JP7492260B2 - ビリルビンオキシダーゼの活性向上方法、およびビリルビンオキシダーゼ製品 - Google Patents
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Description
本発明は、ビリルビンオキシダーゼの活性を向上する方法（以下、「活性向上方法」と称する）に関する。また本発明は、ビリルビンオキシダーゼの活性を向上するためのビリルビンオキシダーゼ製品に関する。また本発明は、高活性型ビリルビンオキシダーゼの製造方法に関する。
ビリルビンオキシダーゼ（以下、適宜「ＢＯＤ」と略記する。）は、ビリルビンをビリベルジンに酸化させる反応を触媒する酵素である。ＢＯＤは、例えば、臨床検査の分野において、生体試料中のビリルビンの濃度を測定するために用いられている。またＢＯＤは、インドール類縁体を酸化する性質を有することから、染毛剤への応用が期待されている。
現在商業的に供給されているＢＯＤ製品は、ＢＯＤに加えて、（ａ）酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、並びに、必要に応じて、（ｂ）（ｂ－１）界面活性剤等の反応条件を制御する成分、および、（ｂ－２）糖類および／または不活性タンパク質などの一般的な賦形剤、などを含む。現在商業的に供給されているＢＯＤ製品は、ＢＯＤに加えて、上述した成分を一緒に凍結乾燥させた状態で流通している。乾燥状態のＢＯＤは、使用時に界面活性剤および／または緩衝剤を含む所定の溶媒に溶解して使用される。製品に含まれるＢＯＤは乾燥状態では比較的安定であるが、いったん溶解した溶液状態では失活しやすいという問題点がある。たとえば、市販されているＢＯＤ試薬を、Ｔｒｉｓ－Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ８．５）緩衝液中、５℃で保存した場合、９６時間安定であるに過ぎない。
また乾燥状態のＢＯＤは、使用の度に必要量を溶解する操作が必要であるため、使用時の工程数の増加、および、使用時にＢＯＤの粉体が飛散することによる作業者へのＢＯＤの暴露、などの問題点もある。またＢＯＤ製品は、流通コストの観点から常温で流通されることが望ましい。
上記の事情に鑑み、ＢＯＤ製品（特に溶液状態）のＢＯＤを安定的に保存する方法が検討されている。例えば、特許文献１では、還元剤（チオ硫酸ナトリウム）を用いたＢＯＤの安定化方法が開示されている。
上述のごとくＢＯＤは、産業上の利用が大いに期待される酵素である。本発明者らは、ＢＯＤの活性を簡便に向上させるという技術的課題を独自に設定し、その解決手段を検討することにした。すなわち、本発明の一実施形態に係る目的は、ＢＯＤの活性を向上させることができる手段を提供することにある。具体的には、本発明の一実施形態は、ＢＯＤの活性を向上させる方法、ＢＯＤの活性を向上させることができるＢＯＤ製品、および高活性型ビリルビンオキシダーゼの製造方法を提供する。
なお、特許文献１に記載された技術は、ＢＯＤを安定的に保存するという技術的課題を解決するための技術であり、ＢＯＤの活性を向上させるという技術的課題を解決するための発明ではない。
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＢＯＤおよび特定の物質（後述する「活性向上剤」）を含むＢＯＤ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置することによって、上述した課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の一実施形態は、ビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤を含むビリルビンオキシダーゼ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置することを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼの活性向上方法である：ここで、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である。
また、本発明の別の一実施形態は、容器内にビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤が含まれ、上記容器内は脱酸素雰囲気であり、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下であることを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼ製品である。
また、本発明の別の一実施形態は、ビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤を含むビリルビンオキシダーゼ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置する工程を含むことを特徴とする、高活性型ビリルビンオキシダーゼの製造方法である：ここで、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である。
本発明の一実施形態によれば、ＢＯＤの活性を向上させることができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。即ち、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせて得られる実施形態または実施例についても、本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。また、本明細書中に記載された特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
本明細書中において、本発明の一実施形態に係るＸ（Ｘは任意の固有名詞、例えば活性向上方法、酵素溶液、ＢＯＤ、活性向上剤、高活性型ＢＯＤの製造方法など）を、単に「本Ｘ」と称する場合もある。
〔１．本発明の一実施形態の技術的思想〕
本発明者らはＢＯＤの酵素活性を向上させる方法について、鋭意検討した。その結果、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）およびＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が特定の範囲内である物質を使用し、かつ、脱酸素雰囲気下にすることによって、ＢＯＤの活性（以下、ＢＯＤ活性と称する場合もある。）を向上させることができるという新規知見を見出し、本発明を完成させた。
本発明者らはＢＯＤの酵素活性を向上させる方法について、鋭意検討した。その結果、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）およびＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が特定の範囲内である物質を使用し、かつ、脱酸素雰囲気下にすることによって、ＢＯＤの活性（以下、ＢＯＤ活性と称する場合もある。）を向上させることができるという新規知見を見出し、本発明を完成させた。
〔２．活性向上方法〕
本活性向上方法は、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置する方法である。ここで、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である物質である。
本活性向上方法は、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置する方法である。ここで、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である物質である。
本活性向上方法は上記活性向上剤を利用することにより、ＢＯＤの活性を簡便に向上させることができるという利点を有する。
本明細書において特に言及しない限り「ＢＯＤ溶液」は、少なくともＢＯＤおよび活性向上剤を含んでいる溶液を意図する。なお、ＢＯＤ溶液には、ＢＯＤおよび活性向上剤以外の物質が含まれていてもよい。
