JP4469435B2 - ビリルビンオキシダーゼの安定化方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼの安定化方法に関する。本発明方法によれば、例えば、ビリルビンオキシダーゼを液状の形態にて保存する場合において、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性を長期間安定に保持することができる。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビンをビリベルジンに酸化させる反応を触媒する酵素であり、臨床検査の分野において血清等の生体試料中のビリルビンを光学的に測定するために広く利用されている酵素である。血清中ビリルビンの測定は、肝胆道系疾患や黄疸等の臨床診断において重要な検査となっている。ビリルビン測定においては、測定すべきビリルビン種対象物に応じて、ｐＨ、界面活性剤、及び／又は添加剤の添加等により測定条件を調節し、ビリルビンオキシダーゼの酵素反応を促進、あるいは、抑制することによって、総ビリルビン値、抱合ビリルビン値、又は直接ビリルビン値として病態の判断に有用な数値を得ることができる。
【０００３】
ビリルビンを測定するための試薬は、通常、二試薬より構成され、総ビリルビン測定用試薬、抱合ビリルビン測定用試薬、又は直接ビリルビン測定用試薬のいずれも、主に緩衝液よりなる試薬、及び主にビリルビンオキシダーゼよりなる試薬等で構成されることが多い。ビリルビンオキシダーゼは、液状ではかなり不安定であるが、凍結乾燥状態では比較的安定であるため、凍結乾燥品の形態で供給され、緩衝液等で再溶解して使用されてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ビリルビンオキシダーゼは、先に述べたように、液状ではかなり不安定で、ｐＨ９．２〜９．７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で９６時間安定であるにすぎない［アグリカルチュアル・アンド・バイオロジカルケミストリー，第４６巻，第８号，２０３１〜２０３４頁，１９８２年］。そのため、従来市販されてきたビリルビンオキシダーゼを凍結乾燥形態とするビリルビン測定試薬においては、ビリルビンオキシダーゼの活性は、溶解後、徐々に低下し、溶解後の使用期間としては概ね２〜３週間に限定されてきた。更に、近年、臨床検査用試薬においては凍結乾燥品試薬の溶解の手間を省くため、液状形態の試薬が供給されるようになってきており、試薬の長期間の安定化が要求されつつある。そのため、ビリルビンオキシダーゼの安定化について、これまでにいくつかの方法が試みられてきた。
【０００５】
このような安定化の試みとしては、例えば、ジエチルバルビツール酸ナトリウム・塩酸等のｐＨ８〜１０の緩衝液に、乳糖アラニン、グリシン、牛アルブミン、又はシクロデキストリン等の安定化剤を添加する方法（特開昭６０−１５１５６１号公報）、ｐＨ７〜９の緩衝液にて保存する方法（特開昭６１−２０９５８７号公報）、あるいは、アスパラギン酸又はトリプトファンを添加して安定化する方法（特開平６−２８４８８６号公報）等がある。しかし、これらの条件でのビリルビンオキシダーゼの安定化効果は不充分であり、前記方法では、液状の試薬としての供給はかなり困難であった。
【０００６】
その後、更に、ビリルビンオキシダーゼを安定化する技術が発表され、例えば、ハロゲン化物塩存在下で保存する方法（特開平７−２０３９６２号公報）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸等の緩衝液とカルボン酸との組み合わせによる安定化方法（特許第２８２０８９３号明細書）、還元剤（具体的には、チオ硫酸、亜硫酸、若しくは硫酸水素等、若しくはそれらの塩、又はチオール類、ジチオール類、カテキン、若しくはアスコルビン酸等）を添加した安定化方法（特開平１０−４２８６９号公報）、あるいは、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール等の含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体による安定化方法（特開平１０−７５７７９号公報）などが公開されている。しかし、これらの方法は、酵素単独の水溶液での安定性には効果があるものの、実際のビリルビン測定試薬の第二試薬、すなわち、ビリルビンオキシダーゼ以外に反応促進剤や種々の界面活性剤等を含有する第二試薬におけるビリルビンオキシダーゼの安定性を満足することのできるものではなかった。
【０００７】
ビリルビンオキシダーゼに加えて反応促進剤や種々の界面活性剤等を含む液状試薬中におけるビリルビンオキシダーゼの酵素活性を安定に保つ手段を開発するために、本発明者らは検討を行った結果、安定化剤として、リチウム化合物又はホモシスチンを少なくとも１種（すなわち、１種又は２種以上）共存させることにより、前記液状試薬中におけるビリルビンオキシダーゼの安定化を達成することができることを見出した。
すなわち、本発明の課題は、これまで述べたように、溶液状態では不安定なビリルビンオキシダーゼの酵素活性を溶液状態で長期間安定に保つための方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、リチウム化合物又はホモシスチンを安定化剤として用いることを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼの安定化方法によって解決することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ビリルビンオキシダーゼ（特には、溶液中でのビリルビンオキシダーゼ）の活性を安定化するための安定化剤として、リチウム化合物又はホモシスチンを少なくとも１種（すなわち、１種又は２種以上）使用する。本発明方法を用いて、液相内のビリルビンオキシダーゼ（すなわち、ビリルビンオキシダーゼ溶液中のビリルビンオキシダーゼ）の活性を安定化する場合には、前記ビリルビンオキシダーゼ溶液中に前記の特定の安定化剤を共存させることができる。
【００１０】
本発明において用いることのできるリチウム化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、無機塩、例えば、炭酸リチウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、又は四ホウ酸リチウム、あるいは、有機塩、例えば、酢酸リチウム、クエン酸リチウム、乳酸リチウム、又はピルビン酸リチウムを挙げることができる。
【００１１】
本発明において安定化剤として使用する場合の前記リチウム化合物の濃度は、ビリルビンオキシダーゼ活性の安定化に充分な効果を示す限り、特に限定されるものではないが、好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭの範囲で用いることができる。
【００１２】
本発明において用いることのできるホモシスチンは、式：
ＨＯＯＣＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2ＣＨ2Ｓ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
で表される化合物である。前記ホモシスチンとしては、Ｄ体、Ｌ体、又はＤＬ体（ラセミ体）を用いることができる。
本発明において安定化剤として使用する場合の前記ホモシスチンの濃度は、ビリルビンオキシダーゼ活性の安定化に充分な効果を示す限り、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの範囲で用いることができる。
【００１３】
