KR20190133005A - 항 IgM/B 세포 표면 항원 이중 특이성 항체 - Google Patents

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타카히로 오하시
히토시 미야시타
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젠야쿠코교가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 혈중의 분비형 IgM 존재하에서도 B 세포 표면의 막 결합형 IgM과의 결합 활성이 높고, B 세포에 대해 증식 저해 효과를 발휘하는 항체를 제공한다. IgM 및 B 세포 표면 항원에 결합하는 이중 특이성 항체를 제공한다.

Description

항 IgM/B 세포 표면 항원 이중 특이성 항체
본 발명은, IgM 및 B 세포 표면 항원에 결합하는 항 IgM/B 세포 표면 항원 이중 특이성 항체 및 그 이용에 관한 것이다.
면역 글로불린 M (IgM)은, 항체 및 이것과 구조 또는 기능상 관련을 갖는 단백질인 면역 글로불린 클래스의 1종으로, 막 결합형과 분비형이 존재한다. 막 결합형 IgM은 B 세포수용체로서 적응 면역에 관여하는 주요 림프구인 B 세포에 특이적으로 발현하고, B 세포의 생사에 관여하고 있다. 항원이 B 세포수용체에 결합하면 B 세포는 증식하고, 일부는 형질 세포로 분화하며, 형질 세포는 대량의 분비형 IgM을 분비한다. 분비형 IgM은 5 또는 6량체를 형성하고, 혈중에 대량으로 존재 (0.4 내지 2.8 mg/ml)하며, 면역 초기 응답에 기여하고 있다.
IgM에 대한 항 IgM 단일 클론 항체는, in vitro에서는 B 세포 종양 세포주의 세포 증식을 저해하고, 아포토시스를 유도하는 것으로 알려져 있다 (비특허문헌 1, 2 및 3).
항체를 이용한 암 치료는 21세기에 들어서 유전자 공학에 의한 인간화 및 개변 항체 등의 기술 발전과 함께, 유효한 치료법으로 받아 들여지고 있다. 최근, 많은 항체 의약이 출시되어 새로운 항체 의약의 개발도 진행되고 있다. 이 중, 암을 직접 표적으로 한 항체 의약은 다양한 항원을 표적 항원으로 하고, 항체의존세포매개세포독성 (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity : ADCC), 보체의존세포독성 (complement dependent cytotoxicity : CDC), 증식신호전달저해, 항체 약물 복합체의 약물에 의한 세포 독성 등의 작용 기전을 통해 항종양 효과를 나타내는 분자 표적 치료제로 유용하다.
한편, 막 결합형 IgM을 발현하는 B 세포성 종양은 예후 불량이라는 보고가 있어 (비특허문헌 4 및 5), 막 결합형 IgM이 치료 표적이 될 수 있다고 추측된다. 그러나 지금까지 항 IgM 단일 클론 항체는 B 세포성 종양의 치료제로 실용화되고 있지 않다.
Carey, G. B., et al., Cell Res. 17 (11) : 942-955, 2007. Besnault, L., et al., J. Immunol. 167 (2) : 733-740, 2001. Mongini, P. A., et al., Blood, 92 (10) : 3756-3771, 1998. Miyazaki, K., et al., Br. J. Haematol. 142 (4) : 562-570, 2008. Cutrona, G., et al., ABSSUB-4465,19th Congress of the European Hematology Association, 2014.
기존의 항 IgM 단일 클론 항체는 생체에 투여된 경우, 혈중에 대량으로 존재하는 분비형 IgM과 결합하여 중화되어 버려, 막 결합형 IgM을 발현하는 B 세포와의 결합성이 충분하다고는 할 수 없었다. 따라서 분비형 IgM 존재하에서 막 결합형 IgM을 발현하는 B 세포에 결합하여 증식 저해 효과를 발휘하려면 항 IgM 단일 클론 항체를 대량으로 투여해야 했다.
따라서, 본 발명의 과제는 혈중의 분비형 IgM 존재하에서도 B 세포 표면의 막 결합형 IgM에 결합하고, 상기 B 세포와의 결합 활성이 높으며, 또한 상기 B 세포에 대해 증식 저해 효과를 발휘하는 항체를 제공하는 것이다.
이에 본 발명자들은, B 세포 표면의 막 결합형 IgM과의 결합 활성이 높은 항체를 제작하기 위해 여러 검토를 한 결과, IgM 및 B 세포 표면 항원에 대한 이중 특이성 항체가 대량의 분비형 IgM 존재하에서도, B 세포 표면의 막 결합형 IgM에 결합하고, 상기 B 세포와의 결합 활성이 높으며, 또한 상기 B 세포에 대해 우수한 세포 증식 저해 효과를 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 다음의 [1] 내지 [15]를 제공하는 것이다.
[1] IgM 및 B 세포 표면 항원에 결합하는 이중 특이성 항체.
[2] [1]에 있어서, 상기 IgM에 결합하는 제1 항원 결합 부위와, 상기 B 세포 표면 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 것인, 이중 특이성 항체.
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 B 세포 표면 항원이 HLA-DR, CD20, CD32b, CD37, CD38, CD52, CD81, BAFF 수용체, BCMA 및 TACI로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 이중 특이성 항체.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 이중 특이성 항체.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 항체 가변 영역이 하기 (a) 내지 (f)의 중쇄 CDR1 내지 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 CDR3 및 하기 (g) 내지 (l)의 중쇄 CDR1 내지 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 것인, 이중 특이성 항체;
(a) 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1,
(b) 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2,
(c) 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3,
(d) 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1,
(e) 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2,
(f) 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3,
(g) 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1,
(h) 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2,
(i) 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3,
(j) 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1,
(k) 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및
(l) 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, B 세포의 증식을 저해하는 것인, 이중 특이성 항체.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 이중 특이성 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
[8] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 이중 특이성 항체를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 B 세포 관련 질환 치료제.
[9] [8]에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환이 B 세포성 종양인, B 세포 관련 질환 치료제.
[10] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 이중 특이성 항체의, B 세포 관련 질환 치료제 제조를 위한 사용.
[11] [10]에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환이 B 세포성 종양인, 사용.
[12] B 세포 관련 질환의 치료에 사용하기 위한, [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 이중 특이성 항체.
[13] [12]에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환이 B 세포성 종양인, 이중 특이성 항체.
[14] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 이중 특이성 항체의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 B 세포 관련 질환의 치료 방법.
[15] [14]에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환이 B 세포성 종양인, B 세포 관련 질환의 치료 방법.
본 발명의 항 IgM/B 세포 표면 항원 이중 특이성 항체는 대량의 분비형 IgM 존재하에서도, B 세포 표면의 막 결합형 IgM에 결합하고, 상기 B 세포와의 결합 활성이 높다는 특징이 있다. 또한 부작용이 적다. 따라서, 본 발명의 이중 특이성 항체를 B 세포 관련 질환, 특히 B 세포성 종양 환자에 투여한 경우, 혈중의 분비형 IgM에서 중화되지 않고, 표적의 B 세포 표면의 막 결합형 IgM에 결합하며, 상기 B 세포에 대해 세포 증식 저해 활성을 발휘하는 것이 가능해진다. 즉, B 세포성 종양 증식 저해 활성을 발휘할 수 있게 된다. 따라서, 항체의 대량 투여에 따른 환자의 부담, 의료비의 증대 등의 문제도 해결할 수 있다.
도 1은 HH 세포막 표면상의 IgM 분자수 및 HLA-DR 분자수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1) 및 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체의 IgM 및 HLA-DR에 대한 결합성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 평균 형광 강도 (MFI)를, 가로축은 항체 농도를 나타낸다.
도 3은 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 4는 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM 항체 (1)과 항 HLA-DR 항체 (1)의 병용, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 5는 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 6은 인간 혈청 부재하 (왼쪽 그래프) 또는 존재하 (오른쪽 그래프)에서의 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 세포 생존율을 나타낸다.
도 7은 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (1), 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프 있다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 8은 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (2), 항 IgM (1)/CD20 (2) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프 있다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 9는 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (1), 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 10은 인간 혈청 부재하 (왼쪽 그래프) 또는 존재하 (오른쪽 그래프)에서의 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (1), 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 세포 생존율을 나타낸다.
도 11은 항 IgM 항체 (1), 항 CD52 항체, 항 IgM (1)/CD52 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 12는 분비형 IgM 부재하 (각 왼쪽 차트) 또는 존재하 (각 오른쪽 차트)에서의 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조가 JeKo-1 세포의 세포주기에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 13은 인간 혈청 부재하 (각 왼쪽 차트) 또는 존재하 (각 오른쪽 차트)에서의 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조가 JeKo-1 세포의 세포주기에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 14는 항 IgM 항체, 항 HLA-DR 항체 (1) 및 항 IgM/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 랫트 B 세포수에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 15는 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 원숭이 혈중 B 세포수에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 16은 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 원숭이 혈중 T 세포수에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 17은 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 원숭이 혈중 적혈구 수에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 18은 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 원숭이 혈중 혈소판 수에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 19는 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 원숭이 체온에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 20은 항 IgM 항체 (2), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (2)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 21은 항 IgM 항체 (3), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (3)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 22는 항 IgM 항체 (4), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (4)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 23은 항 IgM 항체 (5), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (5)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 24는 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (2), 항 IgM (1)/HLA-DR (2) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 25는 항 IgM 항체 (1), 항 CD38 항체, 항 IgM (1)/CD38 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 26은 항 IgM 항체 (1), 항 CD81 항체, 항 IgM (1)/CD81 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 나타내는 그래프이다. 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
도 27은 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 Ramos 세포에 대한 세포 아포토시스 유도 작용을 나타내는 그래프이다. 세로축은 아포토시스 유도율을 나타낸다.
도 28은 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (2), 항 IgM (1)/CD20 (2) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 Ramos 세포에 대한 아포토시스 유도 작용을 나타내는 그래프이다. 세로축은 아포토시스 유도율을 나타낸다.
도 29는 항 IgM 항체 (1), 항 CD38 항체, 항 IgM (1)/CD38 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 Ramos 세포에 대한 아포토시스 유도 작용을 나타내는 그래프이다. 세로축은 아포토시스 유도율을 나타낸다.
본 명세서에서, "이중 특이성 항체"란, 다른 항원에 결합 가능한 적어도 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단일 클론 항체를 가리킨다. 구체적으로, "이중 특이성 항체"란, 예를 들어, 제1 항체의 중쇄 가변 영역과 제1 항체의 경쇄 가변 영역으로 형성되는 제1 항원 결합 부위와, 제2 항체의 중쇄 가변 영역과 제2 항체의 경쇄 가변 영역으로 형성되는 제2 항원 결합 부위를 적어도 1개씩 포함하고, 다른 두 종의 항원 인식 능력을 갖는 단백질을 의미한다.
이중 특이성 항체의 형태로는 특별히 한정되지 않고, 당해 기술 분야에서 공지된 형태 중 하나일 수도 있고, 두 종의 항원에 대한 특이성을 보유하고 있는 한, 그 이외의 형태일 수도 있다. 이중 특이성 항체의 형태는, IgG 유사형과 저분자형으로 대별된다. IgG 유사형은 Fc 영역을 보유한 형태이다. IgG 유사형 항체의 형태로는 이에 한정되는 것은 아니지만, CrossMab, DAF (two-in-one), DAF (four-in-one), DutaMab, DT-IgG, knobs-into-holes, knobs-into-holes common LC, SEEDbody, Triomab, κλ-body, DVD-Ig, IgG-scFv, DuoBody 등을 들 수 있다. IgG 유사형 항체는 Fc 영역을 보유하고 있기 때문에, ADCC와 CDC 같은 이펙터 기능의 발휘, 정제 용이화, 안정성개선, 혈중 반감기의 연장이 기대된다. 한편, 저분자형은 일반적으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 Fv 영역을 기본 구성 요소로 한 형태이다. 저분자형 항체의 형태로는 이에 한정되는 것은 아니지만, Diabody (Db), BiTE, DART, TandAb, scDb, triple body, miniantibody, minibody, scFv, tandem scFv, F(ab')2, 류신 지퍼 등을 들 수 있다. 저분자형은 그 크기에서 조직 투과성의 향상 및 생산성의 높음이 기대된다. 그 외, 항원과의 결합능을 보유 하면서 아미노산 서열을 결실, 치환 또는 부가시킨 것, 당쇄의 일부 또는 전부를 결실 또는 부가시킨 것, 링커 등이 부가된 것, 다른 단백질과 융합시킨 것, 항체와 저분자 의약을 링커를 통해 결합한 항체 약물 복합체 (ADC) 등의 개변 항체도 포함된다. 본 발명의 항 IgM/B 세포 표면 항원 이중 특이성 항체 (이하, 단순히 본 발명의 이중 특이성 항체라고도 칭함)의 형태는, 사용 목적, 제조의 용이성 등을 고려하여 적절히 선택하면 좋으나, B 세포에 대한 세포 독성 활성의 점에서 Fc 영역을 보유하고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 IgM에 결합하는 제1 항원 결합 부위와, B 세포 표면 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기에서, IgM은 면역 글로불린 M을 가리킨다. IgM이 유래하는 동물 종은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 인간이나, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 염소 등과 같은 비인간 동물을 들 수 있으며, 이 중 인간이 바람직하다. IgM에 대한 제1의 특이성은, 바람직하게는 IgM에 대한 항체에 유래하는 부위에 의해 발현되고, 보다 바람직하게는, IgM에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 유래하는 부위에 의해 발현되고, 더욱 바람직하게는, IgM에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 의해 형성되는 항원 결합 부위에 의해 발현되는 것이다.
