JP7050333B2 - 抗IgM/B細胞表面抗原二重特異性抗体 - Google Patents
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Description
従って、本発明の課題は、血中の分泌型IgM存在下であっても、B細胞表面の膜結合型IgMに結合し、当該B細胞との結合活性が高く、さらに当該B細胞に対し増殖阻害効果を発揮する抗体を提供することにある。
〔1〕IgM及びB細胞表面抗原に結合する二重特異性抗体。
〔2〕前記IgMに結合する第一の抗原結合部位と、前記B細胞表面抗原に結合する第二の抗原結合部位とを含むものである、〔1〕記載の二重特異性抗体。
〔3〕前記B細胞表面抗原がHLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、BAFF受容体、BCMA及びTACIからなる群より選択されるものである、〔1〕又は〔2〕に記載の二重特異性抗体。
〔4〕キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の二重特異性抗体。
〔5〕抗体の可変領域が下記(a)~(f)の重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3並びに下記(g)~(l)の重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3を含むものである、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の二重特異性抗体。
(a)配列番号1、48、60、66、72及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号1、48、60、66、72及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1、48、60、66、72及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR1
(b)配列番号2、49、61、67、73及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号2、49、61、67、73及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号2、49、61、67、73及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR2
(c)配列番号3、50、62、68、74及び80からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号3、50、62、68、74及び80からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号3、50、62、68、74及び80からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR3
(d)配列番号4、51、63、69、75及び81からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号4、51、63、69、75及び81からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号4、51、63、69、75及び81からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1
(e)配列番号5、52、64、70、76及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号5、52、64、70、76及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号5、52、64、70、76及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2
(f)配列番号6、53、65、71、77及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号6、53、65、71、77及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号6、53、65、71、77及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
(g)配列番号7、13、19、25、30、36、42、84、90及び96からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号7、13、19、25、30、36、42、84、90及び96からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号7、13、19、25、30、36、42、84、90及び96からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR1
(h)配列番号8、14、20、26、31、37、43、85、91及び97からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号8、14、20、26、31、37、43、85、91及び97からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号8、14、20、26、31、37、43、85、91及び97からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR2
(i)配列番号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92及び98からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92及び98からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92及び98からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR3
(j)配列番号10、16、22、27、33、39、45、87、93及び99からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号10、16、22、27、33、39、45、87、93及び99からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号10、16、22、27、33、39、45、87、93及び99からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1
(k)配列番号11、17、23、28、34、40、46、88、94及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号11、17、23、28、34、40、46、88、94及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号11、17、23、28、34、40、46、88、94及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2
(l)配列番号12、18、24、29、35、41、47、89、95及び101からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号12、18、24、29、35、41、47、89、95及び101からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号12、18、24、29、35、41、47、89、95及び101からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
〔6〕B細胞の増殖を阻害するものである、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の二重特異性抗体。
〔7〕〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の二重特異性抗体を含有することを特徴とする医薬組成物。
〔8〕〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とするB細胞関連疾患治療剤。
〔9〕前記B細胞関連疾患がB細胞性腫瘍である、〔8〕記載のB細胞関連疾患治療剤。
〔10〕〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の二重特異性抗体の、B細胞関連疾患治療剤製造のための使用。
〔11〕前記B細胞関連疾患がB細胞性腫瘍である、〔10〕記載の使用。
〔12〕B細胞関連疾患の治療に用いるための、〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の二重特異性抗体。
〔13〕前記B細胞関連疾患がB細胞性腫瘍である、〔12〕記載の二重特異性抗体。
〔14〕〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の二重特異性抗体の有効量を投与することを特徴とする、B細胞関連疾患の治療方法。
〔15〕前記B細胞関連疾患がB細胞性腫瘍である、〔14〕記載のB細胞関連疾患治療方法。
ここで、IgMとは免疫グロブリンMを指す。IgMが由来する動物種は特に限定されないが、例えば、ヒトや、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等といった非ヒト動物が挙げられ、このうちヒトが好ましい。IgMに対する第一の特異性は、好ましくは、IgMに対する抗体に由来する部位により発現され、より好ましくは、IgMに対する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に由来する部位により発現され、さらに好ましくは、IgMに対する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域により形成される抗原結合部位により発現されるものである。
