JP3425241B2

JP3425241B2 - 汚染防止方法

Info

Publication number: JP3425241B2
Application number: JP24856194A
Authority: JP
Inventors: 武義浦田; 善章片山; 英俊辛島
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1994-09-16
Filing date: 1994-09-16
Publication date: 2003-07-14
Anticipated expiration: 2018-07-14
Also published as: JPH0886782A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、各種臨床検査に広く利
用されている還元性物質の測定技術に関するものであ
る。具体的には、テトラゾリウム化合物を還元性物質に
接触させ生成するホルマザンを指標にして還元性物質を
測定するときに問題となるホルマザンによる機器類の汚
染を防止する技術に関するものである。

【０００２】還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下ＮＡＤＨと省略する）や還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰＨと省
略する）に代表される還元性物質は、各種臨床検査に広
く利用されている。たとえばＮＡＤＨは、ＮＡＤＨその
ものを測定する場合のみならず、他の酵素反応によって
生成するＮＡＤＨを測定することによって数多くの物質
の測定を可能にする非常に重要な物質である。たとえば
以下に示すような成分はＮＡＤＨの生成を指標として測
定することが可能である。コレステロールクレアチンフォスフォキナーゼ（以下ＣＰＫと省略す
る）乳酸脱水素酵素（以下ＬＤＨと省略する）胆汁酸グルコーストリグリセライドグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（アスパ
ラギン酸アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる以下Ｇ
ＯＴと省略する）グルタミン酸ピルビン酸トランスミナーゼ（アラニンア
ミノトランスフェラーゼとも呼ばれる以下ＧＰＴと省略
する）尿酸ＮＡＤＨの他にも、アスコルビン酸、スーパーオキシド
アニオン、そしてフルクトサミン等は臨床検査の分野で
は重要な還元性物質として示すことができる。

【０００３】

【従来技術の問題点】還元性物質の測定には、テトラゾ
リウム化合物が利用されている。テトラゾリウム化合物
は、還元性物質と接触して有色のホルマザンを定量的に
生成する。したがって、このホルマザンの生成を追跡す
ることによって、還元性物質の測定が可能である。

【０００４】テトラゾリウム化合物には次のようなもの
が知られている。２，２’，５，５’−テトラキス（４−ニトロフェニ
ル）−３，３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−
ジフェニレン）−２Ｈ，２’Ｈ−ジテトラゾリウム塩
（以下ＮＴＢと省略する）２−（４−ヨウ化フェニル）−３−（４−ニトロフェニ
ル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下Ｉ
ＮＴと省略する）３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジ
フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（以下ＭＴＴと省略
する）２，２’−ｐ−ジフェニレン−３，３’，５，５’−テ
トラフェニル−２Ｈ，２’Ｈ−ジテトラゾリウム塩（以
下Ｎｅｏ−ＮＴＢと省略する）トリニトロテトラゾリウム塩（以下Ｔ−ＮＴＢと省略す
る）

【０００５】これら従来のテトラゾリウム化合物は、自
身の水溶性が乏しい上、生成するホルマザンの水溶性も
低く、結果として様々な問題の原因となっていた。最も
大きな問題の一つが、ホルマザンによる機器類の汚染で
ある。ホルマザンの水溶性が低いため、分析装置の反応
環境に付着し汚染してしまうのである。分析機器の汚染
は、光学測定に干渉するため測定誤差の原因となる。特
に分析装置の光学系によく用いられるプラスチック製や
ガラス製の光学キュベットは、ホルマザンによる汚染の
影響を受けやすい。加えて自動分析装置の多くは反応か
ら光学測定までを同一のキュベット内で行うシステムと
なっているため、反応液との接触時間が長く汚染の機会
も多いと言える。また光学系以外であっても、反応廃液
流路等の汚染は本来透明であるべき部品の視認性を損な
うし、見た目にも美観を損なうので好ましいものではな
い。