한편, B 세포 표면 항원은 막 결합형 IgM 이외의 B 세포 표면에 발현하는 항원이면 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 B 세포 관련 질환으로 이환된 생체의 B 세포에 의해 발현되는 항원이며, 더욱 바람직하게는 B 세포성 종양으로 이환된 생체의 B 세포에 의해 발현되는 항원이다. B 세포 표면 항원이 유래하는 동물종은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 인간이나, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 염소 등과 같은 비인간 동물을 들 수 있으며, 이 중 인간이 바람직하다. B 세포 표면 항원으로는, 구체적으로 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, CD5, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD28, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD43, CD45RA, CD45RO, CD52, CD53, CD54, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86, CD138, CD272, BAFF 수용체, BCMA, TACI, PD-1 등을 들 수 있고, HLA-DR, CD20, CD32b, CD37, CD38, CD52, CD81, BAFF 수용체, BCMA 및 TACI가 바람직하고, HLA-DR, CD20, CD32b, CD37, CD38, CD52 및 CD81이 보다 바람직하고, HLA-DR, CD20, CD38, CD52 및 CD81이 더욱 바람직하다. B 세포 표면 항원에 대한 제2의 특이성은, 바람직하게는, B 세포 표면 항원에 대한 항체에 유래하는 부위에 의해 발현되고, 보다 바람직하게는, B 세포 표면 항원에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 유래하는 부위에 의해 발현되고, 더욱 바람직하게는, B 세포 표면 항원에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 의해 형성되는 항원 결합 부위에 의해 발현되는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 이중 특이성 항체는 제1의 특이성을 갖는 항 IgM 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드, 상기 항 IgM 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드, 제2의 특이성을 갖는 항 B 세포 표면 항원 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 및 상기 항 B 세포 표면 항원 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 보다 구체적으로, 제1의 특이성을 갖는 항 IgM 항체의 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 폴리펩티드, 상기 항 IgM 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함하는 폴리펩티드, 제2의 특이성을 갖는 항 B 세포 표면 항원 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR을 포함하는 폴리펩티드 및 상기 항 B 세포 표면 항원 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
CDR은 항체 간의 서열이 크게 다른 가변 영역 내의 서열로, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에 각각 3개의 CDR이 있고, 이들이 조합되어 항원 결합 부위를 형성하고, 항원 특이성을 결정한다. CDR은 Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. 참조)의 서열 비교에 의해 정의된다. Kabat에 의해 정의된 바와 같이, 중쇄 CDR1은 중쇄 가변 영역의 31 내지 35 잔기 부근에, 중쇄 CDR2는 50 내지 65 잔기 부근에, 중쇄 CDR3은 95 내지 102 잔기 부근에 위치하고, 경쇄 CDR1은 경쇄 가변 영역 24 내지 34 잔기 부근에, 경쇄 CDR2는 50 내지 56 잔기 부근에, 경쇄 CDR3은 89 내지 97 잔기 부근에 위치한다.
본 발명의 이중 특이성 항체에서, IgM에 대한 제1의 특이성에 기여하는 CDR로는, 예를 들어, 하기 (a) 내지 (f)에 나타난 중쇄 CDR1 내지 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 CDR3을 들 수 있다.
(a) 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1,
(b) 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2,
(c) 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3,
(d) 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1,
(e) 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2,
(f) 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3.
또한, 본 발명의 이중 특이성 항체에서, B 세포 표면 항원에 대한 제2의 특이성에 기여하는 CDR로는, 예를 들어, 하기 (g) 내지 (l)에 나타낸 중쇄 CDR1 내지 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함한다.
(g) 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1,
(h) 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2,
(i) 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3,
(j) 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1,
(k) 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및
(l) 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3.
상기 (a) 내지 (l)의 CDR을 갖는 이중 특이성 항체의 바람직한 구체예로는, 후기 실시예에 나타내는 표 1에 기재된 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 CDR을 갖는 항 IgM/HLA-DR 이중 특이성 항체, 항 IgM/CD20 이중 특이성 항체, 항 IgM/CD32b 이중 특이성 항체, 항 IgM/CD37 이중 특이성 항체, 항 IgM/CD38 이중 특이성 항체, 항 IgM/CD52 이중 특이성 항체, 항 IgM/CD81 이중 특이성 항체 및 항 IgM/BCMA 이중 특이성 항체 또는 항 IgM/BAFF 수용체 이중 특이성 항체 및 항 IgM/TACI 이중 특이성 항체가 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
Figure pct00001
상기 (a) 내지 (l)에서, 아미노산 서열의 동일성은 85% 이상이지만, 90% 이상이 바람직하고, 95% 이상이 보다 바람직하고, 98% 이상이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 아미노산의 결실, 치환 또는 부가의 수는 1 내지 10개가 바람직하고, 1 내지 5개가 보다 바람직하고, 1 내지 3개가 더욱 바람직하다. 서열번호 1 내지 53 및 60 내지 101 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 서열 또는 FDY로 이루어진 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 CDR, 및 서열번호 1 내지 53 및 60 내지 101 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 서열 또는 FDY로 이루어진 아미노산 서열에서, 한 개 내지 복수 개의 아미노산 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 CDR은, 부위 특이적 변이 도입법, 무작위 변이 도입법, 체인 셔플링법, CDR 워킹법 등의 공지의 방법을 이용하여 제작할 수 있다.
아미노산 서열의 동일성은 2개의 아미노산 서열을 얼라인먼트할 때에 양쪽 서열에서 동일한 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수의 전장 아미노산 잔기 수에 대한 비율(%)을 말한다. 예를 들어, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX (제네틱스)를 이용한 Lipman-Pearson 법 (Lipman, D.J. and Pearson, W.R., Science 227 (4693) : 1435-1441, 1985)에 의한 상동 분석 (Search homology) 프로그램을 이용하여 매개 변수 Unit Size to compare를 2로서 산출할 수 있다.
"아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 천연 아미노산뿐만 아니라 아미노산 변이체 및 유도체 등과 같은 비천연 아미노산을 포함한다. 당업자라면, 이 넓은 정의를 고려하여 본원에서 아미노산으로, 예를 들어 천연 단백원성 L-아미노산; D-아미노산; 아미노산 변이체 및 유도체 등의 화학 수식된 아미노산; 노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등의 천연 비단백원성 아미노산; 및 아미노산의 특징인 당해 기술 분야에서 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물 등을 들 수 있다. 비천연 아미노산의 예로, α-메틸 아미노산 (α-메틸 알라닌 등), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산 (2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로 메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘 등), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖는 아미노산 ("호모"아미노산) 및 측쇄 중의 카르복실산 작용기 아미노산이 술폰산기로 치환된 아미노산 (시스테인 산 등)을 들 수 있다.
본 발명의 이중 특이성 항체에는 당쇄 부가 등의 수식이 부가된 것도 포함된다. 이러한 항체로는 예를 들어, Fc 영역에 1 이상의 N-결합형 당쇄가 결합하고, 상기 N-결합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸 글루코사민에 푸코스가 결합하지 않은 항체를 들 수 있다. N-결합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸 글루코사민에는 푸코스가 결합할 수 있지만, 이 푸코스가 결합되어 있지 않은 경우, 결합하는 경우에 비해 ADCC가 현저하게 상승하는 것으로 알려져 있다. 또한, 본 발명의 이중 특이성 항체에는 IgG1의 CH2 영역과 CH3 영역을 각각 IgG3의 CH2 영역과 CH3 영역으로 교체한 IgG1/IgG3 키메라 항체인 개변 항체도 포함된다. 상기 항체의 보체 결합력은 IgG1 및 IgG3 보다 강하고, 높은 CDC를 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 세포 독성 활성의 향상으로 항체를 의약으로 사용하는 경우에는 투여량을 줄이고 부작용을 경감시키는 효과와 함께, 치료비의 절감을 기대할 수 있다.
본 발명의 이중 특이성 항체 면역글로불린 클래스는 특별히 한정되는 것이 아니라, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgY 중 어느 하나의 면역 글로불린 클래스일 수도 있고, 정제의 용이성 등을 고려하면 바람직하게는 IgG이다. 또한, 본 발명의 이중 특이성 항체는 어떠한 동종형 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 항체도 포함하는 것이다.
본 발명의 이중 특이성 항체는, 비인간 동물의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체 중 어느 것일 수 있다. 비인간 동물의 항체로는, 예를 들면, 원숭이, 마우스, 랫트, 토끼, 염소 등의 항체를 들 수 있고, 바람직하게는, 마우스 항체이다.
여기에서 "키메라 항체"란, 비인간 동물 유래이며, 항원과 특이적으로 결합하는 항체의 불변 영역을 인간 항체와 같은 불변 영역을 갖도록 유전자 공학적으로 변경한 항체이며, 바람직하게는, 마우스 항체의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역에 연결시킨 키메라 항체이다. 또한, "인간화 항체"란, 비인간 동물 유래이며, 항원과 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄와 경쇄의 CDR 이외의 일차 구조를 인간 항체에 대응하는 1차 구조로 유전자 공학적으로 변경한 항체이다. 또한, "인간 항체"란, 완전히 인간 유래 항체 유전자의 발현 산물인 항체를 의미한다.
본 발명의 이중 특이성 항체에 제1의 특이성을 제공하는 항체 및 제2의 특이성을 제공하는 항체는, 공지의 항체일 수도 있고, 당해 기술 분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제작될 수 있다.
다중 클론 항체는, 마우스 등의 동물 체내에 면역원 및 필요에 따라 보조제를 여러번 피하 및 복강내 등의 적절한 경로에 주사함으로써 동물의 체내에 생성하게하고, 면역 동물로부터 항체를 함유하는 항혈청을 단리하여, ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 방사선 면역 검정 등의 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 원하는 특이성을 갖는 항체의 존재에 대해 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 면역원으로는, IgM, B세포 표면 항원 단백질, 이들의 부분 펩티드, 이들의 안정 발현 세포 등을 사용할 수 있다.
한편, 단일 클론 항체는, Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256 (5517) : 495-497,1975.에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 얻을 수 있다. 구체적으로, 면역 동물로부터 비장 세포를 채취하여 미에로마 세포와 융합시켜, 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제작함으로써 얻을 수 있다. ELISA, 웨스턴 블롯, 또는 방사선 면역 검정 등의 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법을 이용하여 목적하는 단백질을 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선택한다. 원하는 항체를 분비하는 하이브리도마를 클로닝하고, 적절한 조건하에서 배양하여, 분비된 항체를 회수하고, 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들면 이온교환 컬럼, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 또는, 단일 클론 항체를 재조합 DNA 법 (미국특허 제 4,816,567호 명세서)에 의해 제조할 수 있다.
항체 또는 이에 포함된 가변 영역 등 각 영역을 코딩하는 핵산은, 당업자에 공지된 방법으로 취득해 그 염기 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산은 문헌에 기재된 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 프라이머를 사용하여 하이브리드화에 의해 또는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 단리할 수 있다. 상기 단일 클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 이러한 방법의 DNA 공급원으로 사용될 수 있다. 또한, "핵산"은 그 화학 구조 및 취득 경로에 특별히 제한은 없고, 예를 들면, gDNA, cDNA, 화학 합성 DNA 및 mRNA 등을 포함하는 것이다.
단리한 DNA는 발현 벡터 내에 도입된다. 이어서 이것을 적당한 숙주 세포에 형질감염시킴으로써 상기 재조합 숙주 세포 내에서 단일 클론 항체 또는 이에 포함된 영역을 발현시킬 수 있다.
여기에서, "발현 벡터"는, DNA (일반적으로 이중 가닥이다)의 단편을 말하며, 상기 DNA는 그 안에 외래 DNA 단편을 삽입시킬 수 있다. 외래의 DNA는 이종 DNA로 정의되며, 이것은 대상 숙주 세포에서는 천연에서 발견되지 않는 DNA이다. 벡터는 외래 DNA 또는 이종 DNA를 적절한 숙주 세포에 도입하는 데 사용된다. 일단 숙주 세포 안에 들어가면, 벡터는 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제할 수 있으며, 벡터 및 삽입된 외래 DNA의 여러 카피가 생성될 수 있다. 또한, 벡터는 외래 DNA의 폴리펩티드로의 번역을 가능하게 하는데 필수적인 요소를 포함한다. 따라서, 외래 DNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 많은 분자를 신속하게 생합성할 수 있다.
이러한 벡터는 적절한 숙주 내에서 DNA 서열이 코딩하는 단백질을 발현하도록 적절한 제어 서열과 그것이 기능하도록 (즉, 외래 DNA가 코딩하는 단백질을 발현할 수 있도록) 연결시킨 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미하고 있다. 이러한 제어 서열로는, 전사시키기 위한 프로모터, 이러한 전사를 제어하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적절한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 인핸서, 폴리아데닐화 서열 및 전사 및 번역의 종료를 제어하는 서열 등을 들 수 있다. 또한 벡터는 당업자에 공지된 각종의 서열, 예를 들어, 제한 효소 절단 부위, 약제 내성 유전자 등의 마커 유전자 (선택 유전자), 시그널 서열, 리더 서열 등을 필요에 따라 적절하게 포함할 수 있다. 이러한 각종 서열 또는 요소는 외래 DNA의 종류, 사용하는 숙주 세포, 배양 배지 등의 조건에 따라 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순히 숙주 게놈으로의 삽입체 등의 임의의 형태가 가능하다. 일단 적절한 숙주에 형질 전환으로 도입되면, 상기 벡터는 숙주의 게놈과는 독립적으로 복제 및 기능할 수 있는 것일 수 있다. 또는, 상기 벡터는 숙주 게놈에 통합되는 것일 수도 있다.
PCR 반응은 당해 분야에 공지된 방법 또는 그와 실질적으로 동일한 방법 및변경 방법에 의해 실시할 수 있으나, 예를 들면 Saiki, R. K., et al., Science, 230 (4732) : 1350-1354, 1985. ; Saiki, R. K., et al., Science, 239 (4839) : 487-491, 1988. ; Erlich, H. A., ed., PCR Technology, Stockton Press, New York, NY. 1989. ; Glover, D. M. and Hames, B. D., ed., DNA Cloning, 2nd edition, Vol. 1, The Practical Approach Series, IRL Press, Oxford, UK, 1995. ; Innis, M. A., et al., ed., PCR Protocols, Academic Press, New York, NY. 1990. ; McPherson, M. J., et al., ed., PCR, IRL Press, Oxford, UK, 1991. ; FrohmanM. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (23) 8998-9002, 1988. 등에 기재된 방법 또는 이를 개변한 방법에 따라 실시할 수 있다. 또한, PCR법은 그에 적합한 시판 키트를 사용하여 실시할 수 있고, 키트 제조업자 또는 키트 판매업자가 제공하는 지시서에 따라 실시할 수 있다.
하이브리드화에 대해서는 Grossman, L., et al., ed., Methods in Enzymology, Vol. 29, Nucleic Acids and Protein Synthesis, Part E, Academic Press, New York, NY. 1974. 등을 참고할 수 있다. DNA 등 핵산의 서열 결정은 예를 들어 Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (12) : 5463-5467,1977. 등을 참고할 수 있다. 또한, 일반적인 재조합 DNA 기술은 Sambrook, J., et al., ed., Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989. 및 Glover, D. M. and Hames, B. D., ed., DNA Cloning, 2nd edition., Vol. 1 to 4, The Practical Approach Series, IRL Press, Oxford, UK, 1995. 등을 참고할 수 있다.