一方、B細胞表面抗原とは、膜結合型IgM以外のB細胞表面に発現する抗原であればよく、特に限定されないが、好ましくはB細胞関連疾患に罹患した生体のB細胞で発現している抗原であり、さらに好ましくはB細胞性腫瘍に罹患した生体のB細胞で発現している抗原である。B細胞表面抗原が由来する動物種は特に限定されないが、例えば、ヒトや、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等といった非ヒト動物が挙げられ、このうちヒトが好ましい。B細胞表面抗原としては、具体的には、HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD28、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD43、CD45RA、CD45RO、CD52、CD53、CD54、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD138、CD272、BAFF受容体、BCMA、TACI、PD-1等が挙げられ、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、BAFF受容体、BCMA及びTACIが好ましく、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52及びCD81がより好ましく、HLA-DR、CD20、CD38、CD52及びCD81がさらに好ましい。B細胞表面抗原に対する第二の特異性は、好ましくは、B細胞表面抗原に対する抗体に由来する部位により発現され、より好ましくは、B細胞表面抗原に対する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に由来する部位により発現され、さらに好ましくは、B細胞表面抗原に対する抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域により形成される抗原結合部位により発現されるものである。
CDRとは、抗体間で配列が大きく異なる可変領域内の配列で、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域にそれぞれ3つのCDRがあり、これらが組み合わさって抗原結合部位を形成し、抗原特異性を決定する。CDRは、Kabat(Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.,1991.を参照のこと)の配列比較により定義される。Kabatにより定義されているように、重鎖CDR1は重鎖可変領域の31~35残基付近に、重鎖CDR2は50~65残基付近に、重鎖CDR3は95~102残基付近に位置し、軽鎖CDR1は軽鎖可変領域の24~34残基付近に、軽鎖CDR2は50~56残基付近に、軽鎖CDR3は89~97残基付近に位置する。
(a)配列番号1、48、60、66、72及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号1、48、60、66、72及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号1、48、60、66、72及び78からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(b)配列番号2、49、61、67、73及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号2、49、61、67、73及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号2、49、61、67、73及び79からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(c)配列番号3、50、62、68、74及び80からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号3、50、62、68、74及び80からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号3、50、62、68、74及び80からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(d)配列番号4、51、63、69、75及び81からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号4、51、63、69、75及び81からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号4、51、63、69、75及び81からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(e)配列番号5、52、64、70、76及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号5、52、64、70、76及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号5、52、64、70、76及び82からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(f)配列番号6、53、65、71、77及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号6、53、65、71、77及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号6、53、65、71、77及び83からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
(g)配列番号7、13、19、25、30、36、42、84、90及び96からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号7、13、19、25、30、36、42、84、90及び96からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号7、13、19、25、30、36、42、84、90及び96からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(h)配列番号8、14、20、26、31、37、43、85、91及び97からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号8、14、20、26、31、37、43、85、91及び97からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号8、14、20、26、31、37、43、85、91及び97からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(i)配列番号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92及び98からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92及び98からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92及び98からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(j)配列番号10、16、22、27、33、39、45、87、93及び99からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号10、16、22、27、33、39、45、87、93及び99からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号10、16、22、27、33、39、45、87、93及び99からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(k)配列番号11、17、23、28、34、40、46、88、94及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号11、17、23、28、34、40、46、88、94及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号11、17、23、28、34、40、46、88、94及び100からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(l)配列番号12、18、24、29、35、41、47、89、95及び101からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号12、18、24、29、35、41、47、89、95及び101からなる群より選択されるアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号12、18、24、29、35、41、47、89、95及び101からなる群より選択されるアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を有するアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
ここで、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であって抗原と特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に連結させたキメラ抗体である。また、「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であって抗原と特異的に結合する抗体の重鎖と軽鎖のCDR以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。また、「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体を意味する。
単離したDNAは、発現ベクター中に導入される。次いでこれを、適当な宿主細胞にトランスフェクションすることで、該組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体又はそれに含まれる領域を発現させることができる。
本発明において、抗体と抗原の結合活性は、ELISA、フローサイトメトリー法、表面プラズモン共鳴(SPR)法等の公知の方法で測定することができる。ELISAを用いる場合、例えば、抗原をプレートに固定化し、プレートに本発明の二重特異性抗体を添加して反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)等の酵素で標識した抗IgG抗体等の二次抗体を反応させ、発色基質(例えばTMB発色基質)を加えて吸光度を測定すればよい。フローサイトメトリー法を用いる場合、例えば、本発明の二重特異性抗体を、未標識の評価対象(例えば、個体、臓器、組織、細胞又はこれらの断片等を含む生物試料を指してよい)と結合させた後、蛍光色素結合二次抗体と反応させ、又は、本発明の二重特異性抗体に蛍光色素(例えば、Alexa Fluor647)を直接標識して、フローサイトメーターにて蛍光を検出すればよい。また、SPR法を用いれば、抗体と抗原の結合活性をより詳細に測定することができる。例えば、BIAcoreシステムを用い、センサーチップに抗原を固定化し、本発明の二重特異性抗体を含む溶液をセンサーチップ表面に一定時間供給し、その後緩衝液を供給して、本発明の二重特異性抗体と抗原の結合と解離をモニターし、結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)及び解離定数(KD=kd/ka)を算出することができる。KDは親和性の指標であり、KDが小さいほど抗原に対する抗体の親和性は強い。あるいは、結合定数(KA=1/KD)によっても親和性を表すことができる。
