CN103249833B - 人单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用作人用医药品的抗CD81抗体。具体而言，本发明提供了可以与肽结构域结合的抗人CD81抗体，所述肽结构域由SEQ ID NO：22代表的氨基酸序列中氨基酸编号80至175所代表的氨基酸序列组成。

Description

人单克隆抗体
技术领域
本发明涉及人单克隆抗体分子。具体而言，它涉及针对人CD81的人抗体分子和含有该分子作为有效成分的药物组合物。
背景技术
肠是消化和吸收对生物的生命活动必需的养分和水的器官。同时，它们也是具有用于逐出外来物质(如病原体)的免疫防御性能并且通过以充分平衡的方式控制相反性质而维持生命的器官。然而已知当这些功能的平衡变得反常时，这种动态平衡遭到破坏而引起多种肠病。特别地，炎性肠病(缩写为IBD)(其患者数目近年来已经增加)与消化器官中的异常如腹痛、腹泻、粘血便等相关，并且就其病变状态而言，划分成溃疡性结肠炎和节段性回肠炎。
溃疡性结肠炎是主要显示限于大肠的弥散性肠粘膜炎症的疾病，其中反复炎症导致结直肠癌的发作，通常是需要手术的，并造成排便频率增加、粪便泄露及囊炎(pouchitis)发作的术后问题。节段性回肠炎是一种疾病，其显示从小肠扩展至大肠的病变和从粘膜下层开始的强烈非连续的全部层炎症，其中反复炎症导致需要手术的肠并发症(狭窄、瘘、脓肿)(非专利文献1)。
近年来，已经已知抗TNF-α抗体作为节段性回肠炎和溃疡性结肠炎的治疗剂有效(非专利文献2)。另外，已经报道抗α4整联蛋白抗体那他珠单抗(Natalizumab)作为节段性回肠炎的治疗药有效(非专利文献3)。然而，在包括抗体的现有疗法，40-60％的IBD患者仍没有接受具有令人满意的医学治疗。因而，开发有效治疗药已经成为医疗护理中的迫切要求(非专利文献4)。
CD81是一种在广泛类型细胞中表达的26kDa细胞表面分子。它具有下述活性：通过与B细胞中的CD21、CD19和Leu13形成复合体降低B细胞活化的阈值。在T细胞中，它与CD4和CD8缔合以转导刺激信号至细胞中。考虑到这些因素，认为CD81在针对异源抗原的免疫反应中具有显著作用。另外，它在生理和功能上参与多种整联蛋白以激活B细胞中的VLA-4(α4β1整联蛋白)或胸腺细胞中的LFA-1(αLβ2整联蛋白)。
作为与CD81相关的疾病，丙型肝炎是已知的(非专利文献5)。
近年来，已经报道抗CD81抗体用于IBD的治疗(专利文献1)。IBD与T细胞迁移相关(非专利文献3、6和7)。作为与T细胞迁移相关的其他疾病，多发性硬化和牛皮癣是已知的(非专利文献3、8和9)。
具体而言，已经报道，患有IBD(如节段性回肠炎或溃疡性结肠炎)的患者的肠粘膜层T细胞或外周血T细胞高度表达趋化因子受体CXCR4并且显示出针对趋化因子CXCL12的强烈趋化应答(非专利文献6)，并且通过向IBD模型(硫酸葡聚糖诱导的小鼠结肠炎模型)施用CXCR4抑制剂治愈结肠炎(非专利文献7)，以及通过抑制T细胞迁移治疗IBD的抗α4整联蛋白抗体那他珠单抗已经被批准作为医药品(非专利文献3)。
也已经报道，T细胞迁移对于多发性硬化的动物模型(实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)小鼠)的病理学是重要的(非专利文献8)。认为那他珠单抗在EAE小鼠中通过阻断α4整联蛋白介导的循环T细胞与血脑屏障黏附发挥其治疗功效(非专利文献3)。那他珠单抗也有效用于多发性硬化的治疗。
另外，已经报道，T细胞大量地在牛皮癣皮肤中积累并且抑制T细胞迁移的抗LFA-1抗体依法珠单抗(商品名：Raptiva)有效用于牛皮癣的治疗(非专利文献9)。
当需要向人类临床应用抗CD81抗体时，出现基于物种差异的各种问题。例如，向人施用小鼠抗体可能受血清半寿期短、无法触发某些类型的人类效应子功能和诱导针对小鼠抗体的不利人免疫反应(“人抗小鼠抗体”(HAMA)反应)限制([非专利文献10和11)。另外，甚至抗TNFα抗体(英利昔单抗(Remicade))(其是通过将啮齿类抗体可变(V)区与人抗体恒定(C)区结合所获得的嵌合分子)可能诱导人抗嵌合抗体(HACA)并引起输注反应或药物功效丧失(非专利文献12)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2005/021792
非专利文献
非专利文献1：Inflamm.Bowel.Dis.,8,244-250,2002
非专利文献2：N.Engl.J.Med.,353,2462-2476,2005
非专利文献3：J.Clin.Invest.,118,825-826,2008
非专利文献4：J.Clin.Gastroenterol.,41,799-809,2007
非专利文献5：Science,282,938-941,1998
非专利文献6：Inflamm.BowelDis.,16(4),583-592,2010
非专利文献7：J.Pharmacol.Exp.Ther.,327(2),383-392,2008
非专利文献8：J.Neuroimmunol.,60,17-28,1995
非专利文献9：ExpertOpiniononBiologicalTherapy,3(2),361-370,2003
非专利文献10：Blood,62,988-995,1983
非专利文献11：CancerRes.,45,879-885,1985
非专利文献12：CurrentGastroenterologyReports,5(6),501-505,2003
发明概述
本发明待解决的技术问题
在这样的情况下，需要可以用作医药品的抗CD81抗体。然而，这种抗体是未知的，并且因此，由本发明待解决的技术问题是提供可用做人用医药品的抗CD81抗体。
解决技术问题的手段
在尝试解决上述问题时，发明人已经通过噬菌体文库方法从人互补决定区(CDR)文库制备了完全人抗CD81抗体、评价与这些抗体结合的人CD81区域，并且发现与CD81的某些区域结合的抗体对人体显示优越的功效以及高度安全性，这导致本发明的完成。本发明提供针对人CD81的人单克隆抗体。另外，发明人获得了所述抗CD81抗体抑制T细胞迁移的新研究结果，这揭示本发明的抗体可用于预防、改善或治疗炎性肠病(如节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)和与T细胞迁移相关的疾病(如多发性硬化和牛皮癣)。另外，发明人发现本发明的抗体不仅能够只与表达CD81的癌细胞结合，还具有细胞毒效应，这归因于该抗体对与之结合的癌细胞的补体依赖细胞毒性(CDC)，并且因此也可用于预防、缓解或治疗由表达CD81的癌细胞引起的癌症，包括血液癌症(也称为血液的癌症、血癌、血液癌)。
因而，本发明如下。
抗人CD81抗体，所述抗体能够结合由SEQIDNO:22所示的氨基酸序列中氨基酸编号80至175的氨基酸序列组成的肽区域。
[1]的抗体，其中所述肽区域由氨基酸编号113至175的氨基酸序列组成。
[1]或[2]的抗体，其中所述抗体对选自以下(1)至(13)的至少一种人CD81变体的结合亲和力小于对具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81的结合亲和力的40%，
(1)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号127处的酪氨酸以苯丙氨酸或色氨酸替换的CD81变体；
(2)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号130处的丙氨酸以苏氨酸或缬氨酸替换的CD81变体；
(3)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号135处的缬氨酸以丙氨酸或亮氨酸替换的CD81变体；
(4)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号137处的天冬氨酸以丙氨酸或谷氨酸替换的CD81变体；
(5)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号143处的丙氨酸以苏氨酸或缬氨酸替换的CD81变体；
(6)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号151处的组氨酸以丙氨酸或精氨酸替换的CD81变体；
(7)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号154处的亮氨酸以丙氨酸或异亮氨酸替换的CD81变体；
(8)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号158处的甘氨酸以丙氨酸或丝氨酸替换的CD81变体；
(9)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号164处的丙氨酸以苏氨酸或缬氨酸替换的CD81变体；
(10)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号168处的丝氨酸以丙氨酸或苏氨酸替换的CD81变体；
(11)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号169处的缬氨酸以丙氨酸或亮氨酸替换的CD81变体；
(12)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号170处的亮氨酸以丙氨酸或异亮氨酸替换的CD81变体；和
(13)具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的、其中在氨基酸编号172处的天冬酰胺以丙氨酸或谷氨酰胺替换的CD81变体。
[1]至[3]中任一项的抗体，其中所述抗体对以上确定的人CD81变体(9)和(11)中每一种人CD81变体的结合亲和力小于对具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81的结合亲和力的40%。
抗体，其具有与[1]至[4]中任一项的抗体等同的结合特性，或者与[1]至[4]中任一项的抗体竞争地结合具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
抗体，其与[1]至[4]中任一项的抗体竞争地结合具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81并且具有T细胞迁移的抑制作用。
抗人CD81抗体，其包含在以下组1至24的任一个组中所述的全部6个CDR：
组1
(a-1)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-1)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-1)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-1)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-1)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-1)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组2
(a-2)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-2)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-2)包含SEQIDNO:37中所示氨基酸序列的CDR，
(d-2)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-2)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-2)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组3
(a-3)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-3)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-3)包含SEQIDNO:40中所示氨基酸序列的CDR，
(d-3)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-3)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-3)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组4
(a-4)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-4)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-4)包含SEQIDNO:43中所示氨基酸序列的CDR3，
(d-4)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-4)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-4)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组5
(a-5)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-5)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-5)包含SEQIDNO:46中所示氨基酸序列的CDR6，
(d-5)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-5)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-5)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组6
(a-6)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-6)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-6)包含SEQIDNO:49中所示氨基酸序列的CDR，
(d-6)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-6)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-6)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组7
(a-7)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-7)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-7)包含SEQIDNO:52中所示氨基酸序列的CDR，
(d-7)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-7)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-7)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组8
(a-8)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-8)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-8)包含SEQIDNO:43中所示氨基酸序列的CDR，
(d-8)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-8)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-8)包含SEQIDNO:55中所示氨基酸序列的CDR
组9
(a-9)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的CDR，
(b-9)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-9)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-9)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-9)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-9)包含SEQIDNO:61中所示氨基酸序列的CDR
组10
(a-10)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-10)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-10)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-10)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-10)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-10)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组11
(a-11)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-11)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-11)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-11)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-11)包含SEQIDNO:69中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-11)包含SEQIDNO:70中所示氨基酸序列的CDR，
组12
(a-12)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的CDR，
(b-12)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-12)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-12)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-12)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-12)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR，
组13
(a-13)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-13)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-13)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-13)包含SEQIDNO:77中所示氨基酸序列的CDR，
(e-13)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-13)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组14
(a-14)包含SEQIDNO:80中所示氨基酸序列的CDR，
(b-14)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
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(f-14)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
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(b-15)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-15)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-15)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-15)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-15)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组16
(a-16)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-16)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-16)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的CDR，
(d-16)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-16)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-16)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组17
(a-17)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-17)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-17)包含SEQIDNO:52中所示氨基酸序列的CDR，
(d-17)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-17)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-17)包含SEQIDNO:93中所示氨基酸序列的CDR，
组18
(a-18)包含SEQIDNO:98中所示氨基酸序列的CDR，
(b-18)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-18)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-18)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-18)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-18)包含SEQIDNO:99中所示氨基酸序列的CDR，
组19
(a-19)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的CDR，
(b-19)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-19)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-19)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-19)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-19)包含SEQIDNO:99中所示氨基酸序列的CDR，
组20
(a-20)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-20)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-20)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的CDR，
(d-20)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-20)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-20)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR，
组21
(a-21)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-21)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-21)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-21)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-21)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-21)包含SEQIDNO:55中所示氨基酸序列的CDR，
组22
(a-22)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-22)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-22)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-22)包含SEQIDNO:110中所示氨基酸序列的CDR，