本発明において、安定化剤として、リチウム化合物又はホモシスチンを２種以上用いる場合には、リチウム化合物１種以上とホモシスチンとを組み合わせて用いることもできるし、あるいは、リチウム化合物のみを２種以上組み合わせて用いることもできる。リチウム化合物又はホモシスチンを２種以上用いる場合の各化合物の濃度は、ビリルビンオキシダーゼ活性の安定化に充分な効果を示す限り、特に限定されるものではないが、それぞれ、先に述べた濃度範囲で用いることが好ましい。
【００１４】
本発明においては、ビリルビンオキシダーゼとして、通常のビリルビン分析に使用されているビリルビンオキシダーゼを用いることができる。前記ビリルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｃａｒｉａ）由来のビリルビンオキシダーゼ、バチルス・リフェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のビリルビンオキシダーゼ、又はスエヒロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）由来のビリルビンオキシダーゼなどを挙げることができる。
【００１５】
本発明において用いるビリルビンオキシダーゼの濃度は、それを用いて行なう所望のビリルビン分析（例えば、総ビリルビン測定、抱合ビリルビン測定、又は直接ビリルビン測定）において正確に分析を実施する濃度である限り、特に限定されるものではない。例えば、総ビリルビン測定においては、通常、０．０１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０Ｕ／ｍｌであり、抱合ビリルビン測定又は直接ビリルビン測定においては、通常、０．０１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１０Ｕ／ｍｌである。
【００１６】
本発明において、ビリルビンオキシダーゼと安定化剤とを溶液状態で共存させる場合には、そのｐＨは、ビリルビンオキシダーゼの活性が急激に損なわれることのないｐＨである限り、特に限定されるものではないが、ビリルビンオキシダーゼの活性が比較的安定であるとされるｐＨ８〜１１の範囲であることが好ましく、ｐＨ９〜１０の範囲であることがより好ましい。
【００１７】
本発明においては、前記ｐＨを保持することのできる緩衝液である限り、特に限定されるものではないが、ビリルビンオキシダーゼの安定化に好適な緩衝液としては、例えば、以下の緩衝液成分を用いることができる：
２−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（略称＝ＨＥＰＥＳ）；
２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（略称＝ＴＡＰＳＯ）；
ピペラジン−１、４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸（略称＝ＰＯＰＳＯ）；
２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（略称＝ＨＥＰＰＳＯ）；
３−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（略称＝ＥＰＰＳ）；
Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略称＝Ｔｒｉｃｉｎｅ）；
Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（略称＝Ｂｉｃｉｎｅ）；
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（略称＝ＴＡＰＳ）；
Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（略称＝ＣＨＥＳ）；
Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノエタンスルホン酸（略称＝ＣＡＰＳＯ）；
Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノエタンスルホン酸（略称＝ＣＡＰＳ）；
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（略称＝Ｔｒｉｓ）；
リン酸塩（例えば、リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム）；並びに
ホウ酸及びホウ酸塩（例えば、四ホウ酸ナトリウム）。
【００１８】
本発明においては、前記の特定の安定化剤、前記ビリルビンオキシダーゼ、及び前記緩衝液成分の他にも、所望のビリルビン分析に応じて、それに必要な種々の公知成分を、更に使用することができる。
例えば、血清中のビリルビン測定には、血清由来の成分による測定誤差要因（例えば、脂肪等による乳濁、アスコルビン酸、又は溶血ヘモグロビン）を回避するために有用な成分、例えば、界面活性剤、アスコルビン酸オキシダーゼ、還元剤、酸化剤、又はその他各種の添加剤を共存させることができ、更に場合により、防腐剤を共存させることができる。
また、ビリルビン測定では、一般的にビリルビンオキシダーゼの反応組成条件を適切に設定することにより、総ビリルビン並びに抱合ビリルビン及び直接ビリルビン等の分別測定が可能であるので、ビリルビンの分別測定に必要な成分、例えば、反応促進剤（例えば、界面活性剤等）又は反応抑制剤（例えば、フッ化ナトリウム等）を目的に応じて適宜選択して使用することもできる。
【００１９】
本発明において、前記の特定の安定化剤、前記ビリルビンオキシダーゼ、及び前記緩衝液成分、並びに必要に応じて使用することのできるその他の各種成分を含有するビリルビンオキシダーゼ溶液を調製する場合には、各成分が充分に溶解し、しかも、ビリルビンオキシダーゼの活性が実質的に損なわれない限り、それらの添加順序は特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨを予め調整した前記緩衝液に、必要に応じて界面活性剤及び／又は防腐剤等を添加した後に、安定化剤をそのまま、あるいは、適当な溶液に溶解した状態で添加したところで、ｐＨを再度調整し直し、最後にビリルビンオキシダーゼを添加することにより、ビリルビンオキシダーゼ溶液を調製することができる。
【００２０】
前記安定化剤としてリチウム化合物のみを用いる場合には、緩衝液成分、界面活性剤、及び／又は防腐剤等を含む溶液に、リチウム化合物を直接添加しても、リチウム化合物は溶解性が高く、しかも、ｐＨ変動をわずかしか与えないので、差し支えない。
一方、前記安定化剤としてホモシスチンを用いる場合には、ホモシスチンは中性のｐＨ範囲ではほとんど溶解しない。従って、酸性水溶液にホモシスチンを予め溶解し、このホモシスチン酸性溶液と、緩衝液成分、界面活性剤、及び／又は防腐剤等を含む溶液とを混合することが好ましい。前記ホモシスチン酸性溶液は、例えば、予め添加する濃度の約１０〜５０倍程度の濃度でホモシスチンを塩酸等の酸性成分により溶解しておくことにより調製することができる。
【００２１】
本発明によるビリルビンオキシダーゼの安定化方法を用いることにより、臨床検査試薬として長期間保存可能なビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬を構成することができる。前記ビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬には、総ビリルビン分析用キット及び総ビリルビン分析用試薬、抱合ビリルビン分析用キット及び抱合ビリルビン分析用試薬、並びに直接ビリルビン分析用キット及び直接ビリルビン分析用試薬が含まれる。本発明を用いたビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬は、ビリルビンオキシダーゼと、前記の特定の安定化剤（すなわち、リチウム化合物又はホモシスチン）とを含有すること、及び前記ビリルビンオキシダーゼが溶液状態で供給される（すなわち、液状試薬として供給される）場合には、その液状試薬中に前記安定化剤を共存させることを除けば、従来公知のビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬と同じ試薬構成とすることができる。