本明細書において、「ＢＯＤの活性を向上させる」とは、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を脱酸素雰囲気下で放置する前のＢＯＤ活性に比して、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を脱酸素雰囲気下で放置した後のＢＯＤ活性を向上させることをいう。
なお、ＢＯＤの活性は、当該ＢＯＤの質量に対する活性（活性／質量）で表されることが多く、それ故に、活性を「比活性」と称する場合もある。すなわち、活性向上方法は比活性向上方法ともいい、活性向上剤は比活性向上剤ともいう。
比活性は、以下のようにして算出することができる。ＢＯＤのみを含むＢＯＤ溶液の波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を分子吸光係数１１５，０００で除した値に、ＢＯＤの分子量６６，０００を乗じ、得られた値をＢＯＤ溶液中のＢＯＤタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）とする。後述する方法にてＢＯＤの酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を測定し、当該酵素活性を上記ＢＯＤタンパク質濃度で除した値が、比活性（Ｕ／ｍｇ）である。
本活性向上方法では、ＢＯＤの活性を大きく向上させるほど好ましい。本活性向上方法では、ＢＯＤを放置する前のＢＯＤの活性を１００％としたとき、ＢＯＤを放置する前と比較して、ＢＯＤの活性を１０５％以上向上させることが好ましく、１２０％以上向上させることがより好ましく、１５０％以上向上させることがさらに好ましく、２００％以上向上させることが特に好ましい。
本活性向上方法では、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を放置する期間は、特に限定されず、少なくともＢＯＤの活性が向上するまで放置すればよい。本活性向上方法では、生産効率の観点から、ＢＯＤの活性を向上させるために必要とされる、ＢＯＤ溶液の放置期間が短いほど好ましい。本活性向上方法では、ＢＯＤ溶液の放置期間が、例えば、５０日以下であることが好ましく、４０日以下であることが好ましく、３０日以下であることが好ましい。
本活性向上方法では、ＢＯＤ溶液を放置する温度は、特に限定されず、少なくともＢＯＤの活性が向上する温度であればよい。本活性向上方法では、生産効率の観点から、ＢＯＤ溶液を、１０℃以上の温度環境下にて放置することが好ましい。本活性向上方法では、ＢＯＤ溶液を放置する温度が、例えば、３０℃以上であることが好ましく、４０℃以上であることが好ましく、５０℃以上であることが好ましい。上記構成であれば、ＢＯＤの活性をより向上させることができ、かつ、ＢＯＤの活性を短期間で向上させることができる、という利点を有する。本活性向上方法において、ＢＯＤ溶液を放置する温度の上限は、ＢＯＤが失活しない温度であることが好ましく、例えば、６０℃以下の温度環境下でＢＯＤ溶液を放置することが好ましい。
本明細書において、ＢＯＤの活性は、簡潔には、以下のように評価する。ＡＢＴＳ基質を含む溶液に対してＢＯＤを添加した後、得られた溶液を３７℃で反応させる。当該反応中、当該溶液の波長４３６ｎｍにおける吸光度の増加量を経時的に測定することによって、ＢＯＤの活性を評価する。ＢＯＤの活性の具体的な測定方法および評価方法は後述する試験例において説明する。
（２－１）ＢＯＤ
本活性向上方法を適用可能なＢＯＤとしては、（１）任意の生物から得られる、公知のすべてのＢＯＤ（非組換えＢＯＤ）、（２）任意の生物に由来するＢＯＤをコードする遺伝子を、任意の生物体内または試験管内で発現させて得ることができる組換えＢＯＤ、（３）任意の生物に由来するＢＯＤのアミノ酸配列の置換、挿入および欠失等の変異によって得られる変異ＢＯＤ、ならびに（４）ＢＯＤの安定化およびＢＯＤの酵素活性の向上を目的とした、任意の担体で修飾したＢＯＤ、などを挙げることができる。上記生物としては、例えば、ミロセシウム属（例えばミロセシウム・ベルカリア）、ペニシリウム・ジャンシネラム、バチルス・リフェニフォルミス、コリネバクテリウム・グルタミカム、エシェリヒア・コリ、アガリカスビスポラス菌茸、スエヒロタケ、エビタケ、キク科植物、アルファルファ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、およびアスペルギルス属、などが挙げられるが、これらに限定されない。また、ＢＯＤをコードする遺伝子の由来となる生物と、ＢＯＤを得るために当該遺伝子を導入し、発現させる生物とは、同一であってもよく異なっていてもよい。
本活性向上方法を適用可能なＢＯＤとしては、（１）任意の生物から得られる、公知のすべてのＢＯＤ（非組換えＢＯＤ）、（２）任意の生物に由来するＢＯＤをコードする遺伝子を、任意の生物体内または試験管内で発現させて得ることができる組換えＢＯＤ、（３）任意の生物に由来するＢＯＤのアミノ酸配列の置換、挿入および欠失等の変異によって得られる変異ＢＯＤ、ならびに（４）ＢＯＤの安定化およびＢＯＤの酵素活性の向上を目的とした、任意の担体で修飾したＢＯＤ、などを挙げることができる。上記生物としては、例えば、ミロセシウム属（例えばミロセシウム・ベルカリア）、ペニシリウム・ジャンシネラム、バチルス・リフェニフォルミス、コリネバクテリウム・グルタミカム、エシェリヒア・コリ、アガリカスビスポラス菌茸、スエヒロタケ、エビタケ、キク科植物、アルファルファ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、およびアスペルギルス属、などが挙げられるが、これらに限定されない。また、ＢＯＤをコードする遺伝子の由来となる生物と、ＢＯＤを得るために当該遺伝子を導入し、発現させる生物とは、同一であってもよく異なっていてもよい。
ＢＯＤは、（１）ミロセシウム属から得られるＢＯＤ（非組換えＢＯＤ）であってもよく、（２）ミロセシウム属に由来するＢＯＤのアミノ酸配列の置換、挿入および欠失等の変異によって得られる変異ＢＯＤであってもよく、（３）ミロセシウム属に由来するＢＯＤをコードする遺伝子を、任意の生物体内または試験管内で発現させて得られた組換えＢＯＤであってもよく、（４）ミロセシウム属に由来するＢＯＤをコードする遺伝子を、任意の生物の遺伝子配列に合わせてコドンの最適化を行った後、当該生物に導入し、当該生物体内で発現させて得られた組換えＢＯＤであってもよい。例えば、組換えＢＯＤは、（１）任意の生物に由来するＢＯＤをコードする遺伝子をアスペルギルス属に導入し、アスペルギルス属にて発現させて得られたＢＯＤであってもよく、（２）任意の生物に由来するＢＯＤをコードする遺伝子を、アスペルギルス属の遺伝子配列に合わせてコドンの最適化を行った後、アスペルギルス属に導入し、アスペルギルス属にて発現させて得られたＢＯＤであってもよい。より具体的には、組換えＢＯＤは、（１）ミロセシウム属に由来するＢＯＤをコードする遺伝子を、アスペルギルス属に導入し、アスペルギルス属にて、発現させて得られたＢＯＤであることが好ましく、（２）ミロセシウム属に由来するＢＯＤをコードする遺伝子を、アスペルギルス属の遺伝子配列に合わせてコドンの最適化を行った後、アスペルギルス属に導入し、アスペルギルス属にて、発現させて得られたＢＯＤであることがより好ましい。
本活性向上方法において用いられるＢＯＤの濃度は、特に限定されず、当該ＢＯＤの用途に応じて適宜設定され得る。
（２－２）活性向上剤
本活性向上剤は、ＢＯＤと共に脱酸素雰囲気下にて放置することによって、ＢＯＤの活性を向上させることができる物質であり、活性向上助剤ともいえる。本活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％＝波長４３６ｎｍの吸光度の１分間あたりの減少率）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％＝波長２５６ｎｍの吸光度の１分間あたりの減少率）が１０．００％以下である物質である限り、特に限定されるものではない。本活性向上剤としては、任意の化合物、混合物、または組成物などを使用可能である。