【０００６】ホルマザンの機器への付着を防止するため
に、一般に界面活性剤が添加されている。しかし界面活
性剤によってもホルマザンを溶解することは困難で、あ
る程度の汚染防止効果が期待できるにすぎない。しかも
多量の界面活性剤は、酵素のような他の反応成分に阻害
的に作用することがあるので好ましくない。界面活性剤
の影響は、テトラゾリウム化合物を含む反応系そのもの
に対して直接的に及ぶだけでなく、反応環境への残留に
よって他の反応系にまで及ぶ危険性もある。界面活性剤
の中には、ごく微量であっても酵素活性等に重大な影響
を与えるものがあり、残留による問題は無視できない。
したがって、汚染対策としての界面活性剤の使用量をで
きるだけ抑制することが望まれる。

【０００７】他方、水溶性基を導入することによってテ
トラゾリウム化合物や生成するホルマザンの溶解性を改
善する試みもある。たとえば４級アンモニウムを導入し
たテトラゾリウム化合物が報告されているが、機器の汚
染防止に有効なホルマザンを生成しない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ホル
マザンによる機器の汚染の防止に有効な技術を提供する
ことである。特にホルマザンの汚染の影響を受けやす
い、プラスチック製、あるいはガラス製のキュベットの
汚染防止手段の提供が本発明の大きな課題のひとつであ
る。更に本発明は、界面活性剤のような反応系に好まし
くない影響を与える可能性のある成分を用いること無
く、効果的に機器の汚染を防止することを課題としてい
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、還元性
物質をテトラゾリウム化合物と接触させ、生成するホル
マザンを指標として還元性物質を測定する方法におい
て、下記構造式（１）のテトラゾリウム化合物を用いる
ことを特徴とするホルマザン化合物による汚染防止方法
によって解決される。

【化３】（式中、Ｒ１は水素原子またはメトキシ基、Ｒ２は水素
原子またはカルボキシル基またはスルホン酸基である）

【００１０】本発明のテトラゾリウム化合物は、水溶性
の改善による機器類の汚染防止を目的として合成された
新規な物質である。このテトラゾリウム化合物は、例え
ば実施例に示すような方法によって合成することが可能
である。すなわち、ヒドラジノベンゾチアゾールのアミ
ノ基にアルデヒドを結合し、次いで対応するジアゾニウ
ム塩を有機溶媒／水中塩基性条件下に反応させてホルマ
ザンとし、これを例えば亜硝酸ブチルのような酸化剤で
酸化すれば目的とするテトラゾリウム化合物を得ること
ができる。実施例に示した合成法はあくまでも代表的な
ものであり、本化合物はこの他の公知の合成方法によっ
ても得ることができる。式１で示されるホルマザン化合
物のうち、Ｒ１＝メトキシ基（−Ｏ−ＣＨ３）、Ｒ２＝
カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）である化合物は、溶解性
と感度に優れるため特に好ましい化合物として挙げられ
る。

【００１１】本発明における還元性物質は、たとえばＮ
ＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、スーパーオキシドアニオン、アス
コルビン酸、およびフルクトサミンから選択することが
できる。これらの還元性物質のテトラゾリウム化合物に
よる測定技術は既に公知である。本発明では、これら公
知の測定技術においてテトラゾリウム化合物として構造
式１に示した化合物を用いることによって機器類等の汚
染を防止することができる。

