有最大抗凝活性所必需的最小肽段,其较小的分子量相对于水蛭素全长蛋白来说更有利于降低出血副作用。本研究室在前期工作中构建表达了重组HV12p-rPA 融合基因(专利号:ZL 2006 1 0022457.8 CN1970574 B)。经基因测序、蛋白质结构解析、层析复性及纯化、体外生物学活性检测以及动物体内药效学研究,证实HV12p-rPA 结构正确且具有抗凝血和溶栓双重功能,表明该融合蛋白质可作为一种潜在的兼具抗凝和溶栓效果的新药。本研究将HV12p-rPA制备成脂质体剂型,以求进一步提高靶向性和降低出血副作用为融合蛋白HV12p-rPA应用于临床实验,开发成为新一代溶栓药物更近一步。
脂质体的制备方法常用的有薄膜法、逆相蒸发法、溶剂注入法和复乳法等。评价脂质体质量的指标有外观、粒径分布和包封率等,其中包封率是衡量脂质体内在质量的一个重要指标。在脂质体制备过程中,温度、脂质的组成及浓度、缓冲液pH、均质化过程、蛋白类药物性质等因素都会影响包封率和药物的稳定性。温度越高使氯仿挥发的时间加快,成膜越快,但温度过高会使成膜不均一而是包封率下降。用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂,如豆磷脂、卵磷脂等;合成磷脂,如二棕榈酰磷脂酰胆碱,二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的附加剂为胆固醇。本研究使用天然的大豆卵磷脂,价格较合成磷脂便宜,适于应用于生产。胆固醇也是两亲性物质,与磷脂混合使用,可制得稳定的脂质体,其作用是调节双分子层的流动性,减低脂质体膜的通透性。为保证包封率,磷脂与胆固醇物质量之比在7:1~1:1之间,具体比例为多少需要根据优化设计来确定;缓冲液pH常选择pH7.4,既保证了药物的稳定性又保证了HV12p-rPA的蛋白活性;薄膜分散法是一种经典的制备方法,它可形成多室脂质体,经超声处理后得到小单室脂质体,超声处理的过程会使包封率降低和蛋白药物活性的受损,本研究发现在超声功率为50w,时间分别在5min、10min、15min时,活性分别为23810±1.69、23810±1.01、10291±0.67。HV12p-rPA是分子量为39.6KB的大分子蛋白药物,在制备脂质体的过程中如何确保其生物活性的保留和较高的包封率是研究的重点。
王向涛等在“血栓靶向尿激酶脂质体的制备及其体内溶栓效果”([J].药学学报,2003,38(3):231-235)中通过逆向蒸发法制得的尿激酶脂质体包封率仅为65%;张霞等在“纳豆激酶脂质体的制备及其体外释放”([J].中国药学杂志,2007年2月第42卷第2期)中用薄膜分散法,将大豆卵磷脂与胆固醇溶于乙醚适量,25℃减压旋蒸制得的纳豆激酶脂质体包封率为54%,粒径为235.7nm。薄膜分散法是将磷脂和胆固醇溶于有机溶剂后,通过挥干有机溶剂,使磷脂和胆固醇均一分散成膜,然后再加入水相混合成乳。此法可以避免有机相与蛋白质接触,保证蛋白的结构与生物活性不被破坏。
将已制备成乳的脂质体通过超声波、高压乳匀器、挤压器等方法,可以将粗制的脂质体均一且达到需要的粒径。Jacques-Philippe等在“Protein en-capsulation in liposomes: efficiency depends on interactions between protein and phospholipids bilayer”([J].BMC Biotech-nology, 2002,2(9):1-8)利用挤出器均质仪,随着挤出次数的增多,包封率发生了由高到低再由低到更高的变化过程。高压均质仪对脂质体进行均质的次数也会影响蛋白质类药物的活性Barnadas-Rodriguez R在“Factors involved in the pro-duction of liposomes with a high-pressure homogenizer”([J].Int J Pharm,2001,213(1/2):175-186)。
上述文献所报道的脂质体的制备方法,对于制备大分子蛋白质药物来说,除了包封率不高以外,也会大大破坏蛋白质的生物活性。这大大损耗了药物量,降低了药物利用率,提高了成本,且得到的脂质体保留活性不高,粒径较大不利于静脉注射。