本活性向上剤は、ＢＯＤと共に脱酸素雰囲気下にて放置することによって、ＢＯＤの活性を向上させることができる物質であり、活性向上助剤ともいえる。本活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％＝波長４３６ｎｍの吸光度の１分間あたりの減少率）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％＝波長２５６ｎｍの吸光度の１分間あたりの減少率）が１０．００％以下である物質である限り、特に限定されるものではない。本活性向上剤としては、任意の化合物、混合物、または組成物などを使用可能である。
本活性向上剤としては、天然由来の、無機塩類、有機化合物、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、脂質、タンパク質、およびペプチドなどからなる群から選択される少なくとも一つ以上の物質であることが好ましい。また、本活性向上剤は、上述した群に列挙された物質の任意の組み合わせであってもよい。
このような活性向上剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、（ａ）亜硫酸ナトリウム、尿酸、グリオキシル酸、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｌ－システイン塩酸塩、Ｌ－アスコルビン酸、トコフェロール、トコフェロール誘導体、Ｔｒｏｌｏｘなどの無機物、および（ｂ）ペプトン類（カゼインペプトン、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトン、および大豆ペプトンなど）、エキス類（肉エキス、魚エキス、植物エキス、麦芽エキス、および酵母エキス）、オリゴペプチド、グルタチオン（還元型）、コーンスティープリカー、大豆粉、小麦ふすまなどの有機物、からなる群から選択される少なくとも一つ以上の物質が挙げられる。
上記無機物としては、例えば和光純薬社などから入手したものを使用できる。また、上記有機物としては、例えば、極東製薬工業社製麦芽エキス、極東製薬工業社製魚粉末エキス、極東製薬工業社製粉末酵母エキス、極東製薬工業社製極東ペプトン、極東製薬工業社製ペプトンＡ、極東製薬工業社製パティケース、極東製薬工業製ポテトペプトンＣＰ、アサヒグループ食品社製の酵母エキス（例えばミーストＰ１ＧおよびイーストックＳ－Ｐｄ）、オリエンタル酵母工業社製のコーンスティープリカー（略して「ＣＳＬ」とも称する）、日本製薬社製のＨｉｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、不二製油社製の大豆オリゴペプチドであるハイニュートＡＭ、昭和産業社製の大豆粉８８、日本ＢＤ社製のＴｒｙｐｔｏｎｅ、および日本ＢＤ社製Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、などからなる群から選択される少なくとも一つ以上の物質が挙げられるが、これらに限定されない。本活性向上剤が上述した群から選択される少なくとも一つである場合には、本活性向上方法は、ＢＯＤの活性をより向上させることができる。本明細書中で列挙した種々の活性向上剤は、１種を単独で使用してもよく、複数種を組み合わせて使用してもよい。
また、本活性向上方法において、ＢＯＤ溶液に含まれる活性向上剤の最適な濃度は、ＢＯＤ溶液中のＢＯＤの濃度、活性向上剤の種類等によって変動し得る。このため、ＢＯＤ溶液に含まれる活性向上剤の最終濃度は、本発明の一実施形態に係る効果が得られる範囲で適宜設定すればよい。
（２－３）脱酸素雰囲気
本活性向上方法においては、ＢＯＤの酸化を防止する為に、ＢＯＤが存在する雰囲気中にできるだけ酸素が存在しない状態（すなわち脱酸素雰囲気）であることが好ましい。このため、本活性向上方法においては、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液が「脱酸素雰囲気」で放置される。本活性向上方法において「脱酸素雰囲気」とは、ＢＯＤ溶液が放置される雰囲気における酸素濃度が、自然状態（換言すれば常温および常圧）で存在する酸素濃度よりも低い状態を意図する。
本活性向上方法においては、ＢＯＤの酸化を防止する為に、ＢＯＤが存在する雰囲気中にできるだけ酸素が存在しない状態（すなわち脱酸素雰囲気）であることが好ましい。このため、本活性向上方法においては、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液が「脱酸素雰囲気」で放置される。本活性向上方法において「脱酸素雰囲気」とは、ＢＯＤ溶液が放置される雰囲気における酸素濃度が、自然状態（換言すれば常温および常圧）で存在する酸素濃度よりも低い状態を意図する。
本活性向上方法では、脱酸素雰囲気下においてＢＯＤ溶液を放置することによって、ＢＯＤの活性を容易に向上させることができるという利点を有する。
本活性向上方法では、ＢＯＤの活性を容易に向上させる観点から、ＢＯＤ溶液が放置される雰囲気における酸素濃度が、０．５体積％未満であることが好ましく、０．１体積％未満が特に好ましい。
本活性向上方法では、脱酸素雰囲気を達成するための方法は特に限定されない。例えば、本活性向上方法では、（１）ＢＯＤ溶液を格納する容器に脱酸素剤を設置することによって脱酸素雰囲気を達成してもよいし、（２）脱酸素剤の成分を有する材質から作製された容器中にＢＯＤ溶液を格納することによって脱酸素雰囲気を達成してもよいし、（３）容器中の酸素を不活性気体（窒素ガスおよびアルゴン等の希ガス）で置換することによって脱酸素雰囲気を達成してもよいし、（４）真空または減圧条件下でＢＯＤ溶液を放置することにより脱酸素雰囲気を達成してもよい。これら脱酸素雰囲気を達成するための方法は、１つの方法を単独で使用してもよく、複数の方法を組み合わせて使用してもよい。
簡便さの観点からは上記（１）の方法が好ましい。上記（１）で用いられる脱酸素剤としては、例えば、三菱ガス化学社製エージレス（登録商標）、三菱ガス化学社製エージレスオーマック（登録商標）、三菱ガス化学社製アネロパック（登録商標）、鳥繁産業社製エバーフレッシュ、パウダーテック社製ワンダーキープ（登録商標）等が挙げられるが、これらに限定されない。
なお、本活性向上方法では、ＢＯＤの活性をさらに容易に向上させる観点から、ＢＯＤを含むＢＯＤ溶液を脱酸素雰囲気下で放置することに加え、ＢＯＤ溶液中の溶存酸素濃度を低溶存酸素状態（好ましくは０．２ｍｇ／Ｌ未満であり、特に好ましくは０．０４ｍｇ／Ｌ未満）にすることが好ましい。ＢＯＤ溶液中の溶存酸素濃度は、ＢＯＤ溶液が保存される雰囲気における上述した好ましい酸素濃度下での、溶液における飽和酸素濃度以下であることがより好ましい。なお、溶液における飽和酸素濃度は溶液の温度に依存して変動し得る。例えば、空気雰囲気の酸素濃度が０．５体積％の場合、溶液における飽和酸素濃度は、２５℃で０．２ｍｇ／Ｌであり、０℃で０．３５ｍｇ／Ｌである。ＢＯＤ溶液中の溶存酸素濃度の好ましい態様（低溶存酸素状態）は、ＢＯＤ溶液に対して公知の脱気操作を行うことにより達成される。
（２－４）ＡＢＴＳ初発吸光度減少率
本明細書において、ＡＢＴＳを含む溶液（ＡＢＴＳ溶液）の波長４３６ｎｍにおける吸光度を、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）とする。本明細書において、活性向上剤のＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）とは、上記ＡＢＴＳ溶液および上記活性向上剤を含む混合液の波長４３６ｎｍにおける吸光度の、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）（１００％）に対する１分間当たりの減少率（％）と定義する。なお、上記ＡＢＴＳ溶液は、光路長１．０ｃｍにて、波長４３６ｎｍにおける吸光度（Ａ４３６）が約１．３となるように、ＡＢＴＳの濃度が調整された溶液とする。ここで、値「約１．３」とは、小数点以下第２位を四捨五入して得られた値が１．３となる範囲の値を意図する。ＡＢＴＳ溶液の波長４３６ｎｍにおける吸光度（Ａ４３６）、および、活性向上剤のＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）の具体的な測定方法は、後述する試験例において説明する。ＡＢＴＳは、２，２’－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）の略称である。