【００１２】なお本発明で言う汚染防止とは、ホルマザ
ン生成反応や光学測定を行う空間、あるいは生成したホ
ルマザンを含む液体の廃棄流路におけるホルマザンの付
着を抑制し光学的な汚れを防ぐことを意味する。ホルマ
ザン生成反応や光学測定を行う空間とは、具体的には試
験管、自動分析装置や分光光度計のキュベット、フロー
式分析装置の反応チューブ、ならびにマルチウエルタイ
プの反応容器等を示すことができる。マルチウエルタイ
プの反応容器は１つの基盤に複数の小さなウエルを併設
した反応容器で、かつてはもっぱら希釈系列の作成に使
われていたためマイクロタイタートレーと呼ばれる９６
穴タイプのものが広く用いられていた。多数の微量試料
の分析を１つの容器内で行えるので、現在では免疫学的
試験に限らず生化学的試験や細菌学的試験にも利用され
ている。更に、ウエル毎に、あるいはウエルの列毎にバ
ラバラにできるタイプのもの、また９６穴以外に様々な
容量のウエルをいろいろな配列に併設したものや、同じ
９６穴でも利用目的に合わせてウエルの形状を変更した
ものなど、種々の容器が市販されている。一方生成した
ホルマザンを含む液体の廃棄流路とは、吸引プローブ〜
チューブ〜廃液タンク〜廃液処理施設にいたる全流路を
含む。中でもホルマザンによる汚染の影響を大きく受け
るプラスチック製、あるいはガラス製の光学キュベット
の汚染防止への応用は本発明の最も好ましい態様であ
る。この種の素材のキュベットはホルマザンによる汚染
の影響を受けやすいが、本発明によって簡単に汚染を防
止することができる。プラスチックとしてはアクリル樹
脂系やポリスチレン樹脂系のものが挙げられる。またガ
ラスとしては通常のガラス材料に加え、石英等の素材が
透明性に優れるため光学キュベットによく用いられてい
る。また光学キュベットの他、反応や培養と光学測定を
１つの容器で行うことの多いマイクロタイタートレーの
ようなマルチウエルタイプの分析容器にもよく利用され
る素材である。したがってこれらの素材に対する汚染防
止技術は、光学系の汚染を防止する技術として非常に有
用である。

【００１３】本発明で測定の対象となる還元性物質は、
酵素反応によって生成したものであってもよい。還元性
物質を生成する酵素反応としては次のようなものが知ら
れている。なお以下に例示する反応系において、ＮＡＤ
あるいはＮＡＤＰと記載した部分はあくまでも一般的な
例であり、ほとんどの場合は相互に置換が可能である。
またフェナジンメトサルフェート（以下ＰＭＳと省略す
る）やジアホラーゼとして記載した電子キャリアーにつ
いても、相互に置換することができる。

【００１４】コレステロールの例

【化４】この例は遊離コレステロールを測定するための反応であ
り、更にコレステロールエステラーゼを組み合わせるこ
とによりエステル型も含めた総コレステロールの測定が
可能となる。

【００１５】ＣＰＫの例

【化５】この例に示したヘキソキナーゼに代えてグルコキナーゼ
（ＧＫ）を用いることができる。なお反応式中では次の
ような省略を行っている。ＡＤＰ：アデノシン２リン酸ＡＴＰ：アデノシン３リン酸ＨＫ：ヘキソキナーゼＧ−６−ＰＤＨ：グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ

【００１６】ＬＤＨの例

【化６】

【００１７】胆汁酸の例

【化７】この例に示した３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ以外にも、７α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼ、１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼによる反応も知られている。

【００１８】グルコースの例

【化８】この例に示したヘキソキナーゼに代えてグルコキナーゼ
を用いることができる。

【００１９】トリグリセライド（中性脂肪）の例

【化９】この他に、ＬＰＬの作用によって生じたグリセリンにグ
リセリンデヒドロゲナーゼを作用させ、ＮＡＤを還元す
る反応系も知られている。なお反応式中では次のような
省略を行っている。ＬＰＬ：リポプロテインリパーゼＦＦＡ：遊離脂肪酸ＧＫ：グリセロキナーゼＧ−３−ＰＤＨ：グリセロール３リン酸デヒドロゲナー
ゼ

