JP2000253873A - ビリルビンオキシダーゼの安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 溶液状態では不安定なビリルビンオキシダー
ゼの酵素活性を溶液状態で長期間安定に保つための方法
を提供する。 【解決手段】 リチウム化合物又はホモシスチンを安定
化剤として用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビリルビンオキシ
ダーゼの安定化方法に関する。本発明方法によれば、例
えば、ビリルビンオキシダーゼを液状の形態にて保存す
る場合において、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性を
長期間安定に保持することができる。

【０００２】

【従来の技術】ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビン
をビリベルジンに酸化させる反応を触媒する酵素であ
り、臨床検査の分野において血清等の生体試料中のビリ
ルビンを光学的に測定するために広く利用されている酵
素である。血清中ビリルビンの測定は、肝胆道系疾患や
黄疸等の臨床診断において重要な検査となっている。ビ
リルビン測定においては、測定すべきビリルビン種対象
物に応じて、ｐＨ、界面活性剤、及び／又は添加剤の添
加等により測定条件を調節し、ビリルビンオキシダーゼ
の酵素反応を促進、あるいは、抑制することによって、
総ビリルビン値、抱合ビリルビン値、又は直接ビリルビ
ン値として病態の判断に有用な数値を得ることができ
る。

【０００３】ビリルビンを測定するための試薬は、通
常、二試薬より構成され、総ビリルビン測定用試薬、抱
合ビリルビン測定用試薬、又は直接ビリルビン測定用試
薬のいずれも、主に緩衝液よりなる試薬、及び主にビリ
ルビンオキシダーゼよりなる試薬等で構成されることが
多い。ビリルビンオキシダーゼは、液状ではかなり不安
定であるが、凍結乾燥状態では比較的安定であるため、
凍結乾燥品の形態で供給され、緩衝液等で再溶解して使
用されてきた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ビリルビンオキシダー
ゼは、先に述べたように、液状ではかなり不安定で、ｐ
Ｈ９．２〜９．７の０．１Ｍリン酸緩衝液中で９６時間
安定であるにすぎない［アグリカルチュアル・アンド・
バイオロジカルケミストリー，第４６巻，第８号，２０
３１〜２０３４頁，１９８２年］。そのため、従来市販
されてきたビリルビンオキシダーゼを凍結乾燥形態とす
るビリルビン測定試薬においては、ビリルビンオキシダ
ーゼの活性は、溶解後、徐々に低下し、溶解後の使用期
間としては概ね２〜３週間に限定されてきた。更に、近
年、臨床検査用試薬においては凍結乾燥品試薬の溶解の
手間を省くため、液状形態の試薬が供給されるようにな
ってきており、試薬の長期間の安定化が要求されつつあ
る。そのため、ビリルビンオキシダーゼの安定化につい
て、これまでにいくつかの方法が試みられてきた。

【０００５】このような安定化の試みとしては、例え
ば、ジエチルバルビツール酸ナトリウム・塩酸等のｐＨ
８〜１０の緩衝液に、乳糖アラニン、グリシン、牛アル
ブミン、又はシクロデキストリン等の安定化剤を添加す
る方法（特開昭６０−１５１５６１号公報）、ｐＨ７〜
９の緩衝液にて保存する方法（特開昭６１−２０９５８
７号公報）、あるいは、アスパラギン酸又はトリプトフ
ァンを添加して安定化する方法（特開平６−２８４８８
６号公報）等がある。しかし、これらの条件でのビリル
ビンオキシダーゼの安定化効果は不充分であり、前記方
法では、液状の試薬としての供給はかなり困難であっ
た。