(e-22)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-22)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组23
(a-23)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-23)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-23)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-23)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-23)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-23)包含SEQIDNO:115中所示氨基酸序列的CDR
组24
(a-24)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-24)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-24)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的CDR，
(d-24)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-24)包含SEQIDNO:120中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-24)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR。
[7]的抗体，其包含在以下组25至48的任一个组中所述的轻链可变区和重链可变区的组合。
组25
(g-1)包含以上确定的CDR(a-1)至(c-1)的轻链可变区；和
(h-1)包含以上确定的CDR(d-1)至(f-1)的重链可变区，
组26
(g-2)包含以上确定的CDR(a-2)至(c-2)的轻链可变区；和
(h-2)包含以上确定的CDR(d-2)至(f-2)的重链可变区，
组27
(g-3)包含以上确定的CDR(a-3)至(c-3)的轻链可变区；和
(h-3)包含以上确定的CDR(d-3)至(f-3)的重链可变区，
组28
(g-4)包含以上确定的CDR(a-4)至(c-4)的轻链可变区；和
(h-4)包含以上确定的CDR(d-4)至(f-4)的重链可变区，
组29
(g-5)包含以上确定的CDR(a-5)至(c-5)的轻链可变区；和
(h-5)包含以上确定的CDR(d-5)至(f-5)的重链可变区，
组30
(g-6)包含以上确定的CDR(a-6)至(c-6)的轻链可变区；和
(h-6)包含以上确定的CDR(d-6)至(f-6)的重链可变区，
组31
(g-7)包含以上确定的CDR(a-7)至(c-7)的轻链可变区；和
(h-7)包含以上确定的CDR(d-7)至(f-7)的重链可变区，
组32
(g-8)包含以上确定的CDR(a-8)至(c-8)的轻链可变区；和
(h-8)包含以上确定的CDR(d-8)至(f-8)的重链可变区，
组33
(g-9)包含以上确定的CDR(a-9)至(c-9)的轻链可变区；和
(h-9)包含以上确定的CDR(d-9)至(f-9)的重链可变区，
组34
(g-10)包含以上确定的CDR(a-10)至(c-10)的轻链可变区；和(h-10)包含以上确定的CDR(d-10)至(f-10)的重链可变区，
组35
(g-11)包含以上确定的CDR(a-11)至(c-11)的轻链可变区；和(h-11)包含以上确定的CDR(d-11)至(f-11)的重链可变区，
组36
(g-12)包含以上确定的CDR(a-12)至(c-12)的轻链可变区；和(h-12)包含以上确定的CDR(d-12)至(f-12)的重链可变区，
组37
(g-13)包含以上确定的CDR(a-13)至(c-13)的轻链可变区；和
(h-13)包含以上确定的CDR(d-13)至(f-13)的重链可变区，
组38
(g-14)包含以上确定的CDR(a-14)至(c-14)的轻链可变区；和
(h-14)包含以上确定的CDR(d-14)至(f-14)的重链可变区，
组39
(g-15)包含以上确定的CDR(a-15)至(c-15)的轻链可变区；和
(h-15)包含以上确定的CDR(d-15)至(f-15)的重链可变区，
组40
(g-16)包含以上确定的CDR(a-16)至(c-16)的轻链可变区；和
(h-16)包含以上确定的CDR(d-16)至(f-16)的重链可变区，
组41
(g-17)包含以上确定的CDR(a-17)至(c-17)的轻链可变区；和
(h-17)包含以上确定的CDR(d-17)至(f-17)的重链可变区，
组42
(g-18)包含以上确定的CDR(a-18)至(c-18)的轻链可变区；和
(h-18)包含以上确定的CDR(d-18)至(f-18)的重链可变区，
组43
(g-19)包含以上确定的CDR(a-19)至(c-19)的轻链可变区；和
(h-19)包含以上确定的CDR(d-19)至(f-19)的重链可变区，
组44
(g-20)包含以上确定的CDR(a-20)至(c-20)的轻链可变区；和
(h-20)包含以上确定的CDR(d-20)至(f-20)的重链可变区，
组45
(g-21)包含以上确定的CDR(a-21)至(c-21)的轻链可变区；和
(h-21)包含以上确定的CDR(d-21)至(f-21)的重链可变区，
组46
(g-22)包含以上确定的CDR(a-22)至(c-22)的轻链可变区；和
(h-22)包含以上确定的CDR(d-22)至(f-22)的重链可变区，
组47
(g-23)包含以上确定的CDR(a-23)至(c-23)的轻链可变区；和
(h-23)包含以上确定的CDR(d-23)至(f-23)的重链可变区，
组48
(g-24)包含以上确定的CDR(a-24)至(c-24)的轻链可变区；和
(h-24)包含以上确定的CDR(d-24)至(f-24)的重链可变区。
[8]的抗体，其包含在以下组49至72的任一个组中所述的轻链可变区和重链可变区的组合。
组49
(i-1)包含SEQIDNO:8中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-1)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组50
(i-2)包含SEQIDNO:38中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-2)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组51
(i-3)包含SEQIDNO:41中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-3)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组52
(i-4)包含SEQIDNO:44中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-4)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组53
(i-5)包含SEQIDNO:47中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-5)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组54
(i-6)包含SEQIDNO:50中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-6)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组55
(i-7)包含SEQIDNO:53中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-7)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组56
(i-8)包含SEQIDNO:56中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-8)包含SEQIDNO:57中所示氨基酸序列的重链可变区，
组57
(i-9)包含SEQIDNO:62中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-9)包含SEQIDNO:63中所示氨基酸序列的重链可变区，
组58
(i-10)包含SEQIDNO:67中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-10)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组59
(i-11)包含SEQIDNO:71中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-11)包含SEQIDNO:72中所示氨基酸序列的重链可变区，
组60
(i-12)包含SEQIDNO:75中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-12)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组61
(i-13)包含SEQIDNO:8中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-13)包含SEQIDNO:78中所示氨基酸序列的重链可变区，
组62
(i-14)包含SEQIDNO:82中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-14)包含SEQIDNO:83中所示氨基酸序列的重链可变区，
组63
(i-15)包含SEQIDNO:86中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-15)包含SEQIDNO:87中所示氨基酸序列的重链可变区，
组64
(i-16)包含SEQIDNO:91中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-16)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组65
(i-17)包含SEQIDNO:94中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-17)包含SEQIDNO:95中所示氨基酸序列的重链可变区，
组66
(i-18)包含SEQIDNO:100中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-18)包含SEQIDNO:101中所示氨基酸序列的重链可变区，
组67
(i-19)包含SEQIDNO:104中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-19)包含SEQIDNO:101中所示氨基酸序列的重链可变区，
组68
(i-20)包含SEQIDNO:106中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-20)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组69
(i-21)包含SEQIDNO:108中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-21)包含SEQIDNO:57中所示氨基酸序列的重链可变区，
组70
(i-22)包含SEQIDNO:111中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-22)包含SEQIDNO:112中所示氨基酸序列的重链可变区，
组71
(i-23)包含SEQIDNO:116中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-23)包含SEQIDNO:117中所示氨基酸序列的重链可变区，
组72
(i-24)包含SEQIDNO:121中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-24)包含SEQIDNO:122中所示氨基酸序列的重链可变区。
[8]或[9]的抗体，其包含在以下组73至96的任一个组中所述的轻链和重链的组合：
组73
(k-1)包含SEQIDNO:26中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-1)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组74
(k-2)包含SEQIDNO:39中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-2)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组75
(k-3)包含SEQIDNO:42中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-3)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组76
(k-4)包含SEQIDNO:45中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-4)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组77
(k-5)包含SEQIDNO:48中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-5)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组78
(k-6)包含SEQIDNO:51中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-6)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组79
(k-7)包含SEQIDNO:54中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-7)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组80
(k-8)包含SEQIDNO:58中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-8)包含SEQIDNO:59中所示氨基酸序列的重链，
组81
(k-9)包含SEQIDNO:64中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-9)包含SEQIDNO:65中所示氨基酸序列的重链，
组82
(k-10)包含SEQIDNO:68中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-10)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组83
(k-11)包含SEQIDNO:73中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-11)包含SEQIDNO:74中所示氨基酸序列的重链，
组84
(k-12)包含SEQIDNO:76中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-12)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组85
(k-13)包含SEQIDNO:26中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-13)包含SEQIDNO:79中所示氨基酸序列的重链，
组86
(k-14)包含SEQIDNO:84中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-14)包含SEQIDNO:85中所示氨基酸序列的重链，
组87
(k-15)包含SEQIDNO:88中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-15)包含SEQIDNO:89中所示氨基酸序列的重链，
组88
(k-16)包含SEQIDNO:92中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-16)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组89
(k-17)包含SEQIDNO:96中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-17)包含SEQIDNO:97中所示氨基酸序列的重链，
组90
(k-18)包含SEQIDNO:102中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-18)包含SEQIDNO:103中所示氨基酸序列的重链，
组91
(k-19)包含SEQIDNO:105中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-19)包含SEQIDNO:103中所示氨基酸序列的重链，
组92
(k-20)包含SEQIDNO:107中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-20)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组93
(k-21)包含SEQIDNO:109中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-21)包含SEQIDNO:59中所示氨基酸序列的重链，
组94
(k-22)包含SEQIDNO:113中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-22)包含SEQIDNO:114中所示氨基酸序列的重链，
组95
(k-23)包含SEQIDNO:118中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-23)包含SEQIDNO:119中所示氨基酸序列的重链，
组96
(k-24)包含SEQIDNO:123中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-24)包含SEQIDNO:124中所示氨基酸序列的重链。
抗体，其与[7]至[10]中任一项的抗体竞争地结合具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
[11]的抗体，其具有T细胞迁移的抑制作用。
抗人CD81抗体，其中所述抗体包含在[7]的组1至24任一组中所述的一个或多个CDR并且与包含在所述组中所述的全部6个CDR的抗体竞争地结合具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
抗人CD81抗体，其中所述抗体与[7]的任一种抗体具有90%序列同源性并且与所述抗体竞争地结合具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
抗人CD81抗体，其包含：
(a-25)包含SEQIDNO:11中所示氨基酸序列的CDR；
(b-25)包含SEQIDNO:12中所示氨基酸序列的CDR；
(c-25)包含SEQIDNO:13中所示氨基酸序列的CDR；
(d-25)包含SEQIDNO:14中所示氨基酸序列的CDR；
(e-25)包含SEQIDNO:15中所示氨基酸序列的CDR；和
(f-25)包含SEQIDNO:16中所示氨基酸序列的CDR。
[15]的抗体，其包含：
(g-25)包含以上确定的CDR(a-25)至(c-25)的轻链可变区；和
(h-25)包含以上确定的CDR(d-25)至(f-25)的重链可变区。
[16]的抗体，其包含：
(i-25)包含SEQIDNO:18中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-25)包含SEQIDNO:20中所示氨基酸序列的重链可变区。
[16]或[17]的抗体，其包含：
(k-25)包含SEQIDNO:30中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-25)包含SEQIDNO:32中所示氨基酸序列的重链。
抗体，其与[15]至[18]中任一项的抗体竞争地结合具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
[19]的抗体，其具有T细胞迁移的抑制作用。
抗人CD81抗体，其中所述抗体包含在[15]中的一个或多个CDR并且与包含在[15]中描述的抗体竞争地结合具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
抗人CD81抗体，其中所述抗体与[15]中所述的抗体具有90%序列同源性并且与所述抗体竞争地结合具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81。
[1]至[6]、[11]至[14]和[19]至[22]中任一项的抗体，其是人源化抗体或人抗体。
[7]至[10]和[15]至[18]中任一项的抗体，其是人源化抗体或人抗体。
包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码[1]至[24]中任一项的抗体的重链可变区和轻链可变区。
以下两种多核苷酸的组合，所述多核苷酸包含编码[1]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一项的抗体的重链可变区的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含编码[1]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一项的抗体的轻链可变区的核苷酸序列。
以下两种多核苷酸的组合，所述多核苷酸包含编码[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一项的抗体的重链可变区的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含编码[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一项的抗体的相应轻链可变区的核苷酸序列。
包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码[1]至[24]中任一项的抗体的重链和轻链。
以下两种多核苷酸的组合，所述多核苷酸包含编码[1]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一项的抗体的重链的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含编码[1]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一项的抗体的轻链的核苷酸序列。
以下两种多核苷酸的组合，所述多核苷酸包含编码[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一项的抗体的重链的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含编码[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一项的抗体的相应轻链的核苷酸序列。
表达载体，其包含[25]或[28]的多核苷酸。
重组细胞，用[31]的表达载体转化。
用以下两种表达载体转化的重组细胞，所述表达载体包含含有编码[1]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一项的抗体的重链的核苷酸序列的多核苷酸，和所述表达载体包含含有编码[1]至[6]、[11]至[14]和[19]至[23]中任一项的抗体的轻链的核苷酸序列的多核苷酸。
用以下两种表达载体转化的重组细胞，所述表达载体包含含有编码[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一项的抗体的重链的核苷酸序列的多核苷酸，和所述表达载体包含含有编码[7]至[10]、[15]至[18]和[24]中任一项所述的抗体的相应轻链的核苷酸序列的多核苷酸。
产生抗人CD81抗体的方法，包括培养[32]至[34]中任一项的重组细胞，和从获得的培养上清回收抗体。
药物组合物，其包含[1]至[24]中任一项所述的抗体。
用于预防、改善或治疗选自炎性肠病、多发性硬化、牛皮癣和血液癌症的疾病的药剂，其包含[1]至[24]中任一项的抗体。
[1]至[3]中任一项的抗体，其中所述抗体对以上确定的人CD81变体(3)、(4)、(8)、(11)和(12)中每一种的结合亲和力小于对具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81的结合亲和力的40%。