【００２０】ＧＯＴの例

【化１０】基質としてＬ−アスパラギン酸に代えてＬ−アラニンを
用いれば、同様の反応系によりＧＰＴの測定が可能であ
る。

【００２１】尿酸の例

【化１１】尿酸の測定においては、用いるアルコールの種類により
組み合わせる酵素を選択する。すなわち、アルコールと
してメタノールを用いるのであれば、アルコールデヒド
ロゲナーゼにホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを用い
る。この場合ギ酸デヒドロゲナーゼを更に組み合わせ
て、もう１分子のＮＡＤＰを生成させる反応系も知られ
ている。一方アルコールにエタノールを用いれば、アル
コールデヒドロゲナーゼにはアセトアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼが適当である。

【００２２】これらの反応は、酵素活性の増強や補酵素
の安定性を向上させるために付加的な成分の元で行うこ
とができる。たとえば、酵素活性の増強には一部の界面
活性剤の組み合わせが有効なことが知られている。また
酵素活性の発現にＭｇ²⁺やＣａ²⁺のような金属イオンを
要求する場合が有るので必要に応じて添加すると良い。
ＮＡＤやＮＡＤＰのような補酵素は、重金属によって活
性を失うのでキレート剤の添加が安定化に有効である。
各反応は、至適ｐＨのもとで進行するように適当な緩衝
剤を利用すると良い。本発明に利用することができる一
般的な緩衝剤を次に示す。（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣ
ＥＳと省略する）ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazi
ne-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省
略する）３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid
、ＭＯＰＳＯと省略する）ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfo
nic acid、ＢＥＳと省略する）３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morphol
ino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する）トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタン
スルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoeth
anesulfonic acid、ＴＥＳと省略する）ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸
（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic a
cid 、ＨＥＰＥＳと省略する）３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyet
hyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳ
Ｏと省略する）トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−
３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethy
l)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、Ｔ
ＡＰＳＯと省略する）２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯ
と省略する）ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic
acid)、ＰＯＰＳＯと省略する）２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホ
ン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfo
nicacid、ＥＰＰＳと省略する） N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid 、ＴＡＰＳと省略する）３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）ア
ミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（3-[(1,1-
Dimethyl-2-hydroxyethyl)amino]-2-hydroxypropanesul
fonic acid、ＡＭＰＳＯと省略する）２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］エタン−スルホン酸
（2-[N-Cyclohexylamino]ethane sulfonic acid、ＣＨ
ＥＳと省略する）３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−
プロパンスルホン酸（3-[Cyclohexylamino]-2-hydroxy-
1-propanesulfonic acid、ＣＡＰＳＯと省略する）２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（2-Amino-
2-Methyl-1-Propanol、ＡＭＰと省略する）式１で示されるテトラゾリウム化合物から生成するホル
マザンは、ｐＨ７．０〜９．５の範囲で５５０nm付近に
吸収ピークを示すため、光学測定時のｐＨはこの範囲か
ら選べばより高い感度を期待できるので有利である。反
応に用いる酵素の反応速度がこの範囲で劣る場合には、
ｐＨ６〜９の範囲を採用しても良い。このような場合に
は、測定波長も５００〜６００の間で適当な波長を選択
するようにすることもできる。なお５００〜６００nmと
いう吸収波長は光学的な妨害成分であるビリルビン等の
影響を受けにくい好ましい波長域である。本発明におい
ては、基本的にはホルマザンによる汚染の防止を目的と
して界面活性剤を添加する必要は無い。しかし、各種反
応系に影響を与えない範囲で界面活性剤を加えてやれ
ば、より完全な汚染防止効果を期待できる。このような
目的で界面活性剤を用いるときには、ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、Ｔｗｅｅｎ２０、およびＢｒｉｄｇｅ３５のよ
うな界面活性剤を、０．００１〜０．２%（最終濃度）
の範囲で加えても良い。

【００２３】また本発明は、前記汚染防止技術を応用し
た試薬組成物をも提供するものである。すなわち本発明
は、テトラゾリウム化合物を含む還元性物質測定用試薬
組成物において、下記構造式（１）のテトラゾリウム化
合物を用いることを特徴とするホルマザン化合物による
機器の汚染を防止した試薬組成物を提供する。