本明細書において、ＡＢＴＳを含む溶液（ＡＢＴＳ溶液）の波長４３６ｎｍにおける吸光度を、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）とする。本明細書において、活性向上剤のＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）とは、上記ＡＢＴＳ溶液および上記活性向上剤を含む混合液の波長４３６ｎｍにおける吸光度の、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）（１００％）に対する１分間当たりの減少率（％）と定義する。なお、上記ＡＢＴＳ溶液は、光路長１．０ｃｍにて、波長４３６ｎｍにおける吸光度（Ａ４３６）が約１．３となるように、ＡＢＴＳの濃度が調整された溶液とする。ここで、値「約１．３」とは、小数点以下第２位を四捨五入して得られた値が１．３となる範囲の値を意図する。ＡＢＴＳ溶液の波長４３６ｎｍにおける吸光度（Ａ４３６）、および、活性向上剤のＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）の具体的な測定方法は、後述する試験例において説明する。ＡＢＴＳは、２，２’－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）の略称である。
本活性向上方法において、上記活性向上剤のＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）を測定する際の、測定用のＡＢＴＳ溶液中の活性向上剤の濃度は、（ａ）活性向上剤が単一の化合物からなるような、活性向上剤の分子量が明らかである場合、１ｍＭとし、（ｂ）活性向上剤が、分子量が不明の組成物からなるような物質である場合、窒素元素含有量を基準とし、測定用のＡＢＴＳ溶液１００ｍＬ中における活性向上剤由来の窒素元素量が０．０１１ｇとなる濃度とする。なお、上記（ｂ）において、ＡＢＴＳ溶液中の活性向上剤由来の窒素含有量は、ケルダール法により算定した値とする。
本活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が、０．１０％以上であればよい。上記ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）は、０．２５％以上であることが好ましく、０．５０％以上であることがより好ましく、１．００％以上であることがさらに好ましく、３．００％以上であることが特に好ましい。上記構成によれば、ＢＯＤの活性をより容易に向上させることができるという利点を有する。
（２－５）ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率
本明細書において、ＤＭＢＱを含む溶液（ＤＭＢＱ溶液）に活性向上剤を添加直後の混合液の波長２５６ｎｍにおける吸光度を、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）とする。本明細書において、活性向上剤のＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）とは、上記ＤＭＢＱ溶液および上記活性向上剤を含む混合液の波長２５６ｎｍにおける吸光度の、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）（１００％）に対する１分間当たりの減少率（％）と定義する。なお、上記ＤＭＢＱ溶液は、光路長１．０ｃｍにて、波長２５６ｎｍにおける吸光度（Ａ２５６）が約１．８となるように、ＤＭＢＱの濃度が調整された溶液とする。ここで、値「約１．８」とは、小数点以下第２位を四捨五入して得られた値が１．８となる範囲の値を意図する。ＤＭＢＱ溶液の波長２５６ｎｍにおける吸光度（Ａ２５６）、および、活性向上剤のＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）の具体的な測定方法は、後述する試験例において説明する。ＤＭＢＱは、２，５－ジメチル－１，４－ベンゾキノンの略称である。
本明細書において、ＤＭＢＱを含む溶液（ＤＭＢＱ溶液）に活性向上剤を添加直後の混合液の波長２５６ｎｍにおける吸光度を、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）とする。本明細書において、活性向上剤のＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）とは、上記ＤＭＢＱ溶液および上記活性向上剤を含む混合液の波長２５６ｎｍにおける吸光度の、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）（１００％）に対する１分間当たりの減少率（％）と定義する。なお、上記ＤＭＢＱ溶液は、光路長１．０ｃｍにて、波長２５６ｎｍにおける吸光度（Ａ２５６）が約１．８となるように、ＤＭＢＱの濃度が調整された溶液とする。ここで、値「約１．８」とは、小数点以下第２位を四捨五入して得られた値が１．８となる範囲の値を意図する。ＤＭＢＱ溶液の波長２５６ｎｍにおける吸光度（Ａ２５６）、および、活性向上剤のＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）の具体的な測定方法は、後述する試験例において説明する。ＤＭＢＱは、２，５－ジメチル－１，４－ベンゾキノンの略称である。
本活性向上方法において、上記活性向上剤のＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）を測定する際の、測定用のＤＭＢＱ溶液中の活性向上剤の濃度は、（ａ）活性向上剤が単一の化合物からなるような、活性向上剤の分子量が明らかである場合、０．１ｍＭとし、（ｂ）活性向上剤が、分子量が不明の組成物からなるような物質である場合、窒素元素含有量を基準とし、測定用のＤＭＢＱ溶液１００ｍＬ中における活性向上剤由来の窒素元素量が０．００１１ｇとなる濃度とする。なお、上記（ｂ）において、ＤＭＢＱ溶液中の活性向上剤由来の窒素含有量は、上記（２－４）の項と同様の方法で算定した値とする。
本活性向上剤は、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が、１０．００％以下であればよい。上記ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）は、７．００％以下であることが好ましく、５．００％以下であることがより好ましく、４．００％以下であることがさらに好ましく、１．００％以下であることがさらに好ましく、本明細書における測定方法において０．００％以下、すなわち検出限界以下であることが特に好ましい。上記構成によれば、ＢＯＤの活性をより容易に向上させることができるという利点を有する。
（２－６）溶媒
本活性向上方法では、ＢＯＤは活性向上剤とともに溶液中に含まれる。ＢＯＤ溶液を形成するための溶媒としては、本ＢＯＤおよび本活性向上剤を溶解できるものであれば特に限定されず、従来公知の溶媒を使用することができる。本溶媒は、本ＢＯＤおよび本活性向上剤を容易に溶解できる点から好ましくは水（例えば蒸留水）である。
本活性向上方法では、ＢＯＤは活性向上剤とともに溶液中に含まれる。ＢＯＤ溶液を形成するための溶媒としては、本ＢＯＤおよび本活性向上剤を溶解できるものであれば特に限定されず、従来公知の溶媒を使用することができる。本溶媒は、本ＢＯＤおよび本活性向上剤を容易に溶解できる点から好ましくは水（例えば蒸留水）である。
本ＢＯＤ溶液は、本ＢＯＤ溶液を用いる用途に合わせて、任意のｐＨを有してもよい。本ＢＯＤ溶液は、当該ＢＯＤ溶液中に含有されるＢＯＤの立体構造を安定に保つために、ｐＨ６～１０のｐＨを有することが好ましい。本ＢＯＤ溶液は、所望のｐＨを有するために、緩衝剤を含むことが好ましい。上記緩衝剤としては、従来公知の緩衝剤を使用可能である。また、本ＢＯＤ溶液は、所望のｐＨを有するために、従来公知の酸またはアルカリを用いて従来公知の方法でｐＨが調整され得る。
（２－７）その他
本ＢＯＤ溶液は、ＢＯＤの活性を向上させることができる限り、ＢＯＤ、活性向上剤、および溶媒以外の任意の物質を含んでいてもよい。本ＢＯＤ溶液は、例えば、緩衝剤、酸、塩基、無機塩、有機塩、金属塩、糖類、アミノ酸、不活性タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、界面活性剤、および樹脂などを含んでいてもよい。