[1]至[3]中任一项的抗体，其中所述抗体对以上确定的人CD81变体(3)、(4)、(6)和(8)至(13)中每一种的结合亲和力小于对具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81的结合亲和力的40%。
[1]至[3]中任一项的抗体，其中所述抗体对以上确定的人CD81变体(1)至(5)、(7)、(8)、(11)和(12)中每一种的结合亲和力小于对具有SEQIDNO:22中所示氨基酸序列的人CD81的结合亲和力的40%。
发明的效果
本发明可以提供针对人CD81的人单克隆抗体，其具有对人的优越药物功效和低免疫原性。由于发明人获得了新研究结果：所述抗CD81抗体抑制T细胞迁移并且还对癌细胞显示出细胞毒效应，因此本发明的抗体也可用于预防、改善或治疗炎性疾病(包括炎性肠病)和与T细胞迁移相关的疾病(包括自身免疫疾病，如多发性硬化和牛皮癣)，以及由表达CD81的癌细胞引起的癌症(包括血液癌症)。
实施方案的描述
在本说明书中，遵循IUPAC-IUB的定义[IUPAC-IUB生物学命名委员会名,Eur.J.Biochem.,138:9(1984)]、“用于准备含有核苷酸序列或氨基酸序列的说明书等的指南(Guidelineforpreparingspecificationandthelikecontainingnucleotidesequenceoraminoacidsequence)”(日本专利局编辑)和本领域中所用的常规标记，使用缩写的标示表示如氨基酸，(多)肽，(多)核苷酸等。
本文中，“基因”或“DNA”以这样的含义使用，从而它不仅包括双链DNA，还包括相应单链DNA、构成双链DNA的有义链和反义链。它不特别地受其长度限制。因而，除非另外说明，否则本说明书中的基因(DNA)包括双链DNA(包括人基因组DNA)、单链DNA(正链)(包括cDNA)、具有与所述正链互补的序列的单链DNA(互补链)、及它们的片段。
本文中，术语“CD81基因”意指由SEQIDNO:21显示的人CD81基因(DNA)或其天然存在的突变体或多态性变体(除了作为突变或多态性的结果，编码下文所述的突变体蛋白(1)至(13)中任一种的那些变体之外)。这类突变体或多态性变体包括例如在从NCBI可获得的SNP数据库中登记的那些。
这里，术语“CD81蛋白”或简单地“CD81”意指由SEQIDNO:22显示的人CD81蛋白，或由上文提到的天然存在突变体DNA或多态性变体DNA编码的蛋白质。
本文中所用的“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体或能够与其抗原结合的其部分如Fab片段或从Fab表达文库产生的片段。
这里，术语“表位”是与抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，它包括抗原上能够与免疫球蛋白或T细胞受体或B细胞受体特异性结合的任何位点。抗原决定簇包括化学活跃的分子表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构性特征，和/或特定的电荷特征。在某些实施方案中，可以提到当抗体优先地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中其靶抗原时，称作这种抗体与其抗原特异性结合。
抗体的结构
抗体分子的基本结构由全部类别共有并且由具有50000至70000分子量的重链和具有20000至30000分子量的轻链组成(Immunology第4版,I.Roitt,J.Brostoff,D.Male编著,Mosby-YearBook,1996)。重链通常由包含约440个氨基酸的多肽链组成；重链在每个不同类别中具有特征性结构并且称作γ、μ、α、δ和ε链，对应于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。另外，IgG作为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4出现并且相应的链分别称作γ1、γ2、γ3和γ4。轻链通常由包含约220个氨基酸的多肽链组成；两个型L型和K型是已知的并且分别称作λ链和κ链。就抗体分子基本结构的肽构型而言，两条同源重链和两条同源轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键键结，并且分子量是150000至190000。两个种类的轻链能够与任何重链配对。每个抗体分子总是由两条相同轻链和两条相同重链组成。
重链中存在4个分子内S-S键(μ链和ε链的5个键)和轻链中存在2个分子内S-S键；每100至110个氨基酸残基形成一个环，并且这种立体结构在各环之间是类似的，并且称作结构单元或结构域。对于重链和轻链，位于N末端处的结构域的氨基酸序列是不定的，甚至在来自相同动物物种的相同类(亚类)的制备物中也是如此，并且这种结构域称作可变区(V区)(重链可变区结构域称作VH并且轻链可变区结构域称作VL)。在其C端侧的氨基酸序列在每个类或亚类中是几乎恒定的，并且称作恒定区(C区域)(这些结构域分别表述为CH1、CH2、CH3和CL)。
抗体的抗原决定位点由VH和VL组成，并且结合特异性取决于这个位点的氨基酸序列。在另一方面，生物学活性如(与互补物或多种细胞的结合作用)反映多种Ig类别之间C区域结构的差异。轻链和重链的可变区的变异性已经发现几乎限于在两条链中存在的3个小的高变区内，并且这些区域称作互补决定区(CDR)。常使用几种编号系统用于确定CDR。Kabat定义基于序列变异性，并且Chothia定义基于结构性环区域的位置。AbM定义是Kabat方案和Chothia方案之间的折衷。轻链可变区和重链可变区的CDR根据Kabat、Chothia或AbM算法(Martin等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272；Martin等人,(1991)MethodsEnzymol.203:121-153；Pedersen等人,(1992)Immunomethods1:126；和Rees等人,(1996)引自SternbergM.J.E.(编著),ProteinStructurePrediction,OxfordUniversityPress,Oxford,第141-172页)进行界定。
在002-A07抗体的情况下，重链可变区中的CDR由SEQIDNO:10所显示的氨基酸序列的氨基酸编号29-42(CDR1-H)、49-67(CDR2-H)和97-108(CDR3-H)处的残基界定，并且轻链可变区中的CDR由SEQIDNO:8所显示的氨基酸序列的氨基酸编号22-36(CDR1-L)、52-58(CDR2-L)和90-101(CDR3-L)处的残基界定。在005-C01抗体的情况下，重链可变区中的CDR由SEQIDNO:20所显示的氨基酸序列的氨基酸编号29-42(CDR1-H)、49-67(CDR2-H)和97-102(CDR3-H)处的残基界定，并且轻链可变区中的CDR由SEQIDNO:18所显示的氨基酸序列的氨基酸编号22-35(CDR1-L)、51-57(CDR2-L)和89-99(CDR3-L)处的残基界定。
除可变区的CDR之外的部分称作框架区(FR)，是相对恒定的。框架区采用β折叠构象，并且CDR可以形成连接β折叠结构的环。每条链中的CDR由框架区以其三维结构维持并且与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。
抗体的结合测定法
抗体结合可以通过任何已知测定法，如直接和间接夹心测定法、流式细胞术和免疫沉淀测定法证实(Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.,1987,第147-158页)。在本发明中，例如通过以下方法，可以测量抗人CD81单克隆抗体与人CD81多肽或与在表面呈递该多肽的细胞的结合。
作为常见方法，例举一种方法，其包括将人CD81多肽(抗原)吸附到固相上，用不参与后续抗原-抗体反应或酶反应的蛋白质(例如，脱脂乳、白蛋白等)封闭该固相，使人抗人CD81单克隆抗体(测试抗体)与固相接触并孵育，通过B/F分离移除未反应的抗体，并且向固相添加与测试抗体(例如，抗人IgG等)特异性反应的标记第二抗体以确定固相上标记物的量。作为固相，例如，可以使用不溶性多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素、合成树脂如塑料、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅氧烷(例如，管、微量平板等)或玻璃(珠、管等)。表达人CD81多肽的细胞的膜部分可以用作待吸附到固相上的抗原，如下文描述的试验例7(2)中显示。作为用于固定的手段，可以将抗原重组地表达为具有肽(例如，His-标签、GST、MBP等)的融合蛋白，所述肽能够与固相(Ni-、谷胱甘肽-、麦芽糖载体等)结合并且与固相亲和结合，如试验例7(2)中显示。作为标记物质，可以使用放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。作为放射性同位素的实例，可以提到[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。作为酶的实例，优选具有高比活性的稳定酶；例如，可以提到β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等。作为荧光物质的实例，可以提到荧光胺、异硫氰酸荧光素等。作为发光物质的实例，可以提到鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精(lucigenin)等。
在夹心方法中，固定的抗人CD81抗体(其与人CD81在与本发明抗体结合的位点不同的位点处结合)与人CD81多肽(抗原)反应，并且还与抗人CD81单克隆抗体(测试抗体)反应。在通过B/F分离移除未反应的抗体后，添加与测试抗体(例如，抗人IgG等)特异性反应的标记第二抗体以确定标记物在固相上的量。标记物质和固相可以与上文提到的相同。
为检验抗人CD81单克隆抗体与表达人CD81多肽的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简而言之，(在标准生长条件下培育的)表达人CD81的细胞可以在例如含有0.1%BSA的PBS中与抗人CD81抗体(测试抗体)混合并在37°C孵育1小时。在洗涤后，使细胞在与测试抗体反应相同的条件下同荧光标记的(如荧光素或藻红蛋白(PE))标记的第二抗体(例如，抗人IgG抗体)反应。使用光散射特性和侧向散射特性以便对单个细胞设门，可以通过流式细胞仪分析样品。例如，当拥有比使用非特异性抗体(例如，人IgG)时更大的荧光强度的细胞的百分比是90%或更高、优选地是95%或更高、更优选地是97%或更高时，可以证实测试抗体与抗原特异性结合。除流式细胞术测定法之外或取而代之，可以使用利用荧光显微术的备选测定法。细胞可以完全如上文所述那样染色并且由荧光显微术检验。这种方法允许各个细胞的可视化。
竞争性测定
竞争性测定法如竞争性ELISA可以用来确定抗人CD81抗体的结合常数(Ka)或鉴定与已经获得的本发明抗体(已知抗体)竞争地结合人CD81的另一种本发明抗体。通过以下方式实施竞争性测定法：通过在上文提到的使用抗原固定化固相的结合测定法中，将游离抗原或已知抗体添加至固相和测试抗体的反应体系中而实施。例如，使给定浓度的测试抗体溶液和其中向这种测试抗体溶液添加了多种浓度抗原的混合物分别与抗原固定的固相接触并且孵育，并且测量相应固相上的标记物的量。可以基于相应抗原浓度的测量值，将结合常数计算为显示斯卡查德分析结果的图的斜率。在另一方面，可以通过以下方式鉴定与本发明抗体竞争地结合人CD81的抗体：使标记的已知抗体(本发明的抗体)和多种浓度的测试抗体与抗原固定的固相反应，并且选择以剂量依赖性方式减少固相上标记物的量的测试抗体。
本发明的抗体
本发明的抗体是一种能够与肽区域结合的抗人CD81抗体，所述肽区域由SEQIDNO:22中所示的氨基酸序列中氨基酸编号80至175、优选地113至175的氨基酸序列组成，或者是一种与所抗人CD81抗体竞争地结合人CD81的抗体，所述人CD81由SEQIDNO:22中所示的氨基酸序列组成。SEQIDNO:22中所示的氨基酸序列是人CD81蛋白的报道的氨基酸序列(EMBOJ.,20:12-18,2001)并且NCBI数据库中登记为RefseqID:NP_004347。下文，由这种氨基酸序列组成的蛋白质也称作“天然存在的人CD81”、“野生型CD81”或“野生型人CD81”。
本发明是基于以下研究结果：识别上文作为表位提到的肽区域的抗人CD81抗体产生治疗作用如抑制T细胞迁移，而无副作用或副作用少。
本发明的抗体可以是任何单克隆抗体，只要它与上文提到的野生型人CD81的特定肽区域结合，或与结合这种肽区域的抗体竞争性地结合野生型人CD81。
表位分析
可以根据多种已知的方法实施表位分析(EpitopeMappingProtocols/第2版，MikeSchutkowski，UlrichReineke,AnnNYAcadSci.2010Jan;1183:267-87)。针对抗体的更详细表位分析可以通过结合抑制测定法、同源物扫描法和/或丙氨酸扫描法进行(例如，见JP2009-159948A,Science,244:1081-1085(1989))。
丙氨酸扫描法是一种通过以下方式确定人CD81的每个氨基酸残基对于与其抗体结合是否为必需的方法：制备突变体，其中野生型人CD81的每个氨基酸残基以丙氨酸替换，并且检测抗体在针对CD81突变体和针对野生型人CD81的结合活性方面的差异。
同源物扫描法是一种通过将野生型人CD81多肽的至少一个氨基酸残基替换为其他同源氨基酸，确定可以插入、替换或缺失哪个氨基酸残基而不对活性造成不利影响的方法。在这种方法中，将人CD81多肽的氨基酸序列与已知的同源蛋白质分子的那些氨基酸序列比较，并且使得在具有高度同源性的区域内部产生的氨基酸变化的数目最小化(ProteinScience,(2005),14,2405)。
在本发明中实施的同源物扫描法和丙氨酸扫描法诱变(见试验例8和9等)已经揭示，用其他氨基酸替换在上文提到的肽区域内的特定氨基酸残基明显降低抗人CD81抗体对人CD81突变体的结合亲和力。这些研究结果显示，替换的氨基酸残基主要对该抗体与野生型人CD81的结合作出贡献。
因此，在一个优选的实施方案中的，本发明抗体的特征在于当其针对上述野生型人CD81的结合亲和力是100%时，其针对选自以下(1)至(13)的至少一种CD81变体的结合亲和力小于40%：
(1)其中野生型人CD81的第127位酪氨酸(Y)以苯丙氨酸或色氨酸替换的CD81变体（Y127F或Y127W）；
(2)其中野生型人CD81的第130位丙氨酸(A)以苏氨酸或缬氨酸替换的CD81变体（A130T或A130V）；
(3)其中野生型人CD81的第135位缬氨酸(V)以丙氨酸或亮氨酸替换的CD81变体（V135A或V135L）；
(4)其中野生型人CD81的第137位天冬氨酸(D)以丙氨酸或谷氨酸替换的CD81变体（D137A或D137E）；
(5)其中野生型人CD81的第143位丙氨酸(A)以苏氨酸或缬氨酸替换的CD81变体（A143T或A143V）；
(6)其中野生型人CD81的第151位组氨酸(H)以丙氨酸或精氨酸替换的CD81变体（H151A或H151R）；
(7)其中野生型人CD81的第154位亮氨酸(L)以丙氨酸或异亮氨酸替换的CD81变体（L154A或L154I）；
(8)其中野生型人CD81的第158位甘氨酸(G)以丙氨酸或丝亮氨酸替换的CD81变体（G158A或G158S）；
(9)其中野生型人CD81的第164位丙氨酸(A)以苏氨酸或缬氨酸替换的CD81变体（A164T或A164V）；
(10)其中野生型人CD81的第168位丝氨酸(S)以丙氨酸或苏亮氨酸替换的CD81变体（S168A或S168T）；
(11)其中野生型人CD81的第169位缬氨酸(V)以丙氨酸或亮氨酸替换的CD81变体（V169A或V169L）；
(12)其中野生型人CD81的第170位亮氨酸(L)以丙氨酸或异亮氨酸替换的CD81变体（L170A或L170I）；
(13)其中野生型人CD81的第172位天冬酰胺(N)以丙氨酸或谷氨酰胺替换的CD81变体（N172A或N172Q）；
其中将待替换的氨基酸残基的位置确定为SEQIDNO:22中所显示的氨基酸序列的氨基酸编号。
这里，可以通过以下试验例的描述或已知方法产生上述CD81变体，例如将造成氨基酸替换的合适核苷酸变化导入编码野生型人CD81多肽的DNA中或化学地合成所需的变体多肽。在此描述的人CD81多肽的突变可以通过例如美国专利号5,364,934中所显示的技术或指南涉及保守或非保守突变形成(例如，见本发明的试验例8和9)。
可以通过上文描述的多种结合测定法确定抗体针对野生型或突变人CD81的结合亲和力。本发明抗体针对野生型人CD81的结合常数(Ka)是至少1x107M-1、优选地1x108M-1、更优选地1x109M-1、甚至更优选地1x1010M-1。可以通过上文描述的竞争性测定法或其他熟知方法如表面等离子体共振法(SPR)确定抗体的结合常数。
更优选地，本发明的抗体是这样的抗体，其针对上文人CD81变体(9)和(11)中每一者的结合亲和力小于针对野生型人CD81的结合亲和力的40%。本发明的抗体也是这样的抗体，其针对上文人CD81变体(3)、(4)、(9)和(11)中每一者的结合亲和力小于针对野生型人CD81的结合亲和力的40%，针对上文人CD81变体(3)、(4)、(9)、(10)和(11)中每一者的结合亲和力小于40%，针对上文人CD81变体(3)、(4)、(8)、(9)、(10)和(11)中每一者的结合亲和力小于40%，或者针对上文人CD81变体(3)、(4)、(6)、(8)、(9)、(10)、(11)和(12)中每一者的结合亲和力小于40%。在下文(i)中详述拥有结合特征的一系列抗体。在包含属于组1(其代表在下文(i)中描述的本发明实施方案的具体模式)的全部6个CDR的抗体情况下，针对人CD81变体(3)、(4)、(6)和(8)至(13)中每一者的结合亲和力小于40%。
在另一个优选实施方案中，本发明的抗体是这样的抗体，其针对上文人CD81变体(1)至(5)、(7)、(8)、(11)和(12)中每一者的结合亲和力小于针对野生型人CD81的结合亲和力的40%。在下文(ii)中详述拥有结合特征的一系列抗体。由这种抗体和在下文(i)中所述的实施方案的具体模式中的前述抗体(其结合亲和力小于针对野生型人CD81的结合亲和力的40%)共有的人CD81变体分别是上文的人CD81变体(3)、(4)、(8)、(11)和(12)。
本发明也提供与上文描述的任何本发明抗体竞争地结合野生型人CD81的抗体。这种抗体可以与野生型人CD81抗体在下述区域内结合，所述区域含有在SEQIDNO:22中所示的氨基酸序列中氨基酸编号80-175的氨基酸区域外部的氨基酸，只要它对T细胞迁移具有抑制作用和/或对表达CD81的癌细胞具有细胞毒效应。尽管合乎需要的是，对T细胞迁移的抑制作用和对表达CD81的癌细胞的细胞毒活性应当等同于(例如，0.5-2倍)在SEQIDNO:22中所示的氨基酸序列中氨基酸编号80-175或113-175的氨基酸区域内与野生型人CD81结合的抗体的那些作用和活性，但是活性的程度可以是不同的，只要这种抗体对人的炎性肠病、多发性硬化、牛皮癣或血液癌症产生预防、缓解或治疗作用。可以通过上文描述的竞争性测定法检测抗体与其抗原的“竞争性结合”。
(i)一个具体实施方案
一个优选的实施方案是这样的抗体，当所述抗体对野生型人CD81的结合亲和力是100%时，它针对(9)和(11)中描述的每种人CD81变体具有小于40%的结合亲和力。
具有上文提到的结合特性的抗体的一个优选实例是：
组1
(a-1)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-1)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-1)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-1)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-1)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-1)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组2
(a-2)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-2)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-2)包含SEQIDNO:37中所示氨基酸序列的CDR，
(d-2)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-2)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-2)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组3
(a-3)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-3)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-3)包含SEQIDNO:40中所示氨基酸序列的CDR，
(d-3)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-3)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-3)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组4
(a-4)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-4)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-4)包含SEQIDNO:43中所示氨基酸序列的CDR3，
(d-4)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-4)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-4)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组5
(a-5)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-5)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-5)包含SEQIDNO:46中所示氨基酸序列的CDR6，
(d-5)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-5)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-5)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组6
(a-6)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-6)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-6)包含SEQIDNO:49中所示氨基酸序列的CDR，
(d-6)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-6)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-6)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组7
(a-7)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-7)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-7)包含SEQIDNO:52中所示氨基酸序列的CDR，
(d-7)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-7)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-7)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组8
(a-8)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-8)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-8)包含SEQIDNO:43中所示氨基酸序列的CDR，
(d-8)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-8)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-8)包含SEQIDNO:55中所示氨基酸序列的CDR
组9
(a-9)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的CDR，
(b-9)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-9)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-9)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-9)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-9)包含SEQIDNO:61中所示氨基酸序列的CDR
组10