本発明の二重特異性抗体は、例えば、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9以下、10-10M以下、又は10-11M以下のKDでB細胞に結合することが好ましい。
本発明において、「細胞周期の停止」とは、細胞周期の進行がG1期で停止することを意味する。細胞周期は、定法に従って、例えばフローサイトメーターにより細胞のDNA量を測定することで解析できる。
また、本発明において、「細胞増殖阻害活性」とは、細胞表面にIgMを発現するB細胞に対して本発明の二重特異性抗体を投与することにより、当該B細胞の増殖が阻害されることを意味する。より具体的には、細胞増殖阻害活性は、後述の実施例4の式(1)により求められる。
さらに、本発明において、「アポトーシス誘導作用」とは、細胞に対し細胞自らが積極的に引き起こす細胞の死を誘導する作用を意味する。アポトーシスが誘導されると、細胞は縮小し、核の凝集及びDNAの断片化が生じ、最終的にアポトーシス小体となってマクロファージ等に貪食される。アポトーシス誘導作用は、定法に従って、例えば、細胞膜の構造変化、核の凝集及びDNAの断片化、カスパーゼ活性等を検出することで評価できる。
(1)ヒト化抗IgM抗体(1)に関する発現ベクターの構築
ヒト化抗IgM抗体(1)重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、既知マウス抗IgM抗体(GenBankエントリー:L17037.1)を参考に、定法によりマウスフレームワーク領域(FR)を対応するヒトFRをコードする塩基配列に置換することで得た。表2において、使用した重鎖相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列を配列番号1~3に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号4~6に示す。CDRはKabatの定義に準拠した。
ヒト化抗IgM抗体(1)発現ベクターは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域遺伝子断片が挿入された各クローニングベクターより、特異的な制限酵素によって得られる遺伝子断片をWO2014/069647の実施例1に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトIgG1重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結した。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒト化抗ヒトIgM抗体(1)遺伝子を発現する。
ヒト型抗HLA-DR抗体(1)の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、特開2005-325133の実施例12に記載の抗体可変領域塩基配列を元にPCRプライマーを設計し、PCR法により合成した。PCR産物をクローニングベクター(p3Tなど)にクローニング後、記載された遺伝子配列と同一の配列をもつクローンを選抜した。表3において、使用した抗体の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号7~9に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号10~12に示す。
キメラ抗CD20抗体(1)の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、特表平8-503468の実施例IIに記載の抗体可変領域塩基配列を元にPCRプライマーを設計し、PCR法により合成した。PCR産物をクローニングベクター(p3Tなど)にクローニング後、記載された遺伝子配列と同一の配列をもつクローンを選抜した。表4において、重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号13~15に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号16~18に示す。
定法に従って、Ramos細胞(CRL-1596、American Type Culture Collection:ATCC)をBALB/cマウスに免疫し、マウス抗CD20抗体産生ハイブリドーマを樹立した。Ramos細胞はヒトのバーキットリンパ腫由来の細胞株であり、細胞表面にCD20、IgM、CD37を発現する。Ramos細胞はRamos細胞増殖培地を用いて、37℃、5%CO2条件下で培養した。Ramos細胞増殖培地はRPMI1640(Life Technologies)に10%ウシ胎仔血清(FBS、Life Technologies)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ペニシリン最終濃度:100units/mL、ストレプトマイシン最終濃度:0.1mg/mL、Sigma-Aldrich)を含む。ハイブリドーマ全RNAよりcDNAを合成し、抗体可変領域遺伝子をクローニングした。表5において、取得した抗体の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号19~21に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号22~24に示す。
キメラ抗CD32b抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、US2006/0073142 A1のExample 1.0に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして得た。表6において、重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号25~26に、又軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号27~29に示す。なお、重鎖CDR3のアミノ酸配列はFDYである。
定法に従って、Ramos細胞をBALB/cマウスに免疫し、マウス抗CD37抗体産生ハイブリドーマを樹立した。ハイブリドーマ全RNAよりcDNAを合成し抗体可変領域遺伝子をクローニングした。表7において、クローニングした抗体の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号30~32に、又軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号33~35に示す。
ヒト化抗CD52抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、特表平2-503514の実施例1に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして取得した。表8において、重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号36~38に、又軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号39~41に示す。
ヒト化抗BAFF受容体抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子を取得する。得られる重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例1(1)と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域3’末端部に制限酵素認識配列を連結する。実施例1(1)と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、WO2014/069647の実施例1に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトIgG1重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結する。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ヒト化抗BAFF受容体抗体遺伝子を発現する。
キメラ抗BCMA抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、特許第6061469号に記載のC12A3.2の可変領域のアミノ酸配列を参考にして取得した。表9において、重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号42~44に、又、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号45~47に示す。
キメラ抗TACI抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子を取得する。得られる重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片の上流部に実施例1(1)と同一の細胞外分泌シグナル配列を連結し、さらに、分泌シグナル配列の上流部及び可変領域3’末端部に制限酵素認識配列を連結する。実施例1(1)と同様にして、目的とする遺伝子配列と同一の塩基配列をもつクローンを選抜した後、特異的な制限酵素によって重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子断片を切り出し、WO2014/069647の実施例1に記載のヒトκ軽鎖定常領域遺伝子及びヒトIgG1重鎖定常領域遺伝子を有する抗体発現ベクターに順次連結する。連結したベクターは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、キメラ抗TACI抗体遺伝子を発現する。
定法に従って、WKAH/HkmラットB細胞をBALB/cマウスに免疫し、マウス抗IgM抗体産生ハイブリドーマを樹立した。ハイブリドーマ全RNAよりcDNAを合成し、抗体可変領域遺伝子をクローニングした。表10において、取得した抗体の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号48~50に、又軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号51~53に示す。