【０００６】その後、更に、ビリルビンオキシダーゼを
安定化する技術が発表され、例えば、ハロゲン化物塩存
在下で保存する方法（特開平７−２０３９６２号公
報）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸等の緩衝
液とカルボン酸との組み合わせによる安定化方法（特許
第２８２０８９３号明細書）、還元剤（具体的には、チ
オ硫酸、亜硫酸、若しくは硫酸水素等、若しくはそれら
の塩、又はチオール類、ジチオール類、カテキン、若し
くはアスコルビン酸等）を添加した安定化方法（特開平
１０−４２８６９号公報）、あるいは、２−メルカプト
−１−メチルイミダゾール等の含窒素複素環化合物のメ
ルカプト誘導体による安定化方法（特開平１０−７５７
７９号公報）などが公開されている。しかし、これらの
方法は、酵素単独の水溶液での安定性には効果があるも
のの、実際のビリルビン測定試薬の第二試薬、すなわ
ち、ビリルビンオキシダーゼ以外に反応促進剤や種々の
界面活性剤等を含有する第二試薬におけるビリルビンオ
キシダーゼの安定性を満足することのできるものではな
かった。

【０００７】ビリルビンオキシダーゼに加えて反応促進
剤や種々の界面活性剤等を含む液状試薬中におけるビリ
ルビンオキシダーゼの酵素活性を安定に保つ手段を開発
するために、本発明者らは検討を行った結果、安定化剤
として、リチウム化合物又はホモシスチンを少なくとも
１種（すなわち、１種又は２種以上）共存させることに
より、前記液状試薬中におけるビリルビンオキシダーゼ
の安定化を達成することができることを見出した。すな
わち、本発明の課題は、これまで述べたように、溶液状
態では不安定なビリルビンオキシダーゼの酵素活性を溶
液状態で長期間安定に保つための方法を提供することに
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
る、リチウム化合物又はホモシスチンを安定化剤として
用いることを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼの安
定化方法によって解決することができる。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明においては、ビリルビンオ
キシダーゼ（特には、溶液中でのビリルビンオキシダー
ゼ）の活性を安定化するための安定化剤として、リチウ
ム化合物又はホモシスチンを少なくとも１種（すなわ
ち、１種又は２種以上）使用する。本発明方法を用い
て、液相内のビリルビンオキシダーゼ（すなわち、ビリ
ルビンオキシダーゼ溶液中のビリルビンオキシダーゼ）
の活性を安定化する場合には、前記ビリルビンオキシダ
ーゼ溶液中に前記の特定の安定化剤を共存させることが
できる。

【００１０】本発明において用いることのできるリチウ
ム化合物としては、特に限定されるものではないが、例
えば、無機塩、例えば、炭酸リチウム、塩化リチウム、
硫酸リチウム、又は四ホウ酸リチウム、あるいは、有機
塩、例えば、酢酸リチウム、クエン酸リチウム、乳酸リ
チウム、又はピルビン酸リチウムを挙げることができ
る。

【００１１】本発明において安定化剤として使用する場
合の前記リチウム化合物の濃度は、ビリルビンオキシダ
ーゼ活性の安定化に充分な効果を示す限り、特に限定さ
れるものではないが、好ましくは１０〜５００ｍＭ、よ
り好ましくは５０〜３００ｍＭの範囲で用いることがで
きる。

【００１２】本発明において用いることのできるホモシ
スチンは、式： ＨＯＯＣＣＨ（ＮＨ₂）ＣＨ₂ＣＨ₂Ｓ−ＳＣＨ₂ＣＨ₂Ｃ
Ｈ（ＮＨ₂）ＣＯＯＨ で表される化合物である。前記ホモシスチンとしては、
Ｄ体、Ｌ体、又はＤＬ体（ラセミ体）を用いることがで
きる。本発明において安定化剤として使用する場合の前
記ホモシスチンの濃度は、ビリルビンオキシダーゼ活性
の安定化に充分な効果を示す限り、特に限定されるもの
ではないが、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好まし
くは１〜１０ｍＭの範囲で用いることができる。