【化１２】（式中、Ｒ１は水素原子またはメトキシ基、Ｒ２は水素
原子またはカルボキシル基またはスルホン酸基である）本発明による試薬組成物において、式１で示されるテト
ラゾリウム化合物は塩の形で用いても良い。代表的な塩
は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩であ
る。本発明によって提供される試薬組成物の具体的な構
成を以下に例示する。ここに例示する試薬組成物におい
て、電子キャリアーはＰＭＳ、１−メトキシ−５−メチ
ルフェナジウム−メチルサルフェイト、メルドラブル
ー、およびジアホラーゼ等の中から任意の物質を選ぶこ
とができる。

【００２４】●下記成分で構成されるコレステロール測
定用試薬組成物コレステロールデヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００２５】●下記成分で構成されるＣＰＫ測定用試薬
組成物クレアチンリン酸アデノシン３リン酸ヘキソキナーゼ、またはグルコキナーゼグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００２６】●下記成分で構成されるＬＤＨ測定用試薬
組成物乳酸ＮＡＤ電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００２７】●下記成分で構成される胆汁酸測定用試薬
組成物ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００２８】●下記成分で構成されるグルコース測定用
試薬組成物アデノシン３リン酸ヘキソキナーゼ、またはグルコキナーゼグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００２９】●下記成分で構成されるトリグリセライド
測定用試薬組成物リポプロテインリパーゼグリセロールキナーゼグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００３０】●下記成分で構成されるＧＯＴ測定用試薬
組成物Ｌ−アスパラギン酸 α−ケトグルタル酸グルタミン酸デヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００３１】●下記成分で構成されるＧＰＴ測定用試薬
組成物Ｌ−アラニン α−ケトグルタル酸グルタミン酸デヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００３２】●下記成分で構成される尿酸測定用試薬組
成物ウリカーゼカタラーゼアルコールアルデヒドデヒドロゲナーゼＮＡＤ（Ｐ）電子キャリアーテトラゾリウム化合物

【００３３】本発明の試薬組成物において、各試薬成分
は最終的な反応液中で必要な濃度を与えるように設計さ
れる。必要な濃度は、公知の測定方法にならって決定す
れば良い。更にこれらの必須成分に合わせて、適当なｐ
Ｈを与える緩衝剤成分、酵素反応に必要な金属イオン、
あるいは酵素活性を促進する界面活性剤のような補助的
な成分があればあらかじめ試薬組成物に添加しておくと
良い。これらの試薬組成物は、乾燥状態でも液体状態で
も供給することができる。いずれの場合であっても必要
に応じて公知の安定剤を組み合わせることができる。公
知の安定剤には、動物血清、アルブミン、グルコース、
フルクトース、ラクトース、シュクロース、グリセロー
ス、デキストリン、アルコール類等の物質が知られてい
る。安定剤の他、保存剤の併用も試薬寿命の延長に有効
である。保存剤にはアジ化ナトリウムのようなアジ化物
が一般に用いられる。

【作用】本発明における式１で示されるテトラゾリウム
化合物は、水溶性に優れたホルマザンを生成し、結果と
して機器の汚染防止に貢献する。しかも本発明は、界面
活性剤の不存在下においても十分な効果を得ることがで
きるので、酵素反応を阻害する恐れが無い。