이렇게 취득된 항체 또는 여기에 포함된 각 영역을 코딩하는 핵산은 목적에 따라 당업자에게 공지된 방법으로 적절히 원하는 펩티드 또는 아미노산을 코딩하도록 개변할 수 있다. 이와 같이 DNA를 유전자적으로 개변 또는 수식하는 기술은 McPherson, M. J., ed., Mutagenesis, IRL Press, Oxford, UK, 1991. 에 총설이 기재되어 있으며, 예를 들어, 위치 지정 돌연변이 도입법 (부위 특이적 변이 도입법), 카세트 돌연변이 유발법 및 PCR 돌연변이 생성법을 들 수 있다.
여기에서 핵산의 "개변"은 얻은 원래의 핵산에서 아미노산 잔기를 코딩하는 적어도 하나의 코돈에 있어서, 염기의 삽입, 결실 또는 치환을 의미한다. 예를 들어, 원래의 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈을 다른 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈에 의해 치환함으로써 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열 자체를 변경하는 방법이 있다. 또는 아미노산 자체는 변경하지 않고 그 숙주 세포에 있던 코돈 (적정 코돈)을 사용하도록 핵산을 개변할 수도 있다. 이처럼 적정 코돈으로 개변함으로써, 숙주 세포 내에서 폴리펩티드의 발현 효율 등의 향상을 도모할 수 있다.
숙주 세포로는 당업자에게 공지된 임의의 세포를 사용할 수 있지만, 예를 들어, 대표적인 숙주 세포로는 대장균 (E.coli) 등의 원핵 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포), 인간 유래 세포 등의 포유 동물 세포, 효모, 곤충 세포 등의 진핵 세포를 들 수 있다.
이러한 숙주 세포에서 발현 등에 의해 얻어진 항체 분자는 일반적으로 분비 된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수되지만, 그것이 분비 신호를 가지지 않고 생산된 경우에는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다.
항체 분자의 정제 작업은 당업자에게 공지된 임의의 방법을 적절히 조합하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 원심 분리, 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 이온교환 컬럼상에서의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 크로마토그래피 (폴리아스파르트산 컬럼 등), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산 암모늄 침전 및 친화성 크로마토그래피에 의해 적합하게 정제된다.
본 발명의 이중 특이성 항체에 제1의 특이성을 제공하는 항체 및 제2의 특이성을 제공하는 항체는, 비인간 동물, 예를 들어 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 불변 영역으로 구성된 키메라 항체일 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 마우스 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 인간 항체의 불변 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고 이것을 발현 벡터에 통합하여 숙주에 도입하여 생산함으로써 얻을 수 있다.
또는, 상기 항체는, 비인간 동물, 예를 들어 마우스 항체의 중쇄, 경쇄 CDR을 인간 항체의 CDR에 이식한 것인, 인간화 항체일 수 있다. 이 인간화 항체는 재구성 (reshaped) 인간 항체라고도 하며, 이의 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져있다. 구체적으로, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임 워크 영역 (FR)을 연결하도록 설계 한 DNA 서열을 말단부에 겹치는 부분을 갖도록 제작한 여러개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR 법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 불변 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 포함시켜 이를 숙주에 도입하여 생산함으로써 얻는다 (유럽 특허 출원 공개 번호 EP239400, 국제 특허 출원 공개 번호 WO96/02576). CDR을 통해 연결되는 인간 항체의 FR은, CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역의 FR의 아미노산을 치환할 수 있다 (Sato, K.et al., Cancer Res., 53 ( 4) 851-856,1993).
또는, 상기 항체는 인간 항체일 수 있다. 인간 항체는 예를 들어, 인간 림프구를 인비트로에서 원하는 항원 또는 원하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 림프구를 인간 미에로마 세포와 융합시켜, 항원에 결합 활성을 갖는 원하는 인간 항체를 스크리닝하여 얻을 수 있다 (일본특허공개 평1-59878). 또한 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질 전환 동물을 원하는 항원으로 면역함으로써 원하는 인간 항체를 취득할 수도 있다 (WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, WO96/34096, WO96/33735). 또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 단일 가닥 항체 (scFv)로서 파지 디스플레이 법으로 파지 표면에 발현시켜 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 분석하면 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 염기 서열이 밝혀지면 해당 서열을 포함하는 적당한 발현 벡터를 제작하여 인간 항체를 얻을 수 있다. 이러한 방법은 이미 주지의 것이며, WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388을 참조할 수 있다. 또한, 체인 셔플링법 (chain shuffling)에 의해 고친화성 (nM의 오더 범위)의 인간 항체를 생성할 수 있다 (Marks, J.D., et al., Bio/Technol., 10 ( 7) : 779-783,1992). 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 방법으로서, 조합 감염 (combinatorial infection) 및 생체 내 재조합 (Waterhouse, P., et al., Nuc.Acids Res., 21 (9) : 2265-2266,1993. ) 등도 알려져있다.
본 발명의 이중 특이성 항체 제1의 특이성을 제공하는 항체 및 제2의 특이성을 제공하는 항체의 조합은 비인간 동물의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체 중의 조합일 수 있다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 당해 기술 분야에서 공지의 다양한 방법에 따라 제조할 수 있다. IgG 유사형 이중 특이성 항체의 제조 방법으로는, 예를 들어, 단일 클론 항체를 생산하는 2종의 하이브리도마를 융합시켜, 생산된 항체로부터 원하는 항체를 정제하는 쿼드로마법 (Milestein, C. and Cuello , A.C., Nature, 305 (5934) : 537-540,1983. 등); 2종의 항체 힌지 영역의 이황화 결합을 환원 후 동종에서의 재회합을 막기 위해 화학적 처리를 하고, 가교제에 의해 결합시킴으로써 목적의 이중 특이성 항체를 얻는 화학 합성에 의한 방법 (Nitta, T., et al., Lancet, 335 (8686) : 368-371,1990); 제1의 특이성을 갖는 항체의 중쇄 유전자, 경쇄 유전자, 제2의 특이성을 갖는 항체의 중쇄 유전자, 및 경쇄 유전자를 세포에 도입하여 공동 발현시켜 목적하는 항체를 얻는 유전자 재조합 기술을 이용한 방법 등을 들 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용한 방법으로는, 1종의 유전자만을 포함하는 벡터를 4종류 모아서, 또는 중쇄 유전자와 경쇄 유전자를 포함하는 벡터를 2종류 모아서 적당한 숙주 세포에 형질감염함으로써, 상기 재조합 숙주 세포내에서 이중 특이성 항체를 발현시킬 수 있다. 또한, 이중 특이성 항체의 생산, 정제 등은 상기한 항체의 생산, 정제 등에 준하여 실시하면 된다.
그러나 쿼드로마법 및 4종의 유전자를 공동 발현시키는 방법에서는, IgM에 대한 제1의 특이성을 갖는 항체 유래의 중쇄 및 경쇄가 회합하고, B 세포 표면 항원에 대한 제2의 특이성을 갖는 항체 유래의 중쇄 및 경쇄가 회합하고, 이들의 중쇄끼리 회합한 목적의 구조를 갖는 항체 이외에, 유래가 다른 중쇄와 경쇄가 회합한 항체, 또는 유래가 같은 중쇄끼리 회합한 항체 등, 총 10종의 항체 분자가 생산되어 버린다. 이 경우 목적 항체를 얻기 위해서는 복잡한 정제 작업이 필요하며, 항체 생산량도 충분하지 않다.
여기서, 이중 특이성 항체의 제조 방법에 있어서, 정제를 용이하게 하는 기술을 적용할 수 있다. 이러한 기술로서, 예를 들어, 마우스 및 랫트 유래의 중쇄 및 경쇄가 공존하면 이종 간 회합은 일어나지 않고, 마우스 유래의 IgG2 중쇄가 프로테인 A에 결합하는 한편, 랫트 유래의 IgG2는 프로테인 A에 거의 결합하지 않는다는 특성을 이용하여, 프로테인 A 컬럼을 사용하여 목적 항체를 정제하는 방법이 알려져있다 (WO98/050431). 또는 IgG1과 IgG3의 프로테인 A 결합능의 차이를 이용하여 효율적으로 목적 항체를 정제하는 방법도 이용할 수 있다.
또한, 유래가 다른 중쇄 간의 이종의 회합을 촉진하는 기술을 적용할 수도 있다. 이러한 기술로서, 예를 들어, 하나의 중쇄의 CH3 영역의 아미노산을 큰 아미노산으로 치환 (knob 변이)하고, 다른 중쇄의 CH3 영역의 대응하는 아미노산을 입체적으로 상보하는 작은 아미노산으로 치환 (hole 변이)함으로써, 중쇄 간의 이종의 회합을 촉진하는 방법이 알려져 있다 (Ridgway, J.B., et al., Protein Eng., 9 (7) : 617-621,1996). 중쇄의 CH3 영역의 계면에 전하적인 변이를 도입하고, 중쇄 간의 이종의 회합을 촉진하는 한편, 동종의 회합은 전하의 반발에 의해 저해하는 방법도 알려져있다 (Gunasekaran, K., et al., J.Biol.Chem. 285 (25) : 19637-19646,2010). 또는 IgG와 IgA의 CH3 영역의 β-가닥 부분을 서로 결합함으로써, 중쇄 간의 이종의 회합을 촉진하는 방법도 알려져있다 (Davis, J.H., et al., Protein Eng. Des.Sel. 23 (4) : 195-202,2010).
또한 유래가 다른 중쇄와 경쇄 간의 회합을 회피하는 기술을 적용할 수도 있다. 이러한 기술로서, 예를 들어 중쇄에 대해 공통으로 회합 가능한 경쇄를 파지 디스플레이 방법으로 선택하는 방법이 알려져있다 (Merchant, A.M., et al., Nat.Biotechnol., 16 (7) : 677-681,1998). 중쇄 CH1 영역과 유래가 동일한 경쇄 CL 영역을 교환하고, 유래가 같은 중쇄와 경쇄의 회합을 촉진하는 방법도 알려져있다 (Schaefer, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 108 (27) : 11187-11192,2011). 1개의 중쇄와 1개의 경쇄로 이루어진 항체의 구성 요소를 2개의 다른 숙주 세포에서 발현시키고, 이를 정제하여 인 비트로에서 어셈블하여 이중 특이성 항체를 제조하는 방법도 알려져있다 (Jackman, J., et al., J.Biol.Chem.285 (7) : 20850-20859,2010). 또한 중쇄와 경쇄 사이에 비천연형 이황화 결합을 도입하여, 중쇄와 경쇄의 특정 조합을 갖는 항체를 효율적으로 제조하는 방법도 알려져있다 (WO2014/069647).
이러한 공지의 기술은 단독으로 사용할 수도, 2개 이상의 기술을 조합하여 사용할 수도 있다. 또한, 이러한 공지의 기술은 2종의 중쇄에 독립적으로 적용할 수 있다.
본 발명의 저분자형 이중 특이성 항체의 제작에 있어서는, 기본 구성 단위로서 중쇄 가변 영역 (VH)과 경쇄 가변 영역 (VL)을 링커로 결합한 단일 가닥 Fv (scFv)가 사용되는 경우가 많다. 상기 scFv의 VL 및 VH의 배치는 N-말단이 VL로 이에 링커, 이어서 VH와 배치되는 것 (VL-Linker-VH 구축형)일 수도, N-말단이 VH로 이에 링커, 이어서 VL과 배치되는 것 (VH-Linker-VL 구축형) 중 하나일 수도 있다. 2종의 scFv를 공동 발현시킴으로써 디아바디로 알려진 이중 특이성 항체를 얻을 수 있다 (Holliger, P., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 (14) : 6444-6448,1993). 디아바디 이외의 형태의 저분자형 이중 특이성 항체에 대해서도, 각각 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 B 세포 표면에 존재하는 막 결합형 IgM에 결합하고, 상기 B 세포와의 결합 활성이 높고, 후기 실시예에 나타내는 바와 같이 대량의 분비형 IgM 존재하에서도 표면에 IgM을 발현하는 B 세포의 세포주기를 정지시킴으로써, 상기 B 세포에 대해 우수한 세포 증식 저해 활성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 이중 특이성 항체는 후기 실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 B 세포에 대해 우수한 아포토시스 유도 작용을 나타낸다. 항 IgM 항체가 B 세포성 종양 세포주에 대해 아포토시스를 유도하는 것은 알려져 있지만, 본 발명의 이중 특이성 항체의 아포토시스 유도 작용은 예상외로 이중 특이성 항체에 제1의 특이성을 제공하는 항 IgM 항체 및 제2의 특이성을 제공하는 항 B 세포 표면 항원 항체의 각각의 아포토시스 유도 작용보다 유의하게 강한 것이다. 또한, 본 발명의 이중 특이성 항체는 부작용이 적다.
본 발명에서 항체와 항원의 결합 활성은 ELISA, 유동 세포 계측법, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 법 등의 공지의 방법으로 측정할 수 있다. ELISA를 사용하는 경우, 예를 들어, 항원을 플레이트에 고정하고 플레이트에 본 발명의 이중 특이성 항체를 첨가하여 반응시킨 후, 서양 고추냉이 퍼옥시데이즈 (HRP) 등의 효소로 표지한 항 IgG 항체 등의 이차 항체를 반응시켜, 발색 기질 (예를 들어, TMB 발색 기질)를 첨가하여 흡광도를 측정하면 된다. 유동 세포 계측법을 사용하는 경우, 예를 들어, 본 발명의 이중 특이성 항체를, 미표지의 평가 대상 (예를 들어, 개체, 기관, 조직, 세포 또는 이들의 단편 등을 포함한 생물 시료를 가리키고 있다)과 결합시킨 후, 형광 색소 결합 이차 항체와 반응시키거나, 또는 본 발명의 이중 특이성 항체에 형광 염료 (예를 들어, Alexa Fluor647)을 직접 표지하여 유세포 측정기에서 형광을 검출하면 된다. 또한 SPR법을 이용하면, 항체와 항원의 결합 활성을 보다 효율적으로 측정할 수 있다. 예를 들어, BIAcore 시스템을 이용하여 센서 칩에 항원을 고정화하고, 본 발명의 이중 특이성 항체를 포함하는 용액을 센서 칩 표면에 일정 시간 공급한 후 완충액을 공급하여 본 발명의 이중 특이성 항체와 항원의 결합과 해리를 모니터하고, 결합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd) 및 해리 상수 (KD = kd/ka)를 산출할 수 있다. KD는 친화성의 지표이며, KD가 작을수록 항원에 대한 항체의 친화성은 강하다. 또는 결합 정수 (KA = 1/KD)에 의해서도 친화성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 예를 들어, 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 또는 10-11M 이하의 KD에서 B 세포에 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, "세포주기 정지"란, 세포주기의 진행이 G1 기에서 정지하는 것을 의미한다. 세포주기는 정법에 따라, 예를 들면 유세포 측정기에 의해 세포의 DNA 양을 측정하여 해석할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "세포 증식 저해 활성"이란, 세포 표면에 IgM을 발현하는 B 세포에 대해 본 발명의 이중 특이성 항체를 투여함으로써, 상기 B 세포의 증식이 저해되는 것을 의미한다. 보다 구체적으로는 세포 증식 저해 활성은 후술의 실시예 4의 식 (1)에 의해 구해진다.