ヒト化抗EGFR抗体(陰性対照)の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、US5558864のEXAMPLE4に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして得た。表11において、重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号54~56に、又軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号57~59に示す。
定法に従って、ヒトIgMおよびサルIgMをBALB/cマウスに免疫し、マウス抗IgM抗体産生ハイブリドーマを4株樹立した。ハイブリドーマ全RNAよりcDNAを合成し抗体可変領域遺伝子をクローニングした。表12において、クローニングした抗IgM抗体(2)の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号60~62に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号63~65に示す。表13において、クローニングした抗IgM抗体(3)の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号66~68に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号69~71に示す。表14において、クローニングした抗IgM抗体(4)の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号72~74に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号75~77に示す。表15において、クローニングした抗IgM抗体(5)の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号78~80に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号81~83に示す。
キメラ抗HLA-DR抗体(2)の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、US7612180のFig1及びFig2記載の抗体可変領域の塩基配列を元にPCRプライマーを設計し、PCR法により合成した。PCR産物をクローニングベクター(p3Tなど)にクローニング後、記載された遺伝子配列と同一の配列をもつクローンを選抜した。表16において、使用した抗体の重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号84~86に、また、軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号87~89に示す。
ヒト化抗CD38抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、WO2012/092612に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして取得した。表17において、重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号90~92に、又軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号93~95に示す。
ヒト化抗CD81抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子は、WO2012/077649に記載の抗体可変領域の塩基配列を参考にして取得した。表18において、重鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号96~98に、又軽鎖CDRのアミノ酸配列を配列番号99~101に示す。
(1)モノクローナル抗体の製造
上記実施例1で作製した抗体発現ベクターをFreeStyle293-F細胞(Life Technologies)に293fectin(Life Technologies)を用いて、又はExpiCHO細胞(Life Ttechnologies)にExpiFectamine(Life Technologies)を用いて遺伝子導入した。メーカー指図書に従い、32~37℃、5~8%CO2条件下で1~2週間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりモノクローナル抗体をHiTrap Protein Aカラム(GEヘルスケア)を用いて精製した。モノクローナル抗体はリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.0)に対して透析した後、試験使用時まで4℃に保存した。
(2-1)Cys1m型二重特異性抗体の製造
上記実施例1で作製した抗体発現ベクターを、WO2014/069647に従って改変した。具体的には、プロテインA結合能の差異を指標に効率的に二重特異性抗体を精製するため、抗IgM抗体(1)の重鎖にH435R及びY436Fの変異を導入し、ヒトIgG1型からヒトIgG3型に置換した。また、二重特異性抗体を調製する際の抗IgM抗体(1)の組み合わせ相手がキメラ抗CD20抗体(1)の場合には、抗IgM抗体(1)の軽鎖-重鎖間の天然型ジスルフィド結合を無効化するため、軽鎖にC214Sの変異を、重鎖にC220Sの変異を加え、非天然型ジスルフィド結合を導入するために、軽鎖にS162Cの変異を、重鎖にF170Cの変異を加えた。組み合わせ相手がキメラ抗CD20抗体(1)以外の場合は、同じ変異を相手方に導入した。これらの変異により、所望の軽鎖と重鎖の組み合わせを有する抗体を効率よく製造することができる。得られた抗IgM抗体(1)発現改変ベクター及び抗B細胞表面抗原抗体発現改変ベクターを共にFreeStyle293-F細胞又はExpiCHO細胞に遺伝子導入した。メーカー指図書に従い、32~37℃、5%~8%CO2存在下で1~2週間培養後、培養上清を回収した。培養上清をHiTrap Protein Aカラム(GEヘルスケア)またはProSep-vA High Capacity カラム(メルクミリポア)を用いて精製後、二重特異性抗体をCEXクロマトグラフィーにて分取した。分取には強陽イオン交換カラムPL-SCX(Agilent、粒子径:8μm、細孔径:1000Å)を用いた。移動相に移動相A液(10mM MES、pH6.0)及び移動相B液(500mM NaCl、10mM MES、pH6.0)を用いた。初期移動相(98%A液、2%B液)を流速1mL/minにてカラムの5倍容量以上を送液して予めカラムを平衡化させておき、ここに精製した試料を注入し(0min)、カラムに試料を電荷的に結合させた。初期移動相で5分間洗浄後、B液の最終混合率が40%となるよう、1分間当たり0.8%増の直線勾配で47.5分間漸増させた。その後、直ちにB液の混合率を100%とし、カラムを洗浄した。この間、280nmにおける吸収を記録し、二重特異性抗体の保持時間に相当するピークを分取した。取得した二重特異性抗体はPBS(pH7.0)に対して透析後、試験使用時まで4℃に保存した。
二重特異性抗体の別態様として、上記実施例1で作製した抗体発現ベクターを、US5731168A及びMarchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.,16(7):677-681,1998.に従って改変した。具体的には、抗IgM抗体(1)の重鎖にT366Wの変異を加え、抗IgM抗体(1)の組み合わせ相手となる抗B細胞表面抗原抗体の重鎖にT366S、L368A、Y407Vの変異を導入した。これらの変異により、所望の重鎖と重鎖の組み合わせを有する抗体を効率よく製造することができる。さらに、プロテインA結合能の差異を指標に効率的に二重特異性抗体を精製するため、抗B細胞表面抗原抗体の重鎖にH435R及びY436Fの変異を導入し、ヒトIgG1型からヒトIgG3型に置換した。得られた抗IgM抗体(1)発現改変ベクター及び抗B細胞表面抗原抗体発現改変ベクターをFreeStyle293-F細胞又はExpiCHO細胞に遺伝子導入した。メーカー指図書に従い、32~37℃、5%~8%CO2存在下で1~2週間培養後、培養上清を回収した。抗IgM抗体(1)発現改変ベクターを導入した細胞の培養上清は、HiTrap Protein Aカラム(GEヘルスケア)を用いて精製後、PBS(pH7.0)に対して透析した。抗B細胞表面抗原抗体発現改変ベクターを導入した細胞の培養上清は、HiTrap Protein Gカラム(GEヘルスケア)を用いて精製後、PBS(pH7.0)に対して透析した。得られた抗IgM抗体(1)と抗B細胞表面抗原抗体を1:1で混合し、そこに終濃度20mM 還元型グルタチオン(Wako)及び2mM 酸化型グルタチオン(Wako)を添加し、25℃で13~15時間反応させた。反応後、HiTrap Protein Aカラムにて抗体を精製し、さらにサイズ排除クロマトグラフィー(東ソー、TSKgel G3000SWXL)にて二重特異性抗体を分取した。移動相には0.2M K2HPO4、0.25M KCl(pH7.0)を用いた。取得した二重特異性抗体はPBS(pH7.0)に対して透析後、試験使用時まで4℃に保存した。