【００１３】本発明において、安定化剤として、リチウ
ム化合物又はホモシスチンを２種以上用いる場合には、
リチウム化合物１種以上とホモシスチンとを組み合わせ
て用いることもできるし、あるいは、リチウム化合物の
みを２種以上組み合わせて用いることもできる。リチウ
ム化合物又はホモシスチンを２種以上用いる場合の各化
合物の濃度は、ビリルビンオキシダーゼ活性の安定化に
充分な効果を示す限り、特に限定されるものではない
が、それぞれ、先に述べた濃度範囲で用いることが好ま
しい。

【００１４】本発明においては、ビリルビンオキシダー
ゼとして、通常のビリルビン分析に使用されているビリ
ルビンオキシダーゼを用いることができる。前記ビリル
ビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム・ベ
ルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｃａｒｉ
ａ）由来のビリルビンオキシダーゼ、バチルス・リフェ
ニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）由来のビリルビンオキシダーゼ、又はスエヒ
ロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）由来のビリル
ビンオキシダーゼなどを挙げることができる。

【００１５】本発明において用いるビリルビンオキシダ
ーゼの濃度は、それを用いて行なう所望のビリルビン分
析（例えば、総ビリルビン測定、抱合ビリルビン測定、
又は直接ビリルビン測定）において正確に分析を実施す
る濃度である限り、特に限定されるものではない。例え
ば、総ビリルビン測定においては、通常、０．０１〜２
０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１０Ｕ／ｍｌであり、
抱合ビリルビン測定又は直接ビリルビン測定において
は、通常、０．０１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０
１〜１０Ｕ／ｍｌである。

【００１６】本発明において、ビリルビンオキシダーゼ
と安定化剤とを溶液状態で共存させる場合には、そのｐ
Ｈは、ビリルビンオキシダーゼの活性が急激に損なわれ
ることのないｐＨである限り、特に限定されるものでは
ないが、ビリルビンオキシダーゼの活性が比較的安定で
あるとされるｐＨ８〜１１の範囲であることが好まし
く、ｐＨ９〜１０の範囲であることがより好ましい。

【００１７】本発明においては、前記ｐＨを保持するこ
とのできる緩衝液である限り、特に限定されるものでは
ないが、ビリルビンオキシダーゼの安定化に好適な緩衝
液としては、例えば、以下の緩衝液成分を用いることが
できる：２−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピ
ペラジニル］エタンスルホン酸（略称＝ＨＥＰＥＳ）；
２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル−３−アミノプロパンスルホン酸（略称＝ＴＡＰＳ
Ｏ）；ピペラジン−１、４−ビス（２−ヒドロキシ−３
−プロパンスルホン酸（略称＝ＰＯＰＳＯ）；２−ヒド
ロキシ−３−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピ
ペラジニル］プロパンスルホン酸（略称＝ＨＥＰＰＳ
Ｏ）；３−［４−（２−ヒドキシエチエル）−１−ピペ
ラジニル］プロパンスルホン酸（略称＝ＥＰＰＳ）；Ｎ
−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略
称＝Ｔｒｉｃｉｎｅ）；Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）グリシン（略称＝Ｂｉｃｉｎｅ）；Ｎ−トリス
（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスル
ホン酸（略称＝ＴＡＰＳ）；Ｎ−シクロヘキシル−２−
アミノエタンスルホン酸（略称＝ＣＨＥＳ）；Ｎ−シク
ロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノエタンスルホ
ン酸（略称＝ＣＡＰＳＯ）；Ｎ−シクロヘキシル−３−
アミノエタンスルホン酸（略称＝ＣＡＰＳ）；トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（略称＝Ｔｒｉ
ｓ）；リン酸塩（例えば、リン酸一ナトリウム又はリン
酸二ナトリウム）；並びにホウ酸及びホウ酸塩（例え
ば、四ホウ酸ナトリウム）。