本ＢＯＤ溶液は、ＢＯＤの活性を向上させることができる限り、ＢＯＤ、活性向上剤、および溶媒以外の任意の物質を含んでいてもよい。本ＢＯＤ溶液は、例えば、緩衝剤、酸、塩基、無機塩、有機塩、金属塩、糖類、アミノ酸、不活性タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、界面活性剤、および樹脂などを含んでいてもよい。
（２－８）用途
本活性向上方法に基づき放置され、ＢＯＤの活性が向上された後のＢＯＤ溶液は、任意の用途に用いられ得る。本活性向上方法によりＢＯＤの活性が向上された後のＢＯＤ溶液は、例えば、染毛、生体試料中のビリルビンの濃度の測定、生体試料中のビリルビンの除去、化粧品、食品加工、酵素燃料電池（例えば、酵素バイオ電池、酵素電池、等）、およびタンパク質の架橋などに用いることができる。
本活性向上方法に基づき放置され、ＢＯＤの活性が向上された後のＢＯＤ溶液は、任意の用途に用いられ得る。本活性向上方法によりＢＯＤの活性が向上された後のＢＯＤ溶液は、例えば、染毛、生体試料中のビリルビンの濃度の測定、生体試料中のビリルビンの除去、化粧品、食品加工、酵素燃料電池（例えば、酵素バイオ電池、酵素電池、等）、およびタンパク質の架橋などに用いることができる。
〔３．ＢＯＤ製品〕
本発明の別の一実施形態は、容器内にＢＯＤおよび活性向上剤が含まれ、上記容器内は脱酸素雰囲気であり、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である、ＢＯＤ製品を提供する。
本発明の別の一実施形態は、容器内にＢＯＤおよび活性向上剤が含まれ、上記容器内は脱酸素雰囲気であり、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である、ＢＯＤ製品を提供する。
本ＢＯＤ製品は上記構成を有することにより、ＢＯＤ製品に含まれるＢＯＤの活性を向上させることができるという利点を有する。
本ＢＯＤ製品に含まれる、ＢＯＤおよび活性向上剤は粉末等の固体状であってもよいが、適切な溶媒によって溶解された溶液（つまりＢＯＤ溶液）であることが好ましい。ＢＯＤは溶液の状態で不安定であるが、本ＢＯＤ製品によればＢＯＤが溶液状態であってもＢＯＤの活性を向上させることができる。
本ＢＯＤ製品に含まれる、ＢＯＤおよび活性向上剤が溶液状態である場合、（ａ）使用の度にＢＯＤおよび活性向上剤を溶解する操作が必要とされることなく、かつ、（ｂ）使用時にＢＯＤの粉体が飛散することによる作業者へのＢＯＤの暴露の虞もない、という利点を有する。
なお、本ＢＯＤ製品に含まれる、ＢＯＤ、活性向上剤、および溶媒等の説明は上記〔２．活性向上方法〕の項の説明を援用することができる。また、本ＢＯＤ製品は、上記（２－７）その他の項で説明した任意の物質をさらに含んでいてもよい。また、本ＢＯＤ製品において、容器内の脱酸素雰囲気は、上記（２－３）脱酸素雰囲気の項で説明した脱酸素雰囲気を形成するための方法によって達成され得る。
（３－１）容器
本ＢＯＤ製品において用いられ得る容器は、少なくともＢＯＤおよび活性向上剤を格納することができる容器であれば、容器の材質、形状、大きさ等は限定されるものではない。容器は、当該容器内の脱酸素状態を一定期間保つことができる容器であってもよく、当該容器内を脱酸素雰囲気にすることができる容器であってもよい。容器の材質はガラス製であっても、樹脂製であってもよい。また容器の形状は、瓶状であっても、袋状であってもよい。袋状の容器としてはファスナー付き樹脂製袋（例えばジップロック（登録商標）等）が利用可能である。容器の大きさは、格納されるＢＯＤおよび活性向上剤、またはＢＯＤ溶液の体積に応じて適宜、設計すればよい。
本ＢＯＤ製品において用いられ得る容器は、少なくともＢＯＤおよび活性向上剤を格納することができる容器であれば、容器の材質、形状、大きさ等は限定されるものではない。容器は、当該容器内の脱酸素状態を一定期間保つことができる容器であってもよく、当該容器内を脱酸素雰囲気にすることができる容器であってもよい。容器の材質はガラス製であっても、樹脂製であってもよい。また容器の形状は、瓶状であっても、袋状であってもよい。袋状の容器としてはファスナー付き樹脂製袋（例えばジップロック（登録商標）等）が利用可能である。容器の大きさは、格納されるＢＯＤおよび活性向上剤、またはＢＯＤ溶液の体積に応じて適宜、設計すればよい。
本容器は、脱酸素状態を容易にかつ長期間保つために、酸素を透過しない材料（または透過しにくい材料）から構成された容器であることが好ましい。また、本容器は、脱酸素剤の性質を有する成分を含む材料から構成されていてもよい。また、本容器は、ＢＯＤの活性をより向上させることを可能とするために、半密閉容器であることが好ましく、あらゆる物質を透過させることがない密閉容器であることがより好ましい。
本ＢＯＤ製品では、ＢＯＤおよび活性向上剤を含む容器に、溶媒を加えることにより、ＢＯＤおよび活性向上剤を溶解して、ＢＯＤ溶液としてもよい。それ故に、本ＢＯＤ製品における容器は、上記溶媒に対して耐性を有する容器であることが好ましい。
（３－２）本ＢＯＤ製品の具体的態様の一例
本ＢＯＤ製品の態様は特に限定されるものではないが、例えば容器が開閉可能な蓋を有する瓶形状であり、蓋部の内側にパッケージングされた脱酸素剤を備えており、容器内部にＢＯＤおよび活性向上剤が格納されているという態様（態様Ａ）であり得る。態様Ａの場合、容器内部に格納されるＢＯＤおよび活性向上剤は液体状であってもよく、固体状であってもよい。固体状のＢＯＤおよび活性向上剤が態様Ａで容器内部に格納される場合には、容器に溶媒を加えてＢＯＤおよび活性向上剤を溶解することによりＢＯＤ溶液とした後であっても、ＢＯＤおよび活性向上剤を格納していた容器と同じ容器を用いて、引き続きＢＯＤ溶液を脱酸素雰囲気下で放置し、ＢＯＤの活性を向上させることができる。
本ＢＯＤ製品の態様は特に限定されるものではないが、例えば容器が開閉可能な蓋を有する瓶形状であり、蓋部の内側にパッケージングされた脱酸素剤を備えており、容器内部にＢＯＤおよび活性向上剤が格納されているという態様（態様Ａ）であり得る。態様Ａの場合、容器内部に格納されるＢＯＤおよび活性向上剤は液体状であってもよく、固体状であってもよい。固体状のＢＯＤおよび活性向上剤が態様Ａで容器内部に格納される場合には、容器に溶媒を加えてＢＯＤおよび活性向上剤を溶解することによりＢＯＤ溶液とした後であっても、ＢＯＤおよび活性向上剤を格納していた容器と同じ容器を用いて、引き続きＢＯＤ溶液を脱酸素雰囲気下で放置し、ＢＯＤの活性を向上させることができる。
ＢＯＤおよび活性向上剤が粉末等の固体状の場合は、パッケージングされた脱酸素剤は蓋部に備えられている必要はなく、ＢＯＤおよび活性向上剤と共に容器内に同封されていればよい。容器内の脱酸素剤によって、容器内部が脱酸素雰囲気となる。さらに、容器内の空気は窒素等の不活性気体に置換されていてもよい。
またファスナー付き樹脂製袋内に、ＢＯＤ、活性向上剤、パッケージングされた脱酸素剤が格納される態様であってもよい。
（３－３）用途
本ＢＯＤ製品は、任意の用途に用いられ得る。本ＢＯＤ製品は、例えば、染毛、生体試料中のビリルビンの濃度の測定、生体試料中のビリルビンの除去、化粧品、食品加工、酵素燃料電池（例えば、酵素バイオ電池、酵素電池、等）、およびタンパク質の架橋などに用いることができる。
本ＢＯＤ製品は、任意の用途に用いられ得る。本ＢＯＤ製品は、例えば、染毛、生体試料中のビリルビンの濃度の測定、生体試料中のビリルビンの除去、化粧品、食品加工、酵素燃料電池（例えば、酵素バイオ電池、酵素電池、等）、およびタンパク質の架橋などに用いることができる。
〔４．高活性型ＢＯＤの製造方法〕
本発明の別の一実施形態に係る高活性型ＢＯＤの製造方法は、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置する工程を含む方法である。ここで、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である物質である。
本発明の別の一実施形態に係る高活性型ＢＯＤの製造方法は、ＢＯＤおよび活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置する工程を含む方法である。ここで、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である物質である。