【００２２】
例えば、本発明を用いたビリルビン分析用キットは、ビリルビンオキシダーゼと、前記の特定の安定化剤（すなわち、リチウム化合物又はホモシスチン）とを少なくとも含有し、通常、前記緩衝液成分を更に含有し、場合により、所望のビリルビン分析に応じて選択することのできる種々の前記公知成分を含有することができる。
また、本発明を用いたビリルビン分析用キットは、二試薬以上の形態で供給するが、キットを構成する各試薬は、それぞれ独立に、液状試薬であることもできるし、あるいは、凍結乾燥試薬であることもできる。前記試薬が溶液状態である場合には、その液状試薬中におけるリチウム化合物又はホモシスチンの濃度は、特に限定されるものではないが、先に述べた濃度範囲であることが好ましい。一方、前記試薬が凍結乾燥状態である場合には、その凍結乾燥状態にある試薬に含有されるリチウム化合物又はホモシスチンの量は、特に限定されるものではないが、凍結乾燥状態にある試薬を溶解した際に、先に述べた濃度範囲になる量であることが好ましい。
【００２３】
本発明を用いてビリルビン分析用キットを構成する場合、測定方法により以下の二種の形態を挙げることができる。
第１の形態では、主に緩衝液成分を含有する試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）と、主に緩衝液成分を含有する前記試薬と同一成分を含有する溶液にビリルビンオキシダーゼ及び安定化剤を添加したビリルビンオキシダーゼ含有試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）とで構成される。この形態では、血清等の検体と主に緩衝液成分を含有する前記試薬とを混合し、所定温度で所定時間加温した反応液の吸光度と、それとは別に、血清等の検体と前記ビリルビンオキシダーゼ含有試薬とを混合し、所定温度で所定時間加温した反応液の吸光度との差より、検体中のビリルビンを測定することができる。
【００２４】
第２の形態では、主に緩衝液成分を含有する試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）と、主にビリルビンオキシダーゼ及び安定化剤を含有するビリルビンオキシダーゼ含有試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）とで構成される。この形態では、血清等の検体と主に緩衝液成分を含有する前記試薬を混合し、所定温度で所定時間加温した後の反応液の吸光度と、その反応液に、更に、前記ビリルビンオキシダーゼ含有試薬を混合し、所定温度で所定時間加温した後の反応液の吸光度との差より、検体中のビリルビンを測定することができる。
前記の二種の試薬構成において、主に緩衝液成分を含有する前記試薬、及び／又は前記ビリルビンオキシダーゼ含有試薬に対して必要に応じてそれぞれ各種成分、すなわち、反応促進剤、反応抑制剤、又は血清由来の測定誤差要因を回避するための添加剤等を各々添加することができる。
【００２５】
本発明を用いたビリルビン分析用キットは、前記の特定の安定化剤（すなわち、リチウム化合物又はホモシスチン）を含有し、従って、溶液状態においてもビリルビンオキシダーゼの酵素活性が長期間安定に保たれること以外は、公知のビリルビン分析用キットと何ら変わるものではない。従って、本発明を用いたビリルビン分析用キットは、公知のビリルビン分析用キットと同じようにして、ビリルビンの分析（例えば、総ビリルビンの分析、抱合ビリルビンの分析、又は直接ビリルビンの分析）に用いることができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２７】
以下の実施例１〜４では、市販のミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｃａｒｉａ）由来のビリルビンオキシダーゼ（天野製薬製）を用いた。
また、ビリルビンオキシダーゼの活性測定は、カタログに記載の方法、すなわち、使用したビリルビンオキシダーゼ標品の表示活性値を測定した方法に準じた方法を用いた。具体的には、アルブミン結合ビリルビンを基質とし、コール酸ナトリウム存在下、ビリルビンオキシダーゼの作用による前記アルブミン結合ビリルビンの酸化に伴う４６０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定することにより、ビリルビンオキシダーゼ活性を求めた。
【００２８】
詳細な測定手順を以下に示す。
アルブミン結合ビリルビン（自家製）３０ｍｇを、５０μＭ ＥＤＴＡ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０；以下、ビリルビンオキシダーゼ希釈用液と称する）１ｍｌに溶解し、基質溶液とした。また、コール酸ナトリウム（和光純薬製）０．５ｇを前記ビリルビンオキシダーゼ希釈用液５０ｍｌに溶解し、コール酸ナトリウム含有緩衝液とした。石英セルに、前記コール酸ナトリウム含有緩衝液３ｍｌ及び前記基質溶液０．２ｍｌを加え、混合した後に、３７℃にて予加温した。１０分後に、前記石英セルに、前記ビリルビンオキシダーゼ希釈用液で希釈したビリルビンオキシダーゼ溶液０．１ｍｌを加えて混合し、反応を開始した。
【００２９】
波長４６０ｎｍにおいて、反応開始後１分経過時と、３分経過時の吸光度とをそれぞれ測定し、その間（２分間）の吸光度変化量［ΔＡ］を算出した。また、前記ビリルビンオキシダーゼ溶液の代わりに、前記ビリルビンオキシダーゼ希釈用液を用いて同様に測定し、ブランクの吸光度変化量［ΔＡｂ］を算出した。続いて、以下の計算式により、ビリルビンオキシダーゼ溶液におけるビリルビンオキシダーゼ活性（単位＝Ｕ／ｍｌ）を算出した。
ビリルビンオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛（ΔＡ−ΔＡｂ）／２｝×｛３．３／（０．１×５９．７）｝×ｄ
上記式で、ｄは、ビリルビンオキシダーゼ希釈用液による希釈倍数である。
【００３０】
【実施例１】
《リチウム化合物によるビリルビンオキシダーゼの安定化効果》
２５ｍＭ Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝液（ｐＨ９．５）に３２ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸及び０．０５％トリトンＸ−１００を添加してなる基本緩衝液組成物に、以下の表１に記載の各リチウム化合物１００ｍＭを添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。この各添加剤含有緩衝液にビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを各々添加して本発明試験液を調製し、試験液を２５℃にて２週間保存した後に、ビリルビンオキシダーゼ活性を測定し、ビリルビンオキシダーゼの安定化効果を確認した。比較のため、リチウム化合物の代わりにナトリウム化合物を同様に添加して調製した比較用試験液の活性を測定し、ビリルビンオキシダーゼの安定化効果を調べた。
【００３１】
結果を表１に示す。表１に示す数値（単位＝％）は、試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存活性の割合である。また、表１の「無添加」の欄は、リチウム化合物又はナトリウム化合物を添加しないで調製した対照用試験液の結果を示す。
【００３２】
【００３３】
【実施例２】
《リチウム添加濃度によるビリルビンオキシダーゼの安定化効果の変化》