또한, 본 발명에서, "아포토시스 유도 작용"이란, 세포에 대해 세포 스스로가 적극적으로 일으키는 세포의 죽음을 유도하는 작용을 의미한다. 아포토시스가 유도되면 세포는 축소하고, 핵의 응집 및 DNA의 단편화가 일어나, 최종적으로 아포토시스 소체가 되어 대식세포 등에 탐식된다. 아포토시스 유도 작용은 정법에 따라 예를 들면, 세포막의 구조 변화, 핵의 응집 및 DNA의 단편화, 카스파아제 활성 등을 검출하여 평가할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 이중 특이성 항체는 B 세포 표면에 존재하는 막 결합형 IgM에 대한 결합성이 높고, 상기 B 세포에 대해 우수한 세포 증식 저해 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 이중 특이성 항체는 B 세포 관련 질환의 예방 치료제로 유용하다. B 세포 관련 질환으로는, 자가 면역 질환, 염증성 질환, 알레르기 질환, 이식편대 숙주병, B 세포 종양 등을 들 수 있다. 자가 면역 질환으로는, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 건선, 피부염, 전신성 강피증 및 경화증, 염증성 장 질환에 관련된 반응, 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 성인성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 피부염, 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체 신염, 알레르기에 의한 병상, 습진, 천식, T 세포의 침윤과 관련한 병상 및 만성 염증 반응, 죽상 동맥경화증, 백혈구 부착 결핍증, 진성 당뇨병, 레이노 증후군, 자가 면역 갑상선염, 알레르기성 뇌척수염, 쇼그렌 (Sjorgen) 증후군, 청소년 발병 당뇨병, T 림프구 및 사이토카인에 의해 매개된 급성 및 지연 고혈압과 관련한 면역 반응, 결핵, 사르코이도증, 다발성 근염, 육아종증, 혈관염, 악성 빈혈 (애디슨 병), 백혈구 혈관외 유출에 관련한 질환, 중추 신경계 (CNS) 염증 질병, 다 장기 상해 증후군, 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개성 질환, 항 사구체 기저막 질환, 항 인지질 증후군, 알레르기성 신경염, 그레이 비스병, 램버트-이튼 근무력증 증후군, 유(類)천포창, 천포창, 자기 면역 다선성 내분비 장애, 라이터 질환, stiff-man 증후군, 베체트 증후군, 거세포동맥염, 면역 복합체 신염, IgA 신증, IgM 다발성 신경 장애, 만성 피로 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반증 (ITP) 또는 자가 면역 혈소판 감소증 질환 등을 들 수 있다. 염증성 질환으로는, 제2형 당뇨병, 치주 질환 등을 들 수 있다. 알레르기 질환으로는, 부적합 수혈에 의한 용혈성 빈혈, 자가 면역성 용혈성 빈혈, 약제성 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 과립구 감소증, Goodpasuture 증후군, 혈청병, 과민성 폐렴, 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 사구체 신염 등을 들 수 있다. B 세포 종양으로는, 전구 B 세포 종양 및 성숙 B 세포성 종양을 들 수 있다. 전구 B 세포 종양으로는, B 세포 림프 아구성 백혈병/림프종을 들 수 있다. 성숙 B 세포 종양으로는, 만성 림프성 백혈병/소림프구성 림프종, 단일 클론성 B 세포 림프구 증가증, B 세포 전 림프구성 백혈병, 비장 변연대 림프종, 유모 세포 백혈병, 비장 B 세포 림프종/백혈병, 림프 형질 세포성 림프종, 단일 클론성 감마 글로불린 혈증 (MGUS) 및 μ 중쇄병, γ 중쇄병, α 중쇄병, IgM 형 MGUS, IgG/IgA 형 MGUS, 형질 세포종, 골 단발성 형질 세포종, 골 외성 형질 세포종, 단일 클론성 면역 글로불린 침착병, 점막 관련 림프 조직형 절외성 변연대 림프종 (MALT 림프종), 절성 변연대 림프종, 여포성 림프종, 소아 여포성 림프종, IRF4 전좌를 수반하는 대 세포형 B 세포 림프종, 원발성 피부 여포 중심 림프종, 맨틀 세포 림프종, 미만성 대 세포형 B 세포 림프종 (DLBCL), T 세포/조직 구 풍부형 대세포형 B 세포 림프종, 중추 신경 원발 DLBCL, 피부 원발 DLBCL, EBV 양성 DLBCL, EBV 양성 점막 피부 궤양, 만성 염증에 따른 DLBCL, 림프종 유사 육아종증, 종격 (흉선) 발생 대 세포형 B 세포 림프종, 혈관 내 대 세포형 B 세포 림프종, ALK 양성 대 세포형 B 세포 림프종, 형질 아세포성 림프종, 원발성 침출액 림프종, HHV8 양성 DLBCL, 바 키트 림프종, 11q 이상을 동반하는 바 키트 유사 림프종, MYC 및 BCL2 및/또는 BCL6 재구성을 수반하는 고악성도 B 세포 림프종, 고 악성도 B 세포 림프종, DLBCL와 고전적 호지킨 림프종의 중간형을 수반하는 분류 불납형의 B 세포 림프종 등을 들 수 있다. 이러한 B 세포 관련 질환 중, 바람직하게는 성숙 B 세포성 종양이며, 더욱 바람직하게는, 만성 림프성 백혈병/소 림프구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종 및 DLBCL, 형질 세포종이며, 더욱 바람직하게는 만성 림프성 백혈병/소 림프구성 림프종 및 DLBCL이다.
본 발명의 이중 특이성 항체를 함유하는 의약 조성물은 당해 기술 분야에서서 잘 알려진 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 혼합, 용해, 유화, 캡슐 봉입, 동결 건조 등으로 제제화할 수 있다.
경구 투여용으로는 본 발명의 이중 특이성 항체를, 물, 생리 식염수와 같은 희석액에 유효량 용해시킨 액제, 유효량을 고체 또는 과립으로서 포함하는 캡슐 제, 과립제, 산제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량을 현탁시킨 현탁액제, 유효량을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시키고 유화시킨 유제 등의 제형으로 제제화할 수 있다.
비경구 투여용으로는 본 발명의 이중 특이성 항체를 약학적으로 허용 가능한 용매, 부형제, 결합제, 안정화제, 분산제 등과 함께, 주사용 용액, 현탁액, 유제, 크림제, 연고제, 흡입제, 좌제 등의 제형으로 제제화할 수 있다. 주사용 처방에 있어서는, 본 발명의 이중 특이성 항체를 수성용액, 바람직하게는 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염 완충액 등의 생리학적으로 적합성 완충액 중에 용해할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 유성 또는 수성의 비히클 중에 현탁액, 용액 또는 유탁액 등의 형상을 취할 수 있다. 또는, 본 발명의 이중 특이성 항체를 분말 형태로 제조하여 사용 전에 멸균수 등을 이용하여 수용액 또는 현탁액을 준비할 수 있다. 흡입에 의한 투여용으로는, 본 발명의 이중 특이성 항체를 분말화하고, 유당 또는 전분 등의 적절한 기제와 함께 분말 혼합물로 할 수 있다. 좌약 처방은, 본 발명의 이중 특이성 항체를 코코아 버터 등의 관용의 좌제 기제와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 고분자 매트릭스 등에 봉입하여 지속 방출용 제제로 처방할 수 있다.
이러한 제형 중 바람직한 양태는 주사제이며, 비경구 (예를 들어, 정맥 내, 경피, 피내, 복강 내, 근육 내)로 투여하는 것이 바람직하다.
유효 성분인 이중 특이성 항체의 투여량은, 환자의 증상, 투여 경로, 체중, 연령 등에 따라 적절히 설정하면 되지만, 예를 들어 성인 1일 당 0.001 내지 1000 mg/kg 투여하는 것이 바람직하고, 0.01 내지 100 mg/kg을 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 이중 특이성 항체 이외에, B 세포 관련 질환, 바람직하게는 B 세포성 종양의 치료에 유용한 성분, 예를 들어 화학 요법제, 다른 항체 의약 등을 배합할 수 있다.
[실시예]
다음 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 발현 벡터의 구축
(1) 인간화 항 IgM 항체 (1)에 관한 발현 벡터의 구축
인간화 항 IgM 항체 (1) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 알려진 마우스 항 IgM 항체 (GenBank 등록 : L17037.1)를 참고하여 정법에 의해 마우스 프레임 워크 영역 (FR)을 대응하는 인간 FR 를 코딩하는 염기 서열로 치환함으로써 얻었다. 표 2에서, 사용된 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열을 서열번호 1 내지 3에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 4 내지 6에 나타낸다. CDR은 Kabat의 정의에 준거하였다.
Figure pct00002
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 공지된 세포외 분비 신호 서열 (Haisma, H.J., et al., Blood, 92 (1) : 184-190,1998)를 연결하고, 클로닝을 용이하게 하기 위해, 중쇄의 분비 신호 서열의 상류부에 제한 효소 KpnI 인식 서열을, 또한 가변 영역 3' 말단부에는 가변 영역과 불변 영역의 접합부의 아미노산을 변이시키지 않도록 제한 효소 NheI 인식 서열을 연결했다. 마찬가지로, 경쇄 분비 신호 서열의 상류부에 제한 효소 Hind III 인식 서열을, 또한 가변 영역 3' 말단부에는 제한 효소 BsiWI 인식 서열을 연결했다. 디자인한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 PCR 법에 의해 합성하고, PCR 산물을 클로닝 벡터 (p3T 등)에 클로닝 후, 염기 서열을 확인하고 디자인한 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 가진 클론을 선발했다.
인간화 항 IgM 항체 (1) 발현 벡터는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 유전자 단편이 삽입된 각 클로닝 벡터에 의해, 특이적인 제한 효소에 의해 얻어진 유전자 단편을 WO2014/069647의 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자 또는 하이그로마이신 내성 유전자, 인간화 항 인간 IgM 항체 (1) 유전자를 발현한다.
(2) 인간형 항 HLA-DR 항체 (1) 발현 벡터의 구축
인간형 항 HLA-DR 항체 (1)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 일본공개특허 2005-325133의 실시예 12에 기재된 항체 가변 영역 염기 서열을 바탕으로 PCR 프라이머를 설계하여 PCR법에 의해 합성했다. PCR 산물을 클로닝 벡터 (p3T 등)에 클로닝 후, 기재된 유전자 서열과 동일한 서열을 갖는 클론을 선발했다. 표 3에서, 사용된 항체의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 7 내지 9에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 10 내지 12에 나타낸다.
Figure pct00003
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포외 분비 신호 서열을 연결하고, 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후, 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자 또는 퓨로마이신 내성 유전자, 인간형 항 HLA-DR 항체 (1) 유전자를 발현한다.
(3) 키메라 항 CD20 항체 (1) 발현 벡터의 구축
키메라 항 CD20 항체 (1)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 일본공표특허 평8-503468의 실시예 II에 기재된 항체 가변 영역 염기 서열을 바탕으로 PCR 프라이머를 설계하여 PCR법에 의해 합성했다. PCR 산물을 클로닝 벡터 (p3T 등)에 클로닝 후, 기재된 유전자 서열과 동일한 서열을 갖는 클론을 선발했다. 표 4에서, 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 13 내지 15에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 16 내지 18에 나타낸다.
Figure pct00004
일본공표특허 평8-503468의 실시예 IIA에 기재된 분비 신호 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 5' 말단부 및 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 실시예 1 (1)에 따라 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후, 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 키메라 항 CD20 항체 (1) 유전자를 발현한다.
(4) 키메라 항 CD20 항체 (2) 발현 벡터의 구축
정법에 따라 Ramos 세포 (CRL-1596, American Type Culture Collection : ATCC)를 BALB/c 마우스에 면역하고, 마우스 항 CD20 항체 생산 하이브리도마를 수립했다. Ramos 세포는 인간의 버킷 림프종 유래 세포주이며, 세포 표면에 CD20, IgM, CD37을 발현한다. Ramos 세포는 Ramos 세포 증식 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. Ramos 세포 증식 배지는 RPMI1640 (Life Technologies)에 10% 소 태아 혈청 (FBS, Life Technologies), 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 (페니실린 최종 농도 : 100 units/mL 스트렙토마이신 최종 농도 : 0.1 mg/mL, Sigma-Aldrich)을 포함한다. 하이브리도마 전체 RNA로 cDNA를 합성하고, 항체 가변 영역 유전자를 클로닝했다. 표 5에서, 취득한 항체의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 19 내지 21에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 22 내지 24에 나타낸다.
Figure pct00005
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 키메라 항 CD20 항체 유전자 (2)를 발현한다.
(5) 키메라 항 CD32b 항체 발현 벡터의 구축
키메라 항 CD32b 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는, US2006/0073142 A1의 Example 1.0에 기재된 항체 가변 영역의 염기 서열을 참고하여 얻었다. 표 6에서, 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 25 내지 26에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 27 내지 29에 나타낸다. 또한, 중쇄 CDR3의 아미노산 서열은 FDY이다.
Figure pct00006
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 키메라 항 CD32b 항체 유전자를 발현한다.
(6) 키메라 항 CD37 항체 발현 벡터의 구축
정법에 따라 Ramos 세포를 BALB/c 마우스에 면역하고, 마우스 항 CD37 항체 생산 하이브리도마를 수립했다. 하이브리도마 전체 RNA로 cDNA를 합성하고 항체 가변 영역 유전자를 클로닝했다. 표 7에서, 클로닝한 항체의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 30 내지 32에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 33 내지 35에 나타낸다.
Figure pct00007
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 키메라 항 CD37 항체 유전자를 발현한다.
(7) 인간화 항 CD52 항체 발현 벡터의 구축
인간화 항 CD52 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 일본공표특허 평2-503514의 실시예 1에 기재된 항체 가변 영역의 염기 서열을 참고하여 취득했다. 표 8에서, 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 36 내지 38에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 39 내지 41에 나타낸다.
Figure pct00008
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 인간화 항 CD52 항체 유전자를 발현한다.
(8) 인간화 항 BAFF 수용체 항체 발현 벡터의 구축
인간화 항 BAFF 수용체 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 취득한다. 얻은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결한다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결한다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 인간화 항 BAFF 수용체 항체 유전자를 발현한다.