上記実施例1で作製した抗体発現ベクターを、WO2014/069647に従って改変した。具体的には、プロテインA結合能の差異を指標に効率的に二重特異性抗体を精製するため、抗IgM抗体(2)~(5)と組み合わせる抗B細胞表面抗原抗体の重鎖にH435R及びY436Fの変異を導入し、ヒトIgG1型からヒトIgG3型に置換した。二重特異性抗体を調製する際の抗IgM抗体(2)~(5)の組み合わせ相手となる抗B細胞表面抗原抗体に軽鎖-重鎖間の天然型ジスルフィド結合を無効化するため、軽鎖にC214Sの変異を、重鎖にC220Sの変異を加え、非天然型ジスルフィド結合を導入するために、軽鎖にS162Cの変異を、重鎖にF170Cの変異を加えた(Cys1m型)。また、上記実施例1で作製した抗体発現ベクターを、US5731168A及びMarchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.,16(7):677-681,1998.に従って改変を加えた。具体的には、抗IgM抗体(2)~(5)の重鎖にT366Wの変異を加え、抗IgM抗体(2)~(5)の組み合わせ相手となる抗B細胞表面抗原抗体の重鎖にT366S、L368A、Y407Vの変異を導入した(KIH型)。これらの変異により、所望の軽鎖と重鎖の組み合わせを有する抗体を効率よく製造することができる。得られた抗IgM抗体(2)~(5)発現改変ベクター及び抗B細胞表面抗原抗体発現改変ベクターを共にFreeStyle293-F細胞又はExpiCHO細胞に遺伝子導入した。メーカー指図書に従い、32~37℃、5%~8%CO2存在下で1~2週間培養後、培養上清を回収した。培養上清をHiTrap Protein Aカラム(GEヘルスケア)を用いて精製後、二重特異性抗体をCEXクロマトグラフィーにて分取した。分取には強陽イオン交換カラムPL-SCX(Agilent、粒子径:8μm、細孔径:1000Å)を用いた。移動相に移動相A液(10mM MES、pH6.0)及び移動相B液(500mM NaCl、10mM MES、pH6.0)を用いた。初期移動相(98%A液、2%B液)を流速1mL/minにてカラムの5倍容量以上を送液して予めカラムを平衡化させておき、ここに精製した試料を注入し(0min)、カラムに試料を電荷的に結合させた。初期移動相で5分間洗浄後、B液の最終混合率が40%となるよう、1分間当たり0.8%増の直線勾配で47.5分間漸増させた。その後、直ちにB液の混合率を100%とし、カラムを洗浄した。この間、280nmにおける吸収を記録し、二重特異性抗体の保持時間に相当するピークを分取した。取得した二重特異性抗体はPBS(pH7.0)に対して透析後、試験使用時まで4℃に保存した。
(1)HH細胞膜表面上のIgM分子数及びHLA-DR分子数の測定
作製した抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体がHLA-DR及びIgMに対する結合性を有することを確認するため、HH細胞を用いた。まず、HH細胞膜表面上に存在するHLA-DR及びIgMの分子数を調べた。HH細胞(CRL-2105、ATCC)はヒトT細胞性リンパ腫由来の細胞株であることからIgMは発現しないと考えられ、一方、細胞膜表面上にHLA-DRを発現することは知られている。HH細胞は10%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を含むRPMI1640を用いて、37℃、5%CO2条件下で培養した。
HLA-DR及びIgMの分子数についてはQIFキット(Dako)を用いて測定した。具体的には、予めHH細胞を播種した96ウェルプレート(2×105cells/well)にマウス抗HLA-DR抗体若しくはマウス抗IgM抗体(20μg/mL)を50μL添加し、氷上で1時間反応させた。その後、200μLの5%のFBSを含むPBS(5%FBS/PBS)で2回洗浄した。次に、キット付属のFITC標識抗マウスIgG抗体を5%FBS/PBSで50倍希釈し、各ウェルに100μLずつ添加した。氷上で45分間反応させた後、200μLの5%FBS/PBSで2回洗浄し、PBSで希釈した1%ホルムアルデヒド(関東化学)でHH細胞を固定した。固定した細胞はフローサイトメーター(FC500MPL、ベックマン・コールター)及び解析ソフトCytomics MXP cytometer(ベックマン・コールター)を用いてHH細胞に由来する蛍光を測定した。またその際、添付の指図書に従い、キットに付属するセットアップビーズ及びキャリブレーションビーズを用いて検量線を作成し、HH細胞膜表面上のHLA-DR及びIgMの分子数を算出した。結果を図1に示す。縦軸は細胞あたりの分子数を示す。
試験の結果、細胞膜表面上のIgMの分子数は-0.1x105molecules/cellと算出され、HLA-DRの分子数は4.4x105molecules/cellと算出された。ヒトT細胞由来のHH細胞を用いた本試験の結果から、HH細胞は細胞膜上にHLA-DRを発現し、IgMを発現しないことを確認した。
抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体がIgMとHLA-DRに同時に結合することを分泌型IgM及びHH細胞を用いて確認した。HH細胞は実施例3(1)の実験の通り、細胞膜表面上にHLA-DRを発現しているが、IgMは発現していない。
このため、蛍光標識した分泌型IgMと二重特異性抗体とをHH細胞に反応させた際には、二重特異性抗体がヘテロ二量体であればHH細胞が蛍光標識されることになる。そこで、この試験系を用いて製造した二重特異性抗体がIgMとHLA-DRに同時に結合することを調べた。
分泌型IgM(AbD Serotec)をLYNX RAPID RPE ANTIBODY CONJUGATION KIT(BIO-RAD)を用いて、添付の指図書に従いPE標識した。20μg/mLより公比3にて抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体、抗HLA-DR抗体(1)又は抗IgM抗体(1)を希釈した後、各々に2μg/mLのPE標識分泌型IgMを体積比1:1となるように添加し、室温で30分間静置した。反応後、当該混合液を予めHH細胞を播種した96ウェルプレート(2×105cells/well)に加え、氷上で1時間反応させた。続いて、各ウェルを200μLの5%FBS/PBSで3回洗浄後、PBSで希釈した1%ホルムアルデヒド液で細胞を固定した。固定した細胞に結合したPE標識由来の蛍光をフローサイトメーターにて測定し、Cytomics MXP cytometerを用いて解析した。結果を図2に示す。図の縦軸は平均蛍光強度(MFI)、横軸は抗体濃度を示す。
抗HLA-DR抗体(1)はHH細胞に結合するが分泌型IgMとは結合しないため、蛍光は検出されなかった。また、抗IgM抗体(1)は分泌型IgMに結合するがHH細胞とは結合しないため、HH細胞はPE標識されず蛍光は検出されなかった。一方、製造した抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体が目的とするヘテロ体を形成しているのであれば、HH細胞に結合すると同時にPE標識分泌型IgMに結合し、PE標識されたHH細胞が検出されるはずである。そこで、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体とPE標識した分泌型IgMとHH細胞を順次反応させたところ、PE標識されたHH細胞が検出された。さらに、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の結合曲線が同等であり、製造法の違いによる結合の差異はないことが示された。なお、データには示さないが、HH細胞のみ、HH細胞に分泌型IgMのみを処理、HH細胞に抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体のみを処理した場合においても蛍光は検出されなかった。
以上の結果から、製造したCys1m型及びKIH型の抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、目的とするヘテロ二量体であり、IgMとHLA-DRに同時に結合する性質をもつことが示された。
(1)抗IgM抗体と抗HLA-DR抗体を組み合せた二重特異性抗体
(1-1)JeKo-1細胞に対する増殖阻害作用1
分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照としての抗EGFR抗体のJeKo-1細胞に対する増殖阻害活性の変化を調べた。JeKo-1細胞(RL-3006、ATCC)はヒトのマントル細胞リンパ腫由来の細胞株であり、細胞表面にIgM、HLA-DR及びCD20を発現する。JeKo-1細胞はJeKo-1細胞増殖培地を用いて、37℃、5%CO2条件下で培養した。JeKo-1細胞増殖培地は、RPMI1640に20%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を含む。増殖阻害活性は、40μg/mLより公比3にてJeKo-1細胞増殖培地で希釈した分泌型IgMと各抗体(1200ng/mL)を体積比1:1で混合し、室温で30分間静置した。予め培地に懸濁したJeKo-1細胞を播種した96ウェルプレート(2×104cells/well)に、上記の当該混合液を体積比1:1となるように添加し、37℃、5%CO2の条件下で72時間培養した。その際、抗体非添加群と100%細胞死群(1% Tween80)を用意した。各ウェルにCell Counting Kit-8(同仁化学研究所)を10μL添加し、37℃、5%CO2の条件で3時間呈色反応を行った。その後、マイクロプレートリーダー(iMark、BIO-RAD)を用いて450nmの吸光度を測定し、次式(1)に従って、細胞増殖阻害活性(%)を算出した。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。さらに、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM抗体(1)と抗HLA-DR抗体(1)の併用、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体のJeKo-1細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は300ng/mLとし、抗体の併用では抗IgM抗体(1)及び抗HLA-DR抗体(1)をそれぞれ300ng/mL(合計600ng/mL)添加した。結果を図4に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗体を併用した場合の増殖阻害活性は、抗IgM抗体(1)単独添加と同様に分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
以上のことから、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は両親抗体を併用するよりも増殖阻害活性が優れていることが示された。
実施例4(1-1)に準じて、JeKo-1細胞の代わりにB104細胞を用いて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体(100ng/mL)のB104細胞に対する増殖阻害活性の変化を調べた。B104細胞(JCRB0117、JCRB細胞バンク)はヒトのB細胞性腫瘍由来の細胞株であり、細胞表面にIgM、HLA-DR、CD20、CD38及びCD52を発現する。B104細胞はB104細胞増殖培地を用いて、37℃、5%CO2条件下で培養した。B104細胞増殖培地は、RPMI1640に20%FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を含む。また、分泌型IgMの希釈はB104細胞増殖培地を用いた。試験の結果を図5に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。また、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