【００３４】

【効果】本発明は、ホルマザンによる機器の汚染を効果
的に抑制し、光学測定の信頼性を高める。特に多量の検
体について、同じ測定項目を繰り返して分析する機会の
多い規模の大きい検査センター等では、わずかな汚染で
あっても蓄積によって光学測定に重大な影響を与える可
能性が有るが、本発明によれば機器の汚染はほとんど無
視しうる程度に抑制することができる。逆に同じ反応環
境をくり返し使うケースにおいては、反応環境に残った
試薬成分による干渉が問題となる場合が有る。具体的に
は、１回目の分析系において用いられた界面活性剤が次
の測定系にたいして影響を与える場合などが考えられ
る。このようなケースを想定したときに、界面活性剤の
使用量を抑制することが可能な本発明の技術は界面活性
剤による干渉の危険性を小さくする。実施例で確認した
とおり、本発明によれば界面活性剤不存在下であっても
反応環境の汚染は実質的に生じないので界面活性剤の使
用は必ずしも要求されないのである。特に試薬間の干渉
が問題となりやすいフローシステムにおいては大きな効
果を期待できる。本発明による汚染防止方法は、分析装
置の光学系で一般に用いられる、アクリル系、ポリスチ
レン系等のプラスチック、あるいは各種のガラスや石英
等に対して顕著な汚染防止効果を示し、分析結果の信頼
性を高める上で非常に有用である。続いて実施例に基づ
き、本発明を更に具体的に説明する。

【００３５】

【実施例】

１．テトラゾリウム化合物の合成先に述べた本発明に用いるテトラゾリウム化合物（式
１）として、下記の構造式（２）で示される、Ｒ１＝メ
トキシ基、Ｒ２＝カルボキシル基である化合物を合成し
た。

【化１３】ｐ−ホルミル安息香酸２５gを２００mlの塩化チオニル
中で２時間加熱還流し、反応溶液を濃縮後、石油エーテ
ルで結晶化して９０%の収率で酸クロライドを得た。タ
ウリン１０gを２００mlの水に溶解し、更にクロロホル
ム２００mlを加えて０℃に冷却し、強くかくはんしなが
ら２N水酸化ナトリウム水溶液を反応液のｐＨが７〜８
を保つように滴下した。反応終了後、水相を分取し２N
塩酸を加えｐＨ２とした。濃縮乾固後、イソプロパノー
ルを加え結晶化しアルデヒドを１００%の収率で得た。
このアルデヒド１０gを２−ヒドラジノベンゾチアゾー
ルとメタノールに混合し、４時間加熱還流した。沈でん
物をろ別しヒドラゾンを６６%の収率で得た。得られた
ヒドラゾン５gを水５０mlとＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド５０mlに溶解し、０℃に冷却した。別に４−アミノ
−３−メトキシ安息香酸を常法によりジアゾ化しヒドラ
ゾン溶液に加えた。この反応混合溶液を−５〜０℃に保
持しながら、水酸化ナトリウム水溶液（２．１gＮａＯ
Ｈ／水２０ml）を滴下し、滴下終了後一夜室温でかくは
んした。反応後、反応混合液に塩酸を加えて生じたちん
でん物をろ別した。得られた粗精製物は水酸化ナトリウ
ム溶液に溶解後、塩酸を加えて再度ちんでんさせ、５３
%の収率でホルマザンを得た。得られたホルマザン３．
９gをメタノール１５０mlに懸濁させ、濃塩酸１３mlお
よび亜硝酸ブチル６．７gを加え、室温で一夜かくはん
した。析出したちんでんをろ別し、粗精製物はメタノー
ル−水から再結晶し、３０%の収率で式１の構造を持つ
テトラゾリウム化合物をナトリウム塩（2-(2-Benzothia
zolyl)-3-(4-Carboxy-2-Methoxyphenyl)-5-(4-N-sulfoe
thylcarboamidephenyl)-1H-Tetrazoliume Na塩）として
得た。

【００３６】２．機器類の汚染程度の比較式１に示したテトラゾリウム化合物として１で合成した
式（２）の化合物を用い、本発明による汚染防止方法に
したがって実際にホルマザンを生成させ、機器類の汚染
が防止できることを確認した。比較には、従来のテトラ
ゾリウム化合物であるＮＴＢを用いた。ホルマザンの生
成反応としては、先に述べたＬＤＨによる反応を利用し
た。あらかじめＬＤＨ活性値のわかっている血清（モニ
トロール２Ｘ、米国デイド製、商品名）をサンプルと
し、生理食塩水で希釈した９段階の希釈系列を作成して
発色反応に用いた。試薬組成は次のとおりである。