(a-10)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-10)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-10)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-10)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-10)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-10)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组11
(a-11)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-11)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-11)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-11)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-11)包含SEQIDNO:69中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-11)包含SEQIDNO:70中所示氨基酸序列的CDR，
组12
(a-12)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的CDR，
(b-12)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-12)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-12)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-12)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-12)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR，
组13
(a-13)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-13)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-13)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-13)包含SEQIDNO:77中所示氨基酸序列的CDR，
(e-13)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-13)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组14
(a-14)包含SEQIDNO:80中所示氨基酸序列的CDR，
(b-14)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-14)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-14)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-14)包含SEQIDNO:81中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-14)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组15
(a-15)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-15)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-15)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-15)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-15)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-15)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组16
(a-16)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-16)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-16)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的CDR，
(d-16)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-16)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-16)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组17
(a-17)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-17)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-17)包含SEQIDNO:52中所示氨基酸序列的CDR，
(d-17)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-17)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-17)包含SEQIDNO:93中所示氨基酸序列的CDR，
组18
(a-18)包含SEQIDNO:98中所示氨基酸序列的CDR，
(b-18)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-18)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-18)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-18)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-18)包含SEQIDNO:99中所示氨基酸序列的CDR，
组19
(a-19)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的CDR，
(b-19)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-19)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-19)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-19)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-19)包含SEQIDNO:99中所示氨基酸序列的CDR，
组20
(a-20)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-20)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-20)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的CDR，
(d-20)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-20)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-20)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR，
组21
(a-21)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-21)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-21)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-21)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-21)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-21)包含SEQIDNO:55中所示氨基酸序列的CDR，
组22
(a-22)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-22)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-22)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的CDR，
(d-22)包含SEQIDNO:110中所示氨基酸序列的CDR，
(e-22)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-22)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR
组23
(a-23)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-23)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-23)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的CDR，
(d-23)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-23)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-23)包含SEQIDNO:115中所示氨基酸序列的CDR
组24
(a-24)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的CDR，
(b-24)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的CDR，
(c-24)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的CDR，
(d-24)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的CDR，
(e-24)包含SEQIDNO:120中所示氨基酸序列的CDR，和
(f-24)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的CDR：
或
(2)包含以上(a-X)至(f-X)的CDR的抗体(X是1至24；这同样适用于下文)，其中将一个或多个、优选一个至几个(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸残基在从(a-X)至(f-X)中所显示的氨基酸序列中选出的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)氨基酸序列中替换和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中该抗体具有与任一种上述抗体等同的结合特性或与任一种上述抗体竞争性地结合野生型人CD81。即，“等同的结合特性”意指至少结合由野生型人CD81多肽的第80位至第175位或第113位至第175位氨基酸残基组成的肽区域，优选地当其针对野生型人CD81的结合亲和力是100%时，其还以小于40%的结合亲和力与选自上文提到的(1)至(13)中的至少一种人CD81变体(更优选地变体(9)和(11))结合。
以上抗体(2)可以通过公众已知的方法获得，例如，通过以下方式获得：用编码以上抗体(1)的可变区的碱基序列的载体作为模板进行PCR来广泛导入突变以便产生噬菌体展示突变抗体文库，以针对人CD81的结合活性或针对以上抗体(1)的竞争性结合作用筛选该文库并且进行淘选。
可以通过上文描述的多种结合测定法和竞争性测定法确定抗体的结合特性和竞争性结合作用。作为测定法的结果，当证实了测试抗体的“等同的结合特性”或“竞争性结合”后，可以通过下文详细描述的细胞迁移实验测试治疗作用。
具有上文提到的结合特性的抗体的一个更优选实例是包含以下区域的抗体：
(1)包含以上确定的CDR(a-X)至(c-X)的轻链可变区和包含以上确定的CDR(d-X)至(f-X)的重链可变区；或
(2)以上(1)的轻链可变区和重链可变区，其中将一个或多个、优选一个至几个(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸残基在从(a-X)至(f-X)中所显示的氨基酸序列中选出的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)氨基酸序列中替换和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中该抗体具有与任一种上述抗体等同的结合特性或与任一种上述抗体竞争性地结合野生型人CD81。这里，“等同的结合特性”意指与上文相同。
更优选地，在上文提到的抗体中，CDR(a-X)、(b-X)和(c-X)以这种顺序从轻链的N末端起存在。即，CDR(a-X)、(b-X)和(c-X)分别对应于轻链的CDR1、CDR2和CDR3。类似地，CDR(d-X)、(e-X)和(f-X)以这种顺序从重链的N末端起存在。即，CDR(d-X)、(e-X)和(f-X)分别对应于重链的CDR1、CDR2和CDR3。
具有上文提到的结合特性的抗体的一个甚至更优选实例是包含以下区域的抗体：
(1)包含(i-X)中所示氨基酸序列的轻链可变区和包含(j-X)中所显示氨基酸序列的重链可变区；或
(2)以上(1)的轻链可变区和重链可变区，其中将一个或多个，优选地1至20个、更优选地1至10个、甚至更优选地一个至几个(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸残基在从(i-X)和(j-X)中的一者或者二者所显示的氨基酸序列中选出的一个或几个氨基酸序列中替换和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中该抗体具有与任一种上述抗体等同的结合特性或与任一种上述抗体竞争性地结合野生型人CD81。这里，“等同的结合特性”意指与上文相同。
具有上文提到的结合特性的抗体的另一个优选实例是这样的抗体，所述抗体与包含轻链可变区和重链可变区的抗体所结合的表位相同或基本上相同的野生型人CD81表位结合，其中所述轻链可变区包含(i-X)中所显示的氨基酸序列并且所述重链可变区包含(j-X)中所显示的氨基酸序列。一个更优选的实例是这样的抗体，所述抗体与包含轻链和重链的抗体所结合的表位相同或基本上相同的野生型人CD81表位结合，其中所述轻链包含(k-X)中所显示的氨基酸序列并且所述重链包含(l-X)中所显示的氨基酸序列。
在此，“基本上相同的表位”意指与具有上述特定轻链(可变区)序列和重链(可变区)序列的抗体所识别的表位不同但以立体方式重叠的表位。识别“基本上相同的表位”的抗体与具有上述特定轻链(可变区)序列和重链(可变区)序列的抗体竞争地与野生型人CD81结合。
最广泛使用和快速的用于确定两种抗体是否与相同表位或立体重叠表位结合的方法是竞争测定法，所述竞争测定法可以按众多不同模式设置，使用标记的抗原或标记的抗体。通常，将抗原固定在基板上；并且使用放射性同位素或酶标记物测量未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。
本发明的抗体也可以是包含选自属于以上组1至24任一组中的6个CDR中至少一个CDR的抗体，所述抗体与包含全部这六个CDR的抗体竞争性地结合野生型人CD81。
另外，本发明的抗体可以是这样的抗体，所述抗体与包含属于以上组1至24任一组的全部六个CDR的抗体的轻链和重链的氨基酸序列拥有80%或更大，优选地90%或更大，更优选地95%或更大的同源性并且与这种抗体竞争性地结合野生型人CD81。如本文中提到的氨基酸序列同源性可以使用NCBIBLAST(国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具)的Blastp程序在以下条件下(期望值=10；允许空位；矩阵=BLOSUM62；过滤=关闭)计算。
(ii)另一个具体实施方案
另一个优选的实施方案是这样的抗体，当所述抗体对野生型人CD81的结合亲和力是100%时，它针对(1)至(5)、(7)、(8)、(11)和(12)中描述的每种人CD81变体具有小于40%的结合亲和力。
具有上文提到的结合特性的抗体的一个优选实例是：
(1)一种抗体，其包含：
(a-25)包含SEQIDNO:11中所示氨基酸序列的CDR；
(b-25)包含SEQIDNO:12中所示氨基酸序列的CDR；
(c-25)包含SEQIDNO:13中所示氨基酸序列的CDR；
(d-25)包含SEQIDNO:14中所示氨基酸序列的CDR；
(e-25)包含SEQIDNO:15中所示氨基酸序列的CDR；和
(f-25)包含SEQIDNO:16中所示氨基酸序列的CDR，或者
(2)包含以上(a-25)至(f-25)的CDR的抗体，其中将一个或多个、优选一个至几个(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸残基在从SEQIDNOs:11至16中所显示的氨基酸序列中选出的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)氨基酸序列中替换和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中该抗体具有与任一种上述抗体等同的结合特性或与任一种上述抗体竞争性地结合野生型人CD81。这里，“等同的结合特性”意指与上文相同。
可以通过上文描述的多种结合测定法和竞争性测定法确定抗体的结合特性和竞争性结合。作为测定法的结果，当证实了测试抗体的“等同的结合特性”或“竞争性结合”后，则可以通过下文详细描述的细胞迁移实验测试治疗作用。
具有上文提到的结合特性的抗体的一个更优选实例是包含以下区域的抗体：
(1)包含以上确定的CDR(a-25)至(c-25)的轻链可变区和包含以上确定的CDR(d-25)至(f-25)的重链可变区；或
(2)以上(1)的轻链可变区和重链可变区，其中将一个或多个、优选一个至几个(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸残基在从SEQIDNOs:11至16中所显示的氨基酸序列中选出的一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)氨基酸序列中替换和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中该抗体具有与任一种上述抗体等同的结合特性或与任一种上述抗体竞争性地结合野生型人CD81。这里，“等同的结合特性”意指与上文相同。
更优选地，在上文提到的抗体中，CDR(a-25)、(b-25)和(c-25)以这种顺序从轻链的N末端起存在。即，CDR(a-25)、(b-25)和(c-25)分别对应于轻链的CDR1、CDR2和CDR3。类似地，CDR(d-25)、(e-25)和(f-25)以这种顺序从重链的N末端起存在。即，CDR(d-25)、(e-25)和(f-25)分别对应于重链的CDR1、CDR2和CDR3。
具有上文提到的结合特性的抗体的一个甚至更优选实例是包含以下区域的抗体：
(1)包含SEQIDNO:18中所示氨基酸序列的轻链可变区和包含SEQIDNO:20中所显示氨基酸序列的重链可变区；或
(2)以上(1)的轻链可变区和重链可变区，其中将一个或多个，优选地1至20个、更优选地1至10个、甚至更优选地一个至几个(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸残基在从SEQIDNOs:18和20中所显示的氨基酸序列中选出的一个或几个氨基酸序列中替换和/或缺失和/或添加和/或插入，并且其中该抗体具有与任一种上述抗体等同的结合特性或与任一种上述抗体竞争性地结合野生型人CD81。这里，“等同的结合特性”意指与上文相同。
具有上文提到的结合特性的抗体的另一个优选实例是这样的抗体，所述抗体与包含轻链可变区和重链可变区的抗体所结合的表位相同或基本上相同的野生型人CD81表位结合，其中所述轻链可变区包含SEQIDNO:18中所显示的氨基酸序列并且所述重链可变区包含SEQIDNO:20中所显示的氨基酸序列。一个更优选的实例是这样的抗体，所述抗体与包含轻链和重链的抗体所结合的表位相同或基本上相同的野生型人CD81表位结合，其中所述轻链包含SEQIDNO:30中所显示的氨基酸序列并且所述重链包含SEQIDNO:32中所显示的氨基酸序列。在此，“基本上相同的表位”意思同上文。
本发明的抗体也可以是这样的抗体，所述抗体包含选自6个CDR(a-25)至(f-25)中的至少一个CDR并且与包含全部这六个CDR的抗体竞争性地结合野生型人CD81。
另外，本发明的抗体可以是这样的抗体，所述抗体与包含全部六个CDR(a-25)至(f-25)的抗体的轻链和重链的氨基酸序列拥有80%或更大，优选地90%或更大，更优选地95%或更大的同源性并且与这种抗体竞争性地结合野生型人CD81。在此，可以按与上文相同的方法计算氨基酸同源性。
(I)抗体的产生
本发明的抗体可以是任何单克隆抗体，只要它与上文提到的野生型人CD81的特定肽区域结合。虽然抗体的同种型不受限制，但是它优选地是IgG、IgM或IgA，特别优选地是IgG。另外，抗体的分子类型不受限制，除完整抗体分子之外，抗体可以例如是片段，如Fab、Fab'或F(ab')2、基因修饰的缀合物分子如scFv、scFv-Fc、小抗体(minibody)或双抗体(diabody)，或用某种分子(例如，具有稳定作用的分子如聚乙二醇(PEG)等)修饰的其衍生物。
由于将本发明的抗体用作以人作为其施用对象的医药品，所以本发明中的所用抗体是向人施用时已经降低了显示抗原性风险的抗体；具体而言，该抗体是(完全)人抗体、人源化抗体、非人(例如，小鼠、大鼠、兔)-人嵌合抗体等，特别优选地是人抗体。可以根据下文描述的方法通过基因工程技术制备人源化抗体和嵌合抗体。虽然(完全)人抗体也可以从人-人(或人-小鼠)杂交瘤产生，但是为了以低成本稳定供应大量抗体，合乎需要的是使用如下文描述的噬菌体展示法或产生人抗体的动物(例如，小鼠)产生它。
(II)本发明抗体的产生方法
本发明的抗体可以通过以下实施例中描述的方法或已知方法产生。
(i)抗原的制备
制备本发明抗体的所用抗原可以是野生型人CD81蛋白或其部分肽、具有一种或多种与其相同的抗原决定簇的(合成)肽(下文中，这些有时简称为本发明的抗原)。
例如通过以下方式产生野生型人CD81蛋白或其部分肽：(a)通过公众已知的方法或其改良方法从人组织或人细胞制备这种蛋白或其部分肽，b)使用肽合成仪等通过公众已知的肽合成方法化学合成这种蛋白或其部分肽，(c)培养转化体，所述转化体包含编码野生型人CD81蛋白或其部分肽的DNA，或(d)以编码野生型人CD81或其部分肽的核酸作为模板使用无细胞转录／翻译系统，生物化学合成这种蛋白质或其部分肽。
(iia)使用噬菌体展示人抗体文库制备人抗体
可以通过噬菌体展示法产生人抗体(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991)；Cole等人,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,第77页(1985)和Boermer等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991))。
制备噬菌体展示人抗体文库的方法包括但不限于例如下文描述的方法。
虽然所用噬菌体不受限制，但是通常情况下优选地使用丝状噬菌体(Ff噬菌体)。作为在噬菌体表面上呈递外来蛋白质的方法，可以提到一种方法，所述方法包括将外来蛋白质作为与任何外壳蛋白g3p和g6p至g9p的融合蛋白表达并呈递在外壳蛋白上；并且经常使用一种方法，所述方法包括将这种外来蛋白质与g3p或g8p的N端侧融合。作为噬菌体展示载体，可以提到1)一种载体，其中将外来基因以具有噬菌体基因组外壳蛋白基因的融合基因形式导入，以允许在噬菌体表面上待呈递的全部外壳蛋白作为具有外来蛋白质的融合蛋白呈递，2)一种载体，其中编码融合蛋白的基因与野生型外壳蛋白基因分开地插入以允许融合蛋白和野生型外壳蛋白同时表达，和3)具有噬菌粒载体(其携带编码融合蛋白的基因)的大肠杆菌(E.coli)用具有野生型外壳蛋白基因的辅助噬菌体感染，以产生同时表达所述融合蛋白和野生型外壳蛋白的噬菌体粒子等。然而，类型2)或3)的噬菌体展示载体用于抗体文库的制备，因为在1)的情况下，当大的外来蛋白质融合时感染能力丧失。
作为具体载体，可以提到由Holt等人(Curr.Opin.Biotechnol.，11:445-449，2000)描述的那些作为实例。例如，pCES1(见J.Biol.Chem.,274:18218-18230,1999)是表达Fab的噬菌粒载体，其中在一个乳糖启动子的控制下配置了g3p信号肽下游的编码κL链恒定区的DNA和g3p信号肽下游的编码CH3的DNA、介于His标签、c-myc标签和琥珀终止密码子(TAG)之间的g3p编码序列。将这种载体导入具有琥珀突变的大肠杆菌时，Fab呈递到g3p外壳蛋白上，但是当它在没有琥珀突变的HB2151菌株等中表达时，产生可溶性Fab抗体。作为表达scFv的噬菌粒载体，例如，使用pHEN1(J.Mol.Biol.,222:581-597,1991)等。