【００１８】本発明においては、前記の特定の安定化
剤、前記ビリルビンオキシダーゼ、及び前記緩衝液成分
の他にも、所望のビリルビン分析に応じて、それに必要
な種々の公知成分を、更に使用することができる。例え
ば、血清中のビリルビン測定には、血清由来の成分によ
る測定誤差要因（例えば、脂肪等による乳濁、アスコル
ビン酸、又は溶血ヘモグロビン）を回避するために有用
な成分、例えば、界面活性剤、アスコルビン酸オキシダ
ーゼ、還元剤、酸化剤、又はその他各種の添加剤を共存
させることができ、更に場合により、防腐剤を共存させ
ることができる。また、ビリルビン測定では、一般的に
ビリルビンオキシダーゼの反応組成条件を適切に設定す
ることにより、総ビリルビン並びに抱合ビリルビン及び
直接ビリルビン等の分別測定が可能であるので、ビリル
ビンの分別測定に必要な成分、例えば、反応促進剤（例
えば、界面活性剤等）又は反応抑制剤（例えば、フッ化
ナトリウム等）を目的に応じて適宜選択して使用するこ
ともできる。

【００１９】本発明において、前記の特定の安定化剤、
前記ビリルビンオキシダーゼ、及び前記緩衝液成分、並
びに必要に応じて使用することのできるその他の各種成
分を含有するビリルビンオキシダーゼ溶液を調製する場
合には、各成分が充分に溶解し、しかも、ビリルビンオ
キシダーゼの活性が実質的に損なわれない限り、それら
の添加順序は特に限定されるものではないが、例えば、
ｐＨを予め調整した前記緩衝液に、必要に応じて界面活
性剤及び／又は防腐剤等を添加した後に、安定化剤をそ
のまま、あるいは、適当な溶液に溶解した状態で添加し
たところで、ｐＨを再度調整し直し、最後にビリルビン
オキシダーゼを添加することにより、ビリルビンオキシ
ダーゼ溶液を調製することができる。

【００２０】前記安定化剤としてリチウム化合物のみを
用いる場合には、緩衝液成分、界面活性剤、及び／又は
防腐剤等を含む溶液に、リチウム化合物を直接添加して
も、リチウム化合物は溶解性が高く、しかも、ｐＨ変動
をわずかしか与えないので、差し支えない。一方、前記
安定化剤としてホモシスチンを用いる場合には、ホモシ
スチンは中性のｐＨ範囲ではほとんど溶解しない。従っ
て、酸性水溶液にホモシスチンを予め溶解し、このホモ
シスチン酸性溶液と、緩衝液成分、界面活性剤、及び／
又は防腐剤等を含む溶液とを混合することが好ましい。
前記ホモシスチン酸性溶液は、例えば、予め添加する濃
度の約１０〜５０倍程度の濃度でホモシスチンを塩酸等
の酸性成分により溶解しておくことにより調製すること
ができる。

【００２１】本発明によるビリルビンオキシダーゼの安
定化方法を用いることにより、臨床検査試薬として長期
間保存可能なビリルビン分析用キット及びビリルビン分
析用試薬を構成することができる。前記ビリルビン分析
用キット及びビリルビン分析用試薬には、総ビリルビン
分析用キット及び総ビリルビン分析用試薬、抱合ビリル
ビン分析用キット及び抱合ビリルビン分析用試薬、並び
に直接ビリルビン分析用キット及び直接ビリルビン分析
用試薬が含まれる。本発明を用いたビリルビン分析用キ
ット及びビリルビン分析用試薬は、ビリルビンオキシダ
ーゼと、前記の特定の安定化剤（すなわち、リチウム化
合物又はホモシスチン）とを含有すること、及び前記ビ
リルビンオキシダーゼが溶液状態で供給される（すなわ
ち、液状試薬として供給される）場合には、その液状試
薬中に前記安定化剤を共存させることを除けば、従来公
知のビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用試薬
と同じ試薬構成とすることができる。