本実施例では、リチウム化合物の濃度の変化と安定化効果の変化との関係を調べた。前記実施例１で使用したのと同じ基本緩衝液組成物に、硫酸リチウムを１０〜３００ｍＭの濃度範囲で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。同様に前記基本緩衝液組成物にクエン酸リチウムを１００〜３００ｍＭの濃度範囲で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。これらのリチウム化合物含有緩衝液にビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを各々添加して試験液を調製し、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。結果を表２に示す。表２に示す数値（単位＝％）は、試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存活性の割合であり、表２の「無添加」の欄は、各リチウム化合物を添加しないで調製した対照用試験液の結果を示す。
【００３４】
【００３５】
【実施例３】
《ホモシスチンによるビリルビンオキシダーゼの安定化効果》
ホモシスチンに関しても、添加濃度の変化と安定化効果の変化との関係を前記実施例２と同様に調べた。
すなわち、前記実施例１で使用したのと同じ基本緩衝液組成物に、ＤＬ−ホモシスチンを１〜１０ｍＭの濃度範囲で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。こうして調製した各ＤＬ−ホモシスチン含有緩衝液にビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを各々添加して試験液を調製し、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。結果を表３に示す。表３に示す数値（単位＝％）は、試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存活性の割合であり、表３の「無添加」の欄は、ホモシスチンを添加しないで調製した対照用試験液の結果を示す。
【００３６】
【００３７】
【実施例４】
《リチウム化合物とホモシスチンとの組み合わせによる安定化効果》
本実施例では、リチウム化合物の中でも、ビリルビンオキシダーゼに対して比較的安定化効果の高い硫酸リチウムと、ホモシスチンとの組合せによる安定化効果を確認した。前記実施例１で使用したのと同じ基本緩衝液組成物に、１００ｍＭ若しくは３００ｍＭ硫酸リチウム又は２．５ｍＭ ＤＬ−ホモシスチンをそれぞれ単独で、あるいは、１００ｍＭ若しくは３００ｍＭ硫酸リチウム及び２．５ｍＭ ＤＬ−ホモシスチンを両方とも添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。続いて、ビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを更に添加して本発明試験液を調製し、１０℃にて１０週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性、あるいは、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。
【００３８】
更に、比較試験として、安定化効果が高いとみられる公知の安定化方法による効果も同時に確認した。すなわち、前記基本緩衝液組成物（ＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ９．５を含む）に、特許第２８２０８９３号明細書に記載されている緩衝液とカルボン酸との組み合わせの一例として、ここではＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ９．５に酒石酸ナトリウムカリウムを１００ｍＭの量で添加するか、あるいは、特開平１０−７５７７９号公報に記載の含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の中でも特に効果が高い２−メルカプト−１−メチルイミダゾール（ＭＭＩ）を２５ｍＭの量で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。続いて、ビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを更に添加して比較用試験液を調製し、１０℃にて１０週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性、あるいは、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。
【００３９】
結果を表４に示す。表４に示す数値（単位＝％）は、各試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存活性の割合である。また、表４に示す（１）〜（７）は、それぞれ、（１）無添加［すなわち、安定化剤を添加しないで調製した対照用試験液］の場合、（２）１００ｍＭ硫酸リチウムを添加した本発明試験液の場合、（３）３００ｍＭ硫酸リチウムを添加した本発明試験液の場合、（４）１００ｍＭ硫酸リチウム及び２．５ｍＭＤＬ−ホモシスチンを添加した本発明試験液の場合、（５）３００ｍＭ硫酸リチウム及び２．５ｍＭＤＬ−ホモシスチンを添加した本発明試験液の場合、（６）１００ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウムを添加した比較用試験液の場合、並びに（７）２５ｍＭ ＭＭＩを添加した比較用試験液の場合を意味する。
【００４０】
【００４１】
特許第２８２０８９３号明細書記載の実施例としては、緩衝液とカルボン酸との組み合わせとしての一例として、ビリルビンオキシダーゼを含有する１０ｍＭＮ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ１０．０）に、８８．５ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウムを添加した場合、及び酒石酸ナトリウムカリウムを無添加の場合の、２５℃で１４日間保存した後の残存活性は、それぞれ４７．２％及び３１．８％であり、酒石酸ナトリウムカリウムの効果が顕著であることが記載されている。
また、特開平１０−７５７７９号公報には、ビリルビンオキシダーゼを含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に、２５ｍＭ ＭＭＩを添加した場合と、ＭＭＩ無添加の場合とでは、３０℃で６日保存した後、それぞれ８４．８％及び２８．０％の残存活性がある旨記載されており、ＭＭＩの安定化効果が顕著であることが記載されている。
【００４２】
前記公報又は前記特許明細書に記載された各従来方法と比較すると、本発明方法によるビリルビンオキシダーゼの安定化効果が高いことが確認された。すなわち、溶液中でのビリルビンオキシダーゼの活性を安定化するために、リチウム化合物又はホモシスチンを少なくとも１種（すなわち、１種又は２種以上）を安定化剤として使用することが有効であることが確認された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明のビリルビンオキシダーゼの安定化方法によれば、液状ではかなり不安定であることが知られているビリルビンオキシダーゼの酵素活性を、溶液状態においても長期間安定に保つことができる。