另外，作为辅助噬菌体的实例，可以提到M13-KO7、VCSM13等。
并且作为另一种噬菌体展示载体，可以提到一种载体，其中将所述载体设计成包含编码半胱氨酸密码子的DNA序列与抗体基因的3'末端和外壳蛋白基因的5'末端的每一者连接，以便同时和独立(不以融合蛋白形式)表达这两个基因并且通过导入的半胱氨酸残基之间的S-S键，将抗体呈递到噬菌体表面的外壳蛋白上(Morphosys公司CysDisplayTM技术)等。
作为人抗体文库种类，可以提到天然/未免疫的文库、合成文库、免疫文库等。
天然/未免疫的文库是通过RT-PCR获得由正常人具有的VH基因和VL基因并且将它们随机克隆入上述噬菌体展示载体而获得的文库。通常，使用源自正常人的外周血淋巴细胞、骨髓、扁桃体等的mRNA等作为模板。将通过以下方式制备的文库特别称作天然文库：选择性扩增其中不发生归因于抗原敏化的类别转换的源自IgM的mRNA，以避免如临床史所引起的V基因偏离。代表性地，可以提到剑桥抗体技术文库(见J.Mol.Biol.,222:581-597,1991；Nat.Biotechnol.,14:309-314,1996)、医学研究委员会文库(见Annu.Rev.Immunol.,12:433-455,1994)、DyaxCorp.文库(见J.Biol.Chem.,1999(上文)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,14:7969-7974,2000)等。
通过选择人B细胞中有功能的特定抗体基因并且将V基因区段中的一部分抗原结合区域(例如，CDR3等)替换为编码适宜长度的随机氨基酸序列的DNA以构建文库，获得合成文库。认为这种文库在抗体表达效率和稳定性方面是优异的，因为从一开始，文库就可以用VH和VL基因的组合构建，这产生有功能的scFv和Fab。代表性地，可以提到MorphosysAG的HuCAL文库(见J.Mol.Biol.,296:57-86,2000)、BioInvent文库(见Nat.Biotechnol.,18:852,2000)、Crucell文库(见Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:3938,1995；J.Immunol.Methods,272:219-233,2003)等。
通过以下方式获得免疫文库：按照与上述天然/未免疫的文库文库相同的方式，从采集自针对靶抗原的血液抗体滴度升高的人(如患有癌症、自身免疫性疾病、传染病等的患者或接种受体)中的淋巴细胞或从通过上述体外免疫方法用靶抗原人工免疫的人淋巴细胞等制备mRNA，并且通过RT-PCR扩增VH和VL基因，以便构建文库。有可能甚至从这类文库获得相对小尺寸的所需抗体，因为在开始时在文库中已经含有所需的抗体基因。
通过噬菌体展示法针对靶抗原选择抗体的过程称作淘选。具体而言，例如，通过以下重复一系列操作约3至5次浓缩呈递抗原特异性抗体的噬菌体：使抗原固定的载体和噬菌体文库彼此接触，洗除未结合的噬菌体，此后从载体洗脱结合的噬菌体，并且将这种噬菌体感染大肠杆菌以增殖该噬菌体。作为用于固定抗原的载体，可以提到在通常的抗原-抗体反应或亲和层析中使用的多种载体，例如不溶性多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素、合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅或包含玻璃、金属等的微量平板、管、膜、柱、珠等和表面等离子体共振(SPR)传感芯片等。对于抗原固定，可以使用物理吸附，和使用化学键的方法也是可接受，其中所述化学键用来使蛋白质或酶等不溶化和固定。例如，优选地使用生物素-(链霉)抗生物素蛋白系统等。为洗涤未结合的噬菌体，可以使用封闭液如BSA溶液(1次或2次)、包含表面活性剂如吐温的PBS(3次至5次)等。也存在提及优选使用柠檬酸盐缓冲液(pH5)等用于洗涤的报道。为洗脱特定噬菌体，通常使用酸(例如，0.1M盐酸等)；用特异性蛋白酶切割(例如，可以在抗体基因和外壳蛋白基因之间的连接位点导入编码胰蛋白酶切割位点的基因序列)。在这种情况下，大肠杆菌感染和增殖是可能的，即便全部外壳蛋白以融合蛋白形式表达，因为野生型外壳蛋白呈递在洗脱的噬菌体的表面上)，所以采用可溶性抗原的竞争性洗脱或通过还原S-S键洗脱(例如，在前述CysDisplayTM中，在进行淘选后，可以通过使用合适的还原剂使抗体和外壳蛋白解离而收集抗原特异性噬菌体)也是可能的。当用酸洗脱时，洗脱物用Tris等中和，并且随后将洗脱的噬菌体感染培养的大肠杆菌；此后通过常规方法收集噬菌体。
在通过淘选法浓缩呈递抗原特异性抗体的噬菌体后，将噬菌体感染大肠杆菌并且将细胞接种到平板上以进行细胞克隆。再从每个克隆收集噬菌体，并且通过上述的抗体滴度测定法(例如，ELISA、RIA等)或使用FACS或SPR的测量，证实抗原结合活性。
可以通过以下方式从呈递抗原特异性抗体的所选择噬菌体克隆中分离和纯化抗体，例如，当使用在抗体基因和外壳蛋白基因的接头位点处并入琥珀终止密码子的载体作为噬菌体展示载体时，使噬菌体感染不具有琥珀突变的大肠杆菌(例如，HB2151菌株)以产生并在周质或培养基中分泌可溶性抗体分子，用溶菌酶等溶解细胞壁，收集胞外级分，并且使用于上述相同的纯化技术纯化。只要已经事先导入His标签或c-myc标签，可以使用固定的金属亲和层析(IMAC)方法、抗c-myc抗体柱等容易地纯化抗体。在淘选中使用特异性蛋白酶切割时，通过这种蛋白酶的作用从噬菌体表面分离抗体分子，从而可以通过进行与上文所提到的相同纯化操作来纯化所需的抗体。
使用包含所述肽区域的多肽，通过上文提到的结合测定法证实如此获得的人抗体(例如，scFv、Fab)针对野生型人CD81的表位区域的亲和力和亲合力。
(iib)使用产生人抗体的动物制备人抗体
如果将有功能的人Ig基因导入其中已经敲除(KO)内源免疫球蛋白(Ig)基因的非人温血动物并且这种动物用抗原免疫，则产生人抗体，而不产生这种动物衍生的抗体。因此，如果使用已经对其建立产生杂交瘤技术的动物如小鼠，则可以通过与用来制备小鼠单克隆抗体的常规方法相同的方法，获得完全的人单克隆抗体。即，可以通过使用产生人抗体的小鼠生成人单克隆抗体(见Immunol.Today，17:391-397，1996)，其中通过使用常规转基因(Tg)技术用人IgH链和L链微型基因转染的小鼠与其中已经使用常规KO技术使内源性小鼠Ig基因失活的小鼠交配，获得产生人抗体的小鼠，从而产生人单克隆抗体(WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096和WO96/33735)。
培养通过从产生人抗体的小鼠获得的产生抗人CD81抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合所获得的杂交瘤，并且可以从培养上清液回收并且通过常规方法纯化抗人CD81抗体。使用包含所述肽区域的多肽，通过上文提到的结合测定法证实如此获得的人抗体针对野生型人CD81的表位区域的亲和力和亲合力。
(iic)嵌合抗体的制备
如本文所用，“嵌合抗体”意指其中H链可变区和L链可变区(VH和VL)的序列源自非人动物物种并且其中恒定区序列(CH和CL)源自人的抗体。可变区的序列优选地源自例如允许容易制备杂交瘤的动物物种，如小鼠、大鼠、兔等。
作为制备嵌合抗体的方法的实例，可以提到美国专利号6,331,415中描述的方法或其部分改良方法等。
用获得的嵌合H链和嵌合L链表达载体转化宿主细胞。作为宿主细胞，除上述的小鼠骨髓瘤细胞之外，可以提到动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴衍生的COS-7细胞、Vero细胞、大鼠衍生的GHS细胞等。对于转化，可以使用适用于动物细胞的任何方法，其中优选电穿孔方法等。可以通过以下方式分离嵌合单克隆抗体：在对其合适的培养基中培养宿主细胞持续给定时间并且随后按照与上述相同的方式收集培养上清液和纯化嵌合单克隆抗体。备选地，也可能从使用动物如牛、山羊或禽的生殖系细胞作为宿主细胞通过常规方法产生的转基因动物的乳或蛋中容易地和大量获得嵌合单克隆抗体，其中已经建立用于所述转基因动物的转基因技术并且已经编纂作为家养动物(家禽)大量增殖的诀窍。另外，也可能从转基因植物的种子、叶等中大量获得嵌合单克隆抗体，其中以植物如谷物、稻、小麦、大豆或烟草的细胞作为宿主细胞，通过使用向原生质体中微量注射和电穿孔、粒子枪法和用于完整细胞的Ti-载体法等产生所述转基因植物，其中已经建立用于所述转基因植物的转基因技术，并且大量培养所述转基因植物作为主要作物。
(iii)人源化抗体
如本文所用，“人源化抗体”意指一种抗体，其中在除互补决定区(CDR)之外的可变区[即，恒定区和可变区中的框架区(FR)]中存在的全部区域的序列均源自人，并且其中仅CDR的序列源自另一个哺乳动物物种。其他哺乳动物物种优选地是其中可以容易地进行杂交瘤产生的动物物种，例如，小鼠、大鼠、兔等。
作为制备人源化抗体的方法的实例，可以提到美国专利号5,225,539、5,585,089、5,693,761和5,693,762、EP239400、WO92/19759中描述的方法或其部分改良方法等。具体而言，按照与上述嵌合抗体相同的方式分离编码源自非人哺乳动物物种(例如，小鼠)的VH和VL的DNA，在此后，使用自动化DNA测序仪(例如，由AppliedBiosystems公司等制造)通过常规方法进行测序后并且使用已知的抗体序列数据库分析所获得的核苷酸序列或从中推导的氨基酸序列[例如，Kabat数据库(见Kabat等人,“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest”,NIH编辑,美国健康与人类服务部,公共卫生服务,第5版,1991)等]以确定两条链的CDR和FR。设计一个核苷酸序列，其中编码具有与测定FR序列相似的FR序列的人抗体L链和H链的核苷酸序列的CDR编码区用编码另一个动物物种的CDR的测定核苷酸序列替换，并且将这个核苷酸序列分成约20至40个碱基的片段，并且将互补于这个核苷酸序列的序列分成约20至40个碱基的片段，从而这些片段可选地与前述片段重叠。可以通过以下方式构建编码具有人衍生的FR和源自另一个哺乳动物物种的CDR的VH和VL的DNA：使用DNA合成仪合成各个片段并且将它们根据常规方法杂交和连接。为了更快和更高效地将源自另一个哺乳动物物种的CDR转移至人衍生的VH和VL中，优选的是使用基于PCR的位点定向诱变。作为这种方法的实例，可以提到JP-A-5-227970等中描述的顺序CDR移植方法。
应当指出在通过如上文所述的方法制备人源化抗体时，如果仅将CDR的氨基酸序列移植至模板人抗体FR，则与原始非人抗体相比，抗原结合活性有时可能下降。在这种情况下，在CDR周围组合地移植一些FR氨基酸是有效的。待移植的非人抗体FR氨基酸可以是对维持每个CDR的立体结构重要的氨基酸残基；可以通过使用计算机的立体结构评估推导这种氨基酸残基。
可以通过将如此获得的编码VH和VL的DNA与编码人衍生的CH和CL的DNA分别连接并将连接产物导入合适的宿主细胞中，获得产生人源化抗体的细胞或转基因动物／植物。
在不使用CDR移植(其中将小鼠CDR移植入人抗体可变区)情况下制备人源化抗体的备选方法例如是这样的方法，所述方法包括基于抗体之间保守结构-功能相关性确定哪个是在非人可变区中可以替换的氨基酸残基。这种方法可以例如在如EP0571613B1、US5,766,886、US5,770,196、US5,821,123、US5,869,619中所述那样实施。如果存在关于原始非人抗体的VH和VL中每一者的氨基酸序列信息，则使用这种方法制备人源化抗体可以容易地通过利用例如Xoma公司所提供的合同抗体制备服务进行。
如同嵌合抗体，可以通过使用基因工程技术，将人源化抗体改变成scFv、scFv-Fc、小抗体、dsFv、Fv等；并且它们可以通过使用合适的启动子在微生物如大肠杆菌或酵母中产生。
使用包含肽区域的多肽，通过上文提到的结合测定法证实如此获得的人源化抗体针对野生型人CD81的表位区域的亲和力和亲合力。
(III)抗体的优化
可以轻易地制备上文提到的本发明的抗人CD81抗体以包含多种变化、替换、插入和缺失。例如，为了使抗体的表达水平最大化，可以优化抗体基因的核苷酸序列，从而匹配用于抗体表达的细胞的密码子选择频率。增强抗体稳定性的额外修饰包括如下文描述的修饰IgG4以用脯氨酸替换铰链区中残基228处的丝氨酸。就其他修饰而言，可以提到如需要用来优化抗体与药物缀合时的效率的替换。例如，抗体可以在其羧基末端进行修饰以包括用于药物连接的氨基酸，例如，可以添加一个或多个半胱氨酸残基。可以修饰恒定区以导入用于结合糖或其他部分的位点。
使用标准重组技术，包括位点定向诱变或重组克隆，可以产生本发明的抗CD81抗体的突变体。
一个特别优选的替换变体类型涉及替换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物学特性。用于产生此类替换性变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟法。简而言之，将几个高变区突变以便在每个位点处产生全部可能的氨基酸替换。如此产生的抗体变体被展示为与噬菌体上丝状噬菌体M13的外壳蛋白g3p融合的蛋白质。随后如本文中所公开那样，对噬菌体展示的变体筛选它们的生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定明显有助于抗原结合的高变区残基。一旦产生此类变体，将这组变体进行如本文中所述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定法中具有优异特性的抗体用于进一步研发。通过本领域已知的多种方法制备编码抗人CD81抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于从天然来源中分离(在天然存在的氨基酸序列变体情况下)或通过寡核苷酸介导(或位点定向)的诱变、PCR诱变和盒诱变早先制备的抗人CD81抗体变体或非变体形式而制备。
优选的亲和力成熟的抗体具有比制备成熟抗体的起始抗体大5倍、更优选地10倍、甚至更优选地20或30倍的亲和力。
IgG4突变
将IgG4抗体施用至人或一些动物时，已经观察到IgG4抗体的血清浓度因与内源性IgG4转换而降低的现象。已经已知的这种IgG4转换受残基228处Ser至Pro的点突变抑制(Mol.Immunol.30,105,1993,ProteinSci.6,407,1997,MolImmunol.38,1,2001,NatBiotechnol.27,767,2009)。
(IV)证实抗体的治疗作用
本发明的抗体对T淋巴细胞迁移具有抑制作用。使用广泛已知的用于淋巴细胞功能的评价系统检测这种作用。例如，通过以下方式评价对T淋巴细胞迁移的影响：在细胞因子(例如，PHA、IL-2、TNF-α、IL-22、IL-7和VIP)存在的情况下，将培养的人外周血单个核细胞(PBMCs)与测试抗体接触，刺激PBMC的移行(例如，通过添加趋化因子，基质细胞衍生因子1(SDF-1；也称作CXCL12)，并且确定对移行的抑制(见例如，Blood2009年8月13日；114(7):1366-1373)。具体而言，可以使用下文描述的细胞迁移实验。
作为淋巴细胞，可以使用建立的细胞系如Jurkat细胞(克隆E6-1，ATCC编号TIB-152)和源自人外周血的细胞。人外周血衍生细胞是可商业获得的(KACCo.,Ltd.等)。备选地，也可以通过使用Ficoll/Paque密度梯度离心根据TheJournalofImmunology,147,2251(1991)，从健康人的外周血中分离含有单核细胞和淋巴细胞的单个核细胞部分制备人外周血衍生细胞。
细胞迁移实验
可以使用细胞迁移实验评价抗体或其功能性片段抑制其抗原涉及细胞迁移的功能的能力。通常，通过以下方式进行细胞迁移实验：通过屏障(例如，内皮、滤器)分开适宜的细胞如白细胞(例如，淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和趋化因子并且监测这些细胞向该屏障或跨过该屏障的移行。例如，可以通过以下方式检验测试抗体对细胞迁移的抑制作用：添加含有趋化因子如SDF-1的培养基至96孔移行平板的孔(第一室)，将具有由细胞可透过性微孔膜组成的底表面(第二室)的跨孔(transwell)放置到该孔上，添加测试抗体和细胞，测量细胞从第二室至第一室的移行并且将移行程度与不存在抗体或存在非特异性抗体时的移行程度比较(Immunol.Invest.17:625-677(1988))。
(V)重组抗体的产生
任何产生系统可以用于产生本发明中所用的抗体。用于产生抗体的产生系统包括体外和体内产生系统。体外产生系统包括使用真核细胞的产生系统和使用原核细胞的那些。
可以按已知的方法表达并且获得如上文所述那样构建的抗体基因。在哺乳动物细胞的情况下，可以使用这样的DNA或含有所述DNA的载体完成表达，其中常用的可用启动子、待表达的抗体基因和在其3'下游的多聚A信号已经功能性连接。启动子/增强子的实例包括人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。
额外地，作为可以用于表达本发明中使用的抗体的启动子，有病毒启动子/增强子如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猴病毒40(SV40)启动子/增强子和源自哺乳动物细胞的启动子/增强子如人延伸因子1α(hEF1α)。
例如，当使用SV40启动子/增强子时，可以通过Mulligan等人(Mulligan,R.C.等人,Nature(1979)277,108-114)的方法轻易地完成表达，或当使用ShEF1α启动子/增强子时，可以通过Mizushima等人(Mizushima,S.和Nagata,S.NucleicAcidsRes.(1990)18,5322)的方法轻易地完成表达。
在大肠杆菌的情况下，可以通过功能性连接常用的可用启动子、用于抗体分泌的信号序列和待表达的抗体基因，随后表达之，实施表达。作为启动子，例如，可以提到lacZ启动子和araB启动子。当使用lacZ启动子时，可以使用Ward等人(Ward,E.S.等人,Nature(1989)341,544-546；Ward,E.S.等人,FASEBJ.(1992)6,2422-2427)的方法，或当使用araB启动子时，可以使用Better等人(Better,M.等人,Science(1988)240,1041-1043)的方法。
作为用于抗体分泌的信号序列，当在大肠杆菌周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.等人,J.Bacteriol.(1987)169,4379-4383)。在分离周质中产生的抗体后，使抗体的结构在使用之前适当地再折叠(见例如，WO96/30394)。
作为复制起点，可以使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的那些。另外，为了扩增宿主细胞系统中的基因拷贝数，表达载体可以包含氨基糖甙类转移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。
当使用真核细胞时，存在采用动物细胞、植物细胞和真菌细胞的产生系统。已知的动物细胞包括(1)哺乳动物细胞如CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、和Vero细胞，(2)两栖类细胞如非洲爪蟾卵母细胞，或(3)昆虫细胞如sf9、sf21和Tn5。已知的植物细胞包括，例如，源自烟草(Nicotianatabacum)的经历过愈伤组织培养的那些。已知的真菌细胞包括酵母如酵母属(Saccharomyces)，更具体地是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，或丝状真菌如曲霉属(Aspergillus)，更具体地是黑曲霉(Aspergillusniger)。
当使用原核细胞时，存在采用细菌细胞的产生系统。已知的细菌细胞包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
通过借助转化将所需抗体基因导入这些细胞中并且在体外培养转化的细胞，可以获得抗体。培养按已知的方法实施。例如，作为培养基，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640和IMDM，并且可以组合使用血清补充物如胎牛血清(FCS)。此外，可以通过将其中已经导入抗体基因的细胞植入动物的腹腔等在体内产生抗体。
作为体内产生系统，可以提到采用动物的那些和采用植物的那些。当使用动物时，存在采用哺乳动物和昆虫的产生系统。
作为哺乳动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠和牛(VickiGlaser,SPECTRUMBiotechnologyApplications,1993)。另外，作为昆虫，可以使用蚕。
当使用植物时，例如，可以使用烟草。
将抗体基因导入这些动物或植物中，并且在这类动物或植物中产生抗体并且回收。例如，将抗体基因插入编码在乳中内在产生的蛋白质(如山羊β-酪蛋白)的基因的中部以制备融合基因。将含有其中已经插入抗体基因的融合基因的DNA片段注射至山羊胚中，并且将这种胚导入至雌山羊中。从转基因山羊或其后代产生的乳获得所需抗体，其中所述转基因山羊由已经接受这种胚的山羊生产。为了增加含有由转基因山羊产生的所需抗体的乳的量，根据需要，可以向转基因山羊给予激素。(Ebert,K.M.等人,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
当使用蚕时，将已经插入所需抗体基因的杆状病毒感染蚕，并且可以从所述蚕的体液获得所需的抗体(Maeda，S.等人,Nature(1985)315,592-594)。另外，当使用烟草时，将所需的抗体基因插入用于植物的表达载体中，例如pMON530，并且随后将该载体导入细菌如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中。随后将细菌感染烟草如普通烟草(Nicotianatabacum)以从烟草的叶获得所需的抗体(Julian,K.-C.Ma等人,Eur.J.Immunol.(1994)24,131-138)。
当抗体在体外或体内产生系统中产生时，如上文所述，编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA可以分别整合入表达载体中并且同时转化宿主，或者编码H链和L链的DNA可以整合入单个表达载体中并且宿主用所述载体转化(见国际专利申请WO94-11523)。
本发明中使用的抗体可以是抗体片段或其修饰形式，只要它们能够用于本发明即可。例如，作为抗体的片段，可以提到Fab、F(ab')2、Fv或其中H链和L链的Fv经合适接头连接的单链Fv(scFv)。具体而言，抗体用酶(例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)处理，以产生抗体片段，或构建编码这些抗体片段的基因，并且随后将该基因导入表达载体中，所述表达载体在合适的宿主细胞中表达(见例如，Co,M.S.等人,J.Immunol.(1994)152,2968-2976；Better,M.和Horwitz,A.H.,MethodsinEnzymology(1989)178,476-496,Plueckthun,A.和Skerra,A.,MethodsinEnzymology(1989)178,476-496,Lamoyi,E.,MethodsinEnzymology(1986)121,652-663；Rousseaux,J.等人,MethodsinEnzymology(1986)121,663-669；Bird,R.E.等人,TIBTECH(1991)9,132-137)。
可以通过连接抗体H链的V区和抗体L链的V区获得scFv。在scFv中，H链的V区和L链的V区优选地通过接头、优选地通过肽接头连接(Huston,J.S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879-5883)。scFv中H链的V区和L链的V区可以源自上述抗体的任一种。作为用于连接V区的肽接头，可以使用包含例如12-19个氨基酸残基的任何单链肽。
可以通过以下方式获得编码scFv的DNA：使用编码以上抗体的H链或H链V区的DNA和编码以上抗体的L链或L链V区的DNA作为模板，采用针对两个末端的引物对，通过用PCR技术扩增编码上述序列中目的氨基酸序列的DNA部分，并且进一步组合旨在将编码肽接头部分的DNA与在其两端分别连接H链和L链的特定引物对进行扩增。
一旦构建了编码scFv的DNA，可以通过常规方法获得含有这些DNA的表达载体和用所述表达载体转化的宿主，并且可以使用所产生的宿主，通过常规方法获得scFv。
这些抗体片段可以通过以与上文所提到的相似方式获得其基因，并且通过允许该基因在宿主中表达来产生。如本申请的权利要求中使用的“抗体”包括这些抗体片段。
作为修饰的抗体，可以使用与多种分子例如聚乙二醇(PEG)连接的抗体。如本申请的权利要求中使用的“抗体”包括这些修饰的抗体。可以通过化学修饰获得的抗体，从而获得这些修饰的抗体。本领域中已经建立了这些方法。
可以从宿主细胞的内部或外部分离如上所述产生和表达的抗体，并随后可以纯化至均一。可以通过亲和层析完成用于本发明中的抗体的分离和纯化。作为用于这类亲和层析的柱子，可以提到蛋白A柱和蛋白G柱。用于蛋白A柱的载体的实例是HyperD、POROS和SepharoseF.F等。备选地，可以不受限制地使用常规用于蛋白质的分离和纯化方法。根据需要，可以通过组合上述亲和层析之外的层析、过滤、超滤、脱盐、透析等完成用于本发明中的抗体的分离和纯化。层析包括例如离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤等。这些层析法可以适用于HPLC(高效液相色谱)。备选地，可以使用反相HPLC。
可以通过测量吸光度或通过酶联免疫吸附测定(ELISA)等确定以上获得的抗体的浓度。因此，当使用吸光度测量时，用于本发明中的抗体或含有这种抗体的样品适当地用PBS(-)稀释并且随后在280nm测量吸光度，随后使用1mg/ml的吸收系数是1.35OD来计算。当使用ELISA方法时，如下实施测量。即，在pH9.6的0.1M重碳酸盐缓冲液中稀释至1μg/ml的100μl山羊抗人IgG(由TAGO制造)添加至96孔板(由Nunc制造)并且在4°C孵育过夜以固定抗体。