本発明の別の一実施形態に係る高活性型ＢＯＤの製造方法は、上記構成を有することにより、ＢＯＤの活性が向上した、高活性型ＢＯＤを提供できるという利点を有する。高活性型ＢＯＤとは、当該製造方法を実施する前のＢＯＤと比較して、当該製造方法を実施することにより、比活性が上昇したＢＯＤである。
本発明の別の一実施形態に係る高活性型ＢＯＤの製造方法を、単に本製造方法、とも称する。
本製造方法における、ＢＯＤ、活性向上剤、および溶媒等の説明は上記〔２．活性向上方法〕の項の説明を援用することができる。また、本製造方法では、上記（２－７）その他の項で説明した任意の物質をさらに使用してもよい。また、本製造方法において、脱酸素雰囲気下を形成するための方法は、上記（２－３）脱酸素雰囲気の項で説明した脱酸素雰囲気を形成するための方法によって達成され得る。
本製造方法は、放置する工程の後に、さらに、ＢＯＤ溶液を凍結乾燥し、固体（粉末）状のＢＯＤを得る工程を含んでいてもよい。本製造方法が固体状のＢＯＤを得る工程を含む場合には、本製造方法は、高活性型ＢＯＤを固体として提供できる。
本製造方法によって得られた高活性型ＢＯＤは、上記（２－８）用途の項で説明したように、様々な用途に用いることができる。
なお、本発明は、本発明の一実施形態に係る高活性型ＢＯＤの製造方法により製造されたＢＯＤ（高活性型ＢＯＤ）をも包含するものである。
本発明の一実施形態は、以下の様な構成であってもよい。
〔１〕ビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤を含むビリルビンオキシダーゼ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置することを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼの活性向上方法：ここで、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である。
〔２〕上記ビリルビンオキシダーゼ溶液を、１０℃以上の温度環境下にて放置することを特徴とする、〔１〕に記載のビリルビンオキシダーゼの活性向上方法。
〔３〕容器内にビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤が含まれ、上記容器内は脱酸素雰囲気であり、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下であることを特徴とする、ビリルビンオキシダーゼ製品。
〔４〕上記ビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤は溶液状態である、〔３〕に記載のビリルビンオキシダーゼ製品。
〔５〕ビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤を含むビリルビンオキシダーゼ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置する工程を含むことを特徴とする、高活性型ビリルビンオキシダーゼの製造方法：ここで、上記活性向上剤は、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）が０．１０％以上であり、かつ、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が１０．００％以下である。
以下、実施例によって本発明の一実施形態を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例（試験例）に限定されるものではない。
本実施例で使用した本活性向上剤、およびその他の物質（以下、比較物質と称する。）は以下の通りである。なお、グリオキシル酸のみ、水酸化カリウム溶液を用いて、ｐＨ７．０に調整し、本実施例にて使用した。
（活性向上剤）
・尿酸（和光純薬社製）
・グリオキシル酸（和光純薬社製）
・粉末麦芽エキス（極東製薬工業社製）
・粉末魚エキス（極東製薬工業社製）
・粉末酵母エキス（極東製薬工業社製）
・ＣＳＬ ソルリス０９５Ｅ（オリエンタル酵母工業社製）（表１、３、７および８、ならびに図２および３ではＣＳＬと表記）
・ミーストＰ１Ｇ（アサヒグループ食品社製）
・ペプトンＡ（極東製薬工業社製）
・大豆粉８８（昭和産業社製）
・Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（日本ＢＤ社製）
・パティケース（極東製薬工業社製）
・Ｈｉｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬社製）
・ペプトン（極東製薬工業社製）
・亜硫酸ナトリウム（和光純薬社製）
・グルタチオン（還元型）（和光純薬社製）
・Ｌ－システイン塩酸塩（和光純薬社製）
・Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（和光純薬社製）
・Ｌ－アスコルビン酸（和光純薬社製）
・Ｔｒｏｌｏｘ（シグマアルドリッチ社製）
（比較物質）
・尿素（和光純薬社製）
・硫酸アンモニウム（ナカライテスク社製）
・ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬社製）
・チオグリコール酸アンモニウム（佐々木化学社製）
・システアミン塩酸塩（佐々木化学社製）
・グリセリルモノチオグリコレート（表１、２、７および８、ならびに図２および３ではＧＭＴと表記）（佐々木化学社製）。
・尿酸（和光純薬社製）
・グリオキシル酸（和光純薬社製）
・粉末麦芽エキス（極東製薬工業社製）
・粉末魚エキス（極東製薬工業社製）
・粉末酵母エキス（極東製薬工業社製）
・ＣＳＬ ソルリス０９５Ｅ（オリエンタル酵母工業社製）（表１、３、７および８、ならびに図２および３ではＣＳＬと表記）
・ミーストＰ１Ｇ（アサヒグループ食品社製）
・ペプトンＡ（極東製薬工業社製）
・大豆粉８８（昭和産業社製）
・Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（日本ＢＤ社製）
・パティケース（極東製薬工業社製）
・Ｈｉｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬社製）
・ペプトン（極東製薬工業社製）
・亜硫酸ナトリウム（和光純薬社製）
・グルタチオン（還元型）（和光純薬社製）
・Ｌ－システイン塩酸塩（和光純薬社製）
・Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（和光純薬社製）
・Ｌ－アスコルビン酸（和光純薬社製）
・Ｔｒｏｌｏｘ（シグマアルドリッチ社製）
（比較物質）
・尿素（和光純薬社製）
・硫酸アンモニウム（ナカライテスク社製）
・ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（和光純薬社製）
・チオグリコール酸アンモニウム（佐々木化学社製）
・システアミン塩酸塩（佐々木化学社製）
・グリセリルモノチオグリコレート（表１、２、７および８、ならびに図２および３ではＧＭＴと表記）（佐々木化学社製）。
（試験例１）本活性向上方法によるＢＯＤの活性の向上
ＢＯＤと、本活性向上剤または比較物質と、を含むＢＯＤ溶液を一定期間、脱酸素雰囲気下かつ３０℃の温度環境下にて放置した。放置後、ＢＯＤの活性を測定することにより、本活性向上方法によるＢＯＤの活性の向上について評価した。
ＢＯＤと、本活性向上剤または比較物質と、を含むＢＯＤ溶液を一定期間、脱酸素雰囲気下かつ３０℃の温度環境下にて放置した。放置後、ＢＯＤの活性を測定することにより、本活性向上方法によるＢＯＤの活性の向上について評価した。
試験例１では、ＢＯＤとして、ミロセシウム・ベルカリアＭＴ－１由来のＢＯＤ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバー：Ｄ１２５７９．１）をアスペルギルス属に導入した後、当該アスペルギルス属で発現させた遺伝子組換えＢＯＤ（以下、単にＢＯＤとも称する）を、公知の技術を用いて精製した後、使用した。ミロセシウム・ベルカリアＭＴ－１由来のＢＯＤ遺伝子は、アスペルギルス属の遺伝子配列に合わせてコドンの最適化を行った後、アスペルギルス属に導入した。また、精製したＢＯＤは、当該ＢＯＤの濃度が１．０ｍｇ／ｍLとなるように５０ｍＭグリシン－ＫＯＨ（ｐＨ８．５）緩衝液に溶解し、ＢＯＤ酵素溶液として使用した。