本発明を用いたビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬によれば、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性が溶液状態においても長期間安定に保たれるので、液状形態で試薬を供給することができ、臨床検査時における試薬の再溶解の手間を省くことができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビリルビンオキシダーゼの安定化方法に関する。本発明方法によれば、例えば、ビリルビンオキシダーゼを液状の形態にて保存する場合において、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性を長期間安定に保持することができる。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビンをビリベルジンに酸化させる反応を触媒する酵素であり、臨床検査の分野において血清等の生体試料中のビリルビンを光学的に測定するために広く利用されている酵素である。血清中ビリルビンの測定は、肝胆道系疾患や黄疸等の臨床診断において重要な検査となっている。ビリルビン測定においては、測定すべきビリルビン種対象物に応じて、ｐＨ、界面活性剤、及び／又は添加剤の添加等により測定条件を調節し、ビリルビンオキシダーゼの酵素反応を促進、あるいは、抑制することによって、総ビリルビン値、抱合ビリルビン値、又は直接ビリルビン値として病態の判断に有用な数値を得ることができる。
【０００３】
ビリルビンを測定するための試薬は、通常、二試薬より構成され、総ビリルビン測定用試薬、抱合ビリルビン測定用試薬、又は直接ビリルビン測定用試薬のいずれも、主に緩衝液よりなる試薬、及び主にビリルビンオキシダーゼよりなる試薬等で構成されることが多い。ビリルビンオキシダーゼは、液状ではかなり不安定であるが、凍結乾燥状態では比較的安定であるため、凍結乾燥品の形態で供給され、緩衝液等で再溶解して使用されてきた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ビリルビンオキシダーゼは、先に述べたように、液状ではかなり不安定で、ｐＨ９．２〜９．７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で９６時間安定であるにすぎない［アグリカルチュアル・アンド・バイオロジカルケミストリー，第４６巻，第８号，２０３１〜２０３４頁，１９８２年］。そのため、従来市販されてきたビリルビンオキシダーゼを凍結乾燥形態とするビリルビン測定試薬においては、ビリルビンオキシダーゼの活性は、溶解後、徐々に低下し、溶解後の使用期間としては概ね２〜３週間に限定されてきた。更に、近年、臨床検査用試薬においては凍結乾燥品試薬の溶解の手間を省くため、液状形態の試薬が供給されるようになってきており、試薬の長期間の安定化が要求されつつある。そのため、ビリルビンオキシダーゼの安定化について、これまでにいくつかの方法が試みられてきた。
【０００５】
このような安定化の試みとしては、例えば、ジエチルバルビツール酸ナトリウム・塩酸等のｐＨ８〜１０の緩衝液に、乳糖アラニン、グリシン、牛アルブミン、又はシクロデキストリン等の安定化剤を添加する方法（特開昭６０−１５１５６１号公報）、ｐＨ７〜９の緩衝液にて保存する方法（特開昭６１−２０９５８７号公報）、あるいは、アスパラギン酸又はトリプトファンを添加して安定化する方法（特開平６−２８４８８６号公報）等がある。しかし、これらの条件でのビリルビンオキシダーゼの安定化効果は不充分であり、前記方法では、液状の試薬としての供給はかなり困難であった。
【０００６】
その後、更に、ビリルビンオキシダーゼを安定化する技術が発表され、例えば、ハロゲン化物塩存在下で保存する方法（特開平７−２０３９６２号公報）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸等の緩衝液とカルボン酸との組み合わせによる安定化方法（特許第２８２０８９３号明細書）、還元剤（具体的には、チオ硫酸、亜硫酸、若しくは硫酸水素等、若しくはそれらの塩、又はチオール類、ジチオール類、カテキン、若しくはアスコルビン酸等）を添加した安定化方法（特開平１０−４２８６９号公報）、あるいは、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール等の含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体による安定化方法（特開平１０−７５７７９号公報）などが公開されている。しかし、これらの方法は、酵素単独の水溶液での安定性には効果があるものの、実際のビリルビン測定試薬の第二試薬、すなわち、ビリルビンオキシダーゼ以外に反応促進剤や種々の界面活性剤等を含有する第二試薬におけるビリルビンオキシダーゼの安定性を満足することのできるものではなかった。
【０００７】
ビリルビンオキシダーゼに加えて反応促進剤や種々の界面活性剤等を含む液状試薬中におけるビリルビンオキシダーゼの酵素活性を安定に保つ手段を開発するために、本発明者らは検討を行った結果、安定化剤として、リチウム化合物又はホモシスチンを少なくとも１種（すなわち、１種又は２種以上）共存させることにより、前記液状試薬中におけるビリルビンオキシダーゼの安定化を達成することができることを見出した。
すなわち、本発明の課題は、これまで述べたように、溶液状態では不安定なビリルビンオキシダーゼの酵素活性を溶液状態で長期間安定に保つための方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、リチウム化合物又はホモシスチンを安定化剤として用いることを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼの安定化方法によって解決することができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明においては、ビリルビンオキシダーゼ（特には、溶液中でのビリルビンオキシダーゼ）の活性を安定化するための安定化剤として、リチウム化合物又はホモシスチンを少なくとも１種（すなわち、１種又は２種以上）使用する。本発明方法を用いて、液相内のビリルビンオキシダーゼ（すなわち、ビリルビンオキシダーゼ溶液中のビリルビンオキシダーゼ）の活性を安定化する場合には、前記ビリルビンオキシダーゼ溶液中に前記の特定の安定化剤を共存させることができる。
【００１０】
本発明において用いることのできるリチウム化合物としては、特に限定されるものではないが、例えば、無機塩、例えば、炭酸リチウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、又は四ホウ酸リチウム、あるいは、有機塩、例えば、酢酸リチウム、クエン酸リチウム、乳酸リチウム、又はピルビン酸リチウムを挙げることができる。
【００１１】
本発明において安定化剤として使用する場合の前記リチウム化合物の濃度は、ビリルビンオキシダーゼ活性の安定化に充分な効果を示す限り、特に限定されるものではないが、好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭの範囲で用いることができる。
【００１２】
本発明において用いることのできるホモシスチンは、式：
ＨＯＯＣＣＨ（ＮＨ2）ＣＨ2ＣＨ2Ｓ−ＳＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ
で表される化合物である。前記ホモシスチンとしては、Ｄ体、Ｌ体、又はＤＬ体（ラセミ体）を用いることができる。
本発明において安定化剤として使用する場合の前記ホモシスチンの濃度は、ビリルビンオキシダーゼ活性の安定化に充分な効果を示す限り、特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの範囲で用いることができる。
【００１３】
本発明において、安定化剤として、リチウム化合物又はホモシスチンを２種以上用いる場合には、リチウム化合物１種以上とホモシスチンとを組み合わせて用いることもできるし、あるいは、リチウム化合物のみを２種以上組み合わせて用いることもできる。リチウム化合物又はホモシスチンを２種以上用いる場合の各化合物の濃度は、ビリルビンオキシダーゼ活性の安定化に充分な効果を示す限り、特に限定されるものではないが、それぞれ、先に述べた濃度範囲で用いることが好ましい。
【００１４】