在封闭后，添加100μl适当稀释的本发明使用的每种抗体或含有这种抗体的样品或添加100μl人IgG(由CAPPEL制造)作为标准物，并且在室温孵育1小时。在洗涤后，添加100μl5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(由BIOSOURCE制造)并且在室温孵育1小时。在洗涤后，将底物溶液添加并孵育，随后使用3550型微量平板读数仪(由Bio-Rad制造)在405nm测量吸光度以计算目的抗体的浓度。
(VI)含有本发明抗体的药物组合物
本发明也提供用于预防和/或治疗炎性肠病(IBD)、多发性硬化、牛皮癣或血液癌症的药物。术语“治疗”不仅包括完全治愈，还包括改善症状。已知CD81在IBD患者中过量表达并且抗CD81抗体用于预防、缓解或治疗IBD。这里，“炎性肠病(IBD)”意指包括溃疡性结肠炎和节段性回肠炎的疾病。
由于发明人获得了所述抗CD81抗体抑制T细胞迁移的新研究结果，所以本发明的抗体也可用于预防、改善或治疗与T细胞迁移相关的疾病如多发性硬化和牛皮癣。
由于本发明的抗体不增强细胞因子(如白介素-2)从T细胞产生，含有这种抗体的药物组合物不造成因细胞因子过量产生所致的不良副作用。可以通过已知方法确定对淋巴细胞中细胞因子产生的影响，例如使用ELISA定量在多种条件下培养的淋巴细胞的培养上清液中的细胞因子或治疗后淋巴细胞的胞内细胞因子染色法，如NatureImmunology，第8卷，第9期，2007年9月，942中所述。
本发明人阐明了本发明抗体对源自血液癌症患者的癌细胞的细胞毒效应，并且发现本发明的抗体可用作针对血液癌症的预防性药、缓解药或治疗药。根据WHO分类法，将血液癌症划分成白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。将白血病进一步划分成急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴性白血病。将恶性淋巴瘤划分成霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
急性髓性白血病是最流行类型的成人白血病。虽然急性淋巴性白血病相对流行儿童中，但是它也在成人中以某个发生率发生。慢性髓性白血病是治疗成绩近年来大幅改善的疾病。慢性淋巴性白血病是在欧洲和美国相对流行的白血病类型，但是在日本较不流行。在恶性淋巴瘤中，非霍奇金淋巴瘤包括成人T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、MALT淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤等。MALT淋巴瘤和滤泡淋巴瘤是进展如此缓慢从而在许多年期间没有主要进展的低恶性度肿瘤。相反，Burkitt淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤和成人T细胞淋巴瘤是按周加重的极端恶性的肿瘤。介于之间的其他类型是外周T细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。这些肿瘤按月进展。多发性骨髓瘤是处于来自B淋巴细胞成熟以产生免疫球蛋白的浆细胞阶段的肿瘤类型。骨髓增生异常综合征是总称为以骨髓干细胞的形态和功能反常为特征的一类疾病。
用于血液癌症的可用治疗包括化疗法、放疗法、分子打靶治疗和与造血干细胞移植组合的高剂量化疗法。尽管小儿急性淋巴性白血病是可治疗的，长期存活率为80%，但是成人急性淋巴性白血病具有15-35%的低的长期存活率，尽管在60-80%的患者中实现完全缓解。由于Gleevec(甲磺酸伊马替尼)的出现，慢性淋巴性白血病的治疗成绩已经改善。在低恶性或中度恶性的霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中改进的治疗成绩已经是明显的。同时，在成人T细胞淋巴瘤中，多种疗法不能产生改进的治疗成绩，中位数存活时间是约1年(IGAKUNOAYUMI，第212卷，第5期，第461-466页，2005年)。淋巴母细胞淋巴瘤是划归为高恶性非霍奇金淋巴瘤的一组疾病。对于Burkitt淋巴瘤，已经通过短时间大剂量化疗改进预后；2年存活率目前是约70%或更高，从而显示改进的治疗成绩(Magrath,I.等人,J.Clin.Oncol.,14:925-943,1996；Mead,G.M.等人,Ann.Oncol.,13:1264-1274,2002)；然而，3年存活率仍低至49%，从而需要进一步改善治疗成绩(ThomasD.A.等人,J.Clin.Oncol.,17:2461-2470,1999)。在弥漫性大细胞淋巴瘤中，采用抗CD20抗体(利妥昔单抗)和CHOP疗法(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松龙)的联合疗法正在变成标准疗法，对处于进展阶段的低风险年轻患者具有改进的治疗成绩。然而，对处于进展阶段的高风险年轻患者，没有优于CHOP疗法的疗法可用。关于多发性骨髓瘤的治疗，抗癌药或多或少地有效，但是这种疾病是高度恶性的，从而治疗不如白血病和淋巴瘤那样有效。就骨髓增生异常综合征而言，5年至10年存活率是约30-40%。期望进一步改善治疗功效的高恶性的血液癌症包括急性髓性白血病、急性淋巴性白血病、淋巴母细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等。
如上文所述，对于中度至高度恶性的血液癌症，没有治疗功效令人满意的治疗方法或药物；对于新治疗方法和药物存在需求。发现抗CD81抗体(其作为血液癌症治疗药物的潜力迄今不清楚)基于它们的补体依赖的细胞毒性，对缺少治疗功效的一些类型的血液癌症(即Jurkat细胞(源自急性淋巴性白血病患者的癌细胞系)和Ramos细胞(源自Burkitt淋巴瘤患者的癌细胞系)具有细胞毒效应。抗CD81抗体对癌细胞显示细胞毒效应的研究结果是迄今未知的。
因而，本发明也提供以本发明抗体作为有效成分的用于血液癌症的预防剂、改善剂或治疗剂，优选地用于高度恶性的血液癌症的预防剂、改善剂或治疗剂。
本发明不仅适用于血液癌症，还适用于任何类型表达CD81的癌细胞。因此，以本发明抗体作为有效成分的药物有效作为由表达CD81的癌细胞引起的癌症的预防剂、改善剂或治疗剂。
含有抗CD81抗体作为有效成分的药剂本身作为通过已知的制药方法配制的药剂施用。例如，它可以按采用水或其他可药用液体的无菌溶液或者悬液的注射液形式使用。另外，考虑将它与药学可接受的载体或介质，如无菌水、生理盐水溶液、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、运载体(vehicle)和防腐剂合适地组合，一般地通过以制药实施所要求的单位用量形式混合而制剂化。调节有效成分在这些制剂中的量，以获得规定范围内的合适体积。
用于注射的无菌组合物可以使用运载体如注射用蒸馏水根据常规配制法配制。用于注射的水溶液的实例包括含有葡萄糖和其他辅料(如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠)的生理盐水溶液和等渗溶液。可以组合地使用适宜的增溶剂，例如，醇如乙醇、多元醇如丙二醇或聚乙二醇、非离子表面活性剂如聚山梨醇酯80TM或HCO-50。
油的实例包括芝麻油和大豆油，并且可以将苯甲酸苄酯或苄醇组合地使用作为增溶剂。可以配制入缓冲剂如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液、无痛化剂(soothingagent)如盐酸普鲁卡因、稳定剂如苄醇、酚和抗氧化剂。如此形成的注射液通常填充于适宜的安瓿中。
对于含有抗CD81抗体作为有效成分的药剂，口服施用和肠胃外施用均是可能的。优选肠胃外施用。其具体实例包括注射剂型、经鼻剂型、经肺剂型、经皮剂型等。对于注射剂型的实例，可以通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射等实施全身性或局部施用。
可以根据患者的年龄和症状恰当地选择施用量。例如，可以选择一次施用每千克体重0.0001mg至1000mg范围内的剂量。备选地，可以选择每位患者0.001至100000mg范围内的剂量。然而，本发明的治疗剂不受这些剂量限制。
通过参考下文实施例更详细地解释本发明，所述实施例不应解释为限制性的。
实施例
实施例1人CD81抗体的制备
(1)人抗人CD81抗体片段的选择
使用人CD81蛋白和与CD81具有同源性的人CD9蛋白或表达人CD81的和不表达人CD81的细胞，对完整的人抗体文库n-CoDeR(NatureBiotechnol.18:852-856，2000；WO98/32845)筛选与人CD81的特异性结合，以获得与人CD81特异性结合的人抗体片段(scFv)。首先，使用链霉抗生物素蛋白标记的磁珠，在竞争性CD9蛋白存在的情况下回收与生物素化的CD81蛋白结合的噬菌体。洗去未结合的噬菌体并且通过胰蛋白酶处理洗脱结合的噬菌体。实施淘选3次，并且将选择的噬菌体文库在大肠杆菌中表达为抗体片段。使用FMAT(荧光测量微体积分析技术)筛选与表达CD81的细胞结合但是与不表达CD81的细胞不结合的抗体片段。通过以下方式进行FMAT：向固定在384孔培养平板的各孔上的细胞添加抗体片段并且使用荧光标记的抗scFv抗体检测其结合。作为筛选的结果，选出两种人CD81特异性人抗体片段。通过测序测定这些片段的核苷酸序列(scFv-002-A07:SEQIDNO:33，scFv-005-C01:SEQIDNO:35)和推导的氨基酸序列(scFv-002-A07:SEQIDNO:34，scFv-005-C01:SEQIDNO:36)。
(2)抗人CD81抗体的产生
使用以上(1)所获得的片段的序列信息，通过已知的方法(NatBiotechnol.,18,852-856,2000)制备抗人CD81抗体基因(重链可变区(VH):SEQIDNO:9(002-A07)；SEQIDNO:19(005-C01)和轻链可变区(VL):SEQIDNO:7(002-A07)；SEQIDNO:17(005-C01))，使用具有BsmI和NheI识别位点的一组引物，通过PCR扩增。将扩增的片段用BsmI和NheI消化并亚克隆至pCEP4(Invitrogen)衍生的载体中。在重链表达载体中，插入其中第228位Ser以Pro(S228P)取代的突变人γ4链的基因组区域，并且在轻链表达载体中，插入人λ链的基因组区域。使用FuGene6(Roche)根据制造商的操作方案，将如此构建的重链及轻链表达载体共转染至HEK293-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)中，并且将细胞培养。在培养6日后，从培养上清液纯化IgG4抗体。简而言之，将培养溶液离心并且使上清液经历蛋白A层析。将纯化的物质针对10mMNaP缓冲液(0.15MNaCl，pH6.5)透析。如此获得的002-A07IgG4抗体具有由SEQIDNO:28中所显示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:26中所显示的氨基酸序列组成的轻链。如此获得的005-C01IgG4抗体具有由SEQIDNO:32中所显示的氨基酸序列组成的重链和由SEQIDNO:30中所显示的氨基酸序列组成的轻链。
试验例1抗CD81抗体对表达CD81的细胞的结合活性
(1)细胞制备
基于已知信息(JOURNALOFVIROLOGY.,79,4316-4328,2005)，使用JurkatE6.1细胞和人PBMC(外周血单个核细胞)作为表达人CD81的细胞以证实在实施例1中获得的本发明抗体与表达人CD81的细胞的结合。JurkatE6.1细胞从欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)(目录号88042803)购买。人PBMC从KACCo.,Ltd.(KAC)购买。通过离心(4,000转/分钟，3分钟，4°C)收集这些细胞并且将它们悬浮于FACS染色缓冲液(磷酸盐缓冲液、0.09%叠氮钠、1%牛血清白蛋白(BSA:HycloneLaboratories))中。使用台盼蓝计数活细胞的数目并且将106个细胞/100μl添加于微量离心管中。
(2)细胞染色
向以上(1)中制备的细胞添加实施例1中制备的抗人CD81抗体(002-A07或005-C01)或作为对照的人IgG4(Acris)(0.1μg)，并且将细胞在4°C孵育20分钟。用FACS染色缓冲液洗涤细胞后，将PE(藻红蛋白)标记的抗人IgG4抗体(Beckmancoulter；0.05μg)添加至细胞并且在4°C孵育15分钟。用FACS染色缓冲液洗涤2次后，将细胞离心(4,000转/分钟，3分钟，4°C)，移除上清液并且将沉淀的细胞用BDCytefix/Cyteperm缓冲液(BDBiosciences)固定。在洗涤后，将缓冲液更换成PBS(NACALAITESQUE，Inc.)。使用FACSCalibur(BDBiosciences)，通过流式细胞术分析抗人CD81抗体与细胞的结合率，并且将这种结合率计算为下述细胞的百分比，所述细胞具有比使用对照IgG4时所观察的荧光强度更大的源自PE的荧光强度。在表1中显示结果。002-A07和005-C01强烈地与JurkatE6.1细胞和人PBMC结合。
表1抗人CD81抗体与Jurkat细胞和人PBMC的结合
所示的数据是3个独立实验的代表。
试验例2抗人CD81抗体对Jurakat细胞迁移的抑制作用
(1)Jurkat细胞的继代培养
将JurkatE6.1细胞(从ECACC购买：目录号88042803)在增湿培养箱中在5%CO2下于37°C在补充有10%胎牛血清(FCS：HycloneLaboratories)的RPMI1640培养基(GIBCO)中维持。通过用这种培养基稀释，使细胞密度保持在2x105和1x106个细胞/ml之间。
(2)抗体处理
JurkatE6.1细胞以4x106个细胞/ml悬浮于含有0.5%BSA(Sigma)、50mMHEPES(GIBCO))的游走培养基(RPMI1640(GIBCO))中。将抗人CD81抗体(002-A07或005-C01)或对照人IgG4(AcrisAntibodiesGmbH)以表2中描述的终浓度添加至细胞。将细胞在增湿的培养箱中在5%CO2下于37°C孵育2小时。
(3)游走测定法
使用96孔游走室(CorningInc，5μm孔径)检查游走。下部孔以235μl游走培养基在10ng/mLSDF-1(PEPROTECH)存在的情况下填充。将75μl预孵育的Jurkat细胞在具有或没有抗人CD81抗体的情况下加载到上部孔并且在增湿的培养箱中在5%CO2下于37°C孵育2小时。在孵育后，将50μl下部孔细胞悬液转移至96孔黑色平板(CorningInc)并且添加50μlATPlite(PerkinElmer)。通过使用Envision2102多标记物读数仪(PerkinElmer)测量发光强度，计算迁移的细胞的数目。
(4)游走测定法的分析
将游走百分比计算为添加抗人CD81抗体时已迁移的Jurkat细胞的数目相对于添加对照IgG4时已迁移的Jurkat细胞的数目的百分比。作为结果，两种抗人CD81抗体均抑制Jurkat细胞的游走(表2)。由于观察到002-A07和005-C01对Jurkat细胞的T细胞迁移的抑制作用，证实抗CD81抗体(002-A07和005-C01)可以是IBD的治疗药。
表2002-A07和005-C01对Jurkat细胞迁移的抑制作用
所示的数据是3个独立实验的平均值。
试验例3抗人CD81抗体对人PBMC(外周血单个核细胞)游走的抑制作用
根据Biologicals,2007Oct;35(4):227-33,Epub2007年8月28日中描述的方法检查抗人CD81抗体对人PBMC游走的抑制作用。
(1)细胞制备
人PBMC从KAC购买。根据来自KAC的附带信息，60%所用的人PBMC是T细胞(CD3阳性细胞)。将人PBMC在增湿培养箱中在5%CO2下于37°C在补充有10%胎牛血清(FCS：HycloneLaboratories)的RPMI1640培养基(GIBCO)中维持。将细胞(1x106个细胞/ml)与5μg/ml植物凝血素(PHA，Wako)和50ng/mL人重组IL-2(R&DSystem)在增湿培养箱中在5%CO2下于37°C孵育4日。
(2)抗体处理
人PBMC细胞以4x106个细胞/ml悬浮于含有0.5%BSA(Sigma)、50mMHEPES(GIBCO))的游走培养基(RPMI1640(GIBCO))中。将抗人CD81抗体(002-A07或005-C01)或对照人IgG4(AcrisAntibodiesGmbH)以表3中描述的浓度添加至细胞。将细胞在增湿的培养箱中在5%CO2下于37°C孵育2小时。
(3)细胞迁移测定法
使用96孔游走室(corningcoster,5μm孔径)检查细胞迁移。下部孔以235μl游走培养基在50ng/mLSDF-1存在的情况下填充。将75μl预孵育的人PBMC在具有或没有抗人CD81抗体的情况下加载到上部孔并且在增湿的培养箱中在5%CO2下于37°C孵育2小时。在孵育后，将50μl下部孔细胞悬液转移至96孔黑色平板(CorningInc)并且添加50μlATPlite(PerkinElmer)。通过使用Envision2102多标记物读数仪(PerkinElmer)测量发光强度，计算迁移的细胞的数目。
(4)细胞迁移测定法的分析
将游走百分比计算为添加抗人CD81抗体时已迁移的人PBMC的数目相对于添加对照IgG4时已迁移人PBMC的数目的百分比。作为结果，两种抗人CD81抗体均抑制人PBMC的游走(表3)。由于观察到002-A07和005-C01对含有原代人T细胞的人PBMC的T细胞迁移的抑制作用，证实抗CD81抗体(002-A07和005-C01)可以是IBD的治疗药。
表3002-A07和005-C01对人PBMC游走的抑制作用
试验例4抗人CD81抗体对人PBMC中细胞因子产生和人PBMC细胞增殖的影响
根据LifeSci.2001Nov21;70(1):81-96测定人PBMC中的细胞因子产生。
(1)细胞的培养和刺激
人PBMC从KAC购买。根据来自KAC的附带信息，60%所用的人PBMC是T细胞(CD3阳性细胞)。将人PBMC在增湿培养箱中在5%CO2下于37°C在补充有10%胎牛血清(FCS：HycloneLaboratories)的RPMI1640培养基(GIBCO)中维持。向96孔板(IWAKI)以表4中描述的浓度添加抗人CD81抗体(002-A07或005-C01)或对照人IgG4(AcrisAntibodiesGmbH)，并且将人PBMC(1x105细胞/ml)添加至每个孔(100μl/孔)。向细胞添加1000ng/孔抗CD3抗体(Clone:OKT3，BioLegend)和1000ng/孔抗CD28抗体(BDBiosciences)(50μl/每孔)并且在增湿的培养箱中在5%CO2下于37°C孵育48小时。在孵育后，通过ELISA测定法测量上清液的IL-2水平。
(2)IL-2ELISA测定法
通过人IL-2ELISA试剂盒(R&DSystem)测量从添加了抗体的人PBMC中产生的IL-2浓度。根据制造商的操作方案实施ELISA测定。将IL-2产生百分比计算为添加抗人CD81抗体时从人PBMC产生的IL-2水平相对于添加对照IgG4时从人PBMC产生的IL-2水平的百分比。表4中显示结果。
(3)Alamar蓝测定法
通过Alamar蓝(BIOSOURCE)测量细胞增殖。根据制造商的操作方案实施这种测定法。将细胞增殖百分比计算为添加抗人CD81抗体时人PBMC的细胞增殖相对于添加对照IgG4时人PBMC的细胞增殖的百分比。表5中显示结果。
表4002-A07和005-C01对人PBMC中IL-2产生的影响
表5002-A07和005-C01对人PBMC细胞增殖的影响
这些结果表明两种抗人CD81抗体不刺激人PBMC中的细胞因子产生或其细胞增殖。因此，002-A07和005-C01不影响作为T细胞活化指标的细胞因子生产或细胞增殖。因此，证实了所述抗体不具有副作用顾虑，所述副作用如因细胞因子过量产生所致的细胞因子风暴或因抑制T细胞功能所致的免疫抑制。
试验例5抗人CD81抗体对来自IBD患者的PBMC游走的抑制作用
(1)细胞制备
将IBD患者PBMC(从TissueSolution公司等购买)在增湿培养箱中在5%CO2下于37°C在补充有10%胎牛血清(FCS：HycloneLaboratories)的RPMI1640培养基(GIBCO)中维持。将细胞与或不与植物凝血素(PHA)、人重组IL-2、人TNFα、血管活性肠肽(VIP)、IL-22和IL-7在增湿培养箱中在5%CO2下于37°C孵育4天。
(2)抗体处理
将IBD患者的PBMC细胞悬浮于游走培养基(含有0.5%BSA(Sigma)、50mMHEPES(GIBCO))的RPMI1640(GIBCO))中。将抗人CD81抗体(002-A07或005-C01)或对照人IgG4(AcrisAntibodiesGmbH)以多种浓度添加至细胞。将细胞在增湿的培养箱中在5%CO2下于37°C孵育2小时。
(3)细胞迁移测定法
使用96孔游走室(corningcoster,5μm孔径)检查细胞迁移。下部孔以235μl游走培养基在SDF-1存在的情况下填充。将75μl预孵育的IBD患者PBMC在具有或没有抗人CD81抗体的情况下加载到上部孔并且在增湿的培养箱中在5%CO2下于37°C孵育2小时。在孵育后，将50μl下部孔细胞悬液转移至96孔黑色平板(CorningInc)并且添加50μlATPlite(PerkinElmer)。通过使用Envision2102多标记物读数仪(PerkinElmer)测量发光强度，计算迁移的细胞的数目。
(4)游走测定法的分析
将游走百分比计算为添加抗人CD81抗体时已迁移的IBD患者PBMC的数目相对于添加对照IgG4时已迁移的IBD患者PBMC的数目的百分比。
试验例6抗人CD81抗体对IBD患者PBMC中细胞因子产生的影响
(1)细胞培养和刺激
将IBD患者的PBMC(从TissueSolution公司等购买)在增湿培养箱中在5%CO2下于37°C在补充有10%胎牛血清(FCS：HycloneLaboratories)的RPMI1640培养基(GIBCO)中维持。向96孔板(IWAKI)以多种浓度添加抗人CD81抗体(002-A07或005-C01)或对照人IgG4(AcrisAntibodiesGmbH)，并且将IBD患者PBMC添加至每个孔。向细胞添加1000ng/孔抗CD3抗体(Clone:OKT3，BioLegend)和1000ng/孔抗CD28抗体(BDBiosciences)(50μl/每孔)并且在增湿的培养箱中在5%CO2下于37°C孵育48小时。在孵育后，通过ELISA测定法测量上清液的IL-2水平。
(2)IL-2ELISA测定
通过人IL-2ELISA试剂盒(R&DSystem)测量从添加了抗体的IBD患者PBMC中产生的IL-2浓度。根据制造商的操作方案实施ELISA测定。将IL-2产生百分比计算为添加抗人CD81抗体时从人PBMC产生的IL-2水平相对于添加对照IgG4时从人PBMC产生的IL-2水平的百分比。
试验例7使用人-鸡CD81嵌合体对抗人CD81抗体的表位绘图
为了鉴定每种抗人CD81抗体(002-A07和005-C01)结合的表位，使用表6中列出的人-鸡CD81嵌合构建体进行ELISA测定。在CHO细胞中瞬时表达每种构建体并且将其细胞膜部分用去垢剂增溶并固定到平板上。表7中汇总结果。
(1)嵌合体CD81蛋白的表达
使用人CD81基因(SEQIDNO:21)和鸡CD81基因(SEQIDNO:23)，构建表6中所述的10个类型的嵌合体CD81基因。将每个嵌合体基因亚克隆入pcDNA-DEST40载体中，从而表达在C端具有V5和6×His标签的融合蛋白。根据制造商的操作方案，使用基因导入试剂Trans-ITLT-1(TAKARABIO，目录号MIR2304)，将每种嵌合构建体在CHO细胞中瞬时表达，并且在48小时后，通过以下方法制备膜部分。向表达CD81嵌合体的CHO细胞添加含有1%(w/v)正辛基葡糖苷(NACALAITESQUE，Inc.))的HBS缓冲液(20mMHepes(Invitrogen)、150mMNaCl(NACALAITESQUE，Inc.)，并且将细胞在4°C孵育5分钟。随后，将细胞悬液以10000g离心20分钟并且收集上清液。用BCA蛋白质测定试剂盒(ThermoScientificPierce，目录号：23225)测定上清液中的蛋白质含量。
(2)ELISA测定法
作为对照抗体，使用人IgG4抗体(AcrisAntibodiesGmbH)和小鼠IgG抗体。在1%(w/v)正辛基葡糖苷存在的情况下添加以上(1)中制备的膜部分(5μg/100μL/孔)至NiNTAHisSorb平板(QIAGEN)并且在4°C孵育3小时，借助导入C端的His标签捕获人-鸡嵌合体蛋白。在用TBST(TBS，0.05%(v/v)吐温20)洗涤3次后，添加抗人CD81抗体或对照抗体(50μL/孔)并在室温(RT)孵育1小时。在洗涤后，添加2000倍稀释的HRP标记的抗人IgG4抗体(小鼠抗人IgG4HRP克隆：HP6023BeckmanCoulter)或1000稀释的HRP标记的抗小鼠IgG抗体(Invitrogen)(50μL/孔)。将平板在室温孵育1小时并用TBST洗涤3次。并且随后，通过TMBOneSolution(Promega；目录号53025)测定过氧化物酶活性。用2MH2SO4(50μL)终止反应并且测量在450nm的吸光度。
(3)结果的解释
人CD81具有两个胞外结构域。002-A07和005-C01与hCD81、c80h、h175c和h190c结合，但是不与cCD81、c138h、c156h、c175h、c190h、h80c、h138c和h156c结合。这些结果表明由与人CD81结合的002-A07和005-C01抗体识别的表位存在于人CD81多肽的第80位氨基酸残基和第175位氨基酸残基之间。
表6人-鸡CD81嵌合体
每一数字显示氨基酸残基的位置。
表7使用人-鸡CD81嵌合体的表位绘图
○：在450nm处的吸光度是CD81为hCD81情况下的吸光度的100-10%。
×：在450nm处的吸光度小于CD81为hCD81情况下的吸光度的10%。