ＢＯＤの酵素活性は以下のように測定した。５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１７８０μLに２０ｍＭのＡＢＴＳ基質溶液２００μLを加えて混合溶液（１９８０μL）を作製し、当該混合溶液を３７℃で１分間インキュベートした。その後、混合溶液にＢＯＤを含む溶液（具体的には後述する評価用ＢＯＤ溶液）を２０μL添加して、得られた混合溶液（２ｍL）を３７℃でインキュベートした。混合溶液のインキュベートとともに、評価用ＢＯＤ溶液の添加直後（０秒）を含めて２０秒間ごとに、当該混合溶液の波長４３６ｎｍにおける吸光度を測定した。評価用ＢＯＤ溶液の添加直後の混合溶液の波長４３６ｎｍにおける吸光度、および評価用ＢＯＤ溶液の添加から１分間経過後の混合溶液の波長４３６ｎｍにおける吸光度から、評価用ＢＯＤ溶液の添加後１分間あたりの、混合溶液の波長４３６ｎｍにおける吸光度の増加率を算定した。当該増加率から、評価用ＢＯＤ溶液におけるＢＯＤの活性（ユニット）を算出した。本明細書において、１分間あたり１μｍｏｌのＡＢＴＳを酸化する酵素量を１ユニットと定義した。
試験例１の具体的な試験方法は以下の通りである。ＢＯＤを含むＢＯＤ酵素溶液に、上述した本活性向上剤のうち１種を添加し、ＢＯＤ溶液（本発明の一実施形態に係るＢＯＤ溶液である）を作製した。また、上記ＢＯＤ酵素溶液に、上述した比較物質のうち１種を添加し、ＢＯＤ溶液を作製した。さらに、上記ＢＯＤ酵素溶液に活性向上剤または比較物質の代わりに蒸留水を添加したＢＯＤ溶液を作製し、コントロールのＢＯＤ溶液（表１～表３では無添加と表記）とした。各ＢＯＤ溶液における活性向上剤または比較物質の最終濃度を、「ｍＭ」または「百分率（％）」（ＢＯＤ溶液１００ｍＬに対する活性向上剤または比較物質の量（ｇ））として表１に示した。
評価用ＢＯＤ溶液におけるＢＯＤの活性（ユニット）を上述する方法で測定した。ＢＯＤの活性について、放置開始時（０日目）のＢＯＤの活性（ユニット）を１００％としたときの、所定の日数放置後のＢＯＤの活性（ユニット）の相対値を活性（％）として算出した。４７日間放置した場合の結果を表２に、１４日間放置した場合の結果を表３に、それぞれ示した。
試験例１において、（ａ）（ａ－１）ＢＯＤを含むＢＯＤ酵素溶液、および（ａ－２）本活性向上剤のうち１種、を含むＢＯＤ溶液と、（ｂ）脱酸素剤とを一つの容器内に封入した後、容器を密閉して得られたＢＯＤ容器は、本発明の一実施形態におけるＢＯＤ製品ともいえる。また、本活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を脱酸素雰囲気下にて放置した後に得られたＢＯＤは、放置前のＢＯＤと比較して比活性が上昇していることから、高活性型ＢＯＤともいえる。すなわち試験例１は、本活性向上方法の実施でもあり、本ＢＯＤ製品の製造ともいえ、本発明の一実施形態に係る高活性型ビリルビンオキシダーゼの製造方法の実施ともいえる。
（試験例２）本活性向上方法におけるＢＯＤ溶液を放置するときの温度環境の検討
ＢＯＤと本活性向上剤とを含むＢＯＤ溶液を脱酸素雰囲気下にて放置するときの、温度環境を検討した。
ＢＯＤと本活性向上剤とを含むＢＯＤ溶液を脱酸素雰囲気下にて放置するときの、温度環境を検討した。
試験例２の具体的な試験方法は以下の通りである。試験例１と同様の手順によって、活性向上剤を含むＢＯＤ溶液を作製した。また、活性向上剤を含まない（無添加の）ＢＯＤ溶液を作製し、コントロールとした。試験例２では、活性向上剤としてＬ－アスコルビン酸または尿酸を使用し、ＢＯＤ溶液における最終濃度は、Ｌ－アスコルビン酸を４ｍＭ、尿酸を２０ｍＭとした。また、試験例２では、ＢＯＤ酵素溶液におけるＢＯＤの濃度は３．０ｍｇ／ｍLとした。
上記ＢＯＤ溶液の各々と脱酸素剤（三菱ガス化学社製アネロパック・ケンキ）とを酸素を透過しない一つの容器（パウチ）内に封入した後、容器を密閉し、ＢＯＤ容器を作製した。当該ＢＯＤ容器を、室温（約２５℃）にて約２時間放置することにより、容器内を脱酸素雰囲気とした。その後、ＢＯＤ容器を、５℃、１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、または５０℃に設定した恒温室内に、一定期間放置した。ここで、（ａ）無添加のＢＯＤ溶液については、１日間、３日間、７日間、１４日間、または２９日間放置し、（ｂ）Ｌ－アスコルビン酸を含むＢＯＤ溶液については、１日間、３日間、７日間、または１４日間放置し、（ｃ）尿酸を含むＢＯＤ溶液については、１日間、３日間、８日間、１４日間、または２８日間放置した。各条件に付き、３つのサンプル（ＢＯＤ容器）を用意した。放置後、各ＢＯＤ容器からＢＯＤ溶液を採取し、評価用ＢＯＤ溶液とした。
評価用ＢＯＤ溶液におけるＢＯＤの活性（ユニット）を上述する方法で測定した。ＢＯＤの活性について、放置開始時（０日目）のＢＯＤの活性（ユニット）を１００％としたときの、所定の日数放置後のＢＯＤの活性（ユニット）の相対値を活性（％）として算出した。３つのサンプルの平均値を表４～６に示した。表４にはコントロールの結果を、表５には活性向上剤としてＬ－アスコルビン酸を用いた場合の結果を、表６には活性向上剤として尿酸を用いた場合の結果を、それぞれ示した。また、３つのサンプルの平均値および標準誤差を図１に示した。
Ｌ－アスコルビン酸を用いた場合について具体的に説明する。この場合、４０℃以上の温度環境下にＢＯＤ容器を放置した場合１日後に、３０℃の温度環境下にＢＯＤ容器を放置した場合３日後に、および２０℃の温度環境下にＢＯＤ容器を放置した場合７日後に、それぞれ、放置前のＢＯＤの活性と比較して、ＢＯＤの活性は約２倍以上向上した。
尿酸を用いた場合について具体的に説明する。この場合、４０℃以上の温度環境下にＢＯＤ容器を放置した場合１日後に、放置前のＢＯＤの活性と比較してＢＯＤの活性は約１．８または約２倍向上した。また、３０℃の温度環境下にＢＯＤ容器を放置した場合３日後に、および２０℃の温度環境下にＢＯＤ容器を放置した場合８日後に、それぞれ、放置前のＢＯＤの活性と比較して、ＢＯＤの活性は約１．８倍向上した。
Ｌ－アスコルビン酸を用いた場合、および尿酸を用いた場合、どちらの場合においても、５℃の温度環境下にＢＯＤ容器を放置した場合には、１０℃以上の温度環境下にＢＯＤ容器を放置した場合に達成されるほどのＢＯＤの活性の向上は認められなかった。
以上の結果より、本活性向上方法において、ＢＯＤ溶液を、１０℃以上の温度環境下で放置することが好ましく、ＢＯＤ溶液をより高い温度環境下で放置する場合には、ＢＯＤの活性を短期間で向上させることができることが示唆された。
試験例１と同様に、試験例２もまた、本活性向上方法の実施でもあり、本ＢＯＤ製品の製造ともいえ、本発明の一実施形態に係る高活性型ビリルビンオキシダーゼの製造方法の実施ともいえる。
（試験例３）活性向上剤のＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率の評価
試験例１で用いた本活性向上剤および比較物質について、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）を評価した。
試験例１で用いた本活性向上剤および比較物質について、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）を評価した。
具体的な評価方法は、以下の通りである。ＡＢＴＳとしてはロシュ・ダイアグノティックス社製ＡＢＴＳを用いた。ＡＢＴＳの濃度が２０ｍＭとなるように、ＡＢＴＳを５０ｍＭグリシン－ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、ＡＢＴＳ溶液を調製した。ＡＢＴＳ溶液の波長４３６ｎｍにおける吸光度（ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６））を、分子吸光度計SpectraMax Plus384（日本モレキュラーデバイス社製）を用いて、光路長１．０ｃｍにて測定したところ、吸光度は約１．３であった。次に、活性向上剤溶液または比較物質溶液５μLを、ＡＢＴＳ溶液１９５μLに対して添加し、ＡＢＴＳ評価用反応溶液（以下、「反応溶液Ａ」とも称する）を作製した。ここで、反応溶液Ａ中の各活性向上剤または比較物質の量は、（ａ）活性向上剤もしくは比較物質が単一の化合物からなるような、活性向上剤もしくは比較物質の分子量が明らかである場合、反応溶液Ａ中、活性向上剤もしくは比較物質が１ｍＭとなる量とし、（ｂ）活性向上剤もしくは比較物質が、分子量が不明の組成物からなるような物質である場合、反応溶液Ａ１００ｍＬ中、活性向上剤もしくは比較物質由来の窒素元素量が０．０１１ｇとなる量とした。反応溶液Ａにおける活性向上剤または比較物質の最終濃度を、（ａ）分子量が明らかである活性向上剤または比較物質については「ｍＭ」で、（ｂ）分子量が不明である活性向上剤または比較物質については「百分率（％）」（反応溶液Ａ１００ｍＬに対する活性向上剤または比較物質の量（ｇ））で、表７に示した。