本発明においては、ビリルビンオキシダーゼとして、通常のビリルビン分析に使用されているビリルビンオキシダーゼを用いることができる。前記ビリルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｃａｒｉａ）由来のビリルビンオキシダーゼ、バチルス・リフェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のビリルビンオキシダーゼ、又はスエヒロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）由来のビリルビンオキシダーゼなどを挙げることができる。
【００１５】
本発明において用いるビリルビンオキシダーゼの濃度は、それを用いて行なう所望のビリルビン分析（例えば、総ビリルビン測定、抱合ビリルビン測定、又は直接ビリルビン測定）において正確に分析を実施する濃度である限り、特に限定されるものではない。例えば、総ビリルビン測定においては、通常、０．０１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０Ｕ／ｍｌであり、抱合ビリルビン測定又は直接ビリルビン測定においては、通常、０．０１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜１０Ｕ／ｍｌである。
【００１６】
本発明において、ビリルビンオキシダーゼと安定化剤とを溶液状態で共存させる場合には、そのｐＨは、ビリルビンオキシダーゼの活性が急激に損なわれることのないｐＨである限り、特に限定されるものではないが、ビリルビンオキシダーゼの活性が比較的安定であるとされるｐＨ８〜１１の範囲であることが好ましく、ｐＨ９〜１０の範囲であることがより好ましい。
【００１７】
本発明においては、前記ｐＨを保持することのできる緩衝液である限り、特に限定されるものではないが、ビリルビンオキシダーゼの安定化に好適な緩衝液としては、例えば、以下の緩衝液成分を用いることができる：
２−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（略称＝ＨＥＰＥＳ）；
２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（略称＝ＴＡＰＳＯ）；
ピペラジン−１、４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸（略称＝ＰＯＰＳＯ）；
２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（略称＝ＨＥＰＰＳＯ）；
３−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（略称＝ＥＰＰＳ）；
Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略称＝Ｔｒｉｃｉｎｅ）；
Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（略称＝Ｂｉｃｉｎｅ）；
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（略称＝ＴＡＰＳ）；
Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（略称＝ＣＨＥＳ）；
Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノエタンスルホン酸（略称＝ＣＡＰＳＯ）；
Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノエタンスルホン酸（略称＝ＣＡＰＳ）；
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（略称＝Ｔｒｉｓ）；
リン酸塩（例えば、リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム）；並びに
ホウ酸及びホウ酸塩（例えば、四ホウ酸ナトリウム）。
【００１８】
本発明においては、前記の特定の安定化剤、前記ビリルビンオキシダーゼ、及び前記緩衝液成分の他にも、所望のビリルビン分析に応じて、それに必要な種々の公知成分を、更に使用することができる。
例えば、血清中のビリルビン測定には、血清由来の成分による測定誤差要因（例えば、脂肪等による乳濁、アスコルビン酸、又は溶血ヘモグロビン）を回避するために有用な成分、例えば、界面活性剤、アスコルビン酸オキシダーゼ、還元剤、酸化剤、又はその他各種の添加剤を共存させることができ、更に場合により、防腐剤を共存させることができる。
また、ビリルビン測定では、一般的にビリルビンオキシダーゼの反応組成条件を適切に設定することにより、総ビリルビン並びに抱合ビリルビン及び直接ビリルビン等の分別測定が可能であるので、ビリルビンの分別測定に必要な成分、例えば、反応促進剤（例えば、界面活性剤等）又は反応抑制剤（例えば、フッ化ナトリウム等）を目的に応じて適宜選択して使用することもできる。
【００１９】
本発明において、前記の特定の安定化剤、前記ビリルビンオキシダーゼ、及び前記緩衝液成分、並びに必要に応じて使用することのできるその他の各種成分を含有するビリルビンオキシダーゼ溶液を調製する場合には、各成分が充分に溶解し、しかも、ビリルビンオキシダーゼの活性が実質的に損なわれない限り、それらの添加順序は特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨを予め調整した前記緩衝液に、必要に応じて界面活性剤及び／又は防腐剤等を添加した後に、安定化剤をそのまま、あるいは、適当な溶液に溶解した状態で添加したところで、ｐＨを再度調整し直し、最後にビリルビンオキシダーゼを添加することにより、ビリルビンオキシダーゼ溶液を調製することができる。
【００２０】
前記安定化剤としてリチウム化合物のみを用いる場合には、緩衝液成分、界面活性剤、及び／又は防腐剤等を含む溶液に、リチウム化合物を直接添加しても、リチウム化合物は溶解性が高く、しかも、ｐＨ変動をわずかしか与えないので、差し支えない。
一方、前記安定化剤としてホモシスチンを用いる場合には、ホモシスチンは中性のｐＨ範囲ではほとんど溶解しない。従って、酸性水溶液にホモシスチンを予め溶解し、このホモシスチン酸性溶液と、緩衝液成分、界面活性剤、及び／又は防腐剤等を含む溶液とを混合することが好ましい。前記ホモシスチン酸性溶液は、例えば、予め添加する濃度の約１０〜５０倍程度の濃度でホモシスチンを塩酸等の酸性成分により溶解しておくことにより調製することができる。
【００２１】
本発明によるビリルビンオキシダーゼの安定化方法を用いることにより、臨床検査試薬として長期間保存可能なビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬を構成することができる。前記ビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬には、総ビリルビン分析用キット及び総ビリルビン分析用試薬、抱合ビリルビン分析用キット及び抱合ビリルビン分析用試薬、並びに直接ビリルビン分析用キット及び直接ビリルビン分析用試薬が含まれる。本発明を用いたビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬は、ビリルビンオキシダーゼと、前記の特定の安定化剤（すなわち、リチウム化合物又はホモシスチン）とを含有すること、及び前記ビリルビンオキシダーゼが溶液状態で供給される（すなわち、液状試薬として供給される）場合には、その液状試薬中に前記安定化剤を共存させることを除けば、従来公知のビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬と同じ試薬構成とすることができる。
【００２２】
例えば、本発明を用いたビリルビン分析用キットは、ビリルビンオキシダーゼと、前記の特定の安定化剤（すなわち、リチウム化合物又はホモシスチン）とを少なくとも含有し、通常、前記緩衝液成分を更に含有し、場合により、所望のビリルビン分析に応じて選択することのできる種々の前記公知成分を含有することができる。