【００２２】例えば、本発明を用いたビリルビン分析用
キットは、ビリルビンオキシダーゼと、前記の特定の安
定化剤（すなわち、リチウム化合物又はホモシスチン）
とを少なくとも含有し、通常、前記緩衝液成分を更に含
有し、場合により、所望のビリルビン分析に応じて選択
することのできる種々の前記公知成分を含有することが
できる。また、本発明を用いたビリルビン分析用キット
は、二試薬以上の形態で供給するが、キットを構成する
各試薬は、それぞれ独立に、液状試薬であることもでき
るし、あるいは、凍結乾燥試薬であることもできる。前
記試薬が溶液状態である場合には、その液状試薬中にお
けるリチウム化合物又はホモシスチンの濃度は、特に限
定されるものではないが、先に述べた濃度範囲であるこ
とが好ましい。一方、前記試薬が凍結乾燥状態である場
合には、その凍結乾燥状態にある試薬に含有されるリチ
ウム化合物又はホモシスチンの量は、特に限定されるも
のではないが、凍結乾燥状態にある試薬を溶解した際
に、先に述べた濃度範囲になる量であることが好まし
い。

【００２３】本発明を用いてビリルビン分析用キットを
構成する場合、測定方法により以下の二種の形態を挙げ
ることができる。第１の形態では、主に緩衝液成分を含
有する試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試
薬溶解液）と、主に緩衝液成分を含有する前記試薬と同
一成分を含有する溶液にビリルビンオキシダーゼ及び安
定化剤を添加したビリルビンオキシダーゼ含有試薬（液
状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）とで
構成される。この形態では、血清等の検体と主に緩衝液
成分を含有する前記試薬とを混合し、所定温度で所定時
間加温した反応液の吸光度と、それとは別に、血清等の
検体と前記ビリルビンオキシダーゼ含有試薬とを混合
し、所定温度で所定時間加温した反応液の吸光度との差
より、検体中のビリルビンを測定することができる。

【００２４】第２の形態では、主に緩衝液成分を含有す
る試薬（液状試薬又は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶
解液）と、主にビリルビンオキシダーゼ及び安定化剤を
含有するビリルビンオキシダーゼ含有試薬（液状試薬又
は凍結乾燥試薬及び凍結乾燥試薬溶解液）とで構成され
る。この形態では、血清等の検体と主に緩衝液成分を含
有する前記試薬を混合し、所定温度で所定時間加温した
後の反応液の吸光度と、その反応液に、更に、前記ビリ
ルビンオキシダーゼ含有試薬を混合し、所定温度で所定
時間加温した後の反応液の吸光度との差より、検体中の
ビリルビンを測定することができる。前記の二種の試薬
構成において、主に緩衝液成分を含有する前記試薬、及
び／又は前記ビリルビンオキシダーゼ含有試薬に対して
必要に応じてそれぞれ各種成分、すなわち、反応促進
剤、反応抑制剤、又は血清由来の測定誤差要因を回避す
るための添加剤等を各々添加することができる。

【００２５】本発明を用いたビリルビン分析用キット
は、前記の特定の安定化剤（すなわち、リチウム化合物
又はホモシスチン）を含有し、従って、溶液状態におい
てもビリルビンオキシダーゼの酵素活性が長期間安定に
保たれること以外は、公知のビリルビン分析用キットと
何ら変わるものではない。従って、本発明を用いたビリ
ルビン分析用キットは、公知のビリルビン分析用キット
と同じようにして、ビリルビンの分析（例えば、総ビリ
ルビンの分析、抱合ビリルビンの分析、又は直接ビリル
ビンの分析）に用いることができる。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【００２７】以下の実施例１〜４では、市販のミロセシ
ウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｃ
ａｒｉａ）由来のビリルビンオキシダーゼ（天野製薬
製）を用いた。また、ビリルビンオキシダーゼの活性測
定は、カタログに記載の方法、すなわち、使用したビリ
ルビンオキシダーゼ標品の表示活性値を測定した方法に
準じた方法を用いた。具体的には、アルブミン結合ビリ
ルビンを基質とし、コール酸ナトリウム存在下、ビリル
ビンオキシダーゼの作用による前記アルブミン結合ビリ
ルビンの酸化に伴う４６０ｎｍにおける吸光度の減少速
度を測定することにより、ビリルビンオキシダーゼ活性
を求めた。