(9) 키메라 항 BCMA 항체 발현 벡터의 구축
키메라 항 BCMA 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 일본특허 제6061469호에 기재된 C12A3.2의 가변 영역의 아미노산 서열을 참고하여 취득했다. 표 9에서, 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 42 내지 44에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 45 내지 47에 나타낸다.
Figure pct00009
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결한다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 키메라 항 BCMA 항체 유전자를 발현한다.
(10) 키메라 항 TACI 항체 발현 벡터의 구축
키메라 항 TACI 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 취득한다. 얻은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결한다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결한다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 키메라 항 TACI 항체 유전자를 발현한다.
(11) 키메라 항 IgM 항체 발현 벡터의 구축
정법에 따라 WKAH/Hkm 랫트 B 세포를 BALB/c 마우스에 면역하고, 마우스 항 IgM 항체 생산 하이브리도마를 수립했다. 하이브리도마 전체 RNA로 cDNA를 합성하여 항체 가변 영역 유전자를 클로닝했다. 표 10에서, 취득한 항체의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 48 내지 50에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 51 내지 53에 나타낸다.
Figure pct00010
마우스 항 IgM 항체에 유래하는 분비 신호 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 5' 말단부 및 3' 말단부에 실시예 1 (1)에 따라 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 목적으로 하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647의 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현용 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 키메라 항 IgM 항체 유전자를 발현한다.
(12) 인간화 항 EGFR 항체 (음성 대조) 발현 벡터의 구축
인간화 항 EGFR 항체 (음성 대조)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 US5558864의 EXAMPLE 4에 기재된 항체 가변 영역의 염기 서열을 참고하여 얻었다. 표 11에서, 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 54 내지 56에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 57 내지 59에 나타낸다.
Figure pct00011
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 인간화 항 EGFR 항체 유전자를 발현한다.
(13) 키메라 항 IgM 항체에 대한 발현 벡터의 구축
정법에 따라 인간 IgM 및 원숭이 IgM을 BALB/c 마우스에 면역하고, 마우스 항 IgM 항체 생산 하이브리도마를 4주 수립했다. 하이브리도마 전체 RNA로 cDNA를 합성하고 항체 가변 영역 유전자를 클로닝했다. 표 12에서, 클로닝한 항 IgM 항체 (2)의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 60 내지 62에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 63 내지 65에 나타낸다. 표 13에서, 클로닝한 항 IgM 항체 (3)의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 66 내지 68에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 69 내지 71에 나타낸다. 표 14에서, 클로닝한 항 IgM 항체 (4)의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 72 내지 74에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 75 내지 77에 나타낸다. 표 15에서, 클로닝한 항 IgM 항체 (5)의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 78 내지 80에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 81 내지 83에 나타낸다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
얻어진 분비 신호 서열, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자와 키메라 항 인간 IgM 항체 (2) 유전자, 키메라 항 인간 IgM 항체 (3) 유전자, 키메라 항 인간 IgM 항체 (4) 유전자 또는 키메라 항 인간 IgM 항체 (5 ) 유전자를 발현한다.
(14) 키메라 항 HLA-DR 항체 (2) 발현 벡터의 구축
키메라 항 HLA-DR 항체 (2)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 US7612180의 Fig 1과 Fig 2에 기재된 항체 가변 영역의 염기 서열을 바탕으로 PCR 프라이머를 설계하고, PCR 법에 의해 합성했다. PCR 산물을 클로닝 벡터 (p3T 등)에 클로닝 후, 기재된 유전자 서열과 동일한 서열을 갖는 클론을 선발했다. 표 16에서, 사용 된 항체의 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 84 내지 86에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 87 내지 89에 나타낸다.
Figure pct00016
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자 또는 퓨로마이신 내성 유전자, 키메라 항 HLA-DR 항체 (2) 유전자를 발현한다.
(15) 인간화 항 CD38 항체 발현 벡터의 구축
인간화 항 CD38 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 WO2012/092612에 기재된 항체 가변 영역의 염기 서열을 참고하여 취득했다. 표 17에서, 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 90 내지 92에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 93 내지 95에 나타낸다.
Figure pct00017
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 λ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 인간화 항 CD38 항체 유전자를 발현한다.
(16) 인간화 항 CD81 항체 발현 벡터의 구축
인간화 항 CD81 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자는 WO2012/077649에 기재된 항체 가변 영역의 염기 서열을 참고하여 취득했다. 표 18에서, 중쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 96 내지 98에, 또한 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 서열번호 99 내지 101에 나타낸다.
Figure pct00018
얻어진 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 상류부에 실시예 1 (1)과 같은 세포 외 분비 신호 서열을 연결하고, 또한 분비 신호 서열의 상류부 및 가변 영역 3' 말단부에 제한 효소 인식 서열을 연결했다. 실시예 1 (1)과 동일하게 하여, 목적하는 유전자 서열과 동일한 염기 서열을 갖는 클론을 선발한 후 특이적인 제한 효소에 의해 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 적출하고, WO2014/069647 실시예 1에 기재된 인간 λ 경쇄 불변 영역 유전자 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자를 갖는 항체 발현 벡터에 순차적으로 연결했다. 연결한 벡터는 동물 세포내에서 네오마이신 내성 유전자, 인간화 항 CD81 항체 유전자를 발현한다.
실시예 2 항체 제조
(1) 단일 클론 항체의 제조
상기 실시예 1에서 제작한 항체 발현 벡터를 FreeStyle293-F 세포 (Life Technologies)에 293 fectin (Life Technologies)을 이용하여, 또는 ExpiCHO 세포 (Life Ttechnologies)에 ExpiFectamine (Life Technologies)을 이용하여 유전자를 도입했다. 제조 지시서에 따라, 32 내지 37℃, 5 내지 8% CO2 조건에서 1 내지 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수했다. 배양 상청으로부터 단일 클론 항체를 HiTrap Protein A 컬럼 (GE 헬스케어)를 이용하여 정제하였다. 단일 클론 항체는 인산 완충 생리 식염수 (PBS, pH7.0)에 대해 투석한 후, 시험 사용시까지 4℃에 저장했다.
(2) 이중 특이성 항체의 제조
(2-1) Cys1m 형 이중 특이성 항체의 제조
상기 실시예 1에서 제작한 항체 발현 벡터를 WO2014/069647에 따라 개변했다. 구체적으로, 프로테인 A 결합능의 차이를 지표로, 효율적으로 이중 특이성 항체를 정제하기 위해, 항 IgM 항체 (1)의 중쇄에 H435R 및 Y436F 돌연변이를 도입하고, 인간 IgG1 형에서 인간 IgG3 형으로 치환했다. 또한, 이중 특이성 항체를 제조 할 때의 항 IgM 항체 (1)의 조합 상대가 키메라 항 CD20 항체 (1)의 경우에는, 항 IgM 항체 (1)의 경쇄-중쇄 사이의 천연형 이황화 결합을 무효화하기 위해, 경쇄에 C214S 변이를, 중쇄에 C220S 변이를 추가하고, 비천연형 이황화 결합을 도입하기 위해, 경쇄에 S162C의 변이를 중쇄에 F170C의 변이를 추가했다. 조합 상대가 키메라 항 CD20 항체 (1) 이외의 경우는, 같은 변이를 상대방에 도입했다. 이러한 변이에 의해, 원하는 경쇄와 중쇄의 조합을 갖는 항체를 효율적으로 제조할 수 있다. 얻어진 항 IgM 항체 (1) 발현 개변 벡터 및 항 B 세포 표면 항원 항체 발현 개변 벡터를 함께 FreeStyle293-F 세포 또는 ExpiCHO 세포에 유전자 도입했다. 제조 지시서에 따라, 32 내지 37℃, 5% 내지 8% CO2 존재하에서 1 내지 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수했다. 배양 상청을 HiTrap Protein A 컬럼 (GE 헬스케어) 또는 ProSep-vA High Capacity 컬럼 (밀리포아)를 이용하여 정제한 후, 이중 특이성 항체를 CEX 크로마토그래피로 분취했다. 분취에는 강 양이온 교환 컬럼 PL-SCX (Agilent, 입자 크기 : 8 μm, 기공 크기 : 1000 Å)을 사용하였다. 이동상에 이동상 A액 (10 mM MES, pH6.0) 및 이동상 B액 (500 mM NaCl, 10 mM MES, pH6.0)을 사용하였다. 초기 이동상 (98% A액, 2% B액)을 유속 1 mL/min에서 컬럼의 5배 용량 이상을 송액하여 미리 컬럼을 평형화시켜두고, 여기에 정제한 시료를 주입하여 (0 min), 컬럼에 시료를 전하적으로 결합시켰다. 초기 이동상에서 5분간 세척 후, B액의 최종 혼합율이 40%가 되도록 분당 0.8% 증가하는 직선 구배에서 47.5분간 점차 증가시켰다. 그 후, 바로 B액의 혼합율을 100%로 하여 컬럼을 세척했다. 그동안 280 nm에서의 흡수를 기록하고, 이중 특이성 항체의 지속 시간에 상당하는 피크를 분취했다. 취득한 이중 특이성 항체는 PBS (pH7.0)에 대해 투석 후, 시험 사용시까지 4℃에 저장했다.
(2-2) Knobs-into-Holes (KIH) 형 이중 특이성 항체의 제조
이중 특이성 항체의 다른 양태로서, 상기 실시예 1에서 제작한 항체 발현 벡터를 US5731168A 및 Marchant, A. M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (7) : 677-681,1998.에 따라 개변했다. 구체적으로, 항 IgM 항체 (1)의 중쇄에 T366W의 변이를 추가하고, 항 IgM 항체 (1)의 조합 상대가 되는 항 B 세포 표면 항원 항체의 중쇄에 T366S, L368A, Y407V의 변이를 도입했다. 이들 변이에 의해 원하는 중쇄 및 중쇄의 조합을 갖는 항체를 효율적으로 제조할 수 있다. 또한, 프로테인 A 결합능의 차이를 지표로, 효율적으로 이중 특이성 항체를 정제하기 위해, 항 B 세포 표면 항원 항체의 중쇄에 H435R 및 Y436F 돌연변이를 도입하고, 인간 IgG1 형에서 인간 IgG3형으로 치환했다. 얻어진 항 IgM 항체 (1) 발현 개변 벡터 및 항 B 세포 표면 항원 항체 발현 개변 벡터를 FreeStyle293-F 세포 또는 ExpiCHO 세포에 유전자 도입했다. 제조 지시서에 따라, 32 내지 37℃, 5% 내지 8% CO2 존재하에서 1 내지 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수했다. 항 IgM 항체 (1) 발현 개변 벡터를 도입한 세포의 배양 상청은, HiTrap Protein A 컬럼 (GE 헬스케어)을 사용하여 정제 후, PBS (pH7.0)에 대해 투석했다. 항 B 세포 표면 항원 항체 발현 개변 벡터를 도입한 세포의 배양 상청은, HiTrap Protein G 칼럼 (GE 헬스케어)을 사용하여 정제 후, PBS (pH7.0)에 대해 투석했다. 얻어진 항 IgM 항체 (1)와 항 B 세포 표면 항원 항체를 1 : 1로 혼합하고, 거기에 최종 농도 20 mM 환원형 글루타티온 (Wako) 및 2 mM 산화형 글루타티온 (Wako)을 첨가하여 25℃에서 13 내지 15시간 반응시켰다. 반응 후, HiTrap Protein A 칼럼으로 항체를 정제하고, 크기 배제 크로마토그래피 (토소, TSKgel G3000SWXL)로 이중 특이성 항체를 분취했다. 이동상에는 0.2 M K2HPO4,0.25 M KCl (pH7.0)을 사용하였다. 취득한 이중 특이성 항체는 PBS (pH7.0)에 대해 투석 후, 시험 사용시까지 4℃에 저장했다.
(2-3) Cys1m 형 및 KIH 형 이중 특이성 항체의 제조
상기 실시예 1에서 제작한 항체 발현 벡터를 WO2014/069647에 따라 개변했다. 구체적으로, 프로테인 A 결합능의 차이를 지표로, 효율적으로 이중 특이성 항체를 정제하기 위해, 항 IgM 항체 (2) 내지 (5)와 조합하는 항 B 세포 표면 항원 항체의 중쇄에 H435R 및 Y436F 변이를 도입하여, 인간 IgG1 형에서 인간 IgG3 형으로 치환했다. 이중 특이성 항체를 제조할 때의 항 IgM 항체 (2) 내지 (5) 조합 상대가되는 항 B 세포 표면 항원 항체에 경쇄-중쇄 사이의 천연형 이황화 결합을 무효화하기 위해, 경쇄에 C214S 변이를, 중쇄에 C220S 변이를 추가하고, 비천연형 이황화 결합을 도입하기 위해, 경쇄에 S162C의 변이를, 중쇄에 F170C의 변이를 추가했다 (Cys1m 형). 또한, 상기 실시예 1에서 제작한 항체 발현 벡터를 US5731168A 및 Marchant, A. M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (7) : 677-681,1998.에 따라 개변을 추가했다. 구체적으로, 항 IgM 항체 (2) 내지 (5)의 중쇄에 T366W의 변이를 추가하고, 항 IgM 항체 (2) 내지 (5)의 조합 상대가 되는 항 B 세포 표면 항원 항체의 중쇄에 T366S, L368A, Y407V의 변이를 도입했다 (KIH 형). 이들 변이에 의해, 원하는 경쇄와 중쇄의 조합을 갖는 항체를 효율적으로 제조할 수 있다. 얻어진 항 IgM 항체 (2) 내지 (5) 발현 개변 벡터 및 항 B 세포 표면 항원 항체 발현 개변 벡터를 함께 FreeStyle293-F 세포 또는 ExpiCHO 세포에 유전자 도입했다. 제조 지시서에 따라 32 내지 37℃, 5% 내지 8% CO2 존재하에서 1 내지 2주간 배양 후, 배양 상청을 회수했다. 배양 상청을 HiTrap Protein A 컬럼 (GE 헬스케어)을 사용하여 정제 후, 이중 특이성 항체를 CEX 크로마토그래피로 분취했다. 분취에는 강 양이온이온 교환 컬럼 PL-SCX (Agilent, 입자 크기 : 8 μm, 기공 크기 : 1000 Å)를 사용하였다. 이동상에 이동상 A액 (10 mM MES, pH6.0) 및 이동상 B액 (500 mM NaCl, 10 mM MES, pH6.0)을 사용하였다. 초기 이동상 (98% A액, 2% B액)을 유속 1 mL/min로 컬럼의 5배 용량 이상을 송액하여 미리 컬럼을 평형화시켜두고, 여기에 정제한 시료를 주입하여 (0 min), 컬럼에 시료를 전하적으로 결합시켰다. 초기 이동상에서 5분간 세척 후, B액의 최종 혼합율이 40%가 되도록 분당 0.8% 증가의 직선구배로 47.5분간 점차 증가시켰다. 그 후, 즉시 B액의 혼합율을 100%로하여, 컬럼을 세척했다. 그동안 280 nm에서의 흡수를 기록하고, 이중 특이성 항체의 지속 시간에 상당하는 피크를 분취했다. 취득한 이중 특이성 항체는 PBS (pH7.0)에 대해 투석 후, 시험 사용시까지 4℃에 저장했다.