发明内容
鉴于此,本发明提供了一种改良的薄膜分散-超声法来制备HV12p-rPA的脂质体,以优化的探头超声条件,探头超声用于减小均一脂质体的粒径是一种常用的方法,它操作简单,且均一效果明显,但超声功率和时间过大、过长都会破坏蛋白类药物的活性,但是时间过短又不能达到减小脂质体粒径的目的。本发明在探头超声50W,间隔2s,考察了5min、10min、15min三个水平,最后确立了10min为最佳条件,既减小了脂质体的粒径又保证了HV12p-rPA活性。均一减小粒径,可以满意地解决上述问题。
本发明以改良的薄膜分散-超声法制备HV12p-rPA脂质体,先将大豆卵磷脂与胆固醇,用于制备脂质体的磷脂有天然磷脂,如豆磷脂、卵磷脂等;合成磷脂,如二棕榈酰磷脂酰胆碱,二硬脂酰磷脂酰胆碱等。常用的附加剂为胆固醇。本研究使用天然的大豆卵磷脂,价格较合成磷脂便宜,适于应用于生产。胆固醇也是两亲性物质,与磷脂混合使用,可制得稳定的脂质体,其作用是调节双分子层的流动性,减低脂质体膜的通透性。本实验所诉的磷脂为大豆卵磷脂。以一定的量溶解于氯仿实验中发现当氯仿的用量过少(<8mL)不能溶解磷脂,导致无法均匀成膜;过多又使磷脂浓度降低,导致包封率不高。氯仿是薄膜分散法常用的有机溶剂,除了氯仿以外,还可以选择丙酮、乙醚等有机溶剂。本实验所允许的有机溶剂包括氯仿、丙酮、乙醚等所有有机溶剂。在35℃下减压旋干成膜温度越高使氯仿挥发的时间加快,成膜越快,但温度过高会使成膜不均一而是包封率下降。薄膜分散法即是要通过减压来成膜。本专利所诉的温度范围为15~45℃,其中35℃为优选的最佳温度。加入一定量缓冲液的体积一般要求在5mL到20mL之间的HV12p-rPA的磷酸盐缓冲液缓冲液pH常选择pH7.4,既保证了药物的稳定性又保证了HV12p-rPA的蛋白活性。本专利所述的缓冲液为一切无机盐缓冲液,pH范围为5.0~8.0。水浴超声成乳后,再通过筛选的探头超声条件发明在探头超声50W,间隔2s,考察了5min、10min、15min三个水平,最后确立了10min为最佳条件,既减小了脂质体的粒径又保证了HV12p-rPA活性。本专利所述的探头超声条件为25W~100W,时间为5~15min均一减小粒径。
优化方案如下:
采用正交试验均一设计,对影响脂质体包封率的因素进行筛选,选出4个影响较大的因素:磷脂与胆固醇的比(A)、药物浓度(B)、PBS体积(C)、水浴超声时间(D)。把这四种因素作为主要考察因素,每个因素又取了三个水平,采用正交设计法L 9 (34)进行实验。以包封率作为评价标准,优化脂质体制备的处方和工艺。通过极差分析显示最佳组合为大豆卵磷脂与胆固醇的比为3:1,药物浓度为4mg/ml,HV12p-rPA磷酸缓冲液10ml,水浴超声10min。
采用单因素试验优化探头超声时间,在50W,间隔2s下选出3个时间段:5min、10min、15min,以HV12p-rPA脂质体的包封率、粒径、体外溶栓活性为考察目标,筛选出10min为最佳探头超声时间。
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下,根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更,均应包括在本发明的范围内。
附图说明
图1为在透射电镜下(×60 000)观测到的HV12p-rPA脂质体(实施例四)。
具体实施方式
实施例一
对影响脂质体包封率的因素进行筛选,选出4个影响较大的因素:大豆卵磷脂与胆固醇的比(A)、药物浓度(B)、PBS体积(C)、水浴超声时间(D)。以这四种因素作为考察因素,每个因素取三个水平,采用正交设计法L 9 (34)进行实验。实验设计如表1。
表1 四因素三水平正交设计表
Factor | Level 1 | Level 2 | Lenel 3 | |
A | PC:Chl(m:m) | 3:1 | 4:1 | 6:1 |
B | Pr(mg/ml) | 2 | 3 | 4 |
C | PBS(ml) | 10 | 15 | 20 |
D | Time(min) | 5 | 10 | 15 |
实验结果如表2:
表2 正交实验结果