【００２８】詳細な測定手順を以下に示す。アルブミン
結合ビリルビン（自家製）３０ｍｇを、５０μＭ ＥＤ
ＴＡ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０；以下、
ビリルビンオキシダーゼ希釈用液と称する）１ｍｌに溶
解し、基質溶液とした。また、コール酸ナトリウム（和
光純薬製）０．５ｇを前記ビリルビンオキシダーゼ希釈
用液５０ｍｌに溶解し、コール酸ナトリウム含有緩衝液
とした。石英セルに、前記コール酸ナトリウム含有緩衝
液３ｍｌ及び前記基質溶液０．２ｍｌを加え、混合した
後に、３７℃にて予加温した。１０分後に、前記石英セ
ルに、前記ビリルビンオキシダーゼ希釈用液で希釈した
ビリルビンオキシダーゼ溶液０．１ｍｌを加えて混合
し、反応を開始した。

【００２９】波長４６０ｎｍにおいて、反応開始後１分
経過時と、３分経過時の吸光度とをそれぞれ測定し、そ
の間（２分間）の吸光度変化量［ΔＡ］を算出した。ま
た、前記ビリルビンオキシダーゼ溶液の代わりに、前記
ビリルビンオキシダーゼ希釈用液を用いて同様に測定
し、ブランクの吸光度変化量［ΔＡｂ］を算出した。続
いて、以下の計算式により、ビリルビンオキシダーゼ溶
液におけるビリルビンオキシダーゼ活性（単位＝Ｕ／ｍ
ｌ）を算出した。 ビリルビンオキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛（ΔＡ−
ΔＡｂ）／２｝×｛３．３／（０．１×５９．７）｝×
ｄ 上記式で、ｄは、ビリルビンオキシダーゼ希釈用液によ
る希釈倍数である。

【００３０】

【実施例１】《リチウム化合物によるビリルビンオキシ
ダーゼの安定化効果》２５ｍＭ Ｎ−シクロヘキシル−
２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝液（ｐＨ
９．５）に３２ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸及び０．
０５％トリトンＸ−１００を添加してなる基本緩衝液組
成物に、以下の表１に記載の各リチウム化合物１００ｍ
Ｍを添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とし
た。この各添加剤含有緩衝液にビリルビンオキシダーゼ
４Ｕ／ｍｌを各々添加して本発明試験液を調製し、試験
液を２５℃にて２週間保存した後に、ビリルビンオキシ
ダーゼ活性を測定し、ビリルビンオキシダーゼの安定化
効果を確認した。比較のため、リチウム化合物の代わり
にナトリウム化合物を同様に添加して調製した比較用試
験液の活性を測定し、ビリルビンオキシダーゼの安定化
効果を調べた。

【００３１】結果を表１に示す。表１に示す数値（単位
＝％）は、試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼの
活性を１００％とした場合の、残存活性の割合である。
また、表１の「無添加」の欄は、リチウム化合物又はナ
トリウム化合物を添加しないで調製した対照用試験液の
結果を示す。

【００３２】 《表１》 無添加 ３８％ 添加化合物 リチウム塩 ナトリウム塩 酢酸化合物 ４８％ ３８％ 炭酸化合物 ４２％ ２８％ 塩化物 ４３％ ３２％ クエン酸化合物 ５３％ ３７％ 乳酸化合物 ４３％ −−− ピルビン酸化合物 ４６％ −−− 硫酸化合物 ５２％ ３６％ 四ホウ酸化合物 ５１％ ３９％