分泌型IgM存在下における抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体の増殖阻害活性は、JeKo-1細胞、B104細胞の2種の細胞で同様の結果が得られたことから、IgMとHLA-DRの両者を発現する細胞であれば、分泌型IgMが存在しても抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体の増殖阻害活性が発揮できるものと考えられた。
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(2)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(2)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体のB104細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は500ng/mLとした。結果を図20に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(2)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(2)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(3)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(3)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体のJeKo-1細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は500ng/mLとした。結果を図21に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(3)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(3)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(4)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(4)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体のB104細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は500ng/mLとした。結果を図22に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(4)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(4)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(5)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(5)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体のB104細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は500ng/mLとした。結果を図23に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(5)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(5)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
抗B細胞表面抗原抗体と組み合わせる抗IgM抗体はクローンに関係なく同様の結果が得られたことから、いずれの抗IgM抗体クローンでも、抗IgM/B細胞表面抗原二重特異性抗体は分泌型IgM存在下において増殖阻害活性を有することが示された。
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR(2)抗体、抗IgM(1)/HLA-DR(2)二重特異性抗体及び陰性対照抗体のB104細胞増殖阻害活性の変化を調べた。なお、抗体濃度は500ng/mLとした。結果を図24に示す。図の縦軸は増殖阻害活性を、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/HLA-DR(2)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
抗B細胞表面抗原抗体と組み合わせる抗HLA-DR抗体はクローンに関係なく同様の結果が得られたことから、いずれの抗HLA-DR抗体クローンでも、抗IgM/HLA-DR二重特異性抗体は分泌型IgM存在下において増殖阻害活性を有することが示された。
ヒト血清存在下での抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体のJeKo-1細胞に対する増殖阻害活性を調べた。具体的には、健常人ボランティアより採取した血清を56℃、30分間処理により非働化し、また抗体はPBSにて最終濃度の10倍濃度(100μg/mL)となるよう調製した。生存率の測定にはRealTime-Glo MT Cell Viability Assay(Promega)を用いた。試験時は、90%ヒト血清/10%抗体液(抗体の最終濃度は10μg/mL)となるよう、ヒト血清と抗体を混合し、ヒト血清非添加群では90%JeKo-1細胞増殖培地/10%抗体液とした。予め、JeKo-1細胞を播種した96ウェルプレート(1.5×104cells/well)に当該混合液を添加し、さらに反応液10μLを指図書に従い添加した。37℃、5%CO2条件下で48時間培養後、マイクロプレートリーダー(GloMax Discover、GM3000、Promega)を用いて発光を測定し、次式(2)に従って、細胞生存率(%)を数値化した。
「血清なし」の条件では、抗IgM抗体(1)はB細胞性腫瘍細胞に対して増殖阻害活性を示したが、「血清あり」の条件では、抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は消失した。一方、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は血清の有無に関わらず増殖阻害活性を示した。さらに、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
以上のことから、抗IgM抗体はヒト血清中で増殖阻害活性を失うが、抗IgM/HLA-DR二重特異性抗体にすると血清中でも活性を維持することが示された。
なお、本試験は2人のヒト血清で試験を実施したが、両ドナーの非働化血清で同等の結果が得られ、ドナーによる違いは認められなかった。
(2-1)JeKo-1細胞に対する増殖阻害作用1
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体(300ng/mL)のJeKo-1細胞増殖阻害活性の変化を調べた。結果を図7に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/CD20(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。さらに、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
実施例4(2-1)で用いた抗CD20抗体(1)とは異なるクローン由来の抗CD20抗体(2)を組み合せた二重特異性抗体の検討を行った。実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(2)、抗IgM(1)/CD20(2)二重特異性抗体及び陰性対照抗体(1,000ng/mL)のJeKo-1細胞に対する増殖阻害活性の変化を調べた。結果を図8に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/CD20(2)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
抗IgM抗体と組み合わせる抗CD20抗体は抗CD20抗体(1)であっても抗CD20抗体(2)であっても同様の結果が得られたことから、いずれの抗CD20抗体クローンでも、抗IgM/CD20二重特異性抗体は分泌型IgM存在下において増殖阻害活性を有することが示された。
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体(1,000ng/mL)のB104細胞に対する増殖阻害活性の変化を調べた。尚、B104細胞の培養及び分泌型IgMの希釈にはB104細胞増殖培地を用いた。結果を図9に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/CD20(1)二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。また、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
分泌型IgM存在下における抗IgM(1)/CD20(1)二重特異性抗体の増殖阻害活性は、JeKo-1細胞、B104細胞の2種の細胞で同様の結果が得られたことから、IgMとCD20の両抗原を膜表面に発現する細胞であれば、分泌型IgMが存在しても抗IgM/CD20二重特異性抗体によって増殖阻害されることが示された。
実施例4(1-9)に準じて、ヒト血清存在下での抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体(10μg/mL)のJeKo-1細胞に対する増殖阻害活性を調べた。結果を図10に示す。有意差検定はStudent’s t-testを用いた。図の縦軸は生存率を示す。
「血清なし」の条件では、抗IgM抗体(1)はB細胞性腫瘍細胞に対して増殖阻害活性を示したが、「血清あり」の条件では、抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は消失した。一方、抗IgM(1)/CD20(1)二重特異性抗体は血清の有無に関わらず増殖阻害活性を示した。また、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の増殖阻害活性は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
以上のことから、抗IgM抗体はヒト血清中で増殖阻害活性を失うが、抗IgM/CD20二重特異性抗体は血清中でもその活性を維持することが示された。
本試験は、2人のヒト血清で試験を実施したが、両ドナーの非働化血清で同等の結果が得られ、ドナーによる違いは認められなかった。
(3-1)JeKo-1細胞に対する増殖阻害作用