NO. | A | B | C | D | EE% |
1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 87.03 |
2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 87.83 |
3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 85.32 |
4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 85.03 |
5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 79.01 |
6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 87.52 |
7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 81.37 |
8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 85.25 |
9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 81.89 |
K1 | 86.72667 | 84.47667 | 86.6 | 82.64333 | |
K2 | 83.85333 | 84.03 | 84.91667 | 85.57333 | |
K3 | 82.83667 | 84.91 | 81.9 | 85.2 | |
R | 3.774 | 0.793 | 4.837 | 2.99 |
通过表2分析,由极差R 可知,四种因素对包封率的影响大小依次为:C>A>D>B。综合以上结果,确定薄膜分散法制备HV12p-rPA脂质体的最佳处方工艺组合为A1B3C1D2,即大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为3:1,药物浓度为4mg/ml,PBS 10ml,水浴超声10min。
实施例二
将通过薄膜分散得到的脂质体乳液通过探头超声进一步减小并均一其粒径。探头超声功率50W,间隔2S,累计时间分别在5min、10min、15min三个条件下进行超声,以包封率、体外溶栓活性和粒径为指标,选取最佳超声时间。
表3 探头超声时间对HV12p-rPA脂质体包封率、粒径、溶栓活性的影响(n=3)
The ultrasonic probe time(min) | Encapsulation efficiency(%) | Z-Average(d.nm) | Thrombus Activity( IU·mg-1) |
5 | 92.01 | 166±1.31 | 23810±1.69 |
10 | 89.98 | 157±0.98 | 23810±1.01 |
15 | 56.37 | 144±1.45 | 10291±0.67 |
从表3可见随着超声时间的延长,脂质体包封率降低,探头超声10min与超声5min相比,对包封率的影响不大。随着超声时间延长,粒径在170-140nm之间逐渐减小。当超声时间为从5min增大到10min时,溶栓活性没有改变,但当超声时间延长到15min时,溶栓活性明显降低。综合探头超声时间对脂质体在包封率、粒径、溶栓活性的影响,选取10min为最佳探头超声时间。
实施例三
包封率的测定:BCA试剂法 其原理与Lowery法蛋白定量相似,就是在碱性条件下蛋白质与Cu2+络合并还原Cu2+成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在570 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。
包封率=(总蛋白*稀释倍数-游离蛋白)/总蛋白*稀释倍数*100%
取两份脂质体悬液,一份调节Zeta电位使脂质体絮凝,冷冻离心后,抽取上层上清液,测量脂质体外游离的蛋白质含量;另一份加入破乳剂TritonX-100破坏脂质体的磷脂双分子层,释放脂质体内包裹的蛋白质药物,测量总蛋白质药物的含量。测得包封率为(91.59±1.39)%。