【００３３】

【実施例２】《リチウム添加濃度によるビリルビンオキ
シダーゼの安定化効果の変化》本実施例では、リチウム
化合物の濃度の変化と安定化効果の変化との関係を調べ
た。前記実施例１で使用したのと同じ基本緩衝液組成物
に、硫酸リチウムを１０〜３００ｍＭの濃度範囲で添加
した後に、ｐＨを再調整してｐＨ９．５とした。同様に
前記基本緩衝液組成物にクエン酸リチウムを１００〜３
００ｍＭの濃度範囲で添加した後に、ｐＨを再調整して
ｐＨ９．５とした。これらのリチウム化合物含有緩衝液
にビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを各々添加して試
験液を調製し、２５℃にて２週間保存した後のビリルビ
ンオキシダーゼ活性を測定した。結果を表２に示す。表
２に示す数値（単位＝％）は、試験液調製直後のビリル
ビンオキシダーゼの活性を１００％とした場合の、残存
活性の割合であり、表２の「無添加」の欄は、各リチウ
ム化合物を添加しないで調製した対照用試験液の結果を
示す。

【００３４】 《表２》 無添加 ３７％ 添加濃度 硫酸リチウム クエン酸リチウム １０ｍＭ ４０％ −−− ５０ｍＭ ４６％ −−− １００ｍＭ ５１％ ５３％ ２００ｍＭ ５８％ ５８％ ３００ｍＭ ６２％ ６４％

【００３５】

【実施例３】《ホモシスチンによるビリルビンオキシダ
ーゼの安定化効果》ホモシスチンに関しても、添加濃度
の変化と安定化効果の変化との関係を前記実施例２と同
様に調べた。すなわち、前記実施例１で使用したのと同
じ基本緩衝液組成物に、ＤＬ−ホモシスチンを１〜１０
ｍＭの濃度範囲で添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ
９．５とした。こうして調製した各ＤＬ−ホモシスチン
含有緩衝液にビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／ｍｌを各々
添加して試験液を調製し、２５℃にて２週間保存した後
のビリルビンオキシダーゼ活性を測定した。結果を表３
に示す。表３に示す数値（単位＝％）は、試験液調製直
後のビリルビンオキシダーゼの活性を１００％とした場
合の、残存活性の割合であり、表３の「無添加」の欄
は、ホモシスチンを添加しないで調製した対照用試験液
の結果を示す。

【００３６】

【００３７】

【実施例４】《リチウム化合物とホモシスチンとの組み
合わせによる安定化効果》本実施例では、リチウム化合
物の中でも、ビリルビンオキシダーゼに対して比較的安
定化効果の高い硫酸リチウムと、ホモシスチンとの組合
せによる安定化効果を確認した。前記実施例１で使用し
たのと同じ基本緩衝液組成物に、１００ｍＭ若しくは３
００ｍＭ硫酸リチウム又は２．５ｍＭ ＤＬ−ホモシス
チンをそれぞれ単独で、あるいは、１００ｍＭ若しくは
３００ｍＭ硫酸リチウム及び２．５ｍＭ ＤＬ−ホモシ
スチンを両方とも添加した後に、ｐＨを再調整してｐＨ
９．５とした。続いて、ビリルビンオキシダーゼ４Ｕ／
ｍｌを更に添加して本発明試験液を調製し、１０℃にて
１０週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活性、あ
るいは、２５℃にて２週間保存した後のビリルビンオキ
シダーゼ活性を測定した。

【００３８】更に、比較試験として、安定化効果が高い
とみられる公知の安定化方法による効果も同時に確認し
た。すなわち、前記基本緩衝液組成物（ＣＨＥＳ緩衝液
ｐＨ９．５を含む）に、特許第２８２０８９３号明細書
に記載されている緩衝液とカルボン酸との組み合わせの
一例として、ここではＣＨＥＳ緩衝液ｐＨ９．５に酒石
酸ナトリウムカリウムを１００ｍＭの量で添加するか、
あるいは、特開平１０−７５７７９号公報に記載の含窒
素複素環化合物のメルカプト誘導体の中でも特に効果が
高い２−メルカプト−１−メチルイミダゾール（ＭＭ
Ｉ）を２５ｍＭの量で添加した後に、ｐＨを再調整して
ｐＨ９．５とした。続いて、ビリルビンオキシダーゼ４
Ｕ／ｍｌを更に添加して比較用試験液を調製し、１０℃
にて１０週間保存した後のビリルビンオキシダーゼ活
性、あるいは、２５℃にて２週間保存した後のビリルビ
ンオキシダーゼ活性を測定した。