【００３７】第１試薬トリス１００mM 乳酸ナトリウム２５０mM １−メトキシＰＭＳ０.１mM 式２の化合物、またはＮＴＢ０.５mM ｐＨ８.５トリス：Tris(hydroxymethyl)aminomethane １-メトキシＰＭＳ：1-Methoxy-5-methylphenazinium m
ethylsulfate

【００３８】第２試薬（水酸化ナトリウムでｐＨを調
整）ＮＡＤ１５mM ｐＨ６．５

【００３９】また測定には自動分析装置日立７１５０
（日立製作所製）を用い、測定パラメーターは次のとお
りとした。この条件で測定を行えば、同じキュベット
で、同じ試料について、同じ発色反応を繰り返して行う
ことになり、反応環境の汚染を比較することができる。
なお日立７１５０の光学測定を行うキュベットは、アク
リル系樹脂を素材としている。サンプル１０μl 第１試薬２００μl（Ｒ−１添加後の反応時間＝５
分）第２試薬５０μl（Ｒ−２添加後の反応時間＝５
分）主波長５７０nm 副波長７００nm ・チャンネルは、１＝本発明２＝蒸留水（微量ＮａＣｌ添加：液面センサー対応）３＝ＮＴＢ４〜１２＝蒸留水（微量ＮａＣｌ添加）日立７１５０の反応ディスクは１２０のキュベット（反
応管）からなり、サンプル分注毎に半周し対極のキュベ
ットにサンプルと試薬が分注される。ダミー項目を含む
１２項目を連続的に１０検体測定することにより全ての
キュベットを１回使用する。この条件で引き続き１０検
体を測定すれば１回目と同じ試薬が同じキュベットを２
回使用することになる。本発明とＮＴＢの前後は水だけ
のダミー項目のため、試薬プローブ及びかくはん棒から
のキャリーオーバーは回避され、本発明またはＮＴＢに
よって蓄積される汚染のみを測定することができる。

【００４０】１０時間にわたって同じキュベットで同じ
反応を繰り返して行い、最終的にセルブランクを測定し
た結果を表１（本発明）、および表２（ＮＴＢ）に示し
た。表中、各セル番号の最も若いものがＬＤＨ測定値が
０、以下１／９〜９／９までの９段階希釈試料に対応し
ている。本発明による汚染防止方法を採用した場合、Ｌ
ＤＨ活性値にかかわらずキュベットの汚染はわずかしか
生じない。この程度のセルブランクの上昇は、実際の測
定結果に実質的に何の影響も与えないレベルである。一
方ＮＴＢによる発色反応を行ったキュベットでは、すべ
てのキュベットで無視できない着色を観察した（表
２）。特にＬＤＨ活性値が大きいときにはキュベットが
汚染されやすく、肉眼でも汚染が認識できるほどのキュ
ベットも有った。また当然のことながら測定波長となる
吸収ピーク付近での汚染が目立つ。このことは、キュベ
ットの汚染によって光学測定が大きく影響を受けること
を示している。

【００４１】

【表１】

【００４２】

【表２】

【００４３】３．コレステロールの測定本発明に基づく汚染を防止した試薬組成物が、実際の測
定項目に応用できることを確認した。測定項目としては
トータルコレステロールを選んだ。以下に示す組成を持
つ試薬組成物を準備した。第１試薬コレステロールエステラーゼ（天野製薬製）３．０U/
ml ＮＡＤ（ベーリンガーマンハイム製）３．０mM １−メトキシＰＭＳ３．０mM 式１のテトラゾリウム塩０．１mM ０．１%のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１mMトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）第２試薬コレステロールデヒドロゲナーゼ（国際試薬製）１．０
U/ml 緩衝液は第１試薬と同じ日立７１５０を用い、次のパラメーターによりモニトロ
ール２Ｘ（生理食塩水による５段階希釈）をサンプルと
してコレステロールの測定を行った。比較のためトリン
ダー反応による発色系を利用した市販のコレステロール
測定用試薬「サンテストＴＣ−Ｂ」（三光純薬製、登録
商標）による測定（測定波長は５７０nm）も行った。パラメーターサンプル５μl 第１試薬２５０μl（Ｒ−１添加後の反応時間＝５
分）第２試薬５００μl（Ｒ−２添加後の反応時間＝５
分）主波長５５０nm 副波長４４０nm