试验例8使用丙氨酸扫描法对抗人CD81抗体的表位绘图
如试验例7中所显示，确定针对002-A07和005-C01抗体的人CD81表位区域。在这个实施例中，为了评估表位区域内各个氨基酸残基对结合抗人CD81抗体的贡献并且鉴定详细的表位残基，在试验例7中所确定的表位区域的序列内实施丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989))。通过位点定向诱变制备人CD81突变体(这项工作外包给TAKARABIO)并且将其亚克隆入pcDNA-DEST40载体中。随后，将这些突变体在CHO细胞中表达并且按照与试验例7中相同的方式测定002-A07和005-C01抗体与各个突变体的结合。将相对结合亲和力计算为002-A07或005-C01抗体与每种突变的结合亲和力对002-A07或005-C01抗体与野生型人CD81的结合亲和力的百分比，并且基于相对结合亲和力，将所述突变体划分成3个组。各个突变体的表达水平由插入突变体C端中的V5标签的表达水平校正。表8中汇总结果。
如试验例7中所显示，抗人CD81抗体002-A07和005-C01识别位于人CD81第80位和第175位氨基酸残基之间的相同表位区域。丙氨酸扫描法的结果显示人CD81在该表位区域内部分别具有对与002-A07结合至关重要的13个氨基酸残基(V135、D137、A143、H151、G158、T163、A164、L165、S168、V169、L170、N172和L174)和对与005-C01结合至关重要的17个氨基酸残基(Y127、A130、L131、V135、V136、D137、N142、A143、L154、G158、T163、L165、S168、V169、L170，K171和L174)。
表8通过丙氨酸扫描法对抗人CD81抗体的表位绘图
每种符号显示；
○：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力相等或略弱(相对结合亲和力范围40-100%)。
Δ：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力显著地弱(相对结合亲和力范围20-40%)。
×：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力相当弱(相对结合亲和力范围在20%以下)。
(由于第81位至第112位氨基酸残基是跨膜或胞内结构域，故未制备丙氨酸突变体)
试验例9使用同源物扫描法对抗人CD81抗体的表位绘图
由于丙氨酸扫描法可以造成不想要的构象变化和物理化学破坏(Cunningham和Wells，Science244:1081-1085(1989))，我们实施同源物扫描法，所述同源物扫描法是进一步提高功能表位的能量学曲线的分辨率的其他类型的系统扫描法。将同源物扫描诱变设计成通过引入置换基团进行侧链置换时使结构性破坏的可能性最小化，从而维持蛋白质的结构和功能(ProteinScience(2005),14:2405-2413)。
如试验例8中所显示，人CD81在表位区域内部分别具有对与002-A07和005-C01结合至关重要的13个和17个氨基酸残基。根据ProteinScience(2005),14:2405-2413描述的法则，在这些残基中制备同源物突变体。将这些同源物突变体在CHO细胞中表达并且按照与试验例8相同的方式测定抗人CD81抗体与各个突变体的结合。
表9中汇总结果。同源物扫描法揭示，人CD81在表位区域内部具有对与002-A07结合至关重要的9个氨基酸残和对与005-C01结合至关重要的9个氨基酸残基。第151位、第164位、第168位和第172位残基对与002-A07结合特别至关重要。在另一方面，第127位、第130位、第143位和第154位残基对与005-C01结合特别至关重要。
表9通过同源物扫描法对抗人CD81抗体的表位绘图
002-A07
005-C01
每种符号显示；
○：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力相等或略弱(相对结合亲和力范围40-100%)。
Δ：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力显著地弱(相对结合亲和力范围20-40%)。
×：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力相当弱(相对结合亲和力范围在20%以下)。
Homo：同源物突变体；Ala：丙氨酸突变体
实施例2：产生002-A07突变抗体
糖基化位点突变体的构建
修饰来自n-CoDeR(注册商标)克隆002-A07的VL区以消除位于CDR3中的潜在N-糖基化位点(氨基酸序列：NLS)。设计6种VL变体：N113S、N113G、N113Q、S115A、S115G和S115N并从GeneartAG(德国雷根斯堡)购买。将它们如实施例1中所述那样插入含有λ恒定区的表达载体。将这6种变体轻链与002-A07γ4S228P重链一起转染至HEK293-EBNA细胞中。如实施例1中所述那样表达和纯化抗体。
来自亲和力成熟的克隆的分离
文库制备
对n-CoDeR(注册商标)克隆002-A07产生诱变文库。使用质粒DNA作为易错PCR操作方案(Saviranta等人,1998)中的模板，其中在整个抗体可变区范围内随机地导入突变。将所得到的片段连接入噬菌粒载体并且电穿孔至大肠杆菌HB101F'中(通过将F'质粒接合至菌株HB101(Invitrogen)中构建)以便构建Fab文库。该文库作为细菌甘油贮藏物贮存在-80°C。(SavirantaP,PajunenM,JauriaP,KarpM,PetterssonK,P和T(1998).“Engineeringthesteroid-specificityofananti-17β-estradiolFabbyrandommutagenesisandcompetitivephagepanning”.ProtEng11(2)143-152)
淘选和筛选各可溶性Fab的噬菌体展示
使用辅助噬菌体R408(Stratagene)从大肠杆菌文库表达具有Fab展示的噬菌体并且将其使用PEG沉淀从培养上清液纯化。
通过噬菌体展示技术分离具有改进的亲和力的CD81特异性克隆。两项平行淘选策略(A和B)(每种由两个连续淘选组成)用来分离具有改进的亲和力的克隆。在策略A中，使用聚苯乙烯珠上包被的纯化重组人CD81蛋白作为靶。在策略B中，使用内源性表达人CD81的Jurkat细胞作为靶。通过洗涤移除未结合的噬菌体。使用胰蛋白酶洗脱结合靶的Fab-噬菌体并且将其在大肠杆菌HB101F'中扩增。
从淘选2后的扩增的克隆汇集物中分离噬菌粒DNA。通过限制性酶消化切除基因III，接着再连接，产生表达Fab的质粒汇集物。将质粒转化至大肠杆菌TOP10(Invitrogen)中，并且在含抗生素的琼脂平板上选择表达各可溶性Fab的转化体。将单个细菌菌落从琼脂平板转移至微量滴定板以便表达带有C端His标签的可溶性Fab。
使用ELISA设置，依次添加以下试剂进行初级筛选：1)包被单克隆抗His抗体；2)来自亲和力成熟的加His标签的Fab；3)加FLAG标签的重组人CD81蛋白；4)AP缀合的抗FLAG抗体；5)发光底物。将初次筛选中具有最高活性的克隆精心挑选至新微量滴定板并再表达。采用如初此筛选所述的相同ELISA设置进行二次筛选。通过DNA测序法分析处于Fab形式的与亲本克隆002-A07相比具有改进结合作用的克隆。使用Ni-NTA层析从大肠杆菌周质纯化独特的Fab克隆。使用流式细胞术以Jurkat细胞和使用Biacore以固定的重组人CD81蛋白进行纯化的Fab克隆的亲和力排序。
IgG4-S228P的产生
将与亲本克隆相比具有改进亲和力的克隆转化成IgG4-S228P形式，如实施例1中所述那样表达和纯化。
根据下表10中的对应性，在序列表中显示通过DNA测序法测定的获得的002-A07突变抗体的序列。
表10表示抗体的肽序列或DNA序列的SEQIDNO
试验例10：002-A07突变抗体对Jurkat细胞迁移的抑制作用
按照与试验例2相同的方式进行这个实验。作为结果，全部002-A07突变抗体均对Jurkat细胞(人T细胞系)游走显示抑制作用(表11)。
表11002-A07突变抗体对Jurkat细胞迁移的抑制作用
试验例11：002-A07突变抗体对人PBMC的细胞因子产生和人PBMC细胞增殖的影响
按照与试验例4相同的方式进行这个实验。将5A6(一种增强IL-2产生同时抑制T细胞迁移的市售小鼠抗人CD81抗体(SantaCruzCo.))用于对照。作为结果，没有一种002-A07突变抗体增强人PBMC的IL-2产生(表12)，它们也均不明显影响细胞增殖(表13)。
表12002-A07突变抗体对人PBMC的IL-2产生的影响
表13002-A07突变抗体对人PBMC细胞增殖的影响
试验例12：使用丙氨酸扫描法对002-A07突变抗体的表位绘图
按照与试验例8相同的方式进行这个实验。由于第1至第43位、第63位至第112位、第202位和后续残基是跨膜或胞内结构域(Levy,S.等人,Annu.Rev.Immunol.(1998)16,89-109)，故没有产生丙氨酸突变体。由于第156位、第157位、第175位和第190位是半胱氨酸残基，没有产生丙氨酸突变体。与野生型人CD81相比，针对表14中未列出的丙氨酸突变体的相对结合亲和力在全部002-A07突变抗体中相等或略弱(相对结合亲和力范围40-100%)。
表14通过丙氨酸扫描法对002-A07突变抗体的表位绘图
每种符号显示；
○：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力相等或略弱(相对结合亲和力范围40-100%)。
Δ：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力显著地弱(相对结合亲和力范围20-40%)。
×：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力相当弱(相对结合亲和力范围在20%以下)。
试验例13：使用同源物扫描法对002-A07突变抗体的表位绘图
按照与试验例9相同的方式，对从丙氨酸扫描法的结果判断为对结合002-A07突变抗体重要的氨基酸残基进行同源物扫描。作为结果，对于002-A07突变抗体，鉴定到分别对下文显示的结合作用重要的氨基酸残基。发现全部002-A07突变抗体结合与002-A07相同的表位。
002-A07N113G：V135、D137、H151、G158、A164、S168、V169、L170002-A07N113Q：V135、D137、H151、G158、A164、S168、V169、L170002-A07N113S：V135、D137、H151、G158、A164、S168、V169、L170002-A07S115A：Y127、V135、D137、A143、H151、G158、A164、S168、V169、L170
002-A07S115G：V135、D137、H151、G158、A164、S168、V169、L170、N172
002-A07S115N：V135、D137、A164、S168、V169
001-B06：A164、V169
002-B05：V135、D137、H151、G158、A164、V169、L170
002-B07：V135、A164、V169
002-C02：V135、D137、A164、V169
002-C09：A164、V169
002-D03：V135、D137、A164、V169
002-D08：A164、V169
002-D10：A164、V169
002-F01：V135、D137、G158、A164、S168、V169
002-F05：V135、D137、A164、S168、V169
002-F07：V135、D137、A164、V169
002-H02：A164、V169
002-H03：A164、V169
003-A10：A164、V169
003-A11：A164、V169
003-D07：V135、D137、H151、G158、A164、V169
003-F08：V135、D137、H151、G158、A164、V169、L170
表15通过同源物扫描法对002-A07突变抗体的表位绘图
每种符号显示；
○：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力相等或略弱(相对结合亲和力范围40-100%)。
Δ：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力显著地弱(相对结合亲和力范围20-40%)。
×：与野生型人CD81相比，相对结合亲和力相当弱(相对结合亲和力范围在20%以下)。
-：未测试(由于基于丙氨酸扫描的结果判断这种突变体对结合作用不重要)。
实施例3：产生人IgG1型抗CD81抗体
将EcoRI位点和XhoI位点添加至DNA片段的两个末端，所述DNA片段编码在N端部分添加有人IL-2信号序列的002-A07的L链肽序列，并且将所述片段插入pcDNA3.1(+)(InvitrogenCo.)的EcoRI-XhoI位点(a)。同样地，将EcoRI位点和XhoI位点添加至DNA片段的两个末端，所述DNA片段编码在N端部分添加有人IL-2信号序列的002-A07的H链肽序列，并且将所述片段插入pcDNA3.1(+)的EcoRI-XhoI位点。另外，以并入H链基因的上述质粒作为模板，使用下文显示的DNA引物，通过PCR扩增DNA片段。
5'侧DNA引物(含有EcoRI位点部分的序列)：5'-GGTGGAATTCCCACCATGTACAGGATGCAAC-3'(SEQIDNO:161)
3'侧DNA引物(含有在pFUSE-CHIg-hG1(InvitrogenCo.)上的XhoI位点和编码002-A07H链可变区的C端区的部分序列的序列)：5'-TGCACTCGAGACGGTGACCAGTGTACCTTGGCCCC-3'(SEQIDNO:162)
用EcoRI和XhoI消化后，将扩增的DNA插入pFUSE-CHIg-hG1的EcoRI-XhoI位点以产生IgG1化的H链表达质粒(b)。为了制备人IgG1型抗CD81抗体蛋白，将质粒(a)和b)以瞬时方式导入CHO-S细胞中，并且使细胞经历悬浮培养。回收培养上清液，并且使用蛋白A柱纯化人IgG1型抗CD81抗体。序列表中显示该抗体的L链和H链的核苷酸序列和氨基酸序列。
L-链：
核苷酸序列：SEQIDNO:163
氨基酸序列：SEQIDNO:164
H-链：
核苷酸序列：SEQIDNO:165
氨基酸序列：SEQIDNO:166
试验例14：人IgG1型抗CD81抗体对癌细胞的结合活性
按照与试验例1相同的方式检测人IgG1型抗CD81抗体与源自人急性淋巴性白血病患者的JurkatE6.1细胞(目录号88042803)和源自人Burkitt淋巴瘤患者的Ramos(RA1)细胞(目录号EC85030802)的结合，不同在于使用人IgG(AbDSerotecCo.)作为对照以及将PE(藻红蛋白)标记的抗人Ig抗体(BeckmanCoulterCo.)用于染色。表16中显示使用FACSCalibur(BDBiosciencesCo.)分析的结果。该表中的数值是FACSCalibur中FL2的几何平均值。作为结果，证实人IgG1型抗CD81抗体与Jurkat细胞和Ramos细胞结合。
表16人IgG1型抗CD81抗体与Jurkat细胞和Ramos细胞的结合
试验例15：人IgG1型抗CD81抗体对癌细胞的细胞毒效应(CDC：补体依赖的细胞毒 性)
以4,000转/分钟(4°C，3分钟)离心后，回收Jurkat细胞和Ramos细胞并且悬浮于CDC测试缓冲液(含有20mMHepes和0.1%牛血清白蛋白的RPMI1640培养基)。使用台盼蓝(GIBCOCo.)计数活细胞；将细胞悬浮于CDC测试缓冲液中以获得细胞密度106个细胞/ml。悬浮的细胞以每孔50μL分配至96孔细胞培养平板；将表17中所显示的抗体以每孔50μL添加，并且将平板在37°C孵育30分钟。将干燥的兔补体(CEDARRLANECo.)用无菌蒸馏水复水并且用CDC测试缓冲液稀释10倍，此后，将50μL稀释物添加至每个孔，并且将平板在37°C孵育另外2小时。将100μL培养上清液等分试样与LDH测定试剂盒中的100μL反应液(目录号744934001，RocheCo.)混合并且使它们在室温反应30分钟，此后，使用平板读数仪测量在490nm波长的吸光度。将CDC活性计算为相对于通过TritonX-100处理彻底杀死细胞所获得的LDH活性值的百分比率。作为结果，证实人IgG1型抗CD81抗体对Jurkat细胞和Ramos细胞的补体依赖的细胞毒活性。
表17人IgG1型抗CD81抗体对Jurkat细胞的细胞毒效应
表18人IgG1型抗CD81抗体对Ramos细胞的细胞毒效应
产业上的利用可能性
本发明的抗人CD81抗体用于预防、改善或治疗炎性肠病(IBD)、与T细胞迁移相关的疾病如多发性硬化和牛皮癣或血液癌症。
本申请基于在日本提交的专利申请号2010-272046(申请日：2010年12月6日)，所述专利申请的内容完整并入本文。

Claims (17)

1.抗人CD81抗体，其包含在以下组1至24的任一个组中所述的全部6个CDR：
组1
(a-1)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-1)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-1)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-1)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-1)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-1)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组2
(a-2)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-2)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-2)包含SEQIDNO:37中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-2)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-2)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-2)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组3
(a-3)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-3)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-3)包含SEQIDNO:40中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-3)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-3)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-3)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组4
(a-4)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-4)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-4)包含SEQIDNO:43中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-4)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-4)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-4)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组5
(a-5)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-5)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-5)包含SEQIDNO:46中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-5)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-5)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-5)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组6
(a-6)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-6)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-6)包含SEQIDNO:49中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-6)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-6)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-6)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组7
(a-7)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-7)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-7)包含SEQIDNO:52中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-7)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-7)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-7)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组8
(a-8)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-8)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-8)包含SEQIDNO:43中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-8)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-8)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-8)包含SEQIDNO:55中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组9
(a-9)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-9)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-9)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-9)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-9)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-9)包含SEQIDNO:61中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组10
(a-10)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-10)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-10)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-10)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-10)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-10)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组11
(a-11)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-11)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-11)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-11)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-11)包含SEQIDNO:69中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-11)包含SEQIDNO:70中所示氨基酸序列的重链的CDR3，
组12