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗CD32b抗体、抗IgM(1)/CD32b抗体及び陰性対照抗体(300ng/mL)のJeKo-1細胞増殖阻害活性の変化を調べた。
その結果、抗IgM抗体(1)及び抗IgM(1)/CD32b抗体の増殖阻害活性は、実施例4(1-1)の結果と同様の傾向を示した。
(4-1)Ramos細胞に対する増殖阻害作用
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗CD37抗体、抗IgM(1)/CD37二重特異性抗体及び陰性対照抗体(1,000ng/mL)のRamos細胞増殖阻害活性の変化を調べた。Ramos細胞は細胞表面にIgM及びCD37を発現する。尚、Ramos細胞の培養及び分泌型IgMの希釈にはRamos細胞増殖培地を用いた。
その結果、抗IgM抗体(1)及び抗IgM(1)/CD37抗体の増殖阻害活性は、実施例4(1-1)の結果と同様の傾向を示した。
(5-1)B104細胞に対する増殖阻害作用
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗CD52抗体、抗IgM(1)/CD52二重特異性抗体及び陰性対照抗体(1,000ng/mL)のB104細胞増殖阻害活性の変化を調べた。尚、B104細胞の培養及び分泌型IgMの希釈にはB104細胞増殖培地を用いた。結果を図11に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/CD52二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
実施例4(1)~(5)の結果より本発明の抗IgM/B細胞表面抗原抗体は、B細胞表面抗原の種類に関わらず、分泌型IgM存在下でB細胞に対し細胞増殖阻害効果を示すことが示唆された。
(6-1)Jeko-1細胞又はB104細胞に対する増殖阻害作用
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体、抗BAFF受容体抗体、抗IgM/BAFF受容体二重特異性抗体及び陰性対照抗体のJeko-1細胞又はB104細胞増殖阻害活性の変化を調べる。尚、細胞の培養及び分泌型IgMの希釈には当該細胞の増殖培地を用いる。
(7-1) Ramos細胞又はB104細胞に対する増殖阻害作用
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体、抗BCMA抗体、抗IgM/BCMA二重特異性抗体及び陰性対照抗体のRamos細胞又はB104細胞増殖阻害活性の変化を調べる。尚、細胞の培養及び分泌型IgMの希釈には当該細胞の増殖培地を用いる。
(8-1) Jeko-1細胞又はB104細胞に対する増殖阻害作用
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体、抗TACI抗体、抗IgM/TACI二重特異性抗体及び陰性対照抗体のJeko-1細胞又はB104細胞増殖阻害活性の変化を調べる。尚、細胞の培養及び分泌型IgMの希釈には当該細胞の増殖培地を用いる。
(9-1) B104細胞に対する増殖阻害作用
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗CD38抗体、抗IgM(1)/CD38二重特異性抗体及び陰性対照抗体(500ng/mL)のB104細胞増殖阻害活性の変化を調べた。尚、B104細胞の培養及び分泌型IgMの希釈にはB104細胞増殖培地を用いた。結果を図25に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/CD38二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
(10-1) JeKo-1細胞に対する増殖阻害作用
実施例4(1-1)に準じて、分泌型IgM濃度上昇による抗IgM抗体(1)、抗CD81抗体、抗IgM(1)/CD81二重特異性抗体及び陰性対照抗体(500ng/mL)のJeKo-1細胞増殖阻害活性の変化を調べた。尚、JeKo-1細胞の培養及び分泌型IgMの希釈にはJeKo-1細胞増殖培地を用いた。結果を図26に示す。図の縦軸は増殖阻害活性、横軸は培地に添加した分泌型IgM濃度を示す。
抗IgM抗体(1)の増殖阻害活性は、分泌型IgM濃度上昇に伴い減弱した。一方、抗IgM(1)/CD81二重特異性抗体は、分泌型IgM濃度が上昇しても増殖阻害活性を維持した。
さらに実施例4(9)及び(10)の結果より本発明の抗IgM/B細胞表面抗原抗体は、B細胞表面抗原の種類に関わらず、分泌型IgM存在下でB細胞に対し細胞増殖阻害効果を示すことが示唆された。
(1)抗IgM抗体と抗HLA-DR抗体を組み合せた二重特異性抗体のRamos細胞に対するアポトーシス誘導作用
抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体及び陰性対照抗体(1,000ng/mL)のRamos細胞に対するアポトーシス誘導効果を調べた。予め培地に懸濁したRamos細胞を6ウェルプレートに播種し(3.6×105cells/well)、37℃、5%CO2条件下で3時間培養した。抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体又は陰性対照抗体をPBSにて1mg/mlに調製した溶液を、最終濃度1,000ng/mlとなるように各ウェルへ添加し、37℃、5%CO2条件下でさらに24時間培養した。遠心分離で回収した各細胞を1%グルタルアルデヒドを含むPBSに懸濁し、4℃条件下で16時間インキュベートした。再度、遠心分離で各細胞を回収後、40μLのPBSへ懸濁した。
10μLの細胞懸濁液と2μLの1mM Hoechst33342(同仁化学研究所)を混合した後、蛍光顕微鏡下にて観察を行った。染色体構造が凝集・断片化した細胞をアポトーシス誘導細胞と判断し、無作為に選出した10視野における全細胞数及びアポトーシス誘導細胞数を計測した。
抗IgM抗体(1)及び抗HLA-DR抗体(1)のアポトーシス誘導率はそれぞれ6.0%及び4.2%であり、ビークル及び陰性抗体のアポトーシス誘導率はそれぞれ3.8%及び4.3%であった。二重特異性抗体は11.0%といずれの抗体と比較しても有意に高いアポトーシス誘導率を示した。
実施例5(1)に準じて、抗IgM抗体(1)と抗HLA-DR抗体(1)を組み合せた二重特異性抗体の代わりに抗IgM抗体(1)と抗CD20抗体(2)を組み合せた二重特異性抗体を用いて、アポトーシス誘導率を調べた。
抗IgM抗体(1)及び抗CD20抗体(2)のアポトーシス誘導率はそれぞれ8.7%及び7.9%であり、ビークル及び陰性抗体のアポトーシス誘導率はそれぞれ3.5%及び4.1%であった。一方、二重特異性抗体は22.4%といずれの抗体と比較しても有意に高いアポトーシス誘導率を示した。
実施例5(1)に準じて、抗IgM抗体(1)と抗HLA-DR抗体を組み合せた二重特異性抗体の代わりに抗IgM抗体(1)と抗CD38抗体を組み合せた二重特異性抗体を用いて、アポトーシス誘導率を調べた。
抗IgM抗体(1)及び抗CD38抗体のアポトーシス誘導率はそれぞれ4.3%及び1.4%であり、ビークル及び陰性抗体のアポトーシス誘導率はそれぞれ1.3%及び1.1%であった。一方、二重特異性抗体は16.4%といずれの抗体と比較しても有意に高いアポトーシス誘導率を示した。
(1)分泌型IgM存在下でのJeKo-1細胞に対する細胞周期停止作用
分泌型IgM存在下で抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)及び抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体がJeKo-1細胞の細胞周期に与える影響を検討した。具体的には、JeKo-1細胞増殖培地で調製した各抗体(400ng/mL)と分泌型IgM(40μg/mL)を体積比1:1で混合し、室温で30分間静置した。その後、予め培地に懸濁したJeKo-1細胞を6ウェルプレートに播種し(3×105cells/well)、各ウェルに各抗体濃度が100ng/mL、及び、分泌型IgM濃度が10μg/mLとなるように添加し、37℃、5%CO2の条件下で、24時間培養した。陰性対照は抗体液の代わりにPBSを添加した。培養後、細胞を70%エタノール/PBSで固定し、ヨウ化プロピジウム(シグマ・アルドリッチ)でDNAを染色した上でフローサイトメーター及び解析ソフトCytomics MXP cytometerを用いて細胞周期解析を行った。結果を図12に示す。各スライドの縦軸は細胞数、横軸は細胞あたりのDNA含有量を示す。
抗HLA-DR抗体(1)は分泌型IgMの存在に関係なくJeKo-1細胞の細胞周期に影響を与えなかった。抗IgM抗体(1)は分泌型IgMの非存在下では細胞周期を停止させたが、分泌型IgM添加により細胞周期停止作用は消失した。一方、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、分泌型IgMの存在に関係なく細胞周期をG1期で停止させた。また、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の細胞周期停止作用は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
この結果から、抗IgM抗体をB細胞表面抗原に対する抗体と二重特異性抗体とすることで分泌型IgM存在下でも細胞周期を停止させることが明らかとなった。
実施例6(1)に準じて、分泌型IgMに代えてヒト血清を用い、ヒト血清存在下で抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)及び抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体(1μg/mL)がJeKo-1細胞の細胞周期に与える影響を検討した。具体的には、90%ヒト血清/10%抗体液(抗体の最終濃度は1μg/mL)となるよう、ヒト血清と抗体を混合し、JeKo-1細胞に添加した。ヒト血清非添加群には90%JeKo-1細胞増殖培地/10%抗体液とした。また、陰性対照は抗体液の代わりにPBSを添加した。結果を図13に示す。各図の縦軸は細胞数、横軸は細胞あたりのDNA含有量を示す。
抗HLA-DR抗体(1)はヒト血清の存在に関係なくJeKo-1細胞の細胞周期に影響を与えなかった。抗IgM抗体(1)は、ヒト血清非存在下では細胞周期を停止させたが、ヒト血清を添加することにより細胞周期停止作用は消失した。一方、抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は、ヒト血清の存在に関係なく細胞周期をG1期で停止させた。また、Cys1m型二重特異性抗体とKIH型二重特異性抗体の細胞周期停止作用は同等であり、製造法の違いによる活性の差異はないことが示された。