また、本発明を用いたビリルビン分析用キットは、二試薬以上の形態で供給するが、キットを構成する各試薬は、それぞれ独立に、液状試薬であることもできるし、あるいは、凍結乾燥試薬であることもできる。前記試薬が溶液状態である場合には、その液状試薬中におけるリチウム化合物又はホモシスチンの濃度は、特に限定されるものではないが、先に述べた濃度範囲であることが好ましい。一方、前記試薬が凍結乾燥状態である場合には、その凍結乾燥状態にある試薬に含有されるリチウム化合物又はホモシスチンの量は、特に限定されるものではないが、凍結乾燥状態にある試薬を溶解した際に、先に述べた濃度範囲になる量であることが好ましい。
【００２３】
本発明を用いてビリルビン分析用キットを構成する場合、測定方法により以下の二種の形態を挙げることができる。
第１の形態では、主に緩衝液成分を含有する試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）と、主に緩衝液成分を含有する前記試薬と同一成分を含有する溶液にビリルビンオキシダーゼ及び安定化剤を添加したビリルビンオキシダーゼ含有試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）とで構成される。この形態では、血清等の検体と主に緩衝液成分を含有する前記試薬とを混合し、所定温度で所定時間加温した反応液の吸光度と、それとは別に、血清等の検体と前記ビリルビンオキシダーゼ含有試薬とを混合し、所定温度で所定時間加温した反応液の吸光度との差より、検体中のビリルビンを測定することができる。
【００２４】
第２の形態では、主に緩衝液成分を含有する試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）と、主にビリルビンオキシダーゼ及び安定化剤を含有するビリルビンオキシダーゼ含有試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）とで構成される。この形態では、血清等の検体と主に緩衝液成分を含有する前記試薬を混合し、所定温度で所定時間加温した後の反応液の吸光度と、その反応液に、更に、前記ビリルビンオキシダーゼ含有試薬を混合し、所定温度で所定時間加温した後の反応液の吸光度との差より、検体中のビリルビンを測定することができる。
前記の二種の試薬構成において、主に緩衝液成分を含有する前記試薬、及び／又は前記ビリルビンオキシダーゼ含有試薬に対して必要に応じてそれぞれ各種成分、すなわち、反応促進剤、反応抑制剤、又は血清由来の測定誤差要因を回避するための添加剤等を各々添加することができる。
【００２５】
本発明を用いたビリルビン分析用キットは、前記の特定の安定化剤（すなわち、リチウム化合物又はホモシスチン）を含有し、従って、溶液状態においてもビリルビンオキシダーゼの酵素活性が長期間安定に保たれること以外は、公知のビリルビン分析用キットと何ら変わるものではない。従って、本発明を用いたビリルビン分析用キットは、公知のビリルビン分析用キットと同じようにして、ビリルビンの分析（例えば、総ビリルビンの分析、抱合ビリルビンの分析、又は直接ビリルビンの分析）に用いることができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２７】
以下の実施例１〜４では、市販のミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｃａｒｉａ）由来のビリルビンオキシダーゼ（天野製薬製）を用いた。
また、ビリルビンオキシダーゼの活性測定は、カタログに記載の方法、すなわち、使用したビリルビンオキシダーゼ標品の表示活性値を測定した方法に準じた方法を用いた。具体的には、アルブミン結合ビリルビンを基質とし、コール酸ナトリウム存在下、ビリルビンオキシダーゼの作用による前記アルブミン結合ビリルビンの酸化に伴う４６０ｎｍにおける吸光度の減少速度を測定することにより、ビリルビンオキシダーゼ活性を求めた。
【００２８】
詳細な測定手順を以下に示す。
アルブミン結合ビリルビン（自家製）３０ｍｇを、５０μＭ ＥＤＴＡ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０；以下、ビリルビンオキシダーゼ希釈用液と称する）１ｍｌに溶解し、基質溶液とした。また、コール酸ナトリウム（和光純薬製）０．５ｇを前記ビリルビンオキシダーゼ希釈用液５０ｍｌに溶解し、コール酸ナトリウム含有緩衝液とした。石英セルに、前記コール酸ナトリウム含有緩衝液３ｍｌ及び前記基質溶液０．２ｍｌを加え、混合した後に、３７℃にて予加温した。１０分後に、前記石英セルに、前記ビリルビンオキシダーゼ希釈用液で希釈したビリルビンオキシダーゼ溶液０．１ｍｌを加えて混合し、反応を開始した。
【００２９】
波長４６０ｎｍにおいて、反応開始後１分経過時と、３分経過時の吸光度とをそれぞれ測定し、その間（２分間）の吸光度変化量［ΔＡ］を算出した。また、前記ビリルビンオキシダーゼ溶液の代わりに、前記ビリルビンオキシダーゼ希釈用液を用いて同様に測定し、ブランクの吸光度変化量［ΔＡｂ］を算出した。続いて、以下の計算式により、ビリルビンオキシダーゼ溶液におけるビリルビンオキシダーゼ活性（単位＝Ｕ／ｍｌ）を算出した。
ビリルビンオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）＝
｛（ΔＡ−ΔＡｂ）／２｝×｛３．３／（０．１×５９．７）｝×ｄ
上記式で、ｄは、ビリルビンオキシダーゼ希釈用液による希釈倍数である。
【００３０】
【実施例１】
《リチウム化合物によるビリルビンオキシダーゼの安定化効果》
２５ｍＭ Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝液（ｐＨ９．５）に３２ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸及び０．０５％トリトンＸ−１００を添加してなる基本緩衝液組成物に、以下の表１に記載の各リチウム化合物１００ｍＭを添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。この各添加剤含有緩衝液にビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを各々添加して本発明試験液を調製し、試験液を２５℃にて２週間保存した後に、ビリルビンオキシダーゼ活性を測定し、ビリルビンオキシダーゼの安定化効果を確認した。比較のため、リチウム化合物の代わりにナトリウム化合物を同様に添加して調製した比較用試験液の活性を測定し、ビリルビンオキシダーゼの安定化効果を調べた。
【００３１】
結果を表１に示す。表１に示す数値（単位＝％）は、試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存活性の割合である。また、表１の「無添加」の欄は、リチウム化合物又はナトリウム化合物を添加しないで調製した対照用試験液の結果を示す。
【００３２】
【実施例２】
《リチウム添加濃度によるビリルビンオキシダーゼの安定化効果の変化》
本実施例では、リチウム化合物の濃度の変化と安定化効果の変化との関係を調べた。前記実施例１で使用したのと同じ基本緩衝液組成物に、硫酸リチウムを１０〜３００ｍＭの濃度範囲で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。同様に前記基本緩衝液組成物にクエン酸リチウムを１００〜３００ｍＭの濃度範囲で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。これらのリチウム化合物含有緩衝液にビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを各々添加して試験液を調製し、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。結果を表２に示す。表２に示す数値（単位＝％）は、試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存活性の割合であり、表２の「無添加」の欄は、各リチウム化合物を添加しないで調製した対照用試験液の結果を示す。