(a-12)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-12)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-12)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-12)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-12)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-12)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3，
组13
(a-13)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-13)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-13)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-13)包含SEQIDNO:77中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-13)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-13)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组14
(a-14)包含SEQIDNO:80中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-14)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-14)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-14)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-14)包含SEQIDNO:81中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-14)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组15
(a-15)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-15)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-15)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-15)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-15)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-15)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组16
(a-16)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-16)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-16)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-16)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-16)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-16)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组17
(a-17)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-17)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-17)包含SEQIDNO:52中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-17)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-17)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-17)包含SEQIDNO:93中所示氨基酸序列的重链的CDR3，
组18
(a-18)包含SEQIDNO:98中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-18)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-18)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-18)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-18)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-18)包含SEQIDNO:99中所示氨基酸序列的重链的CDR3，
组19
(a-19)包含SEQIDNO:60中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-19)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-19)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-19)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-19)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-19)包含SEQIDNO:99中所示氨基酸序列的重链的CDR3，
组20
(a-20)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-20)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-20)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-20)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-20)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-20)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3，
组21
(a-21)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-21)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-21)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-21)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-21)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-21)包含SEQIDNO:55中所示氨基酸序列的重链的CDR3，
组22
(a-22)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-22)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-22)包含SEQIDNO:66中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-22)包含SEQIDNO:110中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-22)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-22)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组23
(a-23)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-23)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-23)包含SEQIDNO:3中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-23)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-23)包含SEQIDNO:5中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-23)包含SEQIDNO:115中所示氨基酸序列的重链的CDR3
组24
(a-24)包含SEQIDNO:1中所示氨基酸序列的轻链的CDR1，
(b-24)包含SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的轻链的CDR2，
(c-24)包含SEQIDNO:90中所示氨基酸序列的轻链的CDR3，
(d-24)包含SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的重链的CDR1，
(e-24)包含SEQIDNO:120中所示氨基酸序列的重链的CDR2，和
(f-24)包含SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的重链的CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包含在以下组49至72的任一个组中所述的轻链可变区和重链可变区的组合，
组49
(i-1)包含SEQIDNO:8中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-1)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组50
(i-2)包含SEQIDNO:38中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-2)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组51
(i-3)包含SEQIDNO:41中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-3)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组52
(i-4)包含SEQIDNO:44中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-4)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组53
(i-5)包含SEQIDNO:47中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-5)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组54
(i-6)包含SEQIDNO:50中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-6)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组55
(i-7)包含SEQIDNO:53中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-7)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组56
(i-8)包含SEQIDNO:56中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-8)包含SEQIDNO:57中所示氨基酸序列的重链可变区，
组57
(i-9)包含SEQIDNO:62中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-9)包含SEQIDNO:63中所示氨基酸序列的重链可变区，
组58
(i-10)包含SEQIDNO:67中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-10)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组59
(i-11)包含SEQIDNO:71中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-11)包含SEQIDNO:72中所示氨基酸序列的重链可变区，
组60
(i-12)包含SEQIDNO:75中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-12)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组61
(i-13)包含SEQIDNO:8中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-13)包含SEQIDNO:78中所示氨基酸序列的重链可变区，
组62
(i-14)包含SEQIDNO:82中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-14)包含SEQIDNO:83中所示氨基酸序列的重链可变区，
组63
(i-15)包含SEQIDNO:86中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-15)包含SEQIDNO:87中所示氨基酸序列的重链可变区，
组64
(i-16)包含SEQIDNO:91中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-16)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组65
(i-17)包含SEQIDNO:94中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-17)包含SEQIDNO:95中所示氨基酸序列的重链可变区，
组66
(i-18)包含SEQIDNO:100中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-18)包含SEQIDNO:101中所示氨基酸序列的重链可变区，
组67
(i-19)包含SEQIDNO:104中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-19)包含SEQIDNO:101中所示氨基酸序列的重链可变区，
组68
(i-20)包含SEQIDNO:106中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-20)包含SEQIDNO:10中所示氨基酸序列的重链可变区，
组69
(i-21)包含SEQIDNO:108中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-21)包含SEQIDNO:57中所示氨基酸序列的重链可变区，
组70
(i-22)包含SEQIDNO:111中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-22)包含SEQIDNO:112中所示氨基酸序列的重链可变区，
组71
(i-23)包含SEQIDNO:116中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-23)包含SEQIDNO:117中所示氨基酸序列的重链可变区，
组72
(i-24)包含SEQIDNO:121中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-24)包含SEQIDNO:122中所示氨基酸序列的重链可变区。
3.根据权利要求2所述的抗体，其包含在以下组73至96的任一个组中所述的轻链和重链的组合：
组73
(k-1)包含SEQIDNO:26中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-1)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组74
(k-2)包含SEQIDNO:39中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-2)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组75
(k-3)包含SEQIDNO:42中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-3)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组76
(k-4)包含SEQIDNO:45中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-4)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组77
(k-5)包含SEQIDNO:48中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-5)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组78
(k-6)包含SEQIDNO:51中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-6)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组79
(k-7)包含SEQIDNO:54中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-7)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组80
(k-8)包含SEQIDNO:58中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-8)包含SEQIDNO:59中所示氨基酸序列的重链，
组81
(k-9)包含SEQIDNO:64中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-9)包含SEQIDNO:65中所示氨基酸序列的重链，
组82
(k-10)包含SEQIDNO:68中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-10)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组83
(k-11)包含SEQIDNO:73中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-11)包含SEQIDNO:74中所示氨基酸序列的重链，
组84
(k-12)包含SEQIDNO:76中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-12)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组85
(k-13)包含SEQIDNO:26中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-13)包含SEQIDNO:79中所示氨基酸序列的重链，
组86
(k-14)包含SEQIDNO:84中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-14)包含SEQIDNO:85中所示氨基酸序列的重链，
组87
(k-15)包含SEQIDNO:88中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-15)包含SEQIDNO:89中所示氨基酸序列的重链，
组88
(k-16)包含SEQIDNO:92中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-16)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组89
(k-17)包含SEQIDNO:96中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-17)包含SEQIDNO:97中所示氨基酸序列的重链，
组90
(k-18)包含SEQIDNO:102中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-18)包含SEQIDNO:103中所示氨基酸序列的重链，
组91
(k-19)包含SEQIDNO:105中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-19)包含SEQIDNO:103中所示氨基酸序列的重链，
组92
(k-20)包含SEQIDNO:107中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-20)包含SEQIDNO:28中所示氨基酸序列的重链，
组93
(k-21)包含SEQIDNO:109中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-21)包含SEQIDNO:59中所示氨基酸序列的重链，
组94
(k-22)包含SEQIDNO:113中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-22)包含SEQIDNO:114中所示氨基酸序列的重链，
组95
(k-23)包含SEQIDNO:118中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-23)包含SEQIDNO:119中所示氨基酸序列的重链，
组96
(k-24)包含SEQIDNO:123中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-24)包含SEQIDNO:124中所示氨基酸序列的重链。
4.抗人CD81抗体，其包含：
(a-25)包含SEQIDNO:11中所示氨基酸序列的轻链的CDR1；
(b-25)包含SEQIDNO:12中所示氨基酸序列的轻链的CDR2；
(c-25)包含SEQIDNO:13中所示氨基酸序列的轻链的CDR3；
(d-25)包含SEQIDNO:14中所示氨基酸序列的重链的CDR1；
(e-25)包含SEQIDNO:15中所示氨基酸序列的重链的CDR2；和
(f-25)包含SEQIDNO:16中所示氨基酸序列的重链的CDR3。
5.根据权利要求4所述的抗体，其包含：
(i-25)包含SEQIDNO:18中所示氨基酸序列的轻链可变区；和
(j-25)包含SEQIDNO:20中所示氨基酸序列的重链可变区。
6.根据权利要求5所述的抗体，其包含：
(k-25)包含SEQIDNO:30中所示氨基酸序列的轻链；和
(l-25)包含SEQIDNO:32中所示氨基酸序列的重链。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其是人源化抗体或人抗体。
8.包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的重链可变区和轻链可变区。
9.以下两种多核苷酸的组合，所述多核苷酸包含编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的重链可变区的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的相应轻链可变区的核苷酸序列。
10.包含核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的重链和轻链。
11.以下两种多核苷酸的组合，所述多核苷酸包含编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的重链的核苷酸序列，和所述多核苷酸包含编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的相应轻链的核苷酸序列。
12.表达载体，其包含权利要求8或10所述的多核苷酸。
13.重组细胞，其用权利要求12所述的表达载体转化。
14.用以下两种表达载体转化的重组细胞，所述表达载体包含含有编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的重链的核苷酸序列的多核苷酸，和所述表达载体包含含有编码权利要求1至7中任一项所述的抗体的相应轻链的核苷酸序列的多核苷酸。
15.产生抗人CD81抗体的方法，包括培养权利要求13或14所述的重组细胞，和从获得的培养上清回收抗体。
16.药物组合物，其包含权利要求1至7中任一项所述的抗体。
17.用于预防、改善或治疗选自炎性肠病、多发性硬化、牛皮癣和血液癌症的疾病的药剂，其包含权利要求1至7中任一项所述的抗体。
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