【００４４】結果は図１に示すとおりである。本発明に
よって汚染を防止したコレステロール測定用試薬組成物
は、良好な直線性を備え、測定感度も一般に利用されて
いるトリンダー反応による試薬に劣らない。このように
本発明による試薬組成物は、汚染を効果的に抑制するの
みならず、測定性能の面でも優れていることが確認され
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明による試薬組成物をコレステロ
ールの測定に応用した場合の測定結果を示すグラフであ
る。図中、縦軸は吸光度を横軸は希釈倍率を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】還元性物質をテトラゾリウム化合物と接触
させ、生成するホルマザンを指標として還元性物質を測
定する方法において、下記構造式（１）のテトラゾリウ
ム化合物を用いることを特徴とするホルマザン化合物に
よる汚染防止方法【化１】（式中、Ｒ１は水素原子またはメトキシ基、Ｒ２は水素
原子またはカルボキシル基またはスルホン酸基である）
【請求項２】光学的測定系の汚染を防止するものである
請求項１の汚染防止方法
【請求項３】光学的測定系がプラスチック製またはガラ
ス製の光学キュベット、またはマルチウエルタイプの反
応容器である請求項２の汚染防止方法
【請求項４】プラスチックがアクリル系樹脂、またはポ
リスチレン系樹脂である請求項３の汚染防止方法
【請求項５】還元性物質が、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸、スーパーオキシドアニオン、およ
びフルクトサミンから選択される請求項１の汚染防止方
法
【請求項６】還元性物質が酵素反応によって生成したも
のである請求項１の汚染防止方法
【請求項７】テトラゾリウム化合物を含む還元性物質測
定用試薬組成物において、下記構造式（１）のテトラゾ
リウム化合物、またはその塩を用いることを特徴とする
ホルマザン化合物による機器の汚染を防止した試薬組成
物【化２】（式中、Ｒ１は水素原子またはメトキシ基、Ｒ２は水素
原子またはカルボキシル基またはスルホン酸基である）
【請求項８】下記成分で構成される請求項７の試薬組成
物コレステロールデヒドロゲナーゼ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸電子キャリアーテトラゾリウム化合物
【請求項９】下記成分で構成される請求項７の試薬組成
物クレアチンリン酸アデノシン３リン酸グルコースヘキソキナーゼ、またはグルコキナーゼグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸電子キャリアーテトラゾリウム化合物
【請求項１０】下記成分で構成される請求項７の試薬組
成物乳酸酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド電子キャリアーテトラゾリウム化合物
【請求項１１】下記成分で構成される請求項７の試薬組
成物ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、電子キャリアーテトラゾリウム化合物
【請求項１２】下記成分で構成される請求項７の試薬組
成物アデノシン３リン酸ヘキソキナーゼ、またはグルコキナーゼグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸電子キャリアーテトラゾリウム化合物
【請求項１３】下記成分で構成される請求項７の試薬組
成物リポプロテインリパーゼグリセロールキナーゼグリセリン−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸電子キャリアーテトラゾリウム化合物
【請求項１４】下記成分で構成される請求項７の試薬組
成物Ｌ−アスパラギン酸 α−ケトグルタル酸グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸電子キャリアーテトラゾリウム化合物
【請求項１５】下記成分で構成される請求項７の試薬組
成物Ｌ−アラニン α−ケトグルタル酸グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸電子キャリアーテトラゾリウム化合物
【請求項１６】下記成分で構成される請求項７の試薬組
成物ウリカーゼカタラーゼアルコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、または
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸電子キャリアーテトラゾリウム化合物