【００３４】
【実施例３】
《ホモシスチンによるビリルビンオキシダーゼの安定化効果》
ホモシスチンに関しても、添加濃度の変化と安定化効果の変化との関係を前記実施例２と同様に調べた。
すなわち、前記実施例１で使用したのと同じ基本緩衝液組成物に、ＤＬ−ホモシスチンを１〜１０ｍＭの濃度範囲で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。こうして調製した各ＤＬ−ホモシスチン含有緩衝液にビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを各々添加して試験液を調製し、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。結果を表３に示す。表３に示す数値（単位＝％）は、試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存活性の割合であり、表３の「無添加」の欄は、ホモシスチンを添加しないで調製した対照用試験液の結果を示す。
【００３６】
【実施例４】
《リチウム化合物とホモシスチンとの組み合わせによる安定化効果》
本実施例では、リチウム化合物の中でも、ビリルビンオキシダーゼに対して比較的安定化効果の高い硫酸リチウムと、ホモシスチンとの組合せによる安定化効果を確認した。前記実施例１で使用したのと同じ基本緩衝液組成物に、１００ｍＭ若しくは３００ｍＭ硫酸リチウム又は２．５ｍＭ ＤＬ−ホモシスチンをそれぞれ単独で、あるいは、１００ｍＭ若しくは３００ｍＭ硫酸リチウム及び２．５ｍＭ ＤＬ−ホモシスチンを両方とも添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。続いて、ビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを更に添加して本発明試験液を調製し、１０℃にて１０週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性、あるいは、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。
【００３８】
更に、比較試験として、安定化効果が高いとみられる公知の安定化方法による効果も同時に確認した。すなわち、前記基本緩衝液組成物（ＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ９．５を含む）に、特許第２８２０８９３号明細書に記載されている緩衝液とカルボン酸との組み合わせの一例として、ここではＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ９．５に酒石酸ナトリウムカリウムを１００ｍＭの量で添加するか、あるいは、特開平１０−７５７７９号公報に記載の含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体の中でも特に効果が高い２−メルカプト−１−メチルイミダゾール（ＭＭＩ）を２５ｍＭの量で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。続いて、ビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを更に添加して比較用試験液を調製し、１０℃にて１０週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性、あるいは、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。
【００３９】
結果を表４に示す。表４に示す数値（単位＝％）は、各試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存活性の割合である。また、表４に示す（１）〜（７）は、それぞれ、（１）無添加［すなわち、安定化剤を添加しないで調製した対照用試験液］の場合、（２）１００ｍＭ硫酸リチウムを添加した本発明試験液の場合、（３）３００ｍＭ硫酸リチウムを添加した本発明試験液の場合、（４）１００ｍＭ硫酸リチウム及び２．５ｍＭＤＬ−ホモシスチンを添加した本発明試験液の場合、（５）３００ｍＭ硫酸リチウム及び２．５ｍＭＤＬ−ホモシスチンを添加した本発明試験液の場合、（６）１００ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウムを添加した比較用試験液の場合、並びに（７）２５ｍＭ ＭＭＩを添加した比較用試験液の場合を意味する。
【００４０】
特許第２８２０８９３号明細書記載の実施例としては、緩衝液とカルボン酸との組み合わせとしての一例として、ビリルビンオキシダーゼを含有する１０ｍＭＮ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ１０．０）に、８８．５ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウムを添加した場合、及び酒石酸ナトリウムカリウムを無添加の場合の、２５℃で１４日間保存した後の残存活性は、それぞれ４７．２％及び３１．８％であり、酒石酸ナトリウムカリウムの効果が顕著であることが記載されている。
また、特開平１０−７５７７９号公報には、ビリルビンオキシダーゼを含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に、２５ｍＭ ＭＭＩを添加した場合と、ＭＭＩ無添加の場合とでは、３０℃で６日保存した後、それぞれ８４．８％及び２８．０％の残存活性がある旨記載されており、ＭＭＩの安定化効果が顕著であることが記載されている。
【００４２】
前記公報又は前記特許明細書に記載された各従来方法と比較すると、本発明方法によるビリルビンオキシダーゼの安定化効果が高いことが確認された。すなわち、溶液中でのビリルビンオキシダーゼの活性を安定化するために、リチウム化合物又はホモシスチンを少なくとも１種（すなわち、１種又は２種以上）を安定化剤として使用することが有効であることが確認された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明のビリルビンオキシダーゼの安定化方法によれば、液状ではかなり不安定であることが知られているビリルビンオキシダーゼの酵素活性を、溶液状態においても長期間安定に保つことができる。
本発明を用いたビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬によれば、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性が溶液状態においても長期間安定に保たれるので、液状形態で試薬を供給することができ、臨床検査時における試薬の再溶解の手間を省くことができる。
Claims (4)
- ホモシスチンを安定化剤として用いることを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼの安定化方法。
- リチウム化合物を更に用いる、請求項１に記載のビリルビンオキシダーゼの安定化方法。
- リチウム化合物（但し、ハロゲン化リチウム、及びカルボン酸のリチウム塩を除く）を安定化剤として用いることを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼの安定化方法。
- 前記リチウム化合物が、炭酸リチウム、硫酸リチウム、又は四ホウ酸リチウムである、請求項３に記載の安定化方法。
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