【００３９】結果を表４に示す。表４に示す数値（単位
＝％）は、各試験液調製直後のビリルビンオキシダーゼ
の活性を１００％とした場合の、残存活性の割合であ
る。また、表４に示す（１）〜（７）は、それぞれ、
（１）無添加［すなわち、安定化剤を添加しないで調製
した対照用試験液］の場合、（２）１００ｍＭ硫酸リチ
ウムを添加した本発明試験液の場合、（３）３００ｍＭ
硫酸リチウムを添加した本発明試験液の場合、（４）１
００ｍＭ硫酸リチウム及び２．５ｍＭＤＬ−ホモシスチ
ンを添加した本発明試験液の場合、（５）３００ｍＭ硫
酸リチウム及び２．５ｍＭＤＬ−ホモシスチンを添加し
た本発明試験液の場合、（６）１００ｍＭ酒石酸ナトリ
ウムカリウムを添加した比較用試験液の場合、並びに
（７）２５ｍＭＭＭＩを添加した比較用試験液の場合を
意味する。

【００４０】

【００４１】特許第２８２０８９３号明細書記載の実施
例としては、緩衝液とカルボン酸との組み合わせとして
の一例として、ビリルビンオキシダーゼを含有する１０
ｍＭＮ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン
（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ１０．０）に、８８．５
ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウムを添加した場合、及び酒
石酸ナトリウムカリウムを無添加の場合の、２５℃で１
４日間保存した後の残存活性は、それぞれ４７．２％及
び３１．８％であり、酒石酸ナトリウムカリウムの効果
が顕著であることが記載されている。また、特開平１０
−７５７７９号公報には、ビリルビンオキシダーゼを含
有するホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に、２５ｍＭ Ｍ
ＭＩを添加した場合と、ＭＭＩ無添加の場合とでは、３
０℃で６日保存した後、それぞれ８４．８％及び２８．
０％の残存活性がある旨記載されており、ＭＭＩの安定
化効果が顕著であることが記載されている。

【００４２】前記公報又は前記特許明細書に記載された
各従来方法と比較すると、本発明方法によるビリルビン
オキシダーゼの安定化効果が高いことが確認された。す
なわち、溶液中でのビリルビンオキシダーゼの活性を安
定化するために、リチウム化合物又はホモシスチンを少
なくとも１種（すなわち、１種又は２種以上）を安定化
剤として使用することが有効であることが確認された。

【００４３】

【発明の効果】本発明のビリルビンオキシダーゼの安定
化方法によれば、液状ではかなり不安定であることが知
られているビリルビンオキシダーゼの酵素活性を、溶液
状態においても長期間安定に保つことができる。本発明
を用いたビリルビン分析用キット及びビリルビン分析用
試薬によれば、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性が溶
液状態においても長期間安定に保たれるので、液状形態
で試薬を供給することができ、臨床検査時における試薬
の再溶解の手間を省くことができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リチウム化合物又はホモシスチンを安定
   化剤として用いることを特徴とする、ビリルビンオキシ
   ダーゼの安定化方法。
2. 【請求項２】 前記リチウム化合物が、酢酸リチウム、
   炭酸リチウム、塩化リチウム、クエン酸リチウム、乳酸
   リチウム、ピルビン酸リチウム、硫酸リチウム、又は四
   ホウ酸リチウムである、請求項１に記載の安定化方法。