실시예 3 이중 특이성 항체의 항원 결합 기능의 해석
(1) HH 세포막 표면상의 IgM 분자수 및 HLA-DR 분자수의 측정
제작한 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 HLA-DR 및 IgM에 대해 결합성을 갖는 것을 확인하기 위해, HH 세포를 사용하였다. 먼저, HH 세포막 표면상에 존재하는 HLA-DR 및 IgM의 분자수를 조사했다. HH 세포 (CRL-2105, ATCC)는 인간 T 세포 림프종 유래 세포주이기 때문에 IgM은 발현하지 않는 것으로 간주되는 한편, 세포막 표면상에 HLA-DR를 발현하는 것은 알려져있다. HH 세포는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액을 포함하는 RPMI1640를 이용하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
HLA-DR 및 IgM의 분자수는 QIF 키트 (Dako)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 미리 HH 세포를 파종한 96 웰 플레이트 (2 × 105 cells/well)에 마우스 항 HLA-DR 항체 또는 마우스 항 IgM 항체 (20 μg/mL)을 50 μL 첨가하고, 얼음위에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 200 μL의 5% FBS와 PBS (5% FBS/PBS)로 2회 세척하였다. 다음으로, 키트 부속의 FITC 표지 항 마우스 IgG 항체를 5% FBS/PBS로 50배 희석하고, 각 웰에 100 μL 씩 첨가하였다. 얼음위에서 45분간 반응시킨 후, 200 μL의 5% FBS/PBS로 2회 세척하고, PBS로 희석한 1% 포름알데히드 (칸토 화학)로 HH 세포를 고정하였다. 고정된 세포는 유세포 측정기 (FC500MPL, 벡크만·쿨터) 및 분석 소프트웨어 Cytomics MXP cytometer (벡크만·쿨터)를 사용하여 HH 세포에서 유래하는 형광을 측정했다. 그리고 그 때, 첨부의 지시서에 따라 키트에 부속한 셋업 비즈 및 캘리브레이션 비즈를 사용하여 검량선을 작성하고, HH 세포막 표면상의 HLA-DR 및 IgM의 분자수를 산출했다. 결과를 도 1에 나타낸다. 세로축은 세포당 분자수를 나타낸다.
시험 결과, 세포막 표면상의 IgM 분자수는 -0.1 x 105 molecules/cell로 계산되며, HLA-DR 분자수는 4.4 x 105 molecules/cell로 산출되었다. 인간 T 세포 유래의 HH 세포를 이용한 본 실험의 결과로부터, HH 세포는 세포막상에 HLA-DR를 발현하고, IgM을 발현하지 않는 것을 확인했다.
(2) 항 IgM/HLA-DR 이중 특이성 항체의 IgM 및 HLA-DR에 대한 결합
항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 IgM과 HLA-DR에 동시에 결합하는 것을 분비형 IgM 및 HH 세포를 이용하여 확인하였다. HH 세포는 실시예 3 (1)의 실험과 마찬가지로, 세포막 표면상에 HLA-DR을 발현하고 있으나, IgM은 발현하지 않는다.
따라서, 형광 표지한 분비형 IgM 및 이중 특이성 항체를 HH 세포에 반응시킨 때에는, 이중 특이성 항체가 헤테로 이량체이면 HH 세포가 형광표지가 된다. 여기서, 이 시험계를 사용하여 제조한 이중 특이성 항체가 IgM과 HLA-DR에 동시에 결합하는 것을 알아보았다.
분비형 IgM (AbD Serotec)을 LYNX RAPID RPE ANTIBODY CONJUGATION KIT (BIO-RAD)을 이용하여, 첨부의 지시서에 따라 PE 표지했다. 20 μg/mL로부터 공비 3으로 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체, 항 HLA-DR 항체 (1) 또는 항 IgM 항체 (1)을 희석한 후, 각각에 2 μg/mL의 PE 표지 분비형 IgM을 부피비 1 : 1이 되도록 첨가하고, 실온에서 30분간 정치하였다. 반응 후, 상기 혼합액을 미리 HH 세포를 파종한 96 웰 플레이트 (2 × 105 cells/well)에 가하고, 얼음위에서 1시간 반응시켰다. 이어서, 각 웰을 200 μL의 5% FBS/PBS로 3회 세척 후, PBS로 희석한 1% 포름알데히드 용액으로 세포를 고정하였다. 고정된 세포에 결합된 PE 표지 유래의 형광을 유세포 측정기로 측정하고, Cytomics MXP cytometer를 이용하여 해석하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 도면의 세로축은 평균 형광 강도 (MFI), 가로축은 항체 농도를 나타낸다.
항 HLA-DR 항체 (1)은 HH 세포에 결합하지만 분비형 IgM과 결합하지 않기 때문에 형광은 검출되지 않았다. 또한, 항 IgM 항체 (1)은 분비형 IgM에 결합하지만 HH 세포와 결합하지 않기 때문에 HH 세포는 PE 표지되지 않고 형광은 검출되지 않았다. 한편, 제조한 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 목적으로 하는 헤테로체를 형성하고 있는 것이라면, HH 세포에 결합함과 동시에 PE 표지 분비형 IgM에 결합하고, PE 표지된 HH 세포가 검출될 것이다. 여기서, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체와 PE 표지된 분비형 IgM과 HH 세포를 순차적으로 반응시킨 결과, PE 표지된 HH 세포가 검출되었다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 결합 곡선이 동등하고, 제조 방법의 차이에 의한 결합의 차이는 없는 것으로 나타났다. 또한, 데이터에는 나타나지 않으나, HH 세포 단독, HH 세포에 분비형 IgM만을 처리, HH 세포에 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체만을 처리한 경우에도 형광은 검출되지 않았다.
이상의 결과로부터, 제조한 Cys1m 형 및 KIH 형 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 목적으로하는 이종 이합체이며, IgM 및 HLA-DR에 동시에 결합하는 성질을 가지는 것이 나타났다.
실시예 4 이중 특이성 항체의 세포 증식 저해 작용
(1) 항 IgM 항체와 항 HLA-DR 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(1-1) JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 작용 1
분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조로서의 항 EGFR 항체 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. JeKo-1 세포 (RL-3006, ATCC)는 인간의 맨틀 세포 림프종 유래 세포주이며, 세포 표면에 IgM, HLA-DR 및 CD20을 발현한다. JeKo-1 세포는 JeKo-1 세포 증식 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. JeKo-1 세포 증식 배지는 RPMI1640에 20% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액을 포함한다. 증식 저해 활성은 40 μg/mL로부터 공비 3으로 JeKo-1 세포 증식 배지로 희석한 분비형 IgM과 각 항체 (1200 ng/mL)를 부피비 1 : 1로 혼합하고 실온에서 30분간 정치했다. 미리 배지에 현탁한 JeKo-1 세포를 파종한 96 웰 플레이트 (2 × 104 cells/well)에 상기 혼합액을 부피비 1 : 1이 되도록 첨가하고, 37℃, 5% CO2의 조건에서 72시간 배양하였다. 이때 항체 비첨가군과 100% 세포사군 (1% Tween80)을 준비했다. 각 웰에 Cell Counting Kit-8 (동인 화학 연구소)을 10 μL 첨가하여, 37℃, 5% CO2 조건에서 3시간 정색 반응을 수행하였다. 그 후, 마이크로 플레이트 리더 (iMark, BIO-RAD)를 이용하여 450 nm의 흡광도를 측정하여, 다음 식 (1)에 따라 세포 증식 저해 활성 (%)을 산출했다.
Figure pct00019
결과를 도 3에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는, 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성은 동등하며, 제조 방법의 차이에 의한 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다.
(1-2) JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 작용 2
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM 항체 (1)과 항 HLA-DR 항체 (1)의 병용, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, 항체 농도는 300 ng/mL로 하고, 항체의 병용에서는 항 IgM 항체 (1) 및 항 HLA-DR 항체 (1)를 각각 300 ng/mL (총 600 ng/mL) 첨가하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항체를 병용한 경우의 증식 저해 활성은, 항 IgM 항체 (1) 단독 첨가와 마찬가지로 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는, 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
이상으로부터, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 모항체 둘 모두를 병용하는 것보다 증식 저해 활성이 우수한 것으로 나타났다.
(1-3) B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 JeKo-1 세포 대신 B104 세포를 이용하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (100 ng/mL)의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. B104 세포 (JCRB0117, JCRB 세포 은행)은 인간의 B 세포 종양 유래의 세포주이며, 세포 표면에 IgM, HLA-DR, CD20, CD38 및 CD52을 발현한다. B104 세포는 B104 세포 증식 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. B104 세포 증식 배지는 RPMI1640에 20% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액을 포함한다. 또한, 분비형 IgM의 희석은 B104 세포 증식 배지를 사용하였다. 시험 결과를 도 5에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은, 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성은 동등하며, 제조 방법의 차이에 의한 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다.
분비형 IgM 존재하에서 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성은, JeKo-1 세포, B104 세포의 2종의 세포에서 비슷한 결과를 얻은 것으로부터 IgM과 HLA-DR의 양자를 발현하는 세포라면, 분비형 IgM이 존재해도 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성이 발휘될 수 있는 것으로 생각되었다.
(1-4) B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (2), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (2)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, 항체 농도는 500 ng/mL로 했다. 결과를 도 20에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (2)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (2)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
(1-5) JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (3), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (3)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, 항체 농도는 500 ng/mL로 했다. 결과를 도 21에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (3)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (3)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
(1-6) B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (4), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (4)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, 항체 농도는 500 ng/mL로 했다. 결과를 도 22에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (4)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (4)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
(1-7) B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (5), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (5)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, 항체 농도는 500 ng/mL로 했다. 결과를 도 23에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (5)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (5)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
항 B 세포 표면 항원 항체와 결합하는 항 IgM 항체는 클론에 관계없이 비슷한 결과를 얻은 것으로부터, 어떠한 항 IgM 항체 클론에서도 항 IgM/B 세포 표면 항원 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 존재하에서 증식 저해 활성을 갖는 것으로 나타났다.
(1-8) B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR (2) 항체, 항 IgM (1)/HLA-DR (2) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, 항체 농도는 500 ng/mL로 했다. 결과를 도 24에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성을, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/HLA-DR (2) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
항 B 세포 표면 항원 항체와 결합하는 항 HLA-DR 항체는 클론에 관계없이 비슷한 결과를 얻은 것으로부터, 어떠한 항 HLA-DR 항체 클론에서도 항 IgM/HLA-DR 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 존재하에서 증식 저해 활성을 갖는 것으로 나타났다.
(1-9) 인간 혈청 존재하에서의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성
인간 혈청 존재하에서의 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 조사하였다. 구체적으로, 정상인 지원자로부터 채취한 혈청을 56℃에서 30분간 처리하여 불활성화하고, 또한 항체는 PBS로 최종 농도의 10배 농도 (100 μg/mL)가 되도록 제조하였다. 생존율 측정에는 RealTime-Glo MT Cell Viability Assay (Promega)를 사용하였다. 시험시는 90% 인간 혈청/10% 항체액 (항체의 최종 농도는 10 μg/mL)이 되도록 인간 혈청과 항체를 혼합하고, 인간 혈청 비첨가군에서는 90% JeKo-1 세포 증식 배지/10% 항체액으로 하였다. 미리 JeKo-1 세포를 파종한 96 웰 플레이트 (1.5 × 104 cells/well)에 상기 혼합액을 첨가하고, 반응액 10 μL를 지시서에 따라 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 조건하에서 48시간 배양 후, 마이크로 플레이트 리더 (GloMax Discover, GM3000, Promega)를 이용하여 발광을 측정하고, 다음 식 (2)에 따라 세포 생존율 (%)를 수치화했다.
Figure pct00020
또한, 유의차 검정은 Student's t-test를 이용하였다. 결과를 도 6에 나타낸다. 도의 세로축은 세포 생존율을 나타낸다.
"혈청 없음" 조건에서는, 항 IgM 항체 (1)는 B 세포 종양 세포에 대해 증식 저해 활성을 나타냈지만, "혈청 있음" 조건에서는, 항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 소실하였다. 한편, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 혈청의 유무에 관계없이 증식 저해 활성을 나타내었다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성은 동등하며, 제조 방법의 차이에 의한 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다.
이상으로부터, 항 IgM 항체는 인간 혈청에서 증식 저해 활성을 잃지만, 항 IgM/HLA-DR 이중 특이성 항체로 하면 혈청에서도 활성을 유지하는 것이 나타났다.
또한, 본 시험은 2명의 인간 혈청으로 시험을 실시했지만, 두 기증자의 불활성 혈청에서 동등한 결과를 얻어, 기증자에 의한 차이는 없었다.
(2) 항 IgM 항체 및 항 CD20 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(2-1) JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 작용 1
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (1), 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (300 ng/mL)의 JeKo-1 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 결과를 도 7에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은, 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성은 동등하며, 제조 방법의 차이에 의한 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다.
(2-2) JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 작용 2
실시예 4 (2-1)에서 이용한 항 CD20 항체 (1)과는 다른 클론 유래의 항 CD20 항체 (2)를 조합한 이중 특이성 항체 검사를 실시했다. 실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (2), 항 IgM (1)/CD20 (2) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (1,000 ng/mL)의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 결과를 도 8에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/CD20 (2) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
항 IgM 항체와 결합한 항 CD20 항체는 항 CD20 항체 (1) 이어도, 항 CD20 항체 (2)이어도 비슷한 결과를 얻은 것으로부터, 어떠한 항 CD20 항체 클론에서도 항 IgM/CD20 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 존재하에서 증식 저해 활성을 갖는 것으로 나타났다.
(2-3) B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (1), 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (1,000 ng/mL)의 B104 세포에 대한 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, B104 세포의 배양 및 분비형 IgM의 희석에는 B104 세포 증식 배지를 사용하였다. 결과를 도 9에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성은 동등하며, 제조 방법의 차이에 의한 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다.