続いて、反応溶液Ａ作製直後、すなわちＡＢＴＳ溶液に対して活性向上剤溶液または比較物質溶液の添加直後に、反応溶液Ａを２５℃で１分間反応させた。その後直ちに、反応溶液Ａの波長４３６ｎｍにおける吸光度を、ＡＢＴＳ溶液の吸光度測定に使用した際と同型の分子吸光度計を用いて測定した。また、活性向上剤溶液または比較物質溶液の代わりに蒸留水５μLを、ＡＢＴＳ溶液１９５μLに対して添加し、活性向上剤または比較物質を含まない反応溶液Ａを作製し、コントロール（表２および図２では無添加と表記）とした。コントロールについても、反応溶液Ａを２５℃で１分間反応させた後、反応溶液Ａの波長４３６ｎｍにおける吸光度を、上記分子吸光度計を用いて測定した。以上のようにして得られた、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）と、反応溶液Ａの波長４３６ｎｍにおける吸光度とを比較した。ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）（１００％）に対する、反応溶液Ａの活性向上剤または比較物質を添加後の１分間当たりの吸光度減少率（％）を算定し、ＡＢＴＳ初発吸光度（Ａ４３６）減少率（％）とした。結果を表７および図２に示した。
図２において、無添加の反応溶液Ａ、および尿素または硫酸アンモニウムを含む反応溶液Ａでは、ＡＢＴＳ初発吸光度が変化しないことが分かった。一方、本活性向上剤を含む反応溶液Ａは、ＡＢＴＳ初発吸光度減少率が０．１０％以上であることが分かった。
（試験例４）活性向上剤のＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率の評価
試験例１で用いた本活性向上剤および比較物質について、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）を評価した。試験例４で用いた活性向上剤および比較物質は、後述する表８に記載の各物質である。
試験例１で用いた本活性向上剤および比較物質について、ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）を評価した。試験例４で用いた活性向上剤および比較物質は、後述する表８に記載の各物質である。
具体的な評価方法は、以下の通りである。ＤＭＢＱとしては東京化成工業社製ＤＭＢＱを用いた。まず、１ｍＭのＤＭＢＱ溶液を作製した。１ｍＭのＤＭＢＱ溶液の波長２５６ｎｍにおける吸光度（Ａ２５６）を、紫外可視分光光度計ＵＶ－１６０Ａ（島津製作所社製）を用いて、光路長１．０ｃｍにて測定したところ、吸光度は約１．８であった。次に、蒸留水８９０μLに、（ａ）１ｍＭのＤＭＢＱ溶液を１００μL、および、（ｂ）活性向上剤溶液または比較物質溶液を１０μL、添加し、ＤＭＢＱ評価用反応溶液（以下、反応溶液Ｄとも称する）を作製した。ここで、反応溶液Ｄ中の各活性向上剤または比較物質の量は、（ａ）活性向上剤もしくは比較物質が単一の化合物からなるような、活性向上剤もしくは比較物質の分子量が明らかである場合、反応溶液Ｄ中、活性向上剤もしくは比較物質が０．１ｍＭとなる量とし、（ｂ）活性向上剤もしくは比較物質が、分子量が不明の組成物からなるような物質である場合、反応溶液Ｄ１００ｍＬ中、活性向上剤もしくは比較物質由来の窒素元素量が０．００１１ｇとなる量とした。反応溶液Ｄにおける活性向上剤または比較物質の最終濃度を、（ａ）分子量が明らかである活性向上剤または比較物質については「ｍＭ」で、（ｂ）分子量が不明である活性向上剤または比較物質については「百分率（％）」（反応溶液Ｄ１００ｍＬに対する活性向上剤または比較物質の量（ｇ））で、表８に示した。また、活性向上剤溶液または比較物質溶液の代わりに、蒸留水を１０μL用いた反応溶液Ｄを作製し、コントロール（図３では無添加と表記）とした。
図３は、本発明の一実施形態に係る活性向上剤または比較物質によるＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）、を示す図である。具体的には、図３の（ａ）は、反応溶液Ｄの波長２５６ｎｍにおける吸光度について、試験開始直後（０分）の吸光度を１００％とした場合の、本発明の一実施形態に係る活性向上剤または比較物質の添加後（試験開始後）の吸光度の相対的減少率（％）、を示す図である。図３の（ｂ）は、反応溶液Ｄの波長２５６ｎｍにおける吸光度について、試験開始直後（０分）の吸光度に対する、本発明の一実施形態に係る活性向上剤または比較物質の添加後（試験開始後）の１分間当たりの吸光度減少率（％）（ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％））、を示す図である。
なお、試験例４で用いた粉末麦芽エキス、粉末魚エキス、粉末酵母エキス、ＣＳＬ、ミーストＰ１Ｇ、ペプトンＡ、大豆粉８８、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、パティケース、Ｈｉｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎおよびペプトンは、（１）反応溶液Ｄの波長２５６ｎｍにおける吸光度の相対的減少率（％）（図３（ａ））が１００％から変化せず、かつ（２）ＤＭＢＱ初発吸光度（Ａ２５６）減少率（％）が０．００％（すなわち検出限界以下）であり、図３には図示していない。
本発明の一実施形態によれば、ＢＯＤの活性を向上させることができる。従って、本発明は、染毛の分野、臨床検査の分野、化粧品の分野、酵素燃料電池（例えば、酵素バイオ電池、酵素電池、等）分野、および食品加工分野等ＢＯＤを利用する広範な分野において好適に利用することができる。
Claims (3)
- ビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤を含むビリルビンオキシダーゼ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置することによってビリルビンオキシダーゼの活性を向上させる工程を含む、ビリルビンオキシダーゼの活性向上方法：
ここで、上記活性向上剤は、尿酸、グリオキシル酸、麦芽エキス、魚エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、大豆粉、亜硫酸ナトリウム、グルタチオン（還元型）、Ｌ－システイン塩酸塩、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｌ－アスコルビン酸および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸からなる群から選択される少なくとも一つ以上の物質である。 - 上記ビリルビンオキシダーゼ溶液を、１０℃以上の温度環境下にて放置することを特徴とする、請求項１に記載のビリルビンオキシダーゼの活性向上方法。
- ビリルビンオキシダーゼおよび活性向上剤を含むビリルビンオキシダーゼ溶液を、脱酸素雰囲気下において放置することによってビリルビンオキシダーゼの活性を向上させる工程を含む、高活性型ビリルビンオキシダーゼの製造方法：
ここで、上記活性向上剤は、尿酸、グリオキシル酸、麦芽エキス、魚エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、大豆粉、亜硫酸ナトリウム、グルタチオン（還元型）、Ｌ－システイン塩酸塩、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、Ｌ－アスコルビン酸および６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸からなる群から選択される少なくとも一つ以上の物質である。
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