实施例四
脂质体质量检查:显微镜下观察脂质体形态,采用激光粒度仪测定粒径,最佳处方三批HV12p-rPA脂质体的平均粒径为(142.45±1.20)nm,Zeta 电位平均值为(-30.63±0.48) mV,平均包封率为(91.59±1.39)%。由附图1说明制得的HV12p-rPA脂质体圆整均一。
实施例五
生物活性的测定:
(1)抗凝活性的测定:于酶标板小孔中加200 μl 4mg/ml的人纤维蛋白原(0. 05 mol/ L Tris-HCl ,0.15mol/L NaCl缓冲液(pH7. 4) 配制) ,再加入50μl复性的蛋白溶液,充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(400NIH 单位) ,时间间隔为1 min ,若在1 min 内纤维蛋白原发生凝固,即说明已达滴定终点。由凝血酶的消耗量换算出水蛭素的单位数。由于水蛭素与凝血酶是1∶1 结合,故每消耗一个凝血酶单位(NIH) 相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。测得抗凝活性为抗凝活性为414ATU·mg-1 。
(2) 纤溶活性测定:纤维蛋白- 琼脂糖平板测定法:配制平板用溶液均为0.05mol/L Tris-HCl ,0.15mol/L NaCl缓冲液(pH7. 4) 。将50μl凝血酶(400 NIH单位)加到25ml人纤维蛋白原溶液(4mg/ml)中,迅速混匀,倾入完全融化且降温至50℃左右的25ml琼脂糖溶液(1%),混匀,倒入直径为15cm的平板中,室温放置0.5以上,凝固后打孔使用。孔中滴加不同比活性(10—20000单位/ml)的尿激酶标准品30μl。平皿加盖,37℃温育15h。测量溶栓圈相互垂直的两直径,以直径积的对数lg中将1BP 单位/mL的凝血酶溶液贴壁加入10mL血纤蛋白原(5mg/mL) 溶液中,快速混匀,倾入至完全融化且已降至45℃的10mL琼脂糖溶液(1.0 %) 中 ,混匀,倒入直径90mm的平皿中,凝固后打孔使用。算得溶栓活性为7326 IU·mg-1 。
Claims (7)
1.一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的脂质体制剂及制备方法,将由本实验室研发的水蛭素12肽-瑞替普酶抗凝溶栓双功能融合蛋白HV12p-rPA,通过改良的薄膜分散-超声法将其制备成脂质体剂型,其特征在于将质量比为7:1~1:1的磷脂和胆固醇完全溶解于医药中可以接受的有机溶剂后,挥干溶剂,使磷脂和胆固醇均匀分散成膜,然后加入含有抗凝溶栓双功效融合蛋白(HV12p-rPA)的缓冲液(pH值为5.0~8.0),经水浴超声混合成乳状液,经探头超声减小粒径,最后得到HV12p-rPA脂质体。
2.如权利要求1所述的HV12p-rPA的脂质体,其特征在于以HV12p-rPA融合蛋白为原料药物制备脂质体。
3.如权利要求1所述的HV12p-rPA脂质体的制备方法,其特征在于以磷脂或磷脂、胆固醇为脂质原料,有机溶剂可以是氯仿、丙酮、乙醇等医药中可以接受的有机溶剂。
4. 如权利要求1所述的HV12p-rPA脂质体的制备方法,其特征在于先将磷脂、胆固醇溶于有机溶剂旋干,加入含有HV12p-rPA的缓冲液水浴超声成乳,经探头超声减小均一粒径。
5.如权利要求1至3所述的HV12p-rPA脂质体的制备方法,其特征在于磷脂与胆固醇的质量比为7:1~1:1,有机溶剂量为每60mg磷脂加10mL,在15~45℃下减压1MPa旋干成膜,加入含有HV12p-rPA质量浓度2~4mg/mL的 pH值为5.0~8.0的缓冲液,缓冲液体积为5mL~20mL,经水浴超声混合成乳状液,水浴超声时间为10min。
6.如权利要求1所述的HV12p-rPA脂质体的备方法,其特征在于均一减小粒径的方法是探头超声法。
7. 如权利要求6所述的均一减小粒径的方法是探头超声法,其特征在于探头超声功率为25W~50W,间隔2s,累计超声5min~15min。
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