분비형 IgM 존재하에서 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성은, JeKo-1 세포, B104 세포의 2종의 세포에서 비슷한 결과를 얻은 것으로부터, IgM과 CD20의 양 항원을 막 표면에 발현하는 세포라면, 분비형 IgM이 존재하더라도 항 IgM/CD20 이중 특이성 항체에 의해 증식 저해되는 것이 나타났다.
(2-4) 인간 혈청 존재하에서의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성
실시예 4 (1-9)에 준하여 인간 혈청 존재하에서 항 IgM 항체 (1), 항 CD20 항체 (1), 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (10 μg/mL)의 JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 활성을 조사하였다. 결과를 도 10에 나타낸다. 유의차 검정은 Student's t-test를 이용하였다. 도의 세로축은 생존율을 나타낸다.
"혈청 없음" 조건에서는, 항 IgM 항체 (1)은 B 세포 종양 세포에 대해 증식 저해 활성을 나타냈지만, "혈청 있음" 조건에서는, 항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 소실되었다. 한편, 항 IgM (1)/CD20 (1) 이중 특이성 항체는 혈청의 유무에 관계없이 증식 저해 활성을 나타내었다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 증식 저해 활성은 동등하며, 제조 방법의 차이에 의한 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다.
이상으로부터, 항 IgM 항체는 인간 혈청에서 증식 저해 활성을 잃지만, 항 IgM/CD20 이중 특이성 항체는 혈청에서도 활성을 유지하는 것이 나타났다.
본 시험은 2명의 인간 혈청으로 시험을 실시했지만, 두 기증자의 불활성 혈청에서 동일한 결과를 얻어, 기증자에 의한 차이는 없었다.
(3) 항 IgM 항체와 항 CD32b 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(3-1) JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 CD32b 항체, 항 IgM (1)/CD32b 항체 및 음성 대조 항체 (300 ng/mL)의 JeKo-1 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다.
그 결과, 항 IgM 항체 (1) 및 항 IgM (1)/CD32b 항체의 증식 저해 활성은 실시예 4 (1-1)의 결과와 같은 경향을 보였다.
(4) 항 IgM 항체 및 항 CD37 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(4-1) Ramos 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 CD37 항체, 항 IgM (1)/CD37 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (1,000 ng/mL)의 Ramos 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. Ramos 세포는 세포 표면에 IgM 및 CD37을 발현한다. 또한, Ramos 세포의 배양 및 분비형 IgM의 희석에는 Ramos 세포 증식 배지를 사용하였다.
그 결과, 항 IgM 항체 (1) 및 항 IgM (1)/CD37 항체의 증식 저해 활성은 실시예 4 (1-1)의 결과와 같은 경향을 보였다.
(5) 항 IgM 항체 및 항 CD52 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(5-1) B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 CD52 항체, 항 IgM (1)/CD52 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (1,000 ng/mL)의 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, B104 세포의 배양 및 분비형 IgM의 희석에는 B104 세포 증식 배지를 사용하였다. 결과를 도 11에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/CD52 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
실시예 4 (1) 내지 (5)의 결과로부터 본 발명의 항 IgM/B 세포 표면 항원 항체는 B 세포 표면 항원의 종류에 관계없이, 분비형 IgM 존재하에서 B 세포에 대해 세포 증식 저해 효과를 나타내는 것을 시사한다.
(6) 항 IgM 항체와 항 BAFF 수용체 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(6-1) Jeko-1 세포 또는 B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체, 항 BAFF 수용체 항체, 항 IgM/BAFF 수용체 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포 또는 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사하였다. 또한, 세포 배양 및 분비형 IgM의 희석에는 상기 세포의 증식 배지를 사용하였다.
(7) 항 IgM 항체와 항 BCMA 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(7-1) Ramos 세포 또는 B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체, 항 BCMA 항체, 항 IgM/BCMA 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 Ramos 세포 또는 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사하였다. 또한, 세포 배양 및 분비형 IgM의 희석에는 상기 세포의 증식 배지를 사용하였다.
(8) 항 IgM 항체와 항 TACI 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(8-1) Jeko-1 세포 또는 B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체, 항 TACI 항체, 항 IgM/TACI 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체의 JeKo-1 세포 또는 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사하였다. 또한, 세포 배양 및 분비형 IgM의 희석에는 상기당 세포의 증식 배지를 사용하였다.
(9) 항 IgM 항체 및 항 CD38 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(9-1) B104 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 CD38 항체, 항 IgM (1)/CD38 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (500 ng/mL)의 B104 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, B104 세포의 배양 및 분비형 IgM의 희석에는 B104 세포 증식 배지를 사용하였다. 결과를 도 25에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/CD38 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
(10) 항 IgM 항체 및 항 CD81 항체를 조합한 이중 특이성 항체
(10-1) JeKo-1 세포에 대한 증식 저해 작용
실시예 4 (1-1)에 준하여 분비형 IgM 농도 상승에 따른 항 IgM 항체 (1), 항 CD81 항체, 항 IgM (1)/CD81 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (500 ng/mL)의 JeKo-1 세포 증식 저해 활성의 변화를 조사했다. 또한, JeKo-1 세포의 배양 및 분비형 IgM의 희석에는 JeKo-1 세포 증식 배지를 사용하였다. 결과를 도 26에 나타낸다. 도의 세로축은 증식 저해 활성, 가로축은 배지에 첨가한 분비형 IgM 농도를 나타낸다.
항 IgM 항체 (1)의 증식 저해 활성은 분비형 IgM 농도 상승에 따라 감약했다. 한편, 항 IgM (1)/CD81 이중 특이성 항체는 분비형 IgM 농도가 상승하여도 증식 저해 활성을 유지했다.
또한, 실시예 4 (9) 및 (10)의 결과로부터 본 발명의 항 IgM/B 세포 표면 항원 항체는 B 세포 표면 항원의 종류에 관계없이 분비형 IgM 존재하에서 B 세포에 대해 세포 증식 저해 효과를 나타내는 것을 시사했다.
실시예 5 이중 특이성 항체의 Ramos 세포에 대한 아포토시스 유도 작용
(1) 항 IgM 항체와 항 HLA-DR 항체를 조합한 이중 특이성 항체의 Ramos 세포에 대한 아포토시스 유도 작용
항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 및 음성 대조 항체 (1,000 ng/mL)의 Ramos 세포에 대한 아포토시스 유도 효과를 조사했다. 미리 배지에 현탁한 Ramos 세포를 6 웰 플레이트에 파종하고 (3.6 × 105 cells/well), 37℃, 5% CO2 조건하에서 3시간 배양하였다. 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1), 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 또는 음성 대조 항체를 PBS로 1 mg/ml으로 조제한 용액을 최종 농도 1,000 ng/ml이 되도록 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 더 배양하였다. 원심 분리로 회수한 각 세포를 1% 글루타르 알데히드를 포함하는 PBS에 현탁하고, 4℃ 조건하에서 16시간 동안 배양하였다. 다시 원심 분리로 각 세포를 회수 후 40 μL의 PBS에 현탁했다.
10 μL의 세포 현탁액과 2 μL의 1 mM Hoechst33342 (동인 화학 연구소)를 혼합한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 염색체 구조가 응집·단편화 된 세포를 아포토시스 유도 세포로 판단하고, 무작위로 선출된 10 시야의 전체 세포수 및 아포토시스 유도 세포수를 측정했다.
결과를 도 27에 나타낸다. 유의차 검정은 Student's t-test를 이용하였다. 도의 세로축은 아포토시스가 유도된 세포의 비율을 나타낸다.
항 IgM 항체 (1) 및 항 HLA-DR 항체 (1)의 아포토시스 유도율은 각각 6.0%와 4.2%이며, 비히클 및 음성 항체의 아포토시스 유도율은 각각 3.8%와 4.3%였다. 이중 특이성 항체는 11.0%로 두 항체와 비교해도 상당히 높은 아포토시스 유도율을 보였다.
(2) 항 IgM 항체 (1) 및 항 CD20 (2) 항체를 조합한 이중 특이성 항체의 Ramos 세포에 대한 아포토시스 유도 작용
실시예 5 (1)에 준하여 항 IgM 항체 (1)과 항 HLA-DR 항체 (1)를 조합한 이중 특이성 항체 대신 항 IgM 항체 (1) 및 항 CD20 항체 (2)를 조합한 이중 특이성 항체를 이용하여 아포토시스 유도율을 조사했다.
결과를 도 28에 나타낸다. 도의 세로축은 아포토시스가 유도된 세포의 비율을 나타낸다.
항 IgM 항체 (1) 및 항 CD20 항체 (2)의 아포토시스 유도율은 각각 8.7%와 7.9%이며, 비히클 및 음성 항체의 아포토시스 유도율은 각각 3.5% 및 4.1%였다. 한편, 이중 특이성 항체는 22.4%로 두 항체와 비교해도 상당히 높은 아포토시스 유도 율을 보였다.
(3) 항 IgM 항체 및 항 CD38 항체를 조합한 이중 특이성 항체의 Ramos 세포에 대한 아포토시스 유도 작용
실시예 5 (1)에 준하여 항 IgM 항체 (1) 및 항 CD38 항체를 조합한 이중 특이성 항체 대신 항 IgM 항체 (1) 및 항 CD38 항체를 조합한 이중 특이성 항체를 사용하여 아포토시스 유도율을 조사했다.
결과를 도 29에 나타낸다. 도의 세로축은 전체 세포 중 아포토시스가 유도 된 세포의 비율을 나타낸다.
항 IgM 항체 (1) 및 항 CD38 항체의 아포토시스 유도율은 각각 4.3%와 1.4%이며, 비히클 및 음성 항체의 아포토시스 유도율은 각각 1.3%와 1.1%였다. 한편, 이중 특이성 항체는 16.4%로 어떠한 항체와 비교해도 상당히 높은 아포토시스 유도율을 보였다.
실시예 6 항 IgM 항체와 항 HLA-DR 항체를 조합한 이중 특이성 항체의 세포주기 정지 작용
(1) 분비형 IgM 존재하에서의 JeKo-1 세포에 대한 세포주기 정지 작용
분비형 IgM 존재하에서 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1) 및 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체가 JeKo-1 세포의 세포주기에 미치는 영향을 검토했다. 구체적으로, JeKo-1 세포 증식 배지에서 조제한 각 항체 (400 ng/mL)와 분비형 IgM (40 μg/mL)을 부피비 1 : 1로 혼합하고, 실온에서 30분간 정치하였다. 그 후, 미리 배지에 현탁한 JeKo-1 세포를 6 웰 플레이트에 파종하고 (3 × 105 cells/well), 각 웰에 각 항체 농도가 100 ng/mL 및 분비형 IgM 농도가 10 μg/mL가 되도록 첨가하여, 37℃, 5% CO2 조건하에서 24시간 배양하였다. 음성 대조는 항체액 대신에 PBS를 첨가하였다. 배양 후, 세포를 70% 에탄올/PBS로 고정하고, 요오드화 프로피듐 (시그마 알드리치)로 DNA를 염색한 뒤, 유세포 측정기 및 분석 소프트웨어 Cytomics MXP cytometer를 이용하여 세포주기 분석을 실시했다. 결과를 도 12에 나타낸다. 각 슬라이드의 세로축은 세포수, 가로축은 세포 당 DNA 함량을 나타낸다.
항 HLA-DR 항체 (1)는 분비형 IgM의 존재에 관계없이 JeKo-1 세포의 세포주기에 영향을 주지 않았다. 항 IgM 항체 (1)는 분비형 IgM의 비존재하에서 세포주기를 정지시켰지만, 분비형 IgM 첨가에 의해 세포주기 정지 작용은 소실되었다. 한편, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 분비형 IgM의 존재에 관계없이 세포주기를 G1 기에서 정지시켰다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 세포주기 정지 작용은 동등하며, 제조 방법의 차이에 의한 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다.
이 결과로부터, 항 IgM 항체를 B 세포 표면 항원에 대한 항체와 이중 특이성 항체로 함으로써 분비형 IgM 존재하에서도 세포주기를 정지시키는 것으로 밝혀졌다.
(2) 인간 혈청 존재하에서의 JeKo-1 세포에 대한 세포주기 정지 작용
실시예 6 (1)에 준하여 분비형 IgM 대신 인간 혈청을 이용하여 인간 혈청 존재하에서 항 IgM 항체 (1), 항 HLA-DR 항체 (1) 및 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 (1 μg/mL)가 JeKo-1 세포의 세포주기에 미치는 영향을 검토했다. 구체적으로, 90% 인간 혈청/10% 항체액 (항체의 최종 농도는 1 μg/mL)이 되도록 인간 혈청 항체를 혼합하여 JeKo-1 세포에 첨가하였다. 인간 혈청 비첨가군에는 90% JeKo-1 세포 증식 배지/10% 항체액으로 하였다. 또한, 음성 대조는 항체액 대신에 PBS를 첨가하였다. 결과를 도 13에 나타낸다. 각 도의 세로축은 세포수, 가로축은 세포 당 DNA 함량을 나타낸다.
항 HLA-DR 항체 (1)은 인간 혈청의 존재에 관계없이 JeKo-1 세포의 세포주기에 영향을 주지 않았다. 항 IgM 항체 (1)은, 인간 혈청 비존재하에서 세포주기를 정지 시켰지만, 인간 혈청을 첨가하는 것으로 세포주기 정지 작용은 소실되었다. 한편, 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 인간 혈청의 존재에 관계없이 세포주기를 G1 기에서 정지시켰다. 또한, Cys1m 형 이중 특이성 항체와 KIH 형 이중 특이성 항체의 세포주기 정지 작용은 동등하며, 제조 방법의 차이에 의한 활성의 차이는 없는 것으로 나타났다.
이 결과로부터, 항 IgM 항체를 B 세포 표면 항원에 대한 항체와 이중 특이성 항체로 함으로써 인간 혈청 존재하에서도 세포주기를 정지시키는 것으로 밝혀졌다.
또한, 본 시험은 2명의 인간 혈청으로 시험을 실시했지만, 두 기증자의 불활성 혈청에서 동일한 결과를 얻어, 기증자에 의한 차이는 없었다.
실시예 7 항 IgM 항체와 항 HLA-DR 항체를 조합한 이중 특이성 항체의 랫트 투여 시험
(1) 랫트로의 항체 투여에 의한 B 세포 감소 작용
항 HLA-DR 항체 (1)은 WKAH/Hkm 랫트의 B 세포에 결합하는 것으로 알려져있다. 이에, 항 IgM/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체의 랫트에의 작용을 조사했다.