この結果から、抗IgM抗体をB細胞表面抗原に対する抗体と二重特異性抗体とすることでヒト血清存在下でも細胞周期を停止させることが明らかとなった。
なお、本試験は、2人のヒト血清で試験を実施したが、両ドナーの非働化血清で同等の結果が得られ、ドナーによる違いは認められなかった。
(1)ラットへの抗体投与によるB細胞減少作用
抗HLA-DR抗体(1)は、WKAH/HkmラットのB細胞に結合することが知られている。そこで、抗IgM/HLA-DR(1)二重特異性抗体のラットへの作用を調べた。
抗IgM抗体(1、3、10、30mg/kg)、抗HLA-DR抗体(1)(0.1、0.3、1mg/kg)及び抗IgM/HLA-DR(1)二重特異性抗体(0.1、0.3、1、3、10、30mg/kg)をWKAH/Hkmラットの尾静脈から投与した。投与5時間後に、ラット尾静脈より採血した。PE標識抗ラットCD45RA抗体(BDファーミンゲン)と反応させた後にOptiLyse C(ベックマン・コールター)を用いて溶血処理を行い、血中のB細胞数をフローサイトメーター及び解析ソフトCytomics MXP cytometerを用いて計測した。抗体の代わりにPBSを投与した個体の末梢血中B細胞数を100%とし、各抗体投与後の末梢血B細胞数の変動を算出した。
抗IgM/HLA-DR(1)二重特異性抗体の投与がラット生体内のB細胞に与える影響を図14に示す。抗IgM抗体は10mg/kg以上投与しないとB細胞数が減少しなかったのに対し、抗IgM/HLA-DR(1)二重特異性抗体では0.3mg/kg投与群でもB細胞数を減少させた。抗HLA-DR抗体(1)は0.3mg/kg以上を投与した個体で鎮静、腹臥位などの行動異常が認められ、さらに1mg/kgを投与した個体では、重篤な副作用のため採血不能となった。また、それ以下の投与量ではB細胞の十分な減少効果が認められなかった。以上の結果から、ラット生体内において抗IgM抗体の活性が発揮できない低濃度でも、抗IgM抗体を他のB細胞表面抗原に対する抗体と二重特異性抗体とすることで、B細胞数を減少させることが示された。また、ラット生体内において低濃度でも重篤な副作用が観察される抗B細胞抗原抗体でも、抗IgM抗体と二重特異性抗体とすることにより副作用の発現が抑制され、B細胞数を減少させることが示された。
(1)カニクイザルへの抗体投与によるB細胞減少作用
抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体をカニクイザルへ投与し、その有効性を評価した。抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体をカニクイザル雌1匹の橈側皮静脈内へ投与した。投与は、それぞれ1、3、10、20mg/kgに相当する抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体を低用量から順に、2日に1回実施し、合計4回投与した。初回投与の直前、及び、各投与から24時間後に大腿静脈より採血した。APC標識抗CD20抗体(Biolegend)またはAlexa Fluor 488標識抗CD3抗体(BD Biosciences)を反応させ、B細胞数及びT細胞数をフローサイトメーター(FACS Calibur、BD Biosciences)及び解析ソフトCellQuest Pro(Version6.0、BD Biosciences)を用いて計測すると共に、赤血球及び血小板数を総合血液学検査装置(Siemens healthcare Diagnostics Manufacturing)を用いて計測した。投与前の末梢血中の各血球数を100%とし、各投与後の末梢血中の各血球数を算出した。また、投与期間を通じてサルの症状を観察すると共に試験終了後に剖検により異常所見の有無を観察した。
結果を図15-19に示す。抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は1mg/kg投与により末梢血中のB細胞数が約50%減少した。さらにその効果は濃度依存的に増強し、20mg/kg投与では投与前の約2%まで末梢血中のB細胞を消失させた(図15)。さらに抗体投与後に作製した腋窩リンパ節のヘマトキシリン・エオジン染色において、リンパ節内のリンパ球が占める割合が著しく低下し、リンパ濾胞の萎縮及び胚中心の消失が観察された。一方、B細胞と同様にHLA-DRを細胞膜表面に発現するT細胞は抗体の投与依存的な減少は観察されなかった(図16)。また、HLA-DRを細胞膜表面に発現しない赤血球及び血小板も抗体の投与依存的な減少は観察されなかった(図17、図18)。さらに体温は抗体の投与後も変化せず、ほぼ一定の値を示した(図19)。抗体投与が原因と思われるサルの異常な症状は確認されておらず、剖検の結果からも異常な所見は確認されなかった。
以上の結果は、血中に分泌型IgMが存在するカニクイザル生体内においても抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体は末梢血B細胞の枯渇を引き起こすことを示し、該二重特異性抗体がB細胞性腫瘍だけでなく、正常B細胞に由来するB細胞関連疾患の治療にも有効であることを強く示唆するものである。
抗IgM(1)/HLA-DR(1)二重特異性抗体の親抗体の1つである抗HLA-DR抗体(1)については、実施例6で示した通り、ラットに対する副作用は0.3mg/kgから認められ、さらに1mg/kgの投与で重篤な副作用が認められており、カニクイザルに対しても同様に重篤な副作用を示すことが予想される。しかしながら、以上の結果より、カニクイザル生体内において重篤な副作用が懸念される抗B細胞抗原抗体でも、抗IgM抗体と二重特異性抗体とすることにより、より高い濃度で用いても、副作用の発現が抑制され、B細胞数を減少させることが示された。
実施例7及び8の結果より、抗IgM/B細胞表面抗原二重特異性抗体は、B細胞に対する優れた増殖阻害活性を有するとともに、副作用の面からも顕著な効果を有することが示された。
Claims (13)
- IgMと、HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、BAFF受容体、BCMA及びTACIからなる群より選択されるB細胞表面抗原とに結合する二重特異性抗体。
- 前記IgMに結合する第一の抗原結合部位と、前記B細胞表面抗原に結合する第二の抗原結合部位とを含むものである、請求項1記載の二重特異性抗体。
- キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項1又は2記載の二重特異性抗体。
- 下記(i)~(vi)のいずれかの重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3と、下記(vii)~(xvi)のいずれかの重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3とを含むものである、請求項1~3のいずれか1項記載の二重特異性抗体。
(i)配列番号1~6のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(ii)配列番号48~53のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(iii)配列番号60~65のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(iv)配列番号66~71のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(v)配列番号72~77のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(vi)配列番号78~83のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(vii)配列番号7~12のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(viii)配列番号13~18のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(ix)配列番号19~24のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(x)配列番号25及び26、FDY、並びに配列番号27~29のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(xi)配列番号30~35のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(xii)配列番号36~41のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(xiii)配列番号42~47のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(xiv)配列番号84~89のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(xv)配列番号90~95のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3
(xvi)配列番号96~101のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3 - 上記(i)及び(vii)、(i)及び(viii)、(i)及び(ix)、(i)及び(x)、(i)及び(xi)、(i)及び(xii)、(i)及び(xiii)、(i)及び(xiv)、(i)及び(xv)、(i)及び(xvi)、(ii)及び(vii)、(iii)及び(vii)、(iv)及び(vii)、(v)及び(vii)、並びに(vi)及び(vii)のいずれかの重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3を含む、請求項1~4のいずれか1項記載の二重特異性抗体。
- B細胞の増殖を阻害するものである、請求項1~5のいずれか1項記載の二重特異性抗体。
- 請求項1~6のいずれか1項記載の二重特異性抗体を含有することを特徴とする医薬組成物。
- 請求項1~6のいずれか1項記載の二重特異性抗体を有効成分として含有することを特徴とするB細胞関連疾患治療剤。
- 前記B細胞関連疾患がB細胞性腫瘍である、請求項8記載のB細胞関連疾患治療剤。
- 請求項1~6のいずれか1項記載の二重特異性抗体の、B細胞関連疾患治療剤製造のための使用。
- 前記B細胞関連疾患がB細胞性腫瘍である、請求項10記載の使用。
- B細胞関連疾患の治療に用いるための、請求項1~6のいずれか1項記載の二重特異性抗体。
- 前記B細胞関連疾患がB細胞性腫瘍である、請求項12記載の二重特異性抗体。
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