항 IgM 항체 (1, 3, 10, 30 mg/kg), 항 HLA-DR 항체 (1) (0.1, 0.3, 1 mg/kg) 및 항 IgM/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체 (0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 mg/kg)을 WKAH/Hkm 랫트의 꼬리 정맥에서 투여했다. 투여 5시간 후에 랫트의 꼬리 정맥으로부터 채혈했다. PE 표지 항 랫트 CD45RA 항체 (BD 화민겐)와 반응시킨 후에 OptiLyse C (벡크만·쿨터)를 이용하여 용혈 처리를 실시하고, 혈중 B 세포수를 유세포 측정기 및 분석 소프트웨어 Cytomics MXP cytometer를 이용하여 측정했다. 항체 대신에 PBS를 투여한 개체의 말초 혈중 B 세포수를 100%로 하고, 각 항체 투여 후 말초 혈액 B 세포수의 변동을 산출했다.
항 IgM/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체의 투여가 랫트 생체 내 B 세포에 미치는 영향을 도 14에 나타낸다. 항 IgM 항체는 10 mg/kg 이상 투여하지 않으면 B 세포수가 감소하지 않은 반면, 항 IgM/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 0.3 mg/kg 투여군에서 B 세포수를 감소시켰다. 항 HLA-DR 항체 (1)은 0.3 mg/kg 이상을 투여한개체에서 진정, 복와위 등의 행동 이상이 확인되었고, 추가로 1 mg/kg을 투여한 개체는 심각한 부작용 때문에 채혈 불능이 되었다. 또한, 그 이하의 투여량에서는 B 세포의 충분한 감소 효과가 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, 랫트 생체 내에서 항 IgM 항체의 활성을 발휘할 수 없는 낮은 농도에서도 항 IgM 항체를 다른 B 세포 표면 항원에 대한 항체와 이중 특이성 항체로 함으로써 B 세포수를 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 랫트 생체 내에서 낮은 농도에서도 심각한 부작용이 관찰되는 항 B 세포 항원 항체도, 항 IgM 항체와 이중 특이성 항체로 함으로써 부작용의 발현이 억제되고, B 세포수를 감소시키는 것으로 나타났다.
실시예 8 항 IgM 항체와 항 HLA-DR 항체를 조합한 이중 특이성 항체의 원숭이 투여 시험
(1) 필리핀 원숭이에 대한 항체 투여에 의한 B 세포 감소 작용
항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체를 필리핀 원숭이에 투여하고, 그 효과를 평가했다. 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체를 필리핀 원숭이 암컷 1 마리의 요측 피부 정맥에 투여했다. 투여는 각각 1, 3, 10, 20 mg/kg에 해당하는 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체를 저용량부터 시작하여 2일에 1회 실시하여 총 4회 투여했다. 처음 투여 직전 및 각 투여 24시간 후 대퇴 정맥에서 채혈했다. APC 표지 항 CD20 항체 (Biolegend) 또는 Alexa Fluor 488 표지 항 CD3 항체 (BD Biosciences)를 반응시켜 B 세포수 및 T 세포수를 유세포 측정기 (FACS Calibur, BD Biosciences) 및 분석 소프트웨어 CellQuest Pro (Version6. 0, BD Biosciences)를 이용하여 측정함과 동시에, 적혈구 및 혈소판 수를 종합 혈액학 검사 장치 (Siemens healthcare Diagnostics Manufacturing)을 이용하여 측정하였다. 투여 전 말초 혈액의 각 혈구수를 100%로 하고, 각 투여 후 말초 혈액 중의 각 혈구수를 산출했다. 또한, 투여 기간 동안 원숭이의 증상을 관찰함과 동시에 시험 종료 후 부검으로 이상 소견의 유무를 관찰했다.
결과를 도 15 내지 19에 나타내었다. 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 1 mg/kg 투여에 의해 말초 혈액 B 세포수가 약 50% 감소했다. 또한, 그 효과는 농도 의존적으로 증강하였고, 20 mg/kg 투여에서는 투여 전 약 2%까지 말초 혈액 B 세포를 소실시켰다 (도 15). 또한, 항체 투여 후에 제작한 겨드랑이 림프절의 헤마톡실린·에오진 염색에서 림프절에서 림프구가 차지하는 비중이 현저히 저하하였고, 림프 여포의 위축 및 배아 중심의 소실이 관찰되었다. 한편, B 세포와 마찬가지로 HLA-DR을 세포막 표면에 발현하는 T 세포는 항체의 투여 의존적인 감소는 관찰되지 않았다 (도 16). 또한, HLA-DR을 세포막 표면에서 발현하지 않은 적혈구 및 혈소판도 항체의 투여 의존적인 감소는 관찰되지 않았다 (도 17, 도 18). 또한, 체온은 항체의 투여 후에도 변하지 않고 거의 일정한 값을 나타내었다 (도 19). 항체 투여가 원인이라고 생각하는 원숭이의 이상 증상은 확인되지 않았으며 부검 결과에서도 이상 소견은 확인되지 않았다.
이상의 결과는, 혈중에 분비형 IgM이 있는 필리핀 원숭이 생체 내에서도 항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체는 말초 혈액 B 세포 고갈을 일으키는 것을 나타내고, 상기 이중 특이성 항체가 B 세포성 종양뿐만 아니라 정상 B 세포에서 유래하는 B 세포 관련 질환의 치료에도 효과적임을 강하게 시사하는 것이다.
항 IgM (1)/HLA-DR (1) 이중 특이성 항체의 모항체의 하나인 항 HLA-DR 항체 (1)은 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 랫트에 대한 부작용은 0. 3 mg/kg에서 확인되었고, 추가로 1 mg/kg 투여로 심각한 부작용을 확인하였으며, 필리핀 원숭이에 대해서도 마찬가지로 심각한 부작용을 나타내는 것으로 예상된다. 그러나 이상의 결과로부터, 필리핀 원숭이 생체 내에서 심각한 부작용이 우려되는 항 B 세포 항원 항체라도 항 IgM 항체와 이중 특이성 항체로 함으로써 더 높은 농도로 사용하여도 부작용 발현이 억제되고, B 세포수를 감소시키는 것으로 나타났다.
실시예 7 및 8의 결과로부터, 항 IgM/B 세포 표면 항원 이중 특이성 항체는 B 세포에 대해 우수한 증식 저해 활성을 갖는 동시에, 부작용면에서도 현저한 효과가 있음이 나타났다.
SEQUENCE LISTING <110> Zenyaku Kogyo Co., Ltd. <120> Anti-IgM/B cell surface antigen bispecific antibody <130> IPA190910-JP <150> JP 2017-060131 <151> 2017-03-24 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (1) heavy chain CDR1 <400> 1 Thr Tyr Trp Val Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (1) heavy chain CDR2 <400> 2 Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr Leu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (1) heavy chain CDR3 <400> 3 Glu Thr Tyr Asp Tyr Pro Phe Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (1) light chain CDR1 <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (1) light chain CDR2 <400> 5 Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (1) light chain CDR3 <400> 6 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (1) heavy chain CDR1 <400> 7 Ser Asn Ser Ala Ser Trp Asn 1 5 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (1) heavy chain CDR2 <400> 8 Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (1) heavy chain CDR3 <400> 9 Glu Asn Phe Tyr Gly Ser Glu Thr Cys His Lys Lys Tyr Tyr Cys Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Val 20 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (1) light chain CDR1 <400> 10 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (1) light chain CDR2 <400> 11 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (1) light chain CDR3 <400> 12 Gln Gln Phe Asn Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (1) heavy chain CDR1 <400> 13 Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (1) heavy chain CDR2 <400> 14 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (1) heavy chain CDR3 <400> 15 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (1) light chain CDR1 <400> 16 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (1) light chain CDR2 <400> 17 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (1) light chain CDR3 <400> 18 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (2) heavy chain CDR1 <400> 19 Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (2) heavy chain CDR2 <400> 20 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (2) heavy chain CDR3 <400> 21 Ala Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (2) light chain CDR1 <400> 22 Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Ser Met His 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (2) light chain CDR2 <400> 23 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD20 Ab (2) light chain CDR3 <400> 24 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD32b Ab heavy chain CDR1 <400> 25 Asp Ala Trp Met Asp 1 5 <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD32b Ab heavy chain CDR2 <400> 26 Glu Ile Arg Ser Lys Pro Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD32b Ab light chain CDR1 <400> 27 Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD32b Ab light chain CDR2 <400> 28 Ala Ala Ser Ala Leu Asp Ser 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD32b Ab light chain CDR3 <400> 29 Leu Gln Tyr Val Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD37 Ab heavy chain CDR1 <400> 30 Arg Tyr Ser Val His 1 5 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD37 Ab heavy chain CDR2 <400> 31 Met Ile Trp Gly Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD37 Ab heavy chain CDR3 <400> 32 Pro Trp Gly Ser Ser Gly Pro Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD37 Ab light chain CDR1 <400> 33 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD37 Ab light chain CDR2 <400> 34 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD37 Ab light chain CDR3 <400> 35 Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD52 Ab heavy chain CDR1 <400> 36 Asp Phe Tyr Met Asn 1 5 <210> 37 <211> 19 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD52 Ab heavy chain CDR2 <400> 37 Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD52 Ab heavy chain CDR3 <400> 38 Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD52 Ab light chain CDR1 <400> 39 Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD52 Ab light chain CDR2 <400> 40 Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD52 Ab light chain CDR3 <400> 41 Leu Gln His Ile Ser Arg Pro Arg Thr 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-BCMA Ab heavy chain CDR1 <400> 42 His Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-BCMA Ab heavy chain CDR2 <400> 43 Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-BCMA Ab heavy chain CDR3 <400> 44 Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe 1 5 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-BCMA Ab light chain CDR1 <400> 45 Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-BCMA Ab light chain CDR2 <400> 46 Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-BCMA Ab light chain CDR3 <400> 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Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (3) heavy chain CDR1 <400> 66 Ser Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (3) heavy chain CDR2 <400> 67 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (3) heavy chain CDR3 <400> 68 Gln Ile Gly Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (3) light chain CDR1 <400> 69 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His 1 5 10 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (3) light chain CDR2 <400> 70 Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (3) light chain CDR3 <400> 71 Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (4) heavy chain CDR1 <400> 72 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (4) heavy chain CDR2 <400> 73 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (4) heavy chain CDR3 <400> 74 Trp Thr Gly Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (4) light chain CDR1 <400> 75 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (4) light chain CDR2 <400> 76 Trp Ala Ser Thr Arg His Ile 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (4) light chain CDR3 <400> 77 His Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Tyr Thr 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (5) heavy chain CDR1 <400> 78 Ser Tyr Val Met His 1 5 <210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (5) heavy chain CDR2 <400> 79 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (5) heavy chain CDR3 <400> 80 Val Trp Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (5) light chain CDR1 <400> 81 Arg Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (5) light chain CDR2 <400> 82 Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser 1 5 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-IgM Ab (5) light chain CDR3 <400> 83 His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr 1 5 <210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (2) heavy chain CDR1 <400> 84 Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (2) heavy chain CDR2 <400> 85 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (2) heavy chain CDR3 <400> 86 Asp Ile Thr Ala Val Val Pro Thr Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 87 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (2) light chain CDR1 <400> 87 Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (2) light chain CDR2 <400> 88 Ala Ala Ser Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-HLA-DR Ab (2) light chain CDR3 <400> 89 Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp Ala 1 5 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD38 Ab heavy chain CDR1 <400> 90 Asp Tyr Gly Met Ser 1 5 <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD38 Ab heavy chain CDR2 <400> 91 Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD38 Ab heavy chain CDR3 <400> 92 Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His 1 5 10 <210> 93 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD38 Ab light chain CDR1 <400> 93 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD38 Ab light chain CDR2 <400> 94 Arg Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD38 Ab light chain CDR3 <400> 95 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val 1 5 10 <210> 96 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD81 Ab heavy chain CDR1 <400> 96 Ser Asn Tyr Met Ser 1 5 <210> 97 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD81 Ab heavy chain CDR2 <400> 97 Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly Arg Phe <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD81 Ab heavy chain CDR3 <400> 98 Tyr Ser Tyr Gly Arg Asp Asn Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD81 Ab light chain CDR1 <400> 99 Thr Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Thr His 1 5 10 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD81 Ab light chain CDR2 <400> 100 Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Anti-CD81 Ab light chain CDR3 <400> 101 Gln Ser Tyr Asp Thr Asn Leu Ser Val Trp Val 1 5 10

Claims (15)

  1. IgM 및 B 세포 표면 항원에 결합하는 이중 특이성 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IgM에 결합하는 제1 항원 결합 부위와, 상기 B 세포 표면 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 것인, 이중 특이성 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 B 세포 표면 항원이 HLA-DR, CD20, CD32b, CD37, CD38, CD52, CD81, BAFF 수용체, BCMA 및 TACI로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 이중 특이성 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 이중 특이성 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 가변 영역이 하기 (a) 내지 (f)의 중쇄 CDR1 내지 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 CDR3 및 하기 (g) 내지 (l)의 중쇄 CDR1 내지 CDR3 및 경쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 것인, 이중 특이성 항체;
    (a) 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 48, 60, 66, 72 및 78로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1,
    (b) 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 2, 49, 61, 67, 73 및 79로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2,
    (c) 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 3, 50, 62, 68, 74 및 80으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3,
    (d) 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 4, 51, 63, 69, 75 및 81로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1,
    (e) 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 5, 52, 64, 70, 76 및 82로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2,
    (f) 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 6, 53, 65, 71, 77 및 83으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3,
    (g) 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 7, 13, 19, 25, 30, 36, 42, 84, 90 및 96으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1,
    (h) 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 8, 14, 20, 26, 31, 37, 43, 85, 91 및 97로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2,
    (i) 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 9, 15, 21, FDY, 32, 38, 44, 86, 92 및 98로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3,
    (j) 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 10, 16, 22, 27, 33, 39, 45, 87, 93 및 99로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1,
    (k) 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 11, 17, 23, 28, 34, 40, 46, 88, 94 및 100으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및
    (l) 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열번호 12, 18, 24, 29, 35, 41, 47, 89, 95 및 101로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열에서 한개 내지 복수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포의 증식을 저해하는 것인, 이중 특이성 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 B 세포 관련 질환 치료제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환이 B 세포성 종양인, B 세포 관련 질환 치료제.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체의, B 세포 관련 질환 치료제 제조를 위한 사용.
  11. 제10항에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환이 B 세포성 종양인, 사용.
  12. B 세포 관련 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환이 B 세포성 종양인, 이중 특이성 항체.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 이중 특이성 항체의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 B 세포 관련 질환의 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 B 세포 관련 질환이 B 세포성 종양인, B 세포 관련 질환의 치